MXPA01005547A - Antagonista del receptor de vitronectina - Google Patents

Abstract

Se describe un compuesto de fórmula (1):(Ver Fórmula);o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, el cual es un antagonista del receptor de vitronectina y esútil en el tratamiento de osteoporosis.

Description

ANTAGONISTA DEL RECEPTOR DE VITRONECTINA CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a un compuesto farmacéuticamente activo que inhibe al receptor de vitronectina y es útil para el tratamiento de inflamación, cáncer y alteraciones cardiovasculares, tales como aterosclerosis y reestenosis, y enfermedades en donde la reabsorción de hueso es un factor, tal como osteoporosis.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las integrinas son una superfamilia de receptores de adhesión celular, las cuales son glucoproteínas transmembranales que se expresan sobre una variedad de células. Estos receptores de adhesión de superficie celular incluyen gpllb/llla (el receptor de fibrinógeno) y avß3 (el receptor de vitronectina). El receptor de fibrinógeno gpllb/llla se expresa sobre la superficie de plaquetas, y media la agregación plaquetaria y la formación de un coágulo hemostático en el sitio de la herida. Philips, et al, Blood, 1988, 71,831. El receptor de vitronectina avß3 se expresa sobre un número de células, incluyendo células endoteliales, de músculo liso, osteoclastos, y tumorales, y, así, tiene una variedad de funciones. El receptor avß3 expresado sobre la membrana de células osteoclastos media la adhesión de osteoclastos a la matriz ósea, un paso clave en el proceso de reabsorción de hueso. Ross, et al, J. Biol. Chem. 1987, 262, 7703. La osteoporosis es una enfermedad caracterizada por la reabsorción excesiva de hueso. El receptor avß3 expresado sobre las células del músculo liso de aorta humana media su migración hacia la neoíntima, un proceso que puede llevar a la reestenosis después de la angioplastía coronaria percutánea. Brown, et al, Cardiovascular Res., 1994, 28, 1815. Adicionalmente, Brooks, et al, Cell, 1994, 79, 1157 ha mostrado que un antagonista a avß3 es capaz de promover la regresión tumoral al inducir apoptosis de vasos sanguíneos angiogénicos. Así, los agentes que bloquean al receptor de vitronectina podrían ser útiles para tratar enfermedades, tales como osteoporosis, reestenosis y cáncer. Se sabe que el receptor de vitronectina se refiere a tres diferentes integrinas, designadas avß?, avß3 y avß5. Horton, et al, Int. J. Exp. Pathol. 1990, 71 , 741. avß3 se une a fibronectina y vitronectina. avß3 se une a una gran variedad de ligandos, incluyendo fibrina, fibrinógeno, laminina, trombospondina, vitronectina, factor von Willebrand, osteopontina y sialoproteína I de hueso. avßs se une a vitronectina. Se ha mostrado que el receptor a vitronectina avß5 esta implicado en la adhesión celular de una variedad de tipos celulares, incluyendo células endoteliales microvasculares, (Davis, et al, J. Cell, Biol, 1993, 51 , 206), y se ha confirmado su papel en la angiogénesis. Brooks, et al, Science, 1994, 264, 569. Esta integrina se expresa sobre los vasos sanguíneos en el tejido de granulación de heridas humanas pero no en la piel normal.

Se sabe que el receptor a vitronectina se une a las proteínas de la matriz del hueso las cuales contienen el motivo tri-péptido Arg-Gly-Asp (o RGD). Así, Horton, et al, Exp. Cell Res. 1991, 195, 368, describen que los péptidos que contienen RGD y los anticuerpos al receptor anti-vitronectina (23C6) inhiben la reabsorción de dentina y la extensión celular por los osteoclastos. Además, Sato, et al, J. Cell Biol. 1990, 111 , 1713 describen que ia equistatina, un péptido del veneno de serpiente que contiene la secuencia RGD, es un inhibidor potente de la reabsorción ósea en tejido cultivado, e inhibe el anclaje de osteoclastos al hueso. Actualmente se ha descubierto que un cierto compuesto es un potente inhibidor de los receptores vß3 y avßs. En particular, se ha descubierto que dicho compuesto es un inhibidor más potente para el receptor de vitronectina que para el receptor de fibrinógeno.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Esta invención comprende un compuesto de ia fórmula (I) como se describe aquí, la cual tiene actividad farmacológica para la inhibición del receptor de vitronectina y es útil en el tratamiento de inflamación, cáncer y alteraciones cardiovasculares, tales como la aterosclerosis y reestenosis, y enfermedades en donde la reabsorción de hueso es un factor, tal como la osteoporosis.

Esta invención es una composición farmacéutica que comprende un compuesto de conformidad con la fórmula (I) y un vehículo farmacéutico. Esta invención también es un método para tratar enfermedades que son mediadas por el receptor de vitronectina. En un aspecto particular, el compuesto de esta invención es útil para tratar aterosclerosis, reestenosis, inflamación, cáncer y enfermedades en donde ía reabsorción de hueso es un factor, tal como en osteoporosis.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Esta invención comprende un compuesto novedoso que es un inhibidor más potente para el receptor de vitronectina que para el receptor de fibrinógeno. El compuesto novedoso comprende un núcleo de dibenzocicloheptano en el cual un sustituyente que contiene nitrógeno está presente sobre uno de los anillos aromáticos de seis miembros del dibenzocicloheptano y un sustituyente alifático que contiene una porción acida está presente sobre el anillo de seis miembros del dibenzocicloheptano. Se cree que el sistema de anillos del dibenzocicloheptano orienta las cadenas laterales sustituidas de los anillos de cinco y siete miembros de manera que interaccionan favorablemente con el receptor de vitronectina. Se prefiere que existan alrededor de doce a catorce enlaces covalentes que intervienen vía el patrón intramolecular más pequeño entre el grupo ácido de los sustituyentes alifáticos de los anillos de seis miembros del dibenzocicloheptano y el nitrógeno del sustituyente que contiene nitrógeno en uno de los anillos aromáticos con seis miembros del dibenzocicloheptano. Esta invención comprende un compuesto de fórmula (I): o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. El compuesto de la fórmula (I) inhibe la unión de vitronectina y de otros péptidos que contienen RGD al receptor de vitronectina. La inhibición del receptor de vitronectina sobre ios osteoclastos inhibe la reabsorción de hueso por los osteoclastos y es útil en el tratamiento de enfermedades en donde la reabsorción de hueso está asociada con patología, tal como osteoporosis y osteoartritis. En otro aspecto, esta invención es un método para estimular la formación de hueso que comprende administrar un compuesto de fórmula (I) que causa un incremento en la liberación de osteocalcina. La producción incrementada de hueso es un claro beneficio en los estados de enfermedad en donde hay una deficiencia de masa ósea mineralizada o se desea remodelamiento óseo, tal como fracturas en proceso de sanado y la prevención de fracturas óseas. Las enfermedades y alteraciones metabólicas que resultan en la pérdida de estructura ósea también podrían beneficiarse de dicho tratamiento. Por ejemplo, el hiperparatiroidismo, enfermedad de Paget, hipercalcemia de la malignidad, lesiones osteolíticas producidas por metástasis óseas, pérdida de hueso debida a la inmovilidad o deficiencia de hormonas sexuales, enfermedad de Behcet, osteomalacia, hiperostosis y osteopetrosis, podrían beneficiarse a partir de la administración de un compuesto de esta invención. Adicionalmente, puesto que el compuesto de la presente invención inhibe al receptor de vitronectina sobre un número de distintos tipos celulares, dicho compuesto podría ser útil en el tratamiento de alteraciones inflamatorias, tales como artritis reumatoide y psoriasis, y enfermedades cardiovasculares, tales como aterosclerosis y reestenosis. El compuesto de la fórmula (I) de la presente invención puede ser útil para el tratamiento o prevención de otras enfermedades incluyendo, pero no limitado a, alteraciones tromboembolíticas, asma, alergias, síndrome de dolor respiratorio del adulto, enfermedad del hospedero en contra del injerto, rechazo de transplante de órganos, choque séptico, eczema, dermatitis por contacto, enfermedad por desechos inflamatorios, y otros enfermedades autoinmunes. El compuesto de la presente invención también puede ser útil para la cicatrización. El compuesto de la presente invención también es útil para el tratamiento, incluyendo la prevención, de alteraciones angiogénicas. El término alteraciones angiogénicas como se usa aquí incluye condiciones que implican neovascularización anormal. En donde el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos es la causa de, o contribuye a, la patología asociada con una enfermedad, ia inhibición de la angiogénesis reducirá el efecto deletéreo de la enfermedad. Un ejemplo de dicha enfermedad blanco es la retinopatía diabética. En donde se requiere el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos para mantener el crecimiento del tejido deletéreo, inhibición de angiogénesis que reducirá el suplemento sanguíneo al tejido y por lo tanto contribuirá a ia reducción en masa de tejido basándose en los requerimientos de suplemento sanguíneo. Los ejemplos incluyen el crecimiento de tumores en donde la neovascularización es un requerimiento continúo con el objeto de que el tumor crezca y el establecimiento de metástasis del tumor sólidas. Así, el compuesto de la presente invención inhibe la angiogénesis de tejido tumoral, por lo tanto previniendo la metástasis tumoral y el crecimiento del tumor. Así, de conformidad con los métodos de la presente invención, la inhibición de angiogénesis usando el compuesto de la presente invención puede mejorar los síntomas de la enfermedad, y, en algunos casos, curar la enfermedad. Otro blanco terapéutico para el compuesto de la presente invención son las enfermedades oculares caracterizadas por neovascularización. Dichas enfermedades oculares incluyen alteraciones neovasculares cornéales, tales como transplante de cornea, queratitis herpética, queratitis luética, pterigium y pannus neovascular asociado con uso de lentes de contacto. Las enfermedades oculares adicionales también incluyen degeneración macular relacionada con la edad, histoplasmosis presuntamente ocular, retinopatía de premadurez y glaucoma neovascular.

Esta invención además provee un método para inhibir el crecimiento del tumor que comprende la administración paso a paso o en combinación física de un compuesto de la fórmula (I) y un agente antineoplástico, tal como topotecano y cisplatino. El compuesto novedoso de esta invención es ácido (S)-10,11-dihidro-3-[2-(5,6,7,8-tetrahidro-1 ,8-neftiridin-2-¡l)-1-etoxi]-5H-dibenzo[a,d]cicloheptano-10-acético o sal farmacéuticamente aceptable del mismo. De conformidad con la presente invención, se prefiere la configuración (S) del compuesto de fórmula (I). También se incluye en esta invención los profármacos de los compuestos de esta invención. Los profármacos se consideran como vehículos unidos covalentemente que liberan la actividad del fármaco parental de conformidad con la fórmula (I) in vivo. Así, en otro aspecto de esta invención están los profármacos novedosos, los cuales también son intermediarios en la preparación del compuesto de la fórmula (I), de la fórmula (II): (II) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Las abreviaturas y símbolos comúnmente usados en las técnicas empíricas y químicas se usan aquí para describir los compuestos de esta invención. En general, la abreviación de aminoácidos que se sigue es la IUPAC-IUB unión de la comisión sobre nomenclatura bioquímica como se describe en Eur. J. Biochem., 158, 9 (1984). Alquilo Ove significa un grupo alquilo opcionaimente sustituido de 1 a 6 átomos de carbono que incluyen metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, t-butilo, pentilo, n-pentilo, isopentilo, neopentilo y hexilo y los isómeros alifáticos simples de los mismos. Cualquier alquilo C-.-6 puede estar opcionalmente sustituido por ei grupo Rx, el cual puede estar sobre cualquiera de los átomos de carbono que resultan en una estructura estable y está disponible para técnicas sintéticas convencionales. Los grupos adecuados para Rx son alquilo C1-4, OR", SR", C1-4 alquilsulfonilo, C1-4 alquilsulfonoxilo, -CN, N(R")2l CH2N(R")2, -NO2, -CF2, .CO2 R", -CON(R")2, -COR", -NR"C(0)R", F, Cl, Br, I, o CF3S(O)r_ en donde r es 0,1 o 2 y R" es H o alquilo d-6. Ciertos grupos radicales se abrevian aquí. t-Bu se refiere al radical butilo terciario, Boc se refiere al radical t-butiloxicarbonilo, Fmoc se refiere al radical fluorenilmetoxicarbonilo, Ph se refiere al radical fenilo, Cbz se refiere al radical benciloxicarbonilo, Bn se refiere al radical bencilo, Se me refiere a metilo, Et se refiere a etilo, Ac se refiere a acetilo, Alk se refiere a alquilo C- , Nph se refiere a 1 ó 2-naftilo y cHex se refiere a ciciohexilo. Tet se refiere a 5-tetrazoIilo.

