USO DE INHIBIDORES DE SÍNTESIS DE GLUCOSILCERAMIDA EN TERAPIA
La presente invención proporciona el uso de inhibidores de @ síntesis de glucolípido en la elaboración de medicamentos para utilizarse en el tratamiento de condiciones tales como enfermedad de
A »•* almacenamiento de Niemann-Pick C, enfermedad de Alzheimer, epilepsia, apoplejía y enfermedad de Parkinson. En particular, se proporciona el uso d® N-butildeoxinojirimicina. W La enfermedad Niemann-Pick Tipo C (NPC), que también se conoce como enfermedad de Niemann-Pick con bloque de esterificación de colesterol, es un desorden de almacenamiento recesivo autosomal de metabolismo de colesterol. Los pacientes con NPC generalmente parecen normales por los primeros pocos años de vida. Sin embargo,
11 orgánicamente el hígado y bazo emergen pronto, y pueden dar como resultado en ictericia u otros síntomas de disfunción. Los pacientes con NPC también desarrollan gradualmente anormalidades neurológicas tales co o ataxia, tremores, ataques y pérdida del habla, habilidades cognitivas y motoras, y la dificultad con los movimientos hacia arriba y hacia abajo
20 del ojo. Los progresos de deterioro, particularmente que resultan de incrementar la degeneración neuronal, y la muerte usualmente ocurren por 5-15 años de edad. Vanier et al., (1991 ) reporta que Niemann-Pick Tipo C es heterogéneo, sugiriendo la posibilidad de que más de una mutación
26 genética da origen a la enfermedad. Los estudios moleculares
re ientemente substanciaron esta posibilidad. Un gen más comúnmente muta do eá los pacientes con Niemann-Pick Tipo C se ha identificado como ttfrifl y mapeado en 1 8q 1 1 -q 12 (Carstea eí al., 1 997). El gen NPC1 codifica una proteína de 1 ,278 aminoácidos, y comparte alguna homología de secuencia con las regiones sensibles a esterol putativo de la proteína que activa la separación SREBP y reducatasa de coenzima A de 3-hidroxi- 3-metilglutarilo (Carstea eí al., 1997). Una función específica para el producto de gen NPC1 se desconoce en este momento, aunque los estudios bioquímicos son sugestivos de que las mutaciones de gen NPC1 de alguna manera disturban el metabolismo de colesterol. Por ejemplo, fas células de NPC se bloquean en la estarificación de colesterol, pero también no transloca eficazmente el colesterol de lisosomas en otros organelos intracelulares (Pentchev eí al., 1985, Sokol eí al., 1988). La evidencia de un segundo posible gen mutado en Niemann- Pick Tipo C se ha descrito, aunque aún no se ha identificado (Steinberg eí al., 1994). Los pacientes con las mutaciones de NPC1 se han subclasificado como teniendo enfermedad de Niemann-Pick tipo C1 , mientras que los pacientes con otros genes mutados como teniendo enfermedad de Niemann-Pick Tipo C2. No existe diferencia conocida entre los cursos clínicos de los pacientes con tipo C1 y C2, y parecen responder de la misma manera a los tratamientos de la enfermedad. Además, la subclasificación C1 /C2 no se aplica universalmente. Por lo tanto, las enfermedades de Niemann-Pick Tipo C que se origina de NPC1 u otras mutaciones de gen se refieren colectivamente como NPC en la presente. Los descubrimientos bioquímicos para los pacientes con NPC
muestra una acumulación marcada de colesterol en el hígado y bazo. El hígado y bazo muestran niveles de esfingomielina elevados. Sin embargo, la actividad de esfingomielinasa permanece normal en estos tejidos. Este descubrimiento distingue NPC de las enfermedades de Niemann-Pick Tipos A y B que se causa por las mutaciones de esfingomielinasa lisosomal, y así se presenta con niveles marcadamente reducidos de esta enzima. Además del hígado y bazo, otras células de pacientes con NPC almacenan colesterol también. Por ejemplo, las células de médula ósea toman una apariencia espumosa característica debido a la presencia de grandes números de inclusiones de almacenamiento, mientras que tas células de la piel y ojo típicamente se afectan menos. Las células neuronales almacenan algo de colesterol, aunque predomina la acumulación de glucolípido particularmente gangliósido GM2. No existe aún un tratamiento aceptado para la enfermedad de NPC. Dada las observaciones que soportan el origen de la enfermedad de NPC en un defecto de metabolismo de colesterol, la mayoría de los intentos de tratamiento se han enfocado en reducir el almacenamiento de colesterol (Sylvain eí al., 1994, Pediatr. Neurol. 10:228-32, Patterson eí aL, 1993, Neurology, 43:61 -4). Sin embargo, la restricción de la toma de colesterol o tratamiento de los pacientes con un rango de medicamentos que disminuyen el colesterol ha tenido enigmáticamente poco efecto en los niveles de almacenamiento de tejido de este material, y ningún efecto aparente en el progreso de la enfermedad. La percepción en la materia es que el componente de acumulación de glucolípido de la enfermedad de NPC es un efecto
