MXPA00006123A - Beta-lipotropina y uso de la misma - Google Patents

Abstract

La invención proporcionaácidos nucleicos aislados, vectores, células huésped transformadas, análogos, fragmentos funcionales y proteínas de fusión, relacionados con beta-lipotropina. También se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden beta-lipotropina o fragmentos y/o análogos de la misma, y métodos para tratar diabetes y complicaciones asociadas con la misma mediante la administración de una cantidad efectiva de beta-lipotropina.

Description

BETA-LIPOTROPINA Y USOS DE LA MISMA ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Esta invención se relaciona con los artes farmacéuticos y médicos. En particular la invención concierne a beta-lipot ropina , fragmentos y análogos de ésta, las formulaciones farmacéuticas, y métodos para usar la misma en el tratamiento de diabetes y otras condiciones asociadas en mamiferos.

El propiomelanocort in (POMC) es una molécula precursora neuropept idi ca que se traslada hacia las rutas de secreción dentro de las células neuroendocrinas . El POMC se corta por la acción de las endopept idasas especificas para producir péptidos tales como la hormona adrenocorticot rófica (ACTH) , Beta-lipotropina (BLT), Be t a-endor f ina , y Hormona Estimulante de Melanocito (MSH) . El procesamiento de POMC en uno o más péptidos específicos ocurre de modo especifico en un tejido o célula (ver generalmente, M. Castro and E. Morrison, Cri t . Rev . Ne urobi ol . , 11, 35-57, 1997; Roberts, J. L. and Herbert, E., Pro c Na t Aca d Sci , 74, 4826 (1977); Roberts, J. L. and Herbert, E., Pro c . Na t . Aca d . S ci 74, 5300 (1977); Mains, et a l . , Pro c . Na t .

REF.: 120733 Aca d . S ci . 1 4 , 3 0 1 4 (1977)) . El POMC se produce principalmente en la glándula pituitaria y el hipotálamo. El proceso de pos -trans lación del POMC en la pituitaria anterior produce ACTH y BLT . Por otra parte, los principales productos de la pituitaria intermedia son a-MSH, CLIP, y- 1 ipo rt opi na , ß-endorfina, y ß-MSH, mientras que en el hipotálamo, se procesa principalmente POMC en ?-MSH y ß-endorfina.

Los péptidos derivados de POMC desarrollan una variedad de papeles importantes en la regulación metabólica y fisiológica. Por ejemplo, el ACTH, un péptido de 39 aminoácidos, estimula la secreción de glucocorticoides de la corteza adrenal. Los MSH, por otra parte estimulan la síntesis de melanina por los melanocitos en al piel, y también parece que se involucran en el metabolismo de las grasas. La ß-endorfina se deriva del carboxilo final de la BLT (viz. Residuos 59 a 89 de la secuencia humana) , y posee actividad analgésica que está antagonizada por la naloxona, un antagonista conocido para morfina. Asi, las hormonas de péptidos derivados de POMC tienen diferentes papeles en la regulación fisiológica y metabólica.

El propio combustible y el metabolismo de glucosa dependen del péptido sin relación con POMC, insulina. Específicamente, la insulina estimula la síntesis del glicógeno, el ácido graso, y la proteina, y también estimula la glicólisis. La insulina es critica al promover la entrada de glucosa en el músculo y las células de grasa.

El defectuoso metabolismo de la insulina puede originar diabetes. Los diabéticos tipo 1 requieren la administración exógena de insulina para el control apropiado del combustible y el metabolismo de la glucosa. Por otra parte, los diabéticos tipo 2 tipicamente no requieren insulina exógena hasta las últimas etapas de la enfermedad. El apropiado control-del metabolismo de la glucosa y el combustible es esencial para el efectivo manejo de la diabetes. Sin esto, puede ser serio, quizá aun fatal, las consecuencias incluyen ce t oacidos i s , coma, retinopatia, mi croangi opa t ia diabética, ateroesclerosis, infarto al miocardio, apoplejía, gangrena, hipertrigliceridemia, hipercole t erolemia , cardio iopatía, dermopatia, síndrome de pie diabético, nefropatia, infección del tracto urinario, necros i s papi lar , cataratas, gas t roent eropat ia diabética, constipación, enfermedad vascular periferica , y aun la muerte. En varios casos, debe adoptarse un balance delicado entre la administración de demasiada insulina y muy poca insulina. Por lo tanto, una terapia ideal para la diabetes seria una que controle los niveles de glucosa en la sangre al mejorar la sensibilidad a la insulina .

Se describe aqui un método para el tratamiento y composición farmacéutica que es efectiva para tratar o prevenir la diabetes tipo 1 y tipo 2, y complicaciones asociadas con esta, que comprende la administración de una cantidad farmacéuticamente efectiva de beta-lipotropina y/o fragmentos y/o análogos de esta.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención provee proteínas aisladas que comprenden be t a- lipot ropina (BLT), análogos de esta, fragmentos de esta, ácidos nucleicos que codifican la misma, y los métodos para producir y utilizar la BLT en el tratamiento de diabetes y complicaciones asociadas con esta.

Se expone aqui los métodos para el tratamiento de la diabetes y complicaciones de esta en mamíferos, incluyendo humanos, al administrar cantidades farmacéuticamente efectivas de BLT, análogos de esta, o fragmentos funcionales de esta. La invención se relaciona además a los métodos de tratamiento de la diabetes tipo 1 y tipo 2, retinopatía, ci croangi opa t i a diabética, ateroesclerosis, infarto al miocardio, apoplejía, gangrena, hipertrigliceridemia, hipercoleterolemia , cardiomiopa t í a , dermopatia, síndrome de pie diabético, nefropatía, infección del tracto urinario, necrosis papilar , cataratas, gas troent eropa tí a diabética, constipación, enfermedad vascular periférica.

Se exponen aquí métodos para producir BLT en E . col i y levadura. En el E . col i se produce el BLT como una proteína de fusión que puede recuperarse de los lisados de la célula en presencia de gran cantidad de sal por medio de métodos de purificación convencionales. La proteína de fusión BLT contiene un sitio de reconocimiento para las proteasas específicas que se usan para separar el patrón de fusión de la BLT. En la levadura Pi ch i a pa s t o ri s , la proteína de fusión se divide por la secreción de la proteína de la célula tal que el BLT nativo pueda recuperarse intacto del medio de cultivo .

En una modalidad de la presente invención se relaciona con una proteína sustancialmente pura que tiene la secuencia de aminoácidos que es la_SEC. I D ._ NO: 2, SEC. ID. NO: 5, o la SEC. ID. NO. 7. Aun otra modalidad, la presente invención se relaciona con un compuesto de ácido nucleico aislado que codifica una proteína de fusión o proteína o péptido recombinante que comprende beta lipotropina.

En otra modalidad la presente invención se relaciona al menos con un compuesto de ácido nucleico aislado que codifica una proteína o péptido de la presente invención .

Aun más en otra modalidad la presente invención se relaciona con un vector que comprende un compuestos de ácido nucleico aislado de la invención.

Aun en otra modalidad la presente invención se relaciona con un vector que comprende un ácido nucleico aislado de la invención, en donde el compuesto de ácido nucleico aislado se enlaza operablemente con una secuencia promotora.

En otra modalidad la presente invención se relaciona con una célula huésped que contiene un vector de la presente invención.

Aun en otra modalidad la presente invención se relaciona con un método para construir una célula huésped recombinante que tiene el potencial de expresar la be t a- 1 ipo t ropina , el método comprende introducir un vector de la invención en la célula huésped por cualquier medio adecuado.

Aun otra modalidad la presente invención se relaciona con un método para expresar la beta-lipotropina en una célula huésped recombinante, el método comprende cultivar la célula huésped recombinante bajo condiciones adecuadas para la expresión de genes.

En otra modalidad la presente invención se relaciona con una formulación farmacéutica que comprende como un ingrediente activo be ta-liport opina , análogo, o fragmento funcional de esta, asociada con uno o más vehículos, excipiente, o diluyentes farmacéuticamente aceptables, de esta.

Aun en otra modalidad la presente invención se relaciona con la formulación farmacéutica en donde la beta -"lipotropina , análogo, o fragmento funcional de esta, es be t a-1 ipot ropina de humano.

Aun más en otra modalidad, la presente invención se relaciona con be t a- lipo t ropina , análogo, o fragmento funcional de esta, para el uso en el tratamiento de la diabetes o complicaciones de esta.

Aun más en otra modalidad la presente invención se relaciona con fragmentos de BLT que tiene actividad insulinot rópi ca .

Aun en otra modalidad la presente invención se relaciona con un péptido que tiene actividad in s ul ino t róp i ca seleccionada del grupo que consiste de la SEC. ID NO: 9 hasta la SEC. ID. NO: 13.

Aun en otra modalidad la presente invención se relaciona con un péptido que tiene actividad insulinot rópica seleccionada del grupo que consiste de la SEC. ID NO: 14 hasta la SEC. ID. NO: 25.

Aun en otra modalidad la presente invención se relaciona con un análogo funcional de un péptido de beta-lipotropina expuesto aquí.

Aun en otra modalidad la presente invención se relaciona con un método para tratar la diabetes que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva al menos de un péptido seleccionado del grupo que consiste de la SEC. ID NO: 9 hasta la SEC. ID. NO: 25.

Aun en otra modalidad la presente invención se relaciona con un método para tratar la diabetes que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un péptido seleccionado del grupo que consiste de la SEC. ID NO: 9 hasta la SEC. ID. NO: 13.

Aun en otra modalidad la presente invención se relaciona con una formulación farmacéutica que comprende como un ingrediente activo al menos un péptido que tiene actividad insul inot rópi ca seleccionado del grupo que consiste de la SEC. ID NO: 9 hasta la SEC. ID. NO: 25.

Aun en otra modalidad la presente invención se relaciona con u<n método para tratar la diabetes en un mamífero que incluye un humano que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de be ta-lipot ropina , análogo, o fragmento funcional de esta Aun en otra modalidad la presente invención se relaciona a un método para disminuir los niveles de glucosa en la sangre en un mamífero al administrar una cantidad suficiente de be t a- lipot ropina , análogo o fragmento funcional de esta.

Aun en otra modalidad la presente invención se relaciona a un método para tratar hiperglicemia en un mamífero con necesidad de esta al administrar una cantidad efectiva de be ta-lipot ropina , análogo o fragmento funcional de esta.

En una modalidad la presente invención se relaciona a un método para tratar hiperinsul ine ia en un mamífero al administrar una cantidad efectiva de beta-lipotropina, análogo o fragmento funcional de esta.

En otra modalidad la presente invención se relaciona a un método para mejorar la sensibilidad a la insulina en un mamífero al administrar una cantidad efectiva de bet a-lipot ropina , análogo o fragmento funcional de esta.

En otra modalidad la presente invención se relaciona a un método sintético en fase sólida para sintetizar bet a- lipot ropina , análogo o fragmento funcional de esta.

En otra modalidad la presente invención se relaciona a un proceso para preparar be ta-lipot ropina : a. transformar un huésped adecuado con un vector de expresión en donde el vector codifica una beta-lipotropina, análogo, o fragmento funcional de esta; b. cultivar el huésped transformado bajo condiciones que permitan la expresión de la beta-lipotropina; c. purificar la beta-lipotropina por medio de cualquier medio adecuado.

Aun en otra modalidad la presente invención se relaciona a cualquier ensayo de la actividad de beta-lipotropina que comprende los pasos de: a) administrar a un mamífero que exhibe insensibilidad a la insulina y con elevados niveles de glucosa en la sangre una proteína de prueba; y b) probar la glucosa de la sangre y los niveles de insulina después del paso (a) .

La invención también se relaciona a un método para tratar la diabetes tipo I y tipo II y las complicaciones asociadas qon estas en los mamíferos por la administración de una cantidad farmacéuticamente efectiva de beta-lipotropina, análogo, o fragmento funcional de esta.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones El término "análogo" o "análogo funcional" se refiere a una forma modificada de la BLT en donde se hace al menos una sustitución de aminoácido tal que el análogo retiene sustancialmente la misma actividad biológica como el BLT no modificado en vivo y/o en vitro.

El término "bid" o "b.i.d." se refiere a una dosis de BLT u otro compuesto administrado dos veces al día.

La "BLT" se refiere a la beta-lipotropina. La BLT de humano comprende 89 residuos de aminoácidos (SEC. ID. NO: 8) . La proteína BLT se ha caracterizado en una variedad de organismos y se determina las secuencias de aminoácidos en una variedad de organismos que incluyen humano, ratón, ovino, porcino (Li & Chung, Nature, 260, 622-24 (1976); y elefante (Li et al. Int. J. Pept . Prot. Res. 32, 573-78, 1988) ; así como también otros mamíferos, todos se incorporan aquí como referencia.

El término "proteína de fusión beta-lipoproteína" o "proteína de fusión BLT" se refiere a una clase de moléculas de proteína recombinante híbrida que comprenden BLT, que se producen en E. coli u otro tipo de célula y de la cual puede generarse la BLT o fragmento de BLT a través de la proteólisis específica o división química. Ejemplos de las proteína de fusión BLT incluyen aquellas especificadas aquí como SEC. ID. NO: 2, SEC. ID. NO: 5, y SEC. ID. NO: 7.

Los términos "complementario" o "complementariedad" como se utiliza aquí se refiere a la capacidad de los nucleótidos de purina o pirimidina a asociarse a través de enlaces de hidrógeno para formar moléculas de ácidos nucleicos con doble hebra. Los siguientes pares base se relacionan por complementariedad: guanina y citocina; adenina y tiamina; y adenina y uracilo. Como se utiliza aquí, "complementariedad" significa que las relaciones antes mencionadas aplican substancialmente para todos los pares base que comprenden dos moléculas de ácido nucleico de dos hebras simples en la longitud total de las moléculas. "Parcialmente complementario" se refiere a la relación antes mencionada en donde una de dos moléculas de ácidos nucleicos de dos hebras simples es más corta en longitud que la otra tal que una porción de una de las moléculas permanecen con hebra simple.

El término "complicaciones" o "complicaciones de esto" como se utiliza aquí se refiere a las condiciones, síndromes, enfermedad ( es ) auxil iar ( es ) , alimentos, o los similares asociados con una o más enfermedades o síndromes, o condiciones asociadas con el metabolismo de insulina defectuoso, o el metabolismo de carbohidrato defectuoso, por ejemplo, el metabolismo de glucosa defectuoso, incluyendo pero no limitándose a diabetes tipo 1 y tipo 2. Ejemplos de complicaciones incluirían cet oaci do s i s , coma, retinopatía, microangiopa t í a diabética, ateroesclerosis, infarto al miocardio, apoplejía, gangrena, hipertrigliceridemia, hipercolet erolemí a , cardiomiopat í a , dermopatia, síndrome de pie diabético, nefropatía, infección del tracto urinario, necros is papi lar , cataratas, gas troent eropa t í a diabética, constipación, enfermedad va s cular per i féri ca .

La "sustitución conservativa" o "sustitución de aminoácido conservativa" se refiere a un reemplazo de uno o más residuo(s) de aminoác ido ( s ) en una proteína o péptido como se ejemplifica en la Tabla 1.

El "fragmento de esta" se refiere a un fragmento, pieza, o sub-región de un péptido, o ácido nucleico, tal que el fragmento comprende 2 (dos) o más aminoácidos contiguos, o alterna ivamente aproximadamente 5 a 14 aminoácidos, o mayor; o 10 o más nucleótidos que están contiguos en el péptido o molécula de ácido nucleico madre. El fragmento de esta puede o no puede retener la actividad biológica. Por ejemplo, un fragmento de un péptido expuesto aquí podría utilizarse como un antígeno para aumentar un anticuerpo específico contra el péptido madre del cual se deriva el fragmento. Cuando se refiere a una molécula de ácido nucleico, "fragmento de esta" se refiere a 10 o más nucleótidos contiguos, derivados del ácido nucleico madre, y también, debido al código genético, con la secuencia complementaria. Por ejemplo, sí el fragmento implica la secuencia 5 ' -AGCTAG- 3 ' , después el "fragmento de esta" también incluiría las secuencia complementaria, 3'TCGATC-5' . El término "proteína de fusión" denota una molécula de proteína no encontrada en la naturaleza que comprende una fusión translacional o fusión enzimática en la que dos o más diferentes proteínas o fragmentos de las mismas se enlazan covalentemen e en una cadena polipeptídica s imp 1 e .

Pareja de fusión" se refiere una secuencia de aminoácidos en una proteína de fusión BLT, en donde la secuencia no deriva de BLT, e.g. la secuencia identificada aquí como SEC ID NO: 6.

"Fragmento funcional" o "fragmento funcionalmente equivalente", como se usa aquí, se refiere a una región, o fragmento de una longitud BLT completa que mantiene la actividad biológica, í.e. la capacidad para mejorar el e fe ct-O de la insulina in vivo y/o in vitro; y/o la capacidad para promover una disminución in vivo de la glucosas en la sangre, o para mejorar la toma de glucosa en una célula o tejido in vitro. Los fragmentos funcionales, también podrían proporcionar la actividad biológica manifestada por una BLT de longitud total, i n vi vo y/o i n vi t ro , vi z , la capacidad para promover la toma de glucosa y/o para mejorar los efectos de insulina y/o para mejorar la sensibilidad a insulina. Los fragmentos funcionales podrían producirse por la tecnología de clonación, o por los medios de síntesis química o por el corte químico o enzimático.

"Célula huésped" se refiere a cualquier célula eucaríótica o procariótíca que es apropiada para propagar y/o expresar un gen clonado contenido en un vector que se introduce en la célula huésped mediante, por ejemplo, transformación o transfección, o similares.

El término "homólogo" o "heterólogo" describe la relación entre diferentes moléculas de ácidos nucleicos o secuencias de aminoácidos en los que las secuencias o moléculas se relacionan por identidad o identidad parcial y/o similaridad en uno o más bloques o regiones de secuencia dentro de las moléculas.

El término "hibridización" como se usa aquí, se refiere a un proceso en el que una molécula de ácido nucleico de hebra simple se une con una hebra complementaria a través del par de base de nucleótido. La "hibridización selectiva" se refiere a hibridización bajo condiciones o alta severidad. El grado de hibridización depende, por ejemplo, del grado de homología, la severidad de hibridización y la longitud de las hebras de hibridización.

El término " insul ino t rópi co" se refiere a una actividad mejoradora de insulina, por ejemplo, mediante inversión o mitigando los efectos de la insensibilidad a insul ina .

Compuesto de ácido nucleico aislado" se refiere a cualquier secuencia de ARN o ADN, sin embargo, construida o sintetizada, que es localmente distinta de su localización natural, e.g. en una célula.

Una "sonda de ácido nucleico" o "sonda" como se usa aquí es un compuesto de ácido nucleico marcado que se hibridiza con otro compuesto de ácido nucleico. "Sonda de ácido nucleico" significa una secuencia de ácido nucleico de hebra simple que se combinará con una secuencia de ácido nucleico blanco de hebra simple parcialmente complementaria para formar una molécula de doble hebra. Una sonda de ácido nucleico podría ser un oligonucleótido o polímero de nucleótido. Una sonda usualmente contendrá un radical detectable que podría unirse al extremo de la sonda o ser interno a la secuencia de la sonda.

