CN1352529A - 使用抗氧化剂的组合增强陪伴动物免疫反应的方法和产品 - Google Patents

使用抗氧化剂的组合增强陪伴动物免疫反应的方法和产品 Download PDF

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Abstract

提供了一种饲喂陪伴动物(如狗)饮食的方法,其中饮食包含有效量的抗氧化剂的组合,以增强动物的免疫反应和提高动物的总体健康状况。优选地,饮食包含有从约175至约400 IU的维生素E/千克饮食、从约1至约50mg/天的黄体素、以及从约1至约50mg/天的β－胡萝卜素。

Description

使用抗氧化剂的组合增强陪伴动物免疫反应的方法和产品
本发明涉及一种用于增强陪伴动物(如狗)的免疫反应和提高其总体健康状况的方法和产品，更明确地说，涉及一种于动物饮食中提供有益量的抗氧化剂的方法和产品。
近年来，抗氧化剂的保健作用引起了人们越来越多的兴趣。抗氧化剂是可对抗活性氧类(也公知为自由基)作用的营养物。这些有害分子是正常代谢的副产物。抗氧化剂营养物通过附着至这些分子、中和它们并将它们从身体内清除来对抗自由基的作用。自由基的低效清除牵涉到对人体造成损伤，据信其可导致某些疾病如阿尔茨海默病、自身免疫病、肿瘤、心血管疾病、白内障、糖尿病、斑点退化、多发性硬化症、肌营养不良、胰腺炎、帕金森病以及类风湿性关节炎。由于这些自由基的累积而引起的损伤可能是老化过程的原因，这些自由基随着时间推移而累积，引起随衰老而发生的免疫反应抑制，导致老年人群中渐增的发病趋势。
抗氧化剂营养物是对一些化合物的一种分类，其中所述化合物具有相似的中和有害自由基的作用。它们包括公知的维生素如维生素A、维生素C和维生素E。它们也包括其它分类为类胡萝卜素的化合物。类胡萝卜素的实例包括β-胡萝卜素、黄体素、虾青素、角黄素和番茄红素。这些化合物是形成水果、花和蔬菜中的绿色、黄色、橙色和粉红色色素的原因。这些类胡萝卜素公知对免疫系统的调节起重要作用(例如，已发现类胡萝卜素可防止小鼠中化学诱导的致癌作用以及增加大鼠淋巴细胞增殖)。已发现虾青素和β-胡萝卜素可增加小鼠脾细胞针对T-依赖性抗原的离体抗体反应。已发现饮食性黄体素可增强小鼠脾细胞的淋巴细胞增殖。
虽然这些化合物全部分类为抗氧化剂，但有一点已逐渐明显，即它们并不以同样的方式发挥作用。例如，以前对人进行的研究表明，摄食高抗氧化剂之饮食(即水果和蔬菜的高摄入)的群体较其它人群组比较，前者具有较低的肿瘤发病率。然而提供补加抗氧化剂(如单一的维生素E或β-胡萝卜素)的临床研究表明它们不提供同等的保护。目前认为受益于抗氧化剂营养物的人类之健康可通过一些不同的抗氧化剂的低水平组合实现，而非高水平的单一抗氧化剂。
虽然狗还没有进化为依赖基于大量水果和蔬菜的饮食，但它确实搜寻并吃小的食植动物，后者消费具有高浓度此类化合物的植物。因此，可能狗对抗氧化剂的需要是自然地进化的。据此，在本领域中，需要在陪伴动物(如狗)的饮食中提供有益的抗氧化剂，以提供保健作用。
本发明提供了一种饲喂陪伴动物(如狗)饮食的方法，其中饮食包含有效量的抗氧化剂的组合，以增强动物的免疫反应和提高动物的总体健康状况。优选地，饲喂动物一种饮食，其包括维生素E、黄体素和β-胡萝卜素的组合。该抗氧化剂包为动物提供了从约175至约400IU的维生素E/千克饮食、从约1至约50mg/天的黄体素、以及从约1至约50mg/天的β-胡萝卜素。已发现此类饮食可优化狗的免疫细胞以及增加狗的疫苗识别。
因此，本发明的一个特点是通过在动物饮食中提供有效量的抗氧化剂的组合，来提供增强陪伴动物(如狗)的免疫反应和提高其总体健康状况的一种宠物食品和方法。通过下列详述、附图和附加的权利要求，本发明的这个和其它特点和优点将变得显而易见。
图1是狗的抗体浓度(mg/dl)对mg/kg饮食中的β-胡萝卜素作图。
图2是阐明饮食性黄体素对狗疫苗识别之影响的作图。