secundario del componente de defecto del metabolismo de colesterol (ver po? ejemplo Capítulo 85 en The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, 7ma edición, McGraw-Hill Inc, Nueva York, pp. 2625- 2639 (1995), Loftus eí al., 1997, Science 277:232-235). De esta manera, § hasta ahora, poca atención se ha enfocado en tratar este componente de la enfermedad. Las células neuronales afectadas en pacientes con NPC experimentan los cambios morfológicos incluyendo el desarrollo de defectos fibrilares que son estructuralmente similares a aquellos
10 observados en los desordenes neurodegenerativos tales como la enfermedad de Alzheimer y esclerosis tuberculosis. La edad de inicio y la rapidez de deterioración neuronal en pacientes con NPC puede varar considerablemente. El mecanismo que sustenta estos cambios neurológicos se desconoce. Se ha propuesto que los niveles elevados de
Í5 GM2, tales como aquellos observados en las neuronas de los pacientes con NPC, pueden inducir la proliferación dendrítica ectópica y la formación de meganeurita (Goodman y Walkley (1996) Brain Res Dev Brain Res ^3: 162-71 ) y dendritogenesis y cambios de neuronas se correlacionan bien con la severidad de la enfermedad en un modelo felino de NPC (March eí
20 al., 1997). N-butildeoxinojirimicina (NB-DNJ) de azúcar imino es un inhibidor potente de alfa-glucosidasa 1 (incluida en la síntesis de N- glican), y aún un inhibidor más potente de glucosiltransferasa de glucosilceramida. NB-DNJ se encuentra actualmente experimentado
25 pruebas clínicas como un tratamiento de enfermedades de Gaucher y
Fabry; desordenes de almacenamiento de glucolípido que resultan de mutaciones en glucocerebrosidasa y alfa-galactosidasa A, respectivamente
(ver Figura 1 ) de los dibujos acompañantes. Lo raciona que sustenta estas pruebas clínicas se basa en las observaciones de que las células tratadas con NB-DNJ producen niveles de glucosilceramida marcadamente reducidos debido a la inhibición de la molécula de síntesis de glucosilceramida (ver Figura 1 de los dibujos acompañantes). De esta manera, las pruebas clínicas se determinan si los beneficios de salud del paciente podrían lograrse al equilibrar una reducción inducida por NB-DNJ en la velocidad de síntesis de glucosilceramida contra la velocidad deteriorada de evacuación glucolípido observada en pacientes con enfermedad de Gaucher y Fabry. Hemos encontrado que el almacenamiento de glucolípido neuronal observado en pacientes con NPC, por ejemplo, también puede reducirse por el tratamiento de NB-DNJ. Como se demuestra en la presente, NB-DNJ reduce marcadamente los síntomas patológicos y clínicos en modelos de murino y felino de NPC. De esta manera, en un primer aspecto, la presente invención proporciona el uso de un inhibidor de síntesis de glucosilceramida en la elaboración de un medicamento para utilizase en el tratamiento de enfermedad de Niemann-Pick tipo C. En el contexto de la presente invención, el término "inhibidor" incluye moléculas tales como N-butildeoxinojirimicina, N-butildeoxigalactonojirimicina o N-nonildeoxinojirimicina y otros inhibidores estructuras de imino azúcar de síntesis de glucosilceramida. Sin embargo,
_A-i además, también incluye otros inhibidores de síntesis de glucosilceramida, incluyendo agentes tales como 1 -fenil-2-decanoilamino- 3-morfolino-1 -propanol (PDMP), D-treo-1 -fenil-2-decanoilamino-3-morfilino- 1-propanol y análogos estructuralmente relacionados de los mismos. Además, la inhibición también puede lograrse por el uso de planteamientos genéticos, en base a la introducción de ácido nucleico que codifica las proteínas o péptidos capaces de inhibir la síntesis de glucolípido o secuencias antisensibles o ARN catalítico capaz de interferir con la expresión de las enzimas responsables de la síntesis de glucosilceramida (por ejemplo, sintasa de glucosilceramida). Una combinación de cualquiera de los inhibidores anteriores puede utilizarse. En un segundo aspecto, la presente