MXPA01010940A - Proceso y producto para mejorar la respuesta inmunitlaria en animales de compania, usando una combinacion de antioxidantes. - Google Patents

Abstract

Un proceso para alimentar un animal de compania tal como un perro con una dieta que contiene una cantidad efectiva de una combinacion de antioxidantes para mejorar la respuesta inmunitaria y mejorar la salud general del animal, se proporciona. De manera preferente, la dieta incluye desde aproximadamente 175 a aproximadamente 400 IU de vitamina E por kilogramo de dieta de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 mg/dia de luteina y de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 mg/dia de ?-caroteno.

Description

PROCESO Y PRODUCTO PARA MEJORAR LA RESPUESTA INMUNITARIA EN ANIMALES DE COMPAÑÍA, USANDO UNA COMBINACIÓN DE ANTIOXIDANTES 5 Esta invención se refiere a un proceso y a un producto para mejorar la respuesta inmumtaria y mejorar la salud general de los animales de compañía tal como perros, y de manera más particular, a un proceso y producto que proporciona cantidades benéficas 10 de antioxidantes en la dieta del animal. En los años recientes, ha habido un interés creciente en el beneficio con respecto a la salud de los antioxidantes. Los antioxidantes son nutrientes que contrarrestan el efecto de las especies reactivas de 15 oxigeno (también conocidos como radicales libres) . Estas moléculas perjudiciales son sub-productos del metabolismo normal. Los nutrientes antioxidantes contrarrestan los efectos de los radicales libres al unirse a estas moléculas, al neutralizarlas, y al 20 removerlas del cuerpo. La depuración ineficiente de los radicales libres se ha implicado en la provocación de daño a humanos, que se cree que da por resultado ciertas enfermedades tal como la enfermedad de Alzheimer, enfermedad autommuni taria , cáncer, 25 enfermedad cardiovascular, cataratas, diabetes, degeneración macular, esclerosis múltiple, distrofia muscular, pancreatitis, enfermedad de Parkinson y artritis reumatoide. El daño provocado por la acumulación de estos radicales libres puede ser responsable del proceso de envejecimiento puesto que la acumulación de estos radicales libres durante el tiempo provoca la supresión de la respuesta inmunitaria que se presenta con la edad, dando por resultado una incidencia incrementada de la enfermedad dentro de la población de ancianos. Los nutrientes antioxidantes son una clasificación para una variedad de compuestos con un papel similar de neutralización de los peligrosos radicales libres. Pueden incluir vitaminas comúnmente conocidas tal como vitamina A, vitamina C y vitamina E. Ver, por ejemplo, EP 845216, que describe una composición para la administración a animales que contiene vitamina E y otros antioxidantes opcionales. Los antioxidantes también incluyen otros compuestos que se clasifican como carotenoides. Los ejemplos de los carotenoides incluyen ß-caroteno, luteína, astaxantina, cantoxantina y licopeno. Estos compuestos son responsables del desarrollo de la pigmentación verde, amarilla, naranja y rosa encontrada en las frutas, flores y vegetales. Estos carotenoides se conoce que juegan un papel importante en la modulación del sistema inmunitapo (por ejemplo, se ha encontrado que la cantaxantina previene la carcmogénesis inducida por productos químicos, en ratones así como incrementa la proliferación de lmfocitos en ratas) . Se ha encontrado que la astaxantina y el ß-caroteno incrementan la respuesta de anticuerpos ex vivo de esplenocitos de ratón a antígenos T-dependientes . Ver también, publicación de PCT WO 98/44808, que describe una dieta para animales de compañía que contiene ß-caroteno. Se ha encontrado que la luteína dietética mejora la proliferación de linfocitos en los esplenocitos de ratón. Los beneficios de los antioxidantes individuales también se han estudiado en hoyos. Ver Haq et al., "Effect of ß-carotene, Canthaxanthm, Lutein and Vitamin E on Neonatal Immunity of Chicks When Supplemented in the Broiler Breeder Diets", 1996 Poul try Sci ence . Aunque estos compuestos se clasifican todos como antioxidantes , ha llegado a ser evidente que no funcionan de la misma manera. Por ejemplo, los estudios históricos en humanos muestran que las poblaciones que consumen dietas con alto contenido de antioxidantes (es decir, alto insumo de frutas y vegetales) tienen una menor incidencia de cáncer en comparación a los otros grupos de gente. Sin embargo, los estudios clínicos que proporcionan complementación con antioxidantes tal como vitamina E o ß-caroteno no proporcionan únicamente la misma magnitud de protección. Se cree, actualmente, que un beneficio de salud de humanos de los nutrientes antioxidantes puede ser a través de una combinación de varios antioxidantes diferentes a bajos niveles en lugar de un antioxidante a altos niveles. Aunque el perro no ha evolucionado en una dieta a base de altas cantidades de frutas y vegetales, caza y come pequeños herbívoros que consumen plantas que tienen altas concentraciones de estos compuestos. Por lo tanto, es posible que las necesidades de los perros para los antioxidantes hayan evolucionado de forma natural. Por consiguiente, existe una necesidad en la técnica de proporcionar antioxidantes benéficos en la dieta de un animal de compañía tal como un perro para proporcionar beneficios de salud. La presente invención proporciona un proceso para alimentar un animal de compañía tal como un perro, con una dieta que contiene una cantidad efectiva de una combinación de antíoxidantes para mejorar la respuesta inmunitaria y mejorar la salud general del animal. De manera preferente, el animal se alimenta con una dieta que incluye una combinación de vitamina E, luteína, y ß-caroteno. Este paquete de antioxidantes proporciona al animal desde aproximadamente 175 a aproximadamente 400 IU de vitamina E por kilogramo de dieta, de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 mg/día de luteína y de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 mg/día de ß-caroteno. Esta dieta se ha encontrado que optimiza células inmunitarias en perros así como incrementa el conocimiento de vacunas en perros. Por consiguiente, es una característica de la presente invención proporcionar un alimento para mascotas y un proceso para mejorar la respuesta ínmunitapa y mejorar la salud general de los animales de compañía tal como perros y al proporcionar una cantidad efectiva de una combinación de antioxidantes en la dieta del animal. Esta, y otras características y ventajas de la presente invención, llegarán a ser evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, los dibujos anexos, y las reivindicaciones anexas. La Figura 1 es una gráfica de la concentración de anticuerpos en perros (mg/dl) contra los mg/kg de dieta de beta-caroteno; y La Figura 2 es una gráfica que ilustra el efecto de la luteína de dieta en el reconocimiento de vacunas en el perro . La presente invención proporciona un proceso ÁmlÁÁÉíi áíét.mÁ.i »^^£ -. ,i&t.?r <,a»a ^a^^»^«afr^atowSafc-fiA.#»f a «faaafc é afcá>* «i.» para alimentar un animal de compañía tal como un perro con una dieta que contiene una combinación de antioxidantes para mejorar la respuesta inmunitaria y mejorar la salud general del animal. La combinación de antioxidantes se puede proporcionar al animal ya sea como un complemento o estar contenida en un alimento dietético al animal. Este complemento puede estar en la forma de una pildora o cápsula, o un banquete o una galleta, o cualquier otra forma comestible. Por "dieta", se quiere decir el alimento o bebida consumido regularmente por el animal . Al usar una combinación de antioxidantes, se cree que se proporcionan los beneficios de salud a muchas áreas del sistema inmunitario, por ejemplo, activación optimizada de células inmuní tarias , niveles incrementados de anticuerpos, y reconocimiento mejorado a vacunas. La dieta puede ser cualquier fórmula de alimento para mascotas, adecuada que también proporcione una adecuada nutrición para el animal. Por ejemplo, una dieta canina típica para el uso en la presente invención puede contener aproximadamente 18-40 % de proteína cruda, aproximadamente 4-30 % de grasa y aproximadamente 4-20 % de fibra dietética total. Sin embargo, no se requieren relaciones o porcentajes específicos de estos u otros nutrientes. La combinación de antioxidantes se puede mezclar con esta dieta para proporcionar las cantidades benéficas necesarias. A fin de que la invención se pueda entender más fácilmente, se hace referencia a los siguientes ejemplos que se proponen para ilustrar la invención, pero no limitar el alcance de la misma.