本发明提供了一种饲喂陪伴动物(如狗)饮食的方法，其中饮食包含有效量的抗氧化剂的组合，以增强动物的免疫反应和提高动物的总体健康状况。该抗氧化剂的组合可作为补充物或包含在饲喂动物的饮食中提供给动物。此补充物可为丸剂或胶囊剂形式、糖果(treat)或饼干、或任一其它可食用的形式。“饮食”是指被动物有规律地摄入的食物或饮料。通过使用抗氧化剂的组合，认为可对免疫系统的许多方面提供保健作用，例如，优化的免疫细胞激活、抗体水平的增加、以及抗体识别的提高。
饮食可为任一合适的宠物食品配方，该配方也可为动物提供足够的营养物。例如，本发明使用的一般狗食可包含约18-40％粗蛋白、约4-30％脂肪、以及约4-20％总饮食性纤维。但这些或其它营养物不要求特定比率或百分比。抗氧化剂的组合可与此类饮食混合，以提供所需要的有益的数量。
为了使本发明更易于理解，可参照以下实施例，其用于阐明本发明，而不用于限制发明范围。
实施例1维生素E
为了稳定狗的维生素E水平，在开始本实验前用标准的市售基于小鸡/谷类的饮食饲喂20只年幼的(平均年龄2岁)和20只年老的(平均年龄9.2岁)小猎兔犬1月，其中所配制的饮食含有27IU/kg饮食的维生素E(NRC推荐)(对照饮食)。然后年幼狗和年老狗随机给予含有27IU/kg饮食的维生素E或280IU/kg饮食的维生素E8周。在规定饮食处理之前和第8周后收集血液，用于测量血浆维生素E水平，并评估应答ConA(伴刀豆凝集素A)和PHA(植物凝集素)的淋巴细胞促有丝分裂反应。与其它物种类似，年老狗在规定饮食处理前对PHA和ConA的促有丝分裂反应明显低于年幼狗。令人吃惊的是，饲喂27IU/kg饮食的维生素E之年幼狗和年老狗中血浆维生素E水平明显下降，其中年幼狗显示了较高的下降百分比(年老狗下降35％，年幼狗下降50％，P＝0.12)。检查本研究中的狗在此之前所饲喂的市售食物中维生素E含量，表明市售食物平均含有60IU/kg饮食的维生素E。这样，血浆维生素E水平的下降可归因于对照饮食中维生素E的水平比市售狗食的维生素E水平低。补充维生素E的年幼狗和年老狗均显示血浆维生素E水平明显升高，其中年幼狗显示出较年老狗明显高的上升百分数(年老狗上升20％，年幼狗上升50％，P＝0.02)。饲喂27IU/kg饮食的维生素E之年幼狗在8周的饲喂期间对ConA和PHA所刺激的增殖明显下降。补充280IU/kg饮食的维生素E之狗未观察到此类下降。饲喂27或280IU/kg饮食的维生素E之年老狗在促分裂原刺激的淋巴细胞增殖反应中没有显示明显变化。β-胡萝卜素
用满足或超过对所有必需营养物之需求的基础饮食(The lamsCo.，Lewisburg，OH)饲喂雌性小猎兔犬(年龄18至19个月；体重7至9kg)。动物于光照控制(14小时光；10小时黑暗)及温度控制的房间室内饲喂。单剂口服β-胡萝卜素后，进行试验，以研究β-胡萝卜素的摄入曲线。
为了研究给予单剂口服β-胡萝卜素的狗对口服β-胡萝卜素的摄入，狗(n＝6只/处理)一次性经口给予0、50、100或200mg β-胡萝卜素(10％冷水溶解；BASF Corp.，Ludwigshafen，德国)。合适剂量的β-胡萝卜素溶于5ml水，其通过饲喂注射器口服饲喂。为建立合适的取样时间，用两只狗进行了初步研究。对这些狗一次饲喂50mg的β-胡萝卜素，并于0(恰好在饲喂β-胡萝卜素前)、3、6、9、12、15、18、21和24小时抽取血样。
通过离心分离血浆，并用高效液相层析(HPLC)如下分析β-胡萝卜素浓度。所有步骤在暗光下进行。在BHT存在下，用1∶1的二乙醚和石油醚混合物对双份血浆、每份白细胞匀浆和每份白细胞的亚细胞级分进行提取。移去醚相并于流动氮下干燥。在流动相中重建残余物，用于β-胡萝卜素的HPLC测定。将样品(50μl)注入5μm球形C-18反相柱(3.9×150mm；Resolve)，并且用47∶47∶6(v/v/v)的乙腈、甲醇和氯仿之混合物以1.0ml/分钟的流速洗脱。
这个实施例的结果显示β-胡萝卜素的峰浓度在给予剂量后3至6小时间出现，且于24小时时不可检测到。接下来，在同样的时间段从剩余狗抽取血样。同样分离血浆并通过HPLC分析。
