MXPA00007675A

MXPA00007675A - Conversion enzimatica de manosa-gdp a fucosa-gdp.

Info

Publication number: MXPA00007675A
Application number: MXPA00007675A
Authority: MX
Inventors: Eric R Sjoberg
Original assignee: Neose Technologies Inc
Priority date: 1998-01-15
Filing date: 1999-01-15
Publication date: 2002-04-24
Also published as: ATE408697T1; AU760626B2; US20030134403A1; US20060234354A1; CA2318377A1; US20030143567A1; US6500661B1; US7247456B2; JP2004512002A; AU2321799A; EP1045916A1; WO1999036555A1; US7026142B2; EP1045916B1

Abstract

Esta invencion proporciona metodos para la conversion enzimatica de manosa FDP a fucosa-GDP. Estos metodos son utiles para la sintesis eficiente de reactivos usados en la sintesis de oligosacaridos fucosilados.

Description

CONVERSIÓN ENZIMÁTICA DE MANOSA-GDP A FUCOSA-GDP ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Campo de la Invención La presente invención se relaciona a la síntesis de oligosacáridos. En particular se relaciona con la síntesis enzimática mejorada de la fucosa-GDP, que puede usarse en las reacciones de fucosilación. Los métodos hacen posible la síntesis del complejo de oligosacáridos fucosilados en un solo recipiente usando materiales iniciales fácilmente disponibles.

Arte Previo La comprensión del rol de los carbohidratos como elementos de reconocimiento en la superficie de las células se ha dirigido al interés en la producción de moléculas de carbohidratos de estructura definida. Por ejemplo, los compuestos que comprenden los ligandos de Lewis sialilos, de Lewisx sialilos y Lewis3 sialilos están presentes en las líneas celulares leucocitas y no leucocitas que se enlazan a los receptores tales como el ELAM-1 y los receptores GMP 140. Polley et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88: 6224 (1991 ) y Phillips et al., Science, 250: 1130 (1990), ver también, USSN 08/063,181. Debido al interés en la fabricación de estructuras de carbohidratos deseadas, actualmente se están estudiando las glicosiltransferasas y su rol en la síntesis catalizada mediante enzimas de carbohidratos. Estas enzimas exhiben alta especificidad y son útiles en la formación de estructuras de carbohidratos de secuencia definida. Consecuentemente, las glicosiltransferasas son cada vez más usadas como catalizadores enzimáticos en la síntesis de un número de carbohidratos usados para propósitos terapéuticos y otros propósitos. En la aplicación de enzimas al campo de la química de carbohidratos sintéticos, el uso de glicosiltransferasas para la síntesis enzimática de carbohidratos ofrece ventajas en los métodos químicos debido a su estereoselectividad virtualmente completa y el enlace específicamente proporcionado por las enzimas (Ito et al., Puré Appl. Chem., 65:753 (1993) y las Patentes de E.U.A. 5,352,670 y 5,374,541 ). Sin embargo, la producción a escala comercial de los compuestos carbohidratos es a menudo complicada por el costo y dificultad en la obtención de reactivos que se usan en la síntesis química y enzimática de los carbohidratos. Los métodos mejorados para la síntesis enzimática de los compuestos carbohidratos y los precursores usados en éstas síntesis, avanzarían la producción de un número de compuestos beneficiosos. La presente invención satisface éstas y otras necesidades.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona métodos, vectores de expresión y mezclas de reacción que son útiles para la producción eficiente de oligosacáridos fucosilados. La invención proporciona rutas por las cuáles los azúcares nucleótidos tales como la fucosa-GDP pueden formarse relativamente a bajo costo. En una primera modalidad, la invención proporciona vectores de expresión que incluyen un promotor operablemente enlazado a un ácido nucleico que codifica una enzima procariótica que tiene una actividad reductasa y una epimerasa. Estas dos actividades catalizan la conversión de 4-ceto-6- deoximanosa-GDP a fucosa-GDP. En otra modalidad, la invención proporciona mezclas de reacción para la síntesis de la fucosa-GDP. Las mezclas de reacción incluyen la 4-ceto-6- deoximanosa-GDP, el NADPH o NADH y una enzima procariótica que tiene una actividad reductasa y una epimerasa. La enzima procariótica puede catalizar la conversión de 4-ceto-6-deoximanosa-GDP a fucosa-GDP. En una modalidad actualmente preferida, la 4-ceto-6-deoximanosa-GDP se forma mediante: a) proporcionar una mezcla de reacción que comprende manosa-GDP, manosa-4,6- dehidratasa GDP y NADP+ e b) incubar la mezcla de reacción por un tiempo suficiente para convertir al menos aproximadamente 90% de la manosa-GDP a 4- ceto-6-deoxi manosa-G D P . Otra modalidad de la invención proporciona métodos para la conversión enzimática de manosa-GDP a fucosa-GDP. Estos métodos involucran: a) proporcionar una mezcla de reacción que comprende manosa-GDP, mañosa 4,6-dehidratasa GDP (GMD) y NADP+; b) incubar la mezcla de reacción por un tiempo suficiente para convertir al menos aproximadamente 90% de la manosa-GDP a 4-ceto-6- deoximanosa-GDP. c) Agregar a la mezcla de reacción uno o más polipéptidos que tienen actividades 4-ceto-6-deoxi mañosa 3,5-epimerasa GDP y 4-ceto-6- galactosa reductasa GDP y d) Incubar la mezcla de reacción por un tiempo suficiente para convertir la 4-ceto-6-deoximanosa-GDP a fucosa-GDP.

También se proporcionan métodos para la síntesis enzimática de un oligosacárido fucosilado. Estos métodos involucran transferir una fucosa de la fucosa-GDP producida mediante los métodos de la invención a un sacárido aceptor. Esto puede lograrse mediante los siguientes etapas adicionales: e) agregar una fucosiltransferasa y el sacárido aceptor a la 4-ceto-6-deoxi manosa-GDP producida en la etapa b) o a la fucosa-GDP producida en la etapa d) y f) incubar una mezcla de reacción por un tiempo suficiente para transferir la fucosa de la fucosa-GDP al sacárido aceptor. Modalidades adicionales proporcionan métodos por los cuales se puede generar la fucosa-GDP iniciando a partir de mañosa. Estos métodos involucran el uso de un sistema enzimático para convertir la mañosa en manosa-GDP, que posteriormente se convierte a fucosa-GDP usando los métodos anteriores. La conversión de la mañosa a manosa-GDP involucra las siguientes enzimas: hexoquinasa, que convierte la mañosa a manosa-6-fosfato; fosfomanomutasa, que convierte la manosa-6-fosfato a manosa-1 -fosfato y la pirofosforilasa manosa-GDP que convierte la manosa-1 -fosfato a manosa-GDP. Mediante la invención también se proporcionan métodos para la síntesis de un oligosacárido fucosilado en los cuales se usan las etapas de mejoramiento de la eficiencia. Los métodos involucran contactar un sacárido aceptor con una mezcla de reacción de fucosilación que comprende fucosa-GDP y una fucosiltransferasa que transfiere la fucosa de la fucosa-GDP para proporcionar dicho oligosacárido fucosilado, en donde la eficiencia de dicha fucosilación se mejora mediante una o más etapas de mejoramiento de la eficiencia seleccionadas del grupo que consiste de: 1 ) formar dicha fucosa-GDP mediante la conversión enzimática de la manosa-GDP a fucosa-GDP mediante: a) proporcionar una mezcla de reacción que comprende manosa-GDP, manosa-GDP 4,6-dehidratasa y NADP+; b) incubar la mezcla de reacción por un tiempo suficiente para convertir al menos aproximadamente 90% de la manosa- GDP a 4-ceto-6-deoximanosa-GDP; c) agregar al producto de la etapa b) uno o más polipéptidos que tengan actividades 4-ceto-6-deoximanosa-GDP 3,5- epimerasa y 4-ceto-6-ga lactosa reductasa GDP e d) incubar la mezcla de reacción por un tiempo suficiente para convertir la 4-ceto-6-deoximanosa-GDP a fucosa-GDP; 2) agregar piruvato quinasa y un sustrato para la piruvato quinasa a la mezcla de reacción de fucosilación, en donde la GDP producida como un resultado de la transferencia de fucosa de la fucosa-GDP se convierte a GTP y 3) conducir la fucosilación en un medio de reacción que comprenda un catión metálico divalente soluble, en donde dicho medio se suplementa con dicho catión metálico divalente para mantener la :... . 1 i ridia. . , lÉfcfau. „ »,,. «tJ^^rfh,. concentración de dicho catión metálico divalente entre aproximadamente 2 mM y aproximadamente 75 mM.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS 5 La Figura 1 muestra un diagrama esquemático de la conversión enzimática de la manosa-GDP a fucosa-GDP, en donde: A = Manosa-GDP A' = Manosa-GDP dehidratasa B = 4-ceto-6-deoximanosa-GDP 10 C = 4-ceto-6-deoxigalactosa GDP D = Fucosa-GDP a = 3,5 epimerización HFx e YEF B b = 4-reductasa HFx e YEF B w = Wca H 15 La Figura 2 muestra los resultados de una prueba diseñada para probar si la actividad de la GMD es lineal todo el tiempo, en donde "y" representa los mMols de manosa-GDP consumida y T el tiempo (min). La Figura 3 muestra que la fucosa-GDP es un inhibidor potente de la mañosa 4,6-dehidratasa GDP (GMD), en donde "y" representa el % de 4-ceto-6- 20 deoximanosa-GDP formada y D = fucosa-GDP. La Figura 4 muestra los resultados de un intervalo de tiempo en la prueba de GMD-YEF B acoplada, en donde: D = Fucosa-GDP T = Tiempo (min).

