MXPA00012473A

MXPA00012473A - Particulas de proteinas de envoltura de vhc y su uso para vacunacion

Info

Publication number: MXPA00012473A
Application number: MXPA/A/2000/012473A
Authority: MX
Inventors: Geert Maertens; Erik Depla; Alfons Bosman; Wijnendaele Frans Van
Original assignee: Innogenetics Nv
Priority date: 1998-06-24
Filing date: 2000-12-14
Publication date: 2002-03-26

Abstract

La presente invención se refiere a descubrimiento de que las proteínas de envoltura del VHC inducen una respuesta inmune benéfica en los chimpancés infectados con VHC crónicamente. La inmunización se puede llevar a cabo preferentemente utilizando proteínas de envoltura de VHC en la forma de partículas las cuales son producidas de una manera auxiliada por el detergente. Las proteínas de envoltura cuando son presentadas como tales a los portadores de VHC crónicos, son altamente inmunogénicas y estimulan las respuestas inmune tanto celular como humoral.

Description

PARTÍCULAS DE PROTEÍNAS DE ENVOLTURA DE VHC Y SU USO PARA VACUNACIÓN CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención está basada en el descubrimiento de que las proteínas de envoltura del VHC inducen una respuesta inmune benéfica en los chimpancés los cuales están infectados crónicamente con un subtipo la o subtipo Ib heterólogo de la cepa de VHC. Más específicamente, la presente invención se refiere al descubrimiento de que las proteínas de envoltura son altamente inmunogénicas y conducen a la estimulación de la respuesta inmune tanto celular como humoral. Además, la presente invención se refiere al descubrimiento de que bloqueando las cisteínas por alquilación conduce a proteínas aún más inmunogénicas. Además, las proteínas de envoltura de la presente invención pueden ser incorporadas en partículas las cuales exhiben una inmunogenicidad e inmunorreactividad elevadas. Se demostró además que tales partículas pueden incorporar otras proteínas.

Rßf.125740 ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La infección provocada por el virus de la hepatitis C (VHC) es un problema mayor de salud en los países tanto desarrollados como en desarrollo. Se estima que aproximadamente 1 a 5 % de la población mundial está afectada por el virus. La infección por el VHC parece que va a ser la causa más importante de la hepatitis asociada con la transfusión y frecuentemente progresa hasta el daño crónico del hígado. Además, existe evidencia que implica al VHC en la inducción del carcinoma hepatocelular. En consecuencia, la demanda de métodos de diagnóstico confiables y agentes terapéuticos efectivos es elevada. También son necesarios métodos de selección sensible y específica de los productos de la sangre contaminados con VHC y métodos mejorados para cultivar el VHC. El VHC es un virus de ARN de hebra positiva de aproximadamente 9, 600 pares base el cual codifica al menos tres proteínas estructurales y seis proteínas no estructurales. Con base en la homología de la secuencia, las proteínas estructurales han sido asignadas funcionalmente como una proteína de un solo núcleo y dos proteínas de envoltura: El y E2. La proteína El consiste de 192 aminoácidos y contiene 5 a 6 sitios de N-glicosilación, dependiendo del genotipo del VHC. La proteína E2 consiste de 363 a 370 aminoácidos y contiene 9-11 sitios de N-glicosilación, dependiendo del genotipo del VHC (para revisiones véase: Major y Feinstone, 1997; Maertens y Stuyver, 1997). La proteína El contiene varios dominios variables (Maesterns y Stuyver, 1997), mientras que la proteína E2 contiene tres dominios hipervariables, de los cuales el dominio principal está localizado en el extremo o terminal N de la proteína (Maertens y Stuyver, 1997). Estas últimas proteínas de envoltura han sido producidas por las técnicas recombinantes en Escherichia coli, las células de insectos, las células de levadura y las células de mamíferos. El uso de un sistema de expresión en los eucariotas más elevados y especialmente en el cultivo de las células de mamífero conduce a proteínas de envoltura que son reconocidas de manera efectiva por los anticuerpos en las muestras de los pacientes (Maertens y colaboradores, 1994) . Se ha sugerido que la proteína de envoltura El necesita la proteína de envoltura E2 para alcanzar un estado de pliegue o doblez apropiado (Deleersnyder y colaboradores, 1997) . Además, se ha sugerido que El y E2 forman heterodímeros los cuales pueden formar la unidad básica de la envoltura viral (Yi y colaboradores, 1997) . En WO 98/21338 de Liang y colaboradores, estos suposiciones han sido utilizadas para construir las partículas de VHC, las cuales consisten de El y E2, así como del Núcleo y P7. En otras palabras, el uso de El y E2 separadamente para la inmunización y otros propósitos no es sugerida en la técnica previa. Pero, Houghton (1997) reportó que las inmunizaciones repetidas con gpElE2 recombinantes (4 x 25 µg) de 3 chimpancés infectados con VHC crónicamente no indujeron una respuesta inmune significativa. Los inventores de la presente solicitud dedujeron que la inducción de una respuesta inmune antienvoltura en los pacientes con la hepatitis crónica C podría realmente ser deseable y benéfica para el paciente, puesto que los niveles más elevados de tales anticuerpos parece que se correlacionan con una buena respuesta a la terapia de las interferonas, y por lo tanto pueden ayudar al paciente a borrar o despejar el virus (PCT/EP 95/03031 de Maerterns y colaboradores) . Los inventores de la presente invención dedujeron que, cuando los niveles de los anticuerpos contra el El en los portadores de VHC crónicos están en los niveles más bajos de la totalidad de los anticuerpos de VHC, puede ser benéfico elevar estos niveles de los anticuerpos, y posiblemente la respuesta celular, para inducir el control o aún el retiro o despeje de la infección por el huésped. También, los niveles más elevados de la inmunidad celular contra El parece que se correlacionan con una buena respuesta hacia la terapia de las interferonas (Leroux-Roels y colaboradores, 1996) . Además de la importancia de la inmunidad anti-El con relación a la terapia de interferonas, otras indicaciones puntualizan que algunas otras partes del genoma de VHC pueden ser importantes para inducir una respuesta inmune específica la cual puede permitir el control de la infección. También la reactividad de la célula T contra la región de la terminal C de la proteína central ha sido observada más frecuentemente en los pacientes que responden a la terapia de las interferonas (Leroux-Roels y colaboradores, 1996) . Los anticuerpos potencialmente neutralizadores contra la proteína de NS4B fueron demostrados en pacientes que retiran o eliminan el VHC después del trasplante del hígado (Villa y colaboradores, 1998) . También dentro de NS3 varios epítopes de las célula T han sido mapeados o se les han asignado coordenadas, los cuales parece que se correlacionan con la eliminación o retiro del VHC durante la fase aguda (véase: PCT/EP 94/03555 de Leroux-Roels y colaboradores; Leroux-Roels y colaboradores, 1996; Rehermann y colaboradores, 1996 y 1997; Diepolder y colaboradores, 1995 y 1997). Además, los anticuerpos para NS5A, semejantes a los anticuerpos de El, muestran niveles más elevados en la línea base antes de la terapia de interferona-alfa en los respondedores o retransmisores a largo plazo (LTR) cuando se comparó con los no respondedores. En el presente, la vacunación terapéutica contra el VHC no ha sido exitosa. También la vacunación profiláctica solamente ha mostrado que va a ser efectiva contra una cepa homologa de VHC (Choo y colaboradores, 1994) . La presente invención se refiere al descubrimiento sorprendente de que la administración de un antígeno de la envoltura de VHC puede mejorar dramáticamente el estado de la hepatitis activa crónica en un individuo infectado con una substancia aislada o cepa heteróloga, tanto en una infección provocada por el subtipo la heterólogo o el subtipo Ib heterólogo. Realmente, los chimpancés infectados crónicamente que fueron administrados con seis dosis de 50 µg de Els (es decir aa 192-326 de El) sorprendentemente mostraron respuestas inmunes celulares y humorales vigorosas, las cuales no han sido presentadas sobre el período completo de la infección crónica antes de la última vacunación. Además, el antígeno viral llego a ser indetectable en el hígado durante un período de dos a cinco meses y permaneció no detectable durante al menos 5 meses posvacunación. Aunque las concentraciones de VHC-ARN en el suero no se incrementaron, los niveles de enzima del hígado mostraron una tendencia clara a normalizarse. De manera más importante, la histología del hígado mejoró dramáticamente en ambos tipos de los vacunados. La presente invención se refiere además al descubrimiento sorprendente de que la proteína El utilizada para la vacunación, la cual se expresó como una proteína de VHC única sin su anclaje hidrofóbico, forma partículas estables. Se debe señalar que, para evitar la inducción de una respuesta inmune contra los epítopes no relevantes, la proteína El utilizada para la vacunación se construyó como una secuencia de consenso de los clones individuales derivados de una muestra de suero única desde un portador crónico. Además, la presente solicitud se refiere al descubrimiento de que la inducción de tales respuestas anti-El pueden ser incrementadas utilizando antígenos de un genotipo diferente que algunos de la infección presente en el huésped. Además, la presente solicitud se refiere al descubrimiento de que cuando las cisteínas de las proteínas de la envoltura de VHC son alquiladas, por ejemplo por medio de la N- (yodoetil) -trifluoroacetamida, la etilenimina o los halógenos activos, tales como la yodoacetamida, las partículas oligo éricas como se describieron anteriormente, exhiben una inmunogenicidad aún más elevada. Finalmente, la presente invención también se refiere al descubrimiento de que la mutación de las cisteínas de las proteínas de la envoltura de VHC a cualquier otro aminoácido que está presente de manera natural, preferentemente a la metionina, ácido glutámico o usina, en las partículas oligoméricas como se describió anteriormente, también conduce a una inmunogenicidad más elevada, comparado con las proteínas de envoltura originales.

OBJETOS DE LA INVENCIÓN Es claro de la literatura que existe una necesidad urgente de desarrollar vacunas confiables y agentes terapéuticos efectivos para el VHC. Por lo tanto, la presente invención tiene como objeto proporcionar una preparación de antígeno, la cual sea capaz de inducir la inmunidad humoral y celular específica para las proteínas de envoltura de VHC, aún (pero no solamente) en los portadores de VHC crónicos. Los mismos antígenos pueden ser utilizados para el diagnóstico de la respuesta inmune. Más específicamente, la presente invención tiene co o objeto proporcionar una preparación como la definida anteriormente, la cual consiste de partículas estables de proteínas de envoltura única del VHC. Debe ser claro que, en el presente, tales partículas o un método para preparar tales partículas, no es conocido en la técnica. Además, no existe indicación en la técnica de que cualquier preparación de antígeno, incluyendo tales partículas estables o tales proteínas de envoltura de VHC únicas, purificadas, podría ser utilizada exitosamente como una vacuna profiláctica o terapéutica (heteróloga) contra el VHC. Por consiguiente, la presente invención tiene como objeto proporcionar un método para producir partículas estables, el cual pueda ser utilizado exitosamente como un agente profiláctico o terapéutico contra el VHC, además de proporcionar vacunas de ADN que codifican los antígenos de VHC. Más específicamente, la presente invención tiene como objeto proporcionar un método para producir estas últimas partículas con base en la formación de partículas, auxiliado por un detergente (véase posteriormente) . Además, la presente invención tiene como objeto proporcionar métodos para preparar partículas que consisten de los antígenos obtenidos de diferentes genotipos de VHC. Además, la presente invención tiene como objeto proporcionar un antígeno el cual es una secuencia de consenso de los clones individuales, la cual puede permitir un pliegue o doblez más correcto de las proteínas. Esto para evitar la estimulación de la inmunidad contra los epítopes no relevantes. Además, la presente invención tiene como objeto proporcionar una formulación de antígeno, en particular para la vacunación terapéutica, con base en el genotipo del VHC por el cual el portador crónico es infectado. A este respecto, la presente invención tiene como objeto proporcionar una proteína de envoltura de un genotipo o subtipo ya sea homólogo o diferente, comparado con el genotipo o el subtipo del portador crónico. Un objeto adicional de la invención es proporcionar un método para el tratamiento o la vacunación terapéutica de los pacientes infectados crónicamente utilizando las vacunas de ADN o los antígenos indicados anteriormente, posiblemente en combinación con otros compuestos. La presente invención también tiene como objeto proporcionar un método para vacunar profilácticamente a los seres humanos contra el VHC. Otro objeto de la invención es proporcionar partículas oligoméricas las cuales tienen una inmunogenicidad superior, debido a la mutación de al menos un residuo de cisteína de la proteína de envoltura de VHC en un aminoácido que está presente de manera natural, preferentemente la metionina, el ácido glutámico, la glutamina o la lisina. Alternativamente, la alquilación de al menos un residuo de cisteína de la proteína de envoltura de VHC puede ser efectuada. En particular, esta última proteína puede ser alquilada por medio de la etilenimina, la N- (yodoetil) trifluoroacetamida o los halógenos activos. A este respecto la presente invención tiene como objeto proporcionar el uso adicional de las partículas oligoméricas como vehículos para presentar los epítopes diferentes de VHC eficientemente. Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar un método para tratar pacientes, infectados aguda o crónicamente, con un anticuerpo anti-envoltura, tal como el anticuerpo anti-El, por ejemplo el anticuerpo de la región V2 anti-El, ya sea solo o en combinación con otros tratamientos. Otro objeto de la invención es proporcionar un antígeno estimulante de la célula T tal como el Núcleo (Core), El, E2, P7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, o NS5B en compañía de las proteínas de envoltura de la invención. La totalidad de los objetos de la presente invención se considera que han sido satisfechos por las modalidades como se describirán posteriormente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS TABLAS Y LOS DIBUJOS La Tabla 1 proporciona las secuencias de los clones de El obtenidos de un solo portador crónico, la construcción de El utilizada para la producción de una vacuna es el consenso de la totalidad de estos clones individuales, V1-V5, las regiones variables 1 - 5; C4, el dominio 4 constante; la HR, la región hidrofóbica; el VHC-B con, la secuencia de consenso en las posiciones que son variables entre los clones y el VHC-J. La Tabla 2 proporciona las secuencias de la proteína El de la vacuna y la proteína El como se encontró en los chimpancés infectados Phil y Ton. El subtipo Ib aislado de Phil se diferenció en el 5.92% de la cepa de la vacuna. La diferencia entre la vacuna y el subtipo la aislado de Ton fue del 20.74%. La Tabla 3 proporciona una revisión esquemática de los cambios inducidos por la vacunación terapéutica en dos chimpancés infectados crónicamente (Ton y Phil) . El análisis se efectuó como se explicó en las Figuras 8 y 11. Además, la histología y la inflamación fueron evaluadas de las biopsias del hígado. La Tabla 4 proporciona las secuencias de los péptidos utilizadas para mapear o asignar coordenadas a los epítopes de la célula B. Nótese que HR se superpone con V4V5. La Tabla 5 muestra el rearreglo de NS3 para hacer una proteína más corta que lleva la totalidad de los epítopes mayores que se correlacionan con el espaciado viral . La Tabla 6 muestra la reactividad de LIA de Els-acetamida contra Els-maleimida con el suero de los portadores de VHC crónicos. Las proteínas fueron inmovilizadas sobre las membranas de LIA. La Els-acetamida se roció como tal sobre las tiras de LIA mientras que la Els-maleimida (que contiene también la biotina-maleimida) formó un complejo con la estreptavidina antes del rociado. Los antígenos fueron unidos a las membranas de LIA, y las tiras fueron procesadas esencialmente como se describió en Zrein y colaboradores (1998) . Los anticuerpos humanos dirigidos contra estos antígenos fueron visualizados utilizando una anti-IgG humana conjugada con la fosfatasa alcalina. Los NBT y BCIP fueron utilizados para el desarrollo del color de la tira. El teñido fue evaluado desde 0.5 hasta 4, como se explicó en Zrein y colaboradores (1998) . Utilizando un corte o una porción de este ensayo de 0.5, el número de muestras positivas (#pos) y el porcentaje (%pos) es mencionado en la parte inferior de la Tabla. La Figura 1 muestra los perfiles de cromatografía de exclusión de tamaño superpuestos en PBS/3% Empigen-BB de las proteínas Els y E2s expresadas y purificadas de acuerdo con Maertens y colaboradores (PCT/EP85/03031) . La Figura 2 muestra los perfiles de cromatografía de exclusión de tamaño superpuestos de las proteínas Els y E2s expresadas y purificadas de acuerdo con Maertens y colaboradores (PCT/EP85/03031) , y presentados con otra corrida sobre la misma columna SEC en PBS/0.2% CHAPS, para obtener estructuras oligoméricas específicas de un peso molecular aparente estimado de 250-300 kDa. Los grados similares de asociación pueden ser obtenidos utilizando 3% de betaína. La Figura 3 muestra los perfiles de cromatografía de exclusión de tamaño superpuestos de las proteínas Els y E2s expresadas y purificadas de acuerdo con Maertens y colaboradores (PCT/EP85/03031) , y presentados a una segunda corrida sobre la misma columna SEC en PBS/0.2% CHAPS o 3% de betaína, para obtener estructuras oligoméricas específicas como se muestra en la Figura 2, y presentadas a una tercera corrida sobre la misma columna SEC en 0.05% CHAPS, para obtener estructuras homo-oligoméricas específicas con un peso molecular aparente estimado de 250-300 kDa (E2s) y > 600 kDa (Els) . Se pueden obtener grados similares de asociación utilizando 0.1 o 0.5% de betaína. La Figura 4 muestra un análisis de dispersión de la luz, dinámico, expresado como el porcentaje del número de partículas con relación al diámetro observado en nm, de Els en PBS/0.05% CHAPS. La Figura 5 muestra un análisis de dispersión de la luz, dinámico, expresado como el porcentaje del número de partículas con relación al diámetro observado en nm, de Els en PBS/0.1% betaína (arriba) o 0.5% de betaína (abajo).