El término "plásmido" se refiere a un elemento genético extracromosomal. Los plásmidos descritos aquí son comercialmente disponibles , disponibles públicamente en una base no restringida, o pueden construirse a partir de los plásmidos fácilmente disponibles de acuerdo con los procedimientos publicados.

Un "cebador" es un fragmento de ácido nucleico que funciona como un sustrato iniciador para la elongación enzimática o sintética de, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico.

El término "promotor" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que dirige la transcripción, por ejemplo, de ADN a ARN. Un promotor inducible es uno que se regula por las señales ambientales, tal como por ejemplo fuente de carbono, calor o iones metálicos. Un promotor constitutivo en general opera a un nivel constante y no es regulable .

Los términos "proteína" y "péptido" se usan intercambiablemente, se refieren a dos o más residuos de _ aminoácidos enlazados covalentemente por enlaces peptídicos. En algunos casos, estos términos describen biopolímeros de aminoácidos que comprenden más de 10 y hasta aproximadamente 500 residuos de aminoácidos enlazados por enlaces peptídicos.

"Vector de clonación de ADN recombinante" como se usa aquí se refiere a cualquier agente de replicación autónomamente, que incluye, pero no se limita a, plásmidos y fagos, que comprenden una molécula de ADN a la cual uno o más segmentos de ADN adicionales pueden o se han incorporado El término "vector de expresión de ADN recombinante" o' "vector de expresión" como se usa aquí, se refiere a cualquier vector de clonación de ADN recombinante, por ejemplo un plásmido o fago, en el que un promotor y otros elementos reguladores están presentes, por lo cual se permite la transcripción de un ADN insertado, que podría codificar una proteína.

El término " es tr ingencia" se refiere a las condiciones de hibridización. Las condiciones de alta estringencia desfavorecen el apareamiento de bases no homologas. Las condiciones de baja estringencia tienen el efecto opuesto. La estringencia podría alterarse, por ejemplo, por la temperatura y la concentración salina.

Las condiciones de "baja estringencia" comprenden, por ejemplo, una temperatura de aproximadamente 37°C o menos, una concentración de formamida menor de aproximadamente 50%, y una concentración salina moderada a baja (SSC); o, alternativamente, una temperatura de aproximadamente 50°C o menos, y una concentración salina moderada a alta (SSPE) , por ejemplo NaCl 1M.

Las condiciones de "alta estringencia" comprenden, por ejemplo, una temperatura de aproximadamente 42°C o menos, una concentración de formamida de menos de aproximadamente 20%, y una concentración salina inferior (SSC) ; o, alternati amente, una temperatura de aproximadamente 65°C, o menos, y una concentración salina baja (SSPE) . Por ejemplo, las condiciones de alta estringencia comprenden hibridización en NaHP04 0.5M, dodecil sulfato de sodio al 7% (SDS), EDTA 1 mM a 65°C (Ausubel, F.M. et a l . Current Protocols in Molecular Bioloqy, Vol. I, 1989; Green Inc. New York, en 2.10.3) .

"SSC" comprende una hibridización y una solución de lavado. Una solución de reserva de SSC 20X contiene cloruro de sodio 3M, citrato de sodio 0.3M, pH 7.0.

"SSPE" comprende una hibridización y solución de lavado. Una solución de SSPE IX contiene NaCl 180 mM, Na2HP04 9 mM, NaH2P04 0.9 mM y EDTA 1 mM, pH 7.4.

"Sustancialmente puro" con referencia a una proteína significa que la proteína se separa de otros componentes celulares y no celulares, que incluyen otras moléculas de proteínas .

Una preparación sustancialmente pura es al menos 85% pura; y preferentemente aproximadamente al menos 95% pura. Una proteína "sustancialmente pura" podría prepararse por cualquier número de métodos apropiados que incluyen, por ejemplo, el método de purificación de proteínas IMAC (Patente U.S. No. 4,569,794) incorporado aquí por referencia.

"Tratamiento" como se usa aquí describe el manejo y cuidado de un paciente con el propósito de combatir una enfermedad, condición o padecimiento e incluye la administración de una proteína de la presente invención, para evitar el inicio de los síntomas o complicaciones, aliviando los síntomas o complicaciones, o eliminando la enfermedad, condición o padecimiento.

Todas las referencias citadas en esta especificación se incorporan aquí por referencia.

La beta-lipotropina se aisló en 1964 de las glándulas pituitarias de ovinos, y su estructura primaria se reportó al año siguiente (Li et a l . Na t u re , 208, 1093, 1965) . Desde entonces se ha reportado la secuencia primaria de BLTs de oveja, bovino, ovino, ratón, porcino, cerdo de guinea, rata, elefante y ¿3 humano. (Ver e.g. Loh ar and Li, Biochim. Biophys. Acta, 147, 381, 1967; Li and Chung, Nature, 260, 622, 1976; Drouin and Goodman, Nature, 288, 619, 1980; Li et al. Int. J. Pept. Prot. Res. 32, 573-78, 1988; Blake and Li, Proc. Nat. Acad. Sci. 80, 1556-1559, 1983; Takahashi et al. FEBS Lett. 135, 97-102, 1981; todas las cuales se incorporan por referencia) . Los resultados de la secuencia revelan que el término carboxi de BLT se conserva altamente a través de las especies. Por otra parte, las diferencias considerables de secuencias se presentan en el extremo amino terminal de las moléculas de BLT de las diferentes especies.

La presente invención se refiere además a las proteínas de fusión de BLT, que comprenden BLT de humano (SEC ID NO: 8), o BLT de otras especies, o un fragmento funcional de las mismas. Las proteínas de fusión de BLT ejemplares se describen aquí, como la SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 5 y la SEC ID NO: 7.

Los fragmentos funcionales de BLT se identifican convenientemente como fragmentos de BLT que exhiben actividad biológica, por ejemplo, la capacidad para disminuir los síntomas diabéticos cuando se administran a un mamífero con la necesidad del mismo, o disminuir los niveles de insulina en suero, y/o mejorar la sensibilidad a insulina, y/o disminuir los niveles de glucosa en sangre, y/o estimular la toma de glucosa en el tejido adiposo o muscular, i n vi vo o in vi t ro , o en adipocitos i n vi t ro . Los fragmentos funcionales de BLT comprenden cualquier fragmento que retiene la actividad biológica y que comprenden al menos dos (2) o más residuos de aminoácidos que son en algunos casos contiguos en la proteína BLT.

Los fragmentos preferidos comprenden una región contigua de representación de BLT parcial o completamente exterior a la región de los residuos 59 a 89 de BLT de humano (SEC ID NO: 8), o la región equivalente de la BLT no de humano (i.e. la región que codifica la ß-endorfina) .

Los fragmentos funcionales ejemplares de la BLT de humano se describen aquí como la SEC ID NO: 9 a la SEC ID NO: 25. Los fragmentos preferidos se designan aquí como SEC ID NO: 9 a la SEC ID NO: 13; los fragmentos más preferidos se designan aquí como la SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 12 y la SEC ID NO: 13. En algunos casos, un fragmento funcional podría comprenden una eliminación interna de la BLT madre, e.g. SEC ID NO: 13, en la que los residuos de aminoácidos 7 a 23 de la BLT de humano se eliminan. Los "fragmentos funcionales podrían producirse por la síntesis química en fase sólida y/o por técnicas de ADN recombinante bien conocidas para el experto. Ver e.g. K. Struhl, "Reverse biochemistry: Methods and applications for synthesizing yeast proteins i n vi t ro , " Me th . En zym ol . 194, 520-535. Por ejemplo, en un método, un grupo acoplado de mutaciones de eliminación se introducen en un ácido nucleico que codifica la BLT, de modo que se eliminan cantidades variantes de la región que codifica el péptido, ya sea del extremo terminal amino, o del extremo carboxilo de la molécula. Este método también puede usarse para crear fragmentos internos de la proteína intacta en la que ambos extremos terminales de carboxilo y amino se remueven. Las nucleasas apropiadas para crear tales eliminaciones incluyen, por ejemplo Bal31, o en el caso de una molécula de ácido nucleico de hebra sencilla, de nucleasa de frijol verde o amarillo. Por simplicidad, se prefiere que el ácido nucleico que codifica la BLT se clone en un vector de clonación de hebra simple, tal como el bacteriófago M13, o equivalente. Si se desea, los fragmentos de eliminación resultantes pueden subclonarse en cualquier vector para la propagación y expresión en cualquier célula huésped apropiada.

Los fragmentos funcionales de la BLT podrían identificarse y probarse para la actividad biológica usando cualquier prueba apropiada, por ejemplo, la capacidad de un fragmento de péptido para estimular o mejorar la sensibilidad a insulina y/o la toma de glucosa por células in vivo o in vitro.

Los análogos funcionales de BLT pueden generarse por eliminación, inserción, inversión y/o sustitución de uno o más residuos de aminoácido en la BLT, o cualquiera de los péptidos descritos aquí. Los análogos de sustitución pueden hacerse en general, mediante técnicas de fase sólida o recombinantes en las que se hacen sustituciones de aminoácidos conservativos sencillos o múltiples, por ejemplo, de acuerdo a la Tabla 1. En general, en el caso de las sustituciones múltiples, se prefiere que menos de diez residuos se cambien en cualquier molécula dada, más preferentemente entre uno a cinco residuos se cambien en cualquier molécula dada, de modo que aproximadamente entre 90% a 99% de los residuos son idénticos con la secuencia de SEC ID NO: 8; alternativamente, de modo que entre- aproximadamente 95% a 99% de los residuos son idénticos con la SEC ID NO: 8 u otra BLT apropiada de otras especies.

Por ejemplo, los análogos de BLT de humano (SEC ID NO: 8) que comprenden sustituciones de aminoácidos simples o múltiples en la región entre los residuos de aminoácidos 1 a 89, comprenden sustituciones en donde: el residuo en la posición 1 es alternativamente Glu, Ala, Asp o Gln; el residuo en la posición 2 es alternativamente Leu, lie, Val o Met; el residuo en la posición 3 es alternativamente Thr, Ala, Glu, Ser, Pro o Gly; el residuo en la posición 4 es alternativamente Gly, Arg, Ala, Leu, Pro o Ser; el residuo en la posición 5 es alternativamente Glu, Gln, Asp, Asn o Ala; el residuo en la posición 6 es al t erna t i vament'e Arg, Glu, Leu, Lys, Gln o Ala; el residuo en la posición 7 es alternativamente Leu, Pro, Asp, Val, lie o Met; el residuo en la posición 8 es alternativamente Arg, Glu, Ala, Tyr, Leu, Lys, Pro, Gln o Trp; el residuo en la posición 9 es alternativamente Glu, Ala, Pro, Asp, Asn o Gln; el residuo en la posición 10 es alternativamente Gly, Ala, Ser o Asp; el residuo en la posición 11 es alternativamente Asp, Arg, Pro, Asn, Gln, Ala o Glu; el residuo en la posición 12 es alternativamente Gly, Ala, Ser o Met; el residuo en la posición 13 es alternativamente Pro, Glu, Gly o Val; el residuo en la posición 14 es alternativamente Asp, Glu, Asn, Gln o Gly; el residuo en la posición 15 es alternativamente Gly, Ala, Ser o Glu; el residuo en la posición 16 es alternativamente Pro, Gln, Leu, Gly o Glu; el residuo en la posición 17 es alternati amente Ala, ^Asp, Ser o Gly; el residuo en la posición 18 es alternativamente Asp, Glu, Gln o Asn; el residuo en la posición 19 es alternativamente Asp, Glu, Asn o Gln; el residuo en la posición 20 es alternati amente Gly, Ser o Ala; el residuo en la posición 21 es alternativamente Ala, Gly, Ser o Phe; el residuo en la posición 22 es alternati amente Gly, Ala, Ser o Lys; el residuo en la posición 23 es alternativamente Ala, Phe, Thr, Gly, Ser o Leu; el residuo en la posición 24 es alternativamente Gln, Arg, Asp, Asn, Leu o Val; el residuo en la posición 25 es alternativamente Ala, Leu, Asp, lie, Gly, Ser o Thr; el residuo en la posición 26 es alternativamente Asp, Glu, Gly, Asn, Gln o Lys; el residuo en la posición 27 es alternativamente Leu, Ala, lie, Met o Val; el residuo en la posición 28 es alternativamente Glu, Gln, Asn o Asp; el residuo en la posición 29 es alternativamente His, Asn, Tyr, Ala, Gln o Glu; el residuo en la posición 30 es alternativamente Ser, Gly, Glu, Ala, Leu o Asp; el residuo en la posición 31 es alternativamente Leu, Ala, Val, Met o lie; el residuo en la posición 32 es alternativamente Leu, Ala, Val, lie, Met o Pro; el residuo en la posición 33 es alternativamente Val, Ala, Glu, Leu, lie, Met o Arg; el residuo en la posición 34 es alternativamente Ala, Ser, Pro, Glu o Gly; el residuo en la posición 35 es alternativamente Ala, Asp, Gly, Ser o Leu; el residuo en la posición 36 es alternativamente Glu, Ala, Thr, Leu, Asp, Asn o Gln; el residuo en la posición 37 es alternativamente Lys, Glu, Thr, Arg, Gln o Asp; el residuo en la posición 38 es alternativamente Lys, Arg, Gln o Glu; el residuo en la posición 39 es alternativamente Asp, Ala, Asn, Glu o Lys; el residuo en la posición 40 es alternativamente Glu, Ser, Asp, Asn, Gln o Gly; el residuo en la posición 41 es alternativamente Gly, Ala o Ser; el residuo en la posición 42 es alternativamente Pro, Gly, Ser o Asn; el residuo en la posición 43 es al ernativamente Tyr, Phe o Trp; el residuo en la posición 44 es alternativamente Arg, Lys, Gln o Glu; el residuo en la posición 45 es alternativamente Met , lie, Ser o Val ; el residuo en la posición 46 es alternativamente Glu, Gln, Asp, Asn, His, Arg o Gly; el residuo en la posición 48 es alternativamente Tyr o Trp; el residuo en la posición 49 es alternativamente Arg o Lys; el residuo en la posición 50 es alternativamente Trp, Tyr o Phe; el residuo en la posición 51 es alternati amente Gly, Ala, Ser o Gln el residuo en la posición 52 es alternativamente Ser, Thr, Asn o Ala; el residuo en la posición 53 es alternativamente Pro o Gly; el residuo en la posición 54 es alternativamente Pro, Ala, Gly, Arg, Leu o Thr; el residuo en la posición 55 es alternati amente Lys, Arg, Gln o Ala; el residuo en la posición 56 es al erna ivamente Asp, Asn, Glu, Gln, Ala, Gly o lie; el residuo en la posición 57 es alternativamente Lys, Gln o Arg; el residuo en la posición 58 es alternati amente Arg, Gln o Lys; el residuo en la posición 59 es alternativamente Tyr, Phe o Trp; el residuo en la posición 60 es alternativamente Gly, Ala, o Ser; el residuo en la posición 61 es alternativamente Gly, Ala o Ser; el residuo en la posición 62 es alternativamente Phe Tyr o Trp; el residuo en la posición 63 es alternativamente Met, Leu, lie o Val; el residuo en la posición 64 es alternativamente Thr, Ala, Ser o Lys; el residuo en la posición 65 es alternativamente Ser, Ala, Thr o Pro; el residuo en la posición 66 es alternati amente Glu, Asp, Asn, Lys o Gln; el residuo en la posición 67 es alternativamente Lys, Arg o Gln; el residuo en la posición 68 es alternativamente Ser, Ala, Thr o Gly; el residuo en la posición 69 es alternativamente Gln, Glu, Asp, Asn, Arg o His; el residuo en la posición 70 es alternativamente Thr, Ser, Ala o Lys; el residuo en la posición 71 es alternativamente Pro o Gly; el residuo en la posición 72 es alternativamente Leu, lie, Met o Val; el residuo en la posición 73 es alternativamente Val, Leu, lie o Met; el residuo en la posición 74 es alternativamente Thr, Ala o Ser; el residuo en la posición 75 es alternativamente Leu, lie, Met o Val; el residuo en la posición 76 es alternativamente Phe, Tyr, Trp o Leu; el residuo en la posición 77 es alternativamente Lys, Gln o Arg; el residuo en la posición 78 es alternativamente Asn, Asp, Glu, Gln o His; el residuo en la posición 79 es alternativamente Ala, Gly, Ser, lie o Val; el residuo en la posición 80 es alternativamente lie, Leu, Met, Val o Thr; el residuo en la posición 81 es alternativamente lie, Met, Val, Thr o Leu; el residuo en la posición 82 es alternati amente Lys, Gln o Arg; el residuo en la posición 83 es alternativamente Asn, Asp, Glu, Gln o Ser; el residuo en la posición 84 es alternativamente Ala, Val, Ser, Gly o Glu; el residuo en la posición 85 es alternati amente Tyr, Phe, Trp o His el residuo en la posición 86 es alternativamente Lys, Gln o Arg; el residuo en la posición 87 es alternativamente Lys, Gln o Arg; el residuo en la posición es alternativamente Gly, Ala o Ser; el residuo en la posición 89 es alternati amente Glu, Gln, Asp, Asn o His.

Las sustituciones específicas adicionales en BLT de humano (SEC ID NO: 8) incluyen sustituciones simples o múltiples en la SEC ID NO: 8, en donde: el residuo en la posición 3 es Glu; el residuo en la posición 4 es Arg; el residuo en la posición 6 es Gln; el residuo en la posición 7 es Pro; el residuo en la posición 8 es Glu, Ala o Pro; el residuo en la posición 9 es Pro o Ala; el residuo en la posición 11 es Arg o Pro; 3*8 el res iduo en la posición 16 es Leu o Gln; el res iduo en la posición 21 es Phe; el res iduo en la posición 23 es Thr, Leu o Pro; el res iduo en la posición 24 es Arg o Val; el res iduo en la posición 27 es Ala; el res iduo en la posición 29 es Asn, Tyr o Ala; el res iduo en la posición 30 es Glu; el residuo en la posición 31 es Ala; el res iduo en la posición 32 es Ala; el res iduo en la posición 33 es Ala o Glu; el res iduo en la posición 34 es Pro, Ser; el res iduo en la posición 35 es Asp; el res iduo en la posición 36 es Thr o Ala ; el res iduo en la posición 37 es Glu; el residuo en la posición 40 es Ser; el res iduo en la posición 42 es Ser; el res iduo en la posición 44 es Glu; el res iduo en la posición 45 es Val; el res iduo en la posición 52 es Asn ; el res iduo en la posición 54 es Ala o Arg; el res iduo en la posición 56 es Gly; el residuo en la posición 84 es Val; el res iduo en la posición 85 es His; y el res iduo en la posición 89 es His .