La Figura 5 muestra la formación de Lewis X sialilos (como se indicó mediante el incremento de GDP) todo el tiempo (T <horas>). También se muestra la disminución en el pH de la mezcla de reacción que ocurre como un resultado de la reacción. La Figura 6 muestra el cambio en la concentración de Mg2+ todo el tiempo (T) durante la síntesis de Lewis X sialilos. La Figura 7 muestra un diagrama esquemático de una reacción de fucosiltransferasa a manosa-GDP a medio ciclo, en donde: A = Manosa-GDP B = 4-ceto-6-deoxi manosa-GDP D = Fucosa-GDP ER = Epimerasa/reductasa F = Glucosa GL = Gluconato H = Cilexina. La Figura 8 muestra un diagrama esquemático de una reacción de fucosiltransferasa mañosa a ciclo completo a, en donde: A = Manosa-GDP B = 4-ceto-6-deoximanosa GDP D = Fucosa-GDP F = Glucosa FM = Fosfomanomutasa GL = Gluconato H = Cilexina HX = Hexoquinasa M = Mañosa M1 = Man osa-1 -fosfato M6 = Manosa-6-fosfato MP = Manosa-GDP pirofosforilasa DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones A menos que se defina de otra manera, todos los términos científicos y técnicos usados en este documento tienen el mismo significado como comúnmente lo entiende algún experto en la técnica a la cual pertenece esta invención. Singleton et al. (1994) Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, segunda edición, John Wiley and Sons (New York) proporciona un diccionario general de muchos de los términos usados en esta invención. Si bien cualesquiera de los métodos y materiales similares o equivalentes de los términos usados en este documento pueden usarse en la práctica o para probar la presente invención, se describen los métodos y materiales preferidos. Para propósitos de la presente invención, a continuación se definen los siguientes términos. Se usan en este documento, las siguientes abreviaciones para los compuestos carbohidratos: Ara = arabinosil; Fru = fructosil; Fue = fucosil; Gal = galactosil; ^^^^^^^y^ GalNAc = N-acetilgalactosaminil; Glc = glucosil; GIcNAc = N-acetilglucosaminil; Man = manosil y Sia (NeuAc) = sialil (típicamente N-acetilneuraminil). Se considera que los oligosacáridos tienen un extremo reductor y un no reductor, no importando si el sacárido es o no un azúcar reductor en el extremo reductor. De conformidad con la nomenclatura aceptada, los oligosacáridos se representan en este documento con el extremo no reductor a la izquierda y el extremo reductor a la derecha. Todos los oligosacáridos descritos en este documento se describen con el nombre o abreviación para el sacárido no reductor (por ejemplo, Gal), seguido por la configuración del enlace glicosídico (a o ß), el enlace anular, la posición del anillo del sacárido reductor involucrado en el enlace y después el nombre o abreviación del sacárido reductor (por ejemplo GIcNAc). La unión entre dos azúcares puede expresarse, por ejemplo, como 2,3, 2- 3 ó (2,3). Cada sacárido es una piranosa. El término "ácido siálico" se refiere a cualquier miembro de una familia de azúcares carboxilados de nueve átomos de carbono. El miembro más común de la familia de ácido siálico es el ácido N-acetil-neuramínico (ácido 2-ceto-5-acetamido- 3,5-dideoxi-D-glicero-D-galactononulopiranos-1-ónico, comúnmente abreviado como Neu5Ac, NeuAc o NANA). Un segundo miembro de la familia es el ácido N- glicolil-neuramínico (NeudGc ó NeuGc), en el cual el grupo N-acetil de NeuAc está hidroxilado. Un tercer miembro de la familia de ácido siálico es el ácido 2-ceto-3- deoxi-nonulosónico (KDN) (Nadano et al. (1986) J. Biol. Chem. 261 :11550-11557; Kanamori et al. (1990) J. Biol. Chem. 265: 21811-21819. También se incluyen los ácidos siálicos 9-sustituidos tales como 9-0-C?-C6 acil-Neu5Ac como 9-0-lactil- NeudAc o 9-0-acetil-Neu5Ac, 9-deoxi-9-fluoro-Neu5Ac y 9-azido-9-deoxi-Neu5ac. Para revisión de la familia de ácido siálico, ver por ejemplo, Varki (1992) Glycobiology 2:25-40; Sialic Acids: Chemistry, Metabolism and Function, R. Schauer, Ed. (Springer-Verlag, New York (1992)). La síntesis y el uso de los compuestos de ácido siálico en un procedimiento de sialilación se describen en la solicitud internacional WO 92/16640, publicada el 1 de Octubre, 1992. El término "ácido nucleico" se refiere a un polímero ribonucleótido o deoxiribonucleótido en forma de hebra doble o sencilla y a menos que esté limitado de otra manera, comprende análogos conocidos de nucleótidos naturales que hibridan a los ácidos nucleicos de manera similar a los nucleótidos de ocurrencia natural. A menos que se indique de otra manera, una secuencia de ácido nucleico particular incluye la secuencia complementaria del mismo. El término "operablemente enlazado" se refiere a la unión funcional entre una secuencia de control de expresión del ácido nucleico ( tal como un promotor, secuencia de señal o prueba de sitios de enlace del factor de transcripción) y una segunda secuencia de ácido nucleico, en donde la secuencia de control de expresión afecta la transcripción y/o translación del ácido nucleico correspondiente a la segunda secuencia. El término "recombinante" cuando se usa con referencia a una célula indica que la célula se replica en un ácido nucleico heterólogo o expresa un péptido o proteína codificada mediante un ácido nucleico heterólogo. Las células recombinantes pueden contener genes que no se encuentran en la forma natural (no recombinante) de la célula. Las células recombinantes también pueden contener genes encontrados en la forma natural de la célula en donde los genes se modifican y re introducen en la célula mediante medios artificiales. El término también comprende células que contienen un ácido nucleico endógeno a la célula que se ha modificado sin remover el ácido nucleico de la célula, dichas modificaciones incluyen aquellas obtenidas mediante el reemplazo de genes, mutación específica en sitio y técnicas relacionadas. Un "polipéptido recombinante" es aquel que se ha producido por una célula recombinante. Una "expresión de cinta recombinante" o simplemente una "expresión de cinta" es una construcción de ácido nucleico , generada recombinante o sintéticamente con elementos de ácido nucleico que son capaces de efectuar la expresión de un gen estructural en huéspedes compatibles con dichos elementos de control. Las cintas de expresión incluyen al menos promotores y opcionalmente señales de terminación de transcripción. Típicamente, la cinta de expresión recombinante incluye un ácido nucleico para transcribirse (por ejemplo, un ácido nucleico codificando un polipéptido deseado) y un promotor (por ejemplo, un promotor dual que contiene un componente promotor tac y un componente promotor gal como se describe en la PCT/US97/20528; Publ. ínter. No. WO 9820111 ) que está operablemente enlazado al ácido nucleico. Factores adicionales necesarios o útiles para efectuar la expresión también pueden usarse como se ha descrito anteriormente. Por ejemplo una cinta de expresión que también puede incluir secuencias nucleótidas que codifican una secuencia de señal que dirige la secreción de una proteína expresada de la célula huésped. Las señales de terminación de transcripción, refuerzos y otras secuencias de ácido nucleico que influyen en la expresión de los genes, también pueden incluirse en una cinta de expresión. Una "secuencia heteróloga" o un "ácido nucleico heterólogo", como se usan 5 en este documento, es uno que se origina de una fuente extraña a la célula huésped particular (por ejemplo, de una especie diferente) o, si es de la misma fuente, se modifica de su forma original. Por lo tanto, un ácido nucleico heterólogo operablemente enlazado a un promotor es de una fuente diferente que de la cual el promotor se derivó o, si es de la misma fuente, se modifica desde su forma 0 original. Por ejemplo, un gen promotor glucosa UDP 4-epimerasa puede enlazarse a un gen estructural codificando un polipéptido diferente a la glucosa UDP 4- epimerasa natural. Un gen heterólogo que codifica una enzima involucrada en la conversión de la manosa-GDP a la fucosa-GDP, por ejemplo, en una célula huésped procariótica incluye un gen que es endógeno a la célula huésped 5 particular que se ha modificado. La modificación del ácido nucleico heterólogo puede ocurrir, por ejemplo, mediante el tratamiento del ADN con una enzima de restricción para generar un fragmento de ADN que es capaz de estar operablemente enlazado al promotor. Técnicas tales como mutagénesis dirigida en sitio también son útiles para modificar un ácido nucleico heterólogo. 0 Una "subsecuencia" se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos o aminoácidos que comprende una parte de una secuencia mayor de ácidos nucleicos o aminoácidos (es decir, polipéptido) respectivamente. El término "aislado" se usa para referirse al material que está sustancialmente o esencialmente libre de componentes que normalmente acompañan al ácido nucleico, al polipéptido o a otra molécula como se encontró en su estado natural. Típicamente, las moléculas aisladas son al menos aproximadamente 80 % puras, usualmente al menos aproximadamente 90 % y preferiblemente al menos aproximadamente 95 % puras como se midieron 5 mediante, por ejemplo, la intensidad de banda en un gel de manchado en plata u otro método para determinar la pureza. La homogeneidad y pureza de la proteína pueden indicarse por varios medios bien conocidos en la técnica, tal como la electrofóresis en gel de poliacrilamida de una proteína muestra, seguida por la visualización en el manchado. Para ciertos propósitos se necesitará alta resolución 10 y HPLC o un medio similar para la purificación usada. Los términos "idéntico" o porcentaje de "identidad", en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias polipéptidas, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son las mismas o que tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoácidos o nucleótidos que son los mismos, 15 cuando son comparados y alineados para correspondencia máxima, como se midieron usando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias o mediante inspección visual. La fase "sustancialmente idénticos", en el contexto de dos ácidos nucleicos o polipéptidos, se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que tienen al 20 menos 60 %, preferiblemente 80 %, más preferiblemente 90-95% de identidad de residuos de aminoácidos o nucleótidos, cuando son comparados y alineados para máxima correspondencia, medidos usando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias o mediante inspección visual. Preferiblemente, la identidad sustancial existe en la región de las secuencias que es al menos ^É^á¡^3t? ^y ?XLJYslB É ^^1ltf^rt -"•-- - ' - - •"^"t^-^^'»fc««-- , -r^..~^.r * A. t. . , M*3?^r aproximadamente 50 residuos en longitud, más preferiblemente en una región de al menos aproximadamente 100 residuos y más preferiblemente las secuencias son sustancialmente idénticas en al menos aproximadamente 150 residuos. En una modalidad más preferida, las secuencias son sustancialmente idénticas en toda la longitud de las regiones de codificación. Para la comparación de secuencias, típicamente una secuencia actúa como una secuencia de referencia en la cual las secuencias de prueba se comparan. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, se capturan las secuencias de referencia y de prueba en una computadora, se designan las coordenadas de subsecuencia, si es necesario, y se designan los parámetros del programa de algoritmos de secuencias. Posteriormente el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidad de secuencia para la secuencia (s) de prueba relativa a la secuencia de referencia, basado en los parámetros del programa designados. La alineación óptima de secuencias para la comparación puede conducirse, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman & Wunsh, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), mediante la búsqueda para el método de semejanza de Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), mediante implementaciones computacionales de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Paquete de Programas de Genética de Winsconsin, Grupo Computacional de Genética, 575 Science Dr., Madison, Wl), o mediante inspección visual (ver generalmente, Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel ef al., eds., Current Protocols, una asociación en wriii—ii i '-j ^^^»».^^-" —- - ^~ - ^ t^^?&tl m¡^^ ?^^^?^^.M.M i^^^ A- participación entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc. (Suplemento 1995) (Ausubel)). Ejemplos de algoritmos que son apropiados para determinar la semejanza de secuencia y el porcentaje de identidad de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 y Altschuel ef al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, respectivamente. El programa para realizar los análisis BLAST está públicamente disponible a través del Centro Nacional para la Información de Biotecnología (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo involucra primero la identificación de los pares de secuencia de alta marcación (HSPs) al identificar palabras cortas de longitud W en la pregunta de la secuencia, que iguala o satisface alguna señal positiva valorada T del umbral cuando está alineada con una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. T se refiere como umbral de la palabra vecina (Altschul ef al, supra). Estas palabras claves vecinas actúan como gérmenes para iniciar las búsquedas para encontrar las HSPs mayores que las contienen. Las palabras claves posteriormente se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia hasta que puede incrementarse la señal de alineación acumulativa. Las señales acumulativas se calculan usando, para secuencias nucleótidas, los parámetros M (señal de recompensa para un par de residuos de igualación; siempre > 0) y N (señal de penalización para residuos de no igualación; siempre < 0). Para las secuencias de aminoácidos, se usa una matriz de señalización para calcular la señal acumulativa. La extensión de las palabras claves en cada dirección se para cuando: la señal de alineación acumulativa cae debajo de la cantidad X a partir de su valor máximo logrado; la señal acumulativa pasa a cero o debajo, debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos de señalización negativa o cuando se alcanza el final de cualquier secuencia. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) usa como predeterminado una longitud de palabra (W) de 11 , una expectación (E) de 10, M = 5, N = -4 y una comparación de ambas hebras. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa como predefinidos una longitud de palabra (W) de 3, una expectación (E) de 10 y la matriz de señalización BLOSUM62 (ver Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)). Además para calcular el porcentaje de identidad de secuencia, el algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre las dos secuencias (ver, por ejemplo, Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la suma de probabilidad más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por la cual una igualación entre las dos secuencias de aminoácidos o nucleótidos ocurriría por casualidad. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la suma de probabilidad más pequeña en una comparación del ácido nucleico de prueba al ácido nucleico de referencia es menos que aproximadamente 0.1 , más preferiblemente menor que aproximadamente 0.01 y más preferiblemente menos que aproximadamente 0.001. Una indicación adicional que las dos secuencias de ácido nucleico o polipéptidos son sustancialmente idénticas es que el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico es inmunológicamente reactivo cruzado con el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico, como se describe posteriormente. Por lo tanto, un polipéptido es típicamente sustancialmente idéntico a un segundo polipéptido, por ejemplo, donde los dos péptidos difieren solamente por 5 sustituciones conservadoras. Otra indicación que dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente idénticas es que las dos moléculas hibridan a cada una de las otras bajo condiciones rigurosas, como se describe posteriormente. La frase "hibridación específicamente a", se refiere al enlace, duplicación o hibridación de una molécula solamente a una secuencia nucleótida particular bajo 0 condiciones rigurosas cuando esa secuencia esta presente en una mezcla compleja (por ejemplo, celular total) ADN o ARN. El término "condiciones rigurosas" se refiere a condiciones bajo las cuales una sonda hibridará a su subsecuencia blanco, pero no a otras secuencias. Las condiciones rigurosas son secuencias dependientes y serán diferentes en 5 circunstancias diferentes. Las secuencias mayores hibridan específicamente a altas temperaturas. Generalmente, las condiciones rigurosas se seleccionan para ser aproximadamente 5o C menores que el punto de fusión térmica (Pf) para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. El PF es la temperatura (bajo la fuerza iónica definida, pH y concentración de ácido nucleico) en la cual el 0 50% de las sondas complementarias a la secuencia blanco hibridan a la secuencia blanco en equilibrio. (Como las secuencias blanco están generalmente en exceso, a PF, el 50% de las sondas se ocupan en equilibrio). Típicamente, las condiciones rigurosas serán aquellas en las cuales la concentración de sal es menor que el ¡on de Na aproximadamente 1.0 M, concentración del ¡on de Na típicamente Mmece r t" Ytf i*?iiflit***,^**tJ,*t*'^-" >^*a^«.~ -^ . -- ...^^^^.-««^^.?ttj^.., . ..... ... . . , . . ^^r^.^. aproximadamente 0.01 a 1.0 M ( u otras sales a un pH de 7.0 a 8.3 y la temperatura es al menos aproximadamente 30° C para las sondas cortas (por ejemplo, 10 a 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente 60° C para sondas largas (por ejemplo, más de 50 nucleótidos). Las condiciones rigurosas también pueden lograrse con la adición de agentes desestabilizantes tales como la formamida. Las frases "específicamente enlaza a una proteína" o "específicamente ¡nmunoreactivo con", con referencia a un anticuerpo se refieren a una reacción de enlace que es determinante de la presencia de la proteína en la presencia de una población heterogénea de proteínas y otros compuestos biológicos. Por lo tanto, bajo condiciones de inmunoprueba designadas, los anticuerpos especificados se enlazan preferiblemente a una proteína particular y no se enlazan en una cantidad significativa a otras proteínas presentes en la muestra. El enlace específico a una proteína bajo tales condiciones requiere un anticuerpo que se selecciona por su especificidad para una proteína particular. Una variedad de formatos de inmunoprueba puede usarse para seleccionar anticuerpos específicamente inmunoreactivos con una proteína particular. Por ejemplo, rutinariamente se usan las inmunopruebas ELISA de fase sólida para seleccionar los anticuerpos monoclonales específicamente inmunoreactivos con una proteína. Ver, Harlow y Lañe (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publiccations, New York, para una descripción de formatos de inmunoprueba y condiciones que pueden usarse para determinar inmunoreactividad específica. "Variaciones modificadas conservadoramente" de una secuencia polinucleótida particular se refiere a aquellos polineucleótidos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o donde el polinucleótido no codifica una secuencia de aminoácidos a secuencias esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos idénticos funcionalmente codifican cualquier polipéptido dado. Por ejemplo, los codones CGU, CGC, CGA, CGG, AGA y AGG codifican a la arginina del aminoácido. Por lo tanto, en cada posición en donde una arginina se especifica por un codon, el codon puede alterarse a cualquiera de los codones correspondientes descritos, sin alterar el polipéptido codificado. Dichas variaciones de ácido nucleico son "variaciones silenciosas", que son una especie de "variaciones modificadas conservadoramente". Cada secuencia polinucleótida descrita en este documento que codifica un polipéptido también describe cada variación silenciosa posible, excepto en donde indique lo contrario. Un experto en la técnica reconocerá que cada codon en un ácido nucleico (excepto AUG, que es ordinariamente el codon solamente para metionina) puede modificarse para producir una molécula funcionalmente idéntica mediante técnicas estándares. Por consiguiente, cada "variación silenciosa" de un ácido nucleico que codifica un polipéptido está implícito en cada secuencia descrita. Además, un experto reconocerá que las sustituciones individuales, eliminaciones o adiciones que alteran, agregan o eliminan un solo aminoácido o un porcentaje pequeño de aminoácidos (típicamente menos del 5%, más típicamente menos del 1 %) en una secuencia codificada son "variaciones modificadas conservadoramente" donde las alteraciones resultan en la sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar. Las tablas de sustitución conservadora proporcionan los aminoácidos funcionalmente similares bien conocidos en la técnica. Un experto apreciará que muchas variaciones conservadoras de las enzimas de síntesis de la fucosa-GDP y el ácido nucleico que codifica las enzimas producen productos esencialmente idénticos. Por ejemplo, debido a la degeneración del código genético, las "sustituciones silenciosas" (por ejemplo, sustituciones de una secuencia de ácido nucleico que no resulta en una alteración en un polipéptido codificado) son una característica implicada de cada secuencia de ácido nucleico que codifica a un aminoácido. Como se describe en este documento, las secuencias preferiblemente se optimizan para la expresión en una célula huésped particular usada para producir la enzima (por ejemplo, levadura, humana y similares). De forma parecida, las "sustituciones conservadoras de aminoácidos", en uno o en pocos aminoácidos en una secuencia de aminoácidos; se sustituyen con diferentes aminoácidos con propiedades sumamente similares, se identifican también como sumamente similares a una secuencia de aminoácidos particular o a una secuencia de ácido nucleico particular que codifica a un aminoácido. Tales variaciones sustituidas conservadoramente de cualquier secuencia particular son una característica de la presente invención. Ver también, Creighton (1984) Proteins, W.H. Freeman and Company. Además, las sustituciones individuales, las eliminaciones o adiciones que alteran, agregan o eliminan a un solo aminoácido o a un pequeño porcentaje de aminoácidos en una secuencia codificada son también "variaciones modificadas conservadoramente". j^¡¡^ . -°j. ab? Descripción de las Modalidades Preferidas La presente invención proporciona métodos y mezclas de reacción para la producción eficiente de sustratos tales como los azúcares nucleótidos (es decir, fucosa-GDP) que son útiles en la síntesis de los compuestos carbohidratos fucosilados. También se proporcionan vectores de expresión para producir enzimas que se usan en estos métodos. También se proporcionan mediante la invención métodos para usar estas enzimas y métodos de producción de azúcares nucleótidos para producir oligosacáridos fucosilados. Los métodos de la invención proporcionan ventajas significativas con respecto a los métodos previamente disponibles para fucosilación. Por ejemplo, los métodos proporcionan una ruta relativamente no costosa para hacer fucosa-GDP, un compuesto caro, iniciando a partir de manosa-GDP de bajo costo o incluso a partir de mañosa. La invención proporciona métodos mediante los cuales la eficiencia de la síntesis de fucosa-GDP y la eficiencia de las reacciones de fucosiltransferasa subsecuentes pueden mejorarse. Los métodos de la invención proporcionan una alta producción del compuesto fucosilado deseado. Por consiguiente, los métodos de la invención son perfectamente adecuados para la producción a escala comercial de compuestos fucosilados, incluyendo aquellos que son útiles para usos terapéuticos y de diagnóstico, comestibles y similares.

