MXPA00003680A - Metodos para determinar genotipos de color de piel en cerdos - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a métodos para determinar genotipos de color de piel en cerdos. En particular, estos métodos se basan en determinar si una mutación estápresente o no en uno o más sitios de empalme de exón/intrón del gene KIT. También se describen conjuntos para realizar tales métodos.

Description

MÉTODOS PARA DETERMINAR GENOTIPOS DE COLOR DE PIEL EN CERDOS La presente invención se refiere a métodos para determ inar el genotipo de color de piel en cerdos. En particular, se refiere a métodos para d istinguir entre los alelos /, lp, I* e /' del gene KIT. El color de la piel es importante para la industria de crianza de cerdos por una variedad de razones. En primer lugar, en una variedad de mercados existe una preferencia por carne de piel blanca. Esto se debe al hecho de que el puerco es comercializado frecuentemente con la piel todavía unida, y pieles de cerdos coloreados, aún si se le quita el pelo, todavía puede exhibir raíces del color del pelo, lo cual puede conducir a una percepción negativa del consumidor, debido a que la superficie de la carne puede parecer estar manchada por moho. En consecuencia, es necesario en estos mercados remover la piel de tales cadáveres, acarraendo un costo adicional . Por ejemplo, en Estados Unidos, los cadáveres coloreados están asociados con aproximadamente 1 % de defectos de piel , requiriendo pelado y despellejado para remover el pigmento. Como resultado de esto, generalmente se rebajan los cadáveres de cerdo coloreado. En segundo lugar, la variación de grueso en la apariencia de los cerdos reclama ser genéticamente consistente para otros rasgos, puede conducir a cuestiones sobre la consistencia y cal idad de los animales en la mente de los clientes productores de cerdo. Los criadores también desearían ser capaces de asegurar la consistencia en las poblaciones de crianza. De esta manera, los criadores pueden desear asegurar que la progenie producida mediante cruzas de crianza sea siempre blanca. De manera alternativa, un criador que produce una raza de color, puede desear asegurar que las características de color de piel correctas sean mantenidas aún durante la introgresión de genes de l íneas blancas. El color blanco de la piel en cerdos está controlado por el sitio blanco dominante designado / (para inhibición de color de piel) . Las alteraciones estructurales en el gene KIT porcino han sido correlacionadas recientemente con varios alelos de / y probablemente son responsables de las diferencias en el patrón de color de piel encontrado, o están enlazadas estrechamente con las mutaciones que son encontradas (Johansson Moller et al. 1 996 Mammalian Genome 7, 822-830) . Se han identificado cuatro versiones estructurales del gene KIT porcino a la fecha y se han designado /, lp, I* e / (ver fig ura 1 y tabla 1 ) . La versión encontrada en animales completamente coloreados incluyendo jabal í, y la cual , por lo tanto, es generalmente aceptada como el alelo de tipo natural es /'. Las otras versiones del gene conocidas involucran todas la duplicación de al menos parte del gene KIT porcino. Ip es un alelo parcialmente dominante y provoca , en el estado heterócigo (lp/i) un fenotipo de "parche" caracterizado por parches de piel blanca y de color. / e /* son ambos complementamente dominantes y originan un fenotipo blanco tanto en el estado heterócigo como homócigo. La única diferencia entre / e /* es que existe una supresión de 4 bp en el intrón 1 8 en una de las dos copias de gene KIT asociadas con el alelo /. No se espera que este polimorfismo de secuencia tenga algún efecto funcional.