Tabla 1 Sustituciones de ejemplares de aminoácidos Tabla 2 IDENTIFICADOR DE LA LISTA DE SECUENCIAS Ácido nucleico que codifica Met-Arg-BLT Secuencia de aminoácido de Met-Arg-BLT Secuencia de aminoácido de una pareja de fusión para crear la SEC ID NO: 5 Enlazador de oligonucleótido usado en la construcción de la fusión de BLT Secuencia de aminoácido de una fusión de BLT Pareja de fusión de Glutat iona-S- transferasa (GST) Proteína de fusión CST/BLT Secuencia de aminoácido de BLT de humano BLT de humano 1-49) BLT de humano 50-89) BLT de humano 38-67) BLT de humano 38-89) BLT de humano ?7-23 BLT de humano 1-14) BLT de humano -21) Tabla 2 (Continuación) 16 BLT de humano (15-2 17 BLT de humano 22-35) 18 BLT de humano 29-42 ) 19 BLT de humano 36-49) 20 BLT de humano 43-56) 21 BLT de humano 50-63) 22 BLT de humano 57-70 23 BLT de humano 64-77 24 BLT de humano 71-84) 25 BLT de humano (78-89) 26 Análogo de BLT (l:Glu-Ala) •27 Análogo de BLT (3:T.hr-Ser) 28 Análogo de BLT (5:Gln-Glu) 29 Análogo de BLT (7:Leu-Asp) 30 Análogo de BLT (10:Gly-Ala) 31 Análogo de BLT (15:Gly-Glu) 32 Análogo de BLT (17:Ala-Gly) 33 Análogo de BLT (23:Ala-Phe) 34 Análogo de BLT (30:Ser-Glu 35 Análogo de BLT (42:Pro-Ser; Procedimientos de Aislamiento del Gen Los expertos en el arte reconocerán que un ácido nucleico que codifica BLT, o una fusión de BLT, pueden obtenerse mediante una pluralidad de técnicas de ADN recombinante que incluyen, por ejemplo, amplificación de reacción de cadena de polimerasa (PCR) o síntesis de ADN de novo. (Ve e . g . , T. Maniatis et al. Molecular Cloninq: A Laboratorv Manual, 2d Ed . Capítulo 14 (1989) ) .

Por ejemplo, los cebadores de oligonucleótidos blanco de los extremos 31 y 5' de la SEC ID NO: 1, pueden usarse para la amplificación de la PCR de Met-Arg-BLT. Ver e . g . PCR Protocols: A Guide to Method and Application, Ed. M. Innis et al., Academic Press (1990) . Una amplificación de PCR comprende ADN de molde, enzimas apropiadas, cebadores y amortiguadores y se lleva a cabo convenientemente en un ciclador térmico (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT) . Un resultado positivo se determina detectando un fragmento de ADN dimensionado apropiadamente (viz. 273 pares de bases) después de la electroforesis de gel de agarosa.

Métodos de Producción de Proteínas Una modalidad de la presente invención se refiere al uso de la proteína BLT como un compuesto farmacéutico.

Los expertos en el arte reconocerán que las proteínas y fragmentos, o los fragmentos funcionales de las mismas, de la presente invención pueden sintetizarse mediante un número de diferentes métodos, tal como métodos químicos bien conocidos en el arte, que incluyen síntesis de péptidos en fase sólida o métodos recombinantes. Ambos métodos se describen en la Patente U.S. 4,617,149, incorporados aquí por referencia.

Los principios de la síntesis química de proteínas de fase sólida son bien conocidos en el arte y, podrían encontrarse en los textos generales en el área. Ver , e . g . H. Dugas and C. Penney, Biooraanic Chemistrv (1981) Springer-Verlag, New York, 54-92. Por ejemplo, los péptidos podrían sintetizarse mediante la metodología en fase sólida que utiliza un sintetizador de péptidos 430A Applied Biosystems (Applied Biosystems, Foster City, CA) y los ciclos de síntesis suministrados por Applied Biosys t ems .

La química de t-butoxicarbonilo secuencial usando protocolos de par doble se aplican a las resina .de p-metil bencidril amina iniciadoras para la producción de carboxamidas C terminales. Para la producción de ácidos C terminales, se usa la metiodida de piridin-2 -aldoxima correspondiente. La asparagina, glutamina y arginina se acoplan usando los esteres de hidroxi benzotriazol preformados. Después de completar la síntesis de péptidos, podrían desprotegerse y cortarse de la resina_ con fluoruro de hidrógeno anhidro que contiene 10% de meta-cresol. El corte del grupo protector de cadena lateral y del péptido de la resina se lleva a cabo a. cero grados Celsius o abajo, preferentemente -20°C durante treinta minutos seguido de treinta minutos a 0°C.

En general, la síntesis o de un péptido consiste de una serie de etapas como sigue. Primero, un aminoácido con su a-amino (y el grupo funcional de cadena lateral si es necesario) protegido, se activa para formar un éster reactivo. Este aminoácido activado se enlaza a un soporte sólido inerte por medio de este grupo éster activado y el enlace de aminoácido se lava completamente. Después de esta etapa, se activa un segundo aminoácido protegido a un éster en una reacción separada. El grupo a-amino del primer aminoácido se desprotege produciendo una amina reactiva, y el segundo aminoácido activado se hace reaccionar con éste para formar un di-péptido en el soporte sólido. La repetición secuencial de estas etapas resulta en un péptido de longitud aumentada. Después de completar la síntesis, el péptido se retira del soporte sólido y los grupos funcionales de cadena lateral se desprotegen mediante el tratamiento del péptido con un ácido fuerte. El péptido después se separa del soporte sólido por filtración, se precipita con un disolvente orgánico y se purifica mediante una variedad de técnicas bien conocidas en el arter En el presente caso, el grupo protector a-amino es el grupo 9- fluoroenilme t ilcarbonilo (Fmoc) . Los grupos protectores de cadena lateral son: Boc (para los residuos de Lys y Trp) , Trt (para Asn, His, Gln) , tBu (para Ser, Thr, Tyr), OtBu (para Asp, Glu) y Pmc (para Arg) . Los esteres activos se forman con hexafluorofosfatode2- (lH-benzo-triazol-1-il) -1, 1, 3, 3 -tetrametil uronio (HBTU) .

El grupo protector a-amino Fmoc se remueve mediante el tratamiento de la fase sólida con piperidina. Bajo estas condiciones el grupo Fmoc se remueve fácilmente mientras que no se efectúan el enlazamiento en fase sólida y los grupos protectores de cadena lateral. El aminoácido protegido que se adiciona a una cadena peptídica naciente se activa con HBTU.

La síntesis de BLT de humano presentó varios retos especiales. Primero, la secuencia del péptido contiene un segmento tripeptídico ser-pro-pro. La química de acoplamiento estándar resulta en una serie de errores de eliminación en la síntesis. Tales eliminaciones se minimizan por el acoplamiento doble de los residuos pro. En la modalidad preferida la síntesis se lleva a cabo por el acoplamiento doble de los residuos de Pro y Ser. Además, después de completar la etapa de acoplamiento, cualquier péptido restante desprotegido, sin reaccionar, se bloquea con anhídrido acético para evitar el alargamiento de la cadena de un péptido de eliminación.

Segundo, el péptido humano contiene 3 secuencias dipeptídicas asp-gly. Estas secuencias son susceptibles a la formación de imina cíclica, aún cuando se protejan las cadenas laterales de asp. Estas iminas cíclicas después podrían reaccionar con piperidina en las etapa de desprotección para generar un péptido modificado con piperidina. Esta ciclización se eliminó mediante la utilización de la protección N-a-Hmb de cada residuo de glicina que precede un residuo asp. Ver e . g . Qubbell et a l . J. Ch em . So c . Ch em . Comm un . 2343, 1994, incorporada aquí por referencia. Dos de los dipéptidos asp-gly se preceden por un pro. Debido a esta característica de la secuencia, y la reactividad inferior de los aminoácidos protegidos hmb, cada uno de estos se acoplan en forma múltiple, y después se cubren con anhídrido acético. En una modalidad preferida estos se acoplan dobles.

En un método preferido, el péptido se sintetiza en una corrida simple usando la química Fmoc. La síntesis de BLT se complica por la presencia de varias secuencias dipeptídicas asp-gly en la porción N terminal de la molécula. Las cadenas laterales de aspartilo en las secuencias dipeptídicas asp-gly se han observado que experimentan ciclización catalizada básica y la adición subsecuente con piperidina durante la síntesis Fmoc. Esta reacción se elimina mediante el uso de Fmoc-( FmocHmb ) -glicina en cada secuencia de asp-gly en la síntesis. La protección de la amida de glicilo con el grupo Hmb inhibe la ciclización de la cadena lateral de aspartilo. Después del corte, desprotección y la purificación de HPLC de fase inversa, el péptido puede analizarse por espectroscopia de masa de electroa t omi zado . Las especies principales observadas en esta síntesis de BLT es el péptido de longitud total que tiene la masa esperada. El uso de este método permite la producción de cantidades de proteína purificada en exceso de 100 mg de una corrida simple a la escala de 0.1 mmol .

Las proteínas de la presente invención también pueden producirse por los métodos de ADN recombinante. La expresión de un ácido nucleico clonado que codifica la BLT, o la fusión de BLT (e.g. SEC ID NO: 1), puede llevarse a cabo en una variedad de células huésped apropiadas, bien conocidas para los expertos en el arte. Para este propósito, un ácido nucleico que codifica BLT se introduce en una célula huésped mediante cualquier medio apropiado, bien conocido para los expertos en el arte. Mientras que la integración cromosómica está dentro del alcance de la presente invención, se prefiere-que la secuencia se clone en un vector de expresión mantenido ext ra-cromosómi camente , de modo que la región codificante del gen de BLT se enlaza operablemente a un promotor constitutivo o inducible.

Las etapas básicas de la producción recombinante de la proteína BLT son: construir un ADN natural, sintético o semisintético que codifica la BLT o una proteina de fusión del mismo; b) integrar el ADN en un vector de expresión de una manera apropiada para expresar la proteína; c) transformar o de otra manera introducir el vector en una célula huésped eucariótica o procariótica que forma una célula huésped recombinante , d) cultivar la célula huésped recombinante de una manera que se pueda someter a la expresión de la proteína; y e) recuperar y sustancialmente purificar la proteína por cualquier medio apropiado.

Proteína de Fusión BLT de Expresión Recombinante en Cé 1ui as Huésped Procarióticas y Eucarióticas La beta-lipotropina de humano (BLT) es una hormona de 89 aminoácidos que se produce por la pituitaria en la forma de una proteína precursora, que experimenta el procesamiento pos t -trans lacional para generar varias hormonas bioactivas que incluyen la BLT. Debido a que la BLT es pequeña y contiene sitios prot eol i ticamente sensibles, se ha producido esta proteína inicialmente por la síntesis química. Sin embargo, este método no es útil para generar grandes cantidades. En esta invención, se describe un método mediante el cual la BLT puede producirse en huéspedes de expresión bacterianos o fúngícos en la forma de proteínas de fusión. Estas proteínas de fusión se protegen de la degradación proteolítica y permiten la recuperación de BLT intacta mediante los métodos descritos posteriormente.

En E. coli, la BLT se produce como una proteína de fusión que puede recuperarse de los lisados celulares en presencia de solución salina alta mediante los métodos de purificación convencionales. La proteína de fusión contiene un sitio de reconocimiento para las proteasas específicas que se usan para separar la pareja de fusión de la BLT. En Pi ch i a pa s t ori s , la proteína de fusión se corta en la secreción de la célula, de tal manera que la BLT nativa puede detectarse y recuperarse intacta del medio de cultivo.

Este método ofrece un proceso de producción para la BLT. A diferencia de la síntesis química, el proceso descrito aquí puede aumentarse proporcionalmente para producir grandes cantidades de BLT.

Las procariotas podrían emplearse en la producción de la proteína BLT recombinante. Por ejemplo, la cepa 294 de Escherichia coli K12 (ATCC No. 31446) es particularmente útil para la expresión de proteínas extrañas de una célula procariótica. Otras cepas de E. coli, bacilli tal como Bacillus subtilis, ent erobacteriaceae tal como Salmonella typhimurium o Serratia ma rcescans , varias especies de Pseudomonas y otras bacterias, tal como Streptomyces , también podrían emplearse como células huésped en la clonación y expresión de las proteínas recombinantes de esta invención .

Las secuencias promotoras apropiadas para realizar la expresión de genes en procariotas incluyen b-lactamasa [e.g. vector pGX2907, ATCC 39344, contiene una replicación y el gen de b- lac tama sa ] , sistemas de lactosa [Chang et al., Nature (London), 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature (London), 281:544 (1979)], fosfatasa alcalina y el sistema promotor de triptófano (trp) [vector pATHl (ATCC 37695)], que se designa para facilitar la expresión de un marco de lectura abierto como una proteína de fusión trpE bajo el control del promotor de trp. Los promotores híbridos tal como el promotor tac (aislado del plásmido pDR540, ATCC-37282) también son apropiados, como son los promotores T7. Aún otros promotores bacterianos, cuyas secuencias nucleótidas en general se conocen, podrían ligarse al ADN que codifica de la proteína de la invención inmediata, usando enlazadores o adaptadores para suministrar cualquier sitio de restricción requerido. Los promotores para el uso en los sistemas bacterianos también contendrán una secuencia Shine-Dalgarno enlazada operablemente al ADN que codifica los polipéptidos deseados. Estos ejemplos son ilustrativos en lugar de 1 imitantes .

Las proteínas de esta invención, podrían sintetizarse ya sea por expresión directa o como una proteína de fusión de la cual la pareja de fusión podría removerse mediante el corte enzimático o químico. En principio, esta invención se aplica a cualquier sistema de fusión que pueda expresarse en los huéspedes bacterianos o fúngicos. En una modalidad de un sistema de fusión apropiado, un sitio de reconocimiento se coloca entre la BLT y un par de fusión, en donde, por ejemplo, el par de fusión se coloca en el extremo amino terminal de la BLT. Un sitio apropiado puede ser una secuencia de reconocimiento para una proteasa, o un sitio que es susceptible al corte químico.

Ejemplos de los pares de fusión bacterianos apropiados incluyen glutat iona-S-trans ferasa , proteína de enlazamiento de maltosa, procarboxipept idasa , proteína de enlazamiento de calmodulina o cualquier secuencia localizada terminalmente en amino que promueve la expresión de alto nivel de una proteína de fusión.

Ejemplos de las proteasas apropiadas incluyen el factor Xa, trombina y enterocinasa. Los agentes para el corte químico incluyen bromuro de cianógeno, ácido, etc.

Ejemplos de pares de fusión que son útiles en los sistemas fúngicos incluyen el factor complementario alfa, propéptido, albúmina de suero de humano y cualquier otra secuencia que promueva la expresión y secreción de la proteína de fusión y el corte subsecuente (durante la secreción) para liberar la BLT nativa en el medio de cultivo.

En un método, una proteína de fusión de BLT comprende una secuencia BLT nativa fusionada a un dipéptido (viz. Met-Arg) en el extremo terminal amino de la molécula de BLT nativa (e.g. SEC ID NO: 2) . El par dipeptídico de esta molécula de fusión puede liberarse mediante el tratamiento con Catepsina C, y la molécula de BLT nativa se purifica mediante las técnicas conocidas en el arte, tal como, por ejemplo, HPLC. En otro método para producir la proteína de fusión de BLT recombinante, se usa glutat iona-S-trans fera sa (GST) como el par de fusión para producir la proteína designada aquí como la SEC ID NO: 7, como se describe esencialmente en Smith and Johnson { Gen e , 67, 31, 1998), incorporada aquí por referencia.

Frecuentemente se observa que en la producción de ciertos péptidos en los sistemas recombinantes que expresan una proteína de fusión, se prolonga el tiempo de vida, aumenta el rendimiento del péptido deseado, o se proporciona un medio conveniente para purificar la proteína. Esto es particularmente relevante cuando se expresan proteínas de mamíferos en huéspedes procarióticos. Se conocen una variedad de peptidasas (e.g. enterocinasa y trombina) que cortan un polipéptido en los sitios específicos o digieren los péptidos del termino amino o carboxi (e.g. diaminopept idasa ) de la cadena peptídica. Además, los químicos particulares (e.g. bromuro de cianógeno) cortarán una cadena de polipéptido en los sitios específicos. El experto en el arte apreciará que las modificaciones necesarias para la secuencia de aminoácido (y la secuencia de codificación sintética o semi-s int ética si se emplean medios recombinantes) para incorporar los sitios de corte internos de sitio específico incorporados. Ver e . g . , P. Cárter, "Site Specific Proteolysis of Fusión Proteins", Capítulo 13, en Protein Purification: From Molecular Mechanisms to Larcre Scale Processes, American Chemical Society, Washington, D.C. (1990) .

Además de las procariotas, pueden usarse una variedad de sistemas de expresión anfibianos tal como ovocitos de rana y sistemas celulares de mamíferos. La elección de una célula huésped particular depende en algún grado del vector de expresión particular usado.

Ejemplos de células huésped de mamíferos apropiadas para el uso en la presente invención incluyen por ejemplo HepG-2 (ATCC HB 8065), CV-1 (ATCC CCL 70), LC-MK2 (ATCC CCL 7.1), 3T3 (ATCC CCL 92), CHO-Kl (ATCC CCL 61), HeLa (ATCC CCL 2), RPMI8226 (ATCC CCL 155), H4IIEC3 (ATCC CCL 1600), C127I (ATCC CCL 1616), HS-Sultan (ATCC CCL 1484) y BHK-21 (ATCC CCL 10) .

Una amplia variedad de vectores son apropiados para la transformación en células huésped de mamíferos. Por ejemplo, los vectores de tipo pSV2 comprenden los segmentos del genoma del virus 40 de simio (SV40) requeridos para la transcripción y la poliadenilación.

Se han construido un gran número de vectores de tipo pSV2 del plásmido, tal como pSV2-gpt, pSV2-nec, pSV2-dhfr, pSV2-hyg, y pSV2 -b-globina , en los que el promotor SV40 dirige la transcripción de un gen insertado. Estos vectores son ampliamente disponibles de las fuentes tal como American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20852, o Northern Regional Research Laboratory (NRRL), 1815 N. University Street, Peoría, Illinois, 61604.

Los promotores apropiados para la expresión en células de mamíferos incluyen el promotor tardío SV40, los promotores de los genes eucarióticos, tal como, por ejemplo, el gen de ovalbúmina de pollo inducible de estrótgeno, los genes interferones, el gen de am i n o t r a n s f e r a s a de tirosina inducible de glucocorticoide, el promotor del gen de timidina cinasa y los promotores de los genes de adenovirus temprano y tardío principales.

La transfección de células de mamíferos con vectores puede realizarse mediante una pluralidad de procesos bien conocidos que incluyen, pero no se limitan, fusión de protoplasto, co-precipit ación de fosfato de calcio, electroporación y similares. Ver, e.g. Maniatis et al. , supra .

Algunos virus también hacen los vectores apropiados. Ejemplos incluyen los adenovirus, los virus adeno-asociados, los virus de vacunas, los virus herpes, los baculovirus y el virus de sarcoma rous, como se describe en la Patente U.S. 4,775,624, incorporada aquí por referencia .

Los microorganismos eucarióticos tal como levadura y otros hongos, también son apropiados como células huésped. Las levaduras Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris son los microorganismos eucarióticos preferidos. Otras levaduras tal como Kluyveromyces lactis también son apropiadas. Para la expresión en Saccharomyces , por ejemplo, podría usarse el plásmido YRp7 (ATCC-40053 ) . Ver, e.g. , L. Stinchcomb et al., Nature, 282, 39 (1979) ; J. Kingsman et al. , Gene, 1, 141 (1979); S. Tschemper et al. , Gene, 10, 157 (1980) . El plásmido YRp7 contiene el gen TRP1 que proporciona un marcador seleccionado para el uso en un mutante auxotrófico trpl.