Ciertos reactivos están abreviados aquí. DCC se refiere a diciclohexilcarbodiimida, DMAP se refiere a dimetilaminpiridina, DIEA se refiere a diisopropiletilamina, EDC se refiere a 1-(3-dimetilaminpropil)-3-etiicarbodiimida, hidroclorada. HOBt se refiere a 1-hidroxibenzotriazol, THF se refiere a tetrahidrofurano, DIEA se refiere a diisopropiletilamina, DIAD se refiere a diisopropiiazodicarboxilato, DME se refiere a dimetoxietano, DMF se refiere a dimetilformamida, NBS se refiere a N-bromosuccinamida, Pd/C se refiere a paladio o a catalizadores de carbono, PPA se refiere a ácido polifosfórico, DPPA se refiere a difenilfosforilazida, BOP se refiere a Benzotriazol-1-iloxi-tr¡s(dimetil-amino)fosfonio hexafluorofosfato, HF se refiere a ácido hidrofluórico, TEA se refiere a trietilamina, TFA se refiere a ácido trifluoroácetico, PCC se refiere a clorocromato de piridinio. Los compuestos de la fórmula (I) pueden prepararse por los métodos descritos en Bondinell et al., publicación PCT No. WO 97/01540 (solicitud internacional No. PCT/US96/11108), publicada el 16 de enero de 1997, la descripción entera de la cual esta incorporada aquí como referencia. Adicionalmente, el compuesto de la fórmula (I) se prepara por métodos análogos a aquellos descritos en ios esquemas que se detallan a continuación.

ESQUEMA I a) Pd/C 10%, HOAc; b)SOCl , tolueno; c) AICI3, CH2CI2 El esquema 1 detalla la preparación de un intermediario útil en la preparación del compuesto de la fórmula (I).

ESQUEMA II a)LiN (TMS)2, bromoacetato de etilo; b) reactivo de Jones Os?4; c) H2, Pd/C 10%, HOAC; d)C2O2Cl2, DMF; e) AICI3, CH3CI3, RT; f) H2, Pd/C 10%, HOAC El esquema II también detalla la preparación de un intermediario útil en la preparación del compuesto de la fórmula (I).

ESQUEMA lll (a) EtOAc/LiHMDS, THF; (b) H2, Pd/C 10%, conc. HCl, AcOH; (c) EtSH, AlCI3, CH2CI2; (d) 2-(5.6,7,8-getrah¡dro-1 ,8-naft¡rid¡n-2-il)-1 -etanol, diisopropil azodicarboxilato, (Ph)3P; (e) LiOH 1.0 N, EtOH; HCl. El esquema lll detalla la preparación del compuesto de la fórmula (I). La reacción de 111-1 (el cual es un compuesto del esquema I-3) en una reacción tipo aldol con el enolato de acetato de etilo, que puede generarse a partir de acetato de etilo con la exposición de una base de amida apropiada, por ejemplo diisopropilamida de litio (LDA) o bis(tr¡metilsililo)amida de litio (LiHMDS), que da III-2. Frecuentemente, THF es el solvente de elección para una reacción aldol, aunque THF en la presencia de varios aditivos, por ejemplo HMPA o TMEDA, es frecuentemente usado. La reducción de III-2 para dar III-3 (el cual es un compuesto del esquema H-6) se puede acompañar por la hidrogenolisis sobre un catalizador apropiado, por ejemplo metal de paladio sobre carbón activado (Pd/C), en un solvente apropiado, tai como ácido acético, en la presencia de un ácido mineral tal como HCl. Alternativamente, esta reducción puede acompañarse por el tratamiento de III-2 con trietilsilano en la presencia de trifiuoruro eterato de boro por el método general de Orfanopoulos y Smonour (Synth, Commun. 1998, 833). La remoción del éter metílico de III-3 para dar III-4 puede lograrse con BBr3 en un solvente inerte, por ejemplo CH2CI2, o por reacción con etanetiol y AICI3 en un solvente inerte, preferiblemente CH2CÍ2. Otros métodos útiles para la remoción de un éter metílico se describen en Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis" (publicado por John Wifey e hijos). El compuesto 4 del esquema 3 (III-4) se hace reaccionar con 2-(5,6,7,8-tetrahidro-1 ,8-naftiridin-2-¡l)-1 -etanol para permitir III-5. La reacción está mediada por el complejo que se forma entre el azodicarboxilato diisopropíiico y trifenilfosfina, está conducido en un solvente apropiado, por ejemplo THF, CH2C.2. o DMF. El éster etílico de III-5 se hidroliza usando base acuosa, por ejemplo, LiOH en THF acuoso o NaOH en metanol o etanol acuoso, y la sal de carboxilato intermediaria se acidifica con un ácido adecuado, por ejemplo TFA o HCl, para permitir el ácido carboxílico III-6. Alternativamente, la sal de carboxilato intermediaria puede aislarse, si se desea, a partir de una sal de carboxilato del ácido carboxílico libre que puede prepararse por métodos bien conocidos por los expertos en la técnica.