La Figura 6 muestra el teñido de EM de (A) las Els en PBS/0.05% de CHAPS y (B) las Els en PBS/3% de betaína. La Figura 7 muestra la distribución de tamaño de las partículas de Els en PBS/0.05% de CHAPS. La Figura 8 muestra la evolución de los anticuerpos anti-El inducidos por seis inmunizaciones consecutivas y 3 inmunizaciones de aumeno repentino (indicadas por flechas pequeñas) en un chimpancé infectado con Ib (Phil), y la evolución de ALT, ARN de VHC, y anticuerpos anti-El. Los anticuerpos anti-El que se unen a la 'El de fase sólida fueron detectados utilizando un antisuero secundario específico de IgG antihumano conjugado con peroxidasa. La TMB se utilizó como el substrato para el desarrollo o revelado del color. Los resultados son expresados como la concentración del punto final. Los niveles de ALT fueron determinados con un analizador clínico, y son expresados como U/1. El ARN del VHC en el suero se determinó utilizando el Monitor de VHC (Roche, Basel, Suiza) . La carga viral en el hígado fue determinada por la determinación semicuantitativa de la cantidad del antígeno de E2 teñida en la biopsia del hígado utilizando un compuesto monoclonal específico (ECACC número de acceso 98031215 como se describió en la solicitud de patente EP No. 98870060.5) .

La Figura 9 muestra el mapeo o la asignación de coordenadas de las respuestas de los anticuerpos inducidas por la inmunización con El en el chimpancé Phil. La reactividad de los anticuerpos hacia los diversos péptidos fue medida por un ELISA indirecto en el cual los péptidos biotinilados (véase también la Tabla 4) son adsorbidos sobre las placas de microtitulación por medio de la estreptavidina. Los anticuerpos específicos son detectados utilizando un antisuero secundario específico para IgG antihumano conjugado con la peroxidasa. La TMB se utilizó como el substrato para el desarrollo o revelado del color. La Figura 10 muestra los resultados del ensayo de proliferación de los linfocitos antes y después de la vacunación en el chimpancé Phil. El PMBC congelado fue licuado y se estimuló por triplicado con diferentes antígenos. El control negativo fue el medio solo, mientras que la concavanalina A se utilizó como el control positivo a una concentración de 5 µg/ml. La PBMC a una concentración de 2-4 x 105 células/cavidad en un volumen total de 150 µl se cultivó en un medio RPMI 1640 suplementado con 10% de FCS inactivado con calor en placas de microtitulación de 96 cavidades con forma de U junto con los controles o 1 µg/ml de El durante 90 h a 37 °C en una atmósfera humidificada que contiene 5% de C02. Durante las últimas 18 horas las células fueron estimuladas con 0.5 µCi (3H) de timidina por cavidad. Subsiguientemente, los cultivos fueron colectados sobre los filtros de fibra de vidrio y se determinó la absorción de la etiqueta. Los resultados son expresados como los índices de Estimulación (SI) : cpm promedio del antígeno/cpm promedio del medio solo, de las determinaciones por triplicado. La Figura 11 muestra la evolución de los anticuerpos anti-El inducidos por seis inmunizaciones consecutivas y 3 inmunizaciones de estímulo (indicadas por flechas pequeñas) en el chimpancé Ton infectado con el subtipo la del VHC. La evolución de ALT, VHC ARN en el suero y la determinación del antígeno de VHC en el hígado como es mostrado. Los anticuerpos de anti-El fueron determinados por medio de un ELISA indirecto: los anticuerpos específicos que se unen a la El recubierta con una fase sólida son detectados utilizando un antisuero secundario específico para IgG anti-humano conjugado con peroxidasa. La TMB se utilizó como el substrato para el desarrollo o revelado del color. Los resultados son expresados como las concentraciones del punto final. Los niveles de ALT fueron determinados con un analizador clínico, y son expresados en U/1. El ARN del VHC se determinó utilizando el Monitor de VHC (Roche, Basel, Suiza) . El antígeno de E2 se tiñó en la biopsia del hígado utilizando una substancia monoclonal específica (número de acceso 98031215 de ECACC como se describió en la solicitud EP No. 98870060.5). La evaluación semicuantitativa está indicada por los cuadrados negros para un teñido claramente positivo en la mayoría de las células, por cuadrados grises para el teñido claro en la minoría de las células y por cuadrados blancos para las biopsias que no muestran un teñido detectable. El ARN del VHC está indicado por cajas negras pequeñas. El teñido del E2 podría ser confirmado por el teñido de Core y El (datos no mostrados) . La Figura 12 muestra el mapeo o asignación de coordenadas del epítope de la respuesta del anticuerpo inducida por la inmunización con El en Ton. La reactividad de los anticuerpos hacia los diversos péptidos se midió por un ELISA indirecto en el cual los péptidos biotinilados (véase también la Tabla 4) son adsorbidos sobre las placas de microtitulación por medio de la estreptavidina. Los anticuerpos específicos son detectados utilizando un antisuero secundario específico de IgG antihumano conjugado con peroxidasa. La TMB se utilizó como el substrato para el revelado o desarrollo del color. La Figura 13 muestra el análisis de las respuestas de los anticuerpos de El a las proteínas de El del subtipo la y del subtipo Ib en el chimpancé Ton. Para este propósito un genotipo la de El, derivado de la secuencia de VHC-1, el virus de vaccinia recombinante se generó expresando la misma parte de El que para el genotipo Ib (véase posteriormente) . El se derivó de los usados crudos de las células RK13 infectadas con el virus de vaccinia (preparadas como se describió en Maertens y colaboradores (PCT/EP85/03031) ) . La reactividad de los anticuerpos se midió por un ELISA indirecto en el cual El se adsorbió sobre las placas de microtitulación por medio de la mañosa elevada que se une a la aglutinina Galanthus nivalis (GNA) . Los anticuerpos específicos fueron detectados utilizando un antisuero secundario específico para IgG antihumano conjugado con la peroxidasa. La TMB se utilizó como el substrato para el desarrollo o revelado del color. Los resultados son expresados como la OD diferencial (la OD de la cavidad con la El adsorbida menos la OD de la cavidad sin la El adsorbida) . La Figura 14 muestra los resultados del ensayo de la profileración de linfocitos antes y después de la vacunación del chimpancé Ton. El PMBC congelado se descongeló y se estimuló por triplicado con diferentes antígenos. El control negativo fue solo intermedio, mientras que la concavalina A se utilizó como el control positivo a una concentración de 5 µg/ml. El PMBC a una concentración de 2-4 105 células/cavidad en un volumen total de 150 µl fue cultivado en un medio RPMI 1640 suplementado con 10% de FCS inactivado con calor en placas de microtitulación de 96 cavidades con forma de U junto con los controles o 1 µg/ml de El durante 90h a 37 °C en una atmósfera húmeda que contiene 5% de C02. Durante las últimas 18 h las células fueron excitadas con 0.5 µCi de (3H) timidina por cavidad. Subsiguientemente, los cultivos son colectados sobre filtros de fibra de vidrio y se determinó la absorción de la etiqueta. Los resultados son expresados como los índices de Estimulación (SI) :antígeno de cpm promedio/medio solo de cpm promedio de las determinaciones por triplicado. La Figura 15 muestra los mapas de las construcciones utilizadas para obtener la expresión de una proteína de E2 con su región hipervariable N-terminal delecionada. Las construcciones de pvVHC-92 y pvVHC-99 son construcciones intermedias utilizadas para la construcción de los mutantes de deleción de pvVHC-100 y pvVHC-101. La Figura 16 muestra la secuencia (nucleótidos: A; traducción: B) que corresponden con las construcciones mostradas en la Figura 15 (véase anteriormente) . La Figura 17 muestra las concentraciones de los anticuerpos obtenidas en los ratones durante la inmunización con diferentes preparaciones de El como se describió en el ejemplo 9. Las concentraciones fueron determinadas por medio de ELISA: los sueros de murino fueron diluidos 1/20 y además sobre (0.5 logio) y se incubaron sobre Els (ya sea acetamida o maleimida modificada) recubierta sobre placas de microtitulación. Después del lavado, los anticuerpos de unión son detectados utilizando un antisuero secundario específico de IgG de antirratón conjugado con la peroxidasa. La TMB se utilizó como el substrato para el desarrollo o revelado del color. Los resultados son expresados como la concentración del punto final y las desviaciones estándares son mostradas (n=6) . La Figura 18 muestra el mapeo o asignación de coordenadas del epítope de la respuesta del anticuerpo inducida por la inmunización con diferentes preparaciones de Els en los ratones. La reactividad de los anticuerpos hacia los diversos péptidos se midió por un ELISA indirecto, en el cual los péptidos biotinilados (listados en la Tabla 4) son adsorbidos sobre las placas de microtitulación a través de la estreptavidina. Los sueros de murino fueron diluidos 1/20 y los anticuerpos específicos son detectados utilizando un antisuero secundario específico para IgG antirratón conjugado con peroxidasa. La TMB se utilizó como el substrato para el desarrollo o revelado del color. La Figura 19 muestra el perfil de isotipificación de inmunoglobulina de los ratones inmunizados con las diferentes preparaciones de Els. Los anticuerpos de las clases y subclases de Ig específicas fueron adsorbidos en la placa de microtitulación. Después de la captura de la Ig de murino fuera de los sueros inmunes diluidos 1/500, las Els fueron incubadas a 1 µg/ml. Los inmunocomplejos formados fueron incubados adicionalmente con un antisuero de conejo policlonal dirigido contra El. Finalmente, los anticuerpos de conejo fueron detectados utilizando un antisuero secundario de Ig de anticonejo-cabra conjugado con peroxidasa. La TMB se utilizó como el substrato para el desarrollo o revelado del color. Los resultados fueron normalizados con IgG? (es decir la señal de IgGi fue para cada animal que se considera separadamente que va a ser de 1 y la totalidad de los resultados para los otros isotipos fueron expresados con relación a este IgGi resultante) . La Figura 20 muestra las concentraciones de los anticuerpos inducidas por dos inmunizaciones alrededor del día 1000 con la Els-acetamida en el chimpancé Phil. Los anticuerpos de anti-El fueron determinados por medio de un ELISA indirecto: los anticuerpos específicos que se unen a El en fase sólida son detectados utilizando el antisuero secundario específico de IgG antihumano conjugado con peroxidasa. La concentración es expresada en unidades/ml, estas unidades se refieren a un estándar casero el cual está basado en el suero humano. La Figura 21 muestra las concentraciones de los anticuerpos inducidas por dos inmunizaciones alrededor del día 900 con la Els-acetamida en el chimpancé Ton. Los anticuerpos de anti-El fueron determinados por medio de un ELISA indirecto: los anticuerpos específicos que se unen a El en fase sólida son detectados utilizando el antisuero secundario específico de IgG antihumano conjugado con peroxidasa. La concentración es expresada en unidades/ml, estas unidades se refieren a un estándar casero el cual está basado en el suero humano. La Figura 22 muestra el perfil SEC del paso de reducción del detergente final (0.2 a 0.05% de CHAPS) :partícula solo de El (A), partícula solo de E2 (B) o una mezcla equimolar de El y E2; la partícula mezclada (C) . La Figura también muestra una superposición de los valores de OD de un ELISA que detecta específicamente solo la El (arriba), solo la E2 (en medio) y un ELISA que detecta solamente las partículas mezcladas (abajo) . La Figura 23 muestra el perfil SEC del paso de reducción del detergente final (0.2 a 0.05% de CHAPS) :1a partícula solo del genotipo Ib (arriba), la partícula solo del genotipo 4 de El (en medio) o una mezcla equimolar de los genotipos Ib de El y 4, la partícula mezclada (abajo) . La Figura también muestra una superposición de los valores de OD de un ELISA que detecta específicamente solo las partículas mezcladas (véase también la Figura 22) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención descrita aquí se redactó con base en el trabajo publicado previamente y las solicitudes de patentes pendientes. A - manera de ejemplo, tal trabajo consiste de artículos científicos, patentes o solicitudes de patente pendientes. Todas estas publicaciones y solicitudes, citadas previamente o de manera posterior, son incorporadas aquí para referencia. La presente invención se refiere a la vacunación contra el VHC. Por primera vez se pudo lograr una inmunoterapia exitosa de los chimpancés con varias hepatitis C activas, crónicas, por la vacunación con un antígeno de VHC. La vacuna no solamente indujo respuestas inmune elevadas, sino también indujo el espaciado o despeje del antígeno viral del hígado, y una mejora considerable de la actividad histológica y de la enfermedad del hígado. La presente invención se refiere además a las proteínas de la envoltura de VHC únicas, purificadas, y en particular a partículas oligoméricas. Las partículas oligoméricas consisten esencialmente de las proteínas de envoltura de VHC y tienen un diámetro de 1 a 100 nm como se midió por la dispersión dinámica de la luz y posiblemente por microscopía electrónica. A este respecto se debe enfatizar que las partículas pueden ser formadas solamente por las proteínas de El y/o E2, o las partes de las mismas (véase posteriormente) . Por lo tanto, las partículas oligoméricas de la presente invención difieren fundamentalmente de las partículas semejantes a VHC descritas en WO 98/21338, las cuales consisten necesariamente de El y E2 y Core y P7. Los términos "partículas oligoméricas que consisten esencialmente de las proteínas de la envoltura de VHC" están definidas aquí como las estructuras de una naturaleza y forma específica que contienen varias unidades básicas de las proteínas de la envoltura de El y/o E2 de VHC, las cuales se piensa que consisten de uno o dos monómeros de El y/o E2, respectivamente. Debe ser claro que las partículas de la presente invención están definidas para que estén vacías o libres de genomas del ARN de VHC infecciosos. Las partículas de la presente invención pueden ser partículas de orden más elevado, de naturaleza esférica, las cuales pueden estar vacías, que consisten de una cascara de proteínas de envoltura en la cual los lípidos, los detergentes, la proteína del núcleo (core) del VHC, o las moléculas auxiliares, pueden ser incorporadas. Estas últimas partículas también pueden ser encapsuladas por los liposomas o apolipoproteínas, tales como, por ejemplo, la apolipoproteína B o las lipoproteínas de baja densidad, o por cualquier otro medio de ubicación como blanco de las partículas para un tejido u órgano específico. En este caso, tales partículas esféricas vacías son referidas frecuentemente como "partículas semejantes a las virales" o VLPs. Alternativamente, las partículas de orden más elevado pueden ser estructuras esféricas sólidas, en las cuales la esfera completa consiste de oligómeros de la proteína de envoltura de El o E2 del VHC, en la cual los lípidos, los detergentes, la proteína del núcleo (core) del VHC, o las moléculas auxiliares pueden ser incorporadas adicionalmente, o las cuales a su vez pueden ser encapsuladas por sí mismas por los liposomas o las apolipoproteínas, tales como, por ejemplo, la apolipoproteína B, las lipoproteínas de densidad baja, o por cualquier otro medio de ubicación de blanco de las partículas con respecto a un órgano o tejido específico, por ejemplo las asialoglicoproteínas. Las partículas pueden consistir también de estructuras más pequeñas (comparado con las estructuras esféricas vacías o sólidas indicadas anteriormente) las cuales son de forma redonda usualmente (véase el anexo) y las cuales usualmente no contienen más de una sola capa de las proteínas de envoltura del VHC. Un ejemplo típico de tales partículas más pequeñas son las estructuras semejantes a rosetas las cuales consisten de un número más bajo de proteínas de la envoltura del VHC, usualmente entre 4 y 16. Un ejemplo específico de estas últimas incluye las partículas más pequeñas obtenidas con Els en 0.2% de CHAPS como se ejemplificó aquí, las cuales contienen aparentemente 8-10 monómeros de Els. Tales estructuras semejantes a rosetas están organizadas usualmente en un plano y son de forma redonda, por ejemplo en la forma de una rueda. Nuevamente los lípidos, detergentes, la proteína del núcleo (core) del VHC, o las moléculas auxiliares pueden ser incorporadas adicionalmente, o las partículas más pequeñas pueden ser encapsuladas por los liposomas o las apolipoproteínas, tales como, por ejemplo, la apolipoproteína B o las lipoproteínas de densidad baja, o por cualquier otro medio de ubicación de un blanco de dichas partículas a un órgano o tejido específico. Las partículas más pequeñas también pueden formar estructurales esféricas o globulares pequeñas, que consisten de un número más pequeño similar de las proteínas de envoltura de El o E2 del VHC en las cuales los lípidos, los detergentes, la proteína del núcleo (core) del VHC, o las moléculas auxiliares podrían ser incorporados adicionalmente, o las cuales a su vez pueden ser encapsuladas por los liposomas o las apolipoproteínas, tales como, por ejemplo, la apolipoproteína B o las proteínas de densidad baja, o por cualquier otro medio de ubicación de un blanco de las partículas a un órgano o tejido específico. El tamaño (es decir el diámetro) de las partículas definidas anteriormente, como se miden por las técnicas de dispersión de la luz, dinámicas, bien conocidas en la técnica (véase además la sección de ejemplos), está usualmente entre 1 y 100 nm, más preferentemente entre 2 a 70 nm, aún más preferentemente entre 2 y 40 nm, entre 3 y 20 nm, entre 5 y 16 nm, entre 7 a 14 nm o entre 8 a 12 nm. La invención se refiere además a una partícula oligomérica como se definió anteriormente, en donde las proteínas de la envoltura son seleccionadas del grupo que consiste de las proteínas El de VHC, Els de VHC, E2 de VHC, SEC ID No. 13 o SEC ID No. 14, o las partes de los mismos. Las proteínas El de VHC y E2 de VHC, y una descripción detallada de como purificar estas últimas proteínas, se describe y se caracteriza bien en PCT/EP 95/03031 de Maertens y colaboradores. Las Els de VHC, la SEC ID No. 13 o la SEC ID No. 14, o las partes de las mismas, pueden ser purificadas semejantemente como se describió para la El de VHC o las Els de VHC en PCT/EP 95/03031 de Maertens y colaboradores . Se debe enfatizar que el contenido total, incluyendo la totalidad de las definiciones, de este último documento, son incorporadas para referencia en la presente solicitud. Las Els del VHC de la proteína se refieren a los aminoácidos 192 a 326 de El, y representan la proteína El sin su anclaje hidrofóbico C-terminal. El término "o las partes del mismo" se refiere a cualquier parte de las proteínas indicadas aquí las cuales son inmunogénicas, siempre que las mismas sean parte de una partícula de la presente invención. La invención pertenece además a las partículas oligoméricas como se describen aquí, en donde al menos un residuo de cisteína de la proteína de envoltura de VHC como se describió anteriormente está alquilada, preferentemente por medio de agentes de alquilación, tales como, por ejemplo, halógenos activos, etilenimina o N- (yodoetil) trifluoroacetamida. A este respecto, se va a sobreentender que la alquilación de las cisteínas se refiere a las cisteínas sobre las cuales el hidrógeno sobre el átomo de azufre es reemplazado por (CH2)nR, en la cual n es 0, 1, 2, 3 o 4 y R=H, COOH, NH2, C0NH2, fenilo, o cualquier derivado de los mismos. La alquilación puede ser efectuada por cualquier método conocido en la técnica, tal como, por ejemplo, los halógenos activos X(CH2)nR en los cuales X es un halógeno tal como I, Br, Cl o F. Los ejemplos de los halógenos activos son el yoduro de metilo, el ácido yodoacético, y la 2-bromoetilamina. Otros métodos de alquilación incluyen el uso de la etilenimina o la N- (yodoetil) trifluoroacetamida que conducen ambas a la substitución de H por la -CH2-CH2-NH2 (Hermanson, 1996) . El término "agentes de alquilación" como se utiliza aquí se refiere a los compuestos los cuales son capaces de efectuar la alquilación como se describió aquí. Tales alquilaciones conducen finalmente a una cisteína modificada, la cual puede ser semejante a otros aminoácidos. La alquilación por una etilenimina conduce a una estructura que se asemeja a la lisina, de tal manera que los nuevos sitios de segmentación para la tripsina sean introducidos (Hermanson 1996) . De manera similar, el uso del yoduro de metilo conduce a un aminoácido que se asemeja a la metionina, mientras que el uso del yodoacetato y la yodoacetamida conduce a los aminoácidos que se asemejan al ácido glutámico y la glutamina, respectivamente. En analogía, estos aminoácidos son utilizados preferentemente en la mutación directa de la cisteína. Por lo tanto, la presente invención pertenece a las partículas oligoméricas como se describieron aquí, en donde al menos un residuo de cisteína de la proteína de envoltura de VHC como se describió aquí, es mutada a un aminoácido natural, preferentemente a la metionina, ácido glutámico, glutamina o lisina. El término "mutado" se refiere a la mutagénesis dirigida al sitio de los ácidos nucleicos que codifican estos aminoácidos, es decir a los métodos bien conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, la mutagénesis dirigida al sitio por medio de la PCR o por medio de la mutagénesis mediada por oligonucleótidos como se describió en Sambrook y colaboradores (1989) .