Ejemplo 1 Vitamina E Veinte perros Beagle jóvenes (con un promedio de edad de 2 años) y 20 adultos (promedio de edad de 9.2 años) se alimentaron con una dieta a base de pollo/maíz, comercial, normal formulada para contener 27 IU/Kg de dieta de vitamina E (recomendación de NRC) (dieta de control) durante un mes antes del comienzo del experimento a fin de estabilizar los niveles de vitamina E de los perros. Los perros jóvenes y adultos luego se asignaron al azar a las dietas que contienen 27 IU/kg de dieta de vitamina E o 280 IU/kg de dieta de vitamina E durante 8 semanas. Se recolectó sangre antes y después de 8 semanas de los tratamientos dietéticos para las mediciones de los niveles plasmáticos de vitamina E y la valoración de la respuesta mitogénica de linfocitos a ConA ( concanavalina A) y PHA ( fitoemaglutimna) . Antes del tratamiento dietético y similar a otras especies, los perros adultos tuvieron una respuesta mitogénica significativamente menor a PHA y ConA que los perros jóvenes. De manera sorprendente, hubo una disminución significativa en el nivel plasmático de vitamina E de los perros jóvenes y adultos alimentados con 27 IU/Kg de dieta de vitamina E con los perros jóvenes que exhiben un mayor porcentaje de disminución (35 % en perros adultos contra 50 % en jóvenes, P = 0.12) . El examen del contenido de vitamina E del alimento comercial alimentado a los perros de estudio antes de su arribo a la instalación indicó que en promedio, el alimento comercial contuvo 60 IU/kg de dieta de vitamina E. De esta manera, una declinación en los niveles plasmáticos de vitamina E se puede atribuir a los niveles inferiores de vitamina E en la dieta de control en comparación a aquel del alimento comercial para perros. Tanto los perros jóvenes como adultos complementados con vitamina E mostraron un incremento significativo en los niveles plasmáticos de vitamina E, con los perros jóvenes que exhiben un por ciento significativamente mayor de incremento que los perros adultos (20 % en adultos contra 50 % de incremento en perros jóvenes, P = 0.02) . Los perros jóvenes alimentados con la dieta de 27 IU/Kg de vitamina E también tuvieron una disminución significativa en la proliferación estimulada con ConA y PHA durante el periodo de alimentación de 8 semanas. No se observó esta disminución en perros complementados con dieta de 280 IU/kg de vitamina E. Los perros adultos alimentados con la dieta de 27 a 280 IU/kg de vitamina E no mostraron cambios significativos en la proliferación de linfocitos estimulada con mitógenos. ß-caroteno Perros Beagle hembras (de 18 a 19 meses de edad; de 7 a 9 kg de peso corporal) se alimentaron con una dieta basal (The lams Co . , Le isburg, OH) que cumple o excede los requerimientos para todos los nutrientes esenciales. Los animales se alojaron en interiores en cuartos con luz (14 horas de luz; 10 horas de oscuridad) y temperatura controladas. Se llevó a cabo un estudio para estudiar el perfil de absorción de ß-caroteno después de una dosis oral individual de ß-caroteno . Para estudiar la absorción de ß-caroteno oral en perros a los que se les dio una dosis individual de ß-caroteno oralmente, a los perros (n = 6/ tratamiento) se les dio una vez de manera peroral 0, 50, 100 o 200 mg de ß-caroteno (10 % disolvible en agua fría; BASF Corp., Ludwigshafen, Alemania) . La dosis apropiada de ß-caroteno se disolvió^ ' én 5 ml de agua alimentada oralmente al usar una jeringa de alimentación. A fin de establecer tiempos de muestreo apropiados, se usaron dos perros en un estudio preliminar. Estos perros se alimentaron una vez con 50 mg de ß-caroteno y se muestreo sangre a 0 (inmediatamente antes de la alimentación de ß-caroteno), 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 y 24 horas . Se separó el plasma sanguíneo por centrifugación y se analizaron las concentraciones de ß-caroteno usando cromatografía líquida de alto desempaño (HPLC) como sigue. Todos los procedimientos se llevaron a cabo bajo luz dim. Se extrajeron alícuotas en duplicado de plasma, cada homogenado de leucocitos, y cada fracción subcelular de leucocitos, con una mezcla 1:1 de éter dietílico y éter de petróleo en la presencia de BHT. La fase de éter se removió y secó ba o una corriente de nitrógeno. El residuo se reconstituyó en fase móvil para la determinación por HPLC de ß-caroteno. Se inyectaron muestras (50 µl ) en una columna de fase invertida C-18 esférica de 5 µm (3- 9 x 150 mm, Resolve) y se eluyó con una mezcla 47:47:6 (v/v/v) de acetonitrilo, metanol, y cloroformo a una velocidad de flujo de 1.0 ml/min. Los resultados de este ejemplo mostraron concentraciones pico de ß-caroteno que se presentan entre las 3 y 6 horas después de la dosificación y fueron indetectables a las 24 horas. Subsecuentemente, se muestreo sangre de los perros restantes en los mismos periodos de tiempo. Se separó de manera similar el plasma y se analizó por HPLC. Las concentraciones de ß-caroteno plasmáticos fueron indetectables en perros no complementados en todos los periodos de tiempo estudiados. En contraste, hubo un incremento dependiente de la dosis (P < 0.01) en el ß-caroteno plasmático en perros a los que se les dio una dosis oral de ß-caroteno. Se observaron concentraciones pico a las 6 horas después de la dosificación y fueron consistentes en todos los grupos de tratamiento. Posteriormente, hubo una disminución rápida (P < 0.01) en las concentraciones de ß-caroteno en todos los perros complementados con ß-caroteno. Las concentraciones fueron mdetectables a las 24 horas después de la dosificación. La vida media del ß- caroteno plasmático fue de aproximadamente 3 (dosis de 50 y 100 mg) a 4 (dosis de 100 mg) horas. Las concentraciones pico de ß-caroteno sanguíneo se presentaron tempranamente en perros que en gatos (ver Ejemplo 4 y 5, posteriores) . También, la concentración de ß-caroteno en el plasma de los perros es de aproximadamente 10 a 16 veces menor que aquella observada en los gatos después de ajustar las diferencias en el peso corporal. En un segundo estudio, los perros (n = 6/ tratamiento) se alimentaron diariamente a 08000 hr durante 7 días consecutivos con 0, 12.5, 25, 50 ó 10 mg de ß-caroteno. El ß-caroteno se condimentó desde arriba en el alimento y se alimentó en la comida de la mañana. Se muestreo la sangre una vez diariamente en el día 0 (inmediatamente antes de la primera dosis) y subsecuentemente a 6 horas después de cada dosificación (días 1 hasta 7) . Este tiempo de muestreo de sangre se eligió en base a los resultados obtenidos en el Ejemplo 1 que mostraron concentraciones pico de ß-caroteno a 6 horas después de una dosis. Se aisló el plasma y se analizó para concentración de ß-caroteno. La dosis diaria de los perros con ß-caroteno durante 7 días produjo un incremento dependiente de la dosis (P < 0.01) en el ß-caroteno en circulación. Los perros alimentados con 100 mg de ß-caroteno mostraron el incremento más pronunciado en las concentraciones diarias del ß-caroteno plasmático. Las concentraciones pico (18 µg/L) de ß-caroteno plasmático en el día 1 en los perros alimentados con 100 mg de ß-caroteno en este ejemplo fue similar a aquel observado en el primer estudio. Las concentraciones de ß-caroteno plasmático después de la última dosis fueron en general 2.5 a 4 veces mayores que aquellas observadas después de