A. Clonación y Expresión de Ácidos Nucleicos Codificando Enzimas útiles para la Conversión de manosa-GDP a fucosa-GDP La invención proporciona, en una primera modalidad, métodos de producción de enzimas que son útiles para convertir la manosa-GDP a fucosa- GDP. Esta ruta biosintética, que se muestra en la Figura 1 , involucra tres actividades enzimáticas. La primera enzima, la manosa-GDP dehidratasa cataliza la conversión de manosa-GDP a 4-ceto-6-D-deoximanosa-GDP. Este producto posteriormente se epimeriza a 4-ceto-6-L-deoxigalactosa-GDP, que es a su vez 5 reducida a GDP-L-fucosa mediante una reductasa 4'. Las dos actividades enzimáticas posteriores (epimerasa y reductasa) se encuentran en la proteína humana Fx (Tonetti et al. (1996) J. Biol. Chem. 271 : 27274-27279; GenBank Accesión No. U58766). Sin embargo, para el uso en reacciones sintéticas enzimáticas a escala 10 comercial, se prefiere usar enzimas que se producen fácilmente en procariotas, que son mucho más fáciles y más eficientes para crecer a gran escala que las células de mamíferos. Las enzimas de mamíferos no se expresan a menudo en la forma apropiada en las altas producciones cuando los genes para las enzimas de mamíferos se insertan en las células procarióticas huéspedes. Por lo tanto, era de 15 gran interés obtener una enzima procariótica o enzimas para catalizar la epimerización y reducción. Sin embargo, antes de la presente invención, no se sabía si los sistemas bacteriales para la síntesis fucosa-GDP requerían uno o dos polipéptidos separados para catalizar la epimerización y reducción de la 4-ceto-6- D-deoximanosa-GDP a fucosa-GDP. La presente invención proporciona esta 20 información faltante, demostrando que una enzima cataliza ambas actividades. En E. coli, esta enzima se designa como YEF B. La necesidad de producir solamente una enzima para catalizar dos actividades simplifica el desarrollo a escala mayor de la producción de fucosa-GDP. m^¿umma^ ? .. í.¿„l, e.? . .,.rL, £*eU,,. . ^¿¡j^^^ tH Por consiguiente, la presente invención proporciona métodos y vectores para la producción recombinante de enzimas que son útiles para la producción de fucosa-GDP. La producción recombinante de un polipéptido generalmente involucra una secuencia de ADN que codifica la enzima particular, modificada si se desea, colocando el ADN en una cinta de expresión bajo el control de un promotor particular, expresando la proteína en un huésped, aislando la proteína expresada y si se requiere, renaturalizando la proteína. Más de una de las enzimas puede expresarse en las mismas células huésped, ya sea en el mismo vector de expresión o en más de un vector de expresión que este presente en las células. En una modalidad, la invención proporciona vectores de expresión que son útiles en métodos para producir enzimas involucrados en la síntesis de fucosa- GDP en una célula huésped. Por ejemplo, se proporcionan vectores de expresión que son útiles para la expresión YEF B de E. coli, que cataliza tanto la epimerización y la reducción de la 4-ceto-6-deoximanosa-GDP para obtener fucosa-GDP. Los vectores de expresión también pueden expresar enzimas relacionadas, en particular aquellas a partir de otras procariotas, que también tienen actividad dual epimerasa/reductasa. 1. Ácidos Nucleicos de Codificación de Epimerasa/reductasa Los vectores de expresión de la invención incluyen un ácido nucleico que codifica a una enzima que tiene tanto actividad epimerasa 4-ceto-6-D- deoximanosa-GDP como actividad reductasa 4-ceto-6-L-deoxigalactosa GDP. Una enzima procariótica se codifica mediante el ácido nucleico en las modalidades actualmente preferidas. Por ejemplo, se puede usar un ácido nucleico que codifica a una epimerasa/reductasa procariótica de cualquier especie procariótica, incluyendo la E. coli. La enzima puede ser, por ejemplo, sustancialmente idéntica a un polipéptido E. coli YEF B. En algunas modalidades, los vectores de expresión ¡ncluyen un ácido nucleico que codifica una enzima epimerasa/reductasa que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC ID NO:1. Los ácidos nucleicos también pueden codificar polipéptidos que tienen sustituciones conservadoras de aminoácidos comparadas con la secuencia de aminoácidos de una enzima natural epimerasa/reductasa, tal como la enzima £. coli YEF B. Típicamente, los ácidos nucleicos usados en los vectores de expresión de la invención son al menos aproximadamente 75% idénticos a la secuencia de ácidos nucleicos de la región de codificación E. coli YEF B como se muestra en GenBank Accession No. U38473 (nucleótidos 10748 a 11230). Más preferiblemente, los ácidos nucleicos usados en los vectores de expresión son al menos aproximadamente 85% idénticos a la región de codificación E. coli YEF B y todavía más preferiblemente son al menos aproximadamente 95% idénticos. Típicamente, un algoritmo computacional tal como el BLAST, se usa para la comparación, preferiblemente usando parámetros predeterminados. Estas entidades porcentuales pueden ser un valor total para todas las regiones de codificación o pueden referirse al porcentaje de identidad en una región particular de las regiones de codificación. Por ejemplo, en una modalidad actualmente preferida; los ácidos nucleicos usados en los vectores de expresión de la invención son al menos aproximadamente 85% idénticos al ácido nucleico de codificación E. coli YEF B en una región de al menos 40 nucleótidos en longitud, usando un algoriimo BLAST en pares (BLASTN 2.0.6 como se implemento por el Centro Nacional para la Información de Biotecnología con los siguientes parámetros: Igual: 1 ; Desigual: -2, Distancia abierta: 5; Extensión de distancia: 2; x-dispersión: 50; expectación 10:00; tamaño de letra: 11 , (sin filtrado). Los ácidos nucleicos que codifican a la enzima epimerasa/reductasa 5 pueden obtenerse usando métodos que son conocidos por aquellos expertos en la técnica. Los ácidos nucleicos apropiados (es decir, ADNc, genómico o subsecuentes (sondas)) pueden clonados o amplificarse mediante métodos in vitro tales como la reacción en cadena polimerasa (PCR), la reacción en cadena ligasa (LCR), el sistema de amplificación basado en la transcripción (TAS), el sistema de 10 replicación de secuencia auto-sustentada (SSR). Una amplia variedad de metodologías de amplificación y clonación in vitro son bien conocidas por personas expertas. Ejemplos de estas técnicas y suficientes instrucciones para dirigir a las personas expertas a través de muchos ejercicios de clonación se encuentran en Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, 15 Methods in Enzimology 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2da. ed.) Vol. 1 - 3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY, (Sambrook ef al.); Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel ef al., eds., Current Protocols, una asociación entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & 20 Sons, Inc. (Suplemento 1994) (Ausubel); Cashion ef al., Patente de EUA número 5,017,478 y Carr, Patente Europea No. 0,246,864. Ejemplos de técnicas suficientes para dirigir personas expertas a través de los métodos de amplificación in vitro se encuentran in Berger, Sambrook y Ausubel, así como en Mullis et al., (1987) Patente de E.U.A. No. 4,683,202; PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (Innis et al., eds) Academic Press Inc. San Diego, CA (1990) (Innis); Arnheim & Levinson (Octubre 1 , 1990) C&EN 36-47; The Journal OfNIH Research (1991 ) 3: 81-94; (Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173; Guatelli ef al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874; Lomell et al. (1989) J. Clin. Chem. 35: 1826; Landergren et al., (1988) Science 241 : 1077-1080; Van Brunt (1990) Biotechnology 8: 291 -294; Wu and Wallance (1989) Gene 4: 560 y Barringer et al. (1990) Gene 89:117. Métodos mejorados de clonación in vitro de ácidos nucleicos amplificados se describen en Wallance et al., Pat. de E.U.A. No. 5,426,039. Los ácidos nucleicos que codifican las enzimas que tienen actividades reductasa y epimerasa o subsecuentes de estos ácidos nucleicos, pueden prepararse mediante cualquier método apropiado tales como los descritos anteriormente, incluyendo, por ejemplo, la clonación y restricción de las secuencias apropiadas. Como un ejemplo, se puede obtener un ácido nucleico que codifica a un polipéptido que tiene ambas actividades epimerasa y reductasa mediante métodos rutinarios de clonación. Una secuencia de nucleótidos de un gen que codifica una enzima conocida que tiene ambas actividades, tal como una enzima YEF B, puede usarse para proporcionar pruebas que específicamente hibridan a un gen que codifica a una enzima apropiada en una muestra de ADN genómico o a una ARNm en una muestra total de ARN (por ejemplo, en una marca Southern o Northern). Se proporcionan secuencias apropiadas en, por ejemplo, GenBank u otras bases de datos de secuencias. Una secuencia de nucleótidos apropiada para usarse como una sonda en un vector de expresión de la invención se encontró en un racimo de genes de E. coli que codifica las enzimas de síntesis de fucosa-GDP como se describió por Stevenson ef al. (1996) J. Bacteriol. 178: 4885-4893 (GenBank Accession No. U38473). Se ha reportado que este racimo de genes incluye una estructura de lectura abierta para la dehidratasa manosa-GDP (nucleótidos 8659-9780 en 5 GenBank Accession No. U38473). Los solicitantes descubrieron que este racimo de genes también contiene una estructura de lectura abierta que codifica una enzima que tiene actividades de epimerización 3,5 y reductasa-4 (Figura 1 ) y por lo tanto es capaz de convertir el producto de la reacción dehidratasa manosa-GDP (4-ceto-6-deoximanosa-GDP) a fucosa-GDP. Este ORF, que está designado como 10 YEF B, wcaG y fcl se ha encontrado en nucleótidos 9783-10748 de GenBank Accession No. U 38473. Antes del descubrimiento de los solicitantes con respecto a que el YEF B codifica una enzima que tiene dos actividades, no se conocía si una o dos enzimas se requerían para la conversión de 4-ceto-6-deoximanosa- GDP a fucosa-GDP mediante procariotas. 15 El racimo de genes a partir de E. coli incluye un ORF adicional, que se designa como ivcaH (nucleótidos 10748-11230 de GenBank Accession No. U38473). Este pequeña estructura de lectura abierta, que codifica una hidrolasa manosil manosa-GDP de 15 kd, se localiza justo línea debajo de la región de codificación YEF B (designada como wcaG). Cada una de estas enzimas se 20 expresó en la bacteria según se evaluó mediante SDS-PAGE y tiene la habilidad para formar fucosa-GDP a partir de manosa-GDP. Una vez que el ácido nucleico del blanco epimerasa/reductasa se identifica, se puede aislar de conformidad con los métodos estándares conocidos por aquellos expertos en la técnica (ver, por ejemplo, Sambrook ef al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2da. Ed. Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory; Berger y Kimmel (1987) Methods in Enzymology, Vol. 152: Guide to Molecular Cloning Techniques, San Diego: Academic Press, Inc., o Ausubel et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York). Un ácido nucleico que codifica una epimerasa/reductasa procariótica también puede reproducirse al detectar su producto expresado mediante medios de prueba basados en las propiedades físicas, químicas o inmunológicas. Por ejemplo, se puede identificar un ácido nucleico de codificación epimerasa/reductasa reproducido mediante la capacidad de un polipéptido codificado por el ácido nucleico para catalizar la conversión de 4-ceto-6-deoximanosa-GDP a fucosa-GDP. En un método preferido, la HPLC de fase inversa se usa para determinar las cantidades de manosa-GDP, fucosa-GDP y opcionalmente uno o más intermediarios (por ejemplo, 4-ceto-6-deox?manosa-GDP y 4-ceto-6-deoxigalactosa-GDP) en varios tiempos de reacción. Las condiciones apropiadas de las pruebas se describen en los Ejemplos. En una modalidad, los ácidos nucleicos de codificación epimerasa/ reductasa pueden clonarse usando métodos de amplificación de ADN tales como la reacción en cadena de polimerasa (PCR). Por lo tanto, por ejemplo, la secuencia o subsecuencia del ácido nucleico es PCR amplificada, usando un sitio de restricción conteniendo un iniciador sensible (por ejemplo, Xbal) y otro sitio de restricción conteniendo un iniciador antisensible (por ejemplo, Hinúlll). Esto producirá un ácido nucleico que codifica la secuencia o subsecuencia de aminoácidos epimerasa/reductasa deseada y que tiene sitios de restricción terminal. Este ácido nucleico posteriormente puede ligarse fácilmente con un vector que contenga un ácido nucleico codificando la segunda molécula y que tenga los sitios apropiados de restricción correspondientes. Los iniciadores PCR apropiados pueden determinarse por un experto en la técnica usando la información de secuencia proporcionada en GenBank u otras fuentes. Los sitios de restricción apropiados también pueden agregarse al ácido nucleico que codifica la epimerasa/reductasa o la subsecuencia de aminoácido mediante la mutagénesis dirigida en sitio. El plásmido que contiene la secuencia o subsecuencia nucleótida de codificación epimerasa/reductasa se penetra con la endonucleasa de restricción apropiada y posteriormente se liga en un vector apropiado para amplificación y/o expresión de conformidad con los métodos estándares. Ejemplos de iniciadores apropiados para la amplificación de las enzimas de síntesis de fucosa-GDP se muestran en la Tabla 1 ; cada primer se designa para proporcionar un sitio de restricción Xbal 5' y un sitio Hindlll 3' en el fragmento amplificado. El plásmido que contiene la secuencia o subsecuencia de codificación de enzima se penetra con la endonucleasa de restricción apropiada y posteriormente se liga en un vector apropiado para amplificación y/o expresión de conformidad con los métodos estándares. ^^^^^* -flÉftii iif lf^-*-^-"-^ g^^^^ Tabla 1 Como una alternativa para reproducir un ácido nucleico de codificación epimerasa/reductasa, un ácido nucleico apropiado puede ser sintetizado químicamente a partir de una secuencia conocida que codifica un polipéptido YEF B o una enzima relacionada que tiene actividades epimerasa y reductasa. Los métodos de síntesis química directa incluyen, por ejemplo, el método fosfotriéster de Narang et al. (1979) Meth. Enzymol. 68: 90-99; el método fosfodiéster de Brown et al. (1979) Meth. Enzymol. 68: 109-151 ; el método dietilfosforamidita de 0 Beaucage et al. (1981 ) Tetra Lett., 22: 1859-1862 y el método de soporte sólido de la Patente de EUA No. 4,458,066. La síntesis química produce un oligonucleótido de un solo filamento. Este puede convertirse en un ADN de doble filamento mediante la hibridación con una secuencia complementaria, o mediante polimerización con una polimerasa ADN usando el único filamento como una 5 plantilla. Un experto reconocerá que mientras la síntesis química del ADN a menudo se limita a secuencias de aproximadamente 100 bases, secuencias mayores pueden obtenerse mediante la ligadura de secuencias más pequeñas. Alternativamente, las subsecuencias pueden reproducirse y las subsecuencias apropiadas penetrarse usando las enzimas de restricción apropiadas. Los fragmentos posteriormente pueden ligarse para producir la secuencia de ADN deseada. Un ácido nucleico que codifica una enzima de síntesis de la fucosa-GDP puede identificarse al detectar su producto expresado mediante medios de pruebas basados en las propiedades físicas, químicas o inmunológicas. Por ejemplo, puede identificarse un ácido nucleico reproducido de síntesis fucosa-GDP por la capacidad de un polipéptido codificado por el ácido nucleico para catalizar la conversión de manosa-GDP a fucosa-GDP. Otras propiedades físicas de un polipéptido expresado a partir de un ácido nucleico particular pueden compararse con las propiedades de los polipéptidos conocidos como YEF B para proporcionar otro método de identificación de ácidos nucleicos de codificación epimerasa/reductasa. Alternativamente, un gen supuesto de epimerasa/reductasa puede mutarse y su rol como una epimerasa/reductasa establecerse mediante la detección de una variante en la capacidad para producir fucosa-GDP. En algunas modalidades, puede ser deseable modificar los ácidos nucleicos de codificación epimerasa/reductasa. Un experto reconocerá muchas rutas de generación de alteraciones en una construcción de ácido nucleico dada. Tales métodos bien conocidos incluyen la mutagénesis dirigida en sitio, la amplificación PCR usando oligonucleótidos degenerados, exposición de las células que contienen el ácido nucleico a los agentes mutágenos o radiación, síntesis química de un oligonucleótido deseado (es decir, junto con la ligadura y/o clonación para generar ácidos nucleicos mayores) y otras técnicas bien conocidas. Ver por ejemplo, Giliman and Smith (1979) Gene 8:81-97, Roberts ef al. (1987) Nature 328: 731-734. En una modalidad preferida, los ácidos nucleicos recombinantes presentes en las células de la invención se modifican para proporcionar codones preferidos que mejoran la traducción del ácido nucleico en un organismo seleccionado (por ejemplo, los codones preferidos de levadura se sustituyen en un ácido nucleico de codificación para la expresión en la levadura). 2. Vectores de Expresión y Métodos para la Expresión de Enzimas Involucradas en la Síntesis de Fucosa-GDP La invención proporciona cintas de expresión y vectores de expresión que contienen las cintas, que son útiles para la expresión de las enzimas de síntesis de la fucosa-GDP, en polipéptidos particulares que tienen actividades reductasa y epimerasa. Estas cintas de expresión incluyen los ácidos nucleicos de codificación de enzimas de síntesis de la fucosa-GDP, que están operablemente ligadas a un promotor que es funcional en una célula huésped deseada. Las cintas de expresión también pueden incluir otras secuencias involucradas en la transcripción, traducción y la modificación post-translacional de la enzima. Dichas secuencias posteriormente se describen en más detalle. La invención también proporciona vectores de expresión y las células huésped que comprenden los ácidos nucleicos recombinantes descritos en este documento. Típicamente, el polinucleótido que codifica la enzima involucrada en la síntesis del azúcar nucleótido se coloca bajo el control de un promotor que es g^^^^^^^g^^^^^^^^^^^¿^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^¡¿¿¡¡^^^^^^^^^^^^^^^^_^:^^..^..*-^ » . iii fe ¿ . j$&&é* &í¡ funcional en la célula huésped deseada. Es bien conocida una variedad extremadamente amplia de promotores y pueden usarse en los vectores de la invención, dependiendo de la aplicación particular. Ordinariamente, el promotor seleccionado en la célula en la cual el promotor debe ser activo. Otras secuencias de control de expresión tales como sitios de enlace de ribosoma, sitios de terminación de transcripción y similares también se incluyen opcionalmente. Las secuencias de control de expresión que son apropiadas para usarse en una célula huésped particular a menudo se obtienen mediante clonación de un gen que se expresa en esa célula. En otra modalidad, la invención proporciona células recombinantes que son útiles para la producción de enzimas que catalizan una o más etapas en la conversión de la manosa-GDP a fucosa-GDP. Las células recombinantes contienen una cinta de expresión, preferiblemente incluidas en un vector de expresión ( a menos que la cinta de expresión se integre en el genoma de la célula huésped). Las células huésped de la invención pueden ser células planta o microorganismos, tales como, por ejemplo, células de levadura, células bacteriales o células fúngales. Ejemplos de células apropiadas ¡ncluyen, por ejemplo, Azotobacter sp. (es decir, A. vinelandii), Pseudomonas sp., Rhizobium sp., Erwinia sp., Escherichia sp., (es decir E. Coli) y Klebsiella sp., entre muchas otras. Las células pueden ser de cualquier género, incluyendo Saccharomyces (es decir, S, cerevisiae), Candida (es decir, C. utilis, C. parapsilosis, C. krusei, C. versatilis, C. lipolytica, C. zeylanoides, C. guilliermondii, C. albicans y C. humicola), Pichia (es decir, P. farinosa y P. ohmeri), Torulopsis (es decir, T candida, T sphaerica, T xylinus, T. famata y T versatilis), Debaryomyces (es decir, D. subglobosus, D. cantarellii, D. globosus, D. hansenii y D. japonicus), Zygosaccharomyces (es decir, Z. rouxii y Z. baillii), Kluyveromyces (es decir, K. marxianus), Hansenula (es decir, H. anómala y H. jadinii) y Brettanomyces (es decir, B. lambicus y B. anomalus). Un promotor y otras señales de control pueden derivarse a partir de un gen que está bajo investigación, o puede ser un promotor heterólogo u otra señal que se obtiene a partir de un gen diferente o a partir de especies diferentes. Donde se desea la expresión continua de un gen, se puede usar un promotor "constitutivo", que está generalmente activo bajo condiciones casi ambientales y estados de desarrollo o diferenciación de células. Los promotores constitutivos apropiados para usarse en plantas incluyen, por ejemplo, el virus de mosaico de la coliflor (CaMV) la región de inicio de la transcripción 35S y los promotores de la región VI, el promotor 1 '- ó 2'- derivado del ADN-T de Agrobacterium tumefaciens y otros promotores activos en células planta que son conocidas por aquellos expertos en la técnica. Otros promotores apropiados incluyen el promotor de transcripción de longitud completa a partir del virus en mosaico de Figwort, promotores de actina, promotores de histona, promotores de tubulina o el promotor manopina sintasa (MAS). Otros promotores planta constitutivo incluyen varios promotores poliubiquitin o ubiquitin derivados de inter alia, Arabidopsis (Sun and Callis, Plant J., 11 (5): 1017-1027 (1997)), el mas, promotores Mac o DoubleMac (descritos en la Patente de E.U.A. No. 5,106,739 y por Comai ef al., Plant Mol. Biol. 15:373-381 (1990)) y otras regiones de iniciación de la transcripción a partir de varios genes de plantas conocidos por aquellos expertos en la técnica. Dichos genes ¡ncluyen por ejemplo, ACT11 de Arabidopsis (Huang ef al., Plant Mol. Biol. 33: 125-139 (1996)), Cat3 de Arabidopsis (GenBank No. U43147, Zhong ef al., Mol. Gen.

