* AISLAMIENTO Y ACTIVIDAD DE DESPOLIMERASAS DE LIGNINA Campo de la Invención Esta solicitud se refiere a las despolimerasas de lignina y su uso. Antecedentes de la Invención 5 La lignina es un material polimérico que existe en la naturaleza encontrado en las paredes celulares del material vascular de las plantas, tales como la madera. Los componentes de lignina de alto peso molecular presentes en la pulpa formada durante la elaboración de pulpa química de la madera producen un papel que tiende a descolorar los productos de papel
10 resultantes. Por lo tanto, es preferible eliminar la lignina durante los procesos de producción del papel. Las técnicas establecidas para la eliminación de los contaminantes de lignina durante la producción de papel incluyen el blanqueado químico de la pulpa de madera. Los tratamientos químicos pueden producir compuestos similares a la dioxina que son
15 perjudiciales para el medio ambiente. Por consiguiente, existe una necesidad de substancias alternativas y métodos para eliminar la lignina durante el proceso de blanqueado. Sumario de la Invención La presente invención se refiere a enzimas de despolimerasa de
20 lignina que son efectivas para despolimerizar la lignina in vitro e in vivo. En un aspecto, la presente invención se refiere a despolimerasas de lignina que contienen un polipeptido de despolimerasa de lignina. La despolimerasa de lignina puede tener un peso molecular aparente de aproximadamente 35,000 daltons. No requiere un subtrato de peróxido de
25 hidrógeno. En algunas modalidades, la despolimerasa de lignina contiene un
lipépt.do que tiene un valor pl en un rango de aproximadamente 4 a aproximadamente 6, un pl de aproximadamente 4.9, un pl de aproximadamente 5.8 y cualquier combinación de los mismos. La despolimerasa de lignina puede incluir un polipéptido aislado de un hongo de roya blanca Trametes cingulata. La despolimerasa de lignina puede ser aislada de las fuentes naturales, o expresada in vitro usando tecnologías de ADN recombinante. En otras modalidades, el polipéptido de despolimerasa de lignina es efectivo para la despolimerización de la lignina. La despolimerización puede efectuarse in vitro, por ejemplo, en un proceso industrial de producción de papel. En particular, la despolimerasa de lignina puede ser efectiva para la despolimerización del material café de la pulpa del injerto de madera suave.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un producto de manufactura que contiene un polipéptido de despolimerasa de lignina contenido dentro de un material de empaque en donde el polipéptido es efectivo para la despolimerización de la lignina. En algunas modalidades, la lignina es pulpa de un injerto tal como el material café de la pulpa de injerto de madera suave. Además, el producto de manufactura puede ser utilizado en conjunto con cualquiera de los polipéptidos de despolimerasa de lignina o combinaciones de los péptidos aquí descritos. En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para aislar un derivado polimerizado de lignina por medio de 1 ) cultivar un hongo de roya blanca en la presencia de lignina para producir lignina polimerizada; y posteriormente 2) aislar la lignina polimerizada del cultivo. En ciertas modalidades, el cultivo se hace crecer a través o después de una fase de
4- .
