MXPA01004593A - Metodo para controlar la expresion genetica en bacterias, por decir rhizobiaceae para mejorar el desarrollo de los nodulos de raiz, la fijacion de nitrogeno y producccion de la biomasa en plantas. - Google Patents

Abstract

Se describe una secuencia promintron proveniente de una secuencia intervinente del gen rolA de Agrobacterium rhizogenes cepa A4. La secuencia puede dirigir la expresion genica en bacteroides en todas las etapas del desarrollo de nodulos para obtener, con el tiempo de desarrollo del nodulo, una expresion constitutiva del gen(es) de interes. Tambien se describe el uso de la secuencia, proveniente de vectores y bacterias recombinantes.

Description

MÉTODO PARA CONTROLAR LA EXPRESIÓN GÉNICA EN BACTERIAS, POR DECIR RHIZOBIACEAE, PARA MEJORAR EL DESARROLLO DE LOS NODULOS DE LA RAÍZ, LA FIJACIÓN DE NITRÓGENO Y PRODUCCIÓN DE LA BIOMASA EN PLANTAS La presente invención se refiere al uso de la secuencia de DNA promintron del gen rolA de la cepa Agrobacterium rhizogenes A4, o de las secuencias del promintron del DNA provenientes de ésta, o de las secuencias promintron del DNA de los genes homólogos de otras cepas de Agrobacterium rhizogenes, para favorecer la expresión génica a nivel de la transcripción en bacterias recombinantes y lograr, por ejemplo, la síntesis de las fitohormonas dentro de bacterias y/o bacteroides. La presente invención demuestra que el gen iaaM de Pseudomonas syringae y el gen tms2 de Agrobacterium tumefaciens son capaces de mejorar el proceso de nodulación y la fijación de nitrógeno cuando se expresan como unidad bicistrónica en Rhizobia bajo el control de la secuencia promintron. El promintron es particularmente conveniente y útil para el uso para impulsar la expresión génica dentro de bacteroides en todas las etapas del desarrollo de los nodulos a fin de obtener, con el tiempo de desarrollo del nodulo, una expresión constitutiva del (los) gen (es) de interés. Por tanto, en este caso constitutivo se entiende que, mediante los diferentes patrones de expresión en diferentes etapas del desarrollo del nodulo, se obtiene una expresión génica en todas las partes del nodulo donde Rhizobia albergan células vegetales. La invención se basa en la demostración no descrita que la secuencia intrón de 85 pb del gen rolA de la cepa Agrobacteria A4 puede promover la expresión génica en células procarióticas . Por tanto, la secuencia de DNA de 85 pb ha sido nombrada "promintron", indicando su función de intrón en células eucarióticas (Magrelli, A. y col. (1994) Science, 266, 1986-1988), y del promotor en células procarióticas. El término "promotor" se refiere a las secuencias de nucleótidos necesarias para el inicio de la transcripción, es decir, la unión de la RNA polimerasa, y también incluye por ejemplo los cuadros -35 y -10 u otras regiones reguladoras. La actividad promotora de Rhizobia del promintron rolA pudo lograr la expresión génica en un patrón novedoso y peculiar dentro de los nodulos de las raíces, dando origen a una expresión constitutiva. La invención es particularmente útil: i) para alterar el desarrollo de los nodulos e incrementar la fijación de nitrógeno por las plantas en la nodulación y/o por bacterias fijando nitrógeno; ii) para mejorar el crecimiento de las plantas y acelerar la producción de la biomasa de las plantas inoculando plantas leguminosas con Rhizcbia genéticamente modificada (Rhizobia en la presente se utiliza como un nombre colectivo que incluye Rhizobium, Sinorhizobium, Azorhizobium, Mesorhizobium y Brady rhizobium) . La presente invención también se refiere a las construcciones de DNA en las cuales el promintron controla la expresión de una secuencia de DNA, con lo cual dirige la expresión a los efectos antes mencionados. Además, la presente invención se refiere a las bacterias genéticamente manipuladas que pueden mejorar la fijación de nitrógeno y en consecuencia la producción de la biomasa vegetal. Además, el mejoramiento de la fijación de nitrógeno en plantas podría lograrse en presencia de concentraciones de nitrato afectando de manera negativa el proceso de nodulación. Es muy probable que la población mundial aumente en dos billones de personas los próximos 25 años principalmente en Asia y en África. Las proteínas provenientes de leguminosas representan en realidad el 33% de la dieta humana total. Las plantas leguminosas pueden por sí mismas proporcionar nitrógeno a través de asociaciones con bacterias fijadoras de nitrógeno del género Rhizobia, es decir, Rhizobium, Sinorhizobium, Azorhizobium, Mesorhizobium y Bradyrhizobium . Existen otras plantas no pertenecientes a Leguminosae, y aún pueden hospedar bacterias en un nodulo fijador de nitrógeno.

Una planta no perteneciente a la familia de leguminosas que interactúa con Rhizobia fijadora de nitrógeno es Parasponia (Ulmaceae) . Además, los actinomicetos del género Frankia interactúan con especies de plantas de ocho diferentes familias y permiten la producción de nodulos de raíz (Pawlowski, K. y col. (1988) en: Biological Nitrogen Fixation for the 213t Century, eds. C. Elmerich, A. Kondorosi y W. E. Newton, Kluwer Academic publisher, pp. 199-201) . La fijación de nitrógeno simbiótico desempeña una función principal en el ciclo del nitrógeno. No obstante, la explotación agrícola da origen a una gran captación de nitrógeno orgánico del suelo, lo cual se compensa proporcionando a las plantas fertilizadores . No obstante, la fertilización con nitrógeno provoca problemas ambientales graves debido a que su exceso contribuye a contaminación del agua. La fertilización con nitrógeno representa una de las partes más importantes de los costos agrícolas. El consumo mundial de fertilizantes de nitrógeno aumentó en los últimos 55 años de 3 a 100 TG (1TG = 1012 g) . Para producir fertilizadores de nitrógeno, en todo el mundo, de 2 a 5% de las fuentes de energía no renovables (por ejemplo petróleo y otras formas de combustible) se queman cada año. Un problema ambiental asociado con el uso de fertilizantes de nitrógenos sintéticos es el escurrimiento o filtración del exceso de nitrato hacia el agua subterránea. Hasta el 10% de los nitratos liberados terminan como óxido nitroso, un gas de invernadero cuya reflectividad de energía representa 180 veces la del dióxido de carbono (Hardy, R. W. F. y Eaglesham, A. R. J. (1995) . En: Nitrogen Fixation: Fundamentáis and applications. I. A. Tikhonovich et al., (eds.), pp. 619-620). Grandes poblaciones en los países industrializados actualmente enfrentan el problema de contaminación por nitrato del agua potable, y el precio del agua para uso humano aumentará con rapidez. Por tanto, el problema general subyacente a la presente invención está representado por la necesidad de mejorar el cultivo de leguminosas y otras plantas formadoras de nodulos, con el objeto de contribuir a una disminución drástica de la liberación de nitratos hacia el ambiente. Una solución a estos problemas es aumentar el cultivo de plantas que puedan fijar nitrógeno atmosférico o aumentar su capacidad de fijación de nitrógeno. La fijación de nitrógeno biológico (BNF) mediante microbios de vida libre, fijadores de nitrógeno asociativo y simbiótico es responsable de la conversión de aproximadamente 120 millones de toneladas de nitrógeno atmosférico en amoniaco cada año, lo cual representa 40% de la solicitud de nitrógeno total (Vanee, C. P., Tirad European Nitrogen Fixation Conference, Lunteren, The Netherlands, 1998, p. 17); la fijación de nitrógeno simbiótico es el principal mecanismo natural por el cual se reduce el nitrógeno (Frannssen, H. J. y col. (1992) Plant. Molec. Biol., 19, 89-107). Los miembros de la familia Rhizobiaceae, que incluye Rhizobia fijadora de nitrógeno, pueden entrar en simbiosis con plantas principalmente leguminosas, dando origen a la formación de nodulos de raíz. Dentro de las células del nodulo de raíz, las bacterias se diferencian en bacteroides. Los bacteroides maduros fijan el nitrógeno atmosférico y lo convierten en amoniaco mediante una actividad de la nitrogenasa. El amoniaco así producido es exportado de los nodulos y se incorpora en los aminoácidos de la planta, ureidos y bases azotadas. Así pues, en presencia de una raíz nodulada, el crecimiento de la planta es independiente de las fuentes de nitrógeno alternativas. El desarrollo de los nodulos de la raíz es el resultado de una interacción simbiótica controlada por algunos factores. Las fases tempranas de esta interacción requieren el intercambio de señales químicas entre las dos contrapartes: la raíz de la planta y las bacterias. La raíz de la planta produce señales químicas, como los flavonoides, que interactúan con Rhizobia, y lo que es más importante, inducen la expresión de los genes bacterianos, los genes nod, involucrados en la producción de los denominados factores Nod. Los factores Nod son lipooligosacáridos que desempeñan una función crucial en las fases tempranas del desarrollo del nodulo (Denarié, J. , Debellé, F., y Promé, J. -C. (1996) Annual Review Biochemistry 65, 503-535) . Aunque la función de los factores Nod en activar el desarrollo de los nodulos de la raíz está bien establecida, la función de las fitohormonas en el desarrollo del nodulo de la raíz todavía no es clara. Las fitohormonas son factores de crecimiento de la planta capaces de modificar el crecimiento y desarrollo de la planta. En vista de que las fitohormonas están involucradas en casi cualquier proceso de desarrollo y/o fisiológico de la planta, es más razonable una función de las fitohormonas en el desarrollo del nodulo. No obstante, a pesar de los esfuerzos dirigidos a solucionar la pregunta general de una función de las fitohormonas en la nodulación, en 1994 Hirsch y Fang resumieron el estado de la técnica con las siguientes palabras: "Las preguntas importantes que siguen sin contestar: ¿qué hormonas toman parte en la formación del nodulo, y cómo están involucradas?" (A. M. Hirsch y Y. Fang, (1994) Plant Mol. Biol. 26, 5-9) . Ya en 1936, Thimann (Thimann, K. (1936) P. N. A. S. EU, 22, 511-514) propuso que la(s) auxina(s) desempeña una función en el desarrollo de los nodulos, y que los nodulos de las raíces contienen auxina(s). además, con base en los ensayos biológicos, Thimann mostró que el contenido de auxina, estimado como actividad biológica auxínica, dentro de un nodulo es mayor que el de las raíces no infectadas. En la actualidad está bien establecido que Rhizobia de vida libre contiene auxinas, como puede ser el ácido indol-3-acético (IAA) , indol-3-etanol, indol-3-aldehído e indol-3-metanol (Ernsten, A. y col. (1987) Planta 171, 422-428).