Genet. 251 :196-203 (1996)), el gen de codificación de la proteína desaturasa del portador estearoil-acil de Brassica napus (GenBank No, X74782, Solocombe et al., Plant Physiol. 104:1167-1176 (1994)), GPcl de maíz (GenBank No. X15596, Martínez ef al., J. Mol. Biol. 208:551-565 (1989)) y Gpc2 del maíz (GenBank No. 5 U45855, Manjunath ef al., Plant Mol. Biol. 33:97-112 (1997)). Los promotores útiles para las plantas también ¡ncluyen aquellos obtenidos de los plásmidos Ti o Ri, a partir de células planta, de virus de plantas u otros huéspedes donde los promotores se encuentran para ser funcionales en plantas. Los promotores bacteriales que funcionan en las plantas y por lo tanto son apropiados para usarse 0 en los métodos de la invención incluyen el promotor sintetasa octopina, el promotor sintasa nopalina y el promotor sintetasa manopina. Los promotores de plantas endógenos apropiados incluyen la ribulosa-1 ,6-bifosfato (RUBP) carboxilasa, promotor de subunidad pequeña (ssu), el promotor a-conglicinina, el promotor faseolina, el promotor ADH y los promotores de choque de calor. 5 Los promotores para usarse en E. coli incluyen los promotores T7, trp o lambda. También se proporciona un sitio de enlace ribosoma y preferiblemente una señal de terminación de la transcripción. Para las células eucarióticas, las secuencias de control típicamente incluyen un promotor que opcionalmente incluye un mejorador derivado de los genes de inmunoglobu na, SV40, 0 citomegalovirus, etc., y una secuencia de poliadenilación y pueden incluir secuencias del aceptor y del donante de empalme. En la levadura, los promotores convenientes incluyen el GAL1 -10 (Jonson and Davies (1984 Mol. Cell Biol. 4:1440-1448) ADH2 (Rusell ef al. (1983) J. Biol Chem. 258-2674-2682), PH05 (EMBOJ. (1982) 6: 675-680) y MFa (Herskowitz and Oshima (1982) en The Molecular Biology of the Yeast Saccharamyces (eds. Strathern, Jones and Broach) Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, N.Y pp. 181-209). Otro promotor apropiado para usarse en la levadura es el promotor híbrido ADH2/GADDH como se describe en Cousens et al., Gene 61 : 265-275 (1987). Para los hongos filamentosos tales como, por ejemplo, filamentos del hongo Aspergillus (McKnight et al., Patente de E.U.A. No. 4,935,349), ejemplos de promotores útiles incluyen aquellos derivados de los genes glicolíticos de Aspergillus nidulans, tal como el promotor ADH3 (McKnight ef al., EMBO J 4: 2093 2099 (1985)) y el promotor fp/A. Un ejemplo de un terminador apropiado es el terminador ADH3 (McKnight et al). En algunas modalidades, los polinucleótidos se colocan bajo el control de un promotor inducible, que es un promotor que dirige la expresión de un gen donde el nivel de la expresión es alterable por factores de desarrollo o ambientales tales como, por ejemplo, la temperatura, el pH, las condiciones aeróbicas o anaeróbicas, la luz, los factores de transcripción y químicos. Dichos promotores se refieren en este documento como promotores "inducibles", que permiten el control de sincronización de la expresión de la glicosiltransferasa o la enzima involucrada en la síntesis del azúcar nucleótido. Para E. coli y otras células huésped bacteriales, los promotores inducibles son conocidos por aquellos expertos en la técnica. Estos incluyen, por ejemplo, el promotor lac. Un promotor inducible particularmente preferido para la expresión en las procariotas es un promotor dual que incluye un componente promotor tac enlazado a un componente promotor obtenido de un gen o genes que codifican enzimas involucradas en el metabolismo de la galactosa (es decir, un promotor de un gen de galactosa UDP 4-epimerasa (galE). El promotor dual tac-gal, que se describe en la PCT/US/97/20528 (Publ. ínter. No. WO 9820111 ), proporciona un nivel de expresión que es mayor que el proporcionado por un solo promotor. Los expertos en la técnica conocen a los promotores inducibles para usarse en plantas (ver, por ejemplo, las referencias citadas en Kuhlemeier et al (1987) Ann. Rev. Plant Physiol. 38:221 ) e incluye los genes de la subunidad pequeña de 1 ,5-ribulosa bisfosfato carboxilasa de la Arabidopsis thaliana (el promotor "ssu"), que son ligeramente inducibles y activos solamente en el tejido fotosintético, promotores antera-específicos (EP 344029) y promotores específicos del germen de, por ejemplo, Arabidopsis thaliana (Krebbers ef al. (1988) Plant Physiol. 87:859). Los promotores inducibles para otros organismos son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Estos incluyen, por ejemplo, el promotor arabinosa, el promotor lacZ, el promotor metalotioneina y el promotor de choque de calor así como muchos otros. Una construcción que incluye un polinucleótido de interés operablemente ligado al gen de control de expresión señala que, cuando está colocado en una célula huésped apropiada, la expresión de transmisión del polinucleótido se llama una "cinta de expresión". Las cintas de expresión que codifican la YEF B y/u otra enzima involucrada en la síntesis del azúcar nucleótido a menudo se colocan en los vectores de expresión para su introducción en la célula huésped. Los vectores típicamente incluyen, además a una cinta de expresión, una secuencia de ácido -a. i 4¿_ t .._,*. «A, l ?a&**~*~.-- ~*&*¿A . . .t,.,,. , , „,.,»., j _. , i^?^^ ^r^. nucleico que permite al vector replicar independientemente en una o más células huésped seleccionadas. Generalmente, esta secuencia es una que permite al vector replicarse independientemente del ADN cromosomal huésped e incluye orígenes de replicación o secuencias de replicación autónoma. Dichas secuencias son bien conocidas para una variedad de bacterias. Por ejemplo, el origen de la replicación a partir del plásmido pBR322 es apropiada para la mayoría de las bacterias Gram-negativo. Alternativamente, el vector puede replicarse mediante la conversión integrada en el complemento genómico de la célula huésped y siendo replicada como la célula experimentando la replicación de ADN. Un vector de expresión preferido para la expresión de las enzimas es en las células bacteriales pTGK, que incluye un promotor tac-gal dual y se describe en la PCT/US97/20528 (Pub. ínter. No. WO 9820111 ). Los constructores de la construcción del polinucleótido generalmente requiere el uso de vectores capaces de replicarse en la bacteria. Una plétora de equipos están comercialmente disponibles para la purificación de los plásmidos a partir de bacterias. Para propósitos de uso, seguir las instrucciones del fabricante (ver, por ejemplo, EasyPrepJ, FlexiPrepJ, ambos de Pharmacia Biotech; StrataCleanJ, de Stratagene y QIAexpress Expression System, Oiagen). Los plásmidos purificados y aislados posteriormente pueden además manipularse para producir otros plásmidos y usarse para transfectar células. También es posible la clonación en Streptomyces o Bacillus . Los marcadores que pueden seleccionarse a menudo se incorporan en los vectores de expresión usados para construir las células de la invención. Estos genes pueden codificar un producto gen, tal como una proteína, necesaria para la supervivencia o crecimiento de las células huésped transformadas desarrolladas en un medio de cultivo selectivo. Las células huésped no transformadas con el vector que contiene el gen de selección no sobrevivirán en el medio de cultivo. Los genes de selección típica codifican proteínas que confieren resistencia a 5 antibióticos u otras toxinas, tales como la ampicilina, neomicina, kanamicina, cloranfenicol o tetraciclina. Alternativamente, los marcadores seleccionables pueden codificar proteínas que complementan las deficiencias auxotróficas o suplen nutrientes críticos no disponibles del medio complejo, por ejemplo, el gen que codifica la racemasa D-alanina para Bacilli. A menudo, el vector tendrá un 10 marcador seleccionable que es funcional en, porejemplo, E. coli u otras células en las cuales el vector es replicado antes de ser introducido en la célula blanco. Un número de marcadores seleccionables son conocidos por aquellos expertos en la técnica y se describen por ejemplo en Sambrook ef al., supra. Un marcador seleccionable preferido para usarse en las células bacteriales es un marcador de 15 resistencia a la kanamicina (Viera y Messing, Gene 19:259 (1982)). El uso de la selección de kanamicina es ventajosa, por ejemplo, en la selección de ampicilina porque la ampicilina se degrada rápidamente mediante la ß-lactamasa en el medio de cultivo, removiendo por lo tanto la presión selectiva y permitiendo al cultivo crecer aún más con células que no contienen el vector. 20 Los marcadores seleccionables apropiados para usarse en células de mamíferos incluyen, por ejemplo, el gen de reductasa dihidrofolata (DHFR), el gen quinasa timidina (TK) o los genes procarióticos que confieren resistencia a la droga, gpt (xantina-guanina fosforibosiltransferasa, que puede seleccionarse con ácido micofenólico; neo (neomicin fosfotransferasa), que puede seleccionarse con G418, higromicina o puromicina y DHFR (dihidrofolata reductasa), que puede seleccionarse con metotraxato (Mulligan & Berg (1981 ) Proc. Nat'l. Acad. Sci. EUA 78:2072; Southern & Berg (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1 :327). Los marcadores de selección para plantas y/u otras células eucarióticas a menudo confieren resistencia a un antibiótico o biocida, tal como, por ejemplo, kanamicina, G418, bleomicina, higromicina o cloranfenicol o resistencia a herbicidas, tal como resistencia al clorosulfurón o Basta. Ejemplos de secuencias de codificación apropiadas para marcadores seleccionables son: el neo gen cuyos códigos para la enzima neomicina fosfotransferasa que confiere resistencia al antibiótico kapamicina (Beck ef a/ (1982) Gene 19:327); el gen hyg, cuyos códigos para la enzima higromicina fosfotransferasa y confiere resistencia al antibiótico higromicina (Gritz y Davis (1983) Gene 25:179) y el gen bar (EP 242236) que codifica la fosfinotricin acetil transferasa que confiere resistencia a los compuestos herbicidales fosfinotricin y bialafos. La construcción de los vectores apropiados que contienen uno o más de los componentes listados anteriormente emplea las técnicas de ligadura estándares como se describen en las referencias citadas anteriormente. Los plásmidos aislados o los fragmentos de ADN se penetran, adaptan y religan en la forma deseada para generar los plásmidos requeridos. Para confirmar las secuencias correctas en los plásmidos construidos, los plásmidos pueden analizarse mediante técnicas estándares tales como por restricción de digestión endonucleasa y/o secuenciación de conformidad con métodos conocidos. Las técnicas de clonación molecular que alcanzan estos fines son conocidas en la técnica. Una amplia variedad de clonación y de métodos de amplificación in vitro apropiados para la construcción de los ácidos nucleicos recombinantes son bien conocidos por aquellas personas expertas en la técnica. Ejemplos de estas técnicas e instrucciones suficientes para dirigir a personas expertas a través de muchos ejercicios de clonación se encuentran en Berger and Kimel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Volumen 152, Academic Press, Inc , San Diego CA (Berger) y Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel ef al., ed., Currents Protocols, una asociación entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., (Suplemento 1998) (Ausubel). Una variedad de vectores comunes apropiados para usarse en la construcción de los vectores de expresión de la invención son bien conocidos en la técnica. Para la clonación en bacteria, los vectores comunes incluyen vectores derivados pBR322 tales como pBLUESCRIPT™ y vectores derivados ?-phage. En la levadura, los vectores ¡ncluyen plásmidos de Integración de Levadura (por ejemplo, Ylp5) y plásmidos de Replicación de Levadura (plásmidos de serie YRp) y pGPD-2. La expresión en las células de mamíferos puede lograrse usando una variedad de plásmidos comúnmente disponibles, incluyendo pSV2, pBC12BI y p91023, así como los vectores del virus lítico (por ejemplo, virus vaccinia, adeno virus y baculovirus), vectores del virus episomal (por ejemplo, papillomavirus de bovino) y vectores retrovirales (porejemplo, retrovirus murina). Métodos apropiados para la introducción de los vectores de expresión en una célula huésped seleccionada son conocidos por aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, los vectores de expresión pueden introducirse en las células . .w....-*.*^. procarióticas, incluyendo E. coli mediante la transformación de cloruro de calcio y en las células eucarióticas mediante el tratamiento con fosfato de calcio o electroporación. También están disponibles otros métodos de transformación. Una vez expresadas, las enzimas de síntesis fucosa-GDP recombinante pueden purificarse de conformidad con los procedimientos estándares de la técnica, incluyendo la precipitación de sulfato de amonio, columnas de afinidad, la cromatografía en columna, la electrofóresis en gel y similares (ver, generalmente, R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y. (1982), Deutscher, Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc. N.Y. (1990)). Se prefieren las composiciones sustancialmente puras de al menos aproximadamente 90 a 95% de homogeneidad y son más preferidas las de 98 a 99% o más homogeneidad. Una vez purificadas, los polipéptidos posteriormente pueden usarse, parcialmente o a homogeneidad como se desee (por ejemplo, como inmunogenes para la producción de anticuerpos). En algunas modalidades, sin embargo, las enzimas se usan en un estado impuro, por ejemplo, como un lisato celular. Las células recombinantes de la invención crecen en el medio de cultivo para obtener un número suficiente de células para usarse en una reacción de una escala deseada. Los métodos y los medios de cultivo para crecimiento de las células huésped respectivas son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. El cultivo puede conducirse en, por ejemplo, cultivo aereado de rotación y agitación, o más preferiblemente en un fermentador. Con respecto al crecimiento de las células recombinantes a una densidad deseada de la célula, las células típicamente se procesan para usarse en las mezclas de reacción y los métodos de la invención. Por ejemplo, las células generalmente se permeabilizan o de lo contrario se interrumpen para permitir la entrada de los aceptores sacáridos solubles en las células. La YEF B u otra enzima producida por las células puede, en algunas situaciones, difundirse en las células en el fluido extracelular. Los métodos de permeabilización de células para 5 degradar no significativamente la actividad enzimática son conocidos por aquellos expertos en la técnica. Las células pueden someterse a concentración, secado, liofilización, tratamiento con surfactantes, tratamiento ultrasónico, interrupción mecánica, tratamiento enzimático y similares. Las células tratadas posteriormente se usan en una mezcla de reacción que 10 contiene reactivos adicionales, conocidos por aquellos expertos en la técnica, que son necesarios o deseables para la actividad enzimática de la enzima de síntesis fucosa-GDP. La concentración de las células tratadas usadas en la mezcla de reacción es típicamente entre aproximadamente 0.1 % (peso de humedad/vol) y 40% (peso de humedad/vol), más preferiblemente entre aproximadamente 1 % 15 (peso de humedad/vol) y aproximadamente 20% (peso de humedad/vol) y más preferiblemente entre aproximadamente 2% (peso de humedad/vol) y aproximadamente 10% (peso de humedad/vol) o una cantidad correspondiente de las células secas. Un experto en la técnica reconocerá que después de la síntesis química, la 20 expresión biológica o purificación, la enzima (s) de síntesis fucosa-GDP puede poseer una conformación sustancialmente diferente que las conformaciones naturales de los polipéptidos constituyentes. En este caso, puede ser necesario desnaturalizar y reducir el polipéptido y posteriormente causar que el polipéptido se redoble en la conformación preferida. Los métodos de reducción y -~-"~""— -- - • - . -....^..r-^ gfflífi i ||T . ....m,*j, ,^. ..^.. ^,,!^,,^^^^-. ... i a>¿^^... desnaturalización de las proteínas y la inducción al redoblamiento son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica (Ver, Debinski et al. (1993) J. Biol. Chem., 268: 14065-14070; Kreitman and Pastan (1993) Bioconjug. Chem., 4:581 -585 y Buchner, ef al., (1992) Anal. Biochem., 205:263-270). Debinski et al., por ejemplo, describen la desnaturalización y la reducción de la inclusión de las proteínas corporales en guanidina DTE. La proteína a menudo se redobla en un estabilizador de óxido reducción que contiene glutationa oxidada y L-arginina. Una ventaja significativa del uso de una enzima procariótica tal como la YEF B en un sistema de expresión procariótica, por ejemplo se usa en una modalidad preferida de la presente invención, es el hecho de que usualmente no se requieren la desnaturalización y el redoblamiento. La epimerasa/reductasa procariótica activa se obtiene en grandes cantidades sin estas etapas adicionales. Un experto reconocerá que pueden hacerse modificaciones a las enzimas de síntesis fucosa-GDP sin disminuir su actividad biológica. Pueden hacerse algunas modificaciones para facilitar la clonación, la expresión o incorporación de la molécula blanco en una fusión de proteínas. Dichas modificaciones son bien conocidas por aquellos expertos en la técnica e incluyen por ejemplo, una metionina agregada al término amino para proporcionar un sitio de inicio o aminoácidos adicionales (por ejemplo, poli His) colocados ya sea en las partes terminales de los mismos para crear sitios de restricción convenientemente ubicados o codones de terminación o secuencias de purificación.

^^^A^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^jg^^^^^^^^^^^^^^ B. Conversión Enzimática de Manosa-GDP a Fucosa-GDP La invención también proporciona métodos para convertir enzimáticamente la manosa-GDP a fucosa-GDP. Los métodos a menudo involucran una o más enzimas epimerasa/reductasa y dehidratasa manosa-GDP (GMD). En modalidades actualmente preferidas, los métodos usan una enzima GMD procariótica, así como una enzima procariótica que tiene las actividades reductasa y epimerasa. Un ejemplo de una enzima preferida que tiene ambas actividades es el polipéptido YEF B de E. coli. En otras modalidades, puede usarse una enzima procariótica tal como una proteína Fx humana. Los métodos de la invención proporcionan un medio por el cual la fucosa-GDP puede producirse eficientemente y en alta pureza usando materiales iniciales relativamente de bajo costo. Varias modalidades de la invención proporcionan métodos por los cuales la eficiencia de la reacción manosa-GDP a fucosa-GDP puede sustancialmente incrementarse. En métodos previamente conocidos, las enzimas en las rutas enzimáticas se usan en una reacción acoplada, en la cual la 4-ceto-6- deoximanosa-GDP se produce y simultáneamente se epimeriza/reduce para obtener fucosa-GDP. Sin embargo, la enzima GMD que cataliza la etapa inicial de la ruta sintética, la conversión de manosa-GDP a 4-ceto-6-deoximanosa-GDP, fuertemente se inhibe por la fucosa-GDP. En la fucosa-GDP 50 µM, la dehidratasa manosa-GDP posee solamente 10% de su actividad catalítica (Broschat ef al (1985) Eur. J. Biochem. 153:397-401). Para evitar la reducción en la producción causada por la inhibición de este producto, los métodos de la invención involucran, en algunas modalidades, permitir que la primera etapa de la ruta proceda cercanamente o totalmente a la terminación antes de agregar la segunda enzima de la ruta (por ejemplo, la epimerasa/reductasa). En modalidades actualmente preferidas, la conversión de manosa-GDP a 4-ceto-6-deoximanosa-GDP es al 5 menos aproximadamente 80% completa, más preferiblemente al menos aproximadamente 90% completa y todavía más preferiblemente al menos aproximadamente 95 % completa, al momento de que se agrega la subsecuente enzima o enzimas a la mezcla de reacción. Las mezclas de reacción para la reacción GMD catalizada requieren la presencia de NADP+. En otra modalidad, 10 una fucosiltransferasa y el sacárido aceptor se agregan al producto de la reacción GMD, 4-ceto-6-deoximanosa-GDP, junto con la epimerasa/reductasa. La fucosa- GDP formada por la epimerasa/reductasa se consume por la fucosiltransferasa, así previniendo la inhibición de retroalimentación de GMD. La invención también proporciona mezclas de reacción para la síntesis 15 enzimática de la fucosa-GDP. En algunas modalidades, las mezclas de reacción incluyen 4-ceto-6-deoximanosa-GDP, NADPH o NADH y uno o más polipéptidos que tienen actividad epimerasa y actividad reductasa (por ejemplo, YEF B o un análogo apropiado), los últimos polipéptidos preferiblemente de una procariota. El polipéptido epimerasa/reductasa cataliza la epimerización y la reducción de 4- 20 ceto-deoximanosa-GDP para formar fucosa-GDP. La 4-ceto-6-deoximanosa-GDP es preferiblemente obtenida por conversión de GMD catalizada de manosa-GDP como se describió anteriormente. La reducción epimerasa para obtener fucosa-GDP requiere NADPH o NADH. En algunas modalidades, puede emplearse un sistema de regeneración mediante el cual el donante de electrones oxidado se regenera a NADPH o NADH. Por ejemplo, puede incluirse en la mezcla de reacción una enzima que utiliza NADP+ o NAD+ para oxidar un sustrato por la enzima, a la cual el sustrato también se incluye en la mezcla de reacción. Ejemplos de enzimas de reciclaje apropiadas ¡ncluyen por ejemplo, alcohol dehidrogenasa, glucosa dehidrogenasa, formato dehidrogenasa, hidrogenasa y glucosa-6-fosfato dehidrogenasa (ver, por ejemplo, Wong ef al. (1985 J. Am. Chem. Soc. 107: 4028-4031 ). En una modalidad actualmente preferida, la glucosa dehidrogenasa y su sustrato de glucosa se usan para regenerar el NADPH o NADH. La invención también proporciona métodos y mezclas de reacción en las cuales las reacciones de síntesis de fucosa-GDP se acoplan a las reacciones fucosiltransferasa en las cuales el residuo de fucosa se transfiere de la fucosa-GDP a un sacárido aceptor apropiado. Aquellos expertos en la técnica conocen varias fucosiltransferasas apropiadas. Brevemente, las fucosiltransferasas incluyen cualesquiera de aquellas enzimas que transfieren la fucosa L de la fucosa-GDP a una posición hidroxi de un azúcar aceptor. Un ejemplo de un azúcar aceptor aceptable es un GIcNAc en un grupo ßGal(1?4)ßGlcNAc en un glicósido oligosacárido. Las fucosiltransferasas apropiadas incluyen la ßGal(1 ?3,4)ßGlcNAc a(1?3,4)fucosiltransferasa conocida (FTIII E.C. No. 2.4.1.65) que puede obtenerse de la leche humana (ver, Palcic, ef al., Carbohydrate Res. 190: 1-11 (1989); Prieels et al., J. Biol. Chem. 256: 10456-10463 (1981 ) y Nunez, et al., Can. J. Chem. 59: 2086-2095 (1981 )) y la ßGal(1 ?4)ßGlcNAc a (1 ?3) fucosiltransferasas (FTIV, FTV, FTVI y FTVII, E.C. No. 2.4.1.65) que se encontraron en el suero humano. Una forma recombinante de ßGal(1?3,4)ßGlcNAc a(1->3,4)fucosiltransferasa también está disponible (ver, Dumas, ef al., Bioorg. Med. Letters 1: 425-428 (1991 ) y Kukowska-Latallo., Genes and Development 4:1288-1303 (1990)). Otras fucosiltransferasas incluyen a 1 ,2-fucosiltransferasa (E.C. No. 2.4.1.69); fucosiltransferasas adicionales se listan en la Tabla 2. La fucosilación enzimática puede llevarse a cabo mediante los métodos descritos en Mollicone et al., Eur. J. Biochem. 191:169-176 (1990) o Patente de E.U.A. No. 5,374,655. La invención también proporciona métodos para mejorar la eficiencia de la transferencia mediada por la fucosiltransferasa de fucosa de la fucosa-GDP a un sacárido aceptor. Un problema con las reacciones acopladas en las cuales la manosa-GDP se convirtió a fucosa-GDP, que es cercana y simultáneamente transferida a un sacárido aceptor, es el hecho de que la GDP inhibe a la GMD y la fucosiltransferasa. Por lo tanto, en una modalidad, los métodos de la invención involucran el mejoramiento de la eficiencia de la producción sacárida fucosilada mediante la conducción de la síntesis enzimática de la fucosa-GDP separadamente de la reacción fucosiltransferasa. La GDP libre no se libera, de manera que la GMD no se inhibe. En una modalidad alternativa, la GDP producida junto con la reacción fucosiltransferasa se convierte a GTP, que no inhibe la fucosiltransferasa o la GMD. Por ejemplo, la mezcla de reacción puede incluir una quinasa y el sustrato correspondiente. Las quinasas apropiadas incluyen, por ejemplo, polifosfato quinasa (EC 2.7.4.1 ), nucleósido fosfato quinasas (EC 2.7.4.4), creatina quinasa i^ist -trfiftí-"^ "- > *&-*>- (EC 2.7.3.2), mioquinasa (EC 2.7.4.3), mioquinasa (EC 2.7.4.3), acetil quinasa (por ejemplo, EC 2.7.1.59), acetil fosfato quinasa y piruvato quinasa (EC 2.7.1.40). Sustratos apropiados para estas enzimas son conocidos por aquellos expertos en la técnica. Un esquema de reacción que incorpora esta modalidad se muestra en 5 la Figura 8. En una modalidad preferida, las enzimas de síntesis fucosa-GDP se usan en un ciclo enzimático. Los ciclos enzimáticos apropiados incluyen medios ciclos tal como el mostrado en la Figura 7, que usa manosa-GDP como el material inicial y ciclos completos como los mostrados en la Figura 8, que usan mañosa como el 10 material inicial. Un ejemplo de un medio ciclo de manosa-GDP (Figura 7) usa glucosa dehidrogenasa para reciclar enzimáticamente el NADPH, un cofactor requerido por los polipéptidos epimerasa/reductasa y fucosiltransferasa V para transferir la fucosa a SLN, resultando en la formación de un compuesto sialilo- Lewisx. Dado que la GDP inhibe a la fucosiltransferasa y la manosa-GDP 15 dehidratasa, una fosfatasa que es capaz de penetrar la GDP pero no penetra el fosfato del NADP preferiblemente se agrega al ciclo. Se prefiere el MgCI2 como una fuente de catión divalente, como la YEF B se inhibe mediante MnCI2. Además la manosa-GDP dehidratasa y los polipéptidos epimerasa/reductasa, el medio ciclo fucosiltransferasa manosa-GDP preferiblemente incluye lo siguiente: una enzima 20 que recicla al NADPH, tal como la glucosa dehidrogenasa, un sustrato para la enzima regeneradora NADPH tal como la glucosa o galactosa, fucosiltransferasa, un aceptor oligosacárido o glicoconjugado, NADP, manosa-GDP y un sistema estabilizador. rr ÉwftTiTi— - - «-*---- <- -fch..-.. . . ...^.„ . _ . . .. ...^fe^tt^.^.^Á^. . J,. ^ Alternativamente, las enzimas pueden usarse en un "ciclo completo de mañosa" como se muestra en la Figura 8. La manosa-GDP dehidratasa y un polipéptido epimerasa/reductasa pueden usarse junto con la manosa-GDP pirofosforilasa, fosfomanomutasa GDP, hexoquinasa y piruvato quinasa en un 5 ciclo mañosa fucosiltransferasa "completo". El ciclo completo permite usar simplemente mamosa y el sacárido aceptor deseado como el material inicial. Pueden usarse enzimas de ocurrencia natural o recombinantes. Para las reacciones de ciclo completo, las mezclas de reacción están preferiblemente libres de fosfatasas. 10 Los métodos de reacción de la invención pueden optimizarse al alterar los cationes divalenles presentes en la mezcla de reacción, el pH de la reacción, la temperatura y los aditivos tales como la alcalina fosfatasa que pueden mejorar la reacción cinética mediante remoción de los bi-productos inhibidores tales como GDP. Por ejemplo, como se describió anteriormente, la GDP se conoce por inhibir 15 la manosa-GDP dehidratasa y la fucosiltransferasa (Broschat ef al (1985) Eur. J. Biochem. 153:397-401 ; Staudacher, E. (1996) T/6G 8: 391-408). Una mejora adicional en las reacciones de fucosilación puede obtenerse al suplementar los cationes divalentes presentes en la mezcla de reacción como la reacción procede. Los ciclos glicosiltransferasa (ver, la Patente de E.U.A. No. 20 5,374,541 y WO 9425615 A) típicamente producen una o más moles de pirofosfato inorgánico por cada mol de producto formado y típicamente se llevan a cabo en la presencia de un ion metálico divalente. El ion metálico es un cofactor para al menos una de las enzimas en cada uno de los ciclos. Sin embargo, los cationes metálicos divalentes juegan un rol dual en los ciclos glicosiltransferasa. En particular, el ion metálico divalente forma un complejo de muy baja solubilidad con el fosfato inorgánico o el pirofosfato producido por varios procesos en los ciclos glicosiltransferasa. Como un resultado, el ion metálico puede remover el Pi o Ppi de la reacción mediante precipitación. Esto, resulta en cantidades reducidas de iones metálicos presentes en la solución y una disminución correspondiente en las relaciones del volumen total para aquellas enzimas que requieren los cofactores de ion metálico. Para evitar este problema, los métodos de la invención pueden incluir el agregar suficiente catión metálico divalente al medio de reacción para restaurar una porción del catión divalente perdido durante el curso de la reacción para lograr o mantener una concentración del catión metálico divalente en el medio de reacción entre aproximadamente 1 mM y aproximadamente 75 mM. Preferiblemente, la adición del catión metálico divalente ocurre sin interrupción de tal conversión enzimática. Ver, por ejemplo, la Publicación de Solicitud de Patente Internacional W096/32491. Una vez que las reacciones de la invención se optimizan por la manosa- GDP dehidratasa y una epimerasa/reductasa tal como YEF B, otros análogos de estas actividades enzimáticas pueden probarse usando un proceso similar. Por ejemplo, el Fx humano puede sustituirse por la YEF B.