Otras modalidades de la presente invención comprenden las secuencias de ácido nucleico aisladas que codifican la BLT o el fragmento de la misma. Como los expertos en el arte reconocerán, los compuestos de aminoácidos de la invención pueden codificarse mediante una multitud de diferentes secuencias de ácidos nucleicos. Debido a que esta secuencias de ácidos nucleicos alternativas codificarían las mismas secuencias de aminoácidos, la presente invención además comprende estas secuencias de ácidos nucleicos alternativas .

Los ácidos nucleicos que codifican la BLT de la invención, también podrían producirse por los métodos de síntesis química. La síntesis de ácidos nucleicos es bien conocida en el arte. Ve r , e . g . , E.L. Brown, R. Belagaje, M.J. Ryan, and H.G. Khorana, Me t h ods i n En zym o l o gy , 68:109-151 (1979) . Los fragmentos de la secuencia de ADN que corresponden a BLT, podrían generarse usando un aparato de síntesis de ADN convencional, tal como los sintetizadores de ADN Applied Biosystems Modelo 380A o 380B (Applied Biosystems, Inc., 850 Lincoln Center Drive, Foster City, CA' 94404) usando la química de f os foramidita , posteriormente ligando los fragmentos para reconstituir el gen completo. Alternativamente, la química de f os fot riés t er podría emplearse para sintetizar los ácidos nucleicos de esta invención. { Ve r , e . g . , M.J. Gait, ed., Oliqonucleotide Synthesis, A Practica! Approach, (1984)) .

Vectores Otro aspecto de la presente invención se refiere a los vectores de clonación de ADN recombinante y los vectores de expresión que comprenden los ácidos nucleicos de la presente invención. Los vectores de ácidos nucleicos preferidos son aquellos que comp renden ADN. Los vectores de ADN recombinantes más preferidos comprenden la secuencia de ADN aislada, SEC ID NO: 1.

El experto en el arte entiende que la elección del vector de clonación o vector de expresión más apropiado depende de un número de factores que incluyen la disponibilidad de los sitios de la enzima de restricción, el tipo de célula huésped en la cual el vector se transfiere o transforma, el propósito de la transfección o la transformación (e.g., una transformación estable como un elemento ext racromosómico , o la integración en el cromosoma del huésped), la presencia o ausencia de los marcadores fácilmente probados o seleccionados (e.g., marcadores de resistencia antibiótica o metabólica de un tipo y otro) , y el número de copias del gen deseado en la célula huésped .

Los vectores apropiados para portar los ácidos nucleicos de la presente invención comprenden virus de ARN, virus de ADN, bacteriófagos líticos, bacteriófagos lisogénicos, bacteriófagos estables, plásmidos, viroides y similares. Los vectores más preferidos son los p 1 á smi dos.

Cuando se prepara un vector de expresión, el experto en el arte entiende que existen varias variables a considerarse, por ejemplo, si usar un promotor constitutivo o variable. El practicante también entenderá que la cantidad de ácido nucleico o proteína a producirse dicta, en parte, la selección del sistema de expresión. Con respecto a las secuencias promotoras, los promotores inducibles se prefieren debido a que permiten la expresión regulable, de alto nivel de un gen enlazado operablemente. El experto en el arte reconocerá un número de promotores apropiados que responden a una variedad de inducidores, por ejemplo, fuente de carbono, iones metálicos y calor. Otras consideraciones relevantes con respecto a un vector de expresión incluyen si se incluyen las secuencias para dirigir la localización de una proteína recombinante. Por ejemplo, una secuencia que codifica una señal peptídica que precede la región de codificación de un gen es útil para dirigir la exportación extra-celular de un polipéptido resultante'.

La presente invención también proporciona un método para construir una célula huésped recombinante capaz de expresar proteínas BLT, el método comprende transformar o de otra manera introducir en una célula huésped un vector de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN aislada, que codifica la BLT. La célula huésped preferida es cualquier célula que puede acomodar la expresión de alto nivel de un gen o proteína introducido exogéneament e . Las células huésped transformadas podrían cultivarse bajo las condiciones bien conocidas paro los expertos, de modo que se expresa la BLT recombinante.

La presente invención también proporciona los métodos para tratar humanos y otros animales atacados con enfermedades o condiciones asociadas con los defectos en el metabolismo de insulina o metabolismo de carbohidratos, tal como, por ejemplo, hipergl i cernía , hiperinsul inemia , diabetes de tipo 1 y tipo 2 y complicaciones asociadas con las mismas. El método comprende administrar a un organismo con la necesidad del mismo, una cantidad efectiva de la proteína o péptido BLT, o la proteína de fusión que comprende BLT, o el fragmento funcional de la misma, o el análogo de la misma en una dosificación entre aproximadamente 1 y 1000 ug/kg de peso corporal. En la práctica de este método, la BLT puede administrarse en una dosificación diaria sencilla, en dosificaciones múltiples por día o por la administración continua o discontinua por vía de un dispositivo de bombeo mecánico que se implanta en el cuerpo o se une de otra manera al mismo. La cantidad de BLT o la proteína o el péptido relacionado que se va a administrar se determinará por el médico, y depende de factores tales como la naturaleza y la severidad de la condición, síndrome o la enfermedad que es tratada, y la edad y la salud general del paciente.

La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende como el ingrediente activo una proteína BLT o fragmento funcional de la misma, o análogo de la misma e.g. que se representa por la SEC ID NO: 8, o una sal no tóxica farmacéuticamente aceptable de la misma, en mezcla con un vehículo sólido o líquido farmacéuticamente aceptable. La proteína, preferentemente en la forma de una sal farmacéuticamente aceptable, puede formularse para la administración parenteral durante el tratamiento terapéutico o profiláctico de diabetes o complicación de la misma. Por ejemplo, los compuestos de la SEC ID NO: 8 u otra BLT, o fragmento de la misma, pueden mezclarse con los vehículos o excipientes farmacéuticos convencionales. Las composiciones que comprenden la proteína BLT contienen de aproximadamente 0.1 a 90% en peso de la proteína, preferentemente en una forma soluble, y más en general de aproximadamente 10 a 30%. Además, las presentes proteínas podrían administrarse solas o en combinación con otros agentes ant i-diabéticos o agentes usados en el tratamiento de diabetes.

Para uso intravenoso (IV), la proteína BLT, fragmento o análogo se administra en el fluido (s) intravenoso comúnmente usado y se administra por infusión. Pueden usarse tales fluidos, por ejemplo, solución salina fisiológica, solución de Ringer o solución de dextrosa al 5%.

Para las preparaciones intramusculares, una formulación estéril, preferentemente una forma de sal soluble apropiada de la proteína BLT, por ejemplo SEC ID NO: 8, tal como la sal de clorhidrato, puede disolverse y administrarse en un diluyente farmacéutico tal como agua libre de pirógeno (destilada), solución salina fisiológica o solución de glucosa al 5%. Una forma insoluble apropiada del compuesto podría prepararse y administrarse como una suspensión en una base acuosa o una base aceitosa farmacéuticamente aceptable, e.g. un éster de un ácido graso de cadena larga, tal como oleato de etilo .

Los siguientes ejemplos describen más completamente la presente invención y el uso de BLT para tratar la diabetes. Los expertos en el arte reconocerán que los reactivos, equipo y procedimientos particulares descritos, son simplemente ilustrativos y no se destinan de ninguna manera para limitar la presente invención.

EJEMPLO 1 Síntesis y Purificación en Fase Sólida de la Proteína BLT de Humano Un péptido BLT de humano (SEC ID NO: 8) se sintetizó en una corrida particular usando la química de Fmoc. La síntesis de BLT se complica por la presencia de varias secuencias dipeptídicas asp-gly en la porción N-terminal del péptido. Las cadenas laterales de aspartilo en las secuencias dipeptídicas asp-gly se han observado que experimentan la ciclización catalizada básica y la adición subsecuente con piperidina durante la síntesis FMOC. Esta reacción se elimina mediante el uso de Fmoc- ( FmocHmb ) -glicina en cada secuencia de asp-gly en la síntesis. La protección de la glicidil amida con el grupo Hmb inhibe la ciclización de la cadena lateral de aspartilo. Después del corte, la desprotección, y la purificación por HPLC de fase inversa, el péptido puede analizarse por espectroscopia de masa de elect roa t omi zado . Las especies principales observadas en la síntesis es el péptido de longitud total que tiene la masa esperada. El uso de este método permite la producción de cantidades de la proteína purificada en exceso de 100 mg de una corrida simple a la escala de 0.1 mmol .

Materiales: Resina Fmoc-Glu (OtBu) pre-cargada Wang (1% de poliestireno de enlace cruzado funcionalizado con alcohol p-benzoxibencilico), a aproximadamente 0.6 mmol de aminoácido/g de resina. N-me t i Ipi rrolidina (NMP), piperidina, hexafluorofosfato de 2- ( lH-ben zot r ia zol - 1 -il) -l, l, 3, 3-tetrametiluronio (HBTU) , N , N -diisopropile t ilamina 2M (DIEA), 1 -hidroxibenzot r ia zol (HOBt), diclorometano (DCM), dimetilformamida (DMF) .

La resina, pre-cargada con el aminoácido C terminal protegido con Fmoc (0.1 o 0.25 mmol de aminoácido), se pesó y se colocó en una cámara de reacción. La resina se pre-hinchó lavando con DCM. La resina después se lavó con NMP. El grupo Fmoc N terminal se removió por incubación de la resina en una solución al 18-22% de piperidina en NMP. Después de la desprotección, la resina se lavó extensivamente con NMP.

Un mmol del siguiente aminoácido protegido con Fmoc que se adicionó al péptido, se solubilizó en 2.1 g de NMP, 2.0 g de HBTU 0.45M/react i vo HOBt en DMF. Después de la solubilización, la activación del aminoácido se inició mediante la adición de 3 ml de DIEA 2M en NMP. El aminoácido activado después se adicionó a la resina desprotegida y se dejó acoplarse. Una vez que se completó el acoplamiento, la resina se lavó extensivamente con NMP. El ciclo completo de la desprotección y el acoplamiento, después se repitieron para cada aminoácido suces i vo Las etapas del ciclo específico en la síntesis fueron como sigue: Ciclo, AA Etapas 1 Glu (OtBu) Lavado completo 2 Gly Acoplamiento simple 3 Lys ( Boc ) Acoplamiento simple 4 Lys ( Boc ) Acoplamiento simple 5 Tyr ( tBu) Acoplamiento simple 6 Ala Acoplamiento simple 7 Asn (Trt ) Acoplamiento simple Lys ( Boc ) Acoplamiento simple 9 lie Acoplamiento simple 10 He Acoplamiento simple 11 Ala Acoplamiento simple 12 Asn (Trt ) Acoplamiento simple 13 Lys ( Boc ) Acoplamiento simple 14 Phe Acoplamiento simple 15 Leu Acoplamiento simple 16 Thr (tBu) Acoplamiento simple 17 Val Acoplamiento simple Leu Acoplamiento simple 19 Pro Acoplamiento doble/cebado Ac20 Thr(tBu) Acoplamiento simple 21 Gln(Trt) Acoplamiento simple 22 Ser(tBu) Acoplamiento simple 23 Lys (Boc) Acoplamiento simple 24 Glu(OtBu) Acoplamiento simple 25 Ser (tBu) Acoplamiento simple 26 Thr(tBu) Acoplamiento simple 27 Met Acoplamiento simple 28 Phe Acoplamiento simple 29 Gly Acoplamiento simple 30 Gly Acoplamiento simple 31 Tyr(tBu) Acoplamiento simple 32 Arg(Pmc) Acoplamiento simple 33 Lys (Boc) Acoplamiento simple 34 Asp (OtBu) Acoplamiento simple 35 Lys (Boc) Acoplamiento simple 36 Pro Acoplamiento doble/cebado Ac20 37 Pro Acoplamiento doble/cebado Ac20 38 Ser(tBu) Acoplamiento simple 39 Gly Acoplamiento simple 40 Trp (Boc) Acoplamiento simple 41 Arg ( Pmc ) Acoplamiento simple 42 Phe Acoplamiento simple 43 His (Trt) Acoplamiento simple 44 Glu(OtBu) Acoplamiento simple 45 Met Acoplamiento simple 46 Arg ( Pmc) Acoplamiento simple 47 Tyr(tBu) Acoplamiento simple 48 Pro Acoplamiento doble/cebado Ac20 49 Gly Acoplamiento simple 50 Glu(OtBu) Acoplamiento simple 51 _ Asp (OtBu) Acoplamiento simple 52 ~ Lys (Boc) Acoplamiento simple 53 Lys (Boc) Acoplamiento simple 54 — Glu(OtBu) Acoplamiento simple 55 Ala Acoplamiento simple 56 Ala Acoplamiento simple 57 Val Acoplamiento simple 58 Leu Acoplamiento simple 59 Leu Acoplamiento simple 60 Ser (tBu) Acoplamiento simple 61 His (Trt) Acoplamiento simple 62 Glu (OtBu) Acoplamiento simple 63 Leu Acoplamiento simple 64 Asp (OtBu) Acoplamiento simple 65 Ala Acoplamiento simple 66 Gln (Trt) Acoplamiento simple 67 Ala Acoplamiento simple 68 Gly Acoplamiento simple 69 Ala Acoplamiento simple 70 Gly ( Fmoc-hmb) Acoplamiento doble/cebado Ac20 71 Asp (OtBu) Acoplamiento simple 72 Asp (OtBu) Acoplamiento simple 73 Ala Acoplamiento simple 74 Pro Acoplamiento doble/cebado Ac20 75 Gly ( Fmoc-hmb) Acoplamiento doble/cebado Ac20 76 Asp (OtBu) Acoplamiento simple 77 Pro Acoplamiento doble/cebado Ac20 78 Gly ( Fmoc-hmb ) Acoplamiento doble/cebado Ac20 79 Asp (OtBu) Acoplamiento simple 80 Gly Acoplamiento simple Glu (OtBu Acoplamiento simple Arg ( Pmc Acoplamiento simple 83 Leu Acoplamiento simple 4 Ar g ( Pmc ) Acoplamiento simple 5 G l n ( T r t ) Acoplamiento simple 6 G l y Acoplamiento simple 7 T h r ( t B u ) Acoplamiento simple Leu Acoplamiento simple 89 Glu (OtBu Acoplamiento simple 90 Desprotección final Para los aminoácidos que reaccionan lentamente o ineficientemente, se llevaron a cabo 2 reacciones de acoplamiento separadas. Cualquier péptido residual sin reaccionar se bloqueó por el tratamiento con anhídrido acético. La secuencia de las etapas para una de estos aminoácidos fue desprotección, reacción de acoplamiento 1, lavado, reacción de acoplamiento 2, lavado, cebado ac20, lavado, desprotección.

Abreviaciones: OtBu: t-butil éster, tBu: t-butilo, Boc: t-butoxicarbonilo, Pmc: 2 , 2 , 5 , 7 , 8 -pent ame t ilcroma-6-sulfonilo, Hmb: 2 -hidroxi - 4 -me t oxibencilo , Fmoc: 9-fluorenilmetoxicarbonilo EJEMPLO 2 Construcción de un gen sintético que codifica BLT Las construcciones del plásmido se realizaron usando las metodologías de clonación estándares como se describe por Maniatis et al., Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1982) . Las enzimas y otros reactivos se obtuvieron de Gibco-BRL, Gai ther s gurg , MD o New England Biolabs, Beverly MA 01915. Los métodos para la digestión, identificación, recuperación y purificación de los varios oligonucleótidos y fragmentos de ADN usados en esta invención, son conocidos para los expertos en el arte, como son los métodos para la ligación de estas secuencias en vectores, transformación de microorganismos huéspedes y cultivo de estos microorganismos huéspedes bajo las condiciones que permiten la producción del ADN plásmido y los productos de proteínas recombinantes.

Una secuencia de ADN que codifica la BLT de humano (SEC ID NO: 8) se junta a partir de 8 oligonucleótidos sintetizados químicamente que se encuentran en el rango de 52 a 86 bases. Los oligonucleótidos se generaron usando un aparato de s int et i zación convencional de ADN tal como el Applied Biosystems modelo 380A o 380B (comercialmente disponible en Applied Biosystems, Inc., 850 Lincoln Center Drive, Foster City, CA 94404) . La secuencia de oligonucleótidos se diseñó de tal manera que 4 de los oligonucleótidos generaron una hebra del gen de síntesis y los restantes 4 oligonucleótidos generaron la hebra complementaria del gen de síntesis. Antes del montaje, los oligonucleótidos se trataron con el polinucleótido cinasa en presencia de ATP para fosforilar los grupos hidroxilo libres de los oligonucleótidos individuales.

Los 8 oligonucleótidos se mezclaron en concentración equimolar (3 picomoles /ul ) en un volumen de 100 ul, se calentaron a 95°C y se enfriaron gradualmente a temperatura ambiente durante un período de varias horas. Esto permitió el apareamiento de bases apropiado de los oligonucleótidos individuales. Se adicionó ADN T4 ligasa para ligar los oligonucleótidos y generar un ADN de -285 pares de bases de doble hebra, que se analizó y se purificó en un gel de agarosa al 2%. Este fragmento, que tuvo extremos "pegajosos", se ligó en un vector pUC18 digerido con Ndel y Ba HI. La mezcla de ligación se transformó en las células DH10B competentes que se colocaron en placas de agar de levadura de triptona que contenían 100 ug/ml de ampicilina. Las colonias que crecieron durante toda la noche se analizaron para la presencia de plásmidos que contuvieran el gen sintetizado químicamente. Esto se hizo purificando el ADN de plásmido de estas colonias, digiriendo el ADN de plásmido con Ndel y BamHI y verificando la presencia de un fragmento de -285 pares de bases. La secuencia correcta se confirmó subsecuentemente por análisis de la secuencia de ADN. El plásmido se nombró pOJ838.

EJEMPLO 3 Construcción de plásmidos que expresan una proteína de fusión BLT Debido a que la BLT es una proteína pequeña, es ventajoso aumentar su tamaño creando una proteína de fusión. Para este propósito, se usaron dos diferentes pares de fusión. Uno fue glu tat iona-S-trans f erasa (GST), que tuvo un sitio de corte de factor Xa y la secuencia de aminoácido designada aquí como SEC ID NO: 6, como se codificó por el vector pGEX-2T (Pharmacia Biotechnology, Piscataway, NJ 08855) ; el otro fue una secuencia peptídica corta MI IGLMVGGVSGSGSGSGDDDDP (SEC ID NO: 3) .

Para obtener la beta-lipotropina nativa, las proteínas de fusión se trataron químicamente o por digestión enzimática, para des-asociar la beta-lipotropina de su pareja de fusión. Esto se realiza insertando sitios para el corte enzimático o químico entre la pareja de fusión y la beta-lipotropina. Para las fusiones GST, se eligieron los sitios de reconocimiento para la enterocinasa o factor Xa; para la fusión del péptido sintético pequeño (SEC ID NO: 3), se insertó una prolina, por lo cual se permite el corte químico del siguiente tratamiento ácido.