Además, los flavonoides, es decir, las señales químicas producidas por la raíz de las plantas que atraen Rhizobia y estimulan la síntesis de los factores Nod, estimulan la síntesis de IAA en Rhizobia crecida en cultivo líquido (Prinsen, E. y col. (1991) FEBS Letters, 282, 53-55). Aunque estos datos son consistentes con una función posible de la(s) auxina (s) en el desarrollo del nodulo, Hirsch en 1992 reportó que "la Rhizobia puede sintetizar hormonas vegetales, pero las mutaciones en sus genes productores de auxinas no impiden la nodulación, ni los mutantes de Nod dejan de producir hormonas (Hirsch, A. M. (1992) New Phytologist, 122, 211-237). Otros estudios dirigidos a la "contribución de la planta" al proceso de nodulación, como los de Hirsch, A. M. y col. (P. N. A. S. EU (1989) 86, 1244-1248), de Alien, E. K., Alien, O. N. y Newman, A. S. (Am. J. Botany (1953), 40, 429-435), y de Torrey, J. G. (en: "New root formation in plants and cuttings", 1986 ed. Jackson MB, Martinus Nijhoff Publishers, Dordrecht, 31-66) , han encontrado que los inhibidores del transporte de auxina polar indujo seudonódulos en raíces de alfalfa. Mathesius y col. (The Plant Journal (1998) 14, 23-34) recientemente ha mostrado que la inhibición del transporte de auxina precede a la formación del nodulo de raíz. Kijne, J. W. y col. (Tirad European Nitrogen fixation Conference, Lunteren, The Netherlands, 1998, p. 24), han mostrado que i) un aumento local de IAA precede la inducción de las divisiones celulares en la corteza interna, y ii) el nitrato inhibe la respuesta de IAA en lugar de su acumulación. Otras indicaciones de una función de las fitohormonas auxínicas producidas pro el tejido de las plantas en el desarrollo de los nodulos surge de variantes de Medicago varia, definida como sensible a auxina y por lo común conteniendo un mayor contenido de auxinas, que formó más nodulos que las variantes menos sensibles (Kondorosi, E. y col. (1993) en: Nester, E. W. y Verma, D. P. S. eds., Advances in Molecular-Genetics of Plant microbe interactions, pp. 143-450) . Además, las plantas transgénicas para el gen rolB nodularon más rápido y tuvieron más nodulos (Kondorosi y col. ibidem) . Se sabe que el gen rolB aumenta la sensibilidad a la auxina. La función de rolB es considerada por algunos autores sin efecto sobre el contenido de auxina y como un receptor de membrana para el IAA de auxina, mientras que otros (Solicitud del PCT No. WO 98/28430) consideran a la proteína rolB una beta glucosidasa capaz de liberar la auxina indoletanol del indoletanol-glucósido. Se considera al indoletanol como una auxina per se, y se convierte en IAA, la principal forma de la auxina en plantas (Sembdner, G. y col. (1980) en: Encyclopedia of Plant Physiology, vol. 9: Hormonal regulation of development. I. Molecular aspects of plant hormones, pp. 281-444; MacMillan, J. Ed., Springer, Berlín, Heidelberg, New York; Sandberg, G., Crozier, A., Ernsten, A. (1987) en: The Principies and practices of plant hormone analysis, vol. 2, pp. 169-301, Rivier, L., Crozier, A. eds. Academic Press, Londres) . La presente invención se ha dirigido a tres aspectos relacionados con los problemas antes mencionados: i) es posible modificar el desarrollo del nodulo de la raíz expresando genes que sinteticen auxina con Rhizobia? ; ii) ¿tiene la planta nodulada por la cepa genéticamente manipulada de Rhizobia una mayor capacidad para reducir el nitrógeno atmosférico en amoniaco? iii) ¿la planta nodulada por Rhizobia genéticamente manipulada se altera en su crecimiento, y esta alteración mejora la producción de biomasa de la planta? Los genes que codifican para las enzimas capaces de modificar el metabolismo de auxina pueden ser tomados de los genomas de las plantas, pero también de los genomas de las bacterias (Spena, A., Estruch, J. J. y Schell, J. (1992) Current Opinión in Biotechnology 3, 159-163) . Cualquiera que sea el origen del (los) gen (es) y/o la(s) región (es) codificante, la especificidad adecuada de la expresión dentro de la bacteria y, lo que es más importante, dentro de los bacteroides debe ser conferido a la(s) región (es) codificante posicionando la región (es) codificante bajo el control de una secuencia promotora (DNA) adecuada. La presente invención soluciona los problemas de la técnica anterior proporcionando los medios técnicos para mejora la expresión génica en bacterias recombinantes, de preferencia Rhizobiaceae, y de mayor preferencia Rhizobium, y se utilizan fácilmente para el control adecuado de la expresión de los genes capaces de aumentar el contenido de auxinas y, como consecuencia, mejorar los procesos de nodulación y fijación de nitrógeno. La secuencia promintron de la invención puede promover la expresión procariótica en todas las zonas de los nodulos donde los bacteroides están ubicados con un patrón de expresión temporalmente definido. Además, el promintron .impulsa la expresión génica durante la fase exponencial de crecimiento y es inducido durante la fase estacionaria de crecimiento de las bacterias de vida libre. Todas estas características son muy ventajosas cuando la expresión génica va a ser promovida en bacterias de suelos fijadoras de nitrógeno bajo la fase de crecimiento exponencial y estacionaria, y en bacteroides en el nodulo de raíz . En particular, una construcción génica de la invención comprende la secuencia promintron del gen rolA, como en la SEQ ID NO: 1, y las regiones codificadoras del iaaM de Pseudomonas syringae subespecie savastanoi y el gen tms2 de Agrobacterium tumefaciens . Las dos regiones codificadoras han sido construidas como una unidad bicistrónica bajo el control del promintron rolA cuya actividad promotora toma lugar en el nodulo en un patrón de expresión no descrito y novedoso. La combinación del promintron a la unidad bicistrónica, y su introducción en Rhizobia, ha permitido a los autores de la invención mostrar que las auxinas afectan el desarrollo y función de los nodulos. El uso de dos regiones codificadoras significa aumentar la síntesis y contenido de IAA, y en consecuencia, aumentar también la síntesis y contenido de los conjugados de IAA (nombre colectivo que indica todas las formas de IAA conjugadas por uniones covalentes a los aminoácidos o a glucosa o a otras porciones químicas) en las células vegetales de los nodulos de la raíz. El mismo efecto podría obtenerse utilizando los genes iaaM y tms2 de otras cepas de Agrobacteria o Pseudomonas, o utilizando otros genes que puedan aumentar el contenido de IAA. Dado que, por lo común Rhizobia no contiene indolacetamida, ni pueden convertir triptofano en indolacetamida (IAM) , ni pueden convertir IAM en IAA (Ernstsen y col., 1987, ibidem) , los autores han diseñado una ruta bioquímica novedosa que requiere que ambos genes sinteticen de manera eficiente IAA a partir de triptofano. No obstante, en estas Rhizobia, como puede ser bradirhizobium, que no contiene el gen bam —un homólogo endógeno del gen tms2 (Sekine, M. , Watanabe, K. y Syono, K. (1989) J. Bacteriol. 171, 1718-1724)- esto podría ser suficiente para expresar solo el gen iaaM bajo el control de la secuencia promintron del DNA. Un homólogo funcional de tms2 también está presente en algunas plantas superiores, como se muestra en la solicitud del PCT WO98/28430. En otra modalidad de la presente invención, la expresión de la secuencia de DNA de la cual es dirigida por el promintron es una codificante para indolpiruvato descarboxilasa. La indolpiruvato descarboxilasa es la enzima clave en la ruta indol pirúvico de la síntesis de IAA en la que el IAA se sintetiza a partir de triptofano. La conversión de ácido indolpirúvico en IAA es el paso limitante de la velocidad de esta vía. La secuencia de DNA que codifica para una indolpiruvato descarboxilasa conveniente ya ha sido clonada, por ejemplo, de Enterobacter cloacae (véase, por ejemplo, Koga y col., Mol. Gen. Genet. (1991), 226, 10-16) .