在所有的研究时间段，未补充β-胡萝卜素的狗均不能检测到血浆β-胡萝卜素的浓度。相反对口服给予β-胡萝卜素的狗，其血浆β-胡萝卜素呈剂量依赖性升高(P＜0.01)。在给予剂量后6小时观察到峰浓度，并且在所有的处理组中是一致的。此后所有补充β-胡萝卜素之狗中β-胡萝卜素浓度快速下降(P＜0.01)。在给予剂量后24小时不可检测到浓度。血浆β-胡萝卜素的半寿期为3(50和100mg剂量)至4(100mg剂量)小时。狗的血液β-胡萝卜素的峰浓度比猫早出现(见下面的实施例4和5)。同样，在调整体重差异后狗的血浆β-胡萝卜素的浓度比在猫上观察的低约10至16倍。
在第二个研究中，狗(n＝6只/处理)每天于0800点连续饲喂0、12.5、25、50或100mgβ-胡萝卜素7天。β-胡萝卜素追加在食物中并于早餐饲喂。于0天(恰好在第一次剂量前)和接下来于施用每剂后6小时(1至7天)每天抽取血样一次。该抽取血样时间的选择是基于实施例1得到的结果，其显示β-胡萝卜素的峰浓度位于一次剂量后6小时。分离血浆并分析β-胡萝卜素的浓度。
7天中每天施用β-胡萝卜素的狗产生剂量依赖性上升的循环β-胡萝卜素。饲喂100mgβ-胡萝卜素的狗显示出血浆β-胡萝卜素的日浓度急速上升。在这个实施例中，饲喂100mgβ-胡萝卜素的狗在第一天血浆β-胡萝卜素的峰浓度(18μg/L)类似于第一个研究中所观察到的。在最后一次剂量后血浆β-胡萝卜素的浓度通常较第一次剂量后所观察到的高出2.5至4倍。
设计的第三个研究是用于研究狗的血淋巴细胞对β-胡萝卜素的摄入。狗(n＝8只/处理)每天饲喂0、50或100mgβ-胡萝卜素30天。所有狗的血样于10、20和30天时通过颈静脉抽取。密度梯度离心分离血淋巴细胞和嗜中性粒细胞。计数细胞数。淋巴细胞和嗜中性粒细胞重悬于含有3％抗坏血酸钠(作为抗氧化剂)的PBS。等份的细胞悬液超声处理30秒以破碎细胞。提取白细胞匀浆用于β-胡萝卜素的HPLC分析。
于第30天取较大量的血，如上所述制备白细胞悬液用于接下来的亚细胞分级分离。于5倍体积的0.25M蔗糖中超声20秒破碎细胞。加入抗坏血酸钠作为抗氧化剂。离心匀浆(4℃，600×g10分钟)，从上清液分离核沉淀物。离心去核后的上清液(4℃，17,300×g20分钟)以分离线粒体级分。离心去线粒体后上清液(4℃，102,000×g60分钟)，以从胞质级分分离微粒体。用HPLC分析每种亚细胞级分的β-胡萝卜素含量。
第0天(补充β-胡萝卜素前)，在所有狗的外周血淋巴细胞中均不能检测到β-胡萝卜素的浓度。同样，在整个研究中未补充β-胡萝卜素的狗淋巴细胞中仍然检测不到β-胡萝卜素。相反，饲喂β-胡萝卜素的狗淋巴细胞中β-胡萝卜素浓度通常以时间-依赖性方式上升(P＜0.01)。比较饲喂50或100mgβ-胡萝卜素的狗淋巴细胞中β-胡萝卜素浓度，没有显著的处理差异。
从未补充β-胡萝卜素的狗获得的淋巴细胞之多种亚细胞级分中均不能检测到β-胡萝卜素。相反，从补充β-胡萝卜素的狗所分离的血淋巴细胞之所有亚细胞级分均摄入β-胡萝卜素。胞质级分占淋巴细胞中总β-胡萝卜素的52至62％，而核含有总β-胡萝卜素的最低量(6至8％)。线粒体(14至17％)和微粒体(16至23％)介于胞质和核之间。在饲喂的第30天，饮食性β-胡萝卜素之剂量对亚细胞级分摄入β-胡萝卜素无显著影响。该结果表明所有淋巴细胞亚细胞级分均摄入β-胡萝卜素。但胞质中β-胡萝卜素最高。
与淋巴细胞一样，血嗜中性粒细胞同样摄入β-胡萝卜素。但与淋巴细胞不同的是：其最大摄入发生在第10天，且在第30天观察时嗜中性粒细胞β-胡萝卜素的浓度无进一步的上升。血嗜中性粒细胞的胞质、线粒体和微粒体也显示明显的β-胡萝卜素的摄入。相反，核中未检测到β-胡萝卜素。与血淋巴细胞亚细胞级分一样，血嗜中性粒细胞的胞质级分中β-胡萝卜素最高(61至68)。没有观察到明显的剂量效应。