Tabla 2: Fucosiltransferasas que son útiles en los ciclos fucosiltransferasa.

Fucosiltransferasa Referencia al,3/4Fuc -T III Kukowska-Latallo et al (1990) Genes Dev. 4: 1288-1303 al,3Fuc -T IV Kumar et al (1991) J. Biol. Chem. 266: 21777-21783 al,3Fuc -T V eston et al (1992) J. Biol. Chem.267: 4152-4160 al,3Fuc -T VI Weston et al (1992) J. Biol. Chem.267: 24575-24584 al,3Fuc-T VII Natsuka et al (1994) J, Biol. Chem. 270: 20112-20122 a I }3Fuc-T bacterial Ge et al (1997) J. Biol. Chem. 272: 21357-21363 al,2Fuc I Sarnesto et al (1992) J. Biol. Chem. 267: 2745-2752 al,2Fuc -T p Larsen et al (1990) Proc. Nat 7. Acad. Sci. USA 87: 6674- 6678 Para los ciclos glicosiltransferasa, las concentraciones o cantidades de los vanos reactivos usados en los procesos dependen de numerosos factores incluyendo las condiciones de reacción tales como la temperatura y el valor de pH y la selección y la cantidad de sacáridos aceptores a glicosilarse. Debido a que el proceso de glicosilación permite la regeneración de los nucleótidos de activación, los azúcares donantes activados y depuración del PPi producido en la presencia de cantidades catalíticas de las enzimas, el proceso se limita por las concentraciones o cantidades de los sustratos estequiométricos descritos anteriormente. El límite superior de las concentraciones de los reactivos que pueden usarse de conformidad con el método de la presente invención se determina por la solubilidad de dichos reactivos. Preferiblemente, las concentraciones de los nucleótidos de activación, el donador de fosfato, el azúcar donante y las enzimas se seleccionan de manera que proceda la glicosilación ^ - J • - - — - - - — - - - J.,lL.i_.>. .. ._, .__,__.. _____... hasta que el aceptor se consuma, por consiguiente completando la sialilación de los grupos sacápdos presentes en la glicoproteína. Las cantidades o concentraciones de enzimas se expresan en Unidades de actividad, que es una medida de la velocidad inicial de la catálisis. Una Unidad de 5 actividad cataliza la formación de 1 µmol del producto por minuto a una temperatura dada (típicamente 37° C) y el valor de pH (típicamente 7.5). Por lo tanto, 10 Unidades de una enzima es una cantidad catalítica de dicha enzima en donde 10 µmols del sustrato se convierten a 10 µmols de producto en un minuto a una temperatura de 37° C y un valor de pH de 7.5. 10 Los ingredientes anteriores típicamente se combinan al mezclarse en un medio de reacción acuoso (solución). Ese medio tiene un valor de pH de aproximadamente 6 a aproximadamente 8.5. El medio está desprovisto de quelantes que enlazan a los cofactores de enzima tales como Mg+2 o Mn+2. La selección de un medio se basa en la habilidad del medio para mantener el valor de 15 pH en el nivel deseado. Por lo tanto, en algunas modalidades, el medio se estabiliza a un valor de pH de aproximadamente 7.5, preferiblemente con HEPES. Si no se usa un estabilizador, el pH del medio deberá mantenerse a aproximadamente 6 a 8.5, preferiblemente aproximadamente 7.2 a 7.8, mediante la adición de la base. Una base apropiada es NaOH, preferiblemente NaOH 6 M. 0 El medio de reacción también puede comprender detergentes solubilizantes (por ejemplo, Tritón o SDS) y solventes orgánicos tales como metanol o etanol, si es necesario. Las enzimas pueden utilizarse libres en solución o pueden encontrarse enlazadas a un soporte tal como un polímero. La mezcla de reacción ^^^- -- - . . <. _>..„ . - *».,. . .**.. *Ai«~**., . ^.¿a^¡¡? f m«--rtfM?- -» - " - •*""- es por lo tanto susíanciaimente homogénea al inicio, aunque algún precipitado se puede formar durante la reacción. La temperatura a la cua! un proceso anterior puede llevarse a cabo puede oscilar desde justo antes del congelamiento a una temperatura a la cua! la enzima 5 más sensible se desnaturaliza. Ese rango de temperatura es preferiblemente aproximadamente 0o C a aproximadamente 45° C o arriba de 100° C o más para una enzima obtenida a partir de un organismo termofíüco Un rango típico para las enzimas no termofíücas es aproximadamente 20° C a aproximadamente 37° C. La mezcla de reacción formada se mantiene por un pepodo de tiempo 10 suficiente para el porcentaje deseado de los residuos dei aceptor de azúcar a fucosilarse. Para preparaciones a escala comercial, la reacción comúnmente se dejará proceder por aproximadamente 8-24 horas, con un tiempo de entre aproximadamente 24 y 48 horas siendo el más típico. 15 D. Usos de la Fucosa-GDP sintetizada usando los métodos de la invención Los métodos de la invención son úíiles para la síntesis de la fucosa- GDP, que se usa en la síntesis de una variedad de compuestos carbohidratos de interés. Los compuestos carbohidratos pueden ser oligosacáridos o estructuras 20 polisacáridas en glicoproteínas, glicolípidos o moléculas libres. La fucosa-GDP producida usando los métodos de la invención puede usarse, por ejemplo, para la síntesis de una amplia variedad de carbohidratos fucosilados. Junto con las enzimas fucosiltransferasa apropiadas, las siguientes estructuras de carbohidratos pueden obtenerse usando la fucosa-GDP: (1 ) Fuca(1 ?2)Galß-; (2) Galß(1?3)[Fuca(1?4)]GlcNAcß-; (3) Galß(1 ->4) [Fuca(1?3)]GlcNAcß-; (4) Galß(1 ?4)[Fuca(1?3)]Glc; (5) GlcNAcß(1 ?4)(Fuca(1 ?6)]GlcNAcß1 ?Asn; (6) GlcNAcß(1?4)[Fuca(1?3)GlcNAcß1?Asn; (7) Fuca(1?6)Galß?; (8) Fuca(1?3)Galß-; (9) Glcß(1?3)Fuca ?0-Thr y Fuca1?0-Thr/Ser; (10) Fuca?Ceramida y (11 ) Fuca(1->3)Fuc. Ejemplos de productos que pueden formarse usando la fucosa-GDP como un reactivo incluyen, pero no se limitan a aquellos listados en la Tabla 3.

Tabla 3: Estructuras Oligosacáridas Sintetizadas usando fucosa-GDP y Fucosiltransferasa Oligosacárido Tejido fuente III^Fucosil-para-lacto-N-hexaosa Leche humana 3'-Sialil-3-fucosillactosa Leche humana Lewis X Células hematopoyéticas Lewis A Células hematopoyéticas sialilo Lewis X Células hematopoyéticas sialilo Lewis A Células hematopoyéticas Lacto-N-difucohexaosa II Leche humana Lacto-N-fucopentaosa I Leche humana Lacto-N-fucopentaosa II Leche humana 2'-fucosillactosa Leche humana Lactodifucotetraosa Leche humana 3-Fucosi I lactosa Leche humana Lacto-N-fucopentaosa lll Leche humana Lacto-N-difucohexaosa I Leche humana Lacto-N-fucopentaosa V Leche humana Por ejemplo, la presente invención proporciona mezclas de reacción y métodos para la preparación de compuestos que tienen la fórmula Galß(1 -4)(Fuca1 ->3)Glc- R, Galß(1-3)(Fuca1?4)Glc-R, Galß(1?4)(Fuca1?3)GlcN(R')ß-R y Galß(1 ?3)(Fuca1 ?4)GlcN(R')ß-R. En estas modalidades, el sacárido aceptor es Galß(1 -4)Glc-R, Galß(1 -3)Glc-R, Galß(1 ?4)GlcN(R')ß-R o Galß(1 ?3)GlcN(R')ß-R, respectivamente, en donde: R se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, un sacárido, un oligosacárido y un grupo aglicon que tiene al menos un átomo de carbono y R' se selecciona del grupo que consiste de acetil y aliloxicarbonil. Los sacáridos aceptores también incluyen, por ejemplo, NeuAca(2?3)Galß(1 - 4)GlcN(R')ß(1 ?3)Galß-OR y NeuAca(2- 3)Galß(1 ?3)GlcN((R')ß(1 ?3)Galß-OR. Estos sacáridos aceptores pueden formarse mediante sialilación de un compuesto Galß(1?4)GlcN(R')ß(1?3)Galß-OR o Galß(1?3)GlcN(R) ß(1 ?3)Galß-OR con una sialiltransferasa en la presencia de un derivado CMP de un ácido siálico usando una a(2,3)sialiltransferasa bajo condiciones en donde el ácido siálico se transfiere a un azúcar no reductor del compuesto. Los compuestos Galß(1?4)GlcN(IR') ß(1?3)Galß-OR y Galß(1?3)GlcN(R') ß(1?3)Galß-OR pueden formarse mediante la galactosilación de un compuesto de la fórmula GlcN(R') ß(1?3)Galß-OR o GlcN(R') ß(1?3)Galß-OR, respectivamente con una galactosiltransferasa en la presencia de una galactosa UDP bajo condiciones suficientes para formar el compuesto. En algunas modalidades de la invención, se proporcionan los métodos para la síntesis NeuAca(2?3)Galß(1?4)(Fuca?3)GlcN(R')ß(1?3)Galß-OR o NeuAca(2?3)Galß(1?3)(Fuca1?4)GlcN(R')ß(1?3)Galß-OR. En estas fórmulas, R es un hidrógeno, un sacárido, un oligosacárido o un grupo aglicon que tiene al .* n .l ,?«»A*»? »».. •liMiáÉMikto -"- '"m**-*"***»** ¡jU gyÜ -- -«^•*~»~« menos un átomo de carbono. R1 puede ser acetil o aliloxicarbonil (Alloc). El término "grupo aglicon que tiene al menos un átomo de carbono" se refiere a un grupo -A-Z, en el cual A representa un grupo alquileno de 1 a 18 átomos de carbono opcionalmente sustituido con halógeno, tiol, hidroxi, oxígeno, azufre, 5 amino, imino o alcoxi y Z es hidrógeno, -OH, -SH, -NH2, -NHR1, -N(R1)2, -C02H, - C02R1, -CONH2, -CONHR1, -CON(R1)2, -CONHNH2 o OR1 en donde cada R1 es independientemente alquilo de 1 a 5 átomos de carbono. Además, R puede ser (CH2)nCH(CH2)mCH3 ?o (CH2)0CH3, en donde n,m, o = 1-18; (CH2)n-R2 (en el cual n = 0-18), en donde R2 es un anillo aromático variadamente sustituido, preferiblemente, un grupo fenilo, siendo sustituido con uno o más grupos alcoxi, preferiblemente metoxi u 0(CH2)mCH3, (en el cual m = 0-18) o una combinación de los mismos. 15 Las etapas involucradas en la síntesis de estos compuestos incluyen: (a) galactosilación de un compuesto de la fórmula GlcNR'ß(1 - 3)Galß-OR con una galactosiltransferasa en la presencia de una galactosa UDP bajo condiciones suficientes para formar el compuesto. Galß(1 -»4)GlcNR'ß(1?3)Galß-OR; 20 (b) sialilación del compuesto formado en (a) con una sialiltransferasa en la presencia de un derivado CMP de un ácido siálico usando una a(2,3) sialiltransferasa bajo condiciones en las cuáles el ácido siálico se transfiere a un azúcar no reductor para formar el compuesto: NeuAca(2?3)Galß(1 ?4)GlcNR'ß(1 ?3)Galß-OR y (c) fucosilación del compuesto formado en (b) para proporcionar la NeuAca(2?3)Galß(1 ?4)(Fuca1 ?3)GlcNR'ß(1 ?3)Galß-OR. La etapa de fucosilación preferiblemente se lleva a cabo usando los métodos de la invención, como se describió anteriormente. En algunas modalidades, los lisatos de las células recombinantes que expresan una o más de las enzimas de síntesis de la fucosa-GDP se usan en las reacciones. Las reacciones de glicosiltransferasa también pueden emplear lisatos de células que producen glicosiltransferasas recombinantes. En algunas modalidades, al menos dos de las etapas de reacción se llevan a cabo usando células recombinantes que producen una glicosiltransferasa u otra enzima o reactivo. Las diferentes enzimas pueden expresarse mediante la misma célula o por diferentes células recombinantes que contienen cada una, una glicosiltransferasa exógena o pueden mezclarse junto con el gen de síntesis de la fucosa-GDP. Por lo tanto, mediante la mezcla e igualación de los miembros de un juego de células recombinantes, cada una de los cuales contiene un gen de síntesis de azúcar nucleótido diferente o glicosiltransferasa, puede crearse fácilmente la mezcla de reacción para realizar muchas de las reacciones de glicosilación multi-etapa. En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos para la preparación de compuestos como se describe en WO 94/26760. Generalmente estos compuestos tienen la fórmula: NeuAca(2?3)Galß(1 ?4)(Fuc 1 ?3)GlcN(R")ß-OR2 ^^^^¡ ^ ---- "» -«-»-"- En esta fórmula, R" es alquilo o acilo de 1-18 átomos de carbono, 5,6,7,8- tetrahidro-2-naftamido; benzamido; 2-naftamido; 4-amino benzamido o 4- nitrobenzamido. R2 puede ser el mismo como R como se describió anteriormente o puede ser Galß-OR (R es como se describió anteriormente). 5 En las descripciones anteriores, los términos son generalmente usados de conformidad a sus significados estándares. El término "alquilo" como se usa en este documento significa un radical hidrocarburo ramificado o no ramificado, saturado o no saturado, monovalente o divalente, un radical hidrocarburo que tiene de 1 a 20 átomos de carbono, incluyendo alquilos inferiores de 1-8 átomos 10 de carbono tales como metil, etil, n-propil, butil, n-hexil y similares, cicloalquilos (3- 7 átomos de carbono), cicloalquilmetilos (4-8 átomos de carbono) y arilalquilos. El término "arilo" se refiere a un radical derivado de un hidrocarburo aromático mediante la remoción de un átomo, por ejemplo, fenil de benceno. El hidrocarburo aromático puede tener mas de un anillo de carbono no saturado, por 15 ejemplo, naftil. El término "alcoxi" se refiere a radicales de alquilo enlazados a un remanente de la molécula por un oxígeno, por ejemplo, etoxi, metoxi o n-propoxi. El término "alquiltio" se refiere a radicales de alquilo enlazados al remanente de la molécula por un azufre. El término "acilo" se refiere a un radical derivado de un ácido orgánico 20 mediante la remoción del grupo hidroxilo. Los ejemplos incluyen acetil, propionil, oleoil, miristoil. ^^^^^^^^¿^^^^^^^^^^^^^^^^t¿^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^¡^^^^^^^^^^^^^^^^¿^^^^¿ La presente invención también es útil para la síntesis de una variedad de compuestos que comprende partes del carbohidrato de enlace de la selectina. Estas partes de enlace de selectina tienen la fórmula general: R1Galß, m(Fuc 1 ,n)GlcNR°(R2)p— en la cual R° es carbonll (alquilo C.-C8), carbonil (alcoxi C?-C8) o carbonil (alqueniloxi C2-Cg), R1 es un oligosacárido o un grupo que tiene la fórmula R3 C02H R3 y R4 pueden ser los mismos o diferentes y pueden ser H, alquilo C.-C8, hidroxi (alquilo C?-Cs). arilo-(alquilo C?-C8) o (alcoxi C.-C8)-(alquilo C?-C8), sustituido o no sustituido. R2 puede ser H, alquilo C?-C8, hidroxi-(alquilo C?-C8), arilo (alquilo C?-C8), arilo (alquilo C.-C8), alquiltio, a1 ,2 Man, a1 ,6Ga!NAc, ß1 ,3Galß1 ,4Glc, a1 ,2Man-R8, 1 ,6GalNAc-R8 y ß1 ,3Gal-R8. R8 puede ser H, alquilo C?-C8, alcoxi C?-C8, hidroxi-(alquilo C?-C8), arilo-(alquiio C?-C8), ariio (alquilo C?-C8) o alquiltio. En la fórmula, m y n son números enteros y pueden ser 3 o 4, p puede ser cero o 1. Los grupos sustituidos mencionados anteriormente pueden sustituirse por hidroxi, hidroxi (alquilo C.-C4), polihidroxi (alquilo C?-C4), alcanoamido o sustituyentes hidroxialcanoamido os sustituyentes preferidos incluyen hidroxi, . ... « .i..^ . ^^-iti^.h ??í^.o.^Ji.n^sL. polihidroxi (alquilo C3), acetamido e hidroxiacetamido. Un radical sustituido puede tener más de una sustitución, que puede ser la misma o diferente. Para modalidades en las cuales R1 es un oligosacárido, el oligosacárido es preferiblemente un trisacárido. Los trisacáridos preferidos incluyen NeuAca2,3Galß1 ,4GlcNAcß1 ,3 o NeuGca2,3Galß1 ,4GlcNAcß1 ,3.