invención proporciona el uso de N-butildeoxinojirimicina en la elaboración de un medicamento para utilizarse en el tratamiento de Niemann-Pick tipo C. En un tercer aspecto, la presente invención proporciona el uso de un agente capaz de incrementar la velocidad de degradación del glucolípido neuronal en la elaboración de un medicamento para utilizarse en el tratamiento de enfermedad de Niemann-Pick tipo C. Ejemplos de tales agentes incluyen enzimas que degradan los glucolípidos neuoronales, por ejemplo, hexoseaminidasas lisosomales, galactosidasas, sialidasas y glucosidasa de glucosilceramida, y moléculas que incrementan ta actividad de tal enzima. Además, el agente podría comprender una secuencia de ácido nucleico (ADN o ARN) que codifica las enzimas mencionadas arriba, es decir, tales secuencias podrían introducirse para incrementar la producción natural de tales enzimas.
El metabolismo del lípido juega un papel crítico en otros desordenes neuronales, tales como enfermedad de Alzheimer y epilepsia. Como se menciona arriba, las neuronas del paciente con NPC se presentan con defectos fibrilares evocadores de la morfología observada en la enfermedad de Alzheimer. De manera interesante, la unión del gangliósido GM1 por la proteína beta amiloide induce los cambios conformes que soportan su formación de polímeros fibrosos, y la eliminación fibrilar de esta proteína que es un caso prematuro en la enfermedad de Alzheimer (Yanagisawa eí al (1995) Nat Med 1 : 1062-6, Choo-Smith eí al (1997) Biol Chem 272:22987-90). De esta manera, la reducción de la síntesis de GM1 con agentes tales como NB-DNJ, inhibiría la formación de fibra observada en la enfermedad de Alzheimer. De esta manera, en un cuarto aspecto, la presente invención proporciona el uso de un inhibidor de síntesis de glucosilceramida en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer. De esta manera, en un quinto aspecto, la presente invención proporciona el uso de un inhibidor de síntesis de glucosilceramida en el tratamiento de epilepsia. En un sexto aspecto, la presente invención proporciona el uso de un agente capaz de incrementar la velocidad de degradación del glucolípido en la elaboración de un medicamento para utilizase en e! tratamiento de la enfermedad de Alzheimer o epilepsia. En contraste, las pruebas clínicas preliminares han mostrado que los procesos neuorodegenerativos observados con la enfermedad de Parkison, apolplejia y lesiones del cordón espinal parecen mejorar al tratar
a los pacientes con gangliósido GM1 (Alter (1998) Ann N Y Acad Sci ¿H$391-401 1 ; Schneider (1998) Ann N Y Acad Sci 845:374-81 ). Es posible que la co-administración de inhibidores de síntesis de glucosilceramida proporcionaría el control clínico mauro sobre sus curso de tratamiento. Los inhibidores como NB-DNJ limitarían las inconsistencias específicas del paciente al bloquear su síntesis de glucolípido neuronal. Además, la inhibición de la síntesis de gfucosiceralmida limitaría el metabolismo de los glucolípidos administrados en otras, tal vez formas no productivas. De esta manera, la habilidad para modular la síntesis de glucosilceramida con inhibidores tales como NB-DNJ puede ser útil, el tratamiento de una amplia variedad de desordenes neuoronales. De acuerdo al octavo aspecto de la presente invención, se proporciona el uso de un inhibidor de síntesis de glucosilceramida en la producción de un medicamento para el tratamiento de una condición tratable por la administración de un gangliósido tal como gangliósido GM1 . Los ejemplos de tales condiciones son enfermedad de Parkinson, apoplejía y lesiones del cordón espinal. El medicamento puede comprender además un gangliósido tal como gangliósido GM1 . La invención también proporcionar, en un noveno aspecto, un producto que comprende un inhibidor de síntesis de glucosilceramida y un gangliósido (preferentemente gangliósido GM1 ) como una preparación combinada para su uso simultáneo, secuencial o separado en ei tratamiento de una condición tratable por la administración de un gangliósido, tal como un gangliósido GM1 . Los métodos y procesos para la producción de N-butildeoxinojirimicina puede encontrarse por ejemplo en US-A-4182767, EP-B-0012278, EP-A-0624652, US-A-4266025, US-A-440571 y US-A-5151 51 9, por ejemplo. En otros aspectos, la presente invención proporciona:
(a) un método para el tratamiento de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de síntesis de glucosilceramida; (b) un método para el tratamiento de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad terapéuticamente eficaz de N-butildeoxinojirimicina; (c) un método para el tratamiento de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente capaz de incrementar la velocidad de degradación de glucolípidos neuronales; (d) un método para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer o epilepsia que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de síntesis de glucosilceramida; (e) un método para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer o epilepsia que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad terapéuticamente eficaz de N-butildeoxinojirimicina; (f) un método para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer o epilepsia que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente capaz de incrementar la velocidad de degradación de glucolípidos neuronales; (g) un método para el tratamiento de una condición tratable por la administración de un gangliósido, tal como gangliósido GM1 , que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de síntesis de glucosilceramida; (h) un método para el tratamiento de una condición tratable por la administración de un gangliósido, tal como gangliósido GM1 , que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad terapéuticamente eficaz de N-butildeoxinojirimicina; (i) un método para el tratamiento de una condición tratable por la administración de un gangliósido, tal como gangliósido GM1 , que comprende administrar a un sujeto
en necesidad del mismo una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente capaz de incrementar la velocidad de degradación de glucolípidos neuronales; Los medicamentos descritos en la presente y los cuales también son para utilizarse en los métodos proporcionados en la presente, pueden incluir uno o más de lo siguiente: agentes conservadores, agentes solubilizantes, agentes estabilizadores, agentes humectantes, emulsionantes, endulzantes, colorantes, desodorantes, sales, reguladores, agentes de revestimiento y antioxidantes. También pueden contener agentes terapéuticamente activos además de los compuestos y/o agentes descritos en la presente. Vías de Administración Los medicamentos pueden adaptarse para la administración por cualquier vía apropiada, por ejemplo, por vía oral (incluyendo bucal o sublingual), rectal, nasal, tópica (incluyendo bucal, sublingual o transdérmica), vaginal o parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa o intradérmica). Tal composición puede prepararse por cualquier método conocido en la materia de farmacia, por ejemplo al mezclar los ingredientes activos con un vehículo bajo condiciones estériles. Varias vías de administración se considerarán ahora en mayor detalle: (i) Administración oral Los medicamentos adaptados para la administración oral pueden proporcionarse como cápsulas o tabletas; como polvos o granulos;
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como soluciones, jarabes o suspensiones (en líquidos acuosos y no acuosos); como espumas o batidos comestibles; o como emulsiones. Las tabletas o cápsulas de gelatina dura pueden comprender lactosa, almidón de maíz o derivados del mismo, ácido esteárico o sales del mismo. Las cápsulas de gelatina suave pueden comprender aceites vegetales, ceras, grasas, polioles semi-sólidos o líquidos, etc. Las soluciones y jarabes pueden comprender agua, polioles y azucares. Para la preparación de aceites de suspensión (por ejemplo, aceites vegetales) pueden utilizarse para proporcionar suspensiones de aceite en agua o agua en aceite. (ii) Administración Transdérmica Los medicamentos adaptados para la administración transdérmica pueden proporcionarse como parches discretos que se proponen permanecer en contacto íntimo con la epidermis del receptor por un periodo de tiempo prolongado. Por ejemplo, el ingrediente activo puede suministrarse del parche por iontoforesis (lontoforesis se describe en Pharmaceutical Reserach, 3(6):318 (1986)). (iii) Administración tópica Los medicamentos adaptados para la administración tópica pueden proporcionarse como pomadas, cremas, suspensiones, lociones, polvos, soluciones, pastas, geles, sprays, aerosoles o aceites. Para infecciones del ojo y otros tejidos externos, por ejemplo boca y piel, una crema o pomada tópica se utiliza preferentemente. Cuando se formula en una pomada, el ingrediente activo puede emplearse *«*, « 13 oon ya sea una base de pomada hidromiscible o parafínica. Alternativamente, el ingrediente activo puede formularse en una crema con una base de aceite en agua o base de agua en aceite. Los medicamentos adaptados para la administración tópica al 5 ojo incluyen gotas para ojos. Aquí, el ingrediente activo puede disolverse o suspenderse en un vehículo adecuado, por ejemplo, en un solvente acuoso. Los medicamentos adaptados para la administración tópica en ia boca incluyen tabletas, pastillas y enjuagues bucales. 