la primera dosis. Se diseñó un tercer estudio para estudiar la absorción de ß-caroteno en perros por los linfocitos sanguíneos. Los perros (n = 8 /tratamiento) se alimentaron con 0, 50 o 100 mg de ß-caroteno diariamente durante 30 días. Se muestreo la sangre de todos los perros vía la vena yugular en los días 10, 20 y 30. Se separaron los linfocitos y neutrófilos sanguíneos por centrifugación con gradiente de densidad. Se enumeraron los números celulares. Se redispersaron los linfocitos y neutrófilos en PBS que contiene ascorbato de sodio al 3 % como un antioxidante. Se trató con sonido a una alícuota de la suspensión celular durante 30 segundos para desestabilizar las células. Los homogenados de linfocitos se extrajeron para el análisis de HPLC de ß~ caroteno . En el día 30, se tomó una alícuota mayor de sangre y las suspensiones de leucocito se prepararon como se describe anteriormente para el fraccionamiento subcelular subsecuente. Las células se desestabilizaron or tratamiento con sonido durante 20 segundos en 5 volúmenes de sacarosa 0.25 M. Se adicionó ascorbato ^ sodio como el antioxidante. El homogenado se centrifugó (600 x g durante 10 minutos a 4°C) y el sedimento nuclear se separó del sobrenadante. El sobrenadante post-nuclear se centrifugó (17,300 x g durante 20 minutos a 4°C) para separar la fracción mitocondrial. El sobrenadante post-mitocondrial se centrífugo (102,000 x g durante 60 minutos a 4°C) para separar la fracción microsomal de la citosólica. Cada fracción subcelular se analizó para el contenido de ß-caroteno por HPLC. En el día 0 (antes de la complementación con ß-caroteno), fueron indetectables en todos los perros las concentraciones de ß-caroteno en los linfocitos de la sangre periférica. También, el ß-caroteno en Jos linfocitos de los perros no complementados permaneció indetectable a todo lo largo del estudio. En contraste, las concentraciones de ß-caroteno en los linfocitos de perros alimentados con ß-caroteno se incrementaron en general (P < 0.01) de una manera dependiente del tiempo. No hubo diferencia significativa en el tratamiento en las concentraciones de ß-caroteno en los linfocitos cuando se comparan perros alimentados con 50 mg de ß-caroteno contra 100 mg de ß-caroteno. No se puede detectar ß-caroteno en las varias fracciones subcelulares de los linfocitos obtenidos de perros no complementados. En contraste, el ß-caroteno se tomo por todas las fracciones subcelulares de los linfocítos sanguíneos aislados de los perros complementados con ß-caroteno. La fracción de citosol dio cuenta de 52 a 62 % del ß-caroteno total en los linfocitos en tanto que los núcleos contuvieron la cantidad más baja (de 6 a 8 %) del ß-caroteno total. Las mitocondrias (de 14 a 17 %) y las microsomas (de 16 a 23 % ) fueron intermedios entre el citosol y los núcleos. La dosis del ß-caroteno de dieta no tuvo una influencia significativa en la absorción con ß-caroteno por las fracciones subcelulares en el día 30 de alimentación. Los resultados muestran que el ß-caroteno se tomó por todas las fracciones subcelulares de linfocitos. Sin embargo, el ß-caroteno fue más alto en el citosol . Como con los linfocitos, los neutrófilos sanguíneos toman de manera similar ß-caroteno. Sin embargo, diferente de los linfocitos, la absorción máxima se presentó en el día 10, sin incremento adicional en las concentraciones de ß-caroteno de los neutrófilos, observadas en el día 30. El citosol, mitocondrias y microsomas de los neutrófilos sanguíneos también mostraron absorción significativa de ß- caroteno. En contraste, no se detectó ß-caroteno en los núcleos. Como con las fracciones subcelulares de IOS linfocitos sanguíneos, el ß-caroteno fue el más alto (61 a 68) en la fracción citosólica de los neutrófilos sanguíneos. No se observó un efecto significativo de la dosis . En un cuarto estudio, Beagle hembras (de 4 a 5 meses de edad) se complementaron diariamente con 0, 25, 50 o 100 mg de ß-caroteno para estudiar el papel de ß-caroteno de dieta en el mejoramiento de los sistemas inmunitarios mediados por células y humorales del perro. Se valoraron los siguientes parámetros en todos los animales o en los linfocitos de la sangre periférica: (1) hipersensibilidad tipo retrazada (DTH) contra PHA (inmunidad no específica) y vacuna (inmunidad específica), (2) proliferación de linfocitos, (3) poblaciones de linfocitos y (4) inmunoglobulmas (Ig) . La complementación con ß-caroteno incrementó las concentraciones plasmáticas de ß-caroteno de una manera dependiente de la dosis, pero no tuvo influencia en el retmol o a-tocoferol plasmático. Estos cambios reflejaron en general la respuesta de DTH tanto a los antígenos específicos (vacuna) y no específicos (PHA) . La respuesta más grande a la estimulación de PHA se observó en perros alimentados con 50 mg de ß-caroteno en tanto que los perros alimentados ya sea con 20 ó 50 mg de ß-caroteno mostraron una respuesta de DTH significativamente mayor a la vacuna. La ipersensibilidad tipo retrazada es estrictamente una reacción celular que comprende células T y macrófagos sin la implicación de un componente de anticuerpo. Las células que presentan el antígeno (por ejemplo, macrófagos) presentan el antígeno o alérgeno a células T que llegan a estar activadas y liberan limfocinas . Estas linfocinas activan los macrófagos y provoca que lleguen a ser aniquiladores voraces de los invasores extraños. Por lo tanto, los datos muestran una respuesta creada por células, elevada, con perros alimentados con ß-caroteno. La alimentación con ß-caroteno también produjo cambios significativos en los subconjuntos de linfocitos. En comparación a los controles, los perros alimentados con 20 ó 50 mg de ß-caroteno tuvieron una población elevada de células CD4+ (semana 8) . Los perros alimentados con 20 mg de ß-caroteno tuvieron también una población elevada de células CD8 en las semanas 2 y 4. Las células T se pueden clasificar de acuerdo a la expresión de las moléculas de membrana CD4. Las funciones CD4 como una molécula de adhesión y como un co-receptor de co-sefíalización . Juega un papel en la activación de células T. Los linfocitos T de CD4+- reconocen en antígeno en asociación con las moléculas de MHC clase II y funcionan grandemente como células auxiliares. El incremento en la población de células auxiliares T en este estudio puede explicar el incremento correspondiente en la respuesta de DTH en perros alimentados con 20 a 50 mg de ß-caroteno. Las concentraciones de IgG, IgM y IgG total se incrementaron significativamente en los perros alimentados con ß-caroteno tan tempranamente como 1 semana después de la complementación dietética. Los incrementos en Ig fueron dependientes de la dosis para perros alimentados con 0 a 20 mg de ß-caroteno. El nivel más alto de ß-caroteno (50 mg) no produjo un incremento adicional. Los perros alimentados con 20 mg de ß-caroteno tuvieron consistentemente la respuesta de anticuerpos más grande para ambas y Ig. Una de las funciones principales del sistema inmunítario es la producción de anticuerpos que circulan libremente para proteger el cuerpo contra materiales extraños . Los anticuerpos sirven para neutralizar las toxinas, inmovilizar ciertos microorganismos, neutralizar la actividad viral, aglutinar microorganismos o partículas de antígeno y precipitar antígenos solubles.