ESQUEMA IV (a) PhOH, Cu, K2CO3; (b) sulfuro, morfolina; (c) KOH, H2O, i-PrOH; (d) SOCI2, benzeno; (e) AICI3, CH2CI2; (f) EtOAc, LiN(TMS)2, TMEDA, THF; (g) EtsSiH, BF3. Oet2, CH2CI2; (h) H2, Pd/C, EtOH; (i) BBr3, CH2CI2. La 2-fluoro-4-metoxiacetofenona (IV-1) comercialmente disponible reacciona con un alcohol, por ejemplo fenol, en la presencia de metal de cobre y una base adecuada, por ejemplo K2CO3, para permitir el éter de arilo IV-2. Un tratamiento con azufre y una amina primaria o secundaria apropiada, preferiblemente morfolina, de conformidad con el método general de (J. Med. Chem. 1982, 25, 855), IV-2 se convierte a I -3 en una reacción clásica Willgerodt-Kindler. La tioamida así obtenida se hidroiiza al ácido carboxílico correspondiente IV-4 por reacción con un hidróxido de metal alcalino, adecuadamente KOH, en un solvente alcohólico acuoso, tal como MeOH, EtOH, o ¡-PrOH acuoso. El ácido carboxílico IV-4 se convierte al cloruro ácido correspondiente por reacción ya sea con SOCI2 o cloruro de oxaliio de conformidad con las condiciones bien conocidas por los expertos en la técnica. El tratamiento de este cloruro ácido con un catalizador apropiado Friedel-Crafts, tal como A 3 o SnCU, en un solvente inerte, tal como CH2CI2 o CS2, provee la cetona cíclica IV-5. Alternativamente, IV-4 acida puede convertirse directamente a cetona IV-5 bajo condiciones acidas, por ejemplo con ácido polifosfórico. La reacción de IV-5 en una reacción de tipo aldol con el enolato del acetato de etilo, que puede generarse a partir de acetato de etilo con la exposición de una base de amida apropiada, por ejemplo diisopropilamida de litio (LDA) o bis (trimetilsililo) amida de litio (LiHMDS), que da IV-6. Frecuentemente, THF es el solvente de elección para una reacción de aldol, aunque THF en la presencia de varios aditivos, por ejemplo HMPA o TMEDA, es más frecuentemente usado. La reducción de IV-6 para dar IV-7 puede lograrse con un tratamiento de IV-6 con trietilsilano en la presencia de eterato de trifluoruro de boro por el método general de Orphanopoulos y Smonu (Synth. Commun. 1988, 833). Cualquier subproducto olefínico que resulte de la eliminación del alcohol se reduce por hidrogenación sobre un catalizador apropiado, por ejemplo metal paladio sobre carbón activado (Pd/C), en un solvente apropiado, tal como MeOH o EtOH. Alternativamente, la reducción de IV-6 para dar IV-7 puede lograrse por hidrogenolisis en la presencia de un ácido mineral tal como HCl. Típicamente, esta reacción se cataliza por Pd/C, y se conduce óptimamente en ácido acético. La remoción del éster metílico de IV-7 para dar IV-8 puede lograrse con BBr3 en un solvente inerte, por ejemplo CH2C_2. o por reacción con etanetiol y AICI3 en un solvente inerte, preferiblemente CH2CÍ2. Otros métodos útiles para la remoción de un éter metílico se describen en Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis" (publicado por John Wiley e hijos). IV-8 se convierte subsecuentemente al compuesto de la fórmula (I) luego dei procedimiento descrito en el esquema lll. La adición de sales acidas del compuesto se preparan de manera estándar en un solvente adecuado para el compuesto parental y un exceso de ácido, tal como clorhídrico, bromhídrico, fluorhídrico, sulfúrico, fosfórico, acético, trifluoroacético, maleico, succínico o metanesulfónico. Ciertos compuestos forman sales inertes o zwitteriones los cuales pueden ser aceptables. Las sales catiónicas se preparan al tratar el compuesto parental con un exceso de un reactivo alcalino, tal como hidróxido, carbonato o alcóxido, que contienen el catión apropiado; o con una amina orgánica apropiada. Los cationes tales como Li+, Na+, K+, Ca++, Mg++ y NH4 son ejemplos específicos de cationes presentes en sales farmacéuticamente aceptables. Esta invención también provee una composición farmacéutica que comprende un compuesto de conformidad con la fórmula (I) y un vehículo farmacéuticamente aceptable. De conformidad, el compuesto de la fórmula (I) puede usarse en la fabricación de un medicamento. Las composiciones farmacéuticas del compuesto de la fórmula (I) preparadas como se describe de aquí en adelante pueden formularse como soluciones o polvos liofilizados para administración parenteral. Los polvos pueden reconstituirse por la adición de un diluyente adecuado o de un vehículo farmacéuticamente aceptable antes de su uso. La formulación líquida puede ser una solución reguladora de pH, isotónica, acuosa. Los ejemplos de diiuyentes adecuados son soluciones salinas isotónicas normales, dextrosa en agua al 5% estándar o regulador de pH de sodio o de acetato de sodio en solución. Dichas formulaciones son específicamente adecuadas para administración parenteral, pero también se pueden usar para administración oral o se pueden contener en un inhalador de dosis medida o nebulizador para insuflación. Se puede desear añadir excipientes tales como polivinilpirrolidona, gelatina, hidroxicelulosa, acacia, polietilenglicol, manitol, cloruro de sodio o citrato de sodio. Alternativamente, estos compuestos pueden encapsularse, formarse en tabletas o prepararse en una emulsión o jarabe para administración oral. Para mejorar o estabilizar la composición, o para facilitar la preparación de la composición, pueden añadirse vehículos sólidos o líquidos farmacéuticamente aceptables. Los vehículos sólidos incluyen almidón, lactosa, dihidrato de sulfato de calcio, térra alba, estearato de magnesio o ácido esteárico, talco, pectina, acacia, agar o gelatina. Los vehículos líquidos incluyen jarabe, aceite de cacahuate, aceite de olivo, solución salina y agua. El vehículo también puede incluir un material de liberación sostenida tal como monoestarato de glicerilo o diesterato de glicerilo, solo o con una cera. La cantidad de vehículo sólido varía pero, preferiblemente, será entre alrededor de 20 mg a alrededor de 1 g por unidad de dosis. Las preparaciones farmacéuticas se hacen siguiendo las técnicas convencionales de farmacias que implican molienda, mezclado, granulado, y comprensado, cuando se necesiten, para formas de tableta; o molienda, mezclado y llenado para formas de cápsula de gelatina. Cuando un vehículo líquido se usa, la preparación estará en la forma de un jarabe, elixir, emulsión o una suspensión acuosa o no acuosa. Dicha formulación líquida puede administrarse directamente p.o. o utilizarse para llenar cápsulas de gelatina suave. Para administración rectal, el compuesto de esta invención también puede combinarse con excipientes tales como mantequilla de cocoa, glicerina, gelatina o glicoles de polietileno y moldearse dentro de un supositorio. Los compuestos descritos aquí son antagonistas del receptor a vítronectina, y son útiles para tratar enfermedades en donde la patología subyacente se atribuye al ligando o células que interaccionan con el receptor a vitronectina. Por ejemplo, estos compuestos son útiles para el tratamiento de enfermedades en donde la pérdida de matriz ósea crea patología. Así, el compuesto de la presente es útil para el tratamiento de osteoporosis, hiperparatiroidismo, enfermedad de Paget, hipercalcemia de malignidad, lesiones osteolíticas producidas por metástasis ósea, pérdida de hueso debida a inmovilización o deficiencia de hormonas sexuales. Se cree que el compuesto de esta invención también tiene una utilidad como agente antitumoral, anti-angiogénico, anti-inflamatorio y antimetastásico y puede ser útil en el tratamiento de aterosclerosis y reestenosis. El compuesto se administra ya sea oralmente o parenteralmente al paciente, de manera tal que la concentración del fármaco es suficiente para inhibir la reabsorción ósea, u otras indicaciones. La composición farmacéutica que contiene el compuesto se administra en dosis oral de alrededor de 0.1 a alrededor de 50 mg/kg de manera consistente con las condiciones del paciente. Preferiblemente la dosis oral podrá ser de 0.5 a alrededor de 20 mg/kg. Para terapia aguda, se prefiere la administración parenteral. Es más efectiva una infusión intravenosa del péptido en dextrosa 5% en agua o salina normal, o una formulación similar con excipientes adecuados, aunque una inyección de bolo intramuscular también es útil. Típicamente, la dosis parenteral será de alrededor de 0.01 a alrededor de 10 mg/kg; preferiblemente entre 0.1 y 20 mg/kg. El compuesto se administra una a cuatro veces ai día a un nivel para lograr una dosis diaria total de alrededor de 0.4 a alrededor de 400 mg/kg. El nivel preciso y el método por medio del cual el compuesto se administra es fácilmente determinado por un experto en la técnica comparando los niveles sanguíneos del agente con las concentraciones requeridas para que tenga un efecto terapéutico. Esta invención además provee un método para tratar osteoporosis o inhibir la pérdida ósea que comprende la administración paso a paso o en combinación física de un compuesto de la fórmula (l) y otros inhibidores de reabsorción ósea, tales como bifosfonatos (es decir, alendronato), terapia de reemplazo hormonal, anti-estrógenos, o calcitonina. Además, esta invención provee un método para el tratamiento usando un compuesto de esta invención y un agente anabólico, tal como la proteína morfogenética de hueso, hiproclavona, útiles en la prevención de la pérdida de hueso y/o para incrementar la masa ósea. Adicionalmente, la invención provee un método para inhibir el crecimiento tumoral que comprende la administración paso a paso o en combinación física de un compuesto de la fórmula (I) y un agente antineoplástico. El compuesto de la clase análoga a campotecina, tai como topotecano, irinotecano y 9-aminocampotecina, y complejos de coordinación de platino, tales como cisplatino, ormaplatina y tetraplatina, son grupos bien conocidos de agentes antineoplásicos. Los compuestos de la clase análoga a camptotecina se describe en la patente de E. U. A. números 5,004,758, 4,604,463, 4,473,692, 4,545,880, 4,342,776, 4,513,138, 4,399,276, solicitud de patente EP número de publicación 0 418 099 y 0 088 642, Wani, et al., J. Med. Chem., 1986, 29, 2358, Wani, et al., J. Med. Chem., 1980, 23, 554, Wani, et al., J. Med. Chem., 1987, 30, 1774, y Nitta, et al., Proc. 14th Interna?onal Congr. Chemotherapy., 1985, Anticancer Section 1 , 28, la descripción entera de las cuales esta incorporada aquí como referencias. El complejo coordinador de platino, cisplatino, esta disponible bajo el nombre de Platinol® a partir de la corporación Bristol Myers-Squibb. Las formulaciones útiles para cisplatino se describen en las patentes de E. U. A. números 5,562,925 y 4,310515, la descripción completa de ias cuales esta incorporada aquí como referencia. En el método para inhibir el crecimiento tumoral que comprende la administración paso a paso o en combinación física de un compuesto de la fórmula (I) y un agente antineoplástico, el compuesto coordinador de platino, por ejemplo cisplatino, puede administrarse usando infusión lenta intravenosa. El vehículo preferido es una solución dextrosa/salina que contiene manitol. El calendario de dosis del compuesto de coordinación de platino puede ser con la base a partir de 1 o a alrededor de 500 mg por metro cuadrado (mg/m2) de área de superficie corporal por curso de tratamiento. Las infusiones de los compuestos de coordinación de platino pueden darse una o dos veces a la semana, y los tratamientos semanales pueden repetirse varias veces. Usando un compuesto de la clase camptotecina análoga en una administración parenteral, el curso de la terapia generalmente emplea de alrededor de 0.1 a alrededor de 300.0 mg/m2 de área de superficie corporal por día por alrededor de cinco días consecutivos. Más preferiblemente, el curso de terapia empleado para topotecano es de alrededor de 1.0 a 2.0 mg/m2 de área de superficie corporal por día por alrededor de cinco días consecutivos. Preferiblemente, el curso de terapia se repite al menos una vez a los siete días con un intervalo de alrededor de veintiocho días. Las composiciones farmacéuticas pueden formularse tanto con ei compuesto de la fórmula (I) como con la del agente antineoplástico en el mismo contenedor, pero se prefiere la formulación en diferentes contenedores. Cuando ambos agentes se proveen en forma de una solución, estos pueden estar contenidos en un sistema infusión/inyección para administración simultanea o en un arreglo en tándem. Para la administración conveniente del compuesto de la fórmula (I) y el agente antineoplástico al mismo tiempo o a tiempos diferentes, se preparará un equipo, que comprende, en un único contenedor, tal como una caja, cartón u otro contenedor, botellas individuales, bolsas, viales u otros contenedores cada uno teniendo una cantidad efectiva del compuesto de la formula (I) para administración parenteral, como se describió anteriormente, y una cantidad efectiva del agente antineoplástico para administración parenteral, como se describe anteriormente. Dicho equipo puede comprender, por ejemplo, ambos agentes farmacéuticos en contenedores separados o en el mismo contenedor, opcionalmente como pastillas liofilizadas y contenedores de soluciones para reconstitución. Una variación de esto es incluir la solución para reconstitución y la pastilla liofilizada en dos cámaras de un único contenedor, el cual se puede mezclar antes del uso. Con dicho arreglo, el agente antineoplástico y el compuesto de esta invención pueden empaquetarse separadamente, en dos contenedores, o liofilizados juntos como polvo y provistos en un único contenedor. Cuando ambos agentes se proveen en forma de solución, estos pueden estar contenidos en un sistema infusión/inyección para administración simultánea o en arreglo en tándem. Por ejemplo, el compuesto de la fórmula (I) puede estar en una forma inyectable i.v., o en bolsas de infusión unidas en serie, por tubos, con el agente antineoplástico en una segunda bolsa de infusión. Usando dicho sistema, un paciente puede recibir una inyección tipo bolo inicial o infusión del compuesto de la fórmula (I) seguido por una infusión del agente antineoplástico. El compuesto puede probarse en uno o en varios ensayos biológicos para determinar la concentración del compuesto que se requiere para que tenga un efecto farmacológico dado.

Inhibición de la unión a vitronectina Unión de vß3 a la fase sólida [3H]-SK&F-107260: Se diluyó avß3 de placenta humana o plaquetas humanas (9.1-0.3 mg/ml) en reguiador de pH T (que contiene 2 mM CaCI2 y octliglucósido 1%) con regulador de pH T que contiene 1 mM CaCI2, 1 mM MnCI , 1 mM MgCI2 (regulador de pH A) y 0.05% NaN3, y luego inmediatamente se añadieron a platos de 96 pozos de ELISA (Corning, New York, NY) a 0.1 mi por pozo. Se añadió 0.1-0.2 µg de avß3 por pozo. Los platos se incubaron toda la noche a 4°C. En el momento del experimento, los pozos se lavaron una vez con regulador de pH A y se incubaron con 0.1 ml de albúmina de suero de bovino 3.5% en el mismo regulador de pH por 1 hr. a temperatura ambiente. Luego de la incubación los pozos se aspiraron completamente y se lavaron dos veces con 0.2 ml de regulador de pH A. Los compuestos se disolvieron en DMSO 100% para dar una solución de almacenamiento 2 mM, la cual se diluyó con regulador de pH de unión (Tris-HCl 15 mM (pH 7.4), NaCI 100 mM, CaCI2 1 mM, MnCI2 1 mM, MgC_2 1 mM) hasta una concentración del compuesto final de 100 µM. Esta solución se diluye luego a la concentración final requerida del compuesto. Se añadieron varias concentraciones de antagonistas no marcados (0.001- 100 µM) a los pozos por triplicado, luego de la adición de 5.0 nM de [3H]-SK&F-107260 (65-86 Ci/mmoles). Los platos se incubaron por 1 hr a temperatura ambiente. Siguiendo la incubación los pozos se aspiraron completamente y se lavaron una vez con 0.2 ml de regulador de pH A enfriado en hielo en una manera pozo a pozo. Los receptores se solubilizaron con 0.1 ml de SDS 1% y se determinó la unión [3H]-SK&F-107260 por conteo de centelleo líquido con la adición de 3 ml de Ready Safe en un contador de centelló líquido Beckman LS, con 40% de eficiencia. Se determinó la unión no específica de [3H]-SK&F-107260 en presencia de SK&F-107260 2 µM y fue consistentemente menor que 1% de ia entrada del radioligando total. El IC50 (concentración del antagonista para que inhiba 50% de la unión de [3H]-SK&F-107260) se determinó por un programa no linear, rutina de llenado de la curva por cuadrados, que fue modificado a partir del programa LUNDON-2. La K¡ (constante de disociación del antagonista) se calculó de acuerdo con la ecuación: K¡ IC5o/(1+L/K ), en donde L y K fueron las concentraciones y la constante de disociación de [3H]-SK&F- 107260, respectivamente. El compuesto de la presente invención inhibe la unión de vitronectina a SK&F 107260 a una K¡ de alrededor de 1.7 nanomolar. Los compuestos de esta invención también se probaron para reabsorción ósea in vitro e in vivo en ensayos estándar en la técnica para evaluar la inhibición de ia formación ósea, tal como el ensayo de formación de depresiones descrita en EP 528 587, que se puede llevar a cabo usando osteoclastos humanos en lugar de osteoclastos de rata, y el modelo de rata ovarieactomizada, descrito por Wronski et al., Cells and Materials 1991 , Sup. 1 ,69-74.