crecimiento principal. El método puede incluir el paso de ultrafiltración de la lignina polimerizada. Otras características y ventajas de la invención podrán ser apreciadas a partir de la siguiente descripción de las modalidades preferidas, y de las reivindicaciones. Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1 , es un injerto que tiene una serie de curvas que ilustran los perfiles de elución para una columna Sephadex (TM) G100 cargada con los productos de degradación de muestras de lignina del injerto polimerizado de alto peso molecular catalizadas por una despolemirasa de lignina que tiene un pl de aproximadamente 4.9. La Figura 2, es un injerto que tiene una serie de curvas que ilustran los perfiles de elución para una columna Sephadex (TM) G 100 cargada con los productos de degradación de las muestras de lignina de injerto polimerizado de alto peso molecular catalizadas por una despolimerasa de lignina que tiene un pl de aproximadamente 5.8. La Figura 3, es un injerto que tiene una serie de curvas que ilustran los perfiles de elución para una columna Sephadex (TM) G100 cargada con muestras de lignina del injerto polimerizado de alto peso molecular incubadas en un regulador que carece de despolimerasa de lignina. Descripción Detallada del Invento La presente invención proporciona una fuente de despolimerasa de lignina que es útil para la despolimerización de la lignina. Las despolimerasas de lignina pueden ser una o más despolimerasas de lignina individuales derivadas de cualquier fuente e incluyen despolimerasas de
_ . _ . fe ¡.*?M*i*ftjf:.3P. ^..Aib lignina naturales y/o recombinantes. Una composición de despolimerasa de lignina puede incluir, por ejemplo, una despolimerasa sola de lignina aislada, o una o más despolimerasas de lignina que son combinadas para formar una mezcla de despolimerasas de lignina. Las despolimerasas de lignina naturales son despolimerasas de lignina que son aisladas de las células o cultivos que producen de manera natural la despolimerasa de lignina. Las despolimerasas de lignina recombinantes son despolimerasas de lignina producidas utilizando tecnologías recombinantes de ADN. Las tecnologías recombinantes de ADN incluyen sistemas de expresión procarióticos y eucarióticos conocidos que incluyen sistemas de expresión útiles para expresar las proteínas exógenas en E. coli, hongos, levadura, células de insectos y otros sistemas similares. Las tecnologías recombinantes de ADN pueden ser utilizadas para expresar las despolimerasas naturales de lignina y las despolimerasas de lignina diseñadas genéticamente. Las despolimerasas de lignina recombinantes pueden incluir secuencias codificadoras de polinucléotidos de despolimerasas de lignina enlazadas de manera operable a una secuencia reguladora y/o secuencias de codificadores de polinucléotidos, de despolimerasa de lignina diseñadas genéticamente enlazadas de manera operable a una secuencia regulatoria. Una despolimerasa de lignina diseñada genéticamente es una despolimerasa de lignina que contiene uno o más aminoácidos no encontrados en la despolimerasa de lignina natural existente. Las despolimerasas de lignina útiles incluyen, en particular, despolimerasas de lignina aisladas del hongo de la roya blanca Trametes cingulata (T. cingulata). Se pueden usar Las despolimerasas de lignina que tienen un pl en un rango de aproximadamente 4 a aproximadamente 6. Las despolimerasas de lignina preferidas tiene un pl de aproximadamente 4.9 ó aproximadamente 5.8. Las despolimerasas de lignina incluyen 5 despolimerasas de lignina que tienen un pl en un rango de aproximadamente 4 a aproximadamente 6, y pueden ser usadas solas o en combinación. Las despolimerasas de lignina pueden ser aisladas de la T. cingulata cultivando el hongo de la roya blanca bajo condiciones conocidas que conducen a la proliferación del hongo. Se puede permitir que el hongo
10 prolifere a través o después de la fase primaria de crecimiento, la cual es acompañada frecuentemente por la polimerización del derivado de lignina presente en la solución del cultivo. En un punto en donde la polimerización del derivado de lignina disminuye o se detiene, y el cultivo de T. cingulata sale de la fase primaria de crecimiento, pueden ser agregados los
15 inhibidores de la proteasa. Los inhibidores de proteasa útiles incluyen fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF) y Pepstatina A. Los inhibidores de proteasa pueden ser agregados a una concentración final de aproximadamente 0.05 mM o aproximadamente 1 mM o cualquier otra concentración efectiva. Después de la adición del inhibidor de proteasa, la
20 solución de cultivo puede ser filtrada y concentrada. Las despolimerasas de lignina pueden ser aisladas de la solución de cultivo concentrada utilizando cualquier método incluyendo el enfoque isoeléctrico, cromatografía de gel, purificación por afinidad, y cualquier otro método conocido para la purificación de la proteína.