Para modalidades en las cuales R1 es el grupo que tiene la fórmula: » l C02H R3 y R4 preferiblemente forman un radical simple que tiene la fórmula: 'q (R7)- en la cual R5 es alquilo divalente C3-C , sustituido o no sustituido, R6 y R7 son lo mismo o diferentes y son alquilo divalente C1-C6, sustituido o no sustituido. En la fórmula, q y r son números enteros que pueden ser los mismos o diferentes y son cero o 1. La suma de q y r es siempre al menos 1. Una estructura más preferida para un radical simple formado por R3 y R4 es una que tiene la fórmula: — (R6) en la cual R6 es alquilo divalente C3-C4, sustituido o no sustituido. Por ejemplo, R6 puede tener la fórmula -CH2— CH2— CH2— CH?— , preferiblemente sustituido. El radical puede sustituirse con hidroxi, polihidroxi (alquilo C3) y grupos alcanoamido sustituidos o no sustituidos, tales como acetamido o hidroxiacetamido. La estructura sustituida típicamente formará un monosacárido, preferiblemente un ácido siálico tal como NeuAc o NeuGc enlazados por a2,3 al residuo Gal. En la fórmula general anterior, tanto m como n son números enteros y pueden ser 3 ó 4. Por lo tanto, en un juego de estructuras Gal se enlaza a ß1 ,4 y Fue enlaza a1 ,3 a GIcNAc. Esta fórmula incluye el tetrasacárido SLex. SLex tiene la fórmula NeuAca2,3Galß1 ,4(Fuca1 ,3)GlcNAcß1— . Esta estructura es selectivamente reconocida por las células de soporte LECCAM. Los compuestos SLex que pueden purificarse usando los métodos de la invención incluyen 0 NeuAca2,3Galß1 ,4(Fuca1 ,3)GlcNAcß1 -Gal-OEt, NeuAca2,3Galß1 ,4(Fuca1 ,3)GlcNAcß1 ,4Galß1-OEt y otros que se describen en la solicitud internacional WO 91/19502. Otros compuestos que pueden purificarse usando los métodos incluyen aquellos descritos en la Patente de E.U.A. No. 5,604,207 que tienen la fórmula 15 en donde Z es hidrógeno, acilo C?-C6 o Y se selecciona del grupo que consiste de C(O), S02, HNC(O), OC(O) y SC(O); R1 se selecciona del grupo que consiste de un arilo, un arilo sustituido y un grupo alquileno fenilo C1-C3, en donde dicho arilo sustituto se selecciona del grupo que consiste de un halo, trifluorometil, nitro, alquilo C.-C.8, alcoxi C.-C.ß. amino, mono alquilamino C.-C.8, di alquilamino C.-C.8, benzilamino, alquilbenzilamino d- C?ß, tioalquilo C?-C?8y grupos alquilcarboxamido C.-C.8 o R1Y es al i loxicarboni I o cloroacetil; R2 se selecciona del grupo que consiste del monosacárido (incluyendo ß1 ,3-Gal-OR, donde R=H, alquilo, arilo o acilo), disacárido, hidrógeno, hidrocarbil cíclico C1-C18 de cadena larga o ramificada , alquilo C.-C6, propil 3-(3,4,5- trimetoxifenil), alquileno C1-C5 ?-carboxilato, alquileno C2-C4 ?-silil trisustituído en donde dicho silil ?-trisustituído es un grupo silil que tiene tres sustitutos independientemente seleccionados del grupo que consiste de alquilo C.-C , fenilo, o OR2 de manera conjunta forman un carbamato hidrocarbil C.-C.8 de cadena larga o ramificada o cíclico; R3 es hidrógeno o acilo C?-C8; R4 es hidrógeno, alquilo C.-Ce o benzil; R5 se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, benzil, metoxibenzil, dimetoxibenzil y acil C?-C6; R7 es metil o hidroximetil y X se selecciona del grupo que consiste de aciloxi CI-CT, hidroxilaciloxi C2- Cß, hidroxi, halo y azido. Un juego relacionado de estructuras incluido en la fórmula general es aquel en el cual Gal se enlaza a ß1 ,3 y Fue se enlaza a a1 ,4. Por ejemplo, el tetrasacárido, NeuAca2,3Galß1 ,3(Fuca1 ,4)GlcNAcß1 -, nombrado en este documento como Slea, se reconoce por los receptores selectina. Ver, Berg et al., J. Biol. Chem., 266:14869-14872 (1991). En particular, Berg et al. demostró que las células transformadas con cADN E-selectina selectivamente se enlazan a las neoglicoproteínas que comprenden el Slea. La fucosa-GDP producida por los métodos de la invención puede usarse para modificar los oligosacáridos presentes en glicoconjugados, incluyendo glicoproteínas y glicolípidos. Las proteínas que pueden modificarse por los métodos de la invención ¡ncluyen, por ejemplo, hormonas tales como insulina, hormonas del crecimiento (incluyendo la hormona del crecimiento humano y la hormona del crecimiento bovino), el activador plasminogénico del tipo de tejido (t-PA), renina, factores de coagulación tales como el factor VIII y el factor IX, bombesina, trombina, factor del crecimiento hemopoyético, albúmina en suero, receptores para hormonas o factores del crecimiento, interleuquinas, factores de estimulación de colonia, receptores de células T, polipéptidos MHC, antígenos ^ _t,£ ^ jjr-af "S írtmir ^ás*^?t^¡^^^^¡^^ virales, glicosiltransferasas y similares. Los polipéptidos de interés para la expresión recombinante y la modificación subsecuente usando los métodos de la invención también incluyen la a1 -antitripsina, eritropoietina, factor de estimulación granulocitomacrófago de colonia, antitrombina lll, interleuquina 6, interferón ß, proteína C, fibrinogéno, entre muchos otros. Esta lista de polipéptidos es un ejemplo, no exclusiva. Los métodos también son útiles para modificar los patrones de glicosilación de proteínas quiméricas, incluyendo pero no limitadas a proteínas quiméricas que incluyen una parte derivada de una inmunoglobulina tal como la igG. Los siguientes ejemplos son ilustrativos pero no limitan la presente invención.

Ejemplo 1 Clonación y expresión de los Ácidos Nucleicos que Codifican a la Enzimas de Síntesis de la Fucosa-GDP Este ejemplo describe la clonación y la expresión de los ácidos nucleicos que codifican las enzimas útiles en la conversión enzimática de la manosa-GDP a la fucosa-GDP y el uso de estas enzimas para producir fucosa-GDP.

Métodos A. Amplificación de la Estructura de Lectura Abierta de la manosa-GDP 4,6 dehidratasa Í.M... A OiMsJtmJjijp-ff- -"- gglgg^^^ ^^^^^^^ Ub ^j ¡.feiafc b. Ajain! U??, i i s ^ás^.^-..? La estructura de lectura abierta de la manosa-GDP dehidratasa (GMD) se amplificó mediante PCR usando iniciadores basados en la secuencia conocida por GMD (Stevenson et al. (1996) J. Bacteriol. 178: 4885-4893; Tonetti et al. (1996) J. Biol. Chem. 21 Y. 27274-27279). El ADN genómico de E. coli K12 se purificó usando un equipo de Qiagen, Inc. siguiendo las instrucciones del fabricante. Para amplificar la estructura de lectura abierta GMD, los siguientes iniciadores se utilizaron: iniciador 5': 5' -CGCTCAGATACATGTCAAAAGTCGCT-3' (SEC ID NO: 2); iniciador 3': 5' -GCGAAGCTTTTATGACTCCAGCGCGAT-3' (SEC ID NO: 3). La estructura de lectura abierta para manosa-GDP dehidratasa corresponde a los nucleótidos 8633-9754 del racimo de genes wca de E. coli K12. (Stevenson ef al., supra) (8659-9780 en GenBank No. de Acceso U38473). Cada iniciador se designó con un sitio 5' Xbal y un sitio 3' Hindlll. 100 pmols de cada par iniciador se combinaron con ADN genómico del E. coli K12. Treinta ciclos (95° C por 45 seg, 65° C por 1 min, 73° C por 3 min) se corrieron usando polimerasa Pfu. Los productos se purificaron con gel, se digestaron con Xbal y Hindlll y se subclonaron en estos sitios del plásmido de expresión bacterial pTGK (PCT/US97/20528; Pub. ínter. No. WO 9820111 ). La secuencia de los plásmidos reveló manosa-GDP dehidratasa auténtica con un sitio de inicio ATG colocado apropiadamente para la expresión en pTGK. Esto resultó en el plásmido de expresión pTGK: manosa-GDP dehidratasa (pTGK:GMD).

B. Expresión de la manosa-GDP dehidratasa E. coll JM101 Después de la transformación del pTGKGMD en el filamento E. coli JM101 usando los protocolos de biología molecular estándares, las colonias aisladas crecieron en el medio M9 definido que contenía galactosa para inducir la expresión de la estructura de lectura abierta. Después de una incubación durante toda una noche a 37° C con agitación, las células se granularon y se resuspendieron en Tris 50 mM pH 8.0 en hielo (5 veces del volumen del granulo). Las células se usaron a 4° C con una prensa French. Los restos celulares y las células no usadas formaron células en una centrifugadora (300 rpm; centrifugadora floortop Beckman) por 10 minutos. La nata resultante se almacenó en hielo hasta el análisis, arriba de 2 horas mediante SDS-PAGE y la prueba de actividad.

C. Prueba de manosa-GDP Dehidratasa Para probar la actividad manosa-GDP dehidratasa, se desarrolló una prueba HPLC de fase inversa. Una columna de fase inversa C18 Aquasil se puso en línea en un monitor de solventes Beckman 126. La columna se eluyó isocraticalmente con KH2P04 0.5M por veinte minutos con una velocidad de flujo de 1 ml/min. Se empleo un detector de serie fotodiodo para monitorear la elusión escaneando el rango de longitud de onda 210-300 nm. La actividad manosa-GDP dehidratasa se determinó al reaccionar el extracto de manosa-GDP dehidratasa con 480 nmols ele manosa-GDP en Tris 50 mM pH 7.5, NADP+ 0.15 mM (se requiere absolutamente el NADP+ para la actividad manosa-GDP dehidratasa) en un volumen de reacción de 100 µl. Veinte µl de la mezcla de prueba se inyectaron en la columna C18. Mediante la comparación del área del punto máximo de la enzima de no control, correspondiendo a 200 nmols, la disminución en el área del punto máximo de la manosa-GDP se usó para medir directamente la actividad de la manosa- GDP dehidratasa mediante la siguiente fórmula: 1. (Área del punto máximo no enzima) - (Área del punto máximo enzima) = (Área del punto máximo de la manosa-GDP consumida) 2. (Área del punto máximo de la manosa-GDP consumida)/(Área del punto máximo no enzima) = % del los 200 nmols de la manosa-GDP consumida. Para controlar cualquier pérdida por sobrecarga en la inyección HPLC, se agregaron 10 nmols de CTP a la muestra para analizarse.

D. Amplificación de las Estructuras de Lectura Abierta YEF B, Fx humano y wca H Los ácidos nucleicos que incluyen las estructuras de lectura abierta de YEF B, wcaH y Fx humano se amplificaron usando iniciadores que se sintetizaron basándose en la secuencia de nucleótidos reportada (Stevenson ef al. (1996) supra.; Tonetti ei al. (1996) supra). El ADN genómico del E. coli K12 se purificó usando un equipo de Qiagen, Inc., siguiendo las instrucciones del fabricante. Para amplificar estas estructuras de lectura abierta se usaron los siguientes iniciadores: YEF B iniciador 5': 5' -CGTCCTAGAGCGATGAGTAAACAACGAGTT-3' (SEC ID NO: 4); iniciador 3': 5' -GCGAAGCTTTTACCCCCGAAAGCGGTC-3' (SEC ID NO: 5); wca H iniciador 5': 5' -GCTCTAGAGTAATGATGTTTTTACGTCAGG-3' (SEC ID NO: 6); iniciador 3": 5' -CCCAAGCTTTCATAATCCGGGTACTCCGGT-3' (SEC ID NO: 7) y 5 Fx humano iniciador 5': 5' -GCTCTAGAGACATGGGTGAACCCCAGGGAT-3' (SEC ID NO: 8); iniciador 3': 5' -ACGAAGCTTCACTTCCGGGCCTGCTCGTAGTTG-3' (SEC ID NO: 9). 10 YEF B y wcaH corresponden a los nucleótidos 9757-10722 (9783-10748 en GenBank No. de Acceso U38473) y 10722-11204 (10748-11230 en GenBank No. de Acceso U38473) respectivamente, del racimo de genes wca del E. coli K12 (Stevenson et al., supra). Cada iniciador se designó con un sitio 5' Xbal y un sitio 3' HindlU. Un ciento 15 de pmols de cada par iniciador se combinó con ADN genómico del E. coli K12 o en el caso del Fx humano, cADN de la placenta humana. Treinta ciclos (95° C por 45 seg, 65° C por 1 min, 73° C por 3 min) se corrieron con polimerasa Pfu. Los productos se purificaron con gel, se digestaron con Xbal y HindWl y se subreprodujeron en estos sitios del plásmido de la expresión bacterial pTGK 20 (PCT/US97/20528; Pub. ínter. No. WO 9820111 ). Esto resultó en los siguientes plásmidos de expresión: pTGK?EF B, pTGK: Fx humano (pTGKFx) y pTGK: wcaH.

E. Expresión de YEF B (wcaG), Fx Humano y wcaH en E. coli JM101 Después de la transformación de pTGK?EF B, pTG Fx y pTGK:wcaH en el filamento E. coli JM101 usando protocolos de biología molecular estándares, las colonias aisladas crecieron en el medio definido M9 que contenía galactosa para inducir la expresión de las estructuras de lectura abierta. Después de una incubación durante toda la noche a 37° C con agitación, las células se granularon y se resuspendieron en Tris 50 mM pH 8.0 en hielo (5 veces el volumen del granulo). Las células se usaron a 4o C con una prensa French. El desecho celular y las células no usadas se granularon en una centrifugadora (3000 rpm Beckman floortop) por 10 minutos. La nata resultante se almacenó en hielo hasta el análisis, arriba de 2 horas mediante SDS-PAGE y la prueba de actividad.

F. Prueba de Actividad para YEF B y Fx humano Para probar la actividad YEF B, se desarrolló una prueba HPLC de fase inversa. Una columna de fase inversa Aquesil C18 se puso en línea en un monitor de solvente Beckman 126. La columna se eluyó isocraticalmente con KH2P0 0.5M por veinte minutos con una velocidad de flujo de 1 ml/min. Se empleo un detector de serie fotodiodo para monitorear la elusión escaneando el rango de longitud de onda 210-300 nm. Se empleó una prueba acoplada para probar la actividad YEF B. Se requirió esto dado que su sustrato, 4-ceto-6-deoximanosa-GDP, es inestable y no está disponible comercialmente. Se permitió reaccionar veinte mUnidades de manosa-GDP dehidratasa con 480 nMols de manosa-GDP por 20 minutos bajo condiciones de prueba estándares como anteriormente. Después de este tiempo más del 90% i rt, Aij. iirr Ma ?táízáiU: . _.,_. ...______._. ^•^t¡^*<Mukh^?t»?^?,.^?j?klta^?x ^¿.« .¿ l i de la manosa-GDP se había convertido a 4-ceto-6-deoximanosa-GDP, el sustrato para YEF B. Posteriormente se realizaron las siguientes adiciones: 500 nmols de glucosa, MgCI2 a 20 mM. NADPH a 0.15 mM, 10 mM Unidades de glucosa dehidrogenasa, 100 nmols CTP (para normalizar por pérdidas que puedan ocurrir cuando la muestra se inyecta en HPLC), YEF B y agua a 50 µl. Se permitió que la reacción procediera por diez minutos en tal punto la reacción se detuvo mediante congelación en hielo seco. Después de la descongelación alícuotas de 10 µl se analizaron mediante análisis HPLC de fase inversa. La cantidad de fucosa-GDP formada se calculó al analizar una mezcla de prueba separada en la ausencia de manosa-GDP dehidratasa para producir un valor del 100 % para el punto máximo de absorción de manosa-GDP. Posteriormente se dividió esta área del punto máximo por el área del punto máximo de la fucosa-GDP formada para producir el porcentaje de fucosa-GDP formada (% de fucosa-GDP) (nMols manosa-GDP en la reacción) = nMols de fucosa-GDP formada.

G. Caracterización del azúcar nucleótido formada por la manosa-GDP dehidratasa y YEF B. Para confirmar que la manosa-GDP dehidratasa y YEF B convierten a la manosa-GDP a fucosa-GDP, la manosa-GDP dehidratasa y los extractos YEF B reaccionaron con 5 mg de manosa-GDP y 6 mg de NADPH en Tris 50 mM pH 8.0. El volumen de reacción fue de 1 ml. Después de 3 horas, el 95% de la manosa-GDP se convirtió en un punto máximo de absorción que emigró con la fucosa-GDP. La reacción se templó con 2 ml de metanol, el precipitado se granuló y la i-.üiátf'" -». -i-^— - ««a..*-,.» .. . _._»_.__^_t^µ^^^«-*^tj¡afafcitaiiátÉB .jfc.i.. í nata se secó bajo vacío. El azúcar nucleótido resultante posteriormente reaccionó con sialilo N-acetillactosamina (SLN; un precursor para el sialilo Lewisx), fucosiltransferasa V (20 m Unidades), MnCI2 1 mM en Tris 50 mM pH 7.5 por 24 horas a 37° C. El volumen de reacción fue 200 µl. La reacción aproximadamente fue 80-85% completa según lo juzgado por el TLC. El producto oligosacárido se resolvió de los nucleótidos y la proteína mediante purificación en una columna 15 ml P2 eluída con 20% de etanol y se monitoreo la elusión con un detector de serie fotodiodo. Posteriormente se secó el producto oligosacárido bajo vacío, los protones se intercambiaron con D20 y se sometieron a NMR de protones 500 MHz. Este análisis reveló que el compuesto auténtico que contenía al sialilo Lewisx estaba formado, demostrando que la manosa-GDP dehidratasa y el YEF B actúan de manera conjunta para formar la fucosa-GDP.

H. Síntesis de fucosa-GDP a escala 0.2 kG 800 gramos del granulo celular bacterial expresando la manosa-GDP dehidratasa (GMD) se resuspendieron en 4 litros de hielo Tris 50 mM pH 7.5. Las células se interrumpieron mediante el paso a través de un microfluidizador, el desecho se granuló mediante centrifugación a 4,000 rpm por 15 minutos y la nata se separó del granulo mediante decantación. 200 gramos de manosa-GDP, 87% puros por HPLC, se obtuvieron de Boehringer Mannheim y se disolvieron en 1 litro de Tris 50 mM pH 7.5. A esta solución, 4 litros del extracto de GMD (2000 Unidades) se agregaron junto con NADPH+ para una concentración final de 0.15 mM. La concentración final de . t?r . manosa-GDP fue 66 mM. El azido de sodio se agregó a 0.05 % para inhibir el crecimiento bacterial. La reacción se incubó a 32° C con agitación suave y la reacción seguida por HPLC. Después de 5 horas, 98% de la manosa-GDP se había convertido en su intermediario, 4-ceto-6-deoximanosa-GDP en cuyo tiempo una nata YEF B de un granulo celular bacterial de 300 gramos expresando YEF B derivó idénticamente a la nata GMD (1500 Unidades) se agregaron a la mezcla de reacción junto con 20 mg de NADPH, 0.66 mol de glucosa (2 equivalentes molares a manosa-GDP) y 1800 unidades de glucosa dehidrogenasa. La incubación a 32° C se continuó durante toda la noche con agitación suave. A la mañana siguiente, el 100 % del intermediario, 4-ceto-6-deoximanosa-GDP se había convertido a fucosa-GDP como se determinó por HPLC. Este material se pasó a través de una membrana de flujo tangencial 10 kD MWC para remover el material de alto peso molecular incluyendo la proteína y los polisacáridos bacteriales. El efluente conteniendo la fucosa-GDP posteriormente se precipitó mediante adición de etanol al 80%. Después del almacenamiento a 4o C, la nata se decantó y el precipitado de fucosa-GDP se granuló en una centrifugadora a 4500 rpm por 20 minutos. La nata se removió y los granulos se resuspendieron en agua y se liofilizaron. De 200 gramos de manosa-GDP, 140 gramos de fucosa-GDP se obtuvieron de una producción molar de 72%. La pureza de la fucosa-GDP fue similar a la de la manosa-GDP, aproximadamente 87%.