La alimentación con ß-caroteno no tiene influencia en la blastogénesis de linfocitos, inducida por mitógeno y en la producción de IL-2. Los linfocitos están comprendidos en la inmunidad mediada por células. En el reconocimiento de un antígeno, los linfocitos se dividirán rápidamente, clonándose por si mismo de este modo en la preparación para combatir una invasión potencial. En las respuestas inmunitarias, humorales, la IL-2 se estimula tanto las células auxiliares T como las células B para proliferar en respuesta a antígenos. Se requiere la expansión clonal de células T activadas con antígeno o mitógeno. En la respuesta inmunitaria mediada por células, la IL-2 activa las células aniquiladoras naturales, estimula la proliferación de los timocitos e induce la actividad citotóxica de células T. En base a los resultados de estos experimentos, los perros absorben una cantidad significativa de ß-caroteno a partir de la dieta y transfieren el ß-caroteno en los organelos subcelulares de las células inmunitarias y los fagocitos. En estas células, el ß-caroteno parece mejorar el sistema inmunitario del perro a través de las repuestas inmunitarias mejoradas, mediadas por células (respuestas de DTH, cambio en los subconjuntos de linfocitos) y respuesta humoral (producción de IgG e IgM) .

Luteína Cincuenta y seis perros Beagle hembras (de 17 a 18 meses de edad; con un peso corporal promedio de 11.4 ± 0.4 kg) . Se asignaron aleatoriamente para ser complementados diariamente con 0, 5, 10 o 20 mg de luteína durante 17 semanas. La luteína contuvo 76.66 % de luteína y 5.23 % de zeaxantma. El complemento de luteína se pre-dispersó en aceite de soya a la concentración apropiada y un mL administrado peroalmente a 0800 h diariamente. Se ofreció alimento (200 g/perro/d) inmediatamente después de la complementación con luteína. La dieta basal cumple o excede los requisitos de todos los nutrientes esenciales (NRC 1985). Todos los perros se alojaron en corrales de 2 x 2 m (2 perros/corral) en una instalación con temperatura (20 a 22°C) y luz (14 horas de luz) controladas. Se registró el peso corporal en la semana 0 , 6 y 12. Se recolectó sangre por punción en la vena yugular en tubos evacuados, tratados con heparina, en la semana 0, 2, 4, 8 y 12 y las alícuotas se usaron para análisis de HPLC y para la valoración de las respuestas inmunitarias.