El término "auxina" comprende en este contexto sustancias orgánicas naturales y sintéticas que actúan como fitohormonas en el sentido que favorecen el alargamiento de los brotes o retoños que inhiben el alargamiento de las raíces, de preferencia en concentraciones bajas, de mayor preferencia ya en concentraciones menores que 10~6M. De preferencia, una auxina muestra cuando menos uno de los siguientes efectos sobre el desarrollo de las plantas: estimulación de la división celular, del alargamiento de las células y/o de la expresión celular de dominancia apical, estimulación de la diferenciación del xilema, estimulación del alargamiento celular y actividad en la división celular de las células del cambium, estimulación de la formación de la raíz lateral y adventicia, estimulación de la nodulación, de la germinación, de la epinastia de las hojas, del crecimiento celular del ovario, del partenocarpio, de la formación de las flores hembra y de la expansión de las hojas. Más particularmente, el término "auxinas" se refiere al ácido indol-3-acético (IAA) que se sintetiza principalmente en células vegetales a partir de triptofano a través del indol-3-piruvato e indol-3-acetaldehído, y que se degrada por oxidación catalizada por enzimas. No obstante, el término también comprende otros compuestos naturales que actúan como una auxina y que provienen de indol u otro compuesto, por ejemplo, el ácido fenilacético que ocurre en la naturaleza y que es una auxina no indólica o ácido 4- (indol-3-il) butírico. Además, este término comprende compuestos de organismos además de plantas o compuestos químicamente sintetizados que tienen cuando menos uno de los efectos sobre el desarrollo de las plantas antes mencionado. Un ejemplo de este compuesto es el ácido (2,4-diclorofenoxi) -acético (2,4-D). En una modalidad preferida, la secuencia de DNA ligada al promintron codifica para un polipéptido que está involucrado de manera natural en la biosíntesis de cuando menos una auxina. La expresión de la secuencia de DNA en las células de Rhizobia da origen a un aumento en la actividad biológica (por ejemplo, enzimática) de este polipéptido y en consecuencia al aumento del contenido de cuando menos una auxina primero en el bacteroide, y después exporta la auxina de los bacteroides, en las células vegetales del nodulo. Así pues, en principio, mediante esta modalidad se contempla que el contenido y/o actividad de la auxina puede incrementarse aumentando la biosíntesis de cuando menos una auxina debido a la estimulación/aceleración de una ruta biosintética que de origen a la síntesis de auxina. En otra modalidad preferida, la secuencia de DNA ligada al promintron codifica para una proteína que no se expresa de manera natural en Rhizobia y que con la expresión de bacteroide origina la síntesis de cuando menos una auxina o un precursor de una auxina a partir de un metabolito presente en las células bacterianas y/o bacteroides. Un ejemplo de un gen que de preferencia se utiliza para el propósito de la presente invención es el gen iaaM de Pseudomonas syringae subespecie Savastanoi, el agente etiológico de tumores de plantas en árboles de olivo y adelfa (Spena, A., Estruch, J. J. , Schell, J. , Curr. Opinión in Biotechnology (1992), 3, 159-163) . El desarrollo neoplásico es causado por las fitohormonas sintetizadas por las bacterias, las cuales luego son secretadas hacia los tejidos circundantes y estimulan el crecimiento localizado de las células vegetales. Entre los genes involucrados en la patogénesis de este tipo de tumor, el gen iaaM codifica para la indolacetamida monooxigenasa, y es responsable de convertir por oxidación el aminoácido triptofano en indolacetamida. La indolacetamida no tiene actividad de auxina particular, sino se convierte en iaaH por la hidrolasa codificada por el gen iaaH de Pseudomonas syringae subespecie Savastanoi, que es homólogo al gen tms2 de Agrobacterium tumefaciens . En tejidos vegetales, la indolacetamida , también se convierte a IAA, por reacción química o por hidrolasas no específicas. El gen iaaM de Pseudomonas syringae subespecie Savastanoi es conocido y su secuencia ha sido publicada (Yamada y col. (1985) P. N. A. S. EU, 82, 6522-6526). El gen tms2 de Agrobacterium tumefaciens es conocido y su secuencia ha sido publicada (Klee, H. y col. (1984) P. N. A. S. EU 81, 1728-1732) . De acuerdo con la invención, los genes homólogos en función al gen iaaM de P. syringae y al gen tms2 de Agrobacterium tumefaciens pueden ser utilizados para el propósito de esta invención. Estos genes que de preferencia también son homólogos con respecto a la secuencia de nucleótidos pueden ser aislados por el experto en la técnica utilizando los métodos conocidos, por ejemplo, la detección de bibliotecas de cDNA o genómicas con sondas diseñadas con base en el gen iaaM de Pseudomonas syringae y/o el gen tms2 de Agrobacterium tumefaciens . Estos genes con una actividad similar a la del gen iaaM producto de P. syringae han sido clonados, por ejemplo, a partir de algunas cepas de Agrobacteria (es decir, Agrobacterium tumefaciens y rhizogenes; véase, por ejemplo, Klee y col. (1987), Gene Dev, 1, 186-196; White y col. (1985) J. Bacteriol., 164, 33-44; Cardarelli y col. (1987), Mol. Gen. Genet., 208, 457-463. La secuencia promintron de DNA de 85 pb del gen rolA proveniente del plásmido Ri A4 (SEQ ID NO: 1) favorece la expresión génica de las secuencias de DNA posicionadas bajo su control (es decir, ligadas a su extremo 3' ) en sistemas procarióticos, como puede ser E. _ coli, Rhizobia y Agrobacteria, durante las fases de crecimiento exponencial, post-exponencial y estacionaria. Además, el promintron promueve la expresión génica en bacteroides dentro de los nodulos de la raíz. El experto en la técnica puede fácilmente y sin esfuerzo inventivo aislar secuencias promintron a partir de otras cepas de Agrobacterium rhizogenes y/o asilar promotores homólogos funcionales, a saber, promotores que impulsen la expresión génica con un patrón idéntico en bacteroides en los nodulos de la raíz y/o en bacterias de vida libre. Por tanto, un objetivo específico de la presente invención es utilizar la secuencia promintron del gen rolA de Agrobacterium rhizogenes como en la SEQ ID NO: 1, o de las secuencias de DNA que comprenden la secuencia promintron, o del homólogo funcional o porción de éste, para inducir la expresión de una secuencia codificadora de DNA, en bacterias recombinantes durante la fase de crecimiento exponencial, post-exponencial y estacionaria, y en bacteroides en los nodulos de la raíz, la secuencia de DNA codificadora estando bajo el control de la secuencia promintron, o de promotores homólogos funcionales. De preferencia, la bacteria recombinante que pertenece a las familias Enter obacteriaceae o Rhizobiaceae, de mayor preferencia E. coli, Rhizobia o Agrobacteria . En una modalidad preferida, las bacterias recombinantes son del género Rhizobia, dentro de los nodulos de raíz simbióticos o en el estado de vida libre. Cuando las bacterias están dentro de los nodulos de las raíces simbióticas, estos son bacteroides de etapa I, II, III, IV, V ó Rhizobia, presentes en el espacio apoplástico, o Rhizobia presentes en la zona de senescencia, o Rhizobia presentes en la zona de fijación de nitrógeno, o Rhizobia presentes en la zona de invasión. Otro objetivo de la invención es una molécula de DNA recombinante que comprenda la secuencia promintron de acuerdo con la invención, o un homólogo funcional o porción de éste, y ligado en forma covalente al extremo 3' de la secuencia promintron, una secuencia codificadora de DNA, en donde la molécula de DNA recombinante esta albergada por los elementos episomales o integrada en el genoma bacteriano. De preferencia, la secuencia codificadora de DNA es una unidad de transcripción monocistrónica o policistrónica, de mayor preferencia codifica una proteína involucrada en la síntesis y/o metabolismo de las hormonas vegetales, de mayor preferencia codifica una proteína involucrada en la síntesis y/o metabolismo de auxina, hormona vegetal, de mayor preferencia codifica para una proteína involucrada en la síntesis y/o metabolismo de la auxina IAA o de la auxina indoletanol, aún de mayor preferencia codifica la proteína iaaM de P. syringae subespecie savastanoi o un homólogo (es decir, con una actividad enzimática similar) de esta y/o codifica la proteína tms2 de A. tumefaciens o un homólogo de ésta. En un aspecto preferido, la molécula de DNA recombinante de acuerdo con la invención comprende las regiones codificadoras iaaM y la tms2. De otro modo, la molécula de DNA recombinante de la invención comprende una secuencia codificadora de DNA que codifica la indolpiruvato descarboxilasa de Enterobacter cloacae o un homólogo de éste. Otro objetivo de la invención son las bacterias genéticamente manipuladas que comprenden la molécula de DNA recombinante descrita. Las bacterias de preferencia están comprendidas en la siguiente lista: Rhizobia, como ya se especificó, Azotobacter, Azospirillum, Anabaena , Enterobacter iaceae. Dentro del alcance de la invención esta el uso de la molécula de DNA recombinante para aumentar el tamaño y/o actividad del nodulo, y/o para aumentar la producción de biomasa de las plantas. Esta dentro del alcance de la invención el uso de la molécula de DNA recombinante para aumentar la capacidad de fijación de nitrógeno de los nodulos de las raíces. La invención será descrita en algunos ejemplos haciendo referencia a las siguientes figuras: Figura 1: Dibujo esquemático de los genes reportero quiméricos. La construcción 86AGUS contiene: i) un fragmento de DNA de 86 pb de largo que comprende la secuencia promintron de 85 pb como se muestra en la SEQ ID NO: 1 más un residuo A en su extremo 3' ; ii) la secuencia de DNA correspondiente a los primeros 40 aminoácidos de la proteína rolA fusionada a iii) la región codificadora uidA. La construcción 87-17GUS contiene el extremo 5' al 3' : un sitio de restricción Eco Rl (GAATTC) , la secuencia promintron de la SEQ ID NO: 1, una secuencia ligadora de 17 pb (SEQ ID NO: 2), un sitio de restricción Kpnl (GGTACC) , antes de ATG de la región codificadora uidA. ? GUS indica la construcción que contiene solo la región codificadora uidA, es decir, sin secuencia promintron. Promintron indica la secuencia de 86 pb que comprende las 85 pb del promintron rolA (desde -1 hasta -86 siendo +1 el A del codón de iniciación ATG del gen rolA) . La región codificadora rolA indica la secuencia que codifica para los 40 aminoácidos NH2 terminales de la proteína rolA. GUS indica la región codificadora uidA. Las construcciones fueron clonadas en orientación, como fragmentos EcoRI, en el vector pG, un derivado de pMB393 (Gage, D. J. , Bobo, T. y Long, S. R. (1996) J. Bacteriology, 178, 7159-7166, véase los materiales y métodos) . Figura 2. Fase de crecimiento dependiente de la expresión de la actividad de ß-glucuronidasa en Rhizobium leguminosarum conteniendo la construcción 86AGUS. Las células fueron crecidas en medio rico (medio rico triptona-extracto de levadura) hasta la fase estacionaria (primera muestra en el lado negativo del eje temporal) , luego diluidas 100 veces en medio TYR. La densidad óptica a 600 nm (cuadros claros) y la actividad específica de ß-glucuronidasa (cuadros oscuros) también está mostrada. Los valores son promedio de cuando menos cuatro experimentos independientes .

SE significa error estándar. La construcción ? GUS, conteniendo solo la región codificadora uidA (GUS) , mostró niveles no detectables de actividad específica de ß-glucuronidasa y en consecuencia no ha sido reportada en la figura. Figura 3. Nodulos de raíz de plantas Vicia hirsuta infectadas con R . 1 . viciae conteniendo la construcción 86AGUS fueron teñidas para actividad de ß-glucuronidasa a diferente edad. Los cuadros A a B muestran nodulos de una semana. El cuadro A muestra solo cuatro capas de células infectadas, y en consecuencia, teñidas (azul) , justo atrás del meristemo (indicado con un asterisco en el cuadro E) . El cuadro B muestra que en esta etapa de desarrollo, la zona de infección se agranda y ocupará después (cuadro C) todo el nodulo. El cuadro D muestra tres nodulos en tres diferentes etapas de infección en la misma raíz. El cuadro E muestra un nodulo de dos semanas; se debe observar la forma cilindrica del nodulo donde todo el tejido interno está invadido por bacteroides expresando actividad GUS. El cuadro F muestra un nodulo fijador de nitrógeno de tres semanas donde las zonas II y Til están teñidas (azul) aunque la zona de senescencia IV no esta teñida en su mayor parte. El cuadro G muestra un nodulo de cuatro semanas exhibiendo tinción intensa en la última zona senescente más cercana a la raíz. El cuadro H muestra una doble tinción para la actividad GUS y para el depósito de almidón (véase Materiales y Métodos) ; observe la interzona II-III indicada por las flechas. Arriba de la interzona II-III es visible una zona de invasión II en tamaño reducido y todavía teñida (azul) ; la flecha doble muestra manchas (azul) de la actividad GUS más cercana a la raíz. Figura 4. Los cuadros A hasta El: raíces infectadas con R. l . viciae tipo silvestre conteniendo la construcción 86AGUS (en los cuadros C, D y en el lado derecho de los cuadros A y G) o la construcción promintron-iaa -tms2 (cuadros B, E, El, F y en el lado izquierdo de los cuadros A y G) . Los cuadros F y G son imágenes microscópicas de campo brillante. Observe que la raíz en el lado izquierdo del cuadro A ha sido infectada con bacterias que contienen la construcción promintron-iaa -tms2 y tienen nodulos más grandes, arracimados cerca de la semilla y seguido por una región larga de la raíz sin nodulos. La parte más distante de la raíz tiene otra vez nodulos. La raíz en el lado derecho del cuadro A ha sido infectada con R . 1. viciae conteniendo la construcción 86AGUS: se muestra la aparición regular de nodulos a todo lo largo de la raíz (amplificados en el cuadro D) . Los cuadros B y C permiten la comparación del tamaño de los nodulos producidos con Rhizobia tipo silvestre (cuadro C) y genéticamente manipulada conteniendo la construcción promintron-iaa -tms2 (cuadro B) . El cuadro E y El muestran la morfología de dos nodulos comunes producidos por bacterias que albergan la construcción promintron-iaa -tms.2: bilobados en el cuadro E o altamente arracimados en el cuadro El. En el cuadro F se muestra una vista microscópica de campo oscuro de un nodulo bilobado clarificado (véase Materiales y Métodos) proveniente de la inoculación con R . 1 . viciae conteniendo la construcción promintron-iaa -tms.2. En el cuadro G el mismo par de nodulos mostrados en el cuadro F se compara con un nodulo de una edad idéntica proveniente de R . 1 . viciae que alberga la construcción 86AGUS y teñido para la actividad ß-glucuronidasa . Figura 5. Plantas Vicia hirsuta fueron crecidas en sacos para el crecimiento de semillas (Mega International, Minneapolis), cinco semillas por saco. En la parte izquierda del cuadro A y B, y en el cuadro C se muestran plantas de 35 días infectadas con R . 1. viciae albergando la construcción promintron-iaa - ms2; en la parte derecha de los cuadros A y B, y en el cuadro B se muestran plantas infectadas con R . 1 . viciae conteniendo la construcción 86AGUS. Observe en los cuadros A y B el tamaño más grande de las plantas infectadas con la construcción promintron-iaaM- ms.2 en comparación con el de las plantas infectadas con Rhizobia albergando la construcción 86AGUS. Las plantas noduladas por R . 1 . viciae conteniendo la construcción 86AGUS tienen hojas más pequeñas (cuadro D) , menos ramificaciones y más hojas senescentes por planta. Las hojas con un color verde más oscuro son mostradas por plantas noduladas por Rhizobia albergando la construcción promintron-iaaM-tiOs2 (cuadro C) , además las plantas tienen una apariencia más saludable (compare el cuadro C con el cuadro D) . Figura 6. Ensayo de reducción de acetileno (ARA). Los datos comparan ARA de plantas de 18, 27 y 31 días de edad noduladas con R. 1 . viciae, albergando la construcción 86AGUS (control) o con Rhizobia albergando la construcción promintron-iaaM-tms.2. En cada caso, el control es considerado como 100% y los datos indican el porcentaje de aumento de ARA obtenido a partir de las raíces noduladas con Rhizobia conteniendo la construcción promintron-iaaM-tms2. Cada columna representa el valor promedio obtenido de 50 plantas. El ARA ha sido expresado en unidades arbitrarias. Figura 7. Peso seco de la planta. El tallo de las plantas noduladas fue cortado justo por encima de la semilla y secado en un horno a 85°C durante la noche. El cuadro A muestra el peso seco de la planta de plantas de 18, 27 y 31 días noduladas con R. 1 . viciae albergando la construcción 86AGUS (control) y las infectadas con Rhizobia conteniendo la construcción promintron-iaaM-tms.2. En cada caso, se considera el control como el 100% y se indica como cero en el eje de las abscisas; los datos indican la variación en porcentaje, del control correspondiente, del peso seco obtenido de los tallos de plantas noduladas con la construcción promintron-iaaM-tms2. Cada columna representa el valor de 50 plantas. Figura 8. Secuencia de nucleótidos del promintron rolA del plásmido Ri A4 de Agrobacterium rhizogenes . Las secuencias muestran homología a: i) las regiones -10 y -35 de los 70 promotores sigma dependientes, ii) la región -10 de los 38 promotores sigma dependientes, y iii) la denominada secuencia GEAR-BOX están impresas en negritas. La flecha indica el inicio principal de la transcripción. Figura 9. Nodulos de raíces de 29 (cuadros 1 y 5) , 36 (cuadros 2 y 6) , 43 (cuadros 3 y 7) y 50 (cuadros 4 y 8) días de edad generadas en plántulas de Vicia hirsuta mediante la cepa tipo silvestre de R . 1 . viciae RPR1105 (cuadros 1-4) o por la construcción promintron- iaaM- tms2 (cuadros 5-8) . Observe el aumento en el tamaño de los nodulos y las diferentes formas de los nodulos en 5, 6, 7 y 8 en comparación con los nodulos control en los cuadros 1, 2, 3 y 4.

Figura 10. Nodulos de raíces de plantas Vicia hirsuta, noduladas por la cepa tipo silvestre de R.I. viciae RPR1105 o por su derivado conteniendo la construcción promintron-iaaM-tms2 fueron cortadas desde las raíces a los 14, 21, 28, 35, 42 y 49 días después de infección. El cuadro B muestra un diagrama del peso promedio por planta (Mnod (mg) pp) ; se indica el error estándar. Cada punto representa el peso promedio de los nodulos de las raíces por planta y sus resultados de cuando menos 200 nodulos detectados. El cuadro A muestra la dependencia de las líneas obtenidas. Figura 11. Secciones delgadas (teñidas con azul de toluidina) de nodulos de raíces de cinco semanas de edad generados por la cepa R. 1 . viciae tipo silvestre RPR1105 (cuadros 1 y 2) , mediante la construcción promintron-iaaM-tms2 (cuadros 3 y 4) o por la construcción 86AGUS (cuadro 5) . Los cuadros 2 y 4 son amplificación del meristemo del nodulo de los dos nodulos que se muestran en 1 y 3, respectivamente. Está ausente la actividad meristemática en el cuadro 5, está presente en la punta del nodulo en el cuadro 1 y 2, y es extremadamente activa y amplificada en ambos lados en el cuadro 3 y 4, donde las pequeñas células divisoras están presentes en el sombrerete del nodulo con una zona grande de células recién infectadas con bacterias (teñidas en claro) . Los materiales y métodos utilizados se representan en lo siguiente : Construcción de plásmidos recombinantes Se utilizaron las técnicas normales para la construcción de los plásmidos de DNA recombinante. Las construcciones 86AGUS, 85-17GUS y ?GUS fueron subclonadas en ambas orientaciones como fragmentos EcoRI en el vector plásmido pG, un derivado de pMB393 (Gage, D. J. , Bobo, T. y Long, S. R. (1996) , ibidem) obtenido por deleción de un fragmento EcoRI de 750 pb de largo, y luego introducido por electroporación en Rhizobium leguminosarum biovar viciae, cepa LPR1105, un derivado resistente a rifampicina de RCR1001 (Hooykas P. J. J. y col. (1977) J. Gen. Microbiol., 98, 477-484) . La construcción pG-promintron-iaaM-t.rn.s2, que comprende el promintron rolA impulsando los genes iaaM y tms2 está descrita en el Ejemplo 3.

Condiciones de crecimiento y ensayo de GUS Células de Rhizobium 1 . b. viciae albergando las diferentes construcciones fueron crecidas en medio TYR a 30°C. Se determinaron las curas de crecimiento midiendo la DO600. Las bacterias, recolectadas por centrifugación, fueron resuspendidas en buffer de fosfatos Na 50 mM (pH 7.0), ß-mercaptoetanol 10 mM, Na2EDTA 10 mM, lauril sarcosina de sodio 0.1%, 0.1% de Tritón X-100, sonificadas durante 5 minutos dos veces y centrifugadas a, 16000 x g durante 10 minutos a 4°C. La actividad GUS fue ensayada utilizando el sobrenadante. Los ensayos GUS fluorimétricos fueron realizados como se describe por Jefferson (Jefferson, R. (1987) Plant Mol. Biol. Report, 5, 387-405). La concentración de la proteína en extractos bacterianos se determinó utilizando el reactivo de Bradford (BIORAD) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Rhizobia albergando las diferentes construcciones fueron plaqueadas y seleccionadas en medio rico en TYR complementado con 100 µg/ml de estreptomicina, y replicadas en placas conteniendo 100 µg/ml de rifampicina. Las cepas que iban a ser inoculadas en plantas fueron crecidas hasta la fase estacionaria, centrifugadas 5 minutos a 12000 g, lavadas en buffer PBS pH 7.4 y resuspendidas en el mismo buffer. Se midió la densidad óptica (DO) a 600 nm y las 105 células fueron aplicadas en cada plántula e incubadas durante una hora. Las semillas de Vicia hirsuta fueron esterilizadas en su superficie en peróxido de hidrógeno al 5% durante 30 minutos y luego lavadas extensamente con agua bidestilada estéril. Las semillas se dejaron hinchar durante la noche a 4°C y luego se germinaron sobre placas con 1.5% de agar durante tres días en la oscuridad. Después de la infección, las plántulas germinadas fueron crecidas en sacos para germinación de semillas (MEGA International Minneapolis, USA) conteniendo 10 mi de medio Jensen (Vincent, J. M. (1970) I. B. P. Handbook No. 15, Oxford, Blackwell Scientific publications) . Las plantas fueron crecidas en 70% de humedad, un periodo de luz/oscuridad 16/8 a 17 ó 22°C.

Tinción GUS in situ Las raíces de plantas noduladas fueron cortadas e incubadas a 37°C durante la noche en una mezcla de reactivo X-Gluc (X-glucurónido 1 mM, NaP0 0.1 mM, EDTA 10 mM, pH 7.0, ferrocianuro de potasio 0.5 mM, pH 7.0, ferrocianuro de potasio 0.5 mM, pH 7.0, 0.1% de Tritón X-100) luego fueron fijadas en paraformaldehído al 4% en buffer PBS (protocolos GUS de Gallagher S. G., 1992, Academic Press, Inc.). Las raíces fueron luego deshidratadas en concentraciones crecientes de etanol absoluto y clarificadas por inmersión en una mezcla 2:1 de benzoato de bencilo-alcohol bencílico (Sigma) . Para la tinción del almidón, todos los nodulos fueron sumergidos durante 20 segundos en una solución acuosa de yoduro de potasio 0.1M. Los nodulos completos fueron fotografiados con un microscopio Nikon en campo brillante y óptica de epipolarización. Se realizaron los ensayos de reducción de acetileno (ARA) cortando las raíces noduladas (4 raíces por tubo de 15 mi) e inyectando 1 mi de acetileno durante cuando menos una hora a temperatura ambiente. Se obtuvieron los picos de acetileno y etileno inyectando un mililitro de cada tubo en un cromatógrafo de gases Perkin Elmer Sigma 3B equipado con una columna Porapak Q, equipado con un registrador Perkin Elmer 561.

Ejemplo 1: El intrón enpalmeosomal (spliceosomal) del gen rolA de Agrobacterium rhizogenes es un promotor activo en Rhizobia . La secuencia de DNA, en adelante denominada promintron, que abarca el intrón rolA (que es de 85 pb de largo y va desde la posición -1 hasta la posición -86, siendo +1 la A del codón de iniciación ATG del gen rol A) puede impulsar la expresión procariótica en Rhizobia . Una construcción de gen reportero (86AGUS; Figura 1) fue construido fusionando la región codificadora del gen uidA (Jefferson, 1987, ibidem) a un fragmento qu contenía la secuencia de DNA que codifica para los 40 aminoácidos NH2 terminales de la proteína rolA precedida por el promintron (es decir, las 85 pb del promintron rolA (SEQ ID NO: 1) más la A que precede inmediatamente el codón de inicio ATG de la región codificadora rolA) . Se detectó la actividad GUS por ensayos fluorimétricos en extractos de Rhizobium leguminosarum biovar viciae (R . 1 . viciae) que alberga la construcción 86AGUS (Figura 2) . Un patrón de expresión similar (no se muestran los datos) ha sido obtenido utilizando la construcción 85-17GUS que comprende el promitron de la SEQ ID NO: 1 y un ligador de 17 pb (SEQ ID NO: 2) y la región codificadora uidA (Figura 1) . La construcción ?GUS que consiste en la región codificadora uidA en sí misma (Figura 1) no dio actividad GUS en Rhizobia albergando tal construcción (no se muestran los datos). R. 1 . viciae cepa LPR 1105 que alberga cualquiera de las tres construcciones fueron crecidas en extracto Trypton-levadura [sic] (medio rico) hasta la fase estacionaria a una densidad óptica de 1.8 a 600 nm, luego fueron diluidas 100 veces en el mismo medio. Se tomaron las muestras en la fase de crecimiento exponencial temprana, media y tardía y luego en la fase de crecimiento estacionaria temprana y tardía, la actividad GUS fue detectada solo en extractos de proteínas de R. 1 . viciae albergando las construcciones 86AGUS (Figura 2) o la 85-17GUS (no se muestran los datos) mientras que ?GUS mostró niveles no detectables de actividad ß-glucuronidasa, como Rhizobia no transformada. Los datos obtenidos muestran que, e Rhizobia que alberga el 86AGUS (o las construcciones 85-17GUS) , la actividad ß-glucuronidasa declina durante la fase de crecimiento exponencial y aumenta en la fase de crecimiento estacionaria temprana y llega al valor más alto en la fase de crecimiento estacionaria tardía (Figura 2) . Se repitió el mismo experimento diluyendo 100 veces el cultivo estacionario crecido en medio rico en un medio mínimo definido conteniendo una concentración de manitol, que se utilizó como la fuente de carbono, limitante para el crecimiento. Después de la dilución, se observó un largo periodo de retardo del crecimiento seguido por una fase de crecimiento exponencial y por una fase de crecimiento estacionaria alcanzada a una densidad óptica de 0.6. Esta D. O. reducida fue causada por la condición del límite de carbono que se aplicó. Los promotores de las bacterias entéricas reguladas por el factor sigma estacionario sigma S se activan específicamente bajo estas condiciones. La secuencia promintron alberga una secuencia consenso tipo sigma S (Figura 8) . La actividad GUS en Rhizobia que alberga la construcción 86AGUS se mejoró durante la fase de crecimiento estacionaria y los valores obtenidos fueron dos veces mayores que los medidos en la fase de crecimiento estacionaria obtenidos en medio rico como una consecuencia de la privación del carbono. Así pues, la expresión génica impulsada por la secuencia promintron está correlacionada de manera inversa a la tasa de crecimiento y se induce al principio de la fase de crecimiento estacionaria. Se ha encontrado un patrón de expresión idéntico que utiliza la construcción 85-17GUS donde la secuencia promintron se separa del gen uidA por un poliligador de 17 pares de bases que se muestra en la SEQ ID NO: 2. Así pues, el promintron de 85 pb de largo tiene una función promotora en Rhizobia . Los cuadros claros representan la DO a 600 nm; los cuadros oscuros representan la actividad de GUS.

Ejemplo 2: El promintron impulsa la expresión génica dentro de los nodulos con un patrón de expresión novedoso e inesperado. Rhizobium leguminosarum biovar viciae, cepa LPR 1105 que alberga la construcción 86AGUS o la 85-17GUS o la ?GUS, se utiliza para infectar las plantas Vicia hirsuta . Las plántulas fueron crecidas bajo condiciones de invernadero hasta 60 días después de la plantación, y en tiempos diferentes se cortaron las raíces en paraformaldehído amortiguado y se tiñeron para su actividad GUS in situ (Jefferson, 1987, ibidem) , después de incubación durante la noche en la solución amortiguadora adecuada, las raíces fueron deshidratadas sumergiéndolas en soluciones de etanol en incrementos seguidos por clarificación en tolueno y fueron observadas bajo microscopía de óptica de campo brillante. Los fragmentos de DNA que contenían la secuencia de DNA promintron mostrada en la SEQ ID NO: 1 promueve la expresión en los nodulos dentro de Rhizobia simbiótica con un patrón de expresión característico y novedoso originando una expresión constitutiva del gen de interés. Por expresión constitutiva se entiende que la expresión, aunque regulada en un patrón específico, toda toma lugar en todas las zonas de los nodulos donde las células vegetales contienen bacteroides. Este patrón de expresión es muy diferente del que se muestra por los promotores regulados sigma 54 ó tipo sigma 70, para una comparación véase Sharma S. B. y E. R. Signer (1990) Gene Dev. , 4, 344-356. Cuando las bacterias Rhizobium, entran en la planta hospedera son denominadas bacteroides. Se sabe que los bacteroides sufren 5 formas de diferenciación con la edad progresiva desde la etapa 1 a la 5. Las diferentes etapas están descritas en Vasse, J. y col. (1990) J. Bacteriol., 172, pp. 4295-4306. En un nodulo indeterminado como los de Vicia hirsuta, los bacteroides más jóvenes están ubicados en la zona de infección II temprana, cerca del meristemo apical (que representa la zona I) que crece más de la raíz, donde las bacterias son recién liberadas de la infección, las hebras que cruzan primero los pelos de la raíz y luego las capas corticales para llegar finalmente al nodulo en crecimiento. Bacteroides mucho más viejos están ubicados en la zona de infección II tardía, luego en la zona de fijación de nitrógeno III y por último en la zona senescente IV solo están presentes membranas fantasma de bacteroides. La expresión impulsada por el promintron se observó en las zonas II, III y IV del nodulo en cualquier edad incluida la zona senescente muy vieja en la región más próxima a la raíz (véase la Figura 3) . Así pues, todas las células vegetales que albergan bacteroides en cualquier etapa tienen actividad ß-glucuronidasa dentro de sus bacteroides. Las imágenes se toman de los nodulos infectados por Rhizobia que contienen la construcción 86AGUS. Un patrón de expresión idéntico se ha obtenido utilizando la construcción 85-17GUS que solo da una señal ligeramente más débil. No se ha observado ninguna tinción con Rhizobia albergando la construcción ?GUS. En la Figura 3, cuadro I, se presenta una tinción doble para la actividad GUS (azul) y para almidón (café oscuro) . En nodulos más viejos ocurre el depósito de almidón en las zonas II y IV, pero ésta se utiliza principalmente debido a que su tinción describe la interzona II-III (véase la flecha en la Figura 3, cuadro I) . La tinción GUS está por encima y por debajo de la interzona II-III.

Ejemplo 3: Construcción del plásmido pG-promintron-iaaM-tms2 Se obtuvo el plásmido recombinante pH-promintron-iaaM-tms2 ligando el fragmento EcoRI-Kpnl que comprende la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2, abarcando la secuencia promintron rolA, dentro del plásmido pG (véase materiales y métodos) cortado con EcoRI-Kpnl. Después el plásmido pG-promintron fue cortado con Kpnl-HindIII y las secuencias codificadoras iaaM y tms2 fueron introducidas como fragmentos Kpnl-Sphl y Sphl-HindIII, respectivamente. El fragmento Kpnl-Sphl de 1775 pb (2+53+1671+49) abarca la región codificadora del gen iaaM de Pseudomonas syringae subespecie savastanoi . La secuencia iaaM ha sido caracterizada por Yamada y col. (1985, ibidem) y la secuencia que se utiliza contiene 1773 pb (53+1671+49) del sitio Dral ubicado 53 pb antes del codón de inicio ATG hasta el sitio Sphl 46 pb después del codón de interrupción o antisentido TAA. El fragmento Sphl-HindIII de 1752 (22+13+1403+14) pb abarcando la región codificadora tms2 de Agrobacterium tumefaciens pTi A6 (Klee, H. y col. (1984) P. N. A. S. USA 81, pp. 1728-1732) contiene 1403 pb de la región codificadora precedida por 14 pb y seguida por 5 pb pertenecientes ala región no traducida del gen tms2. En consecuencia, el plásmido pG-promintron-iaaM-tins2 obtenido posee las siguientes características estructurales: — un fragmento promintron contiene las 85 pb del promintron rolA (SEQ ID NO: 1), más 17 pb de la secuencia ligadora (SEQ ID NO: 2) y tiene un adaptador Eco Rl (secuencia GAATTC) en su extremo 5' ; — 6 pb como el sitio Kpnl (secuencia GGTACC) más dos bases adicionales añadidas como ligador; — 53 pb de la secuencia 5' no traducida del gen iaaM de Pseudomonas syringae subespecie savastanoi ; — 1671 pb de la región codificadora del gen iaaM de Pseudomonas syringae subespecie savastanoi ; — 49 pb (46+3 pb del codón antisentido) de la secuencia posterior o cola 3' no traducida del gen iaaM de Pseudomonas syringae subespecie savastanoi finalizando con el sitio SpHI; — 22 pb consistiendo en una secuencia poliligadora (CTGCAGGTCGACTCTAGAGGAT, SEQ ID NO: 3) ; — 13 pb de la región líder no traducida del gen tms2 (CCAACTCAGAGAG, SEQ ID NO: 4); — 1403 pb abarcando la región codificadora del gen tms2 de Agrobacterium tumefaciens pTiA6; — 14 pb en el extremo 3' incluyendo un sitio Hindi (secuencia TAAACATCAAGCTT, SEQ ID NO: 5) siendo TAA el codón antisentido, la secuencia AC en el extremo 3' de la región codificadora tms2 después del codón antisentido, y el resto siendo la secuencia ligadora Hindi (el sitio Hindi siendo AAGCTT) .

Ejemplo 4: La construcción promintron-iaaM-tJOs2 altera el número, ubicación y tamaño de los nodulos de la raíz. Las plántulas Vicia hirsuta fueron cosechadas a los 18 días después de infección con la construcción 86AGUS o la construcción promintron-iaaM-tms2. En el caso de las plantas infectadas con Rhizobia albergando la construcción 86AGUS, un número promedio de 22 nodulos por planta fue observado mientras que este número disminuyó a 7.5 nodulos por planta en el caso de plantas infectadas con Rhizobia albergando la construcción promintron-iaaM- tms2. Considerando las plantas infectadas 86AGUS control como 100%, la presencia del operón bicistrónico en Rhizobia reduce el número de nodulos en 65%. Contrario a esta característica, el tamaño de los nodulos aumenta de manera considerable en plantas infectadas con Rhizobia albergando la construcción promintron-iaaM-tms2. En la Figura 4, cuadros B y C, es posible comparar el tamaño de los nodulos. No solo Rhizobia que contiene la construcción promintron-iaaM-tms2 induce nodulos que son más grandes de tamaño, pero en ocasiones nodulos también son bilobados (cuadro E) . Además, los nodulos de la raíz producidos por Rhizobia albergando la construcción promintron-iaaM-tms2 se ubica principalmente en la raíz principal (Figura 4, cuadro A izquierdo) y en raras ocasiones en las raíces secundarias como es el caso con las plantas inoculadas con Rhizobia albergando la construcción 86AGUS o no albergando ninguna construcción (Figura 4, cuadro A, derecha) . Por último, la Figura 4 (cuadro A, izquierda) muestra que los nodulos producidos por Rhizobia albergando la construcción promintron-iaaM-tms2 están concentrados en la región de la raíz cercana a la semilla, seguida por una gran zona de la raíz donde no se observaron nodulos. Este no fue el modelo de nodulación producido por Rhizobium tipo silvestre, el cual consistió en pequeños nodulos distribuidos de manera uniforme a todo lo largo de la raíz (Figura 4, cuadro A derecho, y cuadro D) .

Ejemplo 5: Los nodulos de la raíz inducidos por Rhizobia albergando la construcción promintron-iaaM-tms2 muestran un aumento en la actividad de reducción de acetileno (ARA) Las raíces noduladas infectadas con Rhizobium leguminosarum biovar viciae tipo silvestre, cepa LPR1105 o la misma cepa albergando la construcción 86AGUS o la construcción promintron-iaaM-tms2 fueron seguidas durante un mes después de infección y ensayadas para la capacidad de reducir acetileno a etileno. Este es el ensayo enzimático indirecto que se utiliza con mayor regularidad para evaluar la capacidad del complejo nitrogenasa para reducir el nitrógeno atmosférico a amoníaco. se han realizado ocho experimentos independientes utilizando hasta 50 plantas por punto en dos diferentes temperaturas (17°C y 22°C) . Los resultados muestran que la construcción promintron-iaaM-tms2 induce la formación (a 22 °C) de los nodulos de la raíz capaces de reducir acetileno a etileno con mayor eficiencia que los nodulos de raíz control generados por Rhizobia tipo silvestre o por Rhizobia albergando las construcciones 86AGUS o la 85-17GUS. Así pues, la presencia de la construcción promintron-iaaM-ti7¡s2 aumenta la capacidad de fijación de nitrógeno de los nodulos de las raíces. Se tomaron las muestras en los días 18, 27 y 31 después de la inoculación de las semillas germinadas con bacterias. Se siguió la actividad de la reducción de acetileno (ARA) en cromatografía de gases (véase Materiales y Métodos) y se expresó en unidades arbitrarias. En la Figura 6 el promedio del valor del control (cuando menos 50 plantas en cada caso) se toman como 100%. Cada columna indica el porcentaje de incremento en comparación con los controles de ARA provenientes de raíces noduladas con la construcción promintron-iaaM-tü2s2. En función del tiempo, el porcentaje de ARA aumenta de 30% a los 18 días, hasta 240% más que los controles a los 31 días.

Ejemplo 6: Crecimiento de las plantas y la biomasa Como se muestra en la Figura 5, plantas Vicia hirsuta de 35 días noduladas por Rhizobia conteniendo la construcción del promintron-íaaM-tiOs2 son más grandes de tamaño (más de 20% de aumento) . Además, estas plantas no solo son más grandes, sino también están alteradas en su fenotipo con hojas verde oscuras y un mejor vigor en comparación con las plantas hermanas inoculadas con R. 1 . viciae tipo silvestre. En la Figura 7 se listan los pesos ecos de las plantas de 18, 27 y 31 días. El peso seco de las plantas control se considera 100% en cualquier edad y se indica como cero. Se puede observar un aumento importante (es decir, 24%) en el peso seco promedio de las plantas noduladas con Rhizobia conteniendo la construcción promintron-íaaM-tms2 a los 18 días, cuando la influencia en el crecimiento de la planta de las proteínas de almacenamiento de la semilla es todavía importante. Por el contrario, las plantas de 27 y 31 días, cuando el nitrógeno contenido en las semillas está principalmente agotado, muestran un 35% y 44%, respectivamente, de aumento en el peso seco de las plantas noduladas con Rhizobia albergando la construcción promintron-?aaM-iiOs2 en comparación con el peso seco de las plantas noduladas por la cepa tipo silvestre de Rhizobia o de R. 1. viciae conteniendo las construcciones 86AGUS o la 85-17GUS.

Ejemplo 7: Mediciones de la reducción de acetileno Se realizaron ensayos de la reducción de acetileno para comparar los nodulos de raíz generados en Vicia hirsuta por Rhizobium leguminosarum biovar viciae tipo silvestre cepa RPR1105 o de su derivado conteniendo la construcción promintron- iaaMtms2. Hasta 23 días después de la infección, las dos cepas reducen la misma cantidad de acetileno a una velocidad similar. Cinco semanas después de la infección se interrumpe la actividad meristemática en los nodulos control mientras que todavía se generan células recién infectadas después de 8 días en nodulos inoculados con bacterias conteniendo la construcción promintron-iaaMtms2. A los 39 días después de la infección, la reducción de acetileno alcanza un 100% de aumento cuando la construcción de promintron-iaaMtms2 se compara con la cepa tipo silvestre.

Ejemplo 8: Aumento del peso seco del tallo Se realizó un análisis del peso seco del tallo de Vicia hirsuta para comparar las plantas Vicia hirsuta noduladas por Rhizobium leguminosarum biovar viciae tipo silvestre cepa RPR1105 con su derivado conteniendo la construcción promintron-iaaMtms2. La biomasa de las plantas fue prácticamente no afectada hasta los 23 días después de la infección. No obstante, un aumento de 15% a los 51 días después de la infección se observó cuando se comparó la construcción promintron-iaaMt.ms2 con la cepa tipo silvestre.

Ejemplo 9: Análisis del contenido de nitrógeno total El análisis del peso seco del tallo de Vicia hirsuta fue seguido por el análisis del contenido de nitrógeno total mineralizado. El contenido de nitrógeno total, como N elemental, fue medido de acuerdo con el método de Dumas (Simonne, y col., J. Sci. Food Agrie. 73, 39-45) utilizando un analizador de nitrógeno Macro-N (Foss Heraeus Analysensysteme, Hanau Alemania) . La concentración de nitrógeno total no se afectó hasta los 51 días después de infección en plantas Vicia hirsuta noduladas con Rhizobium leguminosarum biovar viciae tipo silvestre cepa RPR1105, y con su derivado conteniendo la construcción promintron-iaaMtms2.

Ejemplo 10: Análisis del peso de los nodulos de la raíz Se realizó un análisis del peso de los nodulos de la raíz para comparar las plantas noduladas por Rhizobium leguminosarum biovar viciae tipo silvestre cepa RPR1105, con su derivado conteniendo la construcción promintron-iaaMtiOs2. La Figura 9 muestra nodulos de raíces de 29, 36, 43 y 50 días (cuadros 1, 5; 2, 6; 3, 7; 4, 8; respectivamente) generados en plántulas de Vicia hirsuta por la cepa tipo silvestre R. 1 . viciae 1004 (cuadros 1-4) o por la construcción promintron-i<3aMtms2 (cuadros 5-8) . La masa total de los nodulos no se afectó hasta cuatro semanas después de la infección con ambas cepas. Esta alcanzó un aumento doble 42 días después de la infección cuando se comparó la construcción promintron-iaaMtiHs2 con la cepa tipo silvestre. La Figura 10B muestra un diagrama para comparar los datos del peso de los nodulos hasta el día 49 después de la infección entre las dos cepas. El cuadro de la Figura 10A muestra que la pendiente de la línea de interpolación es 0.26 para el Rhizobium leguminosarum biovar viciae tipo silvestre cepa RPR1105, mientras que el valor de la pendiente de 0.46 se obtuvo cuando se utilizó la construcción promintron- íaaMtms2.

Ejemplo 11: Análisis de la actividad meristemática Se realizó un análisis de secciones delgadas teñidas con azul de toluidina al 0.02% de nodulos de raíces de cinco semanas para comparar las plantas noduladas por el Rhizobium leguminosarum biovar viciae tipo silvestre cepa RPR1105 con su derivado conteniendo la construcción promintron-iaaM-tins2 o la construcción 86GAUS. La Figura 11 muestra que la actividad meristemática y las células recién infectadas están ausentes en los nodulos generados por las bacterias conteniendo 86AGUS. No obstante, éstas están presentes pero limitadas al mero ápice de la raíz cuando se utilizó la cepa RPR1105 tipo silvestre; mientras que la actividad meristemática todavía es muy activa con múltiples células en división (pequeñas) presentes en el capacete del nodulo, con múltiples células recién infectadas (teñidas en claro) cuando se utilizó la construcción promintron-iaaM-tms2. Por tanto, es evidente que, a la misma edad, tanto el tamaño como la forma de los nodulos generados en las tres muestras son estadísticamente diferentes.

Ejemplo 12: Mediciones de la reducción de acetileno en frijol francés Se realizaron los ensayos de reducción de acetileno para comparar las plantas de frijol francés nodulada por la cepa tipo silvestre CE3 de Rhizobium etli o su derivado conteniendo la construcción promintron-iaaM-t2Os . contrario al tipo de nodulo indeterminado de Vicia hirsuta, el frijol francés produce un tipo de nodulo determinado, a saber, un nodulo carente de un meristemo persistente, similar a los generados en raíces de soya. A los 23 días después de la infección, las tasas de reducción de acetileno son idénticas independientemente de la cepa utilizada para la infección de la raíz. A los 43 días después de la infección, las plantas de frijol francés inoculadas con bacterias conteniendo la construcción promintron-iaaM-fcms2 muestran un aumento del 100% en comparación con R. etli CE3 tipo silvestre.

Ejemplo 13: Aumento del peso seco del tallo en frijol francés Se realizó el análisis del peso seco del tallo del frijol francés para comparar plantas noduladas por la cepa CE3 tipo silvestre de Rhizobium etli, o por su derivado conteniendo la construcción promintron-iaaMtms2. El peso seco del* tallo es idéntico hasta el día 23 después de la infección independientemente de la cepa utilizada, aunque en el día 48 el peso seco del tallo de las plantas noduladas por la cepa CE3 conteniendo la construcción promintron-iaaMtms2 aumentó en 15% en comparación con las plantas de frijol francés de 48 días infectadas con la cepa tipo silvestre de R . etli CE3.

Ejemplo 14: Análisis del peso del nodulo de la raíz en frijol francés Se realizó el análisis del peso de los nodulos del frijol francés para comparar las plantas noduladas por la cepa CE3 tipo silvestre de Rhizobium etli o por su derivado conteniendo la construcción promintron-iaaMtms2. El peso de los nodulos es idéntico hasta el día 23 después de la infección, independientemente de la cepa que se utilice, aunque en el día 48 la masa de los nodulos de las plantas noduladas por la cepa CE3 que contiene la construcción promintron-iaaM-tJ2is2 aumentó en 50% en comparación con las plantas de frijol francés de 48 días infectadas con la cepa tipo silvestre de R. etli CE3.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> G. IN. E. ST. R. A. s. c. ar. 1. Consiglio Nazionale delle Ricerche Spena, Angelo Defez, Roberto <120> MÉTODO PARA CONTROLAR LA EXPRESIÓN GÉNICA EN BACTERIAS, POR DECIR RHIZOBIACEAE, PARA MEJORAR EL DESARROLLO DE LOS NODULOS DE LA RAÍZ, LA FIJACIÓN DE NITRÓGENO Y PRODUCCIÓN DE LA BIOMASA EN PLANTAS <130> PCT <140> <141> <160> 5 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 85 <212> DNA <213> Agrobacterium rhizogenes <400> 1 gtgagtgtgg ttgtaggttc aattattact atttttgaag ctgtgtattt ccctttttct 60 aatatgcacc tatttcatgt ttcag 85 <210> 2 <211> 17 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia ligadora <400> 2 gggtaggtca gtccctt 17 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia ligadora <400> 3 ctgcaggtcg actctagagg at 22 <210> 4 <211> 13 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial : secuencia ligadora <400> 4 ccaactcaga gag 13 <210> 5 <211> 14 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia ligadora <400> 5 taaacatcaa gctt 14

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES El uso de la secuencia promintron del gen rolA de Agrobacterium rhizogenes como en la SEQ ID NO: 1, o de las secuencias de DNA que comprenden la secuencia promintron, o del homólogo funcional o porción de éste, para inducir la expresión de una secuencia codificadora de DNA, en bacterias recombinantes durante la fase de crecimiento exponencial, post-exponencial y estacionaria, y en bacteroides dentro de nodulos de raíz, la secuencia de DNA codificante estando bajo el control de la secuencia promintron. El uso de la secuencia promintron de acuerdo con la reivindicación 1, en donde las bacterias recombinantes pertenecen a las familias Enterobacter iaceae o Rhizobiaceae . El uso de la secuencia promintron de acuerdo con la reivindicación 2, en donde las bacterias recombinantes pertenecientes a las familias Enterobacter iaceae o Rhizobiaceae son E. coli, Rhizobia o Agrobacteria . El uso de la secuencia promintron de acuerdo con la reivindicación 3, en donde las bacterias recombinantes son del género Rhizobia, dentro de nodulos de raíces simbióticas o en estado de vida libre. El uso de la secuencia promintron de acuerdo con la reivindicación 4, en donde las bacterias recombinantes del género Rhizobia dentro del nodulo de la raíz simbiótica son bacteroides de etapa I, II, III, IV, V o Rhizobia presentes en el espacio apoplástico, o Rhizobia presentes en la zona de senescencia, o Rhizobia presentes en la zona de fijación de nitrógeno, o Rhizobia presentes en la zona de invasión. Una molécula de DNA recombinante que comprende la secuencia promintron de acuerdo con la reivindicación 1, o el homólogo funcional o porción de ésta, y ligada en forma covalente al extremo 3' de la secuencia promintron, una secuencia codificadora de DNA, la molécula de DNA recombinante estando albergada por los elementos episomales o integrada en el genoma bacteriano. La molécula de DNA recombinante de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la secuencia codificadora del DNA es una unidad de transcripción monocistrónica o policistrónica . La molécula de DNA recombinante de acuerdo con la reivindicación 6 ó 7, en donde la secuencia codificadora del DNA codifica una proteína involucrada en la síntesis y/o metabolismo de hormonas vegetales. La molécula de DNA recombinante de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la secuencia codificadora de DNA codifica una proteína involucrada en la síntesis y/o metabolismo de la hormona vegetal auxina. 10. La molécula de DNA recombinante de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la secuencia codificadora de DNA codifica una proteína involucrada en la síntesis y/o metabolismo de la auxina IAA o de la auxina indoletanol. 11. La molécula de DNA recombinante de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la secuencia codificadora de DNA codifica la proteína iaaM de P. syringae subespecie savastanoi o un homólogo de ésta. 12. La molécula de DNA recombinante de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la secuencia codificadora de DNA codifica la proteína tms2 de A. tumefaciens o un homólogo de ésta. 13. La molécula de DNA recombinante de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la secuencia codificadora del DNA codifica las regiones codificadoras iaaM y tms2 de la reivindicación 11 y 12, respectivamente. 14. La molécula de DNA recombinante de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la secuencia codificadora del DNA codifica la indolpiruvato descarboxilasa de Enterobacter cloacae o un homólogo de ésta. 15. Bacterias genéticamente manipuladas que comprenden la molécula de DNA recombinante de acuerdo con las reivindicaciones de las 6 a la 14. 16. El uso de la molécula de DNA recombinante de acuerdo con las reivindicaciones de la 6 a la 14 para aumentar de manera importante el tamaño de los nodulos de una planta. 17. El uso de la molécula de DNA recombinante de acuerdo con la reivindicación 16, en donde el aumento estadísticamente significativo del tamaño de los nodulos es de cuando menos 20%. 18. El uso de la molécula de DNA recombinante de acuerdo con las reivindicaciones de la 6 a la 14 para aumentar de manera significativa la capacidad para fijar nitrógeno de una planta nodulada. 19. El uso de la molécula de DNA recombinante de acuerdo con la reivindicación 18, en donde el aumento estadísticamente significativo de la capacidad para fijar nitrógeno es de cuando menos 20%. 20. El uso de la molécula de DNA recombinante de acuerdo con las reivindicaciones de la 6 a la 14 para aumentar significativamente la producción de biomasa vegetal. 21. El uso de la molécula de DNA recombinante de acuerdo con la reivindicación 20, en donde el aumento estadísticamente significativo de la producción de biomasa vegetal es de cuando menos 10%. 22. Planta leguminosa infectada por bacterias albergando la molécula de DNA recombinante de acuerdo con las reivindicaciones de la 6 a la 14 y con un aumento importante en el tamaño de los nodulos, y/o de la capacidad de los nodulos para fijar nitrógeno, y/o de la biomasa de las plantas, y/o de la capacidad para fijar nitrógeno.