Un plásmido que codifica una fusión GST con una secuencia de reconocimiento del factor Xa (IEGR) se construyó como sigue. El plásmido pOJ838 (pUCld que contiene la beta-lipotropina sintética; Ver Ejemplo 4) se digirió con Ndel y NruI, y el fragmento del vector más largo se purificó por gel. Un enlazador sintético de la s e c u e n c i a 5 ' -TATGAGATCTATCGAAGGTCGTGAGCTCACCGGTCAGCGTGTTCG-3 ' (SEC ID NO : 4 ) y su complemento, se mezclaron en cantidades equimolares, se calentaron a 95°C y se dejaron moldear disminuyendo gradualmente la temperatura a aproximadamente 25°C. El enlazador moldeado se ligó al fragmento del vector, y la mezcla de ligación se transformó en las células DH10B competentes. Las células transformadas se colocaron en placas en placas de agar de levadura de triptona que contenían 100 ug/ml de ampicílina. Las colonias que crecieron durante toda la noche se analizaron para la presencia de plásmidos que contenían la secuencia enlazadora. Esto se hizo purificando el ADN del plásmido de estas colonias y verificando la presencia de un nuevo sitio BglII que se introdujo por vía del enlazador. La secuencia enlazadora correcta se confirmó subsecuentemente por el análisis de la secuencia de ADN. El plásmido resultante se nombró pOJ839.

El plásmido pOJ839 se digirió con BglII y EcoRI y el fragmento pequeño que contenía el gen de beta-lipotropina (ahora unido a una secuencia de reconocimiento de factor Xa) se purificó por gel y se ligó en pGEX 2-T digerido con BamHI y EcoRI . La mezcla de ligación se transformó en las células DH10B competentes, que se colocaron en placas en de agar de levadura de triptona que contenían 100 ug/ml de ampicilina. Las colonias que crecieron durante toda la noche, se analizaron para la presencia de plásmidos que contuvieran un nuevo fragmento de -300 pb después de la digestión con SaCI. Este nuevo plásmido se nombró pOJ840 EJEMPLO 4 Vector recombinante pHMM260 - ProCpB ( 10 ) /LVPR/Be t a lipotropina (R49) que codifica la proteina de fusión Procarboxipeptidasa-BLT Un vector de expresión de ADN recombinante, pHMM260, contiene un cásete de expresión ProCpB ( 10 ) /LVPR/Be t a Lipotropina (R49), que codifica una proteína de fusión de procarboxipept idas a-BLT . Este vector se produjo usando las técnicas de clonación estándares. Una anotación del cásete de expresión de pHMM260 se muestra en la Figura 16. El cásete de expresión se flanquea por un sitio Ndel en el extremo 51 y. un sitio BamHI en el extremo 3' . La porción del pro-péptido de la proteína procarboxipept ida sa B de porcino se presenta en el extremo 5' del cásete, comenzando con un residuo y terminando con un residuo Ser. Una secuencia de reconocimiento de trombina proteasa, LVPR, se presenta inmediatamente en 3' de la secuencia de procarboxipept idasa . La secuencia que comienza con un residuo Glu al extremo 3' del sitio de corte de trombina codifica la beta-lipotropina de tipo silvestre de humano .

Se construyeron varios casetes derivados, de modo que la posición 49 de la secuencia de BLT se cambió de la secuencia de tipo silvestre Arg (R49) a Ala (A49) pHMM261, o Glu (E49) pHMM262, o Gln (Q49) pHMM263. Estos derivados se hicieron para reducir la susceptibilidad a la proteólisis durante la síntesis y purificación de las proteínas de fusión. Todos estos vectores codifican las proteínas de fusión solubles.

EJEMPLO 5 Vector recombinante pHMM269 que codifica la proteína de fusión serina hidroxi met i 1 trans ferasa (SHMT) Una proteína de fusión que contiene una secuencia amino terminal de la enzima de serina hidroxi metilasa transferasa (SHMT) , se construyó usando las técnicas de clonación estándares. El plásmido pHMM269 se expresó a altos niveles en E. coli. La proteína de fusión producida por pHMM268 fue insoluble y pudo recuperarse con la fracción de particulado. Esta característica proporcionó ventaja en la protección contra la degradación proteolítica .

EJEMPLO 6 Administración de BLT de ratón durante 7 días de los ratones machos Avy A El ratón Avy A es un modelo para obesidad y diabetes. Esta cepa procreada desarrolla hiperglicemia , hiper insulinemia , e insensibilidad a insulina en la vida media y por lo tanto, proporciona un modelo útil para la obesidad y la diabetes.

Los ratones macho Avy A se adquirieron en Harían Co . ( Indianapoli s , IN) a aproximadamente 6 meses de edad. Los animales se alojaron, 6 por caja y se alimentaron con alimento a d l ibi t um 5008 y agua. Los niveles de glucosa sanguínea se midieron a intervalos regulares; cuando los niveles de glucosa en la mañana alcanzaron al menos 300 mg/dL, los animales se sometieron al protocolo experimental. Cinco animales, seleccionados aleatoriamente, se alojaron juntos como un control; 5 animales, seleccionados aleatoriamente, se alojaron juntos para recibir el tratamiento con BLT de ratón (la secuencia de BLT de ratón es fácilmente disponible; Ver e.g. M. Notake et a l . FEBS Lett. 156, 67-71, 1983; incorporada aquí por referencia), se sintetizaron por las técnicas de fase sólida.

Los ratones que se sometieron al tratamiento con BLT recibieron 60 µg dados subcutáneamente (SC) (volumen total de 200 µl por cada dosificación); los animales de control recibieron 200 µl de vehículo (solución salina) . Los animales se inyectaron dos veces diariamente, en la mañana y en la tarde, durante 6 días; en el día 7 recibieron sólo la inyección en la mañana.

Los niveles de glucosa en la sangre, peso corporal y el consumo de alimento se midieron en la mañana en el día 0. El peso corporal y el consumo de alimento se midieron en la mañana del día 1 al día 6. Los triglicéridos de plasma se midieron en la mañana del día 6. Los ratones se sometieron a ayuno durante toda la noche de la tarde del día 6 a la mañana del día 7. En el día 7, se realizó una prueba de tolerancia a la glucosa oral. Los niveles de glucosa al tiempo cero se midieron 2 horas después de la inyección de la mañana de la solución salina o BLT. Para esta prueba, a los animales se administraron en forma oral solución de dextrosa al 25% (100 µl/10 g de peso corporal) , después sangraron a 30, 60 y 120 minutos después. Estas muestras de sangre se usaron para determinar los niveles de glucosa e insulina. Después de la prueba oral de tolerancia a la glucosa, los animales se alimentaron a d 1 ibi t um . En los días 1, 3 y 14 después de la última inyección SC, de la solución salina o BLT, los animales se sangraron para determinar los valores de glucosa en la sangre.

RES UL TADOS : Administración de BLT inferiores a la glucosa e insulina en la sangre in vivo Los resultados de estos experimentos se resumen en las Figuras 1-8. A través de todo el transcurso del día 7 de tratamiento, los animales en el grupo de control y el grupo de prueba consumieron aproximadamente 4.5 a 6 gramos de alimento (Figura 1) . El peso corporal en ambos grupos permaneció el mismo, a aproximadamente 50 gramos ( Figura 2 ) .

El tratamiento de BLT disminuyó los triglicéridos en plasma en los ratones tratados después de 6 días de tratamiento (ver Figura 3) . Los animales de control exhibieron un valor medio de 3.05 nmol/L (s.d. 0.58), mientras que los animales tratados se midieron a un valor medio de 2.05 mmol/L (s.d. 0.43) . Esto representa una declinación en los triglicéridos en suero de aproximadamente 30% a 35%.

La BLT también indujo una declinación sustancial en los niveles de glucosa en la sangre en los animales tratados (Figura 4) . Después de 7 días de administración de BLT, el grupo tratado manifestó niveles de glucosa en la sangre de 135 mg/dL (s.d. 16); en marcado contraste con el grupo de control medido a 171 mg/dL (s.d. 16) .

La disminución de los niveles de glucosa en la sangre en animales tratados continuó durante al menos 3 días después de la última administración de BLT en el día 7 (Figura 5) . Los animales de control exhibieron niveles de glucosa de 331 mg/dL (s.d. 79) . Por otro lado, los animales tratados mantuvieron niveles de glucosa sustancialmente bajos, a 205 mg/dL (s.d. 76) . El efecto de la BLT en la disminución de los niveles de glucosa en la sangre no se observó a los 14 días después de la última administración de BLT (Figura 6) .

Para dirigir los efectos del tratamiento de BLT en los niveles de insulina, se realizó una prueba oral de tolerancia a glucosa después del período de tratamiento de 7 días y un ayuno durante toda la noche (Figura 7 y Figura 8) . Los animales de control y tratados mostraron un aumento inicial en los niveles de glucosa en la sangre de aproximadamente 80 mg/dL a 200 mg/dL o mayor, al punto de tiempo de 30 minutos después de iniciar la prueba; posteriormente ambos grupos mostraron una tasa comparable de disminución en valores, fuera del punto de tiempo de 2 horas (Figura 7) . Sorprendentemente, los animales tratados exhibieron valores de insulina en plasma sustancialmente inferiores de los animales de control (Figura 8) . Por ejemplo, en el punto de tiempo de 30 minutos, los animales de control tuvieron niveles de insulina a 11.5 ng/ml (s.d. 1.9), mientras que los animales tuvieron niveles de insulina de 6.0 ng/ml (s.d. 3.0) .

EJEMPLO 7 Administración de BLT al ratón durante 14 días a los ratones macho Avy A.

Se alojaron ratones macho Avy A, 6 por caja, y se alimentaron a d l ibi t um con alimento 5008 y agua. Los niveles de glucosa en sangre se midieron a intervalos regulares; cuando los niveles de glucosa en la mañana alcanzaron al menos 300 mg/dL los animales se sometieron al protocolo experimental. Cinco animales, seleccionados aleatoriamente, se alojaron juntos como un control; 5 animales, seleccionados aleatoriamente, se alojaron juntos y se trataron con BLT de ratón, que habían sido sintetizados por técnicas de fase sólida Los ratones que se sometieron al tratamiento con BLT recibieron 60 µg dados SC (volumen total de 200 µl por cada dosificación); los animales de control recibieron 200 µl de vehículo (solución salina) . Los animales se inyectaron dos veces diariamente, en la mañana y en la tarde, durante 13 días; en el día 14 recibieron sólo la inyección en la mañana.

Los niveles de glucosa en la sangre, peso corporal y el consumo de alimento se midieron en la mañana en el día 0. El peso corporal y el consumo de alimento se midieron en la mañana del día 1 al día 13. Los ratones se sometieron a ayuno durante toda la noche de la tarde del día 13 a la mañana del día 14. En el día 14, se realizó una prueba de tolerancia a la glucosa oral. Los niveles de glucosa al tiempo cero se midieron 2 horas después de la inyección de la mañana de la solución salina o BLT. Para esta prueba, a los animales se administraron en forma oral solución de dextrosa al 25% (100 µl/10 g de peso corporal) , después sangraron a 30, 60 y 120 minutos después. Las muestras de sangre se usaron para determinar los niveles de glucosa e insulina. Después de la prueba oral de tolerancia a la glucosa, los animales se alimentaron a d l ib i t um . En los días 1, 3 y 14 después de la última inyección SC, de la solución salina o BLT, los animales se sangraron para determinar los valores de glucosa en la sangre.

RES UL TADOS : Administración de BLT durante 14 días inferiores a la glucosa e insulina en la sangre Los resultados de estos experimentos se resumen en las Figuras 9-10. A través de todo el día 14 de tratamiento, los animales en el grupo de control y el grupo de prueba consumieron aproximadamente 4.5 a 6 gramos de alimento y los pesos corporales en ambos grupos permanecieron los mismos, a aproximadamente 50 gramos (resultados no mostrados) .

Para referirse a los efectos de un tratamiento de dos semanas con BLT en los niveles de insulina, se realizó una prueba oral de tolerancia a la glucosa después del período de 14 días (Figura 9 y Figura 10) . Los animales de control y tratados mostraron un aumento inicial en los niveles de glucosa en la sangre de aproximadamente 80 mg/dL a 300 mg/dL, o mayor, en el punto de 30 minutos; posteriormente ambos grupos mostraron una tasa comparable de disminución en valores, fuera del punto final de la prueba a las 2 horas (Figura 9) . Por ejemplo, los animales tratados exhibieron un nivel de glucosa en la sangre promedio a los 30 minutos. El punto de tiempo de 289 mg/dL (s.d. 24) , mientras que los controles tuvieron niveles de 348 mg/dL (s.d. 18) . Los niveles inferiores se observaron a los 60 min. y 120 min. también los puntos de tiempo. Por ejemplo, a los 120 min, los animales tratados tuvieron niveles de glucosa en la sangre promedios de 114 mg/dL (s.d. 4), mientras que los controles tuvieron niveles de 188 mg/dL (s.d. 23) .

Los animales tratados también, exhibieron valores de insulina en plasma sustancialmente inferiores de los animales de control (Figura 10) . Por ejemplo, en el punto de 30 minutos, los animales de control tuvieron niveles de insulina a 7.4 ng/ml (s.d. 2.1), mientras que los animales tratados tuvieron niveles de insulina de 4.8 ng /ml (s.d. 0.6) .

EJEMPLO 8 BLT Estimula la Toma de Glucosa en Adipocitos 3T3 Las células 3T3 de ratón se colocaron en placas en aproximadamente 100 µl de medio de crecimiento por pozo en placas de 96 pozos, de modo que aproximadamente 25,000 células se distribuyeron por pozo.

Medio de crecimiento DMEM, glucosa alta, p/fuera de L-glutamina 10% de suero de becerro L-glutamina 2mM 1% de PenStrep 1.25 µg/ml de Fungizona Las células se indujeron para diferenciación en adipocitos de 3 días después de colocar en placas reemplazando el medio de crecimiento con el medio de diferenciación .

Medio de diferenciación DMEM, glucosa alta, p/fuera de L-glutamina 10% de FBS L-glutamina 2mM 1% de Pen Strep 1.25 µg/ml de Fungizona Hepes 10 mM Dexametasona 0.25 µM (1 µl/ml de reserva 0.25 M) IBMX 0.5 mM (10 µl/ml de reserva 50 mM) 5 µg/ml de insulina (1 µg/ml 5 mg/ml de reserva) El medio se retiró de las células por aspiración usando un tubo múltiple de canal 8 unido a una fuente de vacío de cámara con un regulador de flujo. El medio fresco se repartió en los pozos usando una pipeta electrónica de matriz de canal 8, establecida a la velocidad más baja, para minimizar la ruptura de las células .

En el día 1, se adicionó 100 µl de medio de diferenciación a cada pozo para iniciar la diferenciación de las células 3T3 en los adipocitos. En el día 3 después de comenzar la diferenciación, el medio se cambió al medio de diferenciación que contenía insulina, pero sin IBMX o dexametasona (medio de insulina) . En el día 6, el medio se cambió nuevamente al medio de diferenciación que no contenía insulina, IBMX o dexametasona (medio FBS) . Las células se mantuvieron en el medio FBS, con la alimentación de uno y otro día, hasta que estuvieron listas para una prueba de transporte de glucosa desde los días 15 hasta 21 después del comienzo de la diferenciación.

EJEMPLO 9 Prueba de Transporte de Glucosa en Células 3T3 Inducidas para la Diferenciación en Adipocitos en Presencia de BLT Las células 3T3-L1 de ratón se indujeron para la di f erfinciación en adipocitos como en el Ejemplo 8. A las -24 horas antes de llevar a cabo una prueba de transporte de glucosa, las células se trataron como s igue : 1. Los pozos se lavaron dos veces con 100 ml de solución salina amortiguada con fosfato (PBS) a 37°C, aspirando entre lavados. 2. Luego, se adicionó a cada pozo 100 ml de DMEM, glucosa alta, 1% de solución an t ibiót ica/ant imicót ica , glutamina 2mM, 0.1% de BSA (calentada hasta 37°C), BLT de ratón 0 a 1000 nM (sintetizada por la técnica de fase sólida) , e insulina 0 a 100 nM . Esta es la fase de inanición del suero. 3. Después, las células se incubaron durante toda la noche a 37 ° C .

El día de la prueba, las células se trataron como s igue 1. Se retiró el medio, las placas se mancharon en toallas de papel y las célula se lavaron dos veces con 100 ml de amortiguador de KRBH (amortiguador de Krebs- Ringer que contiene Hepes, pH 7.4) . 2. Después de remover el lavado final, las células se incubaron a 37°C durante 1 hora en 100 µl de KRBH, 0.1% de BSA con glucosa 100 µM, 10 µl/ml de 2-Desoxiglucosa (C14) (0.1 µCi/pozo) radiomarcada y las concentraciones deseadas de insulina. 3. Después de la incubación con glucosa radiomarcada, se adicionó 10 µl de citolasina B lOx (200 µM) para detener la toma adicional de glucosa por las células . 4. La toma de glucosa radiomarcada se determinó por las placas de lectura en la placa lectora Microbeta.

Resultados : Los resultados de este experimento se resumen en la Figura 11. La toma de glucosa en las células 3T3 inducidas para la diferenciación en adipocitos, se estimuló de aproximadamente 3 pliegues a aproximadamente 6 pliegues cuando los adipocitos se pre-trataron antes de la prueba de toma con BLT.

EJEMPLO 10 Prueba de Transporte de Glucosa en Células 3T3 Inducidas para la Diferenciación en Adipocitos en Presencia de Fragmentos Funcionales de BLT Las células 3T3-L1 de ratón se indujeron para la diferenciación en adipocitos como en el Ejemplo 8. Aproximadamente 15-24 horas antes de llevar a cabo una prueba de transporte de glucosa, las células se trataron como s i gue : 1. Los pozos se lavaron dos veces con 100 ml de solución salina amortiguada con fosfato (PBS) a 37°C, aspirando entre los lavados. 2. Luego, se adicionó a cada pozo 100 ml de DMEM, glucosa alta, 1% de solución ant ibió t ica/an t imi có t ica , glutamina 2mM, 0.1% de BSA (calentada hasta 37°C), BLT de ratón o humano 0 a 1000 nM (sintetizada por la técnica de fase sólida) , e insulina 0 a 100 nM . Esta es la fase de inanición del suero. Por ejemplo, se usa en un fragmento de BLT de humano de prueba designado aquí como SEC ID NO: 10; en otra prueba, se usa el fragmento BLT de humano designado aquí como SEC ID NO: 12. 3. Después, las células se incubaron durante toda la noche a 37 ° C .

El día de la prueba, las células se trataron como s igue : 1. Se retiró el medio, las placas se mancharon en toallas de papel y las célula se lavaron dos veces con 100 ml de amortiguador de KRBH (amortiguador de Krebs-Ringer que contiene Hepes, pH 7.4) . 2. Después de remover el lavado final, las células se incubaron a 37°C durante 1 hora en 100 µl de KRBH, 0.1% de BSA con glucosa 100 µM, 10 µl/ml de 2-Des oxiglucosa (C14) (0.1 µCi/pozo) radiomarcada y las concentraciones deseadas de insulina. 3. Después de la incubación con glucosa radiomarcada, se adicionó 10 µl de citolasina B lOx (200 µM) para detener la toma adicional de glucosa por las células . 4. La toma de glucosa radiomarcada se determina por las placas de lectura en la placa lectora Microbeta.

Resultados La toma de glucosa en las células 3T3 inducidas para la diferenciación en adipocitos, se mejora sobre los controles cuando los adipocitos se pre-tratan antes de la prueba de toma con los fragmentos funcionales de BLT.