Extracción y análisis por HPLC Se extrajo el plasma para análisis de luteína, zeaxantina, retinol y a-tocoferol. De manera breve, se precipitó la proteína plasmática al adicionar un volumen igual de etanol que contiene 0.1 % de hidroxitolueno butilado (BHT) (Aldrich Chemical Co . , Milwaukee, Wl ) . La mezcla se extrajo con 5 mL de una mezcla 1:1 de éter de petróleo : éter dietílico anhidro. El residuo secó se redisperso en una fase móvil que consiste de una mezcla 47:47:6 (v:v:v) de acetonitrilo grado HPLC :metanol : cloroformo (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ) . Se cuantificaron la luteína, zeaxantina y a-tocoferol al comparar el área bajo la curva en tanto que se cuantificó el retinol usando la altura pico. La identidad de los compuestos eluidos se confirmó al comparar su espectro de absorción con aquel de las normas puras . Debido a que no se logró la separación de línea base de luteína de zeaxantína, las concentraciones plasmáticas se reportaron como luteína + zeaxantina.

Respuesta de hipersensibilidad tipo retrazada Se valoró la respuesta de endurecimiento de piel en todos los perros a la semana 0, 6, y 12. Los perros se inyectaron intradérmicamente en el área f flanco con solución salina (8.5 g/L; control), una vacuna polivalente atenuada que contiene virus de moquillo canino, adenovirus canino tipo 2, virus de parainfluencia canino y parvovirus (Vanguard 5, Smithkline Beacham, West Chester, PA; antígeno específico), y PHA (0.5 g/L; antígeno no específico). La dosis de vacuna y PHA usadas se determinaron previamente para proporcionar una respuesta óptima a la piel en los perros Beagle de edad similar. El sitio de inyección se esquiló y enjuagó con alcohol etílico al 70 %. El volumen de inyección fue de 100 µl . El endurecimiento de la piel se midió a 0, 24, 48 y 72 horas después de la inyección con la ayuda de un micrómetro digital sensible a presión (Mitsutoyo, Tokio, Japón) y se expresa la respuesta como un porcentaje del espesor de la piel medido a 0 h.

Proliferación de linfocitos La sangre recolectada en la semana 0, 2, 4, 8 y 12 se usó para valorar la proliferación de linfocitos inducida por mitógeno por las células mononucleares de la sangre periférica (PBMC) . Se usó el cultivo de sangre entera a fin de imitar las condiciones ín vivo. Los mitógenos usados fueron fi tohemaglutinina (PHA) , con canavalina A (Con A) y mitógeno de hierva de carmesí (PWM) . La sangre entera se mezcló completamente y luego se diluyó 1:12 con RPMI-1640 que contiene 25 mM de Hepes, penicilina (100 U/mL) y estreptomicina (100 µg/Ml) (Sigma, St. Louís, MO) . Los estudios preliminares usando la sangre no diluida y la sangre diluida 1:2, 1:4, 1:8, 1:12 y 1:16 mostró una respuesta proliferativa óptima de PBMC con una dilución de 1:12. Se pipetearon volúmenes de 150 µl en triplicado en placas de fondo redondo de 96 cavidades y se adicionaron 50 µl de los mitógenos apropiados. Las concentraciones finales de los mitógenos en cultivo fueron de 2 y 10 µg/ml para PHA, 1 y 5 µg/mL para Con A y 0.5 y 2.5 ug/mL para PWM. Las dos concentraciones de mitógeno dieron respuestas proliferativas máximas (la más alta concentración de mitógeno) y sub-óptimas (la menor concentración de mitógeno) en estudios preliminares usando sangre a partir de animales similares. La mezcla se incubó durante 72 horas a 37°C en un incubador o humidificado bajo una atmósfera de C02 al 5 % . Cuatro horas antes del término del periodo de incubación, se adicionaron 20 µl de [3H]- timidina (1 [µCi /cavidad] . Las células se recolectaron en filtros de fibra de vidrio y se contó la radioactividad por escintilación líquida. La respuesta de proliferación de PBMC se expresó como el índice de estimulación (cpm de cultivos estimulados/cpm de cultivos no estimulados).

Subconjuntos de lmfocitos Se separaron leucocitos sanguíneos usando Histopaque-1119 (Sigma, St. Louis MO) . Las células se lavaron tres veces con solución salina amortiguada con fosfato (PBS, pH 7.4) y los eritrocitos contaminantes se lisaron en NH4C1 (8.4 g/L) . Los subconjuntos de linfocitos se determinaron por citrometría de flujo (FACScan, Becton Dickinson, San José, CA) . Se redispersaron las células mononucleares aisladas a 1 x 107 células/mL en PBS complementado con suero libre de gamma-globulina al 2 %, suero de cabra al 5 % y 0.2 g/L de azida sódica. Para el análisis de inmunofluorescencia , se incubaron un total de 5 x 105 durante 30 minutos en hielo con concentraciones óptimas de anticuerpo monoclonal anti-canino de ratón (mAb) . Los mAb usados fueron específicos para los siguientes subconjuntos de linfocitos: células T totales (anti- CD5 ) , células auxiliares T (anti-CD4), células citotóxicas/supresoras T (anti-CD8), linfocitos que expresan el complejo de histocompatibilidad principal (antígeno de la clase II de MHQ (anti-MHC clase II) , y células B (ant?-CD21) . Las células luego se lavaron tres veces y se incubaron con un anticuerpo secundario, IgG+IgM (H+L) (Caltag, Burlmgame, CA) anti-ratón de F(ab')2 de cabra conjugado con isotiocianato de fluorescema (FITC) durante 30 minutos en hielo para visualizar los mAb unidos. Las células teñidas se fijaron en paraformaldehido al 4 % en la preparación para la adquisición. Se incluyeron controles negativos apropiados para corregir la fluorescencia de fondo. Los datos se expresaron como el porcentaje de células de tinción positiva corregida para células teñidas de manera no específica con el anticuerpo secundario.