El término "purificado" como se aplica aquí se refiere a una composición en donde los componentes deseados, tales como, por ejemplo, las proteínas de envoltura de VHC o las partículas oligoméricas, comprenden al menos 35% de los componentes totales en la composición. Los componentes deseados comprenden preferentemente al menos aproximadamente 40%, más preferentemente al menos aproximadamente 50%, todavía más preferentemente al menos aproximadamente 60%, todavía más preferentemente al menos aproximadamente 70%, aún más preferentemente al menos aproximadamente 80%, aún más preferentemente al menos aproximadamente 90%, aún más preferentemente al menos aproximadamente 95%, y más preferentemente al menos aproximadamente 98% de la fracción de los componentes totales de la composición. La composición puede contener otros compuestos, tales como, por ejemplo, los carbohidratos, las sales, los lípidos, los solventes, y semejantes, sin afectar la determinación del porcentaje de la pureza como se utiliza aquí. Una partícula oligomérica de VHC "aislada" está propuesta para que signifique una composición de partículas oligoméricas de VHC que es al menos 35% pura. A este respecto debe ser claro que el término "una proteína de envoltura de VHC purificada" como se utiliza aquí, se refiere a proteínas de envoltura de VHC aisladas esencialmente en la forma pura. Los términos "partículas oligoméricas esencialmente purificadas" y "proteínas de envoltura de VHC sencillas" como se utilizan aquí, se refieren a las partículas oligoméricas de VHC o a las proteínas de envoltura de VHC únicas de tal modo que las mismas puedan ser utilizadas en los métodos de diagnóstico in vitro y en terapéutica. Estas partículas oligoméricas de VHC están substancialmente libres de las proteínas celulares, las proteínas derivadas de los vectores u otros componentes virales del VHC. Usualmente, estas partículas o proteínas son purificadas hasta la homogeneidad (al menos 80% de pureza, preferentemente 85%, más preferentemente 90%, más preferentemente 95%, más preferentemente 97%, más preferentemente 98%, más preferentemente 99%, aún más preferentemente 99.5%, y más preferentemente las proteínas contaminantes deben ser indetectables por los métodos convencionales tales como SDS-PAGE y el teñido con plata) . La presente invención también se refiere a una partícula oligomérica como se definió anteriormente en donde las proteínas de envoltura son cualquier mezcla de VHC El, VHC Els, VHC E2, SEC ID No. 13 y/o SEC ID No. 14, o partes de las mismas, tales como, por ejemplo, una partícula de la presente invención puede consistir substancialmente de las proteínas VHC El- y VHC E2, las proteínas VHC El- y VHC Els, las proteínas VHC Els- y VHC E2, y las proteínas VHC El-, VHC E2. Además, la presente invención también se refiere a una partícula oligomérica como se definió anteriormente en donde las proteínas son derivadas de las diferentes cepas, subtipos o genotipos del VHC, tales como, por ejemplo, las proteínas derivadas del genotipo Ib y del genotipo 4, o son una mezcla que consiste de las proteínas de envoltura del VHC de una cepa o genotipo de VHC y de al menos otra cepa o genotipo del VHC. Las diferentes cepas o genotipos de VHC están bien definidos y caracterizados en PCT/EP 95/04155 de Maertens y colaboradores. Se debe enfatizar que el contenido total, incluyendo la totalidad de las definiciones, del último documento, es incorporado para referencia en la presente solicitud. Por consiguiente, la presente invención se refiere a las partículas oligoméricas que comprenden las proteínas de envoltura derivadas de cualquier cepa o genotipo de VHC conocida en la técnica o a partículas que comprenden una mezcla de proteínas derivadas de cualquier cepa o genotipo de VHC conocido en la técnica. A este respecto, la presente invención también se refiere a secuencias de consenso derivadas de los clones individuales como se ejemplifican posteriormente y en la sección de ejemplos (véase posteriormente) . La presente invención se refiere además a una partícula oligomérica como se describió aquí, que se puede obtener por un método, así como al método para producir la partícula oligomérica. El método está caracterizado por los siguientes pasos: (I) Purificar las proteínas de envoltura de VHC, que incluyen posiblemente el uso de un primer detergente opcionalmente. En esencia, el procedimiento de purificación del paso (I) ha sido descrito extensamente en PCT EP 95/03031 de Maertens y colaboradores. De manera importante, de acuerdo con la presente invención, el paso de bloqueado en el procedimiento de purificación como se describió en PCT EP 95/03031, por ejemplo con la NEM- biotina, se lleva a cabo con un paso de alquilación como se describió en la presente solicitud, preferentemente utilizando yodoacetamida. Además, el procedimiento de purificación del paso (I) puede incluir posiblemente el uso de un agente de segmentación de la unión de disulfuro, y posiblemente incluye el uso de un agente de alquilación. Finalmente, el procedimiento del paso (I) conduce a proteínas de envoltura del VHC purificadas en una solución. (II) Reemplazar la solución de las proteínas de envoltura de VHC purificadas con un detergente o una sal, conduciendo a la formación de partículas oligoméricas.

(III) Recuperar o purificar las partículas oligoméricas, incluyendo posiblemente reducir adicionalmente la concentración del detergente o la sal del paso (II), lo cual ayuda además a la formación y estabilización de las partículas oligoméricas, formadas después del reemplazo. Más preferentemente, la presente invención se refiere a una partícula oligomérica como se definió aquí, así como al método para producir dicha partícula, en donde el primer detergente opcionalmente es el Empigen-BB. Más preferentemente, la presente invención se refiere a una partícula oligomérica como se definió aquí, así como al método para producir dicha partícula, en donde el detergente del paso (II) es CHAPS, octilglucósido o Tween, más preferentemente T een-20 o Tween-80, o cualquier otro detergente. Más preferentemente, la presente invención se refiere a una partícula oligomérica como se definió aquí, así como al método para producir dicha partícula, en donde la sal es la betaína. Aún más preferentemente, la presente invención se refiere a una partícula oligomérica como se definió anteriormente, así como al método para producir la partícula, en donde el Empigen-BB es utilizado a una concentración del 1% hasta 10% y en donde el CHAPS o Tween es utilizado a una concentración de 0.01% hasta 10%, o la betaína es utilizada a una concentración de 0.01% hasta 10%. Aún más preferentemente, la presente invención se refiere a una partícula oligomérica como se definió anteriormente, así como al método para producir dicha partícula, en donde la Empigen-BB es utilizada a una concentración del 3% y en donde el CHAPS o la betaína son utilizados a concentraciones de 0.2% o 0.3%, respectivamente, después de lo cual la solución amortiguadora es cambiada y el CHAPS o la betaína son utilizados a concentraciones de 0.05% o 0.1-0.5%, respectivamente. Se va a sobreentender que todos los porcentajes utilizados en el método descrito anteriormente se dan como peso/volumen. Debe ser claro que el método descrito anteriormente (véase también PCT/EP 95/03031 y la sección de ejemplos de la presente solicitud) es un ejemplo de como producir las partículas de la presente invención. A este respecto, la presente invención también se refiere a cualquier otro método conocido en la técnica el cual pueda ser utilizado para producir las partículas oligoméricas de la presente invención, tales como, por ejemplo, omitir el agente de reducción como se describió en PCT/EP 95/03031 y la sección de ejemplos (infra), y la utilización en lugar de éste de células huésped, las cuales tienen un estado redox optimizado en el Retículo Endoplásmico para reducir los puentes de cisteína. Además, debe ser claro que una gama completa de alquilbetaínas puede ser utilizada, tales como, por ejemplo, con una cola o extremo Cn, en el cual n = un entero positivo que varía desde 1 hasta 20, así como los derivados de betaina, tales como, por ejemplo, las sulfobetaínas . Puesto que la primera vez que la inmunoterapia exitosa de los chimpancés con hepatitis C activa crónica severa se. logró por la vacunación con un antígeno de VHC purificado, la presente invención también se refiere a las proteínas de envoltura de VHC únicas, purificadas, en particular a El o Els. Además, la presente invención pertenece a una composición que comprende las proteínas de envoltura de VHC únicas, y al uso de las mismas como una vacuna contra el VHC, o para la fabricación de una vacuna contra el VHC. Para evitar la inducción de una respuesta inmune contra los epítopes relevantes, la proteína de envoltura del VHC utilizada para la vacunación está construida preferentemente como una secuencia de consenso de los subtipos, cepas, o clones individuales. Por lo tanto, la presente invención también pertenece al uso de un antígeno de VHC (ya sea en la forma del péptido, la proteína, o un polinucleótido) para vacunación o diagnóstico. Además, la presente invención también pertenece a una partícula oligomérica, como se definió aquí, y al uso de la misma, en la cual la proteína de envoltura de VHC está codificada por una secuencia de consenso basada en la variabilidad de las cuasiespecies dentro de una substancia aislada (secuencia de consenso aislada) o con base en la secuencia de consenso de diferentes substancias aisladas dentro de un subtipo (secuencia de consenso del subtipo), de un tipo o especie (secuencia de consenso del tipo o especie), o el género de VHC completo (secuencia de consenso del género) . En consecuencia, la secuencia de aminoácidos de esta proteína de envoltura de VHC de consenso es una secuencia de consenso derivada de una secuencia de consenso de la substancia aislada, del subtipo, de la cepa, o del género. Para la connotación del término "consenso" se hace referencia particularmente a Maertens y Stuyver (1997), y las referencias utilizadas allí. La partícula oligomérica de la presente invención exhibe epítopes extremadamente eficientes (véase infra) . Por consiguiente, la partícula oligomérica es un medio para presentar epítopes de tal manera que los mismos puedan ocasionar una respuesta inmune experta. En este contexto, se comprende que las proteínas de envoltura de VHC como se definieron aquí no necesariamente contienen epítopes del VHC exclusivamente. Las proteínas de envoltura del VHC, las cuales forman las partículas oligoméricas, pueden contener los epítopes que son derivados de VHC solamente, y posiblemente contienen epítopes que son derivados de otros agentes exógenos, tales como, por ejemplo, HBV o VIH. En otras palabras, la partícula oligomérica con un esqueleto de proteína de envoltura de VHC, puede ser utilizada como un vehículo para presentar los epítopes diferentes de VHC, posiblemente de manera adicional a los epítopes de VHC. Por lo tanto, la presente invención también abarca una partícula oligomérica, como se definió aquí pero posiblemente sin los epítopes de VHC, y sus aplicaciones y su manufactura, que contiene posiblemente epítopes diferentes de VHC. El término "agente exógeno" como se utiliza aquí, se refiere a cualquier agente, ya sea viviente o no, capaz de producir una respuesta inmune, y el cual no sea endógeno para el huésped, y el cual no sea el VHC. Específicamente, este último término se refiere al grupo que consiste de agentes patógenos, alérgenos y haptenos. Los agentes patógenos comprenden los priones, virus, procariotas y eucariotas. Más específicamente, el virus comprende en particular el VBH, VIH, o el Herpesvirus, pero no el VHC. Los alérgenos comprenden las substancias o moléculas capaces de provocar una respuesta inmune en un huésped sobre sí mismas cuando un huésped es expuesto a los alérgenos. Los haptenos se comportan de manera similar a los alérgenos con respecto a la capacidad de provocar una respuesta inmune, pero en contraste con los alérgenos, los haptenos necesitan una molécula portadora. La presente invención también se refiere a una composición que comprende una partícula oligomérica como se definió anteriormente. Más particularmente, la presente invención se refiere a una composición de vacuna. El término "composición de vacuna" se refiere a una composición inmunogénica capaz de producir la protección contra el VHC, ya sea parcial o completa. Por lo tanto la misma incluye los péptidos, proteínas, o polinucleótidos del VHC. La protección contra el VHC se refiere en particular a los seres humanos, pero se refiere también a los primates no humanos, al ratón trimera (Zauberman y colaboradores, 1999), u otros mamíferos. Las partículas de la presente invención pueden ser utilizadas como tales, en una forma biotinilada (como se explicó en WO 93/18054) y/o en forma de complejo con Neutralite Avidin (Molecular Probes Inc., Eugene, OR, EUA). También se debe señalar que "una composición de vacuna" comprende, además de una substancia activa, un excipiente adecuado, un diluyente, un portador y/o un auxiliar los cuales, por sí mismos, no induzcan la producción de anticuerpos perjudiciales para el individuo que recibe la composición ni ocasionen la protección. Los portadores adecuados son típicamente macromoléculas metabolizadas lentamente, grandes, tales como las proteínas, los polisacáridos, los ácidos polilácticos, los ácidos poliglicólicos, los aa' s poliméricos, los copolímeros de aa y las partículas del virus inactivo. Tales portadores son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Los auxiliares preferidos para mejorar la efectividad de la composición incluyen, pero no están limitados a: hidróxido de aluminio, aluminio en combinación con el monofosforil lípido A 3-0-desacilado como se describió en WO 93/19780, el fosfato de aluminio como se describió en WO 93/24148, la N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina como se describió en la Patente U.S. No. 4,606,918, la N-acetil-normuramil-L-Alanil-D-isoglutamina, la N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutamil-L-alanin2- (1'2' -dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi) etilamina y RIBI (ImmunoChem Research Inc., Hamilton, MT, EUA) la cual contiene el monofosforil lípido A, la endotoxina destoxificada, la trehalosa-6, 6-dimicolato, y el esqueleto de la pared celular (MPL + TDM + CWS) en una emulsión de escualeno/Tween 80 al 2%.