10 • (iv) Administración Rectal Los medicamentos adaptados para la administración rectal pueden proporcionarse como supositorios o enemas. (v) Administración Nasal Los medicamentos adaptados para la administración nasal que
15 utilizan vehículos sólidos incluyen un polvo grueso (por ejemplo, que tiene un tamaño de partícula en el rango de 20 a 500 micrones). Esto puede administrarse en la manera én que la aspiración se toma, es decir, por la inhalación rápida a través de la nariz desde un recipiente de un polvo mantenido cercano a la nariz. 20 Las composiciones adoptadas para la administración nasal que utiliza vehículos líquidos incluyen rociadores nasales o gotas nasales. Pueden comprender soluciones acuosas o aceitosas del ingrediente activo. Los medicamentos adaptados para la administración por inhalación incluyen vapores y polvos de partículas finas, que pueden
26 generarse por medio de varios tipos de aparatos, por ejemplo, aerosoles
presurizados, nebulizadores o insufladores. Tales aparatos pueden construirse para proporcionar dosis predeterminadas del ingrediente activo. (vi) Administración Vaginal Los medicamentos adaptados para la administración vaginal pueden proporcionarse como, pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o formulaciones de spray. (vii) Administración Parenteral Los medicamentos adaptados para la administración parenteral incluyen suspensiones o soluciones inyectables estériles acuosas y no acuosas. Estas pueden contener antioxidantes, reguladores, bacterioestatos y solutos que convierten a la composición en substancialmente isotónica con la sangre de un receptor propuesto. Otros componentes que pueden estar presentes en tales composiciones incluyen agua, alcoholes, polioles, glicerina y aceites vegetales, por ejemplo. Las composiciones adaptadas para la administración parenteral pueden presentarse en recipientes de dosis única o múltiples dosis, por ejemplo frascos y ampolletas cerradas, y pueden almacenarse en una condición seca en hielo (liofilizada) que requiere solamente la adición de un vehículo líquido estéril, por ejemplo, agua estéril para inyecciones, inmediatamente antes de su uso. Las suspensiones y soluciones de inyección extemporáneas pueden prepararse de polvos estériles, granulos y tabletas. Dosis Las dosis se determinarán fácilmente por pruebas de rutina, y
fc-iAfe í ^»» A „ **ju&-**X.**3m&3&*-. y&$í*ut?j¡t * A I j-j se encontrarán bajo control del médico o clínico. El principio guía para determinar una dosis adecuada será el suministro de una cantidad de material adecuadamente eficaz pero no tóxico, o aceptablemente tóxico. Para NB-DNJ o un compuesto similar, una dosis diaria para un adulto podría esperarse que estuviera en el rango de 1 mg a 2 g de agente activo, y puede encontrarse en el rango de 100 a 800 mg o 300 a 600 mg. La dosis puede administrarse en una dosis diaria única o alternativamente en dos, tres o más dosis durante el día. Las características preferidas de cada aspecto de la invención son como para cada uno de los otros aspectos mutatis mutandis. En los dibujos acompañantes: La Figura 1 es una representación esquemática de la síntesis y degradación de los glucolípidos que contienen glucosilceramida. Los ejemplos de enfermedades genéticas que resultan de un defecto en una de las enzimas requeridas para la degradación del glucolípido se indican. La reacción de enzima inhibida por N-butildeoxinojirimicina para reducir la síntesis de glucolípidos que contiene glucosilceramida, también se muestra. La invención se describirá ahora con referencia a los siguientes ejemplos, que no debería construirse en ninguna manera como limitantes del alcance de la invención. EJEMPLOS Eiemplo 1 - Inhibición de síntomas patológicos y clínicos en un modelo felino de NPC Un modelo de gato doméstico con enfermedad de Niemann-
I JL?t ?-,* .