Cualquier lignina polimérica puede ser despolimerizada. Las fuentes útiles de lignina para la despolimerización incluyen lignina de pulpa de madera, lignina de injerto, material café de pulpa de injerto de madera suave y lignina polimerizada por cultivos del hongo de la roya blanca T. cingulata. Las despolimerasas de lignina aisladas pueden ser empacadas y vendidas en la forma de un producto de manufactura. Los métodos para la manufactura de los productos son conocidos. Las despolimerasas de lignina pueden ser empacadas en los productos de manufactura en cualquier forma incluyendo una solución, congeladas y/o liofiilizada. Dicho producto de manufactura es útil para la despolimerización de la pulpa del injerto. La invención también se refiere a un método para hacer negocios que incluyen los pasos de ofrecer para venta una despolimerasa de lignina, y anunciar o comunicar a una audiencia apropiada que la despolimerasa es efectiva para la despolimerización de la lignina en las instalaciones de producción de papel. La presente invención se describirá con mayor detalle por medio de los siguientes ejemplos. Ejemplo 1. Purificación de la Despolimerasa de Lignina Un cultivo que contiene lignina de injerto de hongo de la roya blanca
T. cingulata fue constituido en una solución acuosa homogénea tal y como s« describe en Phytochemistry, 49, páginas 1203 a 1212 (1998) el cual está incorporado a la presente descripción en su totalidad como referencia. El cultivo de T. cingulata, pasó por una fase primaria de proliferización vegetativa. Durante la fase primaria de proliferación, la lignina del injerto pasó por la polimerización. Después de la fase de proliferación primaría, se observó la degradación de la lignina del injerto polimerizada en el cultivo de T. cingulata. Por lo tanto, después de que el cultivo de T. cingulata salió de la fase de proliferación primaria y cuando se hubo iniciado la despolimerización significativa de la lignina del injerto, la solución del cultivo fue filtrada a través de Mira-cloth (TM). Se le agregaron al filtrado inhibidores de proteasa de fluorurofenilmetanosulfonilo (PMSF) y Pepstatina A. El PMFS y la Pepstatina A tuvieron concentraciones finales aparentes de 1.0 mM y 0.05 mM, respectivamente. El filtrado fue almacenado durante un período de 16 a 24 horas, y posteriormente se filtró cualquier exceso sólido de PMSF y/o Pepstatina A que saliera de la solución. La solución fue concentrada utilizando una membrana de ultrafiltración Amicon PM-10 (TM), que se consigue en Milipore Corporation. Después de la concentración inicial, el filtrado fue equilibrado con de 10 a 15 volúmenes de regulador de M acetato 0.020 (pH 4.5) utilizando la membrana PM-10. El filtrado equilibrado del cultivo de T. cingulata fue concentrado de 30- a 80- dobleces utilizando la membrana de ultrafiltración PM-10 y cargada en el lado del ánodo de un gel de enfoque isoeléctrico de poliacrilamida anfolina con pH de 4.0 a 6.5 que se consigue en Amersham Pharmacia Biotech. Después de que se terminó el enfoque isoeléctrico, se identificaron dos proteínas con pls aparentes de 4.9 y aproximadamente 5.8 en el gel de enfoque isoeléctrico, y se electroeluyeron por separado a partir de los segmentos de gel de anfolina correspondientes utilizando un micro-electro eluyente de Amicon Centrilutor (TM) que se consigue en Milipor© Corporation de acuerdo con los métodos conocidos.