Citotox c dad de Células NK Se usaron células de adenocarcmoma de tiroides canino como células objetivo en la valoración de la actividad citotóxica de células NK . Esta línea celular se mostró previamente que es susceptible a la aniquilación por las células NK caninas. Las células objetivo se cultivaron en un matraz T75 con 20 mL de medio esencial mínimo (MEM; Sigma Chem. Co., St, Louis, MO) complementado con suero de becerro fetal al 10 % (FC S) , 100 U/mL de penicilina y 100 µg/mL de estreptomicina. Cuando estuvo confluente, las células objetivo se tripsmizaron, se lavaron tres veces y redispersaron a 5 x 105 células/mL en medio completo (RPMI-1640 + FCS al 10 % + 100 U/mL de penicilina + 100 ug/mL de estreptomicina) . Se pipetearon alícuotas de 100 µL en triplicado de las células objetivo en placas de fondo en U de 96 cavidades (Costar, Cambridge, MA) y se incubaron durante 8 horas para permitir la adherencia celular. Los linfocitos (células efectoras; 100 µl ) aislados por separación percoll (como se describe anteriormente) luego se adicionaron a las células objetivo para proporcionar una relación de célula efectora : objetivo (E:T) de 10:1. Después de 10 horas de incubación a 37°C, se adicionaron 20 µl de un sustrato que contiene 5 ug de bromuro de 3- (4, 5- d?metilt?azol-2-il) -2 , 5-difeniltetrazolio (MTT). La mezcla se incubó durante 4 horas a 370°C después de lo cual se removió el MTT no metabolizado por aspiración. Los cristales de formazan se disolvieron al adicionar 200 µL de etanol al 95 %. Se midió la densidad óptica a 570 mL usando un lector de microplaca. El porcentaje de lisis específica de células NK se calculó como sigue: Citotoxicidad específica (%) = 100 x {l-[(OD de células objetivo y células efectoras-OD de células efectoras ) / (OD de células objetivo)]}.

Producción de IL-2 La sangre entera se diluyó 1:2 con RPMI-1640 complementado con Hepes y antibióticos (descritos anteriormente) y 400 uL de sangre diluida se pipetearon en placas de 48 cavidades (Costar, Cambridge, MA) . Las células se estimularon con PHA _400 µl_ de una solución de 5 µg/ml) durante 48 horas a 3702C en una atmósfera de C02 al 5 % . Las placas se centrifugaron a 200 x g durante 10 minutos y el sobrenadante se congeló a - 802C. El contenido de IL-2 del sobrenadante de cultivo se determinó en triplicado por ELISA (Intergen, Purchase, NY . La IL-2 anti-humana políclonal se hizo reaccionar en forma cruzada con IL-2 canina e IL-2 humana recombinante se usó como la norma.

IgG e IgM de suero El suero recolectado en la semana 0, 2, 4, 8 y 12 se analizó para las concentraciones de IgG e IgM por inmunodifusión radial individual (SRID) . Además, todos los perros se vacunaron con la vacuna polivalente (Vanguard 5, Smithkline Beacham, West Chester, PA) en la semana 13 y nuevamente en la semana 15 para estudiar el posible efecto antecedente de la luteína dietética. La sangre se recolectó semanalmente desde la semana 13 hasta la semana 17. El antisuero de cabra a IgG canina (10 % , molécula entera) o IgM (7.5 %, µ específico de cadena) (ICN, Aurora, OH) se mezcló con agarosa fundida (10 g/L en PBS; Sigma Chem. Co . , St. Louis, MO) y la mezcla solidificó en placas de SRID . Volúmenes de 5 µL en duplicado de suero o IgG (0, 2.88, 5.75, 11.5 y 23.0 mg/ml) o IgM (0, 0.25, 0.5, 1.0 y 2.0 mg/ml) de normas se cargaron en las cavidades . Después de la incubación durante 24 horas a temperatura ambiente en una cámara humidificada , se midieron los diámetros de los anillos usando un vector de SRID (Transidyne General Corp., Ann Arbor, MI) .

Ensayo de peroxidación de lípidos (TBARS) Se determinó la actividad de la peroxidación de lípidos en plasma al medir la producción de alondialdehído (MDA) . La norma usada fue 1,1,3,3- tetrametoxipropano JMP) (Sigma Chem. Co . , St Louis, MO) . Se pipetearon muestras de plasma de 500 µl en duplicado en tubos de vidrio de 15 L y 3 mL de ácido fosfórico 10 g/L y 1 ml de solución de TBA 6 g/L se adicionaron. La mezcla se hirvió en un baño de agua durante 45 minutos. Se dejó que los tubos se enfriaran y se extrajo el complejo de TBA-MDA con 4 ml de n- butanol . La capa de butanol se separó por centrifugación a 1,000 x g durante 10 minutos y se midió la absorbancia a 532 nm (Beckman, Fullerton, CA) . La actividad de TBARS se expresó en nmol MDA/L de plasma .

Estadísticas Se analizaron los datos por ANOVA de gráfica dividida usando el modelo lineal general de SAS. El modelo estadístico fue Y?:?k = µ + Dietaj. + Perro-, (Dieta) (término de error usado para probar los efectos de la Dieta) + Periodok + Dieta-, *Periodok + e13k. Las diferencias entre los medios de tratamiento se compararon usando contraste ortogonal y se consideraron estadísticamente significativos cuando P < 0.05.

Resultados Plasma Las concentraciones en plasma de luteína + zeaxantina en perros complementados con luteína se incrementó rápidamente después de dos semanas de alimentación (Figura 1) . Las concentraciones en plasma continuaron incrementándose posteriormente, aunque de manera más gradual, en perros alimentados con 10 a 20 mg de luteína. En contraste, no se detectó luteína + zeaxantina en plasma en los perros no complementados . Las concentraciones de luteína + zeaxantina en plasma a las 2 semanas hasta 12 semanas fue significativamente mayor (P<0.05) en los perros alimentados con luteína que en los animales no complementados. La complementación con luteína no tiene influencia en las concentraciones de retinol y a-tocoferol en plasma. Las concentraciones de estas vitaminas a través de todos los tratamientos y todos los periodos varió 3.63 ± 0.14 y 37 ± 2 µmol/L, respectivamente.