EJEMPLO 11 Análogos Funcionales de BLT Las células 3T3-L1 de ratón se inducen para diferenciación en adipocitos como en el Ejemplo 10. Los adipocitos después se exponen a los análogos de BLT de humano, por ejemplo, SEC ID NO: 26 a la SEC ID NO: 35 y el transporte de glucosa se monitorea como en el Ejemplo 8. Los análogos funcionales exhiben sustancialmente los mismos resultados como la BLT nativa.

Ej emplo 12 Administración de BLT de humano durante 14 Días a Ratones Avy A Machos La BLT de humano sintetizada en fase sólida se administró a ratones Avy/A machos en la dosificación de acuerdo al régimen descrito en el Ejemplo 7.

Resultados La administración de BLT de humano disminuyó sustancialmente los niveles de suero en los ratones Avy A machos (Ver las Figuras 12 y 13) .

Los resultados se resumen en las Figuras 12-13. A través de todo el día 14 de tratamiento, los animales en el grupo de control y el grupo de prueba consumieron aproximadamente 4.5 a 6 gramos de alimento y los pesos corporales en ambos grupos permanecieron los mismos, en aproximadamente 50 gramos (resultados no mostrados) .

Para relacionar los efectos de un tratamiento de dos semanas con BLT de humano en la glucosa de plasma y los niveles de insulina, se realizó una prueba oral de tolerancia de glucosa después del período de 14 días. Los animales de control y los animales tratados mostraron un aumento en los niveles de glucosa en la sangre de aproximadamente 80 mg/dL a 300 mg/dL, o mayor, en el punto de tiempo de 30 minutos; posteriormente ambos grupos mostraron una tasa comparable de disminución en los valores, fuera del punto final de la prueba a las 2 horas (Figura 12) . Por ejemplo, los animales tratados mostraron un nivel de glucosa en la sangre promedio a los 30 min, punto de tiempo de aproximadamente 400 mg/dL (s.d. 12) , mientras que los controles tuvieron niveles de 330 mg/dL (s.d. 19) . Los niveles inferiores se observaron a los 60 min y 120 min, también puntos de tiempo. Por ejemplo, a los 120 min, los animales tratados tuvieron niveles de glucosa en la sangre promedio de 178 mg/dL (s.d. 16), mientras que los controles tuvieron niveles de 202 mg/dL (s.d. 13) .

Los animales tratados exhibieron valores de insulina en plasma inferiores a los animales de control (Figura 13) . Por ejemplo, en el punto de tiempo de 30 minutos, los animales de control tuvieron niveles de insulina en 14.0 ng/ml (s.d. 1.5), mientras que los animales tratados tuvieron niveles de insulina de 10.2 ng/ml (s.d. 0.4) . En el punto de tiempo de 120 minutos, los animales de control tuvieron niveles de insulina en 9.3 ng/ml (s.d. 2.3) y los animales tratados tuvieron niveles de insulina de 5.4 ng/ml (s.d. 0.9) .

EJEMPLO 13 Administración de Beta Lipotropina de Ratón a Ratones Lepob/L epob Ma ch o s Los ratones Lepob/L epob machos . adquiridos en Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) se alojaron y alimentaron a d l ibi t um con alimento 5008 y agua. Los ratones se sangraron de la cola para los valores glucosa, insulina y triglicéridos iniciales. Los ratones se seleccionaron para el tratamiento de control, beta lipotropina de ratón dados 60 µg o 120 µg. Los ratones tratados recibieron ya sea 60 µg dado SC o 120 µg dado SC (volumen total de cada dosificación de 200 µl); los ratones de control recibieron vehículo de 200 µl (solución salina) . Los ratonéis se inyectaron a las 7:00 am y 3:00 pm diariamente durante 16 días, y se inyectaron a las 7:00 am sólo en el día 17. El peso corporal y el consumo de alimento se midieron en la mañana de los días 0 a 17. Los ratones se sangraron en la cola la mañana del día 7 para determinar los valores de glucosa, insulina y triglicérido. Los animales se ayunaron durante toda la noche de la tarde del día 13 a la mañana del día 14. En el día 14, se realizó una prueba de tolerancia a la glucosa oral. La glucosa en sangre y la insulina al tiempo cero se midieron 2 horas después de la inyección en la mañana. Los ratones se administraron oralmente con solución de dextrosa al 25% (100 µl/10 g de peso corporal) , después se sangraron 30, 60 y 120 minutos después. Las muestras de sangre se usaron para determinar la glucosa y la insulina. Después se la prueba oral de tolerancia a la glucosa, los ratones se alimentaron a d l ibi t um . En el día 16, las muestras de sangre de la cola se tomaron para determinar los valores de glucosa, insulina, triglicéridos y cort icos terona en la sangre. En el día 17, los ratones se sacrificaron.

Los resultados de este experimento se muestran en la Figura 14. Los valores de insulina en plasma se disminuyeron significativamente en los animales tratados a través del período de tratamiento de 16 días. Por ejemplo, en el día 7 del tratamiento, los animales de control exhibieron valores de insulina de aproximadamente 300 ng/ml, mientras que los animales tratados se midieron a aproximadamente 215 ng/ml, al menos un 30% de disminución. Además, los valores de insulina en el plasma permanecieron inferiores en los animales tratados en el día 16 de tratamiento (Figura 14) .

EJEMPLO 14 Administración de la bomba Alzet™ de BLT de Humano a Ratones L eOob/LeDob Machos Los ratones Lep°b / Lepob adquiridos de Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) a un mes de edad, se alojaron solos y se alimentaron a d 1 ibi t um con alimento 5008 y agua, con iluminación en un ciclo de 12 horas (de las 6:00 pm a las 6:00 am) . Los ratones se sangraron de la cola para los valores de glucosa, insulina y triglicéridos iniciales. Los animales tratados recibieron 0.24 mg/día o 0.48 mg/día de administración continua de beta lipotropina de humano (ER4-VBH-43) por vía de bombas Alzet™ implantadas subcutáneamente (Alza, Inc. ) , de modo que los valores promedios de glucosa y triglicérido fueron iguales a través de los 3 grupos. A los animales de control se les dio solución salina. Las bombas se llenaron con solución salina para el grupo de control, y 20 mg/ml de beta lipotropina de humano para el grupo de dosificación inferior y 40 mg/ml de beta lipotropina de humano para el grupo de dosificación superior. Los ratones se anestesiaron con isoflurano antes de la implantación de la bomba. El peso corporal y el consumo de alimento se midieron a la mañana de los días 0 a 7. Los ratones se sangraron de la cola del día 4 para determinar los valores iniciales de glucosa, insulina y triglicéridos en la sangre. Los ratones se ayunaron durante toda la noche de la tarde del día 6 a la mañana del día 7.

En el dia 7 se realizó una prueba oral de tolerancia a la glucosa. Los ratones se sangraron de la cola para determinar la insulina y glucosa al tiempo 0, después se administró solución oral de dextrosa al 25% (100 µl/10 g de peso corporal), después se sangraron a 30, 60 y 120 minutos después. Las muestras de sangre se usaron para determinar la glucosa e insulina. Después de la prueba oral de tolerancia a la glucosa, los ratones se alimentaron a d 1 ibi t um .

Los resultados de la prueba de tolerancia la glucosa con respecto a los niveles de insulina en plasma, se muestran en la Figura 15. El valor a 0.24 mg de BLT/día fue de aproximadamente 25% inferior que el control, mientras que el valor a 0.48 mg de BLT/día fue de aproximadamente 40% inferior que el control (ver el recuadro de la Figura 15 para el área bajo las curvas) .

EJEMPLO 15 Síntesis de Fase Sólida y Purificación de un Análogo de Proteína BLT de Humano Un análogo del péptido de BLT de humano (i.e. el análogo representado por la SEC ID NO: 26), en la que Ala se sustituye por Glu en la SEC ID NO: 8, se sintetizó en una corrida simple usando la química de Fmoc. La síntesis se complica por la presencia de varias secuencias dipeptídicas asp-gly en la porción N terminal del péptido. Las cadenas laterales de aspartilo en las secuencias dipeptídicas asp-gly han sido observadas para someterse a la ciclización catalizada por base y la adición subsecuente con piperidina durante la síntesis FMOC. Esta reacción se elimina mediante el uso de Fmoc-(FmocHmb) -glicina en cada secuencia de asp-gly en la síntesis. La protección de la glicil amida con el grupo Hmn inhibe la ciclización de la cadena lateral de aspartilo. Después del corte, la desprotección y la purificación por HPLC de fase inversa, el péptido puede analizarse por espectroscopia de masa de elect roa t omi zado . La especie principal observada en la síntesis es el péptido de longitud completa que tiene la. masa esperada. El uso de este método permite la producción de cantidades de la proteína purificada en exceso de 100 mg de una corrida simple a la escala de 0.1 mmol .

Materiales: Resina Fmoc-Glu (OtBu) pre-cargada Wang (1% de poliestireno de enlace cruzado funcionalizado con alcohol p-ben zoxibencí lico ) a aproximadamente 0.6 mmol de aminoácido/g de resina. N-me t i lpirrolidina (NMP), piperidina, hexafluorofosfato de 2-(lH-benzotriazol-l-il) -l, l, 3, 3-tetrametiluronio (HBTU) , N , N -dii sopropilet ilamina 2M (DIEA), 1 -hidroxibenz o triazol (HOBt), diclorometano (DCM), dimetilformamida (DMF) .

La resina, pre-cargada con el aminoácido C terminal protegido con Fmoc (0.1 o 0.25 mmol de aminoácido), se pesó y se colocó en una cámara de reacción. La resina se pre-hinchó lavando con DCM. La resina después se lavó con NMP. El grupo Fmoc N terminal se removió por incubación de la resina en una solución al 18-22% de piperidina en NMP. Después de la desprotección, la resina se lavó extensivamente con NMP.

Un mmol del siguiente aminoácido protegido con Fmoc que se adicionó al péptido, se solubilizó en 2.1 g de NMP, 2.0 g de HBTU 0.45M/react i vo HOBt en DMF. Después de la solubilización, la activación del aminoácido se inició mediante la adición de 3 ml de DIEA 2M en NMP. El aminoácido activado después se adicionó a la resina desprotegida y se dejó acoplarse. Una vez que se completó el acoplamiento, la resina se lavó extensivamente con NMP. El ciclo completo de la desprotección y el acoplamiento, después se repitieron para cada aminoácido suces ivo .

Las etapas del ciclo específico en la síntesis fueron como sigue: Ciclo AA Etapa s 1 Ala Lavado completo 2 Gly Acoplamiento simple 3 Lys ( Boc ) Acoplamiento simple 4 Lys ( Boc ) Acoplamiento simple 5 Tyr (tBu) Acoplamiento simple Ala Acoplamiento simple Asn (Trt ) Acoplamiento simple Lys ( Boc ) Acoplamiento simple He Acoplamiento simple 10 lie Acoplamiento simple 11 Ala Acoplamiento simple 12 Asn (Trt ) Acoplamiento simple 13 Lys ( Boc ) Acoplamiento simple 14 Phe Acoplamiento simple 15 Leu Acoplamiento simple 16 Thr (tBu) Acoplamiento simple 17 Val Acoplamiento simple 18 Leu Acoplamiento simple 19 Pro Acoplamiento doble/cebado Ac20 20 Thr (tBu) Acoplamiento simple 21 Gln(Trt) Acoplamiento simple 22 Ser(tBu) Acoplamiento simple 23 Lys (Boc) Acoplamiento simple 24 Glu(OtBu) Acoplamiento simple 25 Ser(tBu) Acoplamiento simple 26 Thr(tBu) Acoplamiento simple 27 Met Acoplamiento simple 28 Phe Acoplamiento simple 29 Gly Acoplamiento simple 30 Gly Acoplamiento simple 31 Tyr(tBu) Acoplamiento simple 32 Arg (Pmc) Acoplamiento simple 33 Lys (Boc) Acoplamiento simple 34 Asp(OtBu) Acoplamiento simple 35 Lys(Boc) Acoplamiento simple 36 Pro Acoplamiento doble/cebado Ac20 37 Pro Acoplamiento doble/cebado Ac20 38 Ser(tBu) Acoplamiento simple 39 Gly Acoplamiento simple 40 Trp (Boc) Acoplamiento simple 41 Arg(Pmc) Acoplamiento simple 42 Phe Acoplamiento simple 43 His (Trt) Acoplamiento simple 44 Glu (OtBu) Acoplamiento simple 45 Met Acoplamiento simple 46 Arg ( Pmc) Acoplamiento simple 47 Tyr(tBu) Acoplamiento simple 48 Pro Acoplamiento doble/cebado Ac20 49 Gly Acoplamiento simple 50 Glu (OtBu) Acoplamiento simple 51 Asp (OtBu) Acoplamiento simple 52 Lys (Boc) Acoplamiento simple 53 Lys (Boc) Acoplamiento simple 54 Glu(OtBu) Acoplamiento simple 55 Ala Acoplamiento simple 56 Ala Acoplamiento simple 57 Val Acoplamiento simple 58 Leu Acoplamiento simple 59 Leu Acoplamiento simple 60 7 Ser (tBu) Acoplamiento simple 61 His (Trt) Acoplamiento simple 62 Glu(OtBu) Acoplamiento simple 63 Leu Acoplamiento simple 64 Asp(OtBu) Acoplamiento simple 65 Ala Acoplamiento simple 66 Gln(Trt) Acoplamiento simple 67 Ala Acoplamiento simple 68 Gly Acoplamiento simple 69 Ala Acoplamiento simple 70 Gly ( Fmoc-hmb Acoplamiento doble/cebado Ac20 71 Asp (OtBu) Acoplamiento simple 72 Asp (OtBu ) Acoplamiento simple 73 Ala Acoplamiento simple 74 Pro Acoplamiento doble/cebado Ac20 75 Gly ( Fmoc-hmb ) Acoplamiento doble/cebado Ac20 76 Asp (OtBu) Acoplamiento simple 77 Pro Acoplamiento doble/cebado Ac20 78 Gly ( Fmoc-hmb ) Acoplamiento doble/cebado Ac20 79 Asp (OtBu) Acoplamiento simple 80 Gly Acoplamiento simple 81 Glu (OtBu) Acoplamiento simple 82 Arg ( Pmc) Acoplamiento simple 83 Leu Acoplamiento simple 84 Arg ( Pmc ) Acoplamiento simple 85 Gln (Trt) Acoplamiento simple 86 Gly Acoplamiento simple 87 Thr (tBu) Acoplamiento simple Leu Acoplamiento simple 89 Glu(OtBu) Acoplamiento simple 90 Desprotección final Para los aminoácidos que reaccionan lentamente o ineficientemente, se llevaron a cabo 2 reacciones de acoplamiento separadas. Cualquier péptido residual sin reaccionar se bloqueó por el tratamiento con anhídrido acético. La secuencia de las etapas para una de estos aminoácidos fue desprotección, reacción de acoplamiento 1, lavado, reacción de acoplamiento 2, lavado, cebado ac20, lavado, desprotección.

Abreviaciones: OtBu: t-butil éster, tBu: t-butilo, Boc: t-butoxicarbonilo, Pmc: 2 , 2 , 5 , 7 , 8 -pent ame t i 1 croma-6-sulfonilo, Hmb: 2 -hidroxi - 4 -me t oxibenci lo , Fmoc: 9-f luoreni lme t oxi carboni 1 o .

EJEMPLO 16 Administración de la Bomba Alzet de BLT de Humano a Ratas ZDF Macho Las ratas de tejido graso diabéticas Zucker (ZDF) macho, adquiridas de Genetic Models Inc. ( Indianapol i s , IN) , se alojaron solas y se alimentaron a d 1 ibi t um con alimento 5008 y agua. A las cinco semanas de edad, las ratas se ayunaron durante toda la noche para una prueba oral de tolerancia a glucosa inicial. La sangre se extrajo de la cola para la determinación de los niveles de insulina y glucosa al punto de tiempo 0, y después a los animales se administraron solución de dextrosa oral al 50% (2.5 g/kg de peso corporal), y la sangre se extrajo a 30, 60 y 120 minutos de la pos t -admini s t raci ón . Después de la prueba oral de tolerancia a la glucosa, las ratas se alimentaron a d l ibi t um . A las semanas de edad, los animales se dividieron en grupos de 4 animales cada uno para la administración de BLT de humano. En el día cero de la prueba, la sangre de la cola se extrajo nuevamente para la medición de los valores de glucosa, insulina, cort icos t erona y triglicéridos. Las ratas se seleccionaron aleatoriamente para cada control, 0.5 mg/día o 1.0 mg/día de administración continua de beta lipotropina de humano (ER4-VTA-2) por vía de las bombas Alzet implantadas subcutáneamente. Las bombas se llenaron con solución salina para los controles, 20.835 mg/ml de beta lipotropina de humano para el grupo de dosificación baja y 41.67 mg/ml de beta lipotropina de humano para el grupo de dosificación alto. Las bombas se incubaron durante toda la noche a 37°C en solución salina antes de la implantación subcutánea. El peso corporal y el consumo de alimento se midieron en los días 0 a 8. Las muestras de sangre se tomaron en la mañana del día 3 para medir los valores de glucosa, insulina, cort i cos terona y triglicéridos. Las ratas se ayunaron durante toda la noche desde la tarde del día 5 a la mañana del día 6. En el día 6, se realizó una prueba oral de tolerancia a la glucosa. Después de la prueba oral de tolerancia a la glucosa, las ratas se alimentaron a d 1 i bi t um .

Los animales Zucker usados en este estudio proporcionan un buen modelo para las diabetes de tipo 2. A las 6 o 7 semanas de edad, los valores de glucosa en sangre y los niveles de triglicéridos aumentaron, mientras que la secreción de insulina disminuyó. Estos animales son hipercort icos teronémi cos e insulino res istentes .

Tabla 3. Ratas ZDF Tratadas con BLT de Humano Los resultados presentados en la Tabla 3 y la Figura 16 demuestran un efecto pronunciado de la BLT de humano en la rata ZDF a una dosificación de 1 mg por día de BLT de humano. A 30 minutos después dé la iniciación de los niveles de glucosa en plasma OGTT fueron 191 ± 16 mg/dL promedio en los controles y 172 ± 5 mg/dL en los animales tratados con BLT (Ver Figura 16) . A los 60 minutos, los animales de control de pos t -iniciación mostraron niveles de glucosa de 157 ± 6 mg/dL, mientras que los animales tratados con BLT fueron a 154 ± 8 mg/dL en los animales tratados con BLT.

La Tabla 3 ilustra que los valores de glucosa en la sangre permanecieron inferiores en los animales tratados con BLT que en los animales de control, especialmente en la dosificación superior. Los animales de control mostraron valores de glucosa de aproximadamente 150 mg/dL a 0, 2 y 7 días después del comienzo de la administración de BLT. Por otra parte, los animales tratados con 1 mg/día de BLT de humano promediaron aproximadamente 140 mg/dL en el día 7, aproximadamente 7% inferior que los animales de control. Los animales tratados también mostraron aproximadamente 11% menos de los niveles de triglicé idos en suero que los animales de control (Tabla 3) , que demuestra el efecto insulinot rópi co del tratamiento de BLT.