Pick C ha descrito que demuestra el almacenamiento del hígado característico del desorden de colesterol, glucosilamida, lactosilceramida y * * fosfolípidos, y almacenamiento neuronal de gangliósidos GM2 y GM3 (Lowenthal eí al., (1990) Acta Neuropathol (Berl) 81 : 189-197). Una colonia de reproducción para este modelo de animal con NPC se mantiene para estudiar la enfermedad y sus tratamiento potenciales (Brown eí al., (1996) J. Inherit Metab. Dis. 19:319-330). Los gatos con NPC muestran señales clínicas de la enfermedad presentándose aproximadamente 2-3 meses con ataxia y titubeo, y progreso a varia ataxia y muerte por aproximadamente 10-12 meses. De siete parejas portadoras de NPC felino, los gatos hembra y macho afectados con NPC se seleccionaron para el estudio. El macho sin afectar y la hembra afectada comenzaron el tratamiento con NB-DNJ en 12000 mg/kg/día. Este nivel de administración prueba que es agudamente hepatotóxico a los gatos, así los tratamientos rápidamente tienen que cesarse. Durante un breve periodo de recuperación para estos animales, un gato normal sin relacionar se trata para determinar la dosis tolerada máxima de NB-DNJ en esta especie. En base al trabajo que varía en dosis, las parejas no afectadas y afectadas con NPC se restauraron con NB-DNJ en 50 mg/kg/día. Durante las siguientes semanas, el nivel de administración se mantiene de aquí en adelante en 100 mg/kg/día. Excepto por breves intervalos cuando los tratamiento se detienen debido a la pérdida de apetito transitoria, las dosis de NB-DNJ se continuaron por aproximadamente tres meses. En esta fecha, los animales se sacrificaron para análisis de lípido e histológico.
Las siguientes secciones destaca los descubrimiento neurológicos y médicos para los animales de estudio. Número de gato: S219 Estado: Normal, sin tratar Fecha de Nacimiento: 4 de Noviembre de 1997 Género: Macho Este gato tuvo un curso de desarrollo no remarcable durante el pepodo de tratamiento, con conducta normal, movilidad y reflejos. También experimenta una ganancia de peso normal, que alcanza aproximadamente 3.6 kg al final del periodo de tratamiento. No se sometió a valoraciones neurológicas durante el periodo de tratamiento. Número de gato: S218 Estado: Normal, tratado con NB-DNJ Fecha de Nacimiento: 4 de Noviembre de 1997 Género: Hembra Este gato tuvo un curso de desarrollo no remarcable antes de su periodo de tratamiento con el comienzo de NB-DNJ. Su dosis inicial de 1200 mg/kg/día de NB-DNJ probó que es agudamente hepatotóxico, causando una elevación dramática en sus niveles de suero de las enzimas de hígado. Pa/ece recuperarse completamente de la hepatotoxicidad después de un periodo de dos semanas sin tratamiento, así se recuperó de NB-DNJ en una dosis eventual de 100 mg/kg/día. Durante el curso restante del periodo de tratamiento, muestra algunos síntomas que parecer ser relacionados con el medicamento. Su apetito fue significativamente menor a aquel de un gato normal, requiriendo que se
alimente con la mano durante algunos intervalos. Su ganancia de peso refleja su apetito reducido, ya que pesa solamente aproximadamente 2.4 kg al final del periodo de tratamiento. Un gato hembra normal podría esperarse que pese aproximadamente 4 kg en una edad similar. Sin embargo, mientras fue excepcionalmente pequeña para su edad, no muestra síntomas de emaciación (por ejemplo, desgaste muscular, letargo). El color de su cabello también parece afectarse por el tratamiento de NB-DNJ. Su pelaje se vuelve cada vez más beige que cualquier otro gato en la colonia durante el curso de los tratamientos, aún más que el otro animal tratado con NB-DNJ (S222, ver abajo). Número de gato: S221 Estado: afectado con NPC, sin tratar Fecha de Nacimiento: 4 de Noviembre de 1997 Género: Macho Este gato tiene un curso de desarrollo no remarcable hasta que comienza a mostrar ataxia y los tremores de cabeza característicos de NPC felino en aproximadamente 10 semanas de edad. Durante el curso de las siguientes 20 semanas, sus síntomas de enfermedad empeoraron lentamente. Al final del periodo de tratamiento, mostró ataxia marcada y tremores de cabeza, y requirió que se alimentara a mano para mantener el peso corporal. Lo siguiente es una tabulación de sus descubrimiento neuorológicos y médicos.