在第四个研究中，雌性小猎兔犬(4至5月龄)每日补充0、25、50或100mgβ-胡萝卜素，以研究饮食性β-胡萝卜素在加强狗细胞介导的免疫和体液免疫系统中的作用。评估所有动物或外周血淋巴细胞中的下列参数：(1)针对PHA(非特异性免疫)和疫苗(特异性免疫)的迟发型超敏反应(DTH)，(2)淋巴细胞增殖，(3)淋巴细胞群以及(4)免疫球蛋白(Ig)。
补充β-胡萝卜素可以剂量依赖性方式使血浆β-胡萝卜素浓度上升，但不影响血浆视黄醇或α-生育酚。这些改变通常反映对特异的(疫苗)和非特异的(PHA)抗原之DTH应答。饲喂50mgβ-胡萝卜素的狗可观察到对PHA攻击的最大反应，而饲喂20或50mgβ-胡萝卜素的狗显示对疫苗明显较高的DTH反应。迟发型超敏反应是严格地细胞反应，其涉及T细胞和巨噬细胞而不涉及抗体成分。抗原呈递细胞(例如巨噬细胞)呈递抗原或变应原至T细胞，使T细胞活化并释放淋巴因子。这些淋巴因子活化巨噬细胞并使它们变为外来入侵者的贪婪杀手。因此该数据显示饲喂β-胡萝卜素的狗具有增高的细胞介导的反应。
β-胡萝卜素饲喂也对淋巴细胞亚群产生明显的改变。与对照比较，饲喂20或50mgβ-胡萝卜素的狗具有增多的CD4+细胞(第8周)。饲喂20mgβ-胡萝卜素的狗在第2和4周也具有增多的CD8细胞。T细胞可根据CD4膜分子的表达分类。CD4作为粘附分子和作为共信号传递的共受体发挥作用。它在T细胞活化中起作用。CD4+T淋巴细胞识别与II类MHC分子结合的抗原并且主要作为辅助细胞起作用。对饲喂20至50mgβ-胡萝卜素的狗，本研究的T辅助细胞群之增多可以解释相应的DTH反应之增强。
早至规定饮食补充后一周，饲喂β-胡萝卜素的狗之IgG、IgM和总IgG的浓度明显增高。饲喂0至20mgβ-胡萝卜素的狗其Ig的增高呈剂量依赖。β-胡萝卜素的最高水平(50mg)不产生进一步的增加。饲喂20mgβ-胡萝卜素的狗一直对两类Ig具有最大的抗体反应。免疫系统的主要功能之一是产生抗体，其自由地循环以保护机体抵御外来物质。抗体起到中和毒素、固定某些微生物、中和病毒活性、凝集微生物或抗原颗粒以及沉淀可溶抗原的作用。
β-胡萝卜素饲喂不影响促分裂原诱导的淋巴细胞母细胞化和IL-2产生。淋巴细胞参与细胞介导的免疫。识别抗原后，淋巴细胞很快分裂，以此克隆自身以备与潜在入侵争斗。在体液免疫反应中，IL-2刺激与抗原反应的T辅助细胞和B细胞增殖。抗原或促分裂原活化的T细胞的克隆扩增需要它。在细胞介导的免疫反应中，IL-2活化天然杀伤细胞、刺激胸腺细胞增殖以及诱导细胞毒T细胞活性。
基于这些实验结果，狗从饮食中吸收了显著量的β-胡萝卜素并将β-胡萝卜素转运至免疫细胞和巨噬细胞的亚细胞器。在这些细胞中β-胡萝卜素看来是通过增强细胞介导的免疫反应(DTH反应、淋巴细胞亚群漂移)和体液反应(IgG和IgM产生)来增强狗的免疫系统。黄体素
56只雌性小猎兔犬(年龄17至18个月；平均体重11.4±0.4kg)随机地每日补充0、5、10或20mg黄体素，共17周。该黄体素含有76.66％黄体素和5.23％玉米黄质。将黄体素补充物重悬于大豆油至合适的浓度，并于每天0800时经口施与1ml。在该黄体素补充物后立即提供食物(200g/狗/天)。基础饮食满足或超过对所有必需营养物的需求(NRC1985)。所有狗置于2×2m围栏内(2只狗/围栏)，置于有温度(20至22℃)及光照(14hr光)控制设施的环境中。在第0、6和12周时记录体重。
第0、2、4、8和12周时，通过颈静脉穿刺将血收集至肝素化的空试管，并将等份用于HPLC分析和评估免疫反应。提取和HPLC分析
提取血浆用于分析黄体素、玉米黄质、视黄醇和α-生育酚。简言之，通过加入等体积含0.1％丁基化羟甲苯(BHT)(Aldrich ChemicalCo.，Milwaukee，WI)的乙醇沉淀血浆蛋白质。该混合物用5ml 1∶1的石油醚∶无水乙醚混合物提取。
将干燥的残余物重悬于移动相，其中移动相由47∶47∶6(v∶v∶v)的HPLC级乙腈∶甲醇∶氯仿(Fisher Scientific，Fair Lawn，NJ)之混合物组成。通过比较曲线下面积对黄体素、玉米黄质和α-生育酚定量，而用峰高度对视黄醇定量。通过比较洗脱化合物与纯标准物的吸收光谱进一步证实它们的身份。由于黄体素和玉米黄质没完成基线分离，故血浆浓度报告为黄体素+玉米黄质。迟发型超敏反应