Ensayo de migración de células de músculo liso vascular Se usaron células de músculo liso de la aorta de rata o de humano. La migración celular se monitoreó en una cámara de cultivo celular Transwell al usar una membrana de policarbonato con poros de 8 µm (Costar). La superficie inferior del filtro se cubrió con vitronectina. Las células se resuspendieron en DMEM suplementado con albúmina de suero bovino 0.2% a una concentración de 2.5 - 5.0 x 106 células/mL. y se pretrataron con el compuesto de prueba a varias concentraciones por 20 minutos a 20°C. El solvente solo se usó como control. Se colocaron 0.2 mL de la suspensión celular en el compartimento superior de la cámara. El compartimento inferior contenía 0.6 mL de DMEM suplementado con albúmina de suero bovino 0.2%. La incubación se llevó a cabo a 37°C en una atmósfera de 95% aire/5% CO2 por 24 horas. Después de la incubación, las células que no migraron de la superficie superior del filtro se removieron por raspado suave. El filtro se fijó en metanol y se tiñó con tinción de Giemsa 10%. La migración se midió ya sea por a) contar el número de células que habían migrado a la superficie inferior del filtro o por b) extracción de las células teñidas con ácido acético 10% seguido por determinación de la absorbancia a 600 nM.

Modelo de rata tiroparatiroidectomizada Cada grupo experimental consistía de 5-6 ratas machos adultos Sprague-Dawley (peso corporal 250-400 g). Las ratas se tiroparatiroidectomizan (por el vendedor, Taconic Farms) 7 días antes de su uso. Todas las ratas recibieron una dosis de reemplazo para tiroxina cada 3 días. Al recibir ias ratas, los niveles de calcio ionizado circulantes se midieron en la sangre completa inmediatamente después de que se había depositado por punción venosa de la cola dentro de tubos heparinizados. Las ratas se incluyeron solamente si el nivel Ca ionizado (medido con el analizador de calcio pH Ciba-Cóming modelo 634) era <1.2 mM/L. A cada rata se le coloca un catéter venoso y arterial para la liberación de material de prueba y para muestra de sangre respectivamente. Las ratas se colocan sobre una dieta libre de calcio y agua ionizada. Los niveles de Ca de línea base se miden y cada rata se administra con vehículo control o con hormona paratiroidea humana péptido 1-34 (hPTH1-34, dosis 1.25 ug/kg/h en solución salina/albúmina de suero bovina 0.1%, Bachem, Ca) o una mezcla de hPTH1-34 y material de prueba, mediante infusión intravenosa continua vía el catéter venoso usando una bomba de jeringa externa. La respuesta calcémica de cada rata se midió a intervalos de dos horas durante el período de infusión de 6-8 horas.

Ensayos de adhesión y de reabsorción de osteoclastos humanos Los ensayos de adhesión y de reabsorción de las fosas se han desarrollado y estandarizado usando osteoclastos humanos normales derivados de tejido de osteoclastoma. El ensayo 1 se desarrolló para la medición de ios volúmenes de los orificios de osteoclastos mediante microscopía confocal láser. El ensayo 2 se desarrolló como una selección mayor en la cual los fragmentos de colágena ( liberada durante la reabsorción) se midieron con ELISA competitiva.

Ensayo 1 (usando microscopía de láser confocal) Las alícuotas de las suspensiones celulares derivadas de osteoclastoma humano se removieron a partir del almacenamiento en nitrógeno líquido, se calentaron rápidamente a 37°C y se lavaron x1 en medio RPMI-1640 por centrifugación (1000 rpm, 5 minutos a 4°C).

El medio se aspiró y se reemplazó con anticuerpo anti-HLA-DR murino entonces se diluyó 1 :3 en medio RPMI-1640. La suspensión se incubó por 30 minutos sobre hielo y se mezcló frecuentemente. Las células se lavaron x2 con RPMI-1640 frío seguido por centrifugación (1000 rpm, 5 minutos, a 4°C) y las células se transfirieron a tubos de centrífuga estériles de 15 ml. El número de células mononucleares se numeró en una cámara de conteo Neubauer mejorada. Suficientes camas magnéticas (5/céluIa mononuclear), cubiertas con IgG de cabra anti-ratón (Dynal, Great Neck, NY) se removieron a partir de sus botellas de almacenamiento y se colocaron dentro de 5 ml de medio fresco (esto lava el conservador tóxico de azida). El medio se removió al inmovilizar las camas sobre un magneto y se remplazó con medio fresco. Las camas se mezclaron con las células y la suspensión se incubó por 30 minutos sobre hielo. La suspensión se mezcló frecuentemente. La cama cubierta con células se inmovilizó sobre un magneto y las células remanentes (fracción rica en osteoclastos) se decantó dentro de un tubo de centrífuga estéril de 50 ml. El medio fresco se añadió a las camas cubiertas con células para desalojar cualquier osteoclasto atrapado. Este procedimiento de lavado se repitió x10. Las camas cubiertas con células se descartaron. Los osteoclastos viables se numeraron en una cámara de conteo, usando diacetato de fluoresceína para marcar las células vivas. Se usó una pipeta pasteur plástica desechable de amplio diámetro interior para añadir la muestra a la cámara. Los osteoclastos se concentraron por centrifugación y la densidad se ajustó para el número apropiado en medio EMEM (el número de osteoclastos es variable de tumor a tumor), suplementado con suero de cabra fetal 10% y bicarbonato de sodio 1.7 g/litro. Se decantaron alícuotas de 3 ml de la suspensión celular (por compuesto de tratamiento) dentro de tubos de centrífuga de 15 ml. Las células se concentraron por centrifugación. A cada tubo, se le añadieron 3 ml del compuesto de tratamiento adecuado (diluido a 50 µM en el medio EMEM). También se incluyeron los controles de los vehículos apropiados, un control positivo (anticuerpo monocional de murino al receptor de anti-vitronectina [87MEM1] diluido a 100 µg/ml) y un control isotipo (lgG2a diluido a 100 ug/ml). Las muestras se incubaron a 37°C por 30 minutos. Las alícuotas de 0.5 ml de las células se sembraron sobre rebanadas de dentina estéril en platos de 48 pozos y se incubaron a 37°C por 2 horas. Cada tratamiento se seleccionó en cuadruplicado. Las rebanadas se lavaron en seis cambios de PBS tibio (10 ml/pozo en una caja de seis pozos) y se colocaron dentro de medio fresco que contenía el compuesto de tratamiento o las muestras control. Las muestras se incubaron a 37°C por 48 horas.

Procedimiento de fosfatasa acida resistente a tartrato (TRAP) (?nción selectiva para células de linaje osteoclasto). Las rebanadas óseas que contenían ios osteoclastos unidos se lavaron en regulador de pH salino de fosfato y se fijaron en glutaraldehído 2% (en cacodilato de sodio 0.2 M) por 5 minutos. Luego se lavaron en agua y se incubaron por 4 minutos en regulador de pH TRAP a 37°C (0.5 mg/ml naftol AS-BI fosfato disuelto en N,N-dimetiiformamida y se mezcló con regulador de pH de citrato 0.25 M (pH 4.5), que contenía tartrato de sodio 10 mM. Siguiendo a un lavado en agua fría las rebanas se sumergieron dentro de reguiador de pH de acetato frío (0.1 M, pH 6.2) que contenía colorante rojo rápido garnet 1 mg/ml y se incubaron a 4°C por 4 minutos. El exceso de regulador de pH se aspiró, y las rebanadas se secaron al aire siguiendo al lavado en agua. Los osteoclastos positivos a TRAP (precipitado rojo tabique/púrpura) se numeraron por microscopía de campo claro y se removieron a partir de la superficie de la dentina por sonicación. Los volúmenes de los orificios se determinaron usando el microscopio confocal Nikon/Lasertec ILM21W.

Ensayo 2 (usando un lector de ELISA) Los osteoclastos humanos están enriquecidos y preparados a partir del compuesto seleccionado como se describió en los 9 pasos iniciales del ensayo 1. Para aclarar, estos pasos se repiten a continuación. Las alícuotas de las suspensiones celulares derivadas de osteoclastoma humano se removieron a partir del almacenamiento en nitrógeno líquido, se calentaron rápidamente a 37°C y se lavaron x1 en medio RPMI-1640 por centrifugación (1000 rpm, 5 minutos a 4°C). El medio se aspiró y se reemplazó con anticuerpo anti-HLA-DR murino entonces se diluyó 1 :3 en medio RPMI-1640. La suspensión se incubó por 30 minutos sobre hielo y se mezcló frecuentemente. Las células se lavaron x2 con RPMI-1640 frío seguido por centrifugación (1000 rpm, 5 minutos, a 4°C) y las células se transfirieron a tubos de centrífuga estériles de 15 ml. El número de células mononucleares se numero en una cámara de conteo Neubauer mejorada. Suficientes camas magnéticas (5/célula mononuciear), cubiertas con IgG de cabra anti-ratón (Dynal, Great Neck, NY) se removieron a partir de sus botellas de almacenamiento y se colocaron dentro de 5 ml de medio fresco (esto lava el conservador tóxico de azida). El medio se removió al inmovilizar las camas sobre un magneto y se remplazó con medio fresco. Las camas se mezclaron con las células y la suspensión se incubó por 30 minutos sobre hielo. La suspensión se mezcló frecuentemente.

La cama cubierta con células se inmovilizó cobre un magneto y ias células remanentes (fracción rica en osteoclastos) se decantó dentro de un tubo de centrífuga estéril de 50 ml. El medio fresco se añadió a las camas cubiertas con células para desalojar cualquier osteoclasto atrapado. Este procedimiento de lavado se repitió x10. Las camas cubiertas con células se descartaron. Los osteoclastos viables se numeraron en una cámara de conteo, usando diacetato de fluoresceína para marcar las células vivas. Se usó una pipeta pasteur plástica desechable de amplio diámetro interno para añadir la muestra a la cámara. Los osteoclastos se concentraron por centrifugación y la densidad se ajustó para el número apropiado en medio EMEM (el número de osteociastos es variable de tumor a tumor), suplementado con suero de cabra fetal 10% y bicarbonato de sodio 1.7 g/litro. En contraste con el método descrito anteriormente en el ensayo 1 , el compuesto se selecciona a 4 dosis para obtener un IC5o, como se describe a continuación: Las preparaciones de osteoclastos se preincuban por 30 minutos a 37°C con el compuesto de prueba (4 dosis) o controles. Entonces éstas se siembran sobre segmentos de hueso cortical de bovino en pozos de un plato de cultivo de tejido de 48 pozos y se incuban por 2 horas adicionales a 37°C.

Los fragmentos de hueso se lavan en seis cambios de regulador de pH salino de fosfatos tibio (PBS), para remover las células no adheridas, y entonces se regresan a los pozos del plato de 48 pozos que contiene compuesto fresco o controles. El plato de cultivo de tejidos se incuba por 48 horas a 37°C. Los sobrenadantes de cada pozo se aspiran dentro de tubos individuales y se seleccionan en un ELISA competitivo que detecta el c-telopéptido de la colágena tipo I la cual se libera durante el proceso de reabsorción. Este es un ELISA disponible comercialmente (Osteometer, Dinamarca) que contiene un anticuerpo de conejo que específicamente reacciona con una secuencia de 8 aminoácidos (Glu,-Lys-Ala-His-Asp-Gly-Gly-Arg) que esta presente en el telopéptido carboxilo-terminai de la cadena a1 de la colágena tipo I. Los resultados se expresan como % de inhibición de reabsorción en comparación con el vehículo control.

Ensayos de adhesión de osteoclastos humanos Los osteoclastos humanos se enriquecen y preparan para selección de compuesto como se describió anteriormente en los 9 pasos iniciales del ensayo 1. Para claridad, estos pasos se repiten a continuación. Las alícuotas de las suspensiones celulares derivadas de osteoclastoma humano se removieron a partir del almacenamiento en nitrógeno líquido, se calentaron rápidamente a 37°C y se lavaron x1 en medio RPMI-1640 por centrifugación (1000 rpm, 5 minutos a 4°C).