Los fenotipos de un número de com binaciones de gene se listan a continuación siendo dominante el alelo / sobre lp e /, y siendo dom inante lp sobre / (Johansson et al. 1 992 Genomics 14, 965-969) Genotipo Color /// Blanco l/lp Blanco ///' Blanco /"//' Parchado ///' Coloreado /*//' Blanco Previamente, Moller Johansson et al. ( 1 996 Mammalian Genome 7, 822-830) revelaron que KIT ocurre como un gene de copia simple en animales de color (i/i) , pero se duplica en el alelo /, /* e lp. Esta duplicación permitió la diferenciación de /, /* e lp de / a través de la examínación del número de copias de gene de KIT y usar polimorfismos enlazados en o en la cercan ía del gene KIT, para d istinguir los diferentes alelos en el sitio /. Esta aproximación es el tema de la patente internacional WO97/05278. Sin embargo, un problema que permanece de este método es que no se disting ue entre /* e lp. El resultado de esto es que si uno desea usar la pantalla para remover animales portadores heterócigos del genotipo l/lp de una l ínea de cerdos blancos, un también excluye innecesariamente anímales ///*. La remoción de animales, potencialmente muy valiosos si se está en la punta de una pirámide de crianza , no necesariamente puede conducir a una reducción en la proporción de mejoram iento de otros rasgos dentro del grupo particular de animales. Otras consecuencias incluyen una pérdida general de la diversidad genética y una pérdida de alelos en el sitio en cuestión que pueden tener todavía un valor no detectado. Es esencial que uno solo excluya alelos donde sea absolutamente necesario.

Un análisis de secuencias adicional del DNA genómico reveló una mutación en el primer nucleótido en el intrón 1 7 de KIT2 , conduciendo a un defecto en el empalme de RNA transcrito desde esta copia particular del gene KIT. En experimentos involucrando varias razas de cerdos, esta mutación mostró una completa concordancia con la presencia de los alelos / e /*, pero no se encontró en los alelos / e lp. La mayoría de los genes eucaríóticos están compuestos tanto de regiones de codificación (exones) como de no de codificación que intervienen (intrones). Las últimas de estas secuencias son removidas de pre-m RNA g rande mediante un corte altamente preciso y reacción de ligación conocida como empalme. El resultado es un transcripto de m RNA maduro, desprovisto de secuencias de intrones, el cual es transportado al citoplasma para traslación. El em palme de genes eucarióticos muy probablemente es un procedimiento de dos pasos. Primero, el pre-m RNA es cortado en el sitio de empalme 5' (donador) seguido por el corte en el sitio de empalme 3' (receptor) . El segundo paso involucra la reunión de los exones empalmados para resultar en una exclusión del intrón que interviene. En consecuencia, el empalme es críticamente dependiente de la precisión de las reacciones de corte y ligación. Esta precisión parece ser dependiente de los dinucleótidos GT y AG casi completamente invariables presentes en los l ímites 5' y 3' de exón/intrón, respectivamente. Estos dinucleótidos y las secuencias circundantes altamente conservadas con frecuencia son conocidos como sitios de empalme y sirven para unir los factores de proteína requeridos para realizar las reacciones de corte y ligación . Las consecuencias para mutación que ocurren dentro de un sitio de empalme pueden ser una reducción en la cantidad de m RNA maduro producido y/o la utilización de sitios de empalme alternativos pero incorrectos en la cercan ía. El resultado es la producción de m RNA, el cual ya sea contiene una secuencia de intrón adicional , o el cual puede carecer de una porción de secuencia de codificación . Donde ocurre la mutación dentro del sitio de empalme 5' (donador) y se previene la un ión de factores de proteína , el exón ya no es reconocido como tal y es cortado junto con los intrones vecinos. Esto es referido como "omisión de exón" (como es revisado por Cooper y Krawczak, 1 994 Human Gene Mutation . Bios Scíentific Publishers, Oxford , U K, 1 994). En la mutación identificada aq u í, la G del par GT conservado en la región l ímite exón 1 7/intrón 17 es alterada una A. Ah í hay una alteración en el RNA mensajero que es trasladado a proteína y que la presencia del cam bio se correlaciona con los fenotipos blanco/coloreado sugiere que esta es la mutación funcional en lugar de meramente un marcador enlazado. Se espera que la variante de empalme origine una proteína defectuosa ya que faltan 41 aminoácidos en la proteína madura. Por lo tanto, suponemos que esta mutación de empalme es la mutación causante de la diferencia entre / e lp. Nuestro conocim iento actual con respecto a las diferencias moleculares entre los alelos en el sitio / se resume en la Tabla 1 . En conclusión , hemos identificado dos mutaciones funcionalmente importantes. Una es la duplicación de gene presente en /", I* e I, que parece ser por si misma la causa del fenotipo de parche. La razón exacta para este efecto fenotípico no es conocida, pero uno puede especular en base a los datos comparativos del ratón que la copia duplicada del gene KIT puede conducir a un defecto en la expresión de gene, la cual a su vez, afecta la migración de melanocitos. Esto es especialmente valioso porq ue no puede haber ruptura del enlace entre el pol imorfismo de DNA y el rasgo en sí mismo. Esto nos ha perm itido desarrollar un rango de ensayos para la determ inación de la presencia del polimorfismo de DNA y el genotipo del animal , con respecto a la determ inación del color de la piel a un grado significativamente mayor que lo que había sido posi ble antes. La segunda mutación es la mutación de empalme q ue ocurre en u na de las copias de KIT asociadas con los alelos blancos dom inantes (/ e /*). Se espera que la expresión de una forma truncada de la proteína KIT provoque un defecto más severo en la función de KIT y un efecto más severo en el color de la piel .