第0、6和12周时对所有狗评估皮肤硬化反应。狗侧腹区真皮内注射盐水(8.5g/L；对照)，含有犬瘟热病毒、犬2型腺病毒、犬副流感病毒和细小病毒的减毒多价疫苗(Vanguard 5，Smithkline Beacham，WestChester，PA；特异性抗原)，以及PHA(0.5g/L；非特异性抗原)。所使用的疫苗和PHA之剂量是事先测定的，其可对年龄相仿的小猎兔犬提供最佳皮肤反应。备皮并用70％乙醇擦拭注射位点。注射体积为100μl。于注射后0、24、48和72h用压力敏感的数字微米尺(Mitsutoyo，东京，日本)测定皮肤的硬化，并将反应表达为0时测得的皮肤厚度百分比。淋巴细胞增殖
对第0、2、4、8和12周收集的血通过外周血单核细胞(PBMC)评估促分裂原诱导的淋巴细胞增殖。使用全血培养物以模拟体内条件。所用的促分裂原为植物凝集素(PHA)、伴刀豆凝集素A(ConA)和商陆丝裂素(PWM)。充分混匀全血，然后用含有25mM Hepes、青霉素(100U/mL)和链霉素(100μg/mL)的RPMI-1640(Sigma，St.Louis，MO)1∶12稀释。使用未稀释的血以及1∶2、1∶4、1∶8、1∶12和1∶16稀释的血进行的初步研究显示，1∶12稀释的血具有最佳PBMC增殖反应。将三个重复的150μL滴加入96孔圆底板并加入50μL合适的促分裂原。培养物中促分裂原的终浓度为PHA2和10μg/mL、ConA 1和5μg/mL以及PWM 0.5和2.5μg/mL。在使用来自类似动物的血液之初步研究中促分裂原的这两个浓度给出最大的(较高的促分裂原浓度)和最适度以下的(较低的促分裂原浓度)增殖反应。混合物于环境中含5％CO2的湿润培养箱37℃培养72小时。在终止培养前4小时，加入20μL[3H]-胸苷(1μCi/孔)。将细胞收获至玻璃纤维滤膜上并通过液体闪烁计数放射活性。PBMC的增殖反应以刺激指数(受刺激培养物的cpm/未受刺激培养物的cpm)表示。淋巴细胞亚群
使用Histopaque-1119(Sigma，St.Louis，MO)分离血淋巴细胞。细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH7.4)洗三次，并于NH4Cl(8.4g/L)中裂解污染的红细胞。用流式细胞术(FACScan，Becton Dickinson，San Jose，CA)测定淋巴细胞亚群。分离的单核细胞以1×107个细胞/mL重悬于PBS，其中的PBS补充有2％无γ球蛋白的血清、5％山羊血清和0.2g/mL叠氮钠。总共5×105个细胞与最佳浓度的小鼠抗犬单克隆抗体(mAb)冰上温育30分钟用于免疫荧光分析。所用的mAb对下列淋巴细胞亚群是特异的：总T细胞(抗-CD5)、T辅助细胞(抗-CD4)、T细胞毒/抑制细胞(抗-CD8)、表达主要组织相容性复合体(MHCII类抗原)的淋巴细胞(抗-MHCII类)以及B细胞(抗-CD21)。然后将细胞洗三次并与二级抗体(异硫氰酸荧光素(FTTC)连接的山羊抗小鼠IgG+IgM(H+L)的F(ab’)2)(Caltag，Burlingame，CA)冰上温育30分钟，以观察结合的mAb。被染色细胞固定于4％多聚甲醛以制备获得物。
包括合适的阴性对照以校正背景荧光。数据以阳性染色细胞百分比表示，其中阳性染色细胞为已经二级抗体非特异的染色细胞校正过的细胞。NK细胞细胞毒性