El medio se aspiró y se reemplazó con anticuerpo anti-HLA-DR murino entonces se diluyó 1 :3 en medio RPMI-1640. La suspensión se incubó por 30 minutos sobre hielo y se mezcló frecuentemente. Las células se lavaron x2 con RPMI-1640 frío seguido por centrifugación (1000 rpm, 5 minutos, a 4°C) y las células se transfirieron a tubos de centrífuga estériles de 15 ml. El número de células mononucleares se numero en una cámara de conteo Neubauer mejorada. Suficientes camas magnéticas (5/céluia mononuclear), cubiertas con IgG de cabra anti-ratón (Dynal, Great Neck, NY) se removieron a partir de sus botellas de almacenamiento y se colocaron dentro de 5 ml de medio fresco (esto lava el preservador tóxico de azida). El medio se removió ai inmovilizar las camas sobre un magneto y se remplazó con medio fresco. Las camas se mezclaron con las células y la suspensión se incubó por 30 minutos sobre hielo. La suspensión se mezcló frecuentemente. La cama cubierta con células se inmovilizó cobre un magneto y las células remanentes (fracción rica en osteoclastos) se decantó dentro de un tubo de centrífuga estéril de 50 ml. El medio fresco se añadió a las camas cubiertas con células para desalojar cualquier osteoclasto atrapado. Este procedimiento de lavado se repitió x10. Las camas cubiertas con células se descartaron. Los osteoclastos viables se numeraron en una cámara de conteo, usando diacetato de fluoresceína para marcar las células vivas. Una pipeta pasteur plástica desechable de amplio diámetro interno se usó para añadir la muestra a la cámara. Los osteoclastos se concentraron por centrifugación y la densidad se ajustó para el número apropiado en medio EMEM (el número de osteoclastos es variable de tumor a tumor), suplementado con suero de cabra fetal 10%o y bicarbonato de sodiol .7 g/litro. Los osteoclastos derivados de osteoclastoma se preincuban con el compuesto (4 dosis) o los controles a 37°c por 30 minutos. Las células se siembran sobre fragmentos cubiertos con osteopontina (osteopontina de rata o humano, 2.5 ug/ml) y se incuban por 2 horas a 37°C. Las células no adheridas se remueven por lavado de los -fragmentos vigorosamente en regulador de pH de fosfato salino y las células remanentes sobre los fragmentos se fijan en acetona. Los osteoclastos se tiñen por fosfatasa acida resistente al tartrato (TRAP), un marcador selectivo de la célula de este fenotipo (ver pasos 15-17), y se numeran por microscopía de luz. Los resultados se expresan como % de inhibición de la adhesión en comparación con el vehículo control.

Prueba de adhesión celular Células y cultivo celular Se obtuvieron células de hígado embriónico de humano (células HEK293) de ATCC (Catálogo No. CRL 1573). Las células se cultivaron en medio esencial mínimo de Earl (EMEM) que contiene sales de Earl, 10% de suero fetal de bovino, 1% de glutamina y 1% de Peniciiina-Esteptomicina.

Construcciones y Transfecciones Un fragmento de EcoRI-Kpnl de 3.2 Kb de la subunidad av y un fragmento de Xbal-Xhol de 2.4 Kb de la subunidad ß3 se insertaron en los sitios de clonación de EcoRI-Eco RV del vector pCDN (Aiyar et al., 1994) el cual contiene un promotor CMV y un marcador de selección G418 mediante ligación de extremos romos. Para expresión estable, se electrotransformaron células HEK 293 80 x 106 con construcciones de av + ß3 (20µg ADN de cada subunidad) utilizando un Gene Pulser (Hensley et al., 1994) y colocadas en cajas de 100 mm (5x105 células/caja). Después de 48 horas, el medio de crecimiento se complementó con 450 µg/mL de Geneticina (G418 Sulfato, GIBCO-BRL, Bethesda, MD). Las células se mantuvieron en medio de selección hasta que las colonias fueron lo suficientemente grandes para ser analizadas.

Análisis inmunocitoquímico de células transfectadas Para determinar si los transfectantes de HEK 293 expresaron el receptor de vitronectina, se inmovilizaron las células en portaobjetos de microscopio de vidrio mediante centrifugación, fijadas en acetona durante 2 minutos a temperatura ambiente y secadas por aire. Se demostró ia reactividad específica con 23C6, un anticuerpo monocional específico para el complejo av ß3 utilizando un método de inmunofluorescencia indirecta estándar.

Estudios de adhesión celular Se precubrieron cajas Corning de 96 pozos para ELISA durante la noche a 4°C con 0.1 mL de vitronectina humana (0.2 µg/mL en medio RPMI). Al momento del experimento, las cajas se lavaron una vez con medio RPMI y se bloquearon con BSA 3.5% en medio RPMI durante 1 hora a temperatura ambiente. Las células 293 transfectadas se resuspendieron en medio RPMI, complementaron con 20 mM Hepes, pH 7.4 y BSA 0.1 % a una densidad de 0.5 x 106 células/mL. Se añadió 0.1 mL de la suspensión celular a cada pozo y se incubó durante 1 hora a 37°C, en presencia o ausencia de diferentes antagonistas de avß3. Después de incubación, se añadió 0.025 mL de una solución de formaldehído al 10%, pH 7.4, y las células se fijaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. Las cajas se lavaron 3 veces con 0.2 mL de medio RPMI y las células adherentes se tiñeron con 0.1 mL de toluidina azul 0.5% durante 20 minutos a temperatura ambiente. El exceso de tinción se removió mediante lavado extenso con agua desionizada. La toluidina azul incorporada en células se eluyó por la adición de 0.1 mL de etanol 50% que contiene 50 mM de HCl. La adhesión celular se cuantificó en una densidad óptica de 600 nm sobre un lector de caja de microtítulo (Titertek Multiskan MC, Sterling, VA).

Prueba de unión a a?ßs de fase sólida El receptor de vitronectina v ßs se purificó de placenta humana. La preparación de receptor se diluyó con 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCI, 1 mM CaCI2. 1 mM Mn Cl2. 1 mM MgCI (regulador de pH A) y se añadió inmediatamente a cajas de ELISA de 96 pozos a 0.1 ml por pozo. Se añadió 0.1-0.2 µg de avß3 por pozo. Las cajas se incubaron durante la noche a 4°C. Al momento del experimento, los pozos se lavaron una vez con regulador de pH A y se incubaron con 0.1 ml de 3.5% de albúmina de suero de bovino en el mismo regulador de pH durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de incubación, los pozos se aspiraron completamente y se lavaron dos veces con 0.2 ml de regulador de pH A. En una prueba de competición de [3H]-SK&F-107260, se añadieron varias concentraciones de antagonistas no marcados (0.001-100 µM) a los pozos, seguido de la adición 5.0 nM de [3H]-SK&F-107260. Las cajas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de incubación, ios pozos se aspiraron completamente y se lavaron una vez con 0.2 mi de regulador de pH A enfriado en hielo en una manera de pozo a pozo.

Los receptores se solubilizaron con 0.1 ml de SDS 1% y se determinó [3H]-SK&F-107260 unido mediante conteo de centelleo líquido con la adición de 3 ml de Ready Safe en un Contador de Centelleo Líquido Beckman LS 6800, con 40%> de eficiencia. Se determinó la unión no específica de [3H]-SK&F-107260 en presencia de 2µM SK&F-107260 y fue consistentemente inferior a 1%> de la entrada total de radioligando. Se determinó el IC50 (concentración del antagonista para inhibir 50% de unión de [3H]SK&F-107260) mediante una rutina no lineal de llenado de curva por cuadrados mínimos, la cual se modificó a partir dei programa LUNDON-2. Se calculó la K¡ (constante de disociación del antagonista) de acuerdo a la ecuación Cheng y Prusoff: K¡ = IC5o/(1+L/Kd), donde L y Kd, eran la concentración y la constante de disociación de [3H]SK&F- 107260, respectivamente.

Inhibición de unión a GPIIb-llla mediada por RGD Purificación de GPIIb-llla Diez unidades de plaquetas humana lavadas, obsoletas (obtenidas de la Cruz Roja) se usaron mediante agitación suave en octilglucósido 3%, Tris-HCl 20 mM, pH 7.4, NaCI 140 mM, CaCI2 2 mM a 4°C durante 2 horas. El lisado se centrifugó a 100,000 g durante 1 hora. El sobrenadante obtenido se aplicó a una columna de 5 mL de lentillectinsefarosa 4B (E.Y. Labs) preequilibrada con 20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 100 mM NaCI, 2 mM CaC , octilglucósido 1% (regulador de pH A). Después de dos horas de incubación, la columna se lavó con 50 mL, de regulador de pH A frío. La GPl Ib-I I la retenida con lectina se eluyó con regulador de pH A que contiene dextrosa10%. Todos los procedimientos se realizaron a 4°C. La GPIIb-llla obtenida fue >95% pura como se muestra mediante electroforesis de gei de poliacrilamida SDS. incorporación de GPlib-llla en Liposomas Una mezcla de fosfatidilserina (70%) y fosfatidilcolina (30%) (Avanti Polar Lipids) se secó hacia las paredes de un tubo de vidrio bajo una corriente de nitrógeno. Se diluyó GPl Ib-Illa purificada para una concentración final de 0.5 mg/mL y se mezcló con los fosfolípidos en una relación de proteína: fosfolípido de 1 :3 (p:p). La mezcla se resuspendió y sónico en un sonicador de baño durante 5 minutos. La mezcla fue entonces diaiizada durante la noche utilizando tubo de diálisis de corte de 12,000-14,000 de peso molecular contra un exceso de 1000 veces de 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 100 mM NaCi, 2 mM CaCI2 (con 2 cambios). Las liposomas que contienen GPIIb-llla se centrifugaron a 12,000 g durante 15 minutos y resuspendieron en el regulador de pH de diálisis en una concentración de proteína final de aproximadamente 1 mg/mL. La liposomas se almacenaron a -70°C hasta que fuera necesario.

Unión competitiva a GPIIb-Illa La unión al receptor de fibrinógeno (GPIIb-llla) se analizó mediante un método de unión competitiva indirecto utilizando [3H]-SK&F-107260 como un ligando de tipo RGD. La prueba de unión se realizó en un ensamble de caja de filtración de 96 pozos (Miliipore Corporation, Bedford, MA) utilizando membranas durapore hidrófilas de 0.22 um. Los pozos se precubrieron con 0.2 mL de 10 µg/mL de polilisina (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) a temperatura ambiente durante 1 hora para bloquear unión no específica. Se añadieron diferentes concentraciones de benzazepinas sin marcar a los pozos por cuadruplicado. Se aplicó [3H]-SK&F- 107260 a cada pozo en una concentración final de 4.5 nM, seguido de la adición de 1 µg de las liposomas que contienen GPIlb-llla de plaqueta purificada. Las mezclas se incubaron durante un hora a temperatura ambiente. El [3H]-SK&F-107260 unido a GPIlb-llla se separó del no unido mediante filtración utilizando un filtro múltiple Millipore, seguido por lavado con regulador de pH enfriado en hielo (2 veces, cada 0.2 mL). La radioactividad unida restante en los filtros se contó en 1.5 mL Ready Solve (Beckman Instruments, Fullerton, CA) en un Contador de Centelleo Líquido Beckman (Modelo LS6800), con 40% de eficiencia. Se determinó la unión no específica en presencia de 2µM de SK&F-107260 sin marcar y fue consistentemente inferior a 0.14% de la radioactividad total añadida a las muestras. Todos los puntos de datos son el promedio de determinaciones cuadruplicadas.