/. Síntesis del Antígeno Sialil Lewis X en una escala de 100 gramos Usando Fucosilación Enzimática.

Aproximadamente 128 gramos o 0.15 mol de SLN (el precursor tetrasacárido de sialil Lewis X) se agregaron a 110 gramos o 0.18 mol de fucosa- GDP y se resuspendieron en 2.5 litros de agua. Se agregaron Tris 5m pH 7.5 a una concentración final de 50 mM y MgCI2 se agregaron a una concentración final de 20 mM, 440 ml de fucosiltransferasa V (FT V) a 1.24 Unidad/ml purificada de caldo A. niger se agregaron junto con 600 unidades de fosfatasa alcalina de Boehringer Mannheim. El azido de sodio se agregó a 0.04 %. El volumen final fue de 3 litros. La reacción se monitoreo mediante TLC, HPLC para determinar el nivel de fucosa-GDP, GDP y MgCI2. El pH de la reacción se monitoreo mediante un medidor de pH. El sistema solvente usado para el análisis TLC fue isopropanol: agua 4:1. Después que se juzgó que la reacción estaba completa mediante TLC, el sialil Lewis X se purificó usando ultrafiltración.

J. Síntesis del Antígeno Sialil Lewis X en una Escala de 1 mg Usando un Medio Ciclo Enzimático Se corrió el medio ciclo usando las siguientes condiciones (todas las concentraciones son finales): SLN 5 mM; manosa-GDP, 10 mM; Glucosa, 18 mM; MgCI2, 20 mM; Tris pH 7.5, 50 mM; NADP+, 0.12 mM; manosa-GDP dehidratasa, 1.16 Unidad/ml; YEF B 740 mUnidad/ml; glucosa dehidrogenasa, 330 Unidades/ml; FT V, 46 mUnidades/ml; piruvato quinasa, 16.5 Unidades/ml; azido de sodio, 0.04 % El volumen final fue 220 µl. La reacción se monitoreo mediante TLC y HPLC.

Resultados A. Caracterización de la Manosa-GDP Dehidratasa 1. Expresión de la manosa-GDP Dehidratasa La expresión de manosa-GDP dehidratasa se analizó mediante SDS-PAGE. Una banda larga se presentó en 42 kD, el peso molecular predicho; esta banda no estuvo presente en el vector de solo control o las células de expresión YEF B. 2. Caracterización de manosa-GDP dehidratasa Para caracterizar la actividad enzimática de la manosa-GDP dehidratasa, se desarrolló una prueba HPLC lineal. La prueba que se basó en diferencias hidrofóbicas entre manosa-GDP, 4-ceto-6-deoximanosa-GDP y fucosa-GDP, es capaz de resolver la manosa-GDP, la 4-ceto-6-deoxi-manosa-GDP, la 4-ceto-6- deoxi-galactosa GDP y la fucosa-GDP. El análisis cromatográfico reveló que más del 98% de la manosa-GDP se había convertido a 4-ceto-6-deoximanosa-GDP. La prueba de que este producto es 4-ceto-6-deoximanosa-GDP se demostró mediante la adición de NADPH y YEF B o proteína Fx que convierte el producto a fucosa-GDP. Las características sobresalientes de esta prueba son: 1 ) concomitante con una disminución en la manosa-GDP existe un incremento en los intermediaros formados por la manosa-GDP 4,6 dehidratasa que se resolvieron por la columna, sirviendo como un control interno para demostrar que la disminución en la manosa-GDP no se debe a la actividad hidrolítica y 2) reproductibilidad cuantitativa. 3. Prueba de Linealidad de la manosa-GDP dehidratasa con el tiempo Para demostrar la linealidad de la prueba manosa-GDP dehidratasa con el tiempo, se realizó la prueba estándar en un tubo eppendorf individual y alícuotas de 10 µl se removieron en rangos de tiempo de 0-30 minutos e inmediatamente se congelaron en hielo seco antes del análisis HPLC de fase inversa. Las muestras se descongelaron e inmediatamente se inyectaron en una columna aquasil HPLC de fase inversa. Como se muestra en la Figura 2, la prueba es lineal arriba de los 30 minutos. Sorpresivamente, la prueba permaneció lineal incluso cuando arriba del 90% del sustrato se consumió. Esto indica que la concentración manosa-GDP permanece arriba del Km de la manosa-GDP dehidratasa y que la 4-ceto- deoximanosa-GDP no inhibe a la enzima. 4. pH Óptimo Para determinar el pH óptimo de la enzima, el pH varió de pH 6.5-8.0 usando MES 50 mM o Tris como estabilizadores y se realizó la prueba estándar. La Tabla 4 muestra el perfil de pH de la manosa-GDP dehidratasa e ilustra un pH óptimo de 7.0. Abajo del pH 7.0, la actividad es aproximadamente 70 % que del pH 7.0, mientras que los pHs arriba de 7.0 producen solamente una disminución moderada en actividad.

Tabla 4: Perfil del pH de la GMD Dado que la manosa-GDP dehidratasa se usará junto con la epimerasa/reductasa y fucosiltransferasa que tienen el pH óptimo de 7.5, el pH de 7.5 se seleccionó como el pH de trabajo para la prueba estándar. 5. Dependencia en NADP Cuando se prueba en la ausencia del NADP+, la manosa-GDP dehidratasa es completamente inactiva. Adicionalmente, el NAD+ no sustituirá al NADP+. Por otra parte, si se incluye la fosfatasa alcalina en la prueba, la actividad manosa- GDP dehidratasa es severamente atenuada. Estos datos se despliegan en la Tabla 5.

Tabla 5. Dependencia NADP+ de GMD 6. La manosa-GDP dehidratasa no depende de cationes divalentes Cuando la manosa-GDP dehidratasa se probó bajo las condiciones de la prueba estándar en la presencia o ausencia de MgCI2 o MnCI2 en concentraciones oscilando de 1-20 mM, esencialmente ningún efecto se observó en actividad. Estos resultados se ilustran en la Tabla 6.

Tabla 6: Dependencia de GMD en Cationes Metálicos Divalentes 7. Inhibición de la Manosa-GDP Dehidratasa por la Fucosa-GDP Dado que la manosa-GDP dehidratasa representa la primera etapa realizada en la biosíntesis de la fucosa-GDP, es posible que la fucosa-GDP sea un inhibidor de retroalimentación de la enzima. Para determinar si esto es verdad, se realizó la prueba estándar en presencia de las cantidades crecientes de fucosa- GDP. La Figura 3 despliega la curva de inhibición. Es claro que la fucosa GDP es un inhibidor potente de esta enzima con un IC50 de aproximadamente 40 µM. Esto es muy importante desde el punto de vista de la síntesis de los oligosacáridos fucosilados dado que el proceso sintético requerirá que 1 ) la fucosa-GDP sea removida de la mezcla de reacción como ocurriría con la adición de fucosa a una cadena de oligosacáridos vía fucosiltransferasa o 2) que toda la manosa-GDP se ^•^^ convierta a su intermediario, la 4-ceto-6-deoximanosa-GDP antes de la conversión de la fucosa-GDP.

B. Caracterización de YEF B, wcaH y Fx humano Expresadas en E. coli 1. Expresión YEF B Para la prueba de expresión, la bacteria hospedando estos plásmidos creció, se liso y analizó mediante SDS-PAGE. Estos lisatos se compararon con los lisatos bacteriales hospedando solo el vector pTGK. Los lisatos hospedando dos clones YEF B separados despliegan proteínas altamente expresadas en 36.5 Kd que están ausentes en los lisatos de la bacteria hospedando solo al vector. El peso molecular predicho de YEF B es 36.5 Kd (Stevenson ef al. (1996) J. Bacteriol. 178:4885-4893; Tonetti et al; supra). 2. Expresión Fx humana y wcaH La expresión de wcaH y Fx humana en E. coli de los vectores de expresión pTGK:wcaH y pTGKFx humano (pTGKFx) se examinaron mediante SDS-PAGE. Una banda grande se observó para la wcaH. Algo inesperado, la proteína Fx humana también se expresó en niveles significativos en la bacteria usando este sistema de expresión. 3. Prueba de la Actividad Fx humana v YEF B La YEF B y la Fx humana se probaron usando un método HPLC que resuelve la manosa-GDP de la 4-ceto-6-deoximanosa-GDP, la 4-ceto-6- deoxiglucosa GDP y fucosa-GDP basada en hidrofobicidad como se describió en los métodos. El análisis HPLC mostró que 55 minutos después de la adición de la manosa-GDP dehidratasa, esencialmente toda la manosa-GDP se había consumido y convertido en los productos intermediarios. En adición de YEF B y NADPH a esta mezcla de prueba, un punto máximo con el mismo espectro de absorción como fucosa-GDP y co-emigra con la fucosa-GDP. Si se usa un extracto irrelevante en lugar del extracto YEF B (extracto de las células JM101 hospedando solamente al plásmido pTGK) el punto máximo de la- absorción fucosa no aparece. Esto indica que la manosa-GDP dehidratasa trabaja junto con YEF B para formar la fucosa-GDP. Por lo tanto la YEF B, similar a su homólogo humano, Fx, es una epimerasa y una reductasa. Se obtienen resultados idénticos si la YEF B se purifica mediante cromatografía de azul Cibacron, proporcionando evidencia adicional de que la YEF B codifica las actividades epimerasa y reductasa en una sola enzima. La proteína Fx humana también desplegó actividad significativa en esta prueba, aunque a niveles aproximadamente 10 veces menos que la YEF B. Esto refleja el nivel de expresión deducido de los geles SDS-PAGE. 4. pH óptimo La prueba de pH se varió de 6.5 a 8.0 usando MES y Tris como estabilizadores. La mezcla de prueba estándar contenía 2 unidades de mañosa dehidratasa GDP, 480 nmol de mañosa GDP, 500 nmol de glucosa, MgCI2 20 mM, NADPH 0.2 mM, 10 mUnidades de glucosa dehidrogenasa (para reciciar el NADPH usado por la YEF B9, 50 mM de estabilizador en el pH apropiado y la YEF B en la dilución apropiada. Se permitió que la reacción procediera por 15 minutos a 37° C e inmediatamente se congeló en hielo seco para detener la reacción. Las alícuotas de 10 µl se removieron después de la descongelación y se analizaron mediante HPLC de fase inversa. Como se muestra en la Tabla 7, la YEF B tiene un pH óptimo de 7.5.

Tabla 7. pH Óptimo de YEF B 5. Requerimiento de Ion Metálico Para estudiar el requerimiento de ion metálico, se emplearon las condiciones de prueba estándares con la adición de varias concentraciones de MgCI2 y MnCI2. Estos dos cationes divalentes se seleccionaron dado que la YEF B puede usarse en un ciclo fucosa y la fucosiltransferasa V requiere MgCI2 o MnCI2 para la actividad. La Tabla 8 despliega los resultados que muestran que la YEF B se inhibe severamente en una manera dosis dependiente por el MnCI2 en concentraciones requeridas para la actividad fucosiltransferasa V. En contraste el MgCI2 fue realmente algo estimulante. Por lo tanto, los "medios ciclos" de fucosa preferiblemente se corren en la presencia de MgCI2 pero no de MnCI2.

Tabla 8: Análisis del Efecto del Ion Metálico en la Actividad YEF B 6. Linealidad en el Tiempo Para determinar la linealidad de la prueba YEF B acoplada en el tiempo, se emplearon condiciones de prueba estándares. Alícuotas de diez µl se removieron del mismo frasco durante 30 minutos. Un tubo separado que no contenía mañosa dehidratasa GDP se utilizó como el control al 100%. La Figura 4 despliega los resultados de esta prueba con respecto al tiempo. A pesar de que la prueba es no lineal con respecto al tiempo, provee una aproximación excelente de la actividad. 10 Las explicaciones probables para la falta de linealidad incluyen la inhibición del producto de la etapa de epimeración o la etapa de reducción, o ambas. A pesar de todo, el usar esta prueba indica que una fermentación de veinte litros produce 600- 700 unidades/litro; suficiente para la síntesis multi kilogramos del antígeno sialil Lewis X u otros oligosacáridos fucosilados de interés. 15 7. Producción de fucosa-GDP a partir de manosa-GDP en una escala de 0.2 kG Para demostrar que la manosa-GDP dehidratasa y la YEF B pueden usarse para producir fucosa-GDP a escala, 200 gramos de manosa-GDP se convirtieron 0 en fucosa-GDP. Esto se efectuó usando 2000 unidades de manosa-GDP dehidratasa y 20O0 unidades de YEF B. Para lograr completar la conversión de manosa-GDP en su intermediario 4-ceto-6-deoximanosa-GDP, la YEF B y la glucosa dehidrogenasa deben agregarse después de que toda la manosa-GDP se ha convertido a 4-ceto-6-deoximanosa-GDP. Esto es porque la fucosa-GDP, el producto de la YEF B es un inhibidor 40 µM de la manosa-GDP dehidrogenasa (ver la Figura 3). Dado que la concentración de la mañosa GDP en la mezcla de reacción es de aproximadamente 65 mM, una vez que la YEF B se añade junto con el NADPH y la glucosa dehidrogenasa para reciclar el NADPH, la conversión de manosa-GDP en su intermediario mediante la manosa-GDP dehidrogenasa se detiene. Por lo tanto, la reacción preferiblemente se monitorea mediante HPLC para rastrear la cantidad de manosa-GDP consumida y la cantidad de 4-ceto-6- deoximanosa-GDP generada. Una vez que la manosa-GDP se ha convertido completamente en su intermediario, 2000 unidades de YEF B, 900 unidades de glucosa dehidrogenasa, 1 gramo de NADPH y 1.2 equivalentes molares de glucosa (relativa a manosa- GDP) se agregaron a la mezcla de reacción y se incubaron durante toda la noche a 35° C. La mezcla se procesó al pasar la mezcla a través de un dispositivo de filtración de flujo tangencial MWC 10 kD para remover la mayoría de las proteínas y polisacáridos. La fucosa-GDP se purificó y concentró mediante ultrafiltración seguida por precipitación mediante la adición de etanol al 80%. La etapa de precipitación removió efectivamente los monosacáridos libres (glucosa y gluconato) que no se removieron mediante la etapa de ultrafiltración. En una base mol:mol esto iguala a una producción aproximada del 65%. El análisis HPLC se usó para confirmar que la reacción se completo. 8. Fucosilación del Precursor Antígeno Sialil Lewis X en la Escala de 100 Gramos Para demostrar la utilidad de la manosa-GDP dehidratasa bacterial y la YEF B para la síntesis a gran escala del antígeno sialil Lewis X y otros carbohidratos bioactivos, una reacción de 100 gramos se llevó a cabo en la cual el precursor tetrasacárido Neu5Aca2,3 Galß1 ,4GlcNAcß1 ,3Gal-OR (SLN), el precursor tetrasacárido del antígeno sialil Lewis X se fucosiló para formar el antígeno sialil Lewis X. La conversión del SLN en el antígeno sialil Lewis X se monitoreo mediante HPLC, TLC y el pH por el electrodo pH. Los resultados de esta prueba se muestran en la Figura 5, en la cual la formación del sialil Lewis X se monitoreo por la detección del incremento en la concentración de GDP libre. También se muestra el pH de la mezcla de reacción. Como el GDP se hidrolizó mediante fosfatasa alcalina liberando fosfatasa inorgánica, el pH de la reacción disminuyó. La fosfatasa inorgánica liberada también formó un precipitado con iones de magnesio, disminuyendo la concentración del magnesio libre, como se muestra en la Figura 6. La disminución en el pH y los iones de magnesio reducen dramáticamente la reacción por dos razones: 1 ) a medida que el pH disminuye, la actividad de la fosfatasa alcalina se inhibe severamente causando que el GDP se acumule a niveles que inhiben la fucosiltransferasa y 2) la fucosiltransferasa V requiere -^, * . Í ? ? r1 ,A.i» ¿.. ^. * bLl^ . . ^^M?t^.. .Í..S.1... ,. __. M , ) r^ ^|1|^ftr^^»a^M8aAi,.fe... . ,4.., ., .. . magnesio a una concentración de 20 mM para óptima actividad. Por lo tanto, como la concentración de magnesio disminuye, la actividad fucosiltransferasa también disminuye. Por consiguiente, el pH de reacción y las concentraciones de magnesio preferiblemente se monitorean y la reacción se suplementa con MgCI2 y el pH se mantiene en 8.0 mediante la adición de NaOH. Dado que la fosfatasa intestinal de becerro tiene un pH óptimo de 9.5 y tiene solamente el 10 % de su actividad a pH 8.0, una fosfatasa neutra (una con una actividad de pH neutro) es óptima para esta reacción. Un análisis de curso del tiempo de una reacción de síntesis del sialil Lewis X a gran escala mostró que la reacción procede inicialmente muy rápido y posteriormente se retrasa dramáticamente. Esto fue debido a la acumulación de GDP y la disminución en el magnesio como se describió anteriormente. Una vez que el pH se colocó en 8.0 y se mantuvo en este nivel y la reacción se suplemento con fosfatasa alcalina y magnesio (que se realizó a 50 horas en esta reacción) la reacción procede a su terminación a más del 95% con 15 gramos de fucosa-GDP agregada al suplemento de la reacción. Se tomaron muestras a 1 , 43, 147 y 160 horas. 9. Análisis NMR del Producto de la Reacción Final de Sialil Lewis X a Escala de 100 Gramos El producto de reacción final se purificó mediante ultrafiltración y se sometió al análisis NMR para confirmar la adición de la fucosa a Neu5Aca2,3Galß1 ,4GlcNAcß1 ,3Gal-OR. El espectro fue idéntico al antígeno sialii j íl lf-TlwiiT1 ~J - 4jt*?« - . i-"--" .-•«*- - . ,-,!...... Í.?»J»t??íl?itu^?^»r.AM??Í?k?^* .. . . .,.-.».. , - , ^,^...„^a..^.