在评估NK细胞细胞毒活性时，用犬甲状腺腺癌细胞作为目标细胞。此细胞系事先已显示易于被犬NK细胞杀伤。在T75烧瓶中用20mL补加10％胎牛血清(FCS)、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的最小必须培养基(MEM；Sigma Chem.Co.，St.Louis，MO)培养目标细胞。当目标细胞铺满后用胰蛋白酶消化，洗三次并以5×105个细胞/mL重悬于完全培养基中(RPMI-1640+10％FCS+100U/mL青霉素+100μg/mL链霉素)。将三个重复的100μL目标细胞等份滴加入96孔U-底板(Costar，Cambridge，MA)并温育8小时使细胞粘附。然后向通过珀可分离法(如上所述)分离的淋巴细胞(效应细胞；100μL)中加入目标细胞，以提供10∶1的效应细胞∶目标细胞(E∶T)比。于37℃温育10小时后，加入20μL底物，其中底物包含5μg3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑(MTT)。混合物于37℃温育4小时，此后吸出未代谢的MTT。加入200μL95％的乙醇溶解甲臜结晶。用微孔板读数仪于570nm处测定光密度。如下计算NK细胞特异性裂解百分比：
特异性细胞毒性(％)＝100×{1-[(目标细胞和效应细胞的OD-效应细胞的OD)/(目标细胞的OD)]}IL-2的产生
全血用补充了Hepes和抗生素的RPMI-1640(前述)1∶2稀释，并将400μL稀释血滴加入48孔板(Costar，Cambridge，MA)。细胞于5％CO2环境、37℃下，用PHA(5μg/mL的溶液取400μL)刺激48小时。200×g离心板10分钟并将上清冻存于-80℃。培养上清液的IL-2含量通过三个重复的ELISA(Intergen，Purchase，纽约)测定。多克隆抗人IL-2可与犬IL-2交叉反应并以重组人IL-2作为标准。血清IgG和IgM
通过单向放射免疫扩散(SRID)分析于第0、2、4、8和12周收集的血清IgG和IgM浓度。此外，所有狗于第13周和再于第15周接种多价疫苗(Vanguard 5，Smithkline Beacham，West Chester，PA)，以研究饮食性黄体素可能的回忆效应。从第13周至第17周每周收集一次血。山羊抗犬IgG(10％，整个分子)或IgM(7.5％，μ链)(LCN，Aurora，OH)抗血清与融化的琼脂糖(用PBS配制为10g/L；SigmaChem.Co.，St.Louis，MO)混合，将混合物固化于SRID板。将两个重复的血清或IgG标准(0、2.88、5.75、11.5和23.0mg/ml)或IgM标准(0、0.25、0.5、1.0和2.0mg/ml)5μL体积上样至孔中。于温室中室温孵育24小时后，用SRID读数仪(Transidyne General Corp.，Ann Arbor，MI)测量环直径。脂质过氧化(TBARS)的测定
通过检测丙二醛(MDA)的产生测定血浆脂质过氧化活性。所用的标准为1，1，3，3-四甲氧丙烷JMP(Sigma Chem.Co.，St.Louis，MO)。将两个重复的500μL血浆样品滴加入15ml玻璃试管，并加入3mL磷酸(10g/L)和1mL TBA溶液(6g/L)。混合物于水浴中沸腾45分钟。使试管冷却并用4ml的正丁醇提取该TBA-MDA复合物。1,000×g离心10分钟分离丁醇层，于532nm(Beckman，Fullerton，CA)处测定吸收。TBARS活性用nmole MDA/L血浆表示。统计
使用SAS的General Linear Model通过分裂-图表ANOVA分析数据。统计模式为Yijk＝μ+Dietj+Dogj(Diet)(误差术语，用于饮食效应的试验)+Periodk+Dietj *Periodk+eijk。用正交对比比较处理平均值之间的差异，并且当P＜0.05时认为统计上具显著性。结果
血浆
对补充黄体素的狗，其黄体素+玉米黄质的血浆浓度在饲喂后2周快速上升(图1)。此后对饲喂10和20mg黄体素的狗，其血浆浓度继续上升，虽然上升较缓。相反，未补充的狗不能检测到血浆黄体素+玉米黄质。饲喂黄体素的狗血浆黄体素+玉米黄质的浓度在第2周至第12周之间明显高于(P＜0.05)未补充的动物。黄体素的补充不影响血浆视黄醇和α-生育酚浓度。在所有处理和整个期间这些维生素的浓度平均分别为3.63±0.14和37±2μmol/L。迟发型超敏反应