Se analizaron los datos de unión de competición mediante un procedimiento no lineal de llenado de curva por cuadrados mínimos. Este método provee el IC50 de los antagonistas (concentración del antagonista que inhibe la unión especifica [3H]-SK&F-107260 por 50% en equilibrio). El IC50 está relacionado con la constante de disociación de equilibrio (Ki) del antagonista con base en la ecuación de Cheng y Prusoff: Ki=IC50/(1+L/Kd), en donde L es la concentración de [3H]-SK&F-107260 utilizada en la prueba de unión competitiva (4.5 nM), y Kd es la constante de disociación de [3H]-SK&F-107260 la cual es 4.5 nM según lo determina el análisis de Scatchard. La eficacia del compuesto de fórmula (I) solo o en combinación con un agente antioneoplásico se puede determinar utilizando diferentes modelos de tumor en ratón que se puede transpiantar. Véanse patentes de E.U.A números 5,004,758 y 5,633,016 para detalles de estos modelos. Los ejemplos a continuación no pretenden limitar el alcance de esta invención, sino que se proveen para ilustrar la manera para elaborar y usar el compuesto de esta invención. Muchas otras modalidades serán fácilmente evidentes para los expertos en la técnica.

EJEMPLOS General Se registraron espectros de resonancia magnética nuclear de protones (1H RMN) a 300 MHz, y se reportaron desplazamiento químicos en partes por millón (d) del campo bajo a partir del tetrametilsiliano estándar interno (TMS). Las abreviaturas para datos de RMN son como sigue: s=singlete, d=doblete, t=triplete, q=cuarteto, m=multipiete, dd=doblete de dobletes, dt=doblete de tripletes, app=aparente, br=ancho. J indica la constante de acoplamiento de NMR medido en Hertz. CDCI3 es deuteriocioroformo, DMSO-d6 es hexadeuteriodimetilsulfóxido, y CD3OD es tetradeuteriometanol. Se obtuvieron espectros de masa utilizando técnicas de ionización por electroaspersión (ES). Se realizaron análisis elementales por Quantitative Techonologies Inc., Whitehouse, NJ. Se obtuvieron puntos de fusión en un aparato de punto de fusión Thomas-Hoover y no están corregidos. Todas las temperatura se reportan en grados Celsius. Se utilizaron cajas de capa delgada de Analtech Silica Gel y E. Merck Silica Gel 60 F-254 para cromatografía de capa delgada. Se realizó cromatografía instantánea sobre gel de sílice de E. Merck Kieselgel 60 (malla de 230-400). Se realizó CLAR de preparación y analítica en cromatógrafos de Beckman. ODS se refiere a un soporte cromatográfico de gel de sílice derivado octadeciisililo. YMC ODS-AQ® es un soporte cromatográfico de ODS y es una marca registrada de YMC Co. Ltd., Kyoto, Japón. PRP-1® es un soporte cromatográfico polimérico (estireno-divinilbenceno), y es una marca registrada de Hamilton Co. Remo, Nevada, Celite® es un auxiliar de filtro compuesto de sílice de diatomeas lavada con ácido, y es una marca registrada de Manville Corp., Denver, Colorado.

PREPARACIÓN 1 Preparación de 2-(5.6.7.8-tetrah¡dro-1,8-naftiridin-2-il)-1 -etanol a) 2-Metil-8-(terbutoxicarbonil.-5.6.7.8-tetrahidro-1.8-naftiridina Una mezcla de 2-metil-1 ,8-naftiridina (J. Chem. Soc. (C) 1966, 315; 5.13 g, 35.58 mmoles), 10% Pd/C (1.14 g, 1.07 mmoles), y etanol absoluto (70 mL) se desoxigenó a través de tres ciclos de purga de evacuación/H2, luego se agitó vigorosamente bajo un balón de H2. Después de 18.5 horas, la mezcla se filtró a través de celite®, y la almohadilla de filtro se lavó consecutivamente con EtOH y EtOAc absoluto. El filtrado se concentró hasta secar, y el residuo se reconcentró a partir de EtOAc para dejar un sólido blanco mate (5.25 g). Una solución del material anterior (5.25 g), dicarbonato de di-terbutilo (15.53 g, 71.16 mmoles), y CH2CI2 (10 mL) se concentró en el rotavap para remover el solvente, y el residuo aceitoso se calentó bajo N2 en un baño de aceite ajustado a 55-60°C. Después de 45 horas, la reacción se enfrió a temperatura ambiente, y el residuo se sometió a cromatografía instantánea sobre gel de sílice (40% EtOAC/hexanos). El compuesto del título (4.90 g, 55%) se obtuvo como sólido amarillo claro: 1H RMN (300 MHz, CDCI3) d 7.27 (d, J = 7.6 Hz, 1 H), 6.81 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 3.69-3.79 (m, 2H), 2.65-2.75 (m, 2H), 2.48 (s, 3H), 1.83-1.98 (m, 2H), 1.52 (s, 9H); MS (ES) m/e 249 (M+H)+. b) Acetato de etil f8-(terbutoxicarbonil.-5.6.7,8-tetrahidro-1.8-naftiridin-2-ilo] A una solución de diisopropilamina (7.24 mL, 55.3 mmoles) en THF seco (50 mL) se añadió n-BuLi (2.5 M en hexanos, 22 mL, 55.3 mmoles) por goteo a 0°C. Después de 15 minutos, esta solución se añadió por goteo a una solución de 2-metil-8-(terbutoxicarbonil)-5,6,7,8-tetrahidro-1 ,8-naftiridina (4.9 g, 19.7 mmoles) y dietilcarbonato (8.86 mL, 73.0 mmoles) en THF seco (50 mL a -78°C. Después de 30 minutos, la mezcla se extinguió con NH4CI saturado (100 mL), se calentó a temperatura ambiente, y se extrajo con EtOAc (3x200 mL). Los extractos orgánicos combinados se secaron sobre MgS04, filtraron y concentraron bajo presión reducida. El residuo se sometió a cromatografía sobre gel de sílice (40% EtOAc/hexanos) para dar el compuesto del título (5.72 g, 91%) como un aceite amarillo claro: MS (ES) m/e 321 (M + H)+. c_ 2-f5.6.7.8-Tetrahidro-1.8-naftiridin-2-ilV1 -etanol A una solución de acetato de etil[8-(terbutoxicarbon¡I)-5,6,7,8-tetrahidro-1 ,8-naft¡rif.n-2-ilo] (5.72 g, 17.85 mmoles) en THF seco (80 mL) a temperatura ambiente se añadió LÍBH4 (2.0 M en THF, 10.7 mL, 21.42 mmoles), y la mezcla resultante se calentó a reflujo. Después de 18 horas, la mezcla se enfrió a 0°C y se extinguió cuidadosamente con H2O (100 mL). Después de 10 minutos, la mezcla se extrajo con EtOAc (3x100 mL). Los extractos orgánicos combinados se secaron sobre MgS04, filtraron, y concentraron bajo presión reducida. El residuo anterior (4.9 g) se disolvió en CH2CI2 (10 mL). A esto se añadió al mismo tiempo, HCl 4 N en dioxano (20 mL) a temperatura ambiente. Después de 4, la mezcla se concentró bajo presión reducida. El residuo fue tomado en una mezcla 1 :1 de NaOH 1.0 N y NaCl saturado (100 mL) y extraído con CH2CI2 (3x100 mL). Los extractos orgánicos combinados se secaron sobre MgS?4, filtraron y concentraron bajo presión reducida. El residuo se sometió a cromatografía sobre gel de sílice (MeOH al 10% en 1 :1 EtOAc/CHC ) para dar el compuesto del título (2.09 g, 66%) como un sólido amarillo: MS (ES) m/e 179 (M+H)+.