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* medido dentro de los 1 0 días antes de la valoración neuronal correspondiente 15 Número de gato: S222 Estado: afectado con NPC, tratado con NB-DNJ Fecha de Nacimiento: 4 de Noviembre de 1997 Género: Hembra Este gato tuvo un curso de desarrollo no remarcable hasta que
20 comienza a mostrar la ataxia y tremores de cabeza característicos de NPC felino en aproximadamente 10 semanas de edad. También se observa que tienen rótulas de luxación bilaterales a aproximadamente el mismo tiempo. Como con S218, su dosis de inicio de 1200 mg/kg/día de NB-DNJ fue agudamente hepatotóxico. Después de un periodo de recuperación sin
25 tratamiento, su dosis eventual de NB-DNJ en 100 mg/kg/día se mantuvo
razonablemente bien. Su apetito se redujo significativamente en relación a tanto los gatos normales como afectados con NPC, requiriendo que se alimenten con la mano con frecuencia. Durante el curso de las siguientes 20 semanas, sus síntomas de enfermedad empeoraron lentamente. Sin embargo, en varias ocasiones se observa por el neurólogo consultante que los síntomas fueron menos severos que aquellos de S221. Como con sus consanguíneos afectados, al final del procedimiento mostró ataxia significativa y temores de cabeza, y requirió la alimentación con la mano continua. También tuvo un efecto de pelaje de color claro de tratamiento de NB-DNJ que se observa para S218. Lo siguiente es una tabulación de sus descubrimientos médicos y neurológicos.
* medido dentro de los 10 días antes de la valoración neuronal correspondiente diagnosticada con rótulas de luxación bilateral.
Número de gato: S161 Estado: normal, tratado con NB-DNJ Fecha de Nacimiento: 17 de Julio de 1995 Género: Hembra Este gato, sin relacionar a cuatro otros en el estudio, se incluye en el estudio para variar la dosis tolerada máxima de NB-DNJ en esta especie. Su desarrolló no fue marcado en el momento cuando el tratamiento comenzó, salvo por el hecho de que tuvo un soplo cardiaco de grado 3/4 debido a la insuficiencia valvular. Comienza el tratamiento con 50 mg(kg/día de NB-DNJ el 1 5 de Marzo de 1 998. El incremento de su dosis a 200 mg/kg/día trae síntomas de letargo, g.i, ditensión y niveles incrementados de enzimas de hígado en su suero. Su dosis se redujo a 100 mg/kg/día por la duración del periodo de tratamiento. Aunque su apetito y respuesta total se redujo en si nivel de dosis, su salud fue suficientemente robusta para mantener los tratamientos. Sin embargo, hacia el final del periodo de tratamiento, necesito ser alimentada a mano para mantener su peso corporal. De esta manera, el tratamiento de NB-DNJ retrasa cualitativamente los síntomas de degeneración neurológico típica para NPC en gatos. Las siguientes secciones destacan los descubrimientos de análisis de lípido e histológico para los animales de estudio. Como con humanos, existe una expresión incrementada de gangliósidos en neuronas de NPC felino. La inmunocitoquímica demuestra numeras neuronas inmunoreactivas de gangliósido en la corteza cerebral y cerebelo. Existe un incremento correspondiente en los cambios de histología y nivel de rosido neuronal observados en humanos con NPC. De manera os gatos con NPC muestran crecimiento dendrita ectópico el observado en niños humanos con esta enfermedad (March Acta Neuropathol, 94: 164-172). Los estudios inmunocitoquímicos con anticuerpos de gangliósido anti-GM2 se utilizaron para probar la expresión de gangliózido en gatos tratados contra no tratados en una manera cualitativa. Tanto los gatos normales, sin considerar el estado de tratamiento, no despliega la inmunoreactividad de GM2 en células piramidales de la corteza cerebral, células de Purkinje, o células dentro de la capa granular del cerebelo. En el gato con NPC no se trata con NB-DNJ, la marcación de GM2 vesicular punteado fue extensivo y marco intensamente numerosas células piramidales de la corteza cerebral que también despliega meganeuritos. También, las células Purkinje de la corteza cerebral y la capa celular granular entera despliega la marcación de GM2 extensiva. En el gato con NPC tratado con NB-DNJ, la marcación de GM2 se observa en la corteza cerebral, pero fue cuantitativamente menos severa en comparación con el gato sin tratar. En el cerebelo, la capa celular granular estuvo libre de inmunoreactividad de GM2, sugiriendo que el almacenamiento de gangliósido se disminuyó cuantitativamente en relación a aquel observado en el gato con NPC sin tratar. Las células Purkinje también demostraron cualitativamente menos marcación de GM2. De esta manera, el tratamiento de NB-DNJ redujo cuantitativamente la acumulación de glucolípidos que contienen glucosilceramida (por ejemplo, GM2) típica para NPC en gatos.