在整个研究期间，对盐水的DTH反应低(皮肤厚度增加3至10％)并在处理组间差别不显著。饲喂黄体素之前(第0周)，所有规定饮食组对PHA和疫苗的DTH反应相似。与处理期间无关的是：在注射后约24小时可观察到对PHA的最大DTH反应，而对疫苗的最大反应发生在48和72小时间。同样，对PHA的皮肤厚度反应约比疫苗高两倍。
第6周时，在注射PHA后24小时呈现剂量相关的DTH反应。在48和72小时时DTH反应下降，并且在这些时间没有观察到明显的处理差异。在注射后48和72小时对疫苗的DTH反应为剂量相关的，而在24小时时并不明显。
第12周时，在24、48和72小时对PHA的DTH反应具有普遍的剂量依赖性升高；然而，饲喂20mg黄体素的狗与未补充的狗比较，该反应明显较高。对疫苗的DTH反应与第6周相反，没有明显的饮食性影响。
促分裂原诱导的PBMC增殖
饮食性黄体素对未刺激之PBMC的自发增殖无明显影响。在第0和4周时，饮食性黄体素对PHA刺激之PBMC反应没有明显影响。但第8周(10μg/mL PHA)和第12周(2和10μg/mL PHA)时，饲喂20mg黄体素的狗与未补充的狗比较，前者增殖反应被加强(P＜0.01)。第8周时，饲喂5和10mg黄体素的狗也对10μg/mL PHA具较高的PBMC增殖反应。
饮食性黄体素对ConA刺激之PBMC增殖反应的影响一般与那些观察到的PHA诱导的增殖相似。在第8和12周，饲喂20mg黄体素的狗对两个浓度的ConA均有较高的PBMC增殖反应。饲喂10mg黄体素的狗在第8和12周对5μg/mL ConA也显示较高的PBMC增殖反应。一般地，5μg/mLConA较1μg/mL ConA的PBMC增殖要高。
对PWM的PBMC增殖反应一般类似于那些观察到的PHA和ConA。在第8和12周，饲喂20mg黄体素的狗与未补充的对照比较，前者对两个浓度的PWM均有明显的较高PBMC增殖反应。那些饲喂10mg黄体素的狗在第8周也具有较高的增殖反应。再者，在第0和4周时观察到不显著的处理差异。
天然杀伤细胞细胞毒活性
饮食性黄体素补充不明显影响NK细胞细胞毒活性。在所有的处理和取样期间PBMC对目标细胞的特异性裂解平均为49.1±1.1％。
淋巴细胞亚群
饮食性黄体素补充前(第0周)，任一淋巴细胞标记的百分比无明显差异。第12周时，饲喂5和10mg黄体素的狗具较高的CD4+细胞％，而该饮食不影响CD8+细胞群。另一方面，饲喂20mg黄体素的狗在第8周时与对照比较，具明显较高的CD8+细胞毒T细胞％。在第0、4和8周时处理之间的CD4∶CD8之比相似，而饲喂10mg的狗(2.50±0.16)与对照(2.10±0.16)比较，前者趋于较高(P＜0.08)。
在第4和8周时，饲喂黄体素的狗与未补充的对照比较，普遍具有较高的CD5+细胞百分比，并且对饲喂5和20mg黄体素的狗具有统计意义。在第8和12周时，饲喂20mg黄体素的狗与未补充的狗比较，前者也具有升高的MHCII类细胞群％。饲喂较低量黄体素的狗具有与对照类似的MHCII类细胞群。
与其它的淋巴细胞亚群相反，饮食性黄体素不明显影响CD21+B细胞群。
IL-2产生
整个实验期间，在饮食性处理中PHA刺激的全血培养物之PBMC产生IL-2方面没有明显差异。研究期间培养基中IL-2浓度平均为15.7±0.4。
免疫球蛋白产生
17周的取样期间，血浆IgG浓度趋于上升(P＞0.05)。在前12周的规定饮食补充期间，饮食性处理间浓度相似。然而，于第15周再接种后，饲喂5mg黄体素的狗在16周以及饲喂20mg黄体素的狗在17周时血浆IgG较高(P＜0.05)，而血浆IgM浓度不变。
脂质过氧化
黄体素的补充不明显影响血浆TBARS活性，其在所有的处理和整个期间平均为95.8±0.1nmole MDA/L。
讨论
结果表明，饮食性黄体素明显加强了狗中细胞介导的免疫反应。黄体素的补充刺激了PBMC对PHA、ConA和PWM的增殖反应。在第12周时饲喂20mg黄体素的狗对PHA和ConA的PBMC增殖反应明显升高。
数据显示饮食性黄体素所致增强的有丝分裂发生可归因于增加的淋巴细胞群。补充黄体素的狗具有较高的CD5+和CD4+细胞群。饮食性黄体素可特异性地对T淋巴细胞起作用，因为观察到黄体素的补充不改变B细胞群。
数据也显示出在第8和12周黄体素的补充明显增加了PWM诱导的PBMC增殖。
饮食性黄体素也明显增加了对疫苗的DTH反应，其表示一种特异的免疫反应。与未补充的狗比较，黄体素的补充明显增加了MHCII类分子的染色阳性细胞数量。
在补充的前12周，黄体素对离体狗多克隆抗体(IgG和IgM)产生无明显影响。但再次暴露于该抗原时，饲喂黄体素的狗血浆IgG浓度上升，这暗示饮食性黄体素在提高记忆B细胞分泌IgG能力方面的回忆效应。
总之，饮食性黄体素使犬T辅助细胞群以及MHCII类分子的表达提高，导致促分裂原诱导的犬PBMC增殖和DTH反应。同样认为黄体素提高了Ig产生。
对每一个研究结果的概述总结在表1中。
                               表1
  优点 维生素E  β-胡萝卜素   黄体素
  优化免疫细胞活性 √(T细胞)   √(B细胞)
  出现在血中的优化细胞类型   √
  增加血中的抗体水平   √
  优化狗对疫苗的识别   √   √
图1阐明向饮食中加入β-胡萝卜素使血中的抗体水平上升20％。
图2显示狗识别疫苗的能力。如图所示，向饮食中加入黄体素可使识别提高达32％。这使狗对接种的疫苗具有升高的反应，以额外地保护狗免于疾病。
应该注意到，没有一种抗氧化剂能对检查的所有免疫系统提供有益作用。例如，虽然维生素E和黄体素均可优化免疫细胞的活性，维生素E对T细胞起作用而黄体素对B细胞起作用。提高的T细胞功能对抵抗病毒感染和肿瘤是重要的，而提高的B细胞功能对抵抗细菌感染是重要的。因此抗氧化剂的组合可提供对免疫系统的协同效应，它优于对任一抗氧化剂水平的增加。
为了阐明本发明，给出了某些代表性的实施方案和详述，同时本领域技术人员对此处公开的方法和设备进行的多种改变显然未离开本发明的范围，在所附的权利要求中对本发明的范围进行了限定。

Claims (10)

1.一种增强陪伴动物中免疫反应的方法，其包括给该动物饲喂一种饮食的步骤，该饮食含有有效量的维生素E、黄体素和β-胡萝卜素的组合。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述的饮食包含从约175至约400IU的维生素E/千克饮食、从约1至约50mg/天的黄体素、以及从约1至约50mg/天的β-胡萝卜素。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述的陪伴动物为狗。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述的饮食包含约18至40％粗蛋白、约4至30％脂肪、以及约4至20％总饮食性纤维。
5.一种优化狗中免疫细胞的方法，其包括饲喂所述狗一种饮食的步骤，该饮食含有有效量的维生素E、黄体素和β-胡萝卜素的组合。
6.一种优化狗中疫苗识别的方法，其包括饲喂所述狗一种饮食的步骤，该饮食含有有效量的维生素E、黄体素和β-胡萝卜素的组合。
7.一种用于增强陪伴动物免疫反应的宠物食品之产品，所述宠物食品之产品包含宠物食品的组合物，该组合物含有有效量的维生素E、黄体素和β-胡萝卜素的组合。
8.如权利要求7所述的产品，其中所述的组合物包含从约175至约400IU的维生素E/千克饮食、从约1至约50mg/天的黄体素、以及从约1至约50mg/天的β-胡萝卜素。
9.如权利要求7所述的产品，其中所述的陪伴动物为狗。
10.如权利要求7所述的产品，其中所述的组合物包含约18至40％粗蛋白、约4至30％脂肪、以及约4至20％总饮食性纤维。
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