PREPARACIÓN 2 Preparación de acetato de etil (+)-10.11-d_hidro-3-hidroxi-5H- dibenzo[a.d]ciclohepteno-10 a) 6-metoxi-1-fenilindeno Una solución de 3.0 M de bromuro de fenilmagnesio en Et2O (680 mL, 2.04 moles) bajo argón a temperatura ambiente, se diluyó con Et2? (700 mL) con agitación, y se añadió una solución de 6-metoxi-1-indanona (277 g, 1.71 moles) en THF (1400 mL) por goteo durante 1 horas. La mezcla de reacción se agitó durante 2 horas a temperatura ambiente y luego se vertió con agitación en NH4CI saturado (2.8 L). Se añadió H2O (1.4 L), y se separó la fase orgánica. La fase acuosa se extrajo con Et2O (2x1 L), y los extractos orgánicos combinados se concentraron para dar 6-metoxi-1-fenil-1-indanoi crudo (445 g) como un aceite café. Este aceite se disolvió en tolueno (2.5 L), y se añadió monohidrato de ácido p-toiuensulfónico (12.3 g, 0.065 moles). La solución se agitó y calentó a reflujo durante 16 horas utilizando una trampa Dean-Stark con un condensador. La recolección de H2O fue mínima después de 2 horas y totalizó en 28 mL. La solución se enfrió y extrajo consecutivamente con Na2C?3 acuoso al 5% (1 L) y H2O (2 x 1 L). La capa orgánica se concentró para dar un aceite café obscuro (400 g). Este aceite se destiló bajo vacío para dar el compuesto del título (298.2 g, 79%) como un aceite amarillo. pe 152-190°C/2.0 Torr; TLC (EtOAc/hexanos al 10%) Rf 0.75. b) Acido 2-benzoil-4-metoxifenilacético Se enfrió acetona (4.2. L) a 10°C, y se añadió una solución de 6-metoxi-1-fenilindeno (271 g, 1.22 moles) en acetona (1.8 L) durante 1.5 horas concurrentemente con reactivo de Jones (1.8 L, preparado a partir de Cr?3 (470 g, 4.70 moles), H2O (1 L), y H2SO concentrado (405 mL). Se añadió OSO4 acuoso al 4% (153 mL) a la mezcla resultante en dos porciones, una al inicio de la adición y la segunda en el punto medio de la adición, manteniendo la temperatura de la mezcla de reacción por debajo de 15°C. Después de la adición, la mezcla de reacción se calentó a 22°C y se agitó durante 1.5 horas, tiempo durante el cual un ligero incrementó exotermo de la temperatura a 28°C. La mezcla de reacción se enfrió entonces a menos de 20°C y se añadió isopropanol (1 L), inicialmente por goteo y rápidamente después de que disminuyó el exotermo inicial. Durante esta fase, la agitación se hizo difícil. La temperatura llegó a 32°C durante la adición de isopropanol. Se añadió H2O (2 L) y la mezcla se transfirió a un embudo de separación. Se agregó H2O adicional para disolver el ácido crómico precipitado, y la mezcla se extrajo con CH2CI2 (2 L). La capa orgánica (superior) se separó y se extrajo la fase acuosa con CH2CI2 (2 x 1 L). Los extractos de CH2CI2 combinados se lavaron consecutivamente con H2O (2 L) y salmuera saturada (2 L), y luego se concentraron para dar un sólido gris húmedo (416 g). Este se trituró con una mezcla de acetona y EtOAc y se filtró y secó para dar el compuesto del título (225.4 g, 71%) como un sólido blanco mate: pf 158-159°C. c) Acido 2-bencil-4-metoxifenilacético Se dividió ácido 2-benzoil-4-metoxifenilacético (215.5 g, 0.80 moles) en dos porciones iguales, y cada una se disolvió en AcOH glacial (1.5 L) en una botella de presión de 2.5 L. Se añadieron a cada una Pd/C al 5% (10 g, 0.0048 moles) y cada mezcla se agitó a temperatura ambiente bajo ' hidrógeno sobre un aparato Parr. Después de 2.5 horas, las mezclas se filtraron para remover el catalizador, y las almohadillas de filtro se lavaron con EtOAc. Los filtrados combinados se concentraron para dar el compuesto del título (215 g, cuantitativo) como un aceite amarillo pesado el cual se cristalizó en reposo: 1H RMN (250 MHz, CDCI3) d 7.05-7.35 (m, 6H), 6.77 (dd, J = 8.3, 2.7 Hz, 1H), 6.71 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 4.00 (s, 2H), 3.76 (s, 3H), 3.54 (s, 2H). d) 10.11 -Dihidro-3-metoxi-5H-dibenzo[a.d]ciclohepten-10-ona Una solución de ácido 2-bencil-4-metoxifenilacético (215 g de material crudo que contenía 204.6 g (0.80 moles) de material puro) en CH2C.2 (1 L) se agitó bajo argón a temperatura ambiente y se añadió DMF (1 ml), seguido de cloruro de oxalilo (400 mL, 4.59 moles). El cloruro de oxalilo se añadió durante 1 hora, inicialmente por goteo para controlar la evolución de gas vigorosa. La solución se agitó durante 16 horas a temperatura ambiente y el luego se concentró para dar el cloruro de ácido crudo (207.7 g, 0.756 moles, 95%) como un líquido amarillo. El líquido se disolvió en CH2CI2 para un volumen total de 500 mL, y se añadieron la solución y AICI3 (100.8 g, 0.756 moles) concurrentemente durante 1 hora a CH2CI2 (3.7 L) con agitación bajo argón a temperatura ambiente. La temperatura fue de 28°C al término de la adición. La mezcla se agitó durante 16 horas a temperatura ambiente, tiempo durante el cual se precipitó un sólido. Se añadió H2O (1 L) inicialmente por goteo, durante un período de 30 minutos. Luego se separó la mezcla y la fase orgánica se lavó consecutivamente con H2O (1 L) y NaHC?3 acuoso al 5% (1 L). Luego la solución de CH2CI2 se concentró para dar un sólido amarillo (175.3 g). La recristalización de EtOAc/hexano dio el compuesto del título (128 g, 71 %): pf 107-109°C. e) Acetato de etil .±)-10,11-dihidro-10-hidroxi-3-metoxi-5H-dibenzo[a.d]ciciohepteno-10 Se añadió una solución de 1.0 M de bis(trimetiisilil)amida de litio en hexanos (1282 mi, 1.282 moles) a THF (4.0 L) a -70°C bajo argón, y luego se añadió por goteo durante 20 minutos EtOAc (146 mL, 1.49 moles). La mezcla de reacción se dejó agitar durante 15 minutos, luego se añadió N^N'.N'-tetrametiletilendiamina (378 mL, 2.5 moles) durante 20 minutos. La mezcla de reacción se agitó durante 10 minutos, iuego se añadió por goteo una solución de 10,11-dihidro-3-metoxi-5H-dibenzo[a,d]ciclohepten-10-ona (119.2 g, 0.50 moles) en THF anhidro (1.26 L) durante 40 minutos. La temperatura se mantuvo por debajo de -65°C durante todas estas adiciones. La mezcla de reacción se agitó durante 20 minutos a -65 a 70°C, y luego se vertió en NH4CI acuoso saturado (6.2 L) con agitación vigorosa. La capa orgánica se separó y la fase acuosa se extrajo con EtOAc (2 x 1 L). Los extractos orgánicos combinados se lavaron con H2O (2 x 1 L) y luego se concentraron para dar un aceite café claro (175 g). La cromatografía de capa delgada (EtOAc/hexanos al 20%) mostró Rf 0.5 mayor (producto deseado) y Rf 0.7 menor (cetona recuperada). El producto crudo se sometió a cromatografía sobre gel de sílice ( 2 kg, EtOAc/hexanos al 10%) para dar el compuesto del título (101 g, 61 %) como un aceite amarillo: 1H RMN (250 MHz, CDCI3) d 7.63 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.00-7.30 (m, 4H), 6.80 (d, J = 2.6 Hz, 1H), 6.69 (dd, J = 8.2, 2.6 Hz, 1H), 3.95-4.35 (m, 2H), 4.07 (s, 2H), 3.76 (s, 3H), 3.68 (s, 1H), 3.64 (d, J = 14.2 Hz, 1H), 3.35 (d, J = 14.2 Hz, 1H), 2.79 (d, J = 16.0 Hz, 1 H), 2.66 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 1.22 (t, J = 7.2 Hz, 3H). f) Acetato de etil f+)-10.11-dihidro-3-metoxi-5H-dibenzo[a.d]ciclohepteno-10 Se disolvió acetato de etil (±)-10,11-dihidro-10-hidroxi-3-metoxi-5H-dibenzo[a,d]ciclohepteno-10 (101 g, 0.31 moles) en ácido acético glacial (1.8 L) y se añadió 12 N HCl (28.5 mL, 0.34 moles). La mezcla se colocó en una botella de presión de 2.5 L que contiene Pd/C al 5% (20 g, 0.0094 moles), y la mezcla resultante se agitó a 35°C bajo hidrógeno en un aparato de hidrogenación de Parr equipado con una camisa calefactora. Después de 18 horas, la reacción se enfrió a temperatura ambiente, y el catalizador se removió por filtración. El filtrado se concentró para dar un aceite amarillo claro (85.1 g). Este se sometió a cromatografía sobre gel de sílice (2 kg, gradiente gradual con EtOAc/hexanos al 5% - 10%) para dar el compuesto del título (69.1 g, 72%) como un aceite: 1H RMN (250 MHz, CDCI3) d 7.05-7.22 (m, 4H), 7.01 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 6.76 (d, J = 2.7 Hz, 1 H), 6.67 (dd, J = 8.2, 2.7 Hz, 1H), 4.30 (d, J = 15.0 Hz, 1H), 4.11-4.25 (m, 2H), 3.85 (d, J = 15.0 Hz, 1H), 3.70-3.90 (m, 1 H), 3.77 (s, 3H), 3.31 (dd, J = 15.0, 4.1 Hz, 1H), 2.93 (dd, J = 15.0, 9.2 Hz, 1H), 2.64 (dd, J = 15.6, 5.0 Hz, 1H), 2.52 (dd, J = 15.6, 9.3 Hz, 1H), 1.27 (t, J = 7.1 Hz, 3H). g) Acetato de etil (+)-10,11-dihidro-3-hidroxi-5H-dibenzo[a,d]ciclohepteno-10 Una solución de acetato de etil (±)-10,11-dihidro-3-metoxi-5H-dibenzo[a.d]ciclohepteno-10 (8.5 g, 0.027 moles) en CH2CI2 (150 mL), se enfrió a -10°C con agitación bajo argón. Se añadió etantiol (10.7 mL, 0.144 moles), seguido de AICI3 (20.6 g, 0.154 moles) en dos porciones durante 15 minutos. Un exotermo incrementó la temperatura a 0°C después de las adiciones, y la temperatura luego se incrementó a 25°C utilizando un baño de agua. La mezcla de reacción se agitó a 25 a 30°C durante 2.25 horas, punto en el cual se vertió en H2O helada. Se separó la capa orgánica, se añadió metanol (100 mL) y la mezcla se extrajo con CH2CI2 (2 x 50 mL). Los extractos de CH2C_2 combinados se lavaron con H20 (250 mL) y luego se concentraron para dar un aceite viscoso (8.6 g). Este se tomó en Et2O (150 mL) y el éter se evaporó mientras se reemplazaba con hexano. El fenol deseado primero se separó como un aceite el cual se cristalizó con agitación a temperatura ambiente. Se recolectaron dos cultivos de sólido para dar el compuesto del título (7.1 g, 89%): pf 110-112°C.

PREPARACIÓN 3 Separación por CLAR de los enantiómeros de acetato de etil (±)-10,11- dihidro-3-hidroxi-5H-dibenzo[a.d]ciclohepteno-10 a) Acetato de etil (RH+)-1Q.11-dihidro-3-hidroxi-5H-dibenzofa.dlciclohepteno-10 v acetato de etil (S.-(-)-10.11-dihidro-3-hidroxi-5H-dibenzo[a.d]ciclohepteno-10 Acetato de etil (±)-10,11-dihidro-3-hidroxi-5H-dibenzo[a,d]cíclohepteno-10 se resolvió en sus enantiómeros utilizando las siguientes condiciones: columna de Daicel chiralcel OJ® (21.2 x 250 mm), etanol al 20% en fase móvil de hexano, velocidad de flujo de 15 ml/min, detección de rayos UV a 254 nm, inyección de 140 mg; Í para acetato de etil (S)-(-)-10,11-dihidro-3-hidroxi-5H-dibenzo[a,d]c¡clohexeno-10 = 10.4 min.; ÍR para acetato de etil (R)-(+)-10,11-dihidro-3-hidroxi-5H-dibenzo[a,d]ciclohexeno-10 = 13.1 min.

PREPARACIÓN 4 Preparación de 10.11-Dihidro-3-metoxí-5H-dibenzo[a.d]ciclohepten-10- ona a) Acido 2-bencil-4-metoxifenilacético Una solución de ácido 2-benciI-4-metoxifenilacético (13.0 g, 0.048 moles), preparada por el método de J. Med. Chem. 1981 , 24, 998, en ácido acético glacial (600 mL) se trató bajo argón con 4.3 g de Pd/C 10% y se hidrogenó a 3.515 kg/cm2 durante 17 horas. La mezcla se agitó utilizando Celite® y el filtrado se concentró y reconcentró a partir de tolueno y cloruro de metileno para dar 14.2 del compuesto del título: 1H RMN (400 MHz, CDCI3) d 3.52 (s, 2H), 3.75 (s, 3H), 4.0 (s, 3H), 6.7 (m, 2H), 7.15 (m, 6H). b) 10, 11 -Dihidro-3-metoxi-5H-dibenzo[a,d]ciclohepten-10-ona Una solución de ácido 2-bencil-4-metoxifenilacético (14.2 g, 0.055 m) en benceno (120 mL) y cloruro de tionilo (28 mL) se sometió a reflujo durante una hora y se concentró. El cloruro de ácido se disolvió en cloruro de metileno seco (40 mL), y la solución se añadió por goteo bajo argón a una solución de AICI3 (14.7 g, 0.11 moles) en cloruro de metileno (600 mL). La reacción se agitó bajo una atmósfera de argón durante 2.5 horas a temperatura ambiente, luego se extinguió con agua helada (200 mL). Las capas se separaron, y la fase orgánica se lavó consecutivamente con solución de NaOH 10%, agua y HCl diluido. La solución resultante se diluyó con éter (200 mL), se secó sobre MgS?4, y se concentró. El residuo sólido se trituró con éter/hexano (1 :1 ) y se recolectó 9.35 g del compuesto del título mediante filtración: Pf 105-106°C; H RMN (400 MHz, CDCI3) d 3.72 (s, 3H), 4.1 (s, 2H), 4.2 (s, 2H), 6.7 (d, 1H), 6.82 (s, 1H), 7.30 (m, 4H), 8.1 (d, 1 H).