Lewis X auténtico y confirma que la acción concertada de la manosa-GDP dehidratasa y la YEF B forma la fucosa-GDP. Este sustrato donante posteriormente puede usarse mediante fucosiltransferasas para sintetizar los oligosacáridos fucosilados, en este ejemplo el antígeno sialil Lewis X. 10. Conversión de SLN al Antígeno Sialil Lewis X Usando un Medio Ciclo Enzimático Experimentos previos demostraron que la fosfatasa alcalina inactivo la manosa-GDP dehidratasa mediante la penetración de su cofactor (NADP) del grupo fosfato (Ver la Tabla 5). Por lo tanto la fosfatasa alcalina no pudo usarse para hidrolizar la GDP a su nucleótido libre. Se requiere la remoción de la GDP para esta reacción para proceder a terminarla debido a que la GDP es un inhibidor potente de las fucosiltransferasas (Shinoda et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:31992- 31997). Para terminar la remoción de la GDP, se probó la conversión de GDP a GTP. La GTP es un inhibidor de la fucosiltransferasa V 10 veces menos potente que la GDP. Para convertir la GDP a GTP, se emplearon PEP y piruvato quinasa en la mezcla de reacción. El esquema para esta reacción fucosiltransferasa de medio ciclo de manosa-GDP se muestra en la Figura 7. El análisis TLC demostró que la reacción consistiendo de SLN 5 mM y manosa-GDP 10 mM, procede a la terminación aproximadamente del 95% después de 2 días. Se requiere un exceso doble 10 molar de PEP a manosa-GDP para terminar esta reacción. Dos importantes resultados emergen de este experimento: 1 ) Es posible para el medio ciclo de manosa-GDP proceder a cercana terminación si la GDP se convierte a GTP y 2) existe fuerte evidencia que el inicio de un ciclo completo de mañosa con la adición de hexoquinasa, fosfomapomutasa y manosa-GDP pirofosforilasa resulta en una reacción eficiente. Ver la Figura 8 para una ilustración del ciclo completo fucosiltransferasa, en el cual la fucosa-GDP se sintetiza de la mañosa. 5 Debe entenderse que los ejemplos y modalidades descritos en este documento son para propósitos ilustrativos solamente y que se pueden sugerir varias modificaciones o cambios de los mismos por las personas expertas en la técnica y están incluidos en el espíritu y alcance de esta descripción y las reivindicaciones que le acompañan. Todas las publicaciones, patentes y 10 solicitudes de patente citadas en este documento se incorporan como referencia. 15 20

Claims

REIVINDICACIONES Un vector de expresión que comprende un promotor operablemente enlazado a un ácido nucleico que codifica una subunidad de enzima procariótica que tiene una actividad epimerasa y una actividad reductasa que cataliza la conversión de 4-ceto-6-deoximanosa-GDP a fucosa-GDP. El vector de expresión de conformidad con la reivindicación 1 , en donde el ácido nucleico codifica a un polipéptido que es al menos 60 % idéntico a un polipéptido E. coli YEF B. El vector de expresión de conformidad con la reivindicación 2, en donde el ácido nucleico codifica a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 1. El vector de expresión de conformidad con la reivindicación 3, en donde el polipéptido es un polipéptido E. coli YEF B. El vector de expresión de conformidad con la reivindicación 1 , en donde el ácido nucleico es sustancialmente idéntico a un ácido nucleico de codificación YEF B. El vector de expresión de conformidad con la reivindicación 1 , en donde el vector de expresión carece de una región de codificación E. coli wcaH. 7. El vector de expresión de conformidad con la reivindicación 1 , en donde el promotor es un promotor heterólogo. 8. El vector de expresión de conformidad con la reivindicación 7, en donde el promotor es un promotor inducible. 9. El vector de expresión de conformidad con la reivindicación 7, en donde el promotor es un promotor tac-gal dual. 10. Una célula que comprende el vector de expresión de conformidad con la reivindicación 1. 11. La célula de conformidad con la reivindicación 10, en donde la célula es una célula procariótica. 12. La célula de conformidad con la reivindicación 10, en donde la célula está permeabilizada. 13. Una mezcla de reacción para sintetizar la fucosa-GDP, la mezcla de reacción comprendiendo 4-ceto-6-deoximanosa-GDP, NADPH o NADH y una sub-unidad de enzima procariótica que tiene una actividad reductasa y una actividad epimerasa, en donde la enzima procariótica puede catalizar la conversión de 4-ceto-deoximanosa-GDP a fucosa-GDP. , . ^ .» J. i .___l_____i -f*- fc«^ .. .^r., m. __^__. . „ ^ ', "tt?ttrtt ffittft??fl¡ - *-"*»-'** ¿-" - -*"" - - *^— • -- La mezcla de reacción de conformidad con la reivindicación 13, en donde la enzima procariótica es sustancialmente idéntica a E. coli YEF B. La mezcla de reacción de conformidad con la reivindicación 13, en donde la 4-ceto-6-deoximanosa-GDP se forma mediante: proporcionar una mezcla de reacción que comprende manosa-GDP, manosa-GDP-4,6-dehidratasa y NADP+ e incubar la mezcla de reacción por un tiempo suficiente para convertir al menos aproximadamente 90 % de la manosa-GDP a 4-ceto-6-deoximanosa-GDP. La mezcla de reacción de conformidad con la reivindicación 13, en donde la enzima procariótica se proporciona como un lisato de células que comprende un vector de expresión que comprende un promotor operablemente enlazado a un ácido nucleico que codifica a la enzima procariótica. Un método para la conversión enzimática de manosa-GDP a fucosa-GDP, el método comprende: a) proporcionar una mezcla de reacción que comprende manosa-GDP, manosa-GDP 4,6-dehidratasa y NADP+ o NAD+, en donde la manosa-GDP 4,6-dehidratasa convierte la manosa-GDP a 4-ceto-6- deoximanosa; » jttÁ,Íaá?&MX*íí álb?? ¡.. ..... ...a . ,_. .,.,,..-. »^¡^fLhA[pjt yif^|.aj%i, b) incubar la mezcla de reacción por un tiempo suficiente para convertir la 4-ceto-6-deoximanosa-GDP a fucosa-GDP; en donde el método comprende la reducción de la inhibición de retroalimentación mediada por la fucosa-GDP de la manosa-GDP 4,6-dehidratasa por uno o ambos de los siguientes métodos: c) incubar la mezcla de reacción de a) por un tiempo suficiente para convertir al menos aproximadamente 90% de la manosa-GDP a 4- ceto — 6-deoximanosa-GDP antes de realizar b) o d) transferir una fucosa de la fucosa-GDP a un sacárido aceptor mediante: 1 ) agregar una fucosiltransferasa y el sacárido aceptor a la mezcla de reacción y 2) incubar la mezcla de reacción por un tiempo suficiente para transferir la fucosa de la fucosa-GDP a un sacárido aceptor. 18. El método de conformidad con la reivindicación 17, cuyo método además comprende reciclar el NADP+ o NAD+ producido mediante la actividad reductasa a NADPH o NADH, respectivamente, incluyendo en la mezcla de reacción de la etapa b) una enzima que puede reducir el NADP+ o NAD+ y un sustrato para la enzima. 19. El método de conformidad con la reivindicación 18, en donde la enzima se selecciona del grupo que consiste de alcohol dehidrogenasa, glucosa dehidrogenasa, formato dehidrogenasa y glucosa-6-fosfato dehidrogenasa. -a^ . .-.,j, , ^¡Éj j '~-+ ^f*.^k?l^?í?líltl?^ ^at.,,.^ _. , _, . .. 1ri|?|kH**««--fa-Jt-atígÉIÉB iir - *n***~t - -«.« * - Í a^.rxrrr. 20. El método de conformidad con la reivindicación 19, en donde la enzima es glucosa dehidrogenasa y el sustrato es glucosa. 21. El método de conformidad con la reivindicación 17, en donde cada una de 5 las etapas son conducidas en el mismo tanque de reacción. 22. El método de conformidad con la reivindicación 17, en donde la fucosiltransferasa y el sacárido aceptor se agregan al producto de la etapa b) después de que toda la 4-ceto-6-deoximanosa-GDP se convierte a 10 fucosa-GDP. 23. El método de conformidad con la reivindicación 17, en donde la fucosa- GDP se purifica antes de agregar la fucosiltransferasa y el sacárido aceptor. 15 24. El método de conformidad con la reivindicación 17, en donde la fucosiltransferasa y el sacárido aceptor se agregan a la 4-ceto-6- deoximanosa-GDP producida en la etapa a) aproximada y simultáneamente con la realización de la etapa b). 20 25. El método de conformidad con la reivindicación 17, en donde el método además comprende agregar una fosfatasa a la mezcla de reacción de la etapa d), en donde la fosfatasa penetra a un fosfatos de GDP pero no penetra a los fosfatos de NADPH. 26. El método de conformidad con la reivindicación 17, en donde el método además comprende agregar una quinasa y un sustrato de quinasa a la mezcla de reacción de la etapa d), en donde la GDP producida como un resultado de la transferencia de la fucosa-GDP se convierte a GTP. 5 27. El método de conformidad con la reivindicación 26, en donde la quinasa se selecciona del grupo que consiste de piruvato quinasa, polifosfato quinasa, creatinina quinasa y acetil quinasa. 10 28. El método de conformidad con la reivindicación 27, en donde la quinasa es piruvato quinasa y el sustrato de quinasa es fosfenolpiruvato. 29. El método de conformidad con la reivindicación 17, en donde el sacárido aceptor se selecciona del grupo que consiste de Galß(1 -4)GlcN(R')ß-R y 15 Galß(1-3)GlcN(R')ß-R, en donde R se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, un sacárido, un oligosacárido y un grupo aglicon que tiene al menos un átomo de carbono y R' se selecciona del grupo que consiste de acetil y aliloxicarbonil. 20 30. El método de conformidad con la reivindicación 29, en donde el sacárido aceptor se selecciona del grupo que consiste de NeuAca(2?3)Galß(1 ?4)GlcN(R')ß(1 ?3)Galß-0R y N?uAca(2?3)Galß(1 ?3)GlcN(R')ß(1 ?3)Galß-0R. El método de conformidad con la reivindicación 30, en donde el sacárido aceptor se selecciona del grupo que consiste de NeuAca(2?3)Galß(1?4)GlcNAcß(1?3)Galß-0R y NeuAca(2?3)Galß(1 ?3)GlcNAcß(1 ?3)Galß-0R. El método de conformidad con la reivindicación 29, en donde la fucosiltransferasa se selecciona del grupo que consiste de: una a1 ,3/4 fucosiltransferasa (Fuc-T lll), una a1 ,3 fucosiltransferasa, una a1 ,3 fucosiltransferasa bacterial, una a1 ,2 fucosiltransferasa. El método de conformidad con la reivindicación 32, en donde la a1 ,3 fucosiltransferasa se selecciona del grupo que consiste de Fuc-T IV, Fue -T V, Fuc -T VI y Fuc- T Vil. El método de conformidad con la reivindicación 32, en donde la a1 ,2 fucosiltransferasa se selecciona del grupo que consiste de Fuc-T I y Fuc-T II. El método de conformidad con la reivindicación 17, en donde el método además comprende un sistema enzimático para generar la manosa-GDP a partir de mañosa. 36. El método de conformidad con la reivindicación 35, en donde el sistema enzimático para generar manosa-GDP a partir de mañosa comprende: hexoquinasa, que convierte la mañosa a manosa-6-fosfato; fosfomanomutasa, que convierte la manosa-6-fosfato a manosa-1 - fosfato y manosa-GDP pirofosforilasa, que convierte la mañosa- 1 -fosfato a manosa-GDP. 37. El método de conformidad con la reivindicación 17, en donde un solo polipéptido proporciona la actividad 4-ceto-6-deoximanosa-GDP 3,5- epimerasa y la actividad 4-ceto-6-galactosa GDP reductasa. 38. El método de conformidad con la reivindicación 37, en donde el polipéptido es una enzima procariótica. 39. El método de conformidad con la reivindicación 38, en donde el pohpéptido es sustancialmente idéntico a un polipéptido E. coli YEF B. 40. El método de conformidad con la reivindicación 39, en donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 1. El método de conformidad con la reivindicación 38, en donde la enzima procariótica es de E. coli. El método de conformidad con la reivindicación 37, en donde el polipéptido es un polipéptido FX de una eucariota. El método de conformidad con la reivindicación 17, en donde el método además comprende agregar suficiente catión metálico divalente a dicho medio de reacción para restaurar una porción de dicha pérdida de catión divalente durante el curso de la reacción para de esa manera conseguir o mantener una concentración de dicho catión metálico divalente en tal medio de reacción entre aproximadamente 1 mM y aproximadamente 75 mM y en donde la adición del catión metálico divalente ocurre sin interrupción de dicha conversión enzimática. Un método para la preparación de un oligosacárido fucosilado, el método comprende contactar un sacárido aceptor con una mezcla de reacción de fucosilación que comprende fucosa-GDP y una fucosiltransferasa que transfiere fucosa de la fucosa-GDP para proporcionar dicho oligosacárido fucosilado, en donde la eficiencia de dicha fucosilación se mejora por una o más etapas de mejora de eficiencia seleccionadas del grupo que consiste de: 1 ) formar dicha fucosa-GDP mediante la conversión enzimática de manosa-GDP a fucosa-GDP mediante: a) proporcionar una mezcla de reacción que comprende manosa-GDP, manosa-GDP 4,6-dehidratasa y NADP+; b) incubar la mezcla de reacción por un tiempo suficiente para convertir al menos aproximadamente el 90% de la manosa- GDP a 4-ceto-6-deoximanosa-GDP; c) agregar al producto de la etapa b) uno o más polipéptidos que tienen actividad 4-ceto-6-deoxi manosa-GDP 3,5- epimerasa y actividad 4-ceto-6-galactosa reductasa y d) incubar la mezcla de reacción por tiempo suficiente para convertir la 4-ceto-6-deoxi manosa-GDP a fucosa-GDP; 2) agregar una quinasa y un sustrato para la quinasa a la mezcla de reacción de fucosilación, en donde la GDP producida como un resultado de la transferencia de fucosa de la fucosa-GDP se convierte a GTP y 3) conducir la fucosilación en un medio de reacción que comprende un catión metálico divalente soluble, en donde dicho medio se suplementa con dicho catión metálico divalente soluble para mantener la concentración de dicho catión metálico divalente entre aproximadamente 2 mM y aproximadamente 75 mM. 5. El método de conformidad con la reivindicación 44, en donde la fucosiltransferasa se agrega a la mezcla de reacción después de que al menos aproximadamente 90% de la 4-ceto-6-deoximanosa-GDP se convierte a fucosa-GDP. e .. -A na . .: .. ^¿jj Xffí^^i.^^^^^^ 46. El método de conformidad con la reivindicación 44, en donde la fucosiltransferasa y los polipéptidos que tienen 4-ceto-6-deoximanosa-GDP 3,5 epimerasa y 4-ceto-6-galactosa GDP reductasa se agregan a la mezcla de reacción después de que al menos 90% de la manosa-GDP se convierte a 4-ceto-6-deoximanosa-GDP. 47. El método de conformidad con la reivindicación 44, en donde cada una de las etapas de reacción se llevan a cabo en el mismo tanque de reacción. 48. El método de conformidad con la reivindicación 44, en donde dicho método además comprende el reciclar NADP+ o NAD+ producidos mediante la actividad reductasa a NADPH o NADH, respectivamente incluyendo en la mezcla de reacción de la etapa c) una enzima que puede reducir el NADP+ o NAD+ y un sustrato para la enzima. 49. El método de conformidad con la reivindicación 48, en donde la enzima se selecciona del grupo que consiste de alcohol dehidrogenasa, glucosa dehidrogenasa, formato dehidrogenasa y glucosa-6-fosfato dehidrogenasa. 50. El método de conformidad con la reivindicación 49, en donde la enzima es glucosa dehidrogenasa y el sustrato es glucosa. 51. El método de conformidad con la reivindicación 44, en donde el sacárido aceptor se selecciona del grupo que consiste de Galß(1-4)GlcN(R')ß-R y Galß(1-3)GlcN(R')ß-R, en donde R se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, un sacárido, un oligosacárido y un grupo aglicon que tiene al menos un átomo de carbono y 5 R' se selecciona del grupo que consiste de acetil y aliloxicarbonil. 52. El método de conformidad con la reivindicación 51 , en donde el sacárido aceptor se selecciona del grupo que consiste de NeuAca(2?3)Galß(1 ?4)GlcN(R')ß(1 ?3)Galß-OR y 0 NeuAca(2?3)Galß(1 ?3)GlcN(R')ß(1 ?3)Galß-OR. 53. El método de conformidad con la reivindicación 52, en donde el sacárido aceptor se forma mediante sialilación de un compuesto Galß(1 ?4)GlcN(R')ß(1 ?3)Galß-OR o Galß(1 ?3)GlcN(R')ß(1 ?3)Galß-OR 5 con una sialiltransferasa en la presencia de un derivado CMP de un ácido siálico usando una a(2,3)sialiltransferasa bajo condiciones en donde el ácido siálico se transfiere al azúcar no reductor del compuesto. 54. El método de conformidad con la reivindicación 53, en donde el compuesto 0 Galß(1 ->4)GlcN(R')ß(1?3)Galß-OR o Galß(1?3)GlcN(R')ß(1 ?3)Galß-OR se forma mediante galactosilación de un compuesto de la fórmula GlcN(R')ß(1?3)Galß-OR o GlcN(R')ß(1 ?3)Galß-OR, respectivamente, con ^"^-"--^-^ afe?ili.. una galactosiltransferasa en la presencia de una galactosa UDP bajo condiciones suficientes para formar el compuesto. 55. El método de conformidad con la reivindicación 1 , en donde el vector de expresión carece de una región de codificación E. coli wcal. 56. La mezcla de reacción de conformidad con la reivindicación 13, en donde la mezcla de reacción además comprende una enzima que puede reducir NADP+ o NAD+ a NADPH o NADH, respectivamente y un sustrato para la enzima. 57. La mezcla de reacción de conformidad con la reivindicación 56, en donde la enzima se selecciona del grupo que consiste de alcohol dehidrogenasa, glucosa dehidrogenasa, formato dehidrogenasa y glucosa-6-fosfato dehidrogenasa. 58. La mezcla de reacción de conformidad con la reivindicación 57, en donde la enzima es glucosa dehidrogenasa y el sustrato es glucosa. 59. La mezcla de reacción de conformidad con la reivindicación 13, en donde la mezcla de reacción además comprende una fucosiltransferasa y un sacárido aceptor para la fucosiltransferasa. 60. La mezcla de reacción de conformidad con la reivindicación 59, en donde la mezcla de reacción además comprende una fosfatasa que puede penetrar fosfatos de GDP pero no de NADPH o NADH. 61. La mezcla de reacción de conformidad con la reivindicación 59, en donde la mezcla de reacción además comprende una quinasa y un sustrato para la quinasa. 62. La mezcla de reacción de conformidad con la reivindicación 61 , en donde la quinasa se selecciona del grupo que consiste de piruvato quinasa, polifosfato quinasa, creatina quinasa y acetil quinasa. 63. La mezcla de reacción de conformidad con la reivindicación 62, en donde la quinasa es piruvato quinasa y el sustrato de quinasa es fosfoenolpiruvato. 64. La mezcla de reacción de conformidad con la reivindicación 59, en donde el sacárido aceptor se selecciona del grupo que consiste de Galß(1 - 4)GlcN(R')ß-R y Galß(1-3)GlcN(R')ß-R, en donde: R se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, un sacárido, un oligosacárido y un grupo aglicon que tiene al menos un átomo de carbono y R' se selecciona del grupo que consiste de acetil y aliloxicarbonil. 65. La mezcla de reacción de conformidad con la reivindicación 64, en donde el sacárido aceptor se selecciona del grupo que consiste de NeuAca(2-»3)Galß(1?4)GlcN(R')ß(1 ?3)Galß-OR y N?uAca(2?3)Galß(1 ?3)GlcN(R')ß(1 ?3)Galß-OR. 66. La mezcla de reacción de conformidad con la reivindicación 65, en donde el sacárido aceptor se selecciona del grupo que consiste de NeuAca(2?3)Galß(1 ?4)GlcNAcß(1 ?3)Galß-OR y NeuAca(2?3)Galß(1 ?3)GlcNAcß(1 ?3)Galß-OR. 67. La mezcla de reacción de conformidad con la reivindicación 59, en donde la fucosiltransferasa se selecciona del grupo que consiste de: una a1 ,3/4 fucosiltransferasa (Fuc-T lll), una a1 ,3 fucosiltransferasa y una a1 ,2 fucosiltransferasa. 68. La mezcla de reacción de conformidad con la reivindicación 15, en donde la mezcla de reacción además comprende un sistema enzimático para generar la mañosa GDP de la mañosa. 69. La mezcla de reacción de conformidad con la reivindicación 68, en donde el sistema enzimático para generar la manosa-GDP comprende: hexoquinasa, que convierte la mañosa a manosa-6-fosfato; fosfomanomutasa, que convierte la manosa-6-fosfato a manosa-1 - fosfato y manosa-GDP pirofosforilasa, que convierte la manosa-1 -fosfato a manosa-GDP. 70. La mezcla de reacción de conformidad con la reivindicación 13, en donde la mezcla de reacción comprende una concentración de catión metálico divalente de entre aproximadamente 1 mM y aproximadamente 75 mM. 71. La mezcla de reacción de conformidad con la reivindicación 70, en donde suficiente catión metálico divalente se agrega a la mezcla de reacción para restaurar una parte de dicha perdida de catión divalente durante el curso de la reacción para de este modo aumentar o mantener una concentración de dicho catión metálico divalente en dicha mezcla de reacción de entre aproximadamente 1 mM y aproximadamente 75 mM, en donde la adición del catión metálico divalente ocurre sin interrupción de la reacción enzimática. 72. El método de conformidad con la reivindicación 17, en donde la mezcla de reacción de a) se incuba por tiempo suficiente para convertir al menos aproximadamente 90% de la manosa-GDP a 4-ceto-6-deoximanosa-GDP antes de realizar b). 73. El método de conformidad con la reivindicación 17, en donde a) y b) se realizan simultáneamente.