Ejemplo 2 - Inhibición de síntomas patológicos v clínicos en un modelo dß ratófí de NPC Las colonias de ratones mutantes que expresan el fenotipo de NPC se han descrito (Pentchev eí al., 1984, Miyawaki eí al., 1986; Kitagawa, 1987), y se ha validado por un número de criterios como un modelo auténtico de la enfermedad (Akaboshi eí al., 1997). Los ratones de NPC despliegan las señales clínicas de la enfermedad aproximadamente 6-8 semanas de edad con ataxia y tremor de intención suave. Por 9 semanas, los ratones muestran ataxia severa, tremores y pérdida de peso. La muerte resulta en 10-12 semanas. Los cerebros de los ratones con NPC son normales en grosor. Sin embargo, la examinación microscópica revela somata hinchada, formación de meganeurita y regiones de altillo de axón alargado de neuronas piramidales córticas. Los mechones neuríticos y meganeuritas aparecen en neurona de amígdala. La materia blanca y células de Purkinje despliegan los esferoides axonales. La coloración del anticuerpo anti-gangliósido muestra niveles de GM2 incrementados principalmente en neuronas piramidales de lamina ll/lll y V, y astrositos en capa I. Los niveles de GD2 se elevan en las neuronas piramidales por toda la corteza cerebral. Los incrementos moderados también se observa para nivel de GM3 en la capa VI, y GM 1 en neuronas piramidales. No existe cambio correspondiente en niveles de CD3 o asialo-GM2 en cerebros de ratones con NPC. Los pares de reproducción de ratones heterocigozos para la mutación que causa NPC se utilizaron para producir descendencia que son
ufe-Ai .?-. ?.~¡ ?*.* .i -^ homocigotos de NPC"'". Estos animales, junto con sus parejas de tipo silvestre normales, se utilizaron en el siguiente estudio con medicamento de NB-DNJ. Cuando se indica, NB-DNJ se administra diariamente al mezclar con alimento para ratón molido. Los ratones se genotiparon en PCR 2-3 semanas de edad para determinar sus antecedentes genéticos. Diez ratones NPC"', con edades que varían de 3-7 semanas, se introdujeron en el estudio de tratamiento. Siete se trataron con 1200 mg/kg/día y seis no se trataron. Sin considerar el tratamiento, los ratones con NPC entre las edades de 0-5 semanas no despliegan ninguna característica del fenotipo de NPC. Sin embargo, por 8 semanas de edad, 5 fuera de los ratones NPC"' sin tratar desplegaron el fenotipo clínico de su enfermedad (tremor de intención, ataxia), mientras que ninguno de NB- DNJ desplegaron síntomas de efectos neurológicos. Los seis ratones sin tratar mostraron deterioro neurológico severo por 9 semanas de edad, mientras que solamente 4 de 7 ratones tratados con NB-DNJ desplegaron cualquier grado de síntomas. Por 10 semanas de edad, los seis ratones con NPC"' sin tratar se murieron o sacrificaron de acuerdo a los requerimientos del cuidado animal veterinario. En contraste, 4 de 7 ratones con NPC"' tratados con NB-DNJ vivieron en su semana doce. Tre de estos cuatro ratones supervivientes desplegaron algún grado de degeneración neuronal inducida por NPC, mientras uno pareció normal. En este experimento, los ratones con NPC"' sin tratar sobrevivieron 65 + 1 día (promedio + SE; n=6), mientras que los ratones con NPC"' tratados con NB-DNJ en 1200 mg/kg/día sobrevivieron 88 + días (n = /). De esta manera, el tratamiento de NB-DNJ incrementa la longevidad en ratones por
20% en este estudio, así como también retrasar cuantitativamente los síntomas de degeneración neurológica típica de NPC en ratones.