PREPARACIÓN 5 Preparación de acetato de etil (+)-10.11-dih_dro-3-metoxi-5H- dibenzo[a.d]cicloheptano-10 a) Indenacetato de etil (±) 3-(3-metoxifenilo) A una solución fría de 3-(3-metoxifenil)indeno (4 g, 18 mmoles), preparada por el método de J. Med. Chem. 1981 , 24, 998, en THF (15 mL) a 0°C se añadió por goteo una solución de LiN (TMS)2(20 mL, 1M en THF) durante 5 minutos. La solución resultante se añadió por goteo a una solución de bromoacetato de etilo (3.34 g, 20 mmoles) en THF (15 mL) a -78°C durante 30 minutos. Después de 2.5 horas, la mezcla se extinguió con solución de cloruro de amonio saturado y se separaron las capas. La capa orgánica se secó sobre MgSÜ4 y se concentró para dar el producto crudo el cual se purificó por cromatografía de columna (SiO2/EtOAc/hexano 2-4%) para dar el compuesto del título (1.1 g): 1H RMN (400 MHz, CDCI3) d 1.30 (t, 3H), 2.50 (m, 1 H), 2.85 (m, 1H), 3.85 (s, 3H), 4.0 (m, 1H), 4.20 (c, 2H), 6.6 (s, 1H), 6.9 (m, 1H), 7.2 (s, 1H), 7.35 (m, 6H). b) Fenilsuccinato de etil (±) 3-f(3-metoxibenzoilo)1 Una solución de indenacetato de etil (±) 3-(3-metoxifenilo) (1.1 g, 3.6 mmoles) en acetona (30 mL) se trató con solución acuosa al 4% de tetróxido de osmio (0.5 mL) seguido por una adición por goteo de reactivo de Jones 1.2 M (5 mL, 6 mmoles) de acuerdo al procedimiento de literatura (J. Org. Chem. 1993, 58, 4745). Después de agitar durante la noche a temperatura ambiente, la mezcla de reacción obscura se extinguió con isopropanol (2.5 mL), seguido de bisulfito de sodio (0.9 g) y agua (30 mL). El producto se extrajo con acetato de etilo, se lavó con salmuera, se secó sobre MgS04, y se concentró para dar un residuo sólido. La trituración con 1 :1 éter/hexano dio 0.76 g del compuesto del título: 1H RMN (400 MHz, CDCI3) d 1.18 (t, 3H), 2.90 (m, 1H), 3.3 (m, 1H), 3.92 (s, 3H), 4.12 (c, 2H), 4.4 (m, 1 H), 4.4 (d, 1 H), 7.25 (m, 2H), 7.5 (m, 6H). c) Fenilsuccinato de etil (±) 3-[Y3-metoxibencilo)] Una mezcla de fenilsuccinato de etil (±) 3-[(3-metoxibenzoilo)] (0.76 g, 2.1 mmoles) y Pd/C 10% (0.6 g) en ácido acético glacial (35 mL) se hidrogenó a 3.515 kg/cm2 durante 17 horas. La mezcla se filtró utilizando Celite® y la almohadilla de filtro se lavó con ácido acético. El filtrado se concentró y reconcentró a partir de tolueno y cloruro de metileno para dar 0.65 g del compuesto del título: 1H RMN (400 MHz, CDCI3) d 1.20 (t, 3H), 2.20 (m, 1 H), 3.0 (m, 1H), 3.74 (s, 3H), 4.1 (c, 2H), 4.18 (c, 2H), 4.4 (d, 1 H), 6.2 (m, 2H), 7.22 (m, 6H). d) Acetato de etil (±)-10.11-dihidro-3-metoxi-11-oxo-5H-dibenzo[a,djcicloheptano-10 A una solución magnéticamente agitada de fenilsuccinato de etil (±) 3-[(3-metoxibencilo)] (0.65 g, 1.9 mmoles) en cloruro de metileno seco (10 mL) se añadió DMF (0.2 mL) y cloruro de oxalilo (0.2 mL, 2.28 mmoles). Después de 1.5 horas, la solución se añadió por goteo a una suspensión de cloruro de aluminio (0.6 g, 4.5 mmoles) en cloruro de metileno seco (15 mL). La mezcla se extinguió después de dos horas con agua helada, las capas se separaron, y la capa acuosa se extrajo con cloruro de metileno. Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre MgS04 y se concentraron. El residuo se purificó mediante cromatografía de columna (SiO2/EtOAc/hexano 2-4%) para dar el compuesto del título (0.3 g): 1H RMN (400 MHz, CDCI3) d 1.28 (t, 3H), 2.88 (m, 1H), 3.55 (m, 1H), 3.84 (s, 3H), 3.88 (d, 2H), 4.18 (c, 2H), 4.85 (d, 1H), 4.95 (m, 1H), 5.8 (m, 2H), 7.22 (m, 4H), 8.1 (s, 1H). e) Acetato de etil (+)-10.11-dihidro-3-metoxi-5H-dibenzo[a,d]cicloheptano-10 Una mezcla de acetato de etil (±)-10,11-dihidro-3-metoxi-11-oxo-5H-dibenzo[a,d]cicloheptano-10 (0.3 g., 0.93 mmoles) y Pd/C 10% (0.3 g) en ácido acético glacial (25 mL) se hidrogenó a 3.515 kg/cm2 durante 16 horas. La mezcla se filtró utilizando Celite® y se lavó con ácido acético. El filtrado se concentró y reconcentró a partir de tolueno y cloruro de metileno para dar 0.25 g del compuesto del título: 1H RMN (400 MHz, CDCI3) d 1.28 (t, 3H), 2.60 (m, 2H), 2.90 (m, 1H), 3.30 (m, 1H), 3.80 (s, 3H), 3.85 (d, 1H), 4.18 (c, 2H), 4.30 (d, 1H), 6.70 (m, 2H), 7.0 (d, 1 H), 7.22 (m, 4H). El siguiente ejemplo ilustra un método para preparar el compuesto biológicamente activo de esta invención a partir de compuestos intermediarios tales como los descritos en las preparaciones anteriores.

EJEMPL0 1 Preparación de ácido (S)-10.11-dihidro-3-[2-(5.6.7.8-tetrahidro-1.8- naft¡ridin-2-il)-1-etoxi]-5H-dibenzo[a.d]cicloheptano-10-acético a) Acetato de etil (S)-10.11-dihidro-3-[2-(5.6.7.8-tetrahidro-1.8-naftiridin-2-il)-1-etQXi]-5H-dibenzQ[a.d]cicloheptano-10 A una solución de acetato de etil (S)-10,11-dihidro-3-hidroxi-5H-dibenzo[a,d]cicloheptano-10 (200 mg, 0.67 mmoles), 2-(5,6.7,8-tetrahidro-1 ,8-naftiridin-2-il)-1 -etanol (241 mg, 1.35 mmoles), y PPf>3 (354 mg, 1.35 mmoles) en THF seco (5 mL) se añadió azodicarboxilato diisopropílico (0.27 mL, 1.35 mmoles) a 0°C. La mezcla se dejó calentar a temperatura ambiente conforme se calentaba el baño. Después de 18 horas, la mezcla se concentró bajo presión reducida. El residuo se sometió a cromatografía sobre gel de sílice (1:4.5 hexanos/Et20) para dar el compuesto del título (94 mg, 31%) como un aceite claro: MS (ES) m/e 457 (M+H)+. b) Acido (SV-10.11-dihidro-3-[2-(5.6.7.8-tetrahidro-1.8-naftiridin-2- ¡l)-1-etoxi]-5H-dibenzo[a.d]cicloheptano-10-acético A una solución de acetato de etil (S)-10,11 -dihidro-3-[2-(5, 6,7,8-tetrahidro-1 ,8-naft¡ridin-2-il)-1-etoxi]-5H-dibenzo[a,d]cicloheptano-10 (131 mg, 0.29 mmoles) en THF/H2O (2 mL) se añadió 1.0 N LiOH (0.43 mL, 0.43 mmoies), y la mezcla se calentó a 50°C. Después de 18 horas, la mezcla se enfrió a temperatura ambiente y se iavó con Et2O (2x2 mL). La capa acuosa se acidificó a pH 6 utilizando HCI10%. La solución lechosa resultante se pasó a través de una columna eluida por unión de C-18 (elución de gradiente: H2O, luego CH3CN/H2O 20%), luego CHCI3 como eluyente). Las fracciones que contienen el producto se concentraron bajo presión reducida para dar el compuesto del título (30 mg, 24%) como un polvo blanco: MS (ES) m/e 429 (M+H)+. Análisis calculado para C27H28N2O3- 0.95 HCl: C, 70.02; H, 6.30; N, 6.05. Encontrado: C, 70.01 ; H, 6.33; N, 5.71.

EJEMPLO 2 Composición de dosificación parenteral por unidad Una preparación la cual contiene 20 mg del compuesto del ejemplo 1 como un polvo seco estéril se prepara como sigue: se disuelven 20 mg del compuesto en 15 mL de agua destilada. La solución se filtra bajo condiciones estériles en una ampolleta de dosis múltiples de 25 mL y se liofiliza. El polvo es reconstituido por adición de 20 mL de dextrosa 5% en agua (D5W) para inyección intravenosa o intramuscular. De este modo, se determina la dosificación por el volumen de inyección. La dilución posterior se puede hacer por adición de un volumen medido de esta unidad de dosificación a otro volumen de D5W para inyección, o se puede añadir una dosis medida a otro mecanismo para surtir el fármaco, como en una botella o bolsa para infusión por goteo IV u otro sistema de infusión por inyección.

EJEMPLO 3 Composición de dosificación oral por unidad Una cápsula para administración oral se prepara al mezclar y moler 50 mg del compuesto del ejemplo 1 con 75 mg de lactosa y 5 mg de estearato de magnesio. El polvo resultante es analizado e introducido en una cápsula de gelatina dura.

EJEMPLO 4 Composición de dosificación oral por unidad Una tableta para administración oral se prepara al mezclar y granular 20 mg de sacarosa, 150 mg de dihidrato de sulfato de calcio y 50 mg del compuesto del ejemplo 1 con una solución de gelatina 10%. Los granulos húmedos son analizados, secados, mezclados con 10 mg de algodón, 5 mg de talco y 3 mg de ácido esteárico; y comprimidos en una tableta. La descripción anterior define completamente la manera para hacer y utilizar la presente invención. Sin embargo, la presente invención no está limitada a las modalidades particulares descritas anteriormente, pero incluye cualquier modificación de la misma dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones. Las diferentes referencias a diarios, patentes y otras publicaciones que son citadas en la presente, comprenden el estado de la técnica y se incorporan a la presente como referencia como si estuvieran completamente expuestas.

Claims (18)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un compuesto de acuerdo con la fórmula (I): o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

2.- Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

3.- Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de acuerdo con ia reivindicación 1, un agente antineoplástico y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

4.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque ei agente antineoplástico es topotecano.

5.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque el agente antineoplástico es cisplatino.

6.- Un compuesto de acuerdo con la fórmula (II):

(II) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 7.- Un procedimiento para preparar un compuesto de la fórmula I como se define en la reivindicación 1 , cuyo procedimiento comprende hacer reaccionar un compuesto de fórmula (lll): (lll) con 2-(5,6,7,8-tetrah¡dro-1 ,8-naftiridin-2-il)-1 -etanol en una reacción mediada por el complejo formado entre azodicarboxilato diisopropílico y trifenilfosfina, seguido de hidrólisis de éster utilizando una base acuosa.

8.- El uso de un compuesto de fórmula I como el que se reclama en la reivindicación 1 , para la elaboración de un medicamento para tratar enfermedades en las cuales se indique el antagonismo del receptor avß3-

9.- El uso de un compuesto de fórmula I como el que se reclama en la reivindicación 1 , para la elaboración de un medicamento para tratar enfermedades en las cuales se indica el antagonismo del receptor vßd.

10.- El uso de un compuesto de fórmula I como el que se reclama en la reivindicación 1 , para la elaboración de un medicamento para tratar osteoporosis.

11.- El uso de un compuesto de fórmula I como el que se reclama en la reivindicación 1 , para la elaboración de un medicamento para inhibir angiogénesis.

12.- El uso de un compuesto de fórmula I como el que se reclama en la reivindicación 1 , para la elaboración de un medicamento para inhibir crecimiento tumoral o metástasis tumoral.

13.- El uso de un compuesto de fórmula I como el que se reclama en la reivindicación 1, para la elaboración de un medicamento para tratar ateroscierosis o reestenosis.

14.- El uso de un compuesto de fórmula como el que se reclama en la reivindicación 1 , para la elaboración de un medicamento para tratar inflamación.

15.- El uso de un compuesto de fórmula I como el que se reclama en la reivindicación 1 y un agente antineoplástico, para la elaboración de un medicamento para inhibir crecimiento tumoral en combinación física o por administración gradual.

16.- El uso de conformidad con la reivindicación 26, en donde el agente antinedplástico es topotecano.

17.- El uso de conformidad con la reivindicación 26, en donde el agente antineoplástico es cisplatino.

18.- El uso de un compuesto de fórmula I como el que se reclama en la reivindicación 1 y un inhibidor de reabsorción ósea, para la elaboración de un medicamento para tratar osteoporosis en combinación física o para administración gradual. « • %