Tabla 1 . Alelo Gene KIT I ntrón 1 7 Fenotipo asociado i KIT1 Normal Coloreado lp KIT1 Normal Parche KIT2 Normal 1 KIT1 Normal Blanco dominante KIT2 Con mutación 1* KIT1 Normal Blanco dominante KIT2 Con mutación Además de estas dos m utaciones funcionalmente importantes, una mutación en el gene KIT sin ningún efecto fenotípico conocido, la supresión de 4 bp en el i ntrón 1 8 ha sido documentada en el sitio / como se describe en la solicitud de patente internacional no. PCT/GB96/01 794.

De esta manera, en un primer aspecto la presente invención proporciona un método para determinar el genotipo de color de piel en un cerdo, el cual comprende: (a) obtener una muestra de ácido nucleico del cerdo; y (b) analizar el ácido nucleico obtenido en (a) para determinar si una m utación está presente o no en uno o más sitios de empalme exón/intrón del gene KIT. En particular, el método determina si una mutación está presente o no en el l ím ite del exón 1 7/intrón 1 7 , por ejemplo, la substitución de G del par GT conservado por A.

El análisis en cadena de polimerasa basado en transcriptasa inversa (RT-PCR) de la reg ión de exón 1 6-1 9 de m RNA de KIT en an imales de la raza Large White (///) y en comparación con aquélla transcrita en animales Hampshire (///) reveló una especie extra de molécula en los animales anteriores. El análisis de RT-PCR de ambas razas produjo un fragmento de producto con una longitud de 424 bp, inciando q ue ambos tipos de animal conten ían un transcripto de m RNA de KIT conteniendo una región correspondiente a esta región del gene. Sin embargo, además de que los animales /// produjeron u n producto de RT-PCR de 301 bp, indicando la presencia de una especie de mRNA, la cual no conten ía la transcripción completa de la secuencia de DNA del exón 1 6- 1 9 (ver el ejem plo 1 ). Se ha mostrado que estos dos transcriptos son derivados de las copias por duplicado separadas del gene KIT asociado con el alelo /. La secuenciación sobre el l ím ite del exón 1 7/intrón 1 7 de KIT reveló una diferencia en las secuencias l ím ite del ¡ntrón presentes en las dos copias por duplicado del gene KIT asociado con el alelo / (ver el ejem plo 2). Las secuencias son como se muestran a contin uación: Alelo Gene Kit Exón 1 7 I ntrón 1 7 KIT1 AAC GTG KIT1 AAC GTG KIT2 AAC GTG KIT1 AAC GTG KIT2 AAC ATG Esta alteración del sitio de empalme de ¡ntrón 5' de un par GT hasta un par AT afecta el empalme del pre-mRNA y resulta en la pérdida de todo el exón 1 7 del m RNA transcrito a partir de la secuencia /-KIT2. Esto resultará en una proteína KIT modificada con las alteraciones asociadas en función y fenotipo. Con base en el polimorfismo de secuencia pueden desarrollarse pruebas rápidas para determ nar los alelos portados por un animal específico en el sitio blanco dom inante. En una forma, tal prueba comprendería la amplificación de la región a través de la reacción en cadena de polimerasa (PCR) utilizando DNA genómico del animal en cuestión como una plantilla. La secuencia de nucleótidos CATG comprende una secuencia de reconocim iento para la enzima de restricción Nla\ \ \ . Esta secuencia solo está presente en la secuencia l-KIT 2 en la posición de unión , y de esta manera puede diferenciar las moléculas de DNA amplificadas de los dos alelos mediante digestión de los productos de ampl ificación con esta enzima o cualquier otra enzima de restricción con un sitio de reconocim iento adecuado. El DNA genóm ico para usarse en tal prueba puede ser preparado mediante un amplio rango de métodos disponibles, a partir de cualq uier tejido o producto derivado del animal en cuestión . Un fragmento de 1 75bp del gene KIT conteniendo la región l ím ite del exón 1 7/intrón 1 7 puede amplificarse a partir del DNA genómico porcino usando un par de in iciadores, tales como: KIT21 (5'-GTA TTC ACÁ GAG ACT TGG CGG C-3') ; y KIT35 (5'-AAA CCT GCA AGG AAA ATC CTT CAC GG-3').