?4¡ ¿ .áa ii&d ^am?U^i?iuÉ?N^**~í*.'.-.~iít *. i .,.^. *,'..~*¿k*jtt¿x&~á&. Aá*Mh..t. aJajaL. Jm? Para aumentar la cantidad de la proteína recuperada, se colocaron varias rebanadas de gel de la proteína apropiada, por ejemplo, pl 4.9 ó pl 5.8 en forma vertical dentro de un número adecuado de tubos de microcentrífuga de 0.5 ml. Cada tubo de microcentrífuga tenía agujeros circulares estrechos perforados en la parte superior en el fondo del tubo. Cada tubo de microcentrífuga fue colocado entonces en un concentrador Amicon Centricon-10 (TM) adaptado con una membrana de ultrafiltración YM-10 en el punto arriba de la membrana YM-10. La unidad del concentrrador Centricon-10 fue pretratada con una solución acuosa de polietilénglicol al 5% durante un período de 12 a 16 horas y lavado con agua (destilada) antes de la electroelución. El ensamble completo de centricon-10 y tubo de microcentrífuga fue colocado entonces en el micro-electroeluyente entre las cámaras superior e inferior ambas, de las cuales llenadas con 30 M de solución reguladora de Tris-fosfato en un pH neutral, por ejemplo, un pH en un rango de aproximadamente 6.5 a aproximadamente 7.5. Los valores útiles de pH utilizados incluyen 7.0 y 7.2. El pH de la solución de electroelución fue supervisado durante la electroelución para asegurar que permaneciera estable. También, se removieron cualesquiera burbujas que aparecieron más allá de las membranas YM-10 en las unidades del concentrador, conforme se fueron formando. Las enzimas de despolimerización de lignina con pls aparentemente de 4.9 y aproximadamente 5.8 purificadas tal y como se describió anteriormente, fueron probadas en un gel SDS PAGE para estimar sus pesos moleculares respectivos. Los pesos moleculares aparentes de estas
proteínas fueron de 35,000 daltons cuando se operaron en gels SDS de poliacrilamida al 10%. Ejemplo 2, Aislamiento de la Lignina Polimerizada del Injerto El hongo de la roya blanca 7". cingulata se preparó de acuerdo con el método descrito en el ejemplo 1 , y se cultivó a través de la fase primaria de proliferación. Antes de que iniciara la despolimerización de la lignina del injerto, la solución del cultivo extracelular filtrada, se ultrafiltró con 10 volúmenes de acetato de 0.020 M acuoso en un pH de 4.5 a través de una membrana de ultrafiltración Amicon PM-10 que se consigue en Milipore Corporation. El pH del retenido se ajustó a un pH 13 con NaOH 0.50 M. El retenido fue diluido y pasó por la ultrafiltración adicional utilizando la membrana Amicon YM-100 (disponible en Milipore Corporation), en una solución de NaOH 0.10 M hasta que el filtrado que salía del aparato de filtración fue incoloro. Posteriormente se ajustó la solución del pH a aproximadamente 7.5, intercambiando la solución de NaOH en el aparato de ultrafiltración utilizando el doble de agua destilada. La solución de lignina polimerizada entonces fue centrifugada durante 20 minutos, a 47,900 x g para remover cualquier material particulado. Se congelaron alícuotas de la lignina polimerizada y luego se secaron por congelación. Ejemplo 3, Degradación de la Lignina del Injerto Polimerizado en
Solución Homogénea. Se prepararon alícuotas de la lignina del injerto polimerizado de acuerdo con el método del ejemplo 2, y se diluyeron en acetato 0.20 M en un pH de 4.5. Las muestras de proteína de las despolimerasas preparadas de acuerdo con el método del ejemplo 1 , fueron agregadas a la solución diluida de lignina del injerto. Se incubaron alícuotas a temperatura ambienté durante un período de 0 a 21 días. La prolongación de la despolimerización de la lignina del injerto fue medida utilizando cromatografía de exclusión por tamaños. Las muestras de las reacciones de despolimerización fueron cargadas en una columna Sephadex (TM) G-100 equilibradas con NaOH 0.10M. La elución de cada muestra fue supervisada en 280 nm utilizando un detector UV/visible adjunto a la columna G-100. La absorbancia fue monitoreada como función del volumen eluyente que salía de la columna G-100, la cual es una medición del peso molecular de los compuestos que salen de la columna. Como se ilustra en la figura 1 , la despolimerasa de lignina que tiene un pl de 4.9 despolimerizó la lignina del injerto polimerizado de alto peso molecular en un periodo de por lo menos 21 días. En la figura 1 , las muestras fueron probadas en 0.025 días, 5 días y 21 días. Como se ilustra en la figura 2, la despolimerasa de lignina que tiene un pl de 5.8 se despolimerizó en la lignina del injerto polimerizada de alto peso molecular en un período de por lo menos 10 días. En la figura 2, las muestras fueron probadas en los días 0.025, 5 días y 10 días. Tal y como se ilustra en la figura 3, la incubación de la lignina del injerto polimerizado de alto peso molecular sin despolimerasa de lignina no dio como resultado la despolimerización de la lignina del injerto en por lo menos 10 días. En la figura 3, las muestras fueron probadas en 1 día y 10 días. Como tales, ambos polopéptidos aislados de acuerdo con los métodos aquí descritos degradaron los componentes de la lignina del injerto de alto