EJEMPLO 17 La BLT de Humano Estimula el Transporte de Glucosa en el Músculo Esquelético de Ratas ZDF Se llevó a cabo un estudio para determinar los efectos de la beta-lipotropina en el transporte de glucosa en el músculo esquelético. Las ratas de tejido graso diabéticas Zucker ( Z DF/Gmi™-f a/ fa ) macho, se obtuvieron de Genetic Models Inc. (Indianapolis, IN) .LAs ratas se mantuvieron en comida de rata Formulab 5008 de Purina (Puina Mills, Inc., St . Louis, MO) y se alojaron en un cuarto de luz controlada con ciclos de alternación de 12 horas de luz y obscuridad. Las ratas se alojaron solas y se les dio el libre acceso a comida y agua.

Para determinar el transporte de glucosa en el tejido muscular, los animales del Ejemplo 16 se anestesiaron por vía de una inyección int er-peri t oneal de pentabarbi t ol de sodio (6.5 mg/100 gm de peso corporal), y los músculos soleos se aislaron y dividieron a la mitad. Cada mitad de la muestra de tejido se lavó en solución salina durante 2 minutos, y después en KHB gasificado (95% de 02-5% de C02) con 1% de BSA, glucosa 8 mM y manitol 32 mM .

Las pruebas de transporte de glucosa se llevaron a cabo como sigue.

Pre -incuba ción Las muestras de tejido muscular se transfirieron a ampolletas de 20 ml que contenían 1.8 ml de KHB gasificado con 1% de BSA, glucosa 8 mM, manitol 32 mM con o sin beta lipotropina de ratón 500 nM . Las muestras se colocaron en una baño de agua agitado durante 20 horas a temperatura ambiente con dos cambios intermitentes de amortiguador.

Después de la pre-incubación , las muestras de tejido muscular se lavaron a 29°C durante 15 minutos bajo gasificación constante de 95% de 02-5% de C02. Las muestras se lavaron en ampolletas que contenían 1.8 ml de KHB con manitol 40 mM , insulina (2000 uU/ml) o sin insulina, y con o sin beta-lipotropina (500 mM) .

Las muestras de músculo después se transfirieron a nuevas ampolletas bajo gasificación constante de 95% de 02-5% de C02. El medio de incubación consistió de 3-0-met il-glucosa (OMG) 8 mM, 2 mCi/ml de 3H-3-OMG, manitol mM , 0.3 mCi/ml de manitol 14C, piruvato 2 mM , insulina (2000 µU/ml) y beta-lipotropina de ratón. Los controles carecieron de insulina y/o beta-lipotropina. Después de 10 minutos a 29°C, las muestras se sujetaron por congelado y se almacenaron congeladas hasta que el transporte de glucosa podía probarse.

Transporte de Glucosa: Los músculos se cortaron a aproximadamente 20-25 mg para la digestión en 0.5 ml de KOH 1M a 70°C durante 30 min. Después de la digestión, las muestras se colocaron en hielo, y se retiró una muestra de 100 µl para el análisis de glicógeno. A la muestra de 0.4 ml restante, se adicionó 0.4 ml de HCl ÍN y el tubo presentó vórtice. Después, 300 ml de la muestra tratada con HCl se adicionó a 6.4 ml del fluido de centelleo y se determinó la reactividad en la muestra en un contador de centelleo.

El transporte de glucosa se calculó sobre la base de la acumulación intracelular de 3H-3-OMG usando manitol 1 C como el marcador extracelular.

Niveles de Glicógeno A la muestra de 100 µl mencionada anteriormente, se adicionó por encima de 17 µl de ácido acético glacial junto con 500 µl de amortiguador de acetato de sodio 0.3 M (pH 4.8 + 5 mg/ml de amiloglucosidasa) . Los tubos después se incubaron durante toda la noche a 37°C. Al día siguiente, 50 µl de la muestra se colocó en una placa de 96 pozos y se adicionó 200 µl del reactivo de Trinder (Sigma 315-100; diluido a 20 µl con agua) . La placa se incubó durante 10 minutos a 37°C y se leyó la absorbancia a una longitud de onda de 505 nm .

Tabla 4. Transporte de Glucosa en el Tejido Muscular de Ratas ZDF Tratadas con BLT de Humano Tra tami ent o Transporte de 3-OMG (µmol/g/10 min) Control 0.08510.01 Insul ina 0.080+ BLT+Insulina 0.11310.018 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes.

LISTA DE SECUENCIAS <110> Butler, Jon P. Hale , John E . Heath Jr . , William F. Schoner, Brigitte E. Heiman, Mark L. Becker, Gerald W. Varshavsky, Alexander D <120> Beta lipotropina y usos de la misma <130> X-12139 <140> <141> <160> 35 <170> Patenteln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 273 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: BLT de humano Met-Arg <400> 1 atgcgtgagc tcaccggtca gcgtcttcgc gaaggtgaog gtccggacgg "tccggctgac 60 gacggtgctg gtgctcaggc agatctcgag cactccctgc tggttgctgc Agaaaaaaaa 120 gacgaaggtc Cgtaccgtat ggaacacttc cgttggggtt ccccgccgaa agasaacgt 180 tacggtggtt tcatgacctc cgaaaaatcc cagaccccgc tggttaccc gttcaaaaac 240 gctatcatca aaaatgcata caaaaaaggt gaa 273 <210> 2 <211> 91 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: BLT de humano Met-Arg <400> 2 Met Arg Glu Leu Thr Gly Gln Arg Leu Arg Glu Gly Asp Gly Pro Asp 1 5 10 15 Gly Pro Ala Asp Asp Gly Ala Gly Ala Gln Ala Asp Leu Glu His Ser 20 25 30 Leu Leu Val Ala Ala Glu Lys Lys Asp Glu Gly Pro Tyr Arg Met Glu 35 40 45 His Phe Arg Trp Gly Ser Pro Pro Lys Asp Lys Arg Tyr Gly Gly Phe 50 55 60 Met Thr Ser Glu Lys Ser Gln Thr Pro Leu Val Thr Leu Phe Lys Asn 65 70 75 80 Ala lie lie Lys Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Glu 85 90 <210> 3 <211> 23 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: pareja de la proteína de fusión <400> 3 Met lie lie Gly Leu Met Val Gly Gly Val Ser Gly Ser Gly Ser Gly 1 5 10 15 Ser Gly Asp Asp Asp Asp Pro 20 <210> 4 ' <211> 45 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial Enlazador de oligonucleótido <400> 4 tatgagatct atcgaaggtc gtgagctcac cggtcagcgt gttcg 45 <210> 5 <211> 114 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Proteína de fusión BLT <400> 5 Met lie lie Gly Leu Met Val Gly Gly Val Ser Gly Ser Gly Ser Gly ' 1 5 10 15 Ser Gly Asp Asp Asp Asp Pro Met Arg Glu Leu Thr Gly Gln Arg Leu 20 25 30 Arg Glu Gly Asp Gly Pro Asp Gly Pro Ala Asp Asp Gly Ala Gly Ala 35 40 45 Gln Ala Asp Leu Glu His Ser Leu Leu Val Ala Ala Glu Lys Lys Asp 50 55 60 Glu Gly Pro Tyr Arg Met Glu His Phe Arg Trp Gly Ser Pro Pro Lys 65 ' 70 75 80 Asp Lys Arg Tyr Gly Gly Phe Met Thr Ser Glu Lys Ser Gln Thr Pro 85 90 - 95 Leu Val Thr Leu Phe Lys Asn Ala lie lie Lys Asn Ala Tyr Lys Lys 100 105 110 Gly Glu <210> 6 <211> 331 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: pareja de fusión GST <400> 6 Met Ser Pro lie Leu Gly Tyr Trp Lys lie Lys Gly Leu Val Gln Pro 1 5 10 15 Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu 20 25 30 Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu 35 40 45 Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr lie Asp Gly Asp Val Lys 50 55 60 Leu Thr Gln Ser Met Ala He He Arg Tyr He Ala Asp Lys His Asn 65 " 70 ' 75 "*" 80 Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu He Ser Met Leu Glu 85 90 95 Gly Ala Val Leu Asp He Arg Tyr Gly Val Ser Arg He Ala Tyr Ser 100 105 110 Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu 115 120 125 Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr tyr Leu Asn 13.0 135 140 Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp 145 150 155 - 160 Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu 165 " 170 - 175 Val Cys Phe Lys Lys Arg He Glu Ala He Pro Gln He Asp Lys tyr 180 185 190 Leu Lys Ser Ser Lys Tyr He Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala 195 200 205 Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg 210 215 220 Gly Ser Pro Gly He His Arg Asp Leu Val Pro Arg Gly Ser He Glu 225 230 235 240 Gly Arg Glu Leu Thr Gly Gln Arg Leu Arg Glu Gly Asp Gly Pro Asp 245 250 255 Gly Pro Ala Asp Asp Gly Ala Gly Ala Gln Ala Asp Leu Glu His Ser 260 265 270 Leu Leu Val Ala Ala Glu Lys Lys Asp Glu Gly Pro Tyr Arg Met Glu 275 280 285 His Píie Arg Trp Gly Ser Pro Pro Lys Asp Lys Arg Tyr Gly Gly Phe 290 295 300 Met Thr Ser Glu Lys Ser Gln Thr Pro Leu Val Thr Leu Phe Lys Asn 305 310 315 320 Ala He He Lys Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Glu 325 330 <210> 7 <211> 422 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Proteína de fusión GST/BLT <400> 7 Met Ser Pro He Leu Gly Tyr Trp Lys He Lys Gl y Leu Va l Gln Pr o 1 5 10 15 Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu 20 25 30 Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu 35 40 45 Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr He Asp Gly Asp Val Lys 50 55 60 Leu Thr Gln Ser Met Ala He He Arg Tyr He Ala Asp Lys His Asn 65 70 75 80 Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu He Ser Met Leu Glu 85 90 - 95 Gly Ala Val Leu Asp He Arg Tyr Gly Val Ser Arg He Ala Tyr Ser 100 105 110 Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu 115 120 125 Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn 130 135 140 Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp 145 150 155 160 Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu 165 170 175 Val Cys Phe Lys Lys Arg He Glu Ala He Pro Gln He Asp Lys Tyr 180 185 190 Leu Lys Ser Ser Lys Tyr lie Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala 195 200 205 Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg 210 215 220 Gly Ser Pro Gly He His Arg Asp Leu Val Pro Arg Gly Ser He Glu 225 230 235 240 Gly Arg Glu Leu Thr Gly Gln Arg Leu Arg Glu Gly Asp Gly Pro Asp 245 250 255 Gly Pro Ala Asp Asp Gly Ala Gly Ala Gln Ala Asp Leu Glu His Ser 260 265 270 Leu Leu Val Ala Ala Glu Lys Lys Asp Glu Gly Pro Tyr Arg Met Glu 275 280 285 His Phe Arg Trp Gly Ser Pro Pro Lys Asp Lys Arg Tyr Gly Gly Phe 290 295 300 Met Thr Ser Glu Lys Ser Gln Thr Pro Leu Val Thr Leu Phe Lys Asn 305 310 315 320 Ala He He Lys Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Glu Met Arg Glu Leu Thr 325 330 335 Gly Gln Arg Leu Arg Glu Gly Asp Gly Pro Asp Gly Pro Ala Asp Asp 340 345 350 Gly Ala Gly Ala Gln Ala Asp Leu Glu His Ser Leu Leu Val Ala Ala 355 360 365 Glu Lys Lys Asp Glu Gly Pro Tyr Arg Met Glu His Phe Arg Trp Gly 370 375 380 Ser Pro Pro Lys Asp Lys Arg Tyr Gly Gly Phe Met Thr Ser Glu Lys 385 390 395 400 Ser Gln Thr Pro Leu Val TÍUY Leu Phe Lys Asn Ala He He Lys Asn 405 410 415 Ala Tyr Lys Lys Gly Glu 420 <210> <211> <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Glu Leu Thr Gly Gln Arg Leu Arg Glu Gly Asp Gly Pro Asp Gly Pro 1 5 10 15 Ala Asp Asp Gly Ala Gly Ala Gln Ala Asp Leu Glu His Ser Leu Leu 20 25 30 Val Ala Ala Glu Lys Lys Asp Glu Gly Pro Tyr Arg Met Glu His Phe 35 40 45 Arg Tjcp Gly Ser Pro Pro Lys Asp Lys Arg Tyr Gly Gly Phe Met Thr 50 55 60 Ser Glu Lys Ser Gln Thr Pro Leu Val Thr Leu Phe Lys Asn Ala He 65 70 75 80 He Lys Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Glu 85 <210> 9 <211> 49 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Glu Leu Thr Gly Gln Arg Leu Arg Glu Gly Asp gly Pro Asp Gly Pro 1 5 10 15 Ala Asp Asp Gly Ala Gly Ala Gln Ala Asp Leu Glu His Ser Leu Leu 20 25 30 Val Ala Ala Glu Lys Lys Asp Glu Gly Pro Tyr Arg Met Glu His Phe 40 45 Arg — <210> 10 <211> 40 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Trp Gly Ser Pro Pro Lys Asp Lys Arg Tyr Gly Gly Phe Met Thr Ser 1 5 10 15 Glu Lys ser Gln Thr Pro Leu Val Thr Leu Phe Lys Asn Ala He He 20 25 30 Lys Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Glu 35 40 <210> 11 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Lys Asp Glu Gly Pro Tyr Arg Met Glu His Phe Arg Trp Gly Ser Pro 1 5 10 15 Pro Lys Asp Lys Arg Tyr Gly Gly Phe Met Thr Ser Glu Lys 20 25 30 <210> 12 <211> 52 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Lys Asp Glu Gly Pro Tyr Arg Met Glu His Phe Arg Trp Gly Ser Pro 1 5 10 15 Pro Lys Asp Lys Arg Tyr Gly Gly Phe Met Thr Ser Glu Lys Ser Gln 20 25 30 Thr Pro Leu Val Thr Leu Phe Lys Asn Ala He He Lys Asn Ala Tyr 35 40 45 Lys Lys Gly Glu 50 <210> 13 <211> 72 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Glu Leu Thr Gly Gln Arg Gln Ala Asp Leu Glu His Ser Leu Leu Val 1 5 10 15 Ala Ala Glu Lys Lys Asp Glu Gly Pro Tyr Arg Met Glu His Phe Arg 20 25 30 Trp Gly Ser Pro Pro Lys Asp Lys Arg Tyr Gly Gly Phe Met Thr Ser 35 40 45 Glu Lys Ser Gln Thr Pro Leu Val Thr Leu Phe Lys Asn Ala He He 50 55 60 Lys Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Glu 65 70 <210> 14 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Glu Leu Thr Gly Gln Arg Leu Arg Glu Gly Asp Gly Pro Asp 1 5 10 <210> 15 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Arg Glu Gly Asp Gly Pro Asp Gly Pro Ala Asp Asp Gly Ala 1 5 10 <210> 16 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Gly Pro Ala Asp Asp Gly Ala Gly Ala Gln Ala Asp Leu Glu 1 5 __ _ 10 <210> 17 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Gly Ala Gln Ala Asp Leu Glu His Ser Leu Leu Val Ala Ala 1 5 10 <210> 18 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 His Ser Leu Leu Val Ala Ala Glu Lys Lys Asp Glu Gly Pro 1 _ _ 5 10 <210> 19 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Glu Lys Lys Asp Glu Gly Pro Tyr Arg Met Glu His Phe Arg 1 5 10 <210> 20 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Tyr Arg Met Glu His Phe Arg Trp Gly Ser Pro Pro Lys Asp 1 5 10 <210> 21 <211> 14 <212> PRT <2l3> Homo sapiens <400> 21 Trp Gly Ser Pro Pro Lys Asp Lys Arg Tyr Gly Gly Phe Met 1 5 10 <210> 22 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Lys Arg Tyr Gly Gly Phe Met Thr Ser Glu Lys Ser Gln Thr 1 5 10 <210> 23 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Thr Ser Glu Lys Ser Gln Thr Pro Leu Val Thr Leu Phe Lys 1 5 10 <210> 24 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Pro Leu Val Thr Leu Phe Lys Asn Ala He He Lys Asn Ala 1 - 5 10 <210> 25 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Asn Ala He He Lys Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Glu 1 5 10 <210> 26 <211> 89 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Análoga de humano <400> 26 Glu Leu Thr Gly Gln Arg Leu Arg Glu Gly Asp Gly Pro Asp Gly Pro 1 5 10 15 Ala Asp Asp Gly Ala Gly Ala Gln Ala Asp Leu Glu His Ser Leu Leu 20 25 30 Val Ala Ala Glu Lys Lys Asp Glu Gly Pro Tyr Arg Met Asp Lys Tyr 35 40 45 Arg Tyr Ala Thr Pro Pro Hi_s Glu His Arg Tyr Ala Ala Phe Met Thr 50 55 60 Ser Glu Lys Ser Gln Thr Pro Leu Val Thr Leu Phe Lys Asn Ala He 65 70 75 ' 80 He Lys Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Glu 85 <210> 27 <211> 89 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Análoga de humano <400> 27 Glu Leu Thr Gly Gln Arg Leu Arg Glu Gly Asp Gly Pro Asp Gly Pro 1 5 10 15 Ala Asp Asp Gly Ala Gly Ala Gln Ala Asp Leu Glu His Ser Leu Leu 20 25 30 Val Ala Ala Glu Lys Lys Asp Glu Gly Pro Tyr Arg Met Glu Lys Phe 35 40 45 Arg Tyr Gly Ser Pro Pro Arg Glu Lys His Trp Gly Ala Trp Met Thr 50 55 60 Ser Glu Lys Ser Gln Thr Pro Leu Val Thr Leu Phe Lys Asn Ala He 65 70 75 80 He Lys Asn Ala Tyr 'Lys Lys Gly GÍU 85 <210> 28 <211> 89 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Análoga de humano <400> 28 Glu Leu Thr Gly Gln Arg Leu arg Glu Gly Asp Gly Pro Asp Gly Pro 1 5 10' 15 Ala Asp Asp Gly Ala Gly Ala Gln Ala Asp Leu Glu His Ser Leu Leu 20 25 30 Val Ala Ala Glu Lys Lys Asp Glu Gly Pro Tyr Arg Met Asp His Phe 35 40 45 His Phe Ala Ser Pro Pro Arg Glu Lys His Tyr Gly Ala Tyr Met Thr 50 55 60 Ser Glu Lys Ser Gln Thr Pro Leu Val Thr Leu Phe Lys Asn Ala He 65 70 75 80 He Lys Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Glu 85 <210> 29 <211> 89 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Análoga de humano <400> 29 Glu Leu Thr Gly Gln Arg Leu Arg Glu Gly Asp Gly Pro Asp Gly Pro 1 5 10 15 Ala Asp Asp Gly Ala Gly Ala Gln Ala Asp Leu Glu His Ser Leu Leu 20 25 30 Val Ala Ala Glu Lys Lys Asp Glu Gly Pro Tyr Arg Met Asp His Phe 35 40 45 Arg Trp Ala Ser Pro Pro Lys Glu Arg His Phe Ala Ala Tyr Met Thr 50 55 60 Ser Glu Lys Ser Gln Thr Pro Leu Val Thr Leu Phe Lys Asn Ala He 65 70 75 80 He Lys Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Glu 85 <210> 30 <211> 89 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Análoga de humano <400> 30 Glu Leu Thr Gly Aln Arg Leu Arg Glu Gly Asp Gly Pro Asp Gly Pro 10 15 Ala Asp Asp Gly Ala Gly Ala Gln Ala Asp Leu Glu His Ser Leu Leu 20 25 30 Val Ala Ala Glu Lys Lys Asp Glu Gly Pro Tyr Arg Met Asp Lys Tyr 40 45 Arg Phe Gly Thr Pro Pro Arg Glu Lys Arg Phe Ala Gly Tyr Met Thr 50 55 60 Ser Glu Lys Ser Gln Thr Pro Leu Val Thr Leu Phe Lys Asn Ala He 65 70 75 80 He Lys Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Glu 85 <210> 31 <211> 89 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Análoga de humano <400> 31 Glu Leu Thr Gly Gln Arg Leu Arg Glu Gly Asp Gly Pro Asp Gly Pro 1 5 10 15 Ala Asp Asp Gly Ala Gly Ala Gln Ala Asp Leu Glu His Ser Leu Leu 20 25 30 Val Ala Ala Glu Lys Lys Asp Glu Gly Pro Tyr Arg Met Asp Arg Trp 35 40 45 Arg Trp Ala Ser Pro Pro Arg Glu Lys His Tyr Gly Ala Trp Met Thr 50 " 55 60 Ser Glu Lys Ser Gln Thr Pro Leu Val Thr Leu Phe Lys Asn Ala He 65 70 75 80 He Lys Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Glu 85 <210> 32 <211> 89 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Aná'loga de humano <400> 32 Glu Leu Thr Gly Gln Arg Leu Arg Glu Gly Asp Gly Pro Asp Gly Pro 1 5 10 15 Ala Asp Asp Gly Ala Gly Ala Gln Ala Asp Leu Glu His Ser Leu Leu 20 25 30 Val Ala Ala Glu Lys Lys Asp Glu Gly Pro Tyr Arg Met Glu Arg Trp 40 45 Lys Phe Ala Thr Pro Pro His Asp His Lys Trp Gly Gly Phe Met Thr 50 55 60 Ser Glu Lys Ser Gln Thr Pro Leu Val Thr Leu Phe Lys Asn Ala He 65 70 75 80 He Lys Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Glu 85 <210> 33 <211> 89 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Análoga de humano <400> 33 Glu Leu Thr Gly Gln Arg Leu Arg Glu Gly Asp Gly Pro Asp Gly Pro 1 5 10 15 Ala Asp Asp Gly Ala Gly Ala Gln Ala Asp Leu Glu His Ser Leu Leu 20 25 30 Val Ala Ala Glu Lys Lys Asp Glu Gly Pro Tyr Arg Met Asp Lys Trp 35 40 45 Arg Trp Ala Ser Pro Pro Lys Glu His Arg Trp Gly Gly Tyr Met Thr 50 55 60 Ser Glu Lys Ser Gln Thr Pro Leu Val Thr Leu Phe Lys Asn Ala He 65 70 75 80 He Lys Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Glu 85 <210> 34 <211> 89 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Análoga de humano <400> 34 Glu Leu Thr Gly Gln Arg Leu Arg Glu Gly Asp Gly Pro Asp Gly Pro 1 5 10 15 Ala Asp Asp Gly Ala Gly Ala Gln Ala Asp Leu Glu His Ser Leu Leu 20 25 30 Val Ala Ala Glu Lys Lys Asp Glu Gly Pro Tyr Arg Met Asp His Phe 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Pro Pro His Glu Arg His Phe Gly Ala Trp Met Thr 50 55 60 Ser Glu Lys Ser Gln Thr Pro Leu Val Thr Leu Phe Lys Asn Ala He 65 70 75 80 He Lys Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Glu 85 \ <210> 35 <211> 89 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Análoga de humano <400> 35 Glu Leu Thr Gly Gln Arg Leu Arg Glu Gly Asp Gly Pro Asp Gly Pro 1 5 10 15 Ala Asp Asp Gly Ala Gly Ala Gln Ala Asp Leu glu His Ser Leu Leu 20 25 30 Val Ala Ala Glu Lys Lys Asp Glu Gly Pro Tyr Arg Met Glu Lys Phe 35 40 45 Lys Trp Ala Thr Pro Pro His Glu Arg Arg Tyr Gly Ala Tyr Met Thr 50 55 . 60 Ser Glu Lys Ser Gln Thr Pro Leu Val Thr Leu Phe Lys Asn Ala He 65 70 75 80 He Lys Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Glu 85