El uso de tales iniciadores en una prueba de PRCR-RFLP produce un fragmento de 175 bp antes de la digestión con Nla\ \ \ . En los alelos con la G presente en la posición de nucleótido 1 del ¡ntrón 1 7 (secuencia tipo I-KIT ) , solo existe un sitio de corte Nla\ \ \ presente 41 bp desde el final del fragmento. Este sitio está presente en todas las versiones de la secuencia KIT. Así, la digestión de los frag mentos de 175 bp obtenidos a partir de los alelos / e lp produce dos fragmentos de 1 34 bp y 41 bp. Donde la G ha sufrido mutación a A, como en la secuencia de I-KIT2 presente en / e /*, se crea un sitio de corte Nla\ \ \ y de esta manera la digestión produce productos de 80 bp y 54 bp y 41 bp (ver la figura 3, ejemplo 2) . Una variedad de otros oligonucleótidos adecuados como iniciadores de PCR podrían ser derivados fácilmente de la secuencia de esta región del genoma porcino. Un ejemplo de tal prueba de PC R-RFLP está dado en el ejemplo 3. Los resu ltados que serían obten idos de tal prueba de PCR-RFLP descrita antes son como se muestra a continuación : Genotipo Ta maños de fragmentos Tamaños de fragmentos 1 34 + 41 bp 80 + 54 + 41 bp l/l SI SI l/l SI S I I/i SI SI lp/lp SI NO lp/i SI NO i/i SI NO /*// SI si /*//* si si si si r/?p si si Así, simplemente al analizar los productos de restricción ciertos genotipos pueden ser distinguidos. Sin embargo, existen otros que no pueden ser distinguidos en esta primera configuración de la prueba. En un refinamiento adicional, la prueba puede ser realizada en tal manera, que puede calcularse la cantidad de cada fragmento. Al realizar la electroforesis en un aparato que permite la cuantificación de cada una de las bandas, uno puede determ inar la proporción de las dos formas de pla nti lla en la muestra de DNA genóm ico usada. Ejemplos de tal aparato incluyen los sistemas de secuenciación de DNA 373 y 377 de Perkin Elmer Applied Biosystems. La aplicación de este tipo de equipo está i lustrada en el ejemplo 4. Cualq uier eq uipo capaz de determ inar las cantidades relativas de los productos de las dos diferentes secuencias es igualmente aplicable a tales pruebas. Los resultados esperados de tal prueba se muestran a continuación. notipo Copias ¿ le Copias de KIT Proporción secuencia KIT mutante de normal/mutante normal empalme de empalme l/l 2 2 1 l/lp 3 1 3 ///* 2 2 1 /// 2 1 2 lp/lp 4 0 0 /"//* 3 1 3 /"//' 3 0 0 /*//' 2 1 2 /*//* 2 2 1 /'// 2 0 0 Así, al usar tal prueba uno podría identificar todos los an imales que portan alelos de blanco dom inante que pudieran disponer a sí m ismos o a su progenie a exhibir un color de piel no blanco ( o lp) como aquéllos que dan una proporción mayor que uno. Dependiendo del requerimiento y la derivación de las l íneas bajo selección , uno podría tomar un subconjunto apropiado de animales. Por ejemplo, en una cruza derivada de animales portando solo alelos / e /', u no podría identificar cualq uier individuo blanco (/// o ///') portando /, ya que tendrían una proporción en la prueba de 2 opuesto a 1 para los animales ///. La distinción de los alelos / e /* puede ser realizada en la base de la supresión de 4bp, como se describió en la publicación de patente previamente presentada WO97/05278. Existe un rango de técnicas mediante las cuales la diferenciación de alelos conteniendo la mutación de empalme y aquéllas conteniendo la secuencia normal podrían diferenciarse mediante una persona experta en el cam po.