Respuesta de hipersensibilidad tipo retrazada Durante todos los periodos estudiados, la respuesta de DTH a solución salina fue baja (incremento de 3 a 10 % en espesor de piel) y no difirió significativamente entre los grupos de tratamiento. Antes de la alimentación de luteína (semana 0) , las respuestas de DTH a PHA y vacuna fueron similares a través de todos los grupos de dieta. A pesar del periodo de tratamiento, la respuesta máxima de DTH a PHA se observó alrededor de 24 horas después de la inyección en tanto que la respuesta máxima a la vacuna se presentó entre 48 y 72 horas. También, la repuesta de espesor de la piel a PHA fue de aproximadamente dos veces mayor que a la vacuna. En la semana 6, hubo una respuesta de DTH relacionada con la dosis a PHA a 24 horas después de la inyección. La respuesta de DTH disminuyó por 48 y 72 horas y no se observó diferencia significativa del tratamiento durante estos tiempos. La respuesta de DTH a la vacuna estuvo relacionada a la dosis a 48 y 72 horas después de la inyección y no fue significativa a las 24 horas . En la semana 12, hubo un incremento general dependiente de la dosis en la respuesta de DTH a PHA a 24, 48 y 72 horas; sin embargo, la respuesta fue significativamente mayor para perros alimentados con 20 mg de luteína en comparación a perros no complementados. En contraste a la semana 6, no hubo efecto dietético significativo en la respuesta de DTH a la vacuna.

Proliferación de PBMC inducida por mitógenos La luteína dietética no tubo influencia significativa en la proliferación espontánea por PBMC no estimulados. No hubo efectos significativo de luteína dietética en la respuesta de PBMC estimulada con PHA en la semana 0 y 4. Sin embargo, la respuesta proliferativa se mejoró (P<0.01) en las semanas 8 (10 pg/mL de PHA) y 12 (2 y 10 µg/mL de PHA) en perros alimentados con 20 mg de luteína en comparación a perros no complementados. Los perros alimentados con 5 y 10 mg de luteína también tuvieron una mayor proliferación de PBMC en la semana 8 en respuesta a 10 µg/ml de PHA. Los efectos de la luteína dietética en la respuesta proliferativa de PBMC estimulada con Con A fueron en general similares a aquellos observados con la proliferación inducida por PHA. En las semanas 8 y 12, los perros alimentados con 20 mg de luteína tuvieron mayor proliferación de PBMC en respuesta a ambas concentraciones de Con A. Los perros alimentados con 10 mg de luteína también mostraron mayor proliferación de PBMC en las semanas 8 y 12 en respuesta a 5 µg/mL de Con A. En general la proliferación de PBMC fue mayor con 5 µg/mL que con 1 µg/mL de Con A. La proliferación de PBMC en respuesta a PWM fue en general similar a aquella observada con PHA y Con A. Los perros alimentados con 20 mg de luteína tuvieron una proliferación de PBMC significativamente mayor en la semana 8 y 12 en respuesta a ambas concentraciones de PWM en comparación a los controles no complementados. Aquellos alimentados con 10 mg de luteína también obtuvieron una respuesta proliferativa mayor en la semana 8. Nuevamente, no se observó diferencia significativa de tratamiento en las semanas i?JjJ^^i^i^^Ai^K^=^Jiji^ O y 4 Actividad Natural citotóxica de células aniquiladoras La complementación con luteína dietética no tiene influencia significativa en la actividad citotóxica de células NK . La lisis específica de células objetivo por PBMC promedió 49.1 ± 1.1 % a través de todos los tratamientos y periodos de muestreo .

Subpoblaciones de linfocitos Antes de la complementación con luteína dietética (semana 0), no hubo diferencias significativas en los porcentajes de cualquiera de los marcadores de linfocito. En la semana 12, el por ciento de células CD4+ fue mayor en perros alimentados con 5 y 10 mg de luteína en tanto que la población de CD8+ no se vio influenciada por la dieta. Por otra parte, los perros alimentados con 20 mg de luteína tuvieron significativamente mayor % de células citotóxicas TCD8+ en la semana 8 en comparación al control. La relación de CD4:CD8 fue similar entre los tratamientos en la semana 0, 4 y 8 pero tendió a ser mayor (P < 0.08) en perros alimentados con 10 mg (2.5 0 ± 0.16) en comparación al control (2.10 ± 0.16) .

En las semanas 4 y 8, los perros alimentados con luteína tuvieron en general mayores porcentajes de células CD5+ que los controles no complementados y fue estadísticamente significativo con perros alimentados con 5 y 20 mg de luteína. Los perros alimentados con 20 mg de luteína también tuvieron un % de población de células clase 11 de MHC en la semana 8 y 12 en comparación a los perros no complementados. Los perros alimentados con menos cantidad de luteína tuvieron poblaciones clase 11 de MHC similares al control. En contraste a otras subpoblaciones de linfocitos, la luteína dietética no tiene influencia significativa en la población de células B, CD21+.

Producción de mterleucina-2 La producción e IL-2 por los PBMC estimulados con PHA en los cultivos de sangre entera no se diferenció significativamente entre los tratamientos de dieta a todo lo largo del periodo experimental. Las concentraciones de IL-2 en el medio de cultivo promediaron 15.7 ± 0.4 ng/mL a todo lo largo del estudio .

Producción de inmunoglobulina Las concentraciones de IgG en plasma tendieron a incrementarse (P > 0.05) a todo lo largo del periodo de muestreo de 17 semanas. Las concentraciones fueron similares entre los tratamientos de dieta durante las primeras 12 semanas de la complementación de dieta. Sin embargo, después de la revacunación en la semana 15, la IgG en plasma fue mayor (P < 0.05) en la semana 16 en perros alimentados con 5 mg de luteína (P < 0.05) y en la semana 17 con perros alimentados con 20 mg de luteína en tanto que la concentración e IgM en plasma no se cambio.

Peroxidación de lípidos La complementación con luteína no afectó de manera significativa a la actividad de plasma del TBARS que promedió 95.8 ± 0.1 nmol de MDA/L a través de todos los tratamientos y periodos.

Análisis Los resultados muestran que la luteína dietética mejora significativamente a la respuesta inmunitaria mediada por células en el perro. La complementación con luteína estimuló la respuesta proliferativa de PBMC a PHA, Con A y PWM. Hubo un incremento marcado en la proliferación de PBMC en la respuesta a PHA y Con A en la semana 12 en los perros alimentados con 20 mg de luteina. Los datos mostraron que la mutagénesis mejorada por luteína dietética se atribuye probablemente a la población incrementada de linfocitos. Los perros complementados con luteína tuvieron mayores poblaciones de células CD5+ y CD4+ . La luteína dietética puede actuar específicamente en los linfocitos T debido a que no se observaron cambios en la población de células B con la complementación de luteína. Los datos también mostraron que la complementación con luteína incrementó significativamente la proliferación de PBMC inducida por PWM en las semanas 8 y 12. La luteína dietética también incrementó significativamente la respuesta DTH a la vacuna, que es indicativa de una respuesta inmunitaria específica. La complementación con luteína incrementó significativamente el número de células teñidas positivas para las moléculas clase II de MHC en comparación a perros no complementados. La luteína no tuvo efecto significativo en la producción de anticuerpos policlónales (IgG e IgM) ex vivo en los caninos durante las primeras 12 semanas de complementación. Sin embargo, en la reexposición al antígeno, las concentraciones plasmáticas de IgG sa incrementaron en perros alimentados con luteína, sugiriendo un efecto antecedente de luteína dietética en el incremento de la capacidad de células B de memoria para segrerar IgG. En resumen, la luteína dietética mejoró la población de células auxiliares T caninas y la expresión de moléculas clase II de MHC, dando por resultado proliferación de PBMC caninos, inducida por mitógeno y respuesta de DTH. También, se cree que la luteína incrementa la producción de Ig. Un resumen de los resultados de cada uno de estos estudios se resume en la Tabla 1. ,Í.Zí- -r..¿-í -Am?- «M&Ofctei*» Tabla 1 Beneficio Vitamina E ß-caroteno Luteína Optimizar actividad de (Células T) (Células B) células inmunitarias Optimizar tipos de células presentes en la sangre Incrementar niveles de anticuerpos en la sangre Optimizar reconocimiento de vacuna para el perro La Figura 1 ilustra un incremento de 20 % en los niveles de anticuerpos en la sangre con la adición de ß-caroteno a la dieta. La Figura 2 demuestra la capacidad del perro para reconocer una vacuna. Como se muestra, se mejoró el reconocimiento tanto como 32 % con la adición de luteína a la dieta. Esto proporciona un perro con una respuesta 5 mejorada a vacunaciones para protección adicional de la enfermedad . Se debe señalar que ningún antíoxidante individual proporcionó los beneficios de todos los aspectos del sistema inmunitario examinado. Por 10 ejemplo, en tanto que la vitamina E y luteína optimizaron la activación de células inmunitarias, la vitamina E trabajó en las células T y la luteína trabajó en las células B. La función mejorada de células T es importante para combatir contra 15 infecciones virales y cáncer, en tanto que la función mejoradas de células B es importante para infecciones bacterianas. Por lo tanto, una combinación de antioxidantes proporciona efectos sinergéticos en el sistema inmunitario que tienen más peso que los 20 beneficios de incrementar el nivel de cualquier antioxidante sólo. ir» ?irftii.hf-*-*»*-*--—-*-»

Claims (10)

1. REIVINDICACIONES 1. El uso de una composición de alimento para mascotas que contienen una combinación de vitamina E, luteína y ß-caroteno en la elaboración de un producto de alimento para mascotas para el uso en la mejora de la respuesta inmunitaria en un animal de compañía .
2. 2. Un uso según la reivindicación 1, en donde la composición incluye desde aproximadamente 175 a aproximadamente 400 IU de vitamina E por kilogramo de dieta, de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 mg/día de luteína, y de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 mg/día de ß-caroteno.
3. 3. Un uso según la reivindicación 1, en donde el animal de compañía es un perro.
4. 4. Un uso según la reivindicación 1, en donde la composición comprende aproximadamente 18 a 40 % de proteína cruda, aproximadamente 4 a 30 % de grasa y aproximadamente 4 a 20 % de fibra dietética total.
5. 5. El uso de una composición de alimento para mascotas que contiene una combinación de vitamina E, luteína y ß-caroteno en la elaboración de un producto alimenticio para mascotas para optimizar las células inmumtarias en un perro.
6. 6. El uso de una composición de alimento para mascotas que contiene una combinación de vitamina E, luteína y ß-caroteno en la elaboración de U?» ""», J producto de alimento para mascotas para optimizar el reconocimiento de vacunas en un perro.
7. 7. Una composición de alimento para mascotas para mejorar la respuesta inmuni tana en un animal de compañía que comprende una combinación de vitamina E, luteína y ß-caroteno.
8. 8. Una composición de alimento para mascotas según la reivindicación 7, en donde la composición incluye de aproximadamente 175 a aproximadamente 400 IU de vitamina E por kilogramo de dieta, de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 mg/día de luteína y de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 mg/día de ß-caroteno.
9. 9. Una composición de alimento para mascotas según la reivindicación 7, en donde el animal de compañía es un perro.
10. 10. Una composición de alimento para mascotas según la reivindicación 7, en donde la composición comprende aproximadamente 18 a 40 % de proteína cruda, aproximadamente 4 a 30 % de grasa y aproximadamente 4 a 20 % de fibra dietética total. Ol, 42 • Í RESUMEN DE LA INVENCIÓN Un proceso para alimentar un animal de compañía tal como un perro con una dieta que contiene una cantidad efectiva de una combinación de antioxidantes para mejorar la respuesta inmunitaría y mejorar la salud general del animal, se proporciona. De manera preferente, la dieta incluye desde aproximadamente 175 a aproximadamente 400 IU de vitamina E por kilogramo de dieta de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 mg/día de luteína y de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 mg/día de ß- caroteno . ot o