Claims (39)

REIVINDICACIONES

1. Una proteína sustancialmente pura, caracterizada porque tiene una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de la SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 5 Y SEC ID NO : 7.

2. Un compuesto de ácido nucleico aislado, caracterizado porque codifica una proteína de la reivindicación 1.

3. Un vector, caracterizado porque comprende un compuesto de ácido nucleico aislado de la reivindicación 2.

4. Un vector como se reivindica en la reivindicación 3, caracterizado porque el compuesto de ácido nucleico aislado se enlaza operablemente a una secuencia promotora .

5. Una célula huésped, caracterizado porque contiene un vector de la reivindicación 4.

6. Un método para construir una célula huésped recombinante, caracterizado porque tiene el potencial para expresar la beta-lipotropina, el método comprende introducir en la célula huésped mediante cualquier medio apropiado un vector de la reivindicación 5.

7. Un método para expresar la beta-lipotropina en una célula huésped recombinante de la reivindicación 6, caracterizado porque el método comprende cultivar la célula huésped recombinante bajo las condiciones apropiadas para la expresión del gen.

8. Una formulación farmacéutica caracterizada porque comprende como un ingrediente activo la beta-lipotropina, análogo o fragmento funcional de la misma, asociado con uno o más vehículos, excipientes o diluyentes farmacéuticamente aceptables de la misma.

9. Una formulación farmacéutica como en la reivindicación 8, caracterizada porque la beta-lipotropina es la beta-lipotropina de humano.

10. La beta-lipotropina, análogo o fragmento funcional de la misma, caracterizado porque se usa en el tratamiento de diabetes o complicación de la misma.

11. Un método para tratar diabetes en un mamífero caracterizado porque comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de beta-lipotropina o análogo de la misma.

12. Un método para tratar diabetes en un mamífero, caracterizado porque comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un fragmento funcional de beta-lipotropina.

13. Un método como se revindica en la reivindicación 11, caracterizado porque la beta-lipotropina es beta-lipotropina de humano, que tiene una secuencia identificada aquí como la SEC ID NO: 8.

14. Un método como en la reivindicación 11, Un método caracterizado porque la beta-lipotropina es beta-lipotropina recombinante de humano.

15. Un método como en la rei indicación 11, Un método caracterizado porque la diabetes es diabetes de Tipo 1 o Tipo 2.

16. Un método como en la reivindicación 11, Un método caracterizado porque el mamífero es un humano.

17. Un método para tratar las complicaciones de diabetes en un paciente con la necesidad del mismo, caracterizado porque comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de beta-lipotropina, análogo o fragmento funciona de la misma.

18. Un método para disminuir los niveles de glucosa en la sangre en un mamífero, caracterizado porque comprende administrar una cantidad efectiva de beta-lipotropina, análogo o fragmento funcional de la misma.

19. Un método para tratar hipergli cernía en un mamífero en necesidad del mismo, caracterizado porque comprende administrar una cantidad efectiva de beta-lipotropina, análogo o fragmento funcional de la misma.

20. Un método para tratar hiper insul inemia en un mamífero, caracterizado porque comprende administrar una cantidad efectiva de beta-lipotropina, análogo o fragmento funcional de la misma.

21. Un método para tratar sensibilidad a la insulina en un mamífero, caracterizado porque comprende administrar una cantidad efectiva de beta-lipotropina, análogo o fragmento funcional de la misma.

22. Un método de síntesis de fase sólida, para sintetizar beta-lipotropina, análogo o fragmento de la misma, en una corrida simple, caracterizado porque comprende las etapas de: a) activar un aminoácido que tiene su grupo a-amino, y alternativamente, el grupo funcional de cadena lateral, protegido para formar un éster reactivo; b) unir el aminoácido activado a un soporte sólido inerte; c) activar un segundo aminoácido protegido a un éster, en donde el grupo a-amino del primer aminoácido se desprotege, produciendo una amina reactiva, y el segundo aminoácido activado se hace reaccionar con el primer aminoácido para formar un di-péptido en el soporte sólido; d) repetir las etapas (a) (c) e) retirar el péptido del soporte sólido y desproteger los grupos funcionales de cadena lateral; f) separar el péptido del soporte sólido; y g) purificar el péptido por cualquier medio apropiado; en donde, h) la secuencia BLT contiene un segmento tripeptídico ser-pro-pro, se lleva a cabo el acoplamiento múltiple de los residuos pro; i) después de completar la etapa de acoplamiento, se bloquea cualquier péptido sin reaccionar, desprotegido para evitar el alargamiento de la cadena de un péptido de eliminación; y en donde la secuencia BLT contiene una secuencia dipeptídica asp-gly, utilización de un grupo protector N-a en cada residuo de glicina que precede un residuo asp.

23. Un proceso para preparar beta-lipotropina como se reivindica en la reivindicación 1, caracterizado porque comprende: a. transformar un huésped apropiado con un vector de expresión en donde el vector codifica una beta-lipotropina; b. cultivar el huésped transformado bajo condiciones que permiten la expresión de la beta-lipotropina; c. purificar la beta-lipotropina mediante cualquier medio apropiado.

24. Una prueba para la actividad de beta-lipotropina, caracterizada porque las etapas de: a) administrar a un mamífero que exhibe insensibilidad a la insulina y niveles de glucosa en la sangre elevados una proteína de prueba; y b) probar por cualquier medio apropiado para niveles de glucosa e insulina en la sangre después de la etapa (a) .

25. Un método, como en la reivindicación 11, caracterizado porque la beta-lipotropina se selecciona del grupo que consiste de la SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7 y la SEC ID NO: 8.

26. Un péptido caracterizado porque tiene actividad insulinot rópi ca seleccionada del grupo que consiste de la SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12 y SEC ID NO: 13.

27. Un péptido caracterizado porque tiene actividad insulinot rópica seleccionada del grupo que consiste de la. SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 20, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 24, y SEC ID NO : 25.

28. Un péptido caracterizado porque tiene actividad insulinot rópica seleccionada del grupo que consiste de la SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: .18, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 20, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 24, y SEC ID NO: 25.

29. Un método para tratar la diabetes, caracterizado porque comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de al menos un péptido seleccionado del grupo que consiste de la SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 20, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 24, y SEC ID NO : 25.

30. Un método para tratar la diabetes, caracterizado porque comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de al menos un péptido seleccionado del grupo que consiste de la SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12 y SEC ID NO: 13.

31. Una formulación farmacéutica, caracterizada porque comprende como un ingrediente activo un péptido que tiene actividad insul inot rópica seleccionada del grupo que consiste de la SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 20, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 24, y SEC ID NO: 25.

32. Un análogo funcional, caracterizado porque es beta-lipotropina .

33. Un fragmento de beta-lipotropina, caracterizado porque tiene actividad insul inotrópica in vitro o in vivo .

34. Un análogo funcional de beta-lipotropina que es de aproximadamente 90% a 95% idéntico con la SEC ID NO: 8, caracterizado porque las sustituciones de aminoácidos se seleccionan del grupo que consiste de: el residuo en la posición 1 es alternativamente Glu, Ala, Asp o Gln; el residuo en la posición 2 es alternati amente Leu, lie, Val o Met; el residuo en la posición 3 es alternati amente Thr, Ala, Glu, Ser, Pro o Gly; el residuo en la posición 4 es .al ternat i vamente Gly, Arg, Ala, Leu, Pro o Ser; el residuo en la posición 5 es alternativamente Glu, Gln, Asp, Asn o Ala; el residuo en la posición 6 es alternativamente Arg, Glu, Leu, Lys, Gln o Ala; el residuo en la posición 7 es alternativamente Leu, Pro, Asp, Val, lie o Met; el residuo en la posición 8 es alternativamente Arg, Glu, Ala, Tyr, Leu, Lys, Pro, Gln o Trp; el residuo en la posición 9 es alternativamente Glu, Ala, Pro, Asp, Asn o Gln; el residuo en la posición 10 es alternativamente Gly, Ala, Ser o Asp; el residuo en la posición 11 es alternati amente Asp, Arg, Pro, Asn, Gln, Ala o Glu; el residuo en la posición 12 es alternativamente Gly, Ala, Ser o Met; el residuo en la posición 13 es alternativamente Pro, Glu, Gly o Val; el residuo en la posición 14 es alternati amente Asp, Glu, Asn, Gln o Gly; el residuo en la posición 15 es alternativamente Gly, Ala, Ser o Glu; el residuo en la posición 16 es alternativamente Pro, Gln, Leu, Gly o Glu; el residuo en la posición 17 es alternativamente Ala, Asp, Ser o Gly; el residuo en la posición 18 es alternativamente Asp, Glu, Gln o Asn; el residuo en la posición 19 es alternativamente Asp, Glu, Asn o Gln; el residuo en la posición 20 es alternativamente Gly, Ser o Ala; el residuo en la posición 21 es alternativamente Ala, Gly, Ser o Phe; el residuo en la posición 22 es alternativamente Gly, Ala, Ser o Lys; el residuo en la posición 23 es alternativamente Ala, Phe, Thr, Gly, Ser o Leu; el residuo en la posición 24 es alternativamente Gln, Arg, Asp, Asn, Leu o Val; el residuo en la posición 25 es alternativamente Ala, Leu, Asp, lie, Gly, Ser o Thr; el residuo en la posición 26 es alternativamente Asp, Glu, Gly, Asn, Gln o Lys; el residuo en la posición 27 es alternativamente Leu, Ala, lie, Met o Val; el residuo en la posición 28 es alternati amente Glu, Gln, Asn o Asp; el residuo en la posición 29 es alternati amente His, Asn, Tyr, Ala, Gln o Glu; el residuo en la posición 30 es alternativamente Ser, Gly, Glu, Ala, Leu o Asp; el residuo en la posición 31 es alternativamente Leu, Ala, Val, Met o lie; el residuo en la posición 32 es alternativamente Leu, Ala, Val, lie, Met o Pro; el residuo en la posición 33 es alternativamente Val, Ala, Glu, Leu, lie, Met o Arg; el residuo en la posición 34 es alternativamente Ala, Ser, Pro, Glu o Gly; el residuo en la posición 35 es alternativamente Ala, Asp, Gly, Ser o Leu; el residuo en la posición 36 es alternativamente Glu, Ala, Thr, Leu, Asp, Asn o Gln; el residuo en la posición 37 es alternativamente Lys, Glu, Thr, Arg, Gln o Asp; el residuo en la posición 38 es alternativamente Lys, Arg, Gln o Glu; el residuo en la posición 39 es alternativamente Asp, Ala, Asn, Glu o Lys; el residuo en la posición 40 es alternativamente Glu, Ser, Asp, Asn, Gln o Gly; el residuo en la posición 41 es alternati amente Gly, Ala o Ser; el residuo en la posición 42 es alternati amente Pro, Gly, Ser o Asn; el residuo en la posición 43 es alternativamente Tyr, Phe o Trp; el residuo en la posición 44 es alternati amente Arg, Lys, Gln o Glu; el residuo en la posición 45 es alternativamente Met, lie, Ser o Val; el residuo en la posición 46 es alternativamente Glu, Gln, Asp, Asn, His, Arg o Gly; el residuo en la posición 48 es alternativamente Tyr o Trp; el residuo en la posición 49 es alternati amente Arg o Lys ; el residuo en la posición 50 es alternativamente Trp, Tyr o Phe; el residuo en la posición 51 es alternativamente Gly, Ala, Ser o Gln el residuo en la posición 52 es alternativamente Ser, Thr, Asn o Ala; el residuo en la posición 53 es alternativamente Pro o Gly; el residuo en la posición 54 es alternativamente Pro, Ala, Gly, Arg, Leu o Thr; el residuo en la posición 55 es alternativamente Lys, Arg, Gln o Ala; el residuo en la posición 56 es alternativamente Asp, Asn, Glu, Gln, Ala, Gly o lie; el residuo en la posición 57 es alternativamente Lys, Gln o Arg; el residuo en la posición 58 es alternativamente Arg , Gln o Lys ; el residuo en la posición 59 es alternativamente Tyr, Phe o Trp; el residuo en la posición 60 es alternativamente Gly, Ala, o Ser; el residuo en la posición 61 es alternativamente Gly, Ala o Ser; el residuo en la posición 62 es alternativamente Phe Tyr o Trp; el residuo en la posición 63 es alternativamente Met, Leu, lie o Val; el residuo en la posición 64 es alternativamente Thr, Ala, Ser o Lys; el residuo en la posición 65 es alternati amente Ser, Ala, Thr o Pro; el residuo en la posición 66 es alternativamente Glu, Asp, Asn, Lys o Gln; el residuo en la posición 67 es alternativamente Lys, Arg o Gln; el residuo en la posición 68 es alternativamente Ser, Ala, Thr o Gly; el residuo en la posición 69 es alternativamente Gln, Glu, Asp, Asn, Arg o His; el residuo en la posición 70 es alternativamente Thr, Ser, Ala o Lys; el residuo en la posición 71 es alternativamente Pro o Gly; el residuo en la posición 72 es alternativamente Leu, lie, Met o Val; el residuo en la posición 73 es alternativamente Val, Leu, lie o Met; el residuo en la posición 74 es alternativamente Thr, Ala o Ser; el residuo en la posición 75 es alternativamente Leu, lie, Met o Val; el residuo en la posición 76 es alternativamente Phe, Tyr, Trp o Leu; el residuo en la posición 77 es alternativamente Lys, Gln o Arg; el residuo en la posición 78 es alternativamente Asn, Asp, Glu, Gln o His; el residuo en la posición 79 es alternativamente Ala, Gly, Ser, lie o Val; el residuo en la posición 80 es alternativamente lie, Leu, Met, Val o Thr; el residuo en la posición 81 es alternativamente lie, "Met, Val, Thr o Leu; el residuo en la posición 82 es alternativamente Lys, Gln o Arg; el residuo en la posición 83 es alternativamente Asn, Asp, Glu, Gln o Ser; el residuo en la posición 84 es alternativamente Ala, Val, Ser, Gly o Glu; el residuo en la posición 85 es alternativamente Tyr, Phe , Trp o His el residuo en la posición 86 es alternativamente Lys, Gln o Arg; el residuo en la posición 87 es alternativamente Lys, Gln o Arg; el residuo en la posición es alternativamente Gly, Ala o Ser; el residuo en la posición es alternativamente Glu, Gln, Asp, Asn o His.

35. Un análogo funcional de beta-lipotropina como en la reivindicación 34, caracterizado porque el análogo es de aproximadamente entre 95% a 99% idéntico con la SEC ID NO: 8.

36. Un péptido que tiene actividad insul ino trópica seleccionada del grupo que consiste de la SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 20, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 22.

37. Un método como en la reivindicación 22, caracterizado porque en la etapa: h) en donde la secuencia BLT contiene un segmento tripeptídico ser-pro-pro, se lleva a cabo el doble acoplamiento de los residuos pro y ser; i) después de completar la etapa de doble acoplamiento, se bloquea cualquier péptido sin reaccionar, desprotegido con una anhídrido para evitar el alargamiento de cadena de un péptido de eliminación.

38. Un método como en la reivindicación 37, caracterizado porque en la etapa: j) la protección N-a comprende N-a-Hmb o benzoato de metilo .

39. Un análogo funcional de beta-lipotropina, caracterizado porque es al menos 90% idéntico con 'la SEC ID NO: 8.