El análisis de la composición genética de un animal podría basarse en una variedad de materiales de fuentes diferentes. Estos incluyen DNA genómico, RNA y la proteína KIT por s í misma. Tam bién pueden existir efectos en los niveles y naturaleza de otras proteínas, metabolitos y especies de RNA, los cuales podrían ser medidos para crear un ensayo más indirecto. El DNA podría ser usado como la base para una variedad de aproximaciones para prueba. Una aproximación es a través de la amplificación de la región de DNA que contiene el polimorfismo usando la reacción en cadena de polímerasa. Esto podría enlazarse entonces a una variedad de formas de análisis del producto. Ejemplos de electroforesis basadas en tecnolog ías, incluyen Polimorfismo de Conformación de Filamento Sim ple (SSCP) , Polimorfismo de Longitud de Fragmento de Restricción (RFLP) y secuenciación de DNA de prod uctos de PCR o secuenciación de genoma directa. Otras técnicas basadas en PCR que pud ieran usarse de manera alternativa incluyen los sistemas TaqMan de Perkin Elmer, Extensión Polimórfica de N ucleótido Simple (Snu PE) y Minísecuenciación . Los productos de PCR de la región tam bién pudieran tener aplicación en aproximaciones basadas en hibridación para la diferenciación de los alelos en este sitio. Los métodos de hibridación pudieran incluir el sondeo de transferencias Southern de DNA genómico con oligonucléotido específico de alelo, RNA, frag mento de DNA o sondas de Acido Nucleico de Proteína (PNA). Otras estrategias de aplicación aqu í incluyen hibridación de DNA genómico o prod uctos de PC R (específico o genoma completo) a arreglos de oligonucleótidos posiblemente en la forma de "chips de DNA". Tales arreglos podrían consistir de cualquier reactivo capaz de unir DNA o RNA derivado del sitio en cuestión en una manera específica de alelo. Métodos útiles adicionales del análisis también incluyen el ensayo de ligación de oligonucleótido y la reacción en cadena de ligasa. Para una revisión de los métodos para detectar mutaciones puntuales ver Landegren , 1 996, Laboratory Protocols for Mutation Detection (Protocolos de laboratorio para detección de m utaciones) , Oxford Universitiy Press, Oxford . Una variedad de efectos del RNA producido a partir del gene en cuestión ha sido y puede ser observada en el futuro. Todas esas diferencias entre las formas con mutación y normales del gene son objetivos útiles para la determ inación del genotipo y un gran rango de métodos está disponible para la persona experta en la técnica. Los cam bios q ue son o pudieran ser observados y métodos de análisis son como sigue. La alteración del tamaño, velocidad de procesamiento, estabilidad y cantidad de transcriptos de RNA pudieran ser medidos a través de técnicas ampliamente usadas, tales como Northern blotting y RT-PCR, así como una variedad de las técnicas descritas antes para el análisis de DNA, tal como, hibridación a oligonucleótido o arreglos de fragmentos de DNA. Otra aproximación , la cual puede usarse, es usar un polimorfismo genético enlazado, el cual está asociado estrechamente a la presencia o ausencia de la alteración del límite de exón/intrón . Tal polimorfismo puede ocurrir en el gene KIT por sí mismo o en una reg ión cromosóm ica enlazada a KIT. Al usar un marcador enlazado simple en la asociación completa con la presencia/ausencia de la duplicación, o una combinación de marcadores mostrando una asociación parcial, puede desarrollarse una prueba altamente informativa. Por ejemplo, el método de SSCP (Polimorfismo de conformación de filamento simple) puede ser usado para desarrollar tal polimorfismo. El principio del método es que DNA de doble filamento, producido mediante PCR, es desnaturalizado en DNA de filamento