peso molecular que habían sitio polimerizados anteriormente por el hongo de la roya blanca. Ejemplo 4, Deslignificación de la Pulpa del Injerto Se considera que las isoenzimas de despolimerasa de lignina son agentes catalíticos activos en la deslignificación del material café de pulpa del injerto de madera suave industrial por medio de la solución de cultivo de T. cingulata. Consultar la publicación de N. Nutsubidze y S. Sarkanen, en Proc. 9th Int'l Symp. Wood Pulp, Chem., G6 páginas 1 a 5 (1997), la cual está incorporada a la presente descripción como referencia. La solución del cultivo de T. cingulata tal y como se describió en el ejemplo 1 , fue preparada y se permitió que se desarrollara en un período de 30 a 35 días. Después de 30 a 35 días de incubación, el cultivo fue despolimerizando el subtrato de lignina del injerto en el medio de cultivo. Los cultivos de T. cingulata fueron conjuntados, filtrados a través de lana de vidrio, centrifugados en 36,000 x g durante 30 minutos, y filtrados esterilizados pasando el sobrenadante a través de un acrodisco de suero de 0.2 mieras (TM) (Gelman No. 4525). Se le agregó PMSF (concentración final de 0.13 g/L) a la solución esterilizada filtrada libre de células. Después de 16 horas, se filtró la solución que contenía el inhibidor de proteasa, para eliminar el inhibidor sólido restante y luego fue sometido a ultrafiltración utilizando un peso molecular nominal de 10,000 con la membrana de corte (PM-10 que se consigue en Amicon Corporation) utilizando veinte volúmenes de regulador de acetato 0.02 M (pH 4.5). El sobrenadante filtrado fue concentrado en tres potencias y luego eliminado de la celda de ultrafiltración.
•" S La pulpa de injerto de madera suave industrial sin blanquear, principalmente de pino Jack (Pinus banksiana), fue lavada con agua destilada, y luego se sometió al autoclave a una temperatura de 121 °C durante 30 minutos para lograr una pulpa esterilizada. La pulpa pasó por un 5 segundo lavado con agua destilada. El material café resultante fue extractado con NaOH 0.40 M acuoso durante 5 minutos a temperatura ambiente y lavado completamente con agua destilada. Las muestras de pulpa de injerto de madera suave (2.5 g, con una consistencia de 42%) fueron divididas en matraces cónicos individuales de 500 mL y se
10 sometieron al autoclave durante un segundo período a una temperatura de 121 °C. Estas muestras de 2.5 g del material café de la pulpa del injerto de madera suave esterilizada (consistencia del 42%) fue sumergido en alícuotas de 50 ml de solución de cultivo de T. cingulata libres de células
15 concentrada a 3 dobleces a la cual se le había agregado dinucleótido de flavina adenina (FAD) para llegar a la concentración final de FAD de 1.6 x 10'4 M. El FAD había sido esterilizado pasando una solución del material a través de un acrodisco de suero de 0.2 mieras que se consigue en (Gelman Sciences (No. 4525). Aunque no se requería el FAD y su uso no significa
20 que indica un modo de acción particular, el FAD fue agregado para facilitar la rotación de la enzima. Las mezclas resultantes fueron incubadas sin agitación a temperatura ambiente en matraces cónicos de 500 ml. La boca de cada matraz fue equipada con un tapón de neopreno adaptado con un tubo de vidrio, dentro
25 del cual se había insertado de manera suelta un tapón de lana de vidrio para
permitir el intercambio de a« , Los números Kappa de la medición de la deslignificación de la pulpa fueron determinados entonces de acuerdo con el Método de Prueba TAPPI T236 cm-85, el cual está incorporado a la presente descripción en su totalidad como referencia. Después del lavado completo de la pulpa con agua destilada antes y después de la extracción durante 5 minutos utilizando 30 ml de una solución de NaOH 0.10 M a temperatura ambiente. El número kappa del material café de pulpa de injerto de madera suave fue reducido en un 50% después de un solo tratamiento de las muestras de la pulpa de esta manera con la solución de cultivo de T. cingulata y libre de células. Otras modalidades se encuentran dentro de las siguientes reivindicaciones.