Cualquiera de los tres componentes MPL, TDM o CWS también pueden ser utilizados solos o combinados 2 por 2.

Adicionalmente, los adyuvantes tales como Stimulon (Cambridge Bioscience, Worcester, MA, EUA) o SAF-1 (Syntex) pueden ser utilizados, así como los adyuvantes tales como las combinaciones entre QS21 y monofosforil lípido A 3-de- O-acetilado (WO94/00153) , o MF-59 (Chiron) , o poli [di (carboxilatofenoxi) fosfaceno] basado en auxiliares (Virus Research Institute) , o los adyuvantes a base de copolímeros de bloques tales como Optivax (Vaxcel, Cyt x) o los auxiliares a base de insulina, tales como Algammulin y Gammalnulin (Anutech), el Auxiliar de Freund Incompleto (IFA) o las preparaciones de Gerbu (Gerbu Biotechnik) . Se va a sobreentender que el Auxiliar de Freund Completo (CFA) puede ser utilizado para aplicaciones no humanas y también para propósitos de búsqueda. "Una composición de . vacuna" contendrá además excipientes y diluyentes, los cuales son inherentemente no tóxicos y no terapéuticos, tales como el agua, una solución salada, el glicerol, etanol, agentes humectantes o e ulsificantes, substancias amortiguadoras del pH, preservativos, y semejantes. Típicamente, una composición de vacuna es preparada como una solución inyectable, ya sea como una solución líquida o como una suspensión. Las formas sólidas, adecuadas para la solución sobre, o en suspensión en, los vehículos líquidos previo a la inyección, también pueden ser preparados. La preparación también puede ser emulsificada o encapsulada en los liposomas para mejorar el efecto del auxiliar. Los polipéptidos también pueden ser incorporados en Complejos Estimulantes Inmunes junto con las saponinas, por ejemplo Quil A (ISCOMS) . Las composiciones de vacuna comprenden una cantidad efectiva inmunológicamente de los polipéptidos de la presente invención, así como cualquier otro de los componentes mencionados anteriormente. "La cantidad efectiva inmunológicamente" significa que la administración de esta cantidad a un individuo, ya sea en una sola dosis o como parte de una serie, es efectiva para la prevención o el tratamiento. Esta cantidad varía dependiendo de la salud y la condición física del individuo que va a ser tratado, del grupo taxonómico del individuo que va a ser tratado (por ejemplo el ser humano, el primate no humano, el primate, etc.), la capacidad del sistema inmune del individuo para establecer una respuesta inmune efectiva, el grado de protección deseado, la formulación de la vacuna, la evaluación del doctor que proporciona el tratamiento, la cepa del VHC de la infección y los otros factores relevantes. Se espera que la cantidad caerá en un intervalo relativamente amplio que puede ser determinado a través de los ensayos de rutina. Usualmente, la cantidad variará desde 0.01 hasta 1000 µg/dosis, más particularmente desde 0.1 hasta 100 µg/dosis. Las composiciones de vacuna son administradas convencionalmente de manera parenteral, típicamente por inyección, por ejemplo, subcutánea o intramuscularmente. Las formulaciones adicionales adecuadas para otros métodos de administración incluyen las formulaciones orales y los supositorios. El tratamiento de dosificación puede ser de un programa de una sola dosis o de un programa de dosis múltiples. La vacuna puede ser administrada en conjunción con otros agentes inmunoreguladores. Por lo tanto, la presente invención pertenece al uso de una partícula oligomérica como se definió aquí para inducir profilácticamente una inmunidad contra el VHC. Se debe señalar que una vacuna también puede ser útil para el tratamiento de un individuo como se puntualizó anteriormente, el tal caso la misma es llamada una "vacuna terapéutica". La presente invención también se refiere a una composición como se definió anteriormente la cual también comprende las proteínas del núcleo, El, E2, P7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A y/o NS5B de VHC, las partes de las mismas. Las partículas de El, E2, y/o E1E2, por ejemplo, pueden ser combinadas con los antígenos estimulantes de la célula T, tales como, por ejemplo, del núcleo, P7, NS3, NS4A, NS4B, NS5A y/o NS5B. En particular, la presente invención se refiere a una composición como se definió anteriormente en donde la proteína de NS3, o las partes de la misma, tienen una secuencia de aminoácidos dada por la SEC ID 1 o la SEC ID 2 (véase posteriormente la sección de los ejemplos) . La purificación de estas proteínas de NS3 preferentemente incluirá una modificación reversible de los residuos de cisteína, y aún más preferentemente la sulfonación de las cisteínas. Los métodos para obtener tal modificación reversible, incluyendo la sulfonación, han sido descritos para las proteínas de NS3 en Maertens y colaboradores (PCT/EP99/02547) . Se debe enfatizar que el contenido completo, incluyendo la totalidad de las definiciones, de este último documento, es incorporado para referencia en la presente solicitud. Es claro de lo anterior que la presente invención también se refiere al uso de una partícula oligomérica como se definió anteriormente o una composición como se definió anteriormente para la fabricación de una composición de vacuna de VHC. En particular, la presente invención se refiere al uso de una partícula oligomérica como se definió aquí para inducir una inmunidad contra el VHC en los portadores de VHC crónicos. De manera más particular, la presente invención se refiere al uso de una partícula oligomérica como se definió aquí para inducir una inmunogenicidad contra VHC en los portadores de VHC crónicos previo a, simultáneamente con o después de cualquier otra terapia, tales como, por ejemplo, la terapia de interferona bien conocida ya sea en combinación o no con la administración de los fármacos pequeños para el tratamiento del VHC, tales como por ejemplo, la ribavirina. Tal composición también puede ser empleada antes o después del trasplante del hígado, o después de una infección presumida, tales como, por ejemplo, lesiones por pinchazos de aguja. Además, la presente invención se refiere a un juego o conjunto que contiene las partículas oligoméricas o las proteínas de envoltura de VHC únicas de la presente invención para detectar los anticuerpos de VHC presentes en una muestra biológica. El término "muestra biológica" como se utilizó aquí, se refiere a una muestra de tejido o de fluido aislado de un individuo, incluyendo pero sin estar limitado a, por ejemplo, el suero, el plasma, el fluido linfático, las secciones externas de la piel, los tractos respiratorio, intestinal, y genitourinario, los oocitos, los desgarres, la saliva, la leche, las células blancas, los tumores, los órganos, las secreciones gástricas, el moco, el fluido de la médula espinal, las secreciones externas tales como, por ejemplo, el excremento, la orina, el esperma, y semejantes. Puesto que las partículas oligoméricas y las proteínas de envoltura de VHC únicas de la presente invención son altamente inmunogénicas, y estimulan tanto las respuestas inmune humorales como celulares, la presente invención se refiere también a un juego o conjunto para detectar la respuesta de la célula T relacionada con el VHC, que comprende la partícula oligomérica o la proteína de envoltura de VHC única purificada de la presente invención. La respuesta de la célula T del VHC puede ser medida por ejemplo como se describió en la sección de ejemplos, o como se describió en PCT/EP 94/03555 de Leroux-Roels y colaboradores. Se debe enfatizar que el contenido total, incluyendo todas las definiciones, de este documento, es incorporado para referencia en la presente solicitud. Debe ser claro que la presente invención también pertenece al uso de las inmunoglobulinas de VHC específicas para el tratamiento y la prevención de la infección provocada por el VHC. Aquí se demostró por primera vez que los niveles suficientes de anticuerpos del VHC, especialmente los anticuerpos de la envoltura del VHC, inducen una mejora de la enfermedad de Hepatitis C. También se demostró por primera vez que los niveles suficientes de los anticuerpos pueden unirse al virus circulante, y que la presencia del virus que ha formado un complejo con Ab coincide con la desaparición del antígeno de VHC del hígado, y con la mejora de la enfermedad del hígado. Los anticuerpos de la envoltura de VHC pueden ser inducidos por la vacunación o pueden ser transferidos pasivamente por inyección después que los anticuerpos han sido purificados de los grupos de la sangre infectada con el VHC o de la sangre obtenida de los vacunados con el VHC. Por lo tanto la presente invención pertenece además a los anticuerpos específicos, generados contra una partícula oligomérica como se describió anteriormente o contra una composición como se describió anteriormente, o una proteína de envoltura de VHC única. En particular, la presente invención se refiere a un juego o conjunto que comprende los anticuerpos para detectar los antígenos de VHC. El término "anticuerpos específicos" como se utiliza aquí, se refiere a los anticuerpos, los cuales son fabricados o cultivados contra los epítopes los cuales son específicos para la partícula oligomérica como se describió en la presente invención. En otras palabras, los anticuerpos específicos son fabricados o cultivados contra los epítopes los cuales resultan de la formación de, y están presentes únicamente sobre las partículas oligoméricas. Además, existen varios procedimientos conocidos para producir los péptidos de VHC. Estos procedimientos podrían conducir a los péptidos de VHC capaces de presentar epítopes. Es concebible que los péptidos de VHC, obtenidos por estos procedimientos diferentes y múltiples, sean capaces de presentar epítopes similares. Los epítopes similares son los epítopes que resultan de procedimientos de producción o purificación diferentes pero reconocibles por el único y el mismo anticuerpo. Sin embargo, las partículas oligoméricas de la presente invención presentan epítopes extremadamente eficientes. En consecuencia, los epítopes sobre las partículas oligoméricas son altamente inmunogénicos. Por lo tanto, la presente invención también pertenece a los epítopes sobre las partículas oligoméricas, dichos epítopes son al menos 10 veces, preferentemente al menos 20 veces, preferentemente al menos 50 veces, preferentemente al menos 100 veces, preferentemente al menos 500 veces, y aún más preferentemente al menos 1000 veces más inmunogénicos que los epítopes sobre los péptidos de VHC, los cuales no son producidos de acuerdo con la presente invención, es decir no producidos por la formación de partículas auxiliada por el detergente. Se apreciará por el experto que la inmunogenicidad, por ejemplo, puede ser detectada y por lo tanto comparada inmunizando mamíferos por medio de la administración de cantidades comparables de los péptidos, producidas por cualquier método. Además, el término "anticuerpo específico" se refiere también a los anticuerpos los cuales son fabricados o cultivados contra una proteína de envoltura de VHC única, purificada. Cuando se utilice aquí, el término "anticuerpo" se refiere a anticuerpos monoclonales o policlonales. El término "anticuerpo monoclonal" se refiere a una composición de anticuerpos que tiene una población de anticuerpos homogénea. El término "anticuerpo" no es limitativo con respecto a las especies o la fuente del anticuerpo, ni está propuesto para ser limitado por la manera en la cual se haga el mismo. Además, el término "anticuerpo" también se refiere a los anticuerpos humanizados en los cuales al menos una porción de las regiones de la armazón de una inmunoglobulina es derivada de las secuencias de inmunoglobulina humana y de los anticuerpos de una sola cadena, tales como, por ejemplo, los que se describen en la patente U.S. No. 4,946,778, a los fragmentos de los anticuerpos tales como Fab, F(ab)2, Fv, y otros fragmentos los cuales retienen la función de unión del antígeno y la especificidad del anticuerpo original. Además, la presente invención también caracteriza el uso de una partícula oligomérica como se describió anteriormente, o una composición como se describió anteriormente para detectar los anticuerpos contra las proteínas de envoltura de VHC. Cuando se utilice aquí, el término "para detectar" se refiere a cualquier ensayo conocido en la técnica adecuado para la detección. En particular, el término se refiere a cualquier inmunoensayo como se describió en WO 96/13590. Los términos "péptido", "polipéptido" y "proteína" son utilizados intercambiablemente en la presente invención. "Polipéptido" se refiere a un polímero de aminoácidos (secuencia de aminoácidos) y no se refiere a una longitud específica de la molécula. Por consiguiente, los oligopéptidos están incluidos dentro de la definición de polipéptido. Se va a sobreentender que las substancias semejantes a los péptidos son inherentes en los términos de "polipéptido", "péptido" y "proteína". También, la presente invención se refiere al uso de una partícula oligomérica como se describió aquí para inducir la inmunidad contra el VHC, caracterizado porque la partícula oligomérica es utilizada como parte de una serie del tiempo y de los compuestos. A este respecto, se va a sobreentender que el término "una serie del tiempo y de los compuestos" se refiere a la administración con los intervalos de tiempo a un individuo de los compuestos utilizados para producir una respuesta inmune. Estos últimos compuestos pueden comprender cualquiera de los siguientes componentes: partículas oligoméricas, una composición de vacuna del ADN de VHC, polipéptidos de VHC. A este respecto, una serie comprende administrar, ya sea: (I) un antígeno de VHC, tal como, por ejemplo, una partícula oligomérica, con intervalos de tiempo, o (II) un antígeno de VHC, tal como, por ejemplo, una partícula oligomérica en combinación con una composición de vacuna de ADN del VHC, en la cual las partículas oligoméricas y el ADN del VHC, pueden ser administradas simultáneamente, a intervalos de tiempo diferentes, incluyendo a intervalos de tiempo alternativos, o (III) ya sea (I) o (II), o posiblemente en combinación con otros péptidos de VHC, con intervalos de tiempo.

A este respecto, debe ser claro que una composición de vacuna del ADN de VHC comprende los ácidos nucleicos que codifican el péptido de envoltura de VHC, que incluyen los péptidos El-, E2-, E1/E2, el péptido Els, la SEC ID No. 13, la SEC ID No. 14, el péptido de NS3, otros péptidos de VHC, o partes de dichos polipéptidos. Además, se va a entender que dichos péptidos de VHC comprenden los péptidos de envoltura de VHC, que incluyen los péptidos El-, E2-, E1/E2, el péptido Els, la SEC ID No. 13, la SEC ID No. 14, el péptido de NS3, otros péptidos de VHC, o partes de los mismos. El término "otros péptidos de VHC" se refiere a cualquier péptido de VHC o fragmento del mismo con la condición de que el péptido de VHC no sea El, E2, Els, la SEC ID No. 13, la SEC ID No. 14, o NS3. En el punto II del esquema anterior, la composición de vacuna del ADN de VHC comprende preferentemente los ácidos nucleicos que codifican los péptidos de envoltura de VHC. En el Punto II del esquema anterior, la composición de vacuna del ADN de VHC consiste aún más preferentemente de los ácidos nucleicos que codifican los péptidos de envoltura de VHC, posiblemente en combinación con una composición de vacuna del ADN de VHC-NS3. A este respecto, debe ser claro que una composición de vacuna del ADN de VHC comprende un vector del plásmido que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica una péptido de VHC como se describió anteriormente, enlazado operativamente a los elementos reguladores de la transcripción. Cuando se utilice aquí, un "vector del plásmido" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual el mismo ha sido enlazado. Los vectores preferidos son aquellos capaces de replicación y/o expresión autónoma de los ácidos nucleicos a los cuales los mismos han sido enlazados. En general, pero sin estar limitados a estos, los vectores del plásmido son bucles o circuitos de ADN de doble hebra, circulares, los cuales, en su forma del vector, no están unidos al cromosoma. Cuando se utilice aquí, una "secuencia de polinucleótidos" se refiere a los polinucleótidos tales como el ácido desoxirribonucléico (ADN) , y, en donde sea apropiado, al ácido ribonucleico (ARN) . El término también se debe entender que incluye, como equivalentes, los análogos ya sea del ARN o del ADN hechos de los análogos de nucleótidos, y los polinucleótidos de una sola hebra o de doble hebra. Cuando es utilice aquí, el término "elementos reguladores de la transcripción" se refiere a la secuencia de nucleótidos la cual contiene elementos reguladores esenciales, de tal modo que durante la introducción en una célula de vertebrado viviente sea capaz de dirigir la maquinaria celular para producir productos de traducción codificados por el polinucleótido. El término "enlazado operativamente" se refiere a una yuxtaposición en donde los componentes están configurados para efectuar su función usual. Así, los elementos reguladores de la transcripción enlazados operativamente a una secuencia de nucleótidos son capaces de efectuar la expresión de la secuencia de nucleótidos. Aquellos expertos en la técnica pueden apreciar que los diferentes promotores transcripcionales, los terminadores, los vectores portadores o las secuencias específicas del gen pueden ser utilizadas exitosamente. Finalmente, la presente invención se refiere a un inmunoensayo para detectar los anticuerpos de VHC, tal inmunoensayo comprende: (1) proporcionar la partícula oligomérica o la proteína de envoltura de VHC única purificada como se definió aquí, o un equivalente funcional de la misma, (2) incubar una muestra biológica con dicha partícula oligomérica, o dicha proteína de envoltura de VHC bajo condiciones que permitan la formación del complejo de anticuerpo-antígeno, (3) determinar si el complejo de antígeno-anticuerpo comprende la partícula oligomérica o la proteína de envoltura de V?C es formada. La presente invención será ilustrada ahora por la referencia a los siguientes ejemplos los cuales describen las modalidades particularmente ventajosas. Sin embargo, se debe señalar que estas modalidades son solamente ilustrativas y no deben ser interpretadas como que restringen la invención de ninguna manera.

EJEMPLOS Ejemplo 1: Expresión, purificación, y homo-oligomerización auxiliada por un detergen-te, de la proteina El de VHC La proteína Els de VHC (aminoácidos 192-326) se expresó y se purificó a partir de las células RK13 utilizando el virus pvHCV-HA de vaccinia recombinante de acuerdo con el protocolo descrito en Maertens y colaboradores (PCT/EP 95/03031) . Además, la proteína El purificada en Empigen-BB al 3% la cual exhibe un peso molecular aparente que corresponde el homo-dímero de El (de aproximadamente 60 kDa; Figura 1), se agrupó y las fracciones agrupadas fueron aplicadas nuevamente a una columna de cromatografía de exclusión de tamaño (de acuerdo con PCT/EP 95/03031) y se corrió en la presencia de 0.2% de CHAPS o 3% de betaína. Sorprendentemente, aunque la proteína de Els está desprovista de su región de anclaje de la membrana, una población homogénea de los homo-oligómeros de El asociados específicamente con un peso molecular aparente de 260-280 kDa podría ser obtenida con ambos detergentes (Figura 2) . Tal estructura homo-oligomérica podría contener un número aproximado de los monómeros de 9 Els. Debe ser claro que este último es un estimado aproximado de la forma en que el oligómero podría tener una influencia drástica en su peso molecular aparente como se midió por la cromatografía de exclusión de tamaño. Por el cambio desde 0.2% de CHAPS hasta 0.05% de CHAPS y repitiendo el mismo procedimiento, el peso molecular aparente es cambiado adicionalmente más allá de la resolución de la columna (vacío de la columna, > 600 kDa, Figura 3), sugiriendo la formación de partículas. El cambio desde 3% de betaína hasta 0.1% de betaína produjo una población de los oligómeros de Els con un comportamiento similar (datos no mostrados) . Otros detergentes podrían ser elegidos por medio de los cual se podría lograr la oligomerización auxiliada por un detergente, similar. La oligomerización que conduce a la formación de partículas no es única para CHAPS o betaína, puesto que se obtuvieron resultados similares utilizando Tween-20 o Tween-80, u octilglucasida. Además, la remoción adicional del detergente puede ser posible, lo cual puede permitir generar partículas aún más grandes. La presencia de los detergentes, por lo tanto, ya no es necesaria para obtener las partículas. Las partículas pueden ser obtenidas por ejemplo por SCC, sin ningún detergente. Notablemente, un monómero El es de aproximadamente 31 kDa, mientras que un monómero E2 es de aproximadamente 70 kDa. Estos valores, sin embargo, pueden diferir dependiendo del estado de glicosilación de la proteína.

Ejemplo 2: Análisis de las estructuras oligomérica de orden más elevado de las Els por medio de la Dispersión Dinámica de la Luz .

Para confirmar el resultado inesperado de que las partículas han sido creadas, las preparaciones de Els en 0.05% de CHAPS y 0.1% de betaína, preparadas de acuerdo con el ejemplo 1, o en 0.1% de betaína, preparadas por la dilución de las preparaciones en betaína al 0.5%, fueron sometidas a análisis por medio de la dispersión dinámica de la luz (DLS) . La técnica de dispersión dinámica de la luz mide el movimiento Browniano y relaciona éste con el tamaño de las partículas. Mientras más grande sea la partícula, más lento será el movimiento Browniano. La velocidad del movimiento Browniano está definida por una propiedad conocida como el coeficiente de difusión (dado usualmente por el símbolo D) . El tamaño de la partícula es calculado del coeficiente de difusión utilizando la ecuación de Stokes-Einstein: d (H) =kT/3p?D, en la cual d(H) es el diámetro hidrodinámico, k es la constante de Boltzmann, T es la temperatura absoluta, ? es la viscosidad. Notablemente, el diámetro medido es un valor el cual se refiere a como se difunde la partícula dentro de un fluido. Así, el mismo es referido como el diámetro hidrodinámico.

El coeficiente de difusión es derivado de una función de autocorrelación (variación de la fluctuación de la intensidad de la luz con respecto al tiempo) . El instrumento utiliza un correlacionador controlado por computadora para calcular la intensidad de la función de autocorrelación automáticamente. Para medir las distribuciones del tamaño, la función de autocorrelación anterior es corregida para obtener las curvas lineales y el instrumento está equipado con un programa de computadora para el análisis de la distribución del tamaño. Sin embargo, la técnica tiene suposiciones restrictivas similares a aquellas de la técnica llamada dispersión de la luz de rayo láser de ángulos múltiples (MALLS) y ningún método se puede considerar que proporcione datos absolutos. Los resultados de las distribuciones de tamaño desde el DLS tienen que ser interpretados como indicadores semicuantitativos de la polidispersidad, en lugar de como una representación verdadera de la distribución. Las muestras que contienen las partículas de Els (80-400 µg de Els/ml de PBS-0.05% de CHAPS, 0.1% o 0.5% de betaína) fueron pasadas por medio de una pipeta a la celda de medición de un instrumento LPS 3.53 DLS equipado con un Rayo Láser de HeNe de 10 mW (PolymerLabs) . Una lectura del análisis es provista en las Figuras 4 (Els en 0.05% de CHAPS) y 5 (Els en 0.1% o 0.5% de betaína). Estos análisis confirmaron el resultado inesperado de que las estructuras de Els obtenidas fueron partículas monodispersas, esféricas. Las partículas de Els en PBS/0.1% de betaína mostraron una distribución de tamaño promedio de 21.3 + 4 nm, en PBS/0.5% de betaína: 27.9 + 5 nm, mientras que un diámetro de 12.5 fue obtenido para Els en PBS/0.05% CHAPS.

Ejemplo 3: Análisis de la forma y el tamaño por medio de Microscopía Electrónica.

Diez µl de Els (226 µg/ml en PBS/0.05% de CHAPS; y 143 µg/ml en PBS al 3% de betaína) se visualizó con un teñido negativo estándar con 1% de acetato de uranilo sobre rejillas de formvar estabilizadas con carbón. La muestra se aplicó durante 30 segundos y luego se enjuagó con dH20 antes del teñido durante 5 segundos y fotografía (Figura 6) . El análisis estadístico produjo los siguientes resultados: la partícula de Els en CHAPS tuvo un diámetro promedio de 8.7 + 0.27 nm (intervalo de 4.3-29.0; 95% Cl 5.4) y que la partícula de Els en betaína fue menos homogénea con un diámetro promedio de 9.7 + 0.55 nm (intervalo de 4.3-40.5; 95% de Cl 11.0). Sorprendentemente, la preparación de betaína al 3%, la cual mostró inicialmente un PM de 250-300 kDa como se analizó por SEC aún muestra partículas más grandes que la preparación de CHAPS al 0.05%, la cual mostró inicialmente un PM de >600 kDa. Se tiene como hipótesis por lo tanto, que las formas homo-oligoméricas intermedias de Els obtenidas por la betaína al 3% pueden haber formado partículas de orden más elevado durante el transcurso del tiempo. Este efecto sorprendente apunta a otras posibilidades para obtener partículas de orden más elevado. Una distribución de tamaño de las partículas (Figura 7) muestra que la preparación de CHAPS es monodispersa, aunque se observa una adaptación a las partículas de tamaño más grande (de hasta 29 nm para 0.05% de CHAPS). Puesto que las estructuras más grandes son sobreestimadas en los análisis de DLS, la presencia de estos partículas más grandes, aunque de número menor, pueden explicar el diámetro más grande obtenido por el análisis de DLS (ejemplo 2) . La diferencia en el diámetro también puede ser explicada por el hecho de que el DLS mide una partícula en movimiento, mientras que la microscopía electrónica mide las partículas estáticas. Debe ser claro que la inmunogenicidad de estas preparaciones como se muestra en los ejemplos posteriores se debe a la totalidad de la preparación, y se puede deber a las partículas más pequeñas, o más grandes, promedio, o a la mezcla de las mismas .

E emplo : Inmunización de un chimpancé infectado crónicamente con el subtipo Ib del VHC Un chimpancé (Phil) ya infectado durante 13 años (5015 días antes de la inmunización) con una cepa del subtipo Ib del VHC fue vacunado con El (aa 192-326) la cual se derivó de una cepa diferente del genotipo Ib, con una identidad del 95.1% al nivel de los aminoácidos (véase también la Tabla 2), y la cual se preparó como se describe en los ejemplos 1-3. El chimpancé recibió en total 6 inmunizaciones intramusculares de cada uno de 50 µg de El en PBS/0.05% de CHAPS mezclado con RIBI R-730 (MPLA+TDM+CWS) de acuerdo con el protocolo del fabricante (Ribi Inc. Hamilton, MT) . Las 6 inmunizaciones se dieron en dos series de tres inyecciones con un intervalo de tres semanas y con un período de retardo de 6 semanas entre las dos series. Empezando de 150 días previo a la inmunización, durante el período de inmunización y hasta 1 año después de la inmunización (véase posteriormente) , el chimpancé fue verificado continuamente con respecto a varios parámetros indicativos de la actividad de la enfermedad inducida por el V?C. Estos parámetros incluyeron la química sanguínea, ALT, AST, gammaGT, químicas sanguínea, carga viral en el suero, carga viral en el hígado e histología del hígado. Además, la respuesta inmune a la inmunización fue verificada al nivel tanto humoral como celular. Durante este período el animal también fue verificado con respecto a cualesquiera efectos adversos de la inmunización, tales como un cambio en el comportamiento, los síntomas clínicos, el peso corporal, la temperatura y las reacciones locales (enrojecimiento, hinchazón, induraciones). Tales efectos no fueron detectados. Claramente, los niveles de ALT (y especialmente la gammaGT, datos no mostrados) se redujeron tan pronto como el nivel de anticuerpos contra la El alcanzó su máximo (Figura 8) . El ALT rebotó más bien rápidamente tan pronto como los niveles del anticuerpo empezaron a declinar, pero la gammaGT permaneció a un nivel inferior mientras que la anti-El permaneció detectable. El antígeno de E2 en el hígado se redujo a niveles casi indetectables durante el período en el cual la anti-El fue detectable y el antígeno de E2 rebotó brevemente después de la desaparición de estos anticuerpos. Junto con los antígenos de Core y R2 que llegan a ser indetectables en el hígado, la inflamación del hígado se redujo marcadamente (véase también la Tabla 3) . Esto es una prueba principal de que la vacuna induce una reducción del daño en el hígado, probablemente por retiro, al menos parcialmente, de los antígenos virales de su órgano de blanco u objetivo principal, el hígado. El nivel de viremia, como se midió por Amplicor HCV Monitor (Roche, Basel, Suiza) permaneció aproximadamente sin cambio en el suero durante el período de estudio completo. Los análisis más detallados de la respuesta humoral revelaron qué la concentración del punto final máxima alcanzó 14.5 x 103 (después de la sexta inmunización) y que esta concentración disminuyó a indetectable 1 año después de la inmunización (Figura 8). La Figura 9 muestra que los epítopes principales, los cuales pueden ser imitados por los péptidos, reconocidos por las células B, están localizados en la región N-terminal de la E2 (péptidos VIV2 y V2V3, para los detalles sobre los péptidos utilizados véase la Tabla 4). Puesto que la reactividad contra la El recombinante es más elevada y de plazo más prolongado, también se puede deducir de esta Figura, que los anticuerpos que reconocen estos péptidos representan solo una parte de la población de anticuerpos totales contra El. La parte restante está dirigida contra los epítopes los cuales lo pueden ser imitados por los péptidos, es decir los epítopes discontinuos. Tales epítopes solamente están presentes sobre la molécula de El completa o aún solamente en la estructura semejante a la partícula. Tal respuesta inmune contra El es única, al menos comparado con lo que es observado normalmente en los portadores de VHC crónicos humanos (WO 96/13590 de Maertens y colaboradores) y en los chimpancés (van Doorn y colaboradores, 1996), quienes fabricaron o cultivaron los anticuerpos de anti-El en su curso natural de la infección. En estos pacientes, la anti-El también está dirigida en parte a los epítopes discontinuos pero una proporción grande está dirigida contra el epítope de C4 (+50% del suero del paciente) , una proporción menor contra VIV2 (que varía desde 2-70% dependiendo del genotipo) , y la reactividad contra V2V3 solo fue registrada excepcionalmente (Maertens y colaboradores, 1997). El análisis de la reactividad de la célula T indicó que también este compartimiento el sistema inmune es estimulado por la vacuna de una manera específica, porque el índice de estimulación se eleva desde 1 hasta 2.5, y permanece algo elevado durante el período de tratamiento complementario (Figura 10) . Es esta reactividad de la célula T la que es observada solamente en los respondedores a largo plazo (Long) para la terapia de interferona (véase: PCT/EP 94/03555 de Leroux-Roels y colaboradores; Leroux-Roéis y colaboradores, 1996) .

Ejemplo 5 : Inmunización de un portador de VHC crónico con un subtipo diferente Un chimpancé (Ton) ya infectado durante 10 años (3809 días antes de la inmunización) con el genotipo la del VHC se vacunó con la El del genotipo Ib, con solamente un 79.3 % de identidad al nivel de los aminoácidos (véase también la Tabla 2), y se prepararon como se describió en los ejemplos previos. El chimpancé recibió un total de 6 inmunizaciones intramusculares de 50 µg de El en PBS/0.05% CHAPS cada uno mezclado con RIBI R-730 de acuerdo con el protocolo del fabricante (Ribi Inc., Hamilton, MT) . Las 6 inmunizaciones se dieron en dos series de tres inyecciones con un intervalo de tres semanas y con un período de retardo de 4 semanas entre las dos series. Partiendo de 250 días previo a la inmunización, durante el período de inmunización y hasta 9 meses (pero véase posteriormente) después de la inmunización, el chimpancé fue verificado continuamente con respecto a varios parámetros indicativos de la actividad de la enfermedad inducida por el VHC. Estos parámetros incluyeron la química sanguínea, ALT, AST, gammaGT, la carga viral en el suero, la carga viral en el hígado y la histología del hígado. Además, la respuesta inmune a la inmunización se verificó al nivel tanto humoral como celular. Durante este período el animal también fue verificado en busca de cualesquiera efectos adversos de la inmunización, tales como un cambio en el comportamiento, los síntomas clínicos, el peso corporal, la temperatura y las reacciones locales (enrojecimiento, hinchazón, induraciones) . Tales efectos no fueron detectados. Claramente, los niveles de ALT (y los niveles de gammaGT, datos no mostrados) se redujeron tan pronto como el nivel del anticuerpo contra la El alcanzó su máximo (Figura 11) . La ALT y gammaGT rebotaron tan pronto como los niveles del anticuerpo empezaron a declinar, pero el ALT y el gammaGT permanecieron a un nivel inferior durante el período siguiente completo. Los niveles de ALT fueron reducidos significativamente después de la vacunación (62 + 6 U/1) cuando se compara con el período antes de la vacunación (85 + 11 U/1) . Puesto que menos marcadores del daño del tejido fueron recuperados en el suero, estos descubrimientos fueron una primera indicación de que la vacunación indujo una mejora de la enfermedad del hígado. Los niveles del antígeno de E2 llegaron a ser indetectables en el período en el cual la anti-El permaneció arriba de una concentración de 1.0 x 103, pero llegaron a ser detectables nuevamente en el tiempo en el que se redujeron los niveles de anticuerpos de El. Junto con la desaparición de los antígenos del VHC, la inflamación del hígado se redujo marcadamente desde la hepatitis activa crónica moderada hasta las formas mínimas de la hepatitis persistente crónica (Tabla 3) . Esta es otra prueba mayor de que la vacuna induce una reducción del daño del hígado, probablemente por retiro, al menos parcialmente, del virus de su órgano de blanco u objetivo principal, el hígado. El nivel de viremia, como se midió por Amplicor HCV Monitor (Roche, Basel, Suiza), en el suero, permaneció a niveles aproximadamente similares durante el período de estudio completo. El análisis más detallado de la respuesta humoral reveló que la concentración del punto final máxima alcanzada fue de 30 x 103 (después de la sexta inmunización) y que esta concentración se redujo a 0.5 x 103 nueve meses después de la inmunización (Figura 11) . La Figura 12 muestra que los epítopes principales, los cuales pueden ser imitados por los péptidos y son reconocidos por las células B, están localizados en la región N-terminal (péptidos V1V2 y V2V3, para los detalles sobre los péptidos utilizados véase la Tabla 4) . Puesto que la reactividad contra la El recombinante es más elevada y de permanencia más prolongada, la misma también puede ser deducida de esta Figura, que los anticuerpos que reconocen estos péptidos representan solamente parte de la población total de anticuerpos contra El. La parte restante está dirigida más probablemente contra los epítopes los cuales no pueden ser imitados por los péptidos, es decir los epítopes discontinuos. Tales epítopes están presentes solo probablemente sobre la molécula de El completa o aún solamente sobre la estructura semejante a la partícula. Tal respuesta inmune contra la El es única, al menos comparado con lo que es observado normalmente en los portadores de VHC crónicos humanos, los cuales tienen la anti-El detectable. En estos pacientes, la anti-El también es discontinua en parte, pero una gran proporción está dirigida contra el epítope de C4 (50% del suero del paciente) , una proporción menor contra VIV2 (que varía desde 2-70% dependiendo del genotipo) y excepcionalmente se registró una reactividad contra V2V3 (Maertens y colaboradores, 1997) . Cuando este chimpancé es infectado con una substancia aislada de la la respuesta del anticuerpo también fue evaluada para verificar la reactividad cruzada hacia un antígeno la-El. Como se puede observar en la Figura 13, tales anticuerpos de reactividad cruzada son generados realmente, aunque, los mismos forman parte solamente de la población de anticuerpos total. Lo remarcable es la correlación entre la reaparición del antígeno viral en el hígado y la desaparición de los anticuerpos de El anti-la detectables en el suero. El análisis de la reactividad de la célula T indicó que también este compartimiento del sistema inmune es estimulado por la vacuna de una manera específica, porque el índice de estimulación de estas células T se eleva desde 0.5 hasta 5, y permanece elevado durante el período > de tratamiento complementario (Figura 14) .

Ejemplo 6: Reinyección de los portadores crónicos con El Cuando las concentraciones de los anticuerpos de El como se observaron en los ejemplos 4 y 5 no fueron estables y declinaron durante el transcurso del tiempo, aún a los niveles indetectables para el chimpancé infectado con Ib, se investigó si esta respuesta de los anticuerpos podría ser incrementada nuevamente por inyección adicional. Ambos chimpancés fueron inmunizados nuevamente con tres inmunizaciones intramusculares consecutivas con un intervalo de tres semanas (50 µg de El mezclados con el auxiliar de RIBI) . Como se puede juzgar de las Figuras 8 y 11, la respuesta anti-El realmente fue aumentada repentinamente, una vez que el antígeno viral en el hígado se redujo abajo del límite de detección. La carga viral en el suero permaneció constante aunque en Ton (Figura 11) un nivel de viremia de < 105 de equivalentes del genoma por ml fue medida por primera vez durante el período de tratamiento complementario.

Lo notable es el descubrimiento de que, como ya fue el caso para la primera serie de inmunizaciones, el chimpancé infectado con la cepa del VHC del subtipo Ib (Phil) responde con concentraciones inferiores de anti-El, que el chimpancé infectado con la cepa del VHC del subtipo la (concentración máxima en la primera ronda de 14.5 x 103 contra 30 x 103 para Ton y después de la reinyección o aumento repentino adicional de solamente 1.2 x 103 para Phil contra 40 x 103 para Ton) . Aunque para ambos animales el efecto benéfico va a ser similar, se podría concluir de este experimento que la inmunización de un portador crónico con una proteína de El derivada de otro subtipo o genotipo puede ser especialmente benéfica para alcanzar concentraciones más elevadas, lo cual puede evitar una supresión inmune preexistente y específica que ya está presente en el huésped e inducida por el subtipo o genotipo de infección. Alternativamente, las concentraciones inferiores observadas en el ajuste o establecimiento del homólogo (vacuna Ib + infección Ib) pueden indicar la unión del material volumétrico de los anticuerpos al virus. Por lo tanto, los anticuerpos inducidos pueden poseer una capacidad de neutralización.

Ejemplo 7a: Construcción de una proteina de NS3 que combina los epxtopes principales que se sabe que se correlacionan con el control de la infección También otros epítopes además de los primeros en El pueden ser relacionados con el retiro del VHC durante la fase aguda o por terapia con interferona. Varios de estos epítopes están localizados dentro de NS3 (Leroux-Roels y colaboradores, 1996; Rehermann y colaboradores, 1996 y 1997; Diepolder y colaboradores, 1995 y 1997) . Dos de los epítopes principales son el epítope de CTL mapeado o con coordenadas asignadas por Rehermann y cotrabajadores (aa 1073-1081), y el epítope de la célula T (CD4) mapeado o asignado con coordenadas por Diepolder y cotrabajadores (aa 1248-1261) . Desafortunadamente, estos epítopes son dispersados en su totalidad sobre la proteína de NS3. Para tener al menos estos epítopes disponibles, una proteína relativamente grande podría ser necesaria (aa 1073-1454) . La producción de tal proteína grande usualmente conduce a rendimientos bajos, y puede resultar de la vacunación en una respuesta la cual es solamente para una parte pequeña ubicada como blanco para los epítopes importantes. Por lo tanto, la producción de una proteína más pequeña podría ser una solución más adecuada a este problema. Para hacerlo así, algunos de los ep^topes necesitan ser recolocados dentro de tal proteína más pequeña. Aprovechando la ventaja del conocimiento de que existe, es decir otro epítope de CTL (aa 1169-1177) el cual no está relacionado con el retiro del VHC (Rehermann y colaboradores 1996, 1997), una molécula de NS3 fue designada para empezar en aa 1166 y para finalizar en aa 1468 (Tabla 5) . Esta construcción ya incluye los epítopes descritos por Weiner y cotrabajadores, y Diepolder y cotrabajadores. Por la mutación de la región 1167 a 1180 a la secuencia de la región 1071 a 1084, el epítope de CTL no relevante fue cambiado al epítope de Rehermann y cotrabajadores que se encontró que va a estar relacionado con el retiro o despeje viral. La construcción fue modificada adicionalmente para que contenga una metionina en la posición 1166 para permitir el inicio de la traducción. Esta metionina será retirada por segmentación en el E. coli puesto que la misma está seguida por una alanina. De esta manera, la introducción de nuevos epítopes, los cuales no están presente en la NS3 natural, está limitada a un mínimo. Alternativamente si la expresión de esta proteína pudiera ser difícil, el epítope de CTL puede ser enlazado a la terminal o extremidad C en aa 1468 como se muestra con detalle en la Tabla 5. La secuencia de codificación de un fragmento de NS3 del VHC se aisló y se expresó como se describió en Maertens y colaboradores (PCT/EP99/02547; clon 19b; VHC aa 1188-1468 se utilizó como el material de partida) . El epítope de CTL como se describió por Tehermann, y que no está presente en el fragmento NS-3 de 19b fue fusionado a este fragmento. Las fusiones tanto N-terminales como C-terminales fueron construidas, puesto que los efectos de la fusión sobre los niveles de la expresión, la susceptibilidad a la ruptura proteolítica y la funcionalidad pueden ser afectados por la posición del epítope. Utilizando el plásmido de pIGRI2N-3, el cual es un plásmido de expresión de E. coli que expresa el fragmento de NS-3 19b bajo el control del promotor hacia la izquierda del fago lambda, como el molde o modelo para PCR, las secuencias de codificación de NS3 19b, fusionadas N- y C-terminalmente de manera respectiva con el epítope de CTL de Rehermann (nombrado NS-319bTn, respectivamente) , fueron subclonados primero en el vector de clonación de pGEM-T (Promega) dando lugar a los vectores pGEM-TNS-319bTn y pGEM-TNS-319bTc. Las secuencias amplificadas por el PCR fueron verificadas por el análisis de la secuencia del ADN. En el caso de la fusión de la secuencia del epítope de la célula T a la región N-terminal de NS-3, la PCR fue llevada a cabo con un cebador de sentido largo o prolongado que lleva el epítope de CTL y un cebador antisentido corto homólogo con las secuencias 3' del codón de parada de NS-3 19b . Las secuencias del cebador son mostradas posteriormente . Cebador 9038 (sentido) ' 5CCATGGCGACCTG :ATCAACGGTGTTTGCTGGACCsT?TACCACGGTCGTGC GGCTGTTTGCACCCGTGGGGTTsCGAAGGCGGTGG-3' (SEC ID NO 5) Cebador 1901 (antisentido) S'-TTpATCAGACCGCpCTGCG-S' (SEC E> NO 6) En el caso del NS-3 fusionado C-terminalmente, la PCR se llevó a cabo con un cebador de sentido corto homólogo con las secuencias 5' del codón de parada NS-3 19b y un cebador de antisentido largo que lleva el epítope de CTL seguido por los codones de parada en el marco. Las secuencias del cebador son mostradas posteriormente.

Cebador 1052 (sentido) S'-AGCAAACCACCAAGTGGA-S' (SEC ID NO 7) Cebador 9039 (antisentido) S'-CTCTAGACTATTAACCGTGGTAAACGsTCCAGCAAACACCGTTGATGCAGGTC GCCAGGCTGAAGTCGACTGTCTGG-3' (SEC ID NO 8) Partiendo de las secuencias de codificación clonadas en los vectores de pGEM-T, las secuencias NS-3 19bT son insertadas en el vector de expresión de E. coli pIGRI2. Para el NS-3 19bT fusionado N-terminalmente, la secuencia de codificación de NS-3 19bT se aisló como un fragmento de NcoI/SnaBI de 379 pb y se ligó con los fragmentos de SnaBI/AllwNI y AlwNI/NcoI del vector PIGRI2NS-3, conduciendo al vector pIGRI2NS-3Tn. Para el NS--3 19bT fusionado C-terminalmente, la secuencia de codificación de NS-3 19bT se aisló como un fragmento SnaBI/Spel de 585 pb y se insertó en el vector abierto de SnaBI/Spel de pIGRI2NS-3, conduciendo al vector pIGRI2NS-3Tc. Los vectores tanto pIGRI2NS-3Tn como pIGRI2NS-3Tc fueron transformados subsiguientemente a la cepa de expresión de E. coli MC1061(pAcI) y después de la inducción de la temperatura del promotor lambda PL, los niveles de expresión fueron analizados sobre SDS-PAGE y manchado de Western, utilizando un suero de NS-3 anti conejo, policlonal.

Secuencia de aminoácidos de la proteína de NS-3 19bTn MATCINGVCWTV?HGRAAVCTRGVA^ QVAHI_HAPTGSGKSTKVPAAYAAQGYKVLVI^ VRTTI GAPITYSTYGKFI.ADGGCSGGAYDMCDECHSROSTSILGIGT? JDQAI^ VVI \TATPPGSVTVPLFF IEEVAI^STGEIPFYGKAIPIEVIKG^ I^GFGSNAVAYYJIGIIWSVIPTSGDVVVVATDAI^ S (SEC ID NO 1) Secuencia de aminoácidos de la proteína NS-3 19bTc MGVAKAVDFVPVESMETTMRSPVFIDNSSPPAVPQTFQVAHIJíAFrGSs AAQGYKVLVIivp>SVAATI?FGAYMSKA^ GCSGGAYDmCDEC?SroSTSlLGIGTVIJDQAETAGARLVV^ AI^STGFJPFYGKAIPEVIKGGPJIUFCHSKKKC^^ TSGDVV ATDAL?pOFTGDFDSVTOCNTCVTQTVDFSL^^ ID NO 2) Secuencia de Nucleótidos de la región de codificación NS-3 19bTn ATGGCGACC GCATCAACGGTGTTTGCTGGACCGTTTACCACGGTCGTGCGGCTGTT TGCACCCGTGGGGTTGCGAAGGCGGTGGACTTTGTACCCGTAGAGTCTATGGAAACC ACCATGCGGTCCCCGGTCTTTACGGATAACTCATCTCCTCCGGCCGTACCGCAGACA TTCCAAGTGGCCCATCTACACGCCCCCACTGGTAGTGGCAAGAGCACTAAGGTGCCG GCGGCATATGCAGCCCAAGGGTACAAGGTACTTGTCCTGAACCCATCCGTTGCCGCC ACCTTAGGATTCGGGGCGTATATGTCTAAAGCACATGGTGTCGACCCTAACATTAGA ACGGGGGTAAGGACCATCACCACGGGCGCCCCCATTACGTACTCCACCTACGGCAA GTr CTTGCCGACGGTGGTTGCTCTGGGGGCGCTTACGACATCATAATATGTGATGA GTGCCACTCGATTGACTCAACCTCCATCTTGGGCATCGGCACCGTCCTGGATCAGGC GGAGACsGCTGGAGCGCGGCTTGTCGTGCTCGCCACTGCTACACCTCCGGGGTCGGT CACCGTGCCACATCCCAACATCGAGGAGGTGGCTCTGTCCAGCACTGGAGAGATCCC CTpTATGGCAAAGCCATCCCCATCGAGGTCATCAAAGGGGGGAGGCACCTCATTTT CTGCCATTCCAAGAAGAAATGTGACGAGCTCGCCGCAAAGCTATCGGGCTTCGGAA TCAACGCTGTAGCGTATTACCGAGGCCTTGATGTGTCCGTCATACCGACTAGCGGAG ACGTCGTTGTTGTGGCAACAGACGCTCTAATGACGGGCITGACCGGCGAC GTGACT CAGTGATCGACTGTAACACATGCGTCACCCAGACAGTCGACTTCAGCTAA (SEC ID NO 3) Secuencia de nucleótidos de la región de codificación NS-3 19bTc ATGGGGGTTGCGAAGGCGGTGGACNTGTACCCGTAGAGTCTATGGAAACCACC TGCGGTCCCCGGTCTGTACGGATAACTCATCTCCTCCGGCCGTACCGCAGACAT TCCAAGTGSCCCATCTACACGCCCCCACTGGTAGTGGCAAGAGCACTAAGGTGC CGGCTGCATATGCAGCCCAAGGGTACAAGGTACTTGTCCTGAACCCATCCGTTGC CGCCACCTTAGGATTCGGGGCGTATATGTCTAAAGCACATGGTGTCGACCCTAAC ATTAGAACTGGGGTAAGGACCATCACCACGGGCGCCCCCATTACGTACTCCACCT ACGGCAAGTTTCTTGCCGACGSTSGTTGCTCTGGGGSCGCTTACGACATCATAAT ATGTGATGAGTGCCACTCGATTGACTCAACCTCCATCTTGGGCATCGSCACCGTC CTGGATCAGGCGGAGACGGCTGGAGCGCGGCTTGTCGTGCTCGCCACTGCTACA CCTCCGGSGTCGGTCACCGTGCCACATCCCAACATCGAGGAGGTGGCTCTGTCCA GCACTGGAGAGATCCCCTGGTATGGCAAAGCCATCCCCATCGAGGTCATCAAAGG GGGGAGGCACCT'CATTTRCTGCCATTCCAAGAAGAAATGTGACGAGCTCGCCGC AAASCTATCGGSCTTCGGAATCAACGCTGTAGCGTATTACCGAGGCCTTGATGTG TCCGTCATACCGACTAGCGGAGACGTCGTTGTRGTGGCAACAGACGCTCRAA?GA CGGGCTTTACCGGCGACTTTGACTCAGTGATCGACTGTAACACATGCGTCACCCA GACAGTCGACTTCAGCCTGGCGACCTGCATCAACGGTGTTGGCTGGACCGTTTAC CACGGTTAA (SEC ID NO 4) Ejemplo 7b: Purificación de las proteinas NS-3 19bTn y NS-3 19bTc Las pastas de las células de E. coli de los cultivos en el erlen eyer se fragmentaron por medio de un fragmentador de células (CLS, modelo B) a 1.4 kbares en 50 mM TRIS, pH 8. Este lisado se aclaro o despejó por centrifugación (15000 g, 30 minutos, 4 °C) . El sobrenadante se desechó, puesto que ambas de las construcciones de NS3 tanto N- como C-terminales se recuperaron en la forma de microesferas. Estas microesferas se fabricaron para que sean altamente estables para la construcción N-terminal permitiendo un lavado completo (primer lavado con 2% de sarcosilo, 0.5 M de cloruro de guanidinio y 10 mM de DTT, un segundo y tercer lavados con 1% de Tritón X-100, 0.5 M de cloruro de guanidinio y 10 mM de EDTA) antes de la solubilización. Este no fue el caso para la construcción C-terminal. La purificación fue proseguida adicionalmente sobre la construcción N-terminal. Las microesferas lavadas se disolvieron finalmente en cloruro de guanidinio 6 M/50 mM Na2HP?4, a pH 7.2 y se sulfonataron como se describió en Maertens y colaboradores (PCT/EP99/02547) . Las microesferas sulfonatadas se desalaron primero sobre una columna Sephadex G25 a 6 M de Urea/50 mM de trietanolamina, pH 7.5, y finalmente se purificaron por dos cromatografías de intercambio de aniones secuenciales en la misma composición amortiguadora. El primer intercambio de aniones se efectuó sobre una columna Hyper DQ (50 µm) (BioSpra Inc. Marlborough, Ma. EUA) y la NS3 se recuperó entre 0.11 y 0.19 M de NaCl. Después de la dilución, estas fracciones fueron aplicadas a una segunda columna Hyper DQ (20 µm) (BioSpra Inc., Marlborough, Ma. USA) y el NS3 se recuperó en las fracciones que contienen 0.125 M NaCl. Estas fracciones fueron desaladas a 6 M de Urea -en PBS, pH 7.5. La pureza final se estimó en > del 90% con base en SDS-PAGE seguido por el teñido con plata. El secuenciamiento N-terminal por la degradación de EDMAN mostró que esta NS3 tiene un extremo o terminal N intacto, en el cual el epítope deseado está presente en la secuencia correcta. También se confirmó que la metionina utilizada para el inicio de la traducción se segmentó como se describió anteriormente .

Ejemplo 8 : Construcción de una proteina E2 sin la región hxpervariable I Una respuesta homologa inmunodominante ha sido observada con respecto a la región HVR I de E2. Esta respuesta será de uso pequeño en un enfoque de la vacuna, puesto que un enfoque de la vacuna es un establecimiento o una base heteróloga (la cepa de la vacuna siempre es diferente de las cepas silvestres) . Por lo tanto, la deleción de esta región podría ser necesario que tenga una proteína E2 que induzca los anticuerpos contra las regiones de E2 más conservadas, pero menos inmunogénicas. Analizando cuidadosamente la secuencia delantera de E2 y la región hipervariable de E2, la construcción más ideal para la expresión de una proteína E2 sin HVR I fue diseñada. Esta construcción permite la expresión de un péptido de E2 que inicia en la posición aa 409 en lugar de aa 384. Como una secuencia delantera, se utilizaron los 20 aminoácidos C-terminales de El. Sin embargo, puesto que el delineado de este HVR no es inambiguo, se hizo una segunda versión (partiendo de aa 412) la cual también tiene una alta probabilidad de ser segmentada en la posición correcta.

Construcción Intermedia pyHCV-99 (véanse también las Figuras 15 y 16) En el cásete de expresión, la secuencia de codificación de E2-715 debe estar precedida por un péptido de la señal directora de El, partiendo en Met364. Por lo tanto, en el plásmido pvHCV-92 (Figura 15), el cual contiene la secuencia de codificación para el tipo Ib del E2-715 VHC con la versión larga del péptido de la señal de El (partiendo en Met347), se hizo una deleción por una doble digestión con EcoRI y Ncol, seguido por una reacción de llenado sobrecolgante de 5' con la polimerasa del ADN de T4. La unión de los extremos despuntados obtenidos (recircularización del fragmento de 6621 pb) , condujo al plásmido pvHCV-99, el cual codifica la misma proteína (E2-715) con un péptido de la señal directora de El más corta (partiendo en Met364) . El pvHCV-99 se depositó en la lista de las cepas como ICCG 3635. Debe ser claro que las secuencias de la señal de HCV o heterólogas de longitud variable pueden ser utilizadas. Los plásmidos pvHCV-100 y -101 deben contener una deleción en la secuencia de E2, es decir una deleción de la región hipervariable I (HVR-I) . En el plásmido pvHCV-100, los aminoácidos 384 (His) -408 (Ala) fueron delecionados, mientras que en el plásmido pcHCV-101 los aminoácidos 384 (His) -411 (lie) fueron delecionados.

Construcción de pyHCV-100 Para la construcción del pvHCV-100, se diseñaron dos oligonucleótidos: HCV-pr 409 [8749] : 5' -CTT TGC CGG CGT CGA CGG GCA GAA AAT CCA GCT CGT AA-3' (SEC ID NO 9) HCV-pr 408 [8750] 5' -TTA CGA GCT GGA TTT TCT GCC CGT CGA CGC CGG CAÁ AG-3' (SEC ID NO. 10) La amplificación por PCR (desnaturalización de 5 minutos a 95 °C, 30 ciclos de amplificación que consisten del recocido a 55 °C, polimerización a 72 °C, y desnaturalización a 95 °C durante 1 minuto cada uno, prolongación durante 10 minutos a 72 °C) del molde o modelo de pvHCV-99 con Gpt-pr [3757] y HCV-pr 408 [8750] condujo a un fragmento de 221 pb, mientras que la amplificación con HCV-pr 409 [8749] y TKr-pr [3756] condujo a un fragmento de 1006 pb. Ambos fragmentos de PCR están superpuestos entre sí por 19 nucleótidos. Estos fragmentos fueron ensamblados y amplificados por PCR con los cebadores Gpt-pr [3757] y Tkr-pr [3756] . El fragmento de 1200 pb resultante se digirió con EcoRI e HinDIII y se unió en el EcoRI/HinDIII digerido con el vector pgsATAld [ICCG 1998] (5558 pb) . Esta construcción, la pvHCV-100, se analizó por el análisis de restricción y de la secuencia, y se depositó en la lista de las cepas como ICCG 3636.

Construcción de pyHCV-101 Para la construcción del pvHCV-101, se diseñaron dos oligonucleótidos : HCV-pr 411 [8747] : 5' -CTT TGC CGG CGT CGA CGG GCA GCT CGT AAA CAC CAÁ CG-3' (SEC ID NO 11) HCV-pr 410 [8748] : 5' -CGT TGG TGT TTA CGA GCT GCC CGT CGA CGC CGG CAÁ AG-3' (SEC ID NO. 12) La amplificación por PCR del molde o modelo de pvHCV-99 con Gpt-pr [3757] y HCV-pr 410 [8748] condujo a un fragmento de 221 pb, mientras que la amplificación con HCV-pr 411 [8747] y TKr-pr [3756] condujo a un fragmento de 997 pb. Ambos fragmentos de PCR están superpuestos entre sí por 19 nucleótidos. Estos fragmentos fueron ensamblados y amplificados por PCR con los cebadores Gpt-pr [3757] y Tkr-pr [3756] . El fragmento de 1200 pb resultante se digirió con EcoRI e HinDIII y se unió en el EcoRI/HinDIII digerido con el vector pgsATAld [ICCG 1998] (5558 pb) . Esta construcción, la pvHCV-101, se analizó por el análisis de restricción y de la secuencia, y se depositó en la lista de las cepas como ICCG 3637. Todos los plásmidos fueron verificados por el análisis de la secuencia y depositados en la lista de las cepas de Innogenetics. Para cada plásmido se hicieron dos preparaciones de mini-ADN (PLASmix) bajo condiciones estériles y se agruparon. La concentración del ADN se determinó y se efectuó la QA por el análisis de restricción. El ADN purificado fue utilizado para generar el virus de vaccinia recombinante como se describe en Maertens y colaboradores (PCT/EP95/03031) . Los virus recombinantes de wHCV-100 y wHCV-101 sin embargo, fueron generados sobre células Vero certificadas con WHO. Después de dos rondas de purificación de la placa, el producto de la expresión se analizó por medio del análisis de manchado de Western como se describió en Maertens y colaboradores (PCT/EP95/03031) . Las proteínas fueron visualizadas por el anticuerpo monoclonal anti-E2 específico (IGH 212, el cual puede ser obtenido de los inventores en Innogenetics N.V., Zwijnaarde, Bélgica) de un peso molecular estimado de 69 y 73 kDa para wHCV-100 y de 68 y 35 kDa para wHCV-101. Estos pesos moleculares indican la presencia de una proteina de E2 tanto glicosilada como no glicosilada, lo cual se confirmó por el tratamiento de las muestras previo al análisis del manchado de Western con PNGaseF. Este tratamiento condujo a la detección de solamente una proteína única de 37 kDa y de 35 kDa para wHCV-100 y wHCV-101, respectivamente.

Secuencia de aminoácidos de la E2 madura, derivada de pyHCV-100 WGPLTYTEPNSSDQRPYCWHYAPRPCGIVPASQVCGPVYC IPSPVVVGTTDRFsVPTY NWGANDSDVIJUWTRPPRGNWGCTWMNGTGF FRKHPF TYARCGSGPWLTPRCMVHYPYRLWHYPCTVNFTIF?^^ CNWTRGERCD EDRDRSEI^P J^TTEWQIIi^^ VGSAWSLVIK (SEC ID NO 13) Secuencia de aminoácidos de la E2 madura derivada de pyHCV-101 QLVNmGSWHJN TAIJrc^SL ^ P ?TEPNSSDQRPYCWHYAPRPCGIVPASQVCGPVY ?rPSPVVVGTIDRFGVPTYN GAMDSDVLIIJ^NTRPPRGNWFGCTWMN^^ Kl^EATYARCGSGPWLTPRCMVHYPYRLWHYPCTVlNJF^ NWptGE O)I^RDRSEI PI _I Ttr?WQ GSAWS VIK.(SEC ID NO 14) Ejemplo 9: Una particula de El con una inmunogenicidad mejorada adicional Como se describe en el ejemplo 1, la proteína Els se purificó de acuerdo con el protocolo descrito en PCT/EP95/03031 de Maerts y colaboradores. Este protocolo incluye la modificación covalente de las cisteínas (cisteínas libres y cisteínas involucradas en el puenteo intermolecular, esto último después de la reducción de los puentes de cisteína utilizando DTT) utilizando los derivados de maleimida (N-metil maleimida y biotinin-maleimida, ambas obtenidas de Sigma) . Como un método alternativo para el bloqueo de la maleimida, también se evaluaron los halógenos activos. Estos compuestos, es decir los halógenos activos, bloquean las cisteínas libres por medio de la alquilación. A manera de ejemplo, un halógeno activo (yodoacetamida, Merck) fue evaluado. El mismo protocolo se utilizó para purificar la El como se describió en Maertens y colaboradores (PCT/EP 95/03031) pero en lugar de los compuestos de maleimida, se utilizó la yodoacetamida. Las proteínas de Els obtenidas por este procedimiento se comportaron de principio a fin del procedimiento de purificación completo de manera similar que las proteínas bloqueadas con maleimida. Durante la reducción final de la concentración del detergente hasta 0.05% de CHAPS o el cambio a 0.5% de betaína como se describió en el ejemplo 1, se obtuvieron partículas similares como se determinó por DLS. Se encontró un efecto sorprendente, sin embargo, durante la inmunización de los ratones con estas Els modificadas con acetamida. En total tres series de 6 ratones fueron inmunizados cada uno con Els utilizando tres inyecciones con un intervalo de tres semanas, cada inyección que consiste de 5 µg de Els a 100 µg/ml de PBS y se mezcló con un volumen igual de auxiliar RIBI (R-700) . Una primera serie recibió la El-maleimida formulada en 0.05% de CHAPS, una segunda serie recibió la El-acetamida también formulada en 0.05% de CHAPS, mientras que una tercera serie recibió la El-acetamida formulada con 0.12% de betaína. Finalmente, a todos los ratones se les extrajo sangre 10 días después de la tercera inmunización. Las concentraciones del punto final (definidas como la dilución del suero todavía conducen a una OD dos veces más elevada que los valores base o del fondo) para cada animal fueron determinadas individualmente contra la El-maleimida y la El-acetamida. La Figura 17 muestra estas concentraciones del punto final, presentadas como el promedio con las desviaciones estándares. Los ratones que recibieron la El-maleimida montaron o mostraron solamente una respuesta de anticuerpos la cual es capaz de reconocer los epítopes que contienen la maleimida (ninguna reactivada en su totalidad sobre la El-acetamida) , los ratones que recibieron la El-acetamida claramente montan o muestran una respuesta de anticuerpos contra los epítopes de El verdaderos, puesto que los anticuerpos fueron reactivos contra la El-acetamida y El-maleimida. Esto se demostró claramente en un experimento adicional, en el cual los anticuerpos para las regiones específicas de El fueron determinadas utilizando los péptidos los cuales no fueron modificados con acetamida ni con maleimida. Los resultados, como se muestra en la Figura 18, demuestran que los ratones inmunizados con El-acetamida (formulados con CHAPS y betaína) montan una respuesta de anticuerpos la cual es capaz de reconocer los péptidos VIV2, V2V3, V3V4, V5C4, C4V6. Como V6 no fue parte de las Els, se puede concluir que los anticuerpos fueron montados o realzados contra C4, V3 (V3V4 es positivo mientras que V4V5 no lo es) VIV2. Los ratones inmunizados con la Els-maleimida montan o muestran solamente una respuesta muy tenue contra los péptidos V1V2 y V2V3. Esto refuerza una vez más el hecho de que una concentración razonablemente elevada medida para estos anticuerpos de ratón contra la maleimida-Els está dirigida principalmente contra los epítopes dependientes de la maleimida. Además, los inventores fueron capaces de probar que la respuesta inducida por la Els-acetamida es particularmente del tipo Thl, puesto que una cantidad substancial de los anticuerpos inducidos es del subtipo IgG2(a+b). la cantidad de IgG2 es aún más elevada para la formulación de betaína comparado con la formulación de CHAPS (Figura 19) . A partir de estos resultados se concluye que las proteínas de envoltura de VHC, en las cuales al menos una cisteína (pero potencialmente más de una cisteína) es alquilada, son proteínas extremadamente inmunogénicas . En consecuencia, la El modificada con acetamida formulada en betaína, también fue utilizada para reinyectar o volver a inyectar a los chimpancés Phil y Ton. Ambos chimpancés fueron inmunizados nuevamente con dos inmunizaciones intramusculares consecutivas con un intervalo de tiempo de tres semanas (50 µg de El mezclados con el auxiliar RIBI para los ejemplos 4 y 5) . Como se puede juzgar de las Figuras 20 y 21, la respuesta anti-El podría ser inyectada o aumentada repentinamente de manera real nuevamente, y esto a niveles más elevados que los obtenidos en las inmunizaciones previas después de dos inyecciones. Esta concentración fue efectuada contra un estándar, el cual es una mezcla de tres sueros anti-El de concentración elevada, humanos (obtenidos de los portadores de VHC crónicos) . La concentración anti-El de estos sueros fue definida como una unidad/ml . En el chimpancé Phil (Figura 20), las concentraciones dos veces tan elevadas como en los portadores humanos fueron inducidas solamente después de dos inmunizaciones. En el chimpancé Ton (Figura 21), las concentraciones de hasta 140 veces más elevadas fueron inducidas. Esto refuerza una vez más la alta inmunogenicidad de estas partículas de El.

Ejemplo 10: La El alquilada tiene cualidades superiores para el uso en el diagnóstico La Els-acetamida como se describió en el ejemplo 9 se evaluó adicionalmente como el antígeno para la detección de los anticuerpos de anti-El en las muestras de suero de los portadores de VHC crónicos, humanos. A manera de ejemplo estos antígenos fueron unidos a las membranas de LIA, y las tiras fueron procesadas esencialmente como se describió en Zrein y colaboradores (1998) . Las muestras del suero de 72 donadores de sangre fueron evaluadas primero, para determinar la concentración óptima del antígeno El el cual puede ser utilizado en el ensayo para excluir los valores positivos "falsos". Para la Els-maleimida, esta concentración probó que va a ser de 8 µg/ml, aunque para la Els-acetamida una concentración de hasta 50 µg/ml no conduce a resultados positivos falsos (ninguna de las muestras exhibe un teñido de color relativo arriba de 0.5). Utilizando 8 y 50 µg/ml, respectivamente, para la Els-maleimida y la Els-acetamida de los portadores crónicos de VHC, los sueros de los portadores crónicos de VHC fueron seleccionados para los anticuerpos contra Els. Como se muestra en la Tabla 6, la Els-acetamida condujo claramente a más muestras de evaluación positiva (67% contra 38% para la Els-maleimida) . Ninguna muestra se encontró que solamente se evaluara como positiva sobre la Els-maleimida. Para las muestras de evaluación positiva sobre tanto la Els-maleimida como sobre la Els-acetamida, la reactividad de esta última es más elevada. A partir de este ejemplo se puede concluir que las proteínas de envoltura alquiladas del VHC son mejores antígenos para detectar los anticuerpos humanos que las proteínas de envoltura modificadas con la maleimida.

Ejemplo 11 : Producción de las partículas mezcladas que contienen El y E2 Las Els y las E2s (wHCV-44) fueron producidas y purificadas como se describió en Maertens y colaboradores PCT/EP95/030301 excepto por el hecho de que la modificación de maleimida se reemplazó por alquilación utilizando la yodoacetamida. Las Els y E2s en 3% de mepigen solo o como una mezcla equimolar se inyectaron sobre una columna Superdex-200 PC 3.2/30 equilibrada en PBS/0.2% CHAPS. Esta columna está diseñada para su uso con el equipo de CLAR SMART® de Pharmacia LKB (Suecia) . Las fracciones fueron seleccionadas por medio de tres ELISAS de emparedado diferentes. Para estas ELISAs, las (IGH 207) y E2 (IGH 223) específicas monoclonales fueron recubiertas a 2 µg/ml. Las fracciones de la filtración con un gel fueron incubadas a una dilución de 1/2500. Otros dos de El (IGH 200) y E2 (IGH 212) monoclonales, conjugadas con biotina fueron utilizadas para la detección del antígeno unido. El sistema de estreptavidina-HRP/TMB se utilizó para desarrollar o revelar la biotina unida en un color amarillo la cual se midió a 450 nm. Este sistema ELISA se utilizó en una preparación o disposición homologa (detección anti-El/recubrimiento anti-El o detección anti-E2/recubrimiento anti-E2) y una preparación o disposición heteróloga (detección anti-E2/recubrimiento anti-El) . Esta última teóricamente solo detecta partículas en las cuales tanto El como E2 son incorporadas. Las fracciones reactivas fueron agrupadas, concentradas sobre un filtro de lOkDa, y nuevamente sometidas a cromatografía sobre Superdex-200 en PBS/0.05% CHAPS. Todas estas fracciones fueron probadas para la reactividad utilizando las preparaciones o disposiciones de ELISA diferentes. Como se puede juzgar de la Figura 22, la adición de E2 a El no conduce a un desplazamiento o cambio mayor en el tiempo de retención, comparado con El sola, indicando que las partículas realmente todavía están presentes. Estas partículas contienen tanto El como E2, puesto que solo en esta preparación o disposición las evaluaciones de ELISA heterólogas serán positivas.

Ejemplo 12 : Producción de las partículas mezcladas que contienen El de 2 diferentes genotipos Las Els del genotipo Ib y del genotipo 4 (wHCV- 72) fueron producidas y purificadas como se describió en Maertens y colaboradores, PCT/EP95/03031, excepto por el hecho de que la modificación de maleimida se reemplazó por alquilación utilizando la yodoacetamida para el genotipo Ib. Las Els-lb y las Els-4 en empigen al 3% solas o como una mezcla equimolar fueron inyectadas sobre una columna Superdex-200 PC 3.2/30 equilibrada en PBS/0.2% CHAPS. Esta columna está diseñada para su uso con el equipo de CLAR SMART® de Pharmacia LKB (Suecia) . Las fracciones que contienen la proteína principal fueron agrupadas, concentradas sobre un filtro de 10 kDa, y nuevamente se sometieron a cromatografía sobre Superdex-200 en PBS/0.5% CHAPS. Todas estas fracciones fueron probadas para verificar la reactividad utilizando una preparación de ELISA la cual solamente debe detectar las partículas que contienen la El de ambos genotipos. Para este ELISA la estreptavidina se recubrió a 2 µg/ml. Las fracciones de filtración en el gel fueron incubadas en una dilución 1/2500. Un anticuerpo monoclonal de El (IGH 200) el cual solamente reconoce la El de los genotipos 1 y 10 se utilizó para la detección del antígeno unido. El sistema de TMB/HRP de cabra-anti-ratón se utilizó para el desarrollo del ensayo en un color amarillo el cual se midió en 450 nm. Como se puede juzgar de la Figura 23, la adición de El-4 a El-lb no conduce a un cambio mayor en el tiempo de retención de las proteínas, indicando que las partículas realmente todavía están presentes. Estas partículas contienen tanto las proteínas de El, es decir las Els del genotipo Ib y del genotipo 4, puesto que solamente en esta preparación o disposición el ELISA se evaluó como positivo.

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Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una particula oligomérica, caracterizada porque consiste esencialmente de las proteínas de envoltura de V?C y porque tiene un diámetro de 1 a 100 nanómetros.

2. Una particula oligomérica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque tiene un diámetro de 2 a 40 nanómetros.

3. Las partículas oligoméricas de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizadas porque la secuencia de aminoácidos de la proteína de envoltura de VHC es una secuencia de consenso derivada de una secuencia de consenso de una substancia aislada, de un subtipo, de una cepa, o de un género.

4. La partícula oligomérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque posiblemente contiene epítopes diferentes de VHC.

5. La partícula oligomérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque al menos un residuo de cisteína de dicha proteína de envoltura está alquilado.

6. La partícula oligomérica de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el residuo de cisteína es alquilado por medio de los halógenos activos, la etilenimina o la N- (yodoetil) trifluoroacetamida.

7. La partícula oligomérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque al menos un residuo de cisteína de la proteína de la envoltura es mutado a un aminoácido natural, seleccionado preferentemente del grupo que consiste de metionina, ácido glutámico, glutamina y lisina.

8. La partícula oligomérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque las proteínas de la envoltura son las proteínas El de VHC o partes de la misma.

9. Las partículas oligoméricas de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizadas porque las proteínas de la envoltura son proteínas Rls de VHC o partes de las mismas.

10. Una partícula oligomérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque las proteínas de la envoltura son proteínas E2 sw VHC o partes de las mismas.

11. La partícula oligomérica de conformidad .con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque las proteínas de la envoltura son de la SEC ID No. 13 y/o de la SEC ID No. 14, o partes de las mismas.

12. La partícula oligomérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizada porque las proteínas de la envoltura son codificadas por una secuencia de consenso del nucleótido aislado, una secuencia de consenso del nucleótido del subtipo, la secuencia de consenso del nucleótido de la especie, o la secuencia de consenso del nucleótido del género, o partes de la misma. '

13. Una partícula oligomérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones l a 7, caracterizada porque las proteínas de la envoltura son una mezcla de las proteínas de El de VHC, Els de VHC, E2 de VHC y/o de la SEC ID No. 13 y/o la SEC ID No. 14 o partes de las mismas.

14. La partícula oligomérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizada porque las proteínas de la envoltura, o partes de las mismas, son derivadas de las diferentes cepas o genotipos de VHC.

15. La partícula oligomérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizada porque las proteínas de la envoltura, o las partes de las mismas, son una mezcla que consiste de las proteínas de la envoltura de VHC desde una cepa o genotipo del VHC y al menos otra cepa o genotipo de VHC.

16. La partícula oligomérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, que se puede obtener por un método caracterizado por los siguientes pasos: I - purificar las proteínas de envoltura de VHC en solución, - incluyendo posiblemente el uso de un primer detergente de manera opcional, - incluyendo posiblemente el uso de un agente de segmentación del enlace de disulfuro, - incluyendo posiblemente el uso de un agente de alquilación, II - reemplazar la solución de las proteínas de envoltura de VHC purificadas con un detergente o sal, conduciendo a partículas oligoméricas, III purificar las partículas oligoméricas formadas después del reemplazo, incluyendo posiblemente reducir adicionalmente la concentración del detergente o la sal del paso II.

17. La partícula oligomérica de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque el primer detergente opcionalmente es un Empigen BB, en donde el detergente del paso II es CHAPS, octilglucasida, Tween, o cualquier otro detergente, y en donde la sal es la betaína.

18. La partícula oligomérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 o 17, caracterizada porque el Empigen-BB es utilizado a una concentración de 1% al 10% y en donde el CHAPS o Tween es utilizado a una concentración de 0.01% a 10%, o la betaína es utilizada a una concentración de 0.01% a 10%.

19. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, caracterizado porque se utiliza para producir las partículas oligoméricas de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.

20. Un método para producir una partícula oligomérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado por los siguientes pasos: I - purificar las proteínas de envoltura de VHC en solución, posiblemente incluir el uso de un primer detergente opcionalmente, posiblemente incluir el uso de un agente de segmentación del enlace de disulfuro, - posiblemente incluir el uso de un agente de alquilación, II - reemplazar la solución de las proteínas de envoltura de VHC purificadas con un detergente o una sal, conduciendo a las partículas oligoméricas, III - purificar las partículas oligoméricas formadas después del reemplazo, - posiblemente incluir además la reducción de la concentración del detergente o la sal del paso II.

21. Un método para producir una partícula oligomérica de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el primer detergente opcionalmente es el Empigen-BB, en donde el detergente del paso II es CHAPS, octilglucasida, Tween, o cualquier otro detergente, y en donde la sal es la betaína.

22. Un método para producir una partícula oligomérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 o 21, caracterizado porque el Empigen-Bb es utilizado a una concentración de 1% hasta 10% y en donde el CHAPS o el Tween es utilizado a las concentraciones de 0.01% hasta 10%, o la betaína es utilizada a una concentración de 0.01% hasta 10%.

23. Una composición, caracterizada porque comprende una partícula oligomérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22.

24. Una composición de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque también comprende la proteína del núcleo del VHC, de P7, El, E2, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A y/o NS5B, o partes de la misma.

25. Una composición de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque la proteína de NS3, o las partes de la misma, tienen una secuencia de aminoácidos dada por la SEC ID No. 1 o la SEC ID No. 2.

26. El uso de la partícula oligomérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25 para la fabricación de una composición de vacuna de VHC.

27. El uso de la partícula oligomérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25 para inducir una inmunidad contra el VHC en los portadores de VHC crónicos.

28. El uso de la partícula oligomérica de conformidad con la reivindicación 17, para inducir la inmunidad contra el VHC en los portadores de VHC crónicos previo a, simultáneamente con o después de cualquier otra terapia.

29. El uso de la partícula oligomérica de conformidad con la reivindicación 27 para inducir una inmunidad contra el VHC en los individuos infectados con VHC previo a o después del transplante de hígado, o después de una infección presumida.

30. El uso de la partícula oligomérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28 para inducir profilácticamente una inmunidad contra el VHC.

31. El uso de la partícula oligomérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28 para inducir una inmunidad contra el VHC, en donde la partícula oligomérica o la composición es utilizada como una parte de una serie del tiempo y los compuestos.

32. La partícula oligomérica o la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, caracterizada porque se usa como una vacuna contra el VHC.

33. La partícula oligomérica o la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, caracterizada porque induce una inmunidad contra el VHC en los portadores de VHC crónicos .

34. La partícula oligomérica o la composición de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada porque induce una inmunidad contra el VHC en los portadores de VHC crónicos previo a, simultáneamente con o después de cualquier otra terapia.

35. La partícula oligomérica o la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25 para inducir una inmunidad contra el VHC, caracterizada porque induce una inmunidad contra el VHC en los individuos infectados con el VHC previo a o después del trasplante del hígado.

36. La partícula oligomérica o la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, caracterizada porque induce profilácticamente una inmunidad contra el VHC.

37. La partícula oligomérica o la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25 para inducir una inmunidad contra el VHC, caracterizada porque la partícula oligomérica es parte de una serie en el tiempo y de los compuestos .

38. Una proteína, caracterizada porque es una envoltura del VHC única, purificada.

39. La proteína de envoltura de VHC única, purificada, de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada porque la proteína de la envoltura es El o Els.

40. Una composición, caracterizada porque contiene la proteína de envoltura de VHC única, purificada, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 38 o 39.

41. La composición de conformidad con la reivindicación 40, caracterizada porque se usa como una vacuna contra el VHC.

42. El uso de la composición de conformidad con la reivindicación 40 como una vacuna contra el VHC.

43. El uso de la composición de conformidad con la reivindicación 40 para la fabricación de una vacuna contra el VHC.

44. Los anticuerpos específicos, caracterizados porque son generados contra la partícula oligomérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, o contra la proteína de envoltura de VHC única, purificada, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 38 a 40.

45. El uso del anticuerpo específico de conformidad con la reivindicación 44, para tratar o prevenir la infección por VHC.

46. Un juego o conjunto para detectar los antígenos del VHC, caracterizado porque comprende el anticuerpo específico de conformidad con la reivindicación 44.

47. Un juego o conjunto para detectar los anticuerpos de VHC presentes en una muestra biológica, caracterizado porque comprende la partícula oligomérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, o la proteína de envoltura de VHC única, purificada, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 38 a 40, en un recipiente adecuado.

48. Un juego o conjunto para detectar la respuesta de la célula T relacionada con el VHC, caracterizado porque comprende la partícula oligomérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, o la proteína de envoltura de VHC única, purificada, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 38 a 40.

49. Un inmunoensayo para detectar el anticuerpo de VHC, el inmunoensayo está caracterizado porque comprende : (1) proveer la partícula oligomérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, o la n7 proteína de envoltura de VHC única, purificada, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 38 a 40, o las partes de la misma, (2) incubar una muestra biológica con dicha partícula oligomérica, o la proteína de envoltura del VHC bajo condiciones que permitan la formación de un complejo de anticuerpo-antígeno, (3) determinar si el complejo de antígeno-anticuerpo que comprende la partícula oligomérica o la proteína de envoltura del VHC, se ha formado.