sim ple, el cual es separado entonces mediante electroforesis en gel no desnaturalizante. Bajo condiciones no desnaturalizantes, el DNA de filamento simple forma una estructura secundaria debido a la interacción intra-filamento, pero una proporción del DNA de filamento simple se renaturalizará y formará DNA de doble filamento. Dos tipos de polimorfismo pueden ser revelados mediante este método. En primer lugar, una diferencia en la secuencia de nucleótidos entre dos alelos puede influenciar la estructura secu ndaria del DNA de filamento simple, que se revela como una diferencia en la velocidad de movilidad durante la electroforesis. En seg undo lugar, una diferencia en la secuencia de nucleótidos frecuentemente influencia la movilidad del DNA heterodúplex (Un heterodúplex es una molécula de DNA de doble filamento formada por dos moléculas de filamento simple representando diferentes alelos) . La asociación entre marcadores genéticos y genes responsables de un rasgo particular, pueden romperse mediante recom binanción genética. Así, mientras más corta sea la distancia física entre el marcador y el gene en cuestión , menos probable es que la recombinación los separe. También es posible establecer el enlace entre a lelos específicos de marcadores de DNA alternativos y alelos de marcadores de DNA conocidos por estar asociados con un gene particular (por ejemplo, el gene KIT discutido en la presente) , el cual ha mostrado previamente estar asociado con un rasgo particular. Así, en la presente situación , tomar el gene KIT sería posible, al menos en un plazo corto, para seleccionar cerdos con un color de piel particular, indirectamente, al seleccionar ciertos alelos de un marcador asociado con el gene KIT a través de la selección de alelos específicos de marcadores alternativos del cromosoma 8. Ejemplos de tales marcadores conocidos por estar enlazados al gene KIT en el cromosoma 8 porcino incluyen polimorfismo genético en el gene KIT por sí m ismo o en los genes estrechamente enlazados para la a-su bunidad del factor de crecimiento derivado de plaqueta (PDGFRA) y albúm ina . Los marcadores genéticos particulares asociados con el gene KIT son microsatélites. Estos son repeticiones de secuencias simples de 4, 3 o más usualmente 2 nucleótidos, que ocurren esencialmente al azar alrededor del genoma a aproximadamente cada 50, 000 bases (aproximadamente 60, 000 microsatélites por genoma haploide) . Se piensa que tartamudeos de DNA polimerasa durante la replicación y cruza desig ual d urante la recombinación resultan en la pérdida o ganancia de unidades repetidas. Esto significa que los microsatélites son usualmente polimórficos y pueden tener varios alelos de longitud de repetición . Ejemplos de secuencias de m icrosatélites enlazadas incluyen S0086 (Ellegre et al. , Genomics, 16:431 -439 ( 1 993)), S001 7 (Coppieters et al . , Animal Genetics 24: 163-1 70 ( 1 993)), Sw527, Swr750 y SW91 6 (Rhorer et al . , Genetics, 1 36: 231 -245 ( 1 994)). Sería posi ble seleccionar indirectamente alelos del gene KIT enlazado a un color de piel usando cualquiera de los marcadores anteriores, o en realidad cualquier otro marcador enlazado en el cromosoma 8 porcino. Las alteraciones en el nivel de la proteína KIT podrían medirse usando ya sea anticuerpos específicos, por ejemplo, en un sistema ELIS o en western blots o a través del uso de un rango de técnicas bioq uímicas para medir la actividad de la proteína. Tales pruebas también podrían ser aplicadas a otras prote ínas o metabolítos, el nivel o naturaleza de los cuales es alterado por la presencia de alelos específicos en el sitio. Las estructuras de proteínas diferentes, debido a la presencia de alelos específicos podrían ser identificadas a través del uso de anticuerpos específicos de estructura. Como con los métodos basados en DNA y RNA, todos estos métodos de prote ínas podrían ser aplicados en una manera cuantitativa, logrando así todas capacidades discrim inatorias posibles. Los conjuntos podrían ser producidos para el análisis específico del polimorfismo descrito aqu í solo y tam bién con los reactivos q ue permiten el análisis combinado de los demás polimorfismos previamente reportados, y el objetivo de la publicación de patente WO97/05278. La invención será descrita ahora con referencia a los siguientes ejemplos, los cuales no deben ser interpretados como limitantes de la invención de ninguna manera. Los ejemplos se refieren a las figuras, en las cuales: Figura 1 : es una representación esquemática de la estructura de los alelos de KIT porcinos , donde 4bp del'n se refiere a la supresión de 4 bp en el intrón 1 8 de una copia del DNA de gene KIT duplicado, como se reportó por Moller et al. 1 996 y el Exón 1 7-A se refiere al cambio del nucleótido 1 del intrón 17 de una G, como en el alelo de tipo natural a una A como se reporta en esta patente; Figura 2: muestra un electroferograma (4% agarosa Nusieve/Seakem 3:1; 100V durante 80 min) mostrando productos de RT-PCR del exón 16-19 de KIT con los iniciadores KIT1F y KIT7R. Las muestras 1-3 y 4-6 son cerdos suecos Large White y Hampshire, respectivamente. La diferencia de tamaño entre los fragmentos de 424 y 301 bp es debida a la carencia del exón 17 en la última fracción. Las dos bandas superiores de los cerdos Yorkshire fueron interpretadas como heterodúplex (HD); Figura 3: muestra una secuencia de 48bp comprendiendo 21 bp del exón 17 de KIT y 27 bp del intrón 17 de KIT, donde la posición del límite intrón/exón es marcada con una línea vertical, la mutación de sitio de empalme (nt1G?A) es indicada con una flecha vertical y las bases idénticas en los alelos lp e / se marcan con un punto; Figura 4: muestra los resultados de la prueba de PCR RFLP de ?//alll para detectar la presencia de una mutación de sitio de empalme en el intrón 17 del gene KIT. La Figura 4A muestra la posición de dos sitios de reconocimiento de Nla\\\ dentro del producto de PCR amplificados usando el par de iniciadores KIT21 y KIT35. Todas las distancias están dadas en pares de bases. La Figura 4B muestra el tamaño de fragmentos que resultan siguiendo la digestión de ?//alll ya sea de KIT normal o KIT mutante de empalme. La Figura 4C ilustra el uso de la prueba de PCR RFLP. El campo 1 muestra el fragmento amplificado KIT21/KIT35 sin digerir. La digestión se realizó en productos de PCR amplificados a partir de, en el campo 2: un clon que contiene la mutación de sitio de empalme; campo 3: un clon que contiene la secuencia de sitio de empalme normal; campo 4: DNA genómico de un cerdo coloreado; campo 5: DNA genómico de un cerdo blanco. Los tamaños de frag mentos están dados en pares de bases; Fig ura 5: muestra una comparación de la proporción de KIT normal a mutante de empalme en animales de genotipos ///, ///' e \/lp Fig u ra 6: muestra los valores de proporciones para 56 animales Landrace y 33 animales Large White. Se observa una distribución claramente bimodal con 7 individuos Landrace y 3 Large White teniendo un valor de proporción de aproximadamente 6 o superior, sugiriendo que son portadores heterócigos para el alelo \p (genotipo l/lp). Esto significa que lp tiene una frecuencia de gene estimada de 6.25% (7/1 1 2 cromosomas probados) y 4.5% (3/66 cromosomas probados) dentro de las razas Landrace y Large White, respectivamente; y Figu ra 7: muestra una gráfica de Ct FAM versus Ct TET para animales de los genotipos //' e // analizados para genotipo de mutante de empalme KIT usando qu ím ica Taq Man®.

Ejemplo 1 RT-PCR de exón 1 6-1 9 de KIT porcino i. Purificación de mRNA a partir de muestras de sangre Se recolectaron muestras de sangre recientes en tubos de cítrato de cerdos de color Ham pshire y cerdos Large White. Los leucocitos fueron aislados de 5 m l de sangre usando Ficoll 1 00 (Pharmacia Biotech). El aislam iento de m RNA de leucocitos fue realizado usando el conjunto de purificación de mRNA Quickprep Micro (Pharmacia Biotech). El m RNA se almacenó como un precipitado bajo etanol a -70°C hasta durante un mes antes de usarse en PCR de transcriptasa inversa (RT) . ii. RT-PCR del exón 1 6-1 9 de KIT La síntesis de cDNA de un filamento se logró usando el conjunto First-Strand cDNA Synthesis (Pharmacia Biotech) de manera que se iniciaron aleatoriamente -1 00 ng de m RNA mediante 0. 1 µg pd(N6) en un volumen total de 1 5 µl . Dos µl de la primera reacción de filamento de cDNA se usó entonces directamente por 1 2 µl de reacción de PCR al adicionar 1 0 µl de mezcla de PCR conteniendo 1 0 pmol de cada uno de los iniciadores derivados de ratón/humano KIT1 F y KIT7R (5'-TCR RAC ATA GAA AGA GAY GTG ACT C y 5'-AGC CTT CCT TGA TCA TCT TGT AG, respectivamente; Moller et al. , 1 996, supra) , 1 .2 µl 1 0 x PCR-amortiguador ( 1 0 m M Tris-HCl, pH 8.3; 50 m M KCl) y 0.5 U de AmpliTaq polimerasa (Perkin-Elmer) incubada con una cantidad igual de anticuerpo Taqstart (Clontech) a 25°C durante 5 m in para lograr una PCR de inicio caliente. La reacción se cubrió con 20 µl de aceite mineral y se termociclizó en una máq uina Hybaid Touchdown (Hybaid) con 40 ciclos a 94°C durante 1 min, 55-48°C ("touchdown" un grado por ciclo los primeros siete ciclos y entonces 48°C en los ciclos restantes) durante 1 m in y 72°C durante 1 min. Después de la PCR, se ad icionan 2 µl de colorante de carga a cada m uestra, las cuales se cargaron entonces en un gel de agarosa 4% (Nusieve/Seakem 3: 1 , FMC Bioproducts) y se sometió a electroforesis con 1 00V durante 80 min. Los productos fueron visualizados mediante manchado con bromuro de etidío e iluminación UV. ¡ii. Clonación y secuencíación de productos de RT-PCR Los productos de RT-PCR representando el exón 1 6- 1 9 de KIT fueron purificados mediante extracción a partir de los geles de agarosa 2% usando el conjunto de extracción de gel QIAEX (QIAGEN) y se clonó en el vector pUC 1 8 usando el conjunto de ligación Sureclone (Pharmacia Biotech) . Los plásmidos se aislaron usando el conjunto Q IAFilter plasmid Midi (Q IAGEN). Las inserciones de plásm idos clonados se secuenciaron usando qu ímica de iniciador de colorante. Cada reacción de ciclización se preparó con un DNA de plantilla de plásmido y mezcla de reacción lista conteniendo iniciador hacia delante o hacia atrás de M 1 3 marcado de manera fluorescente, como se describe en el protocolo de ABl Prism P/N 4021 1 3 (Perkin Elmer). La ciclización y extracción de m uestras se realizaron usando una Catalyst 800 Molecular Biology Workstation (ABl) siguiendo el manual del usuario de los instrumentos (número de documento 903877, Perkin Elmer) . Los productos de extensión resultantes se purificaron , se cargaron y se analizaron usando el secuenciador 377 ABl Prism , como se describió por el protocolo de instrumento P/N 402078 (Perkin Elmer). iv. Resultados y discusión Un frag mento de 424 bp incluyendo exón 1 6-1 9 de cDNA de KIT se amplificó de todos los cerdos. Los cerdos Hampshire no mostraron cualquier producto adicional, mientras que todos los cerdos Large White (ocho probados) mostraron un fragmento de cDNA truncado de 301 bp (Fig. 2) . El análisis de secuencias reveló el fragmento de 424 bp fue idéntico en las dos razas, mientras que el exón 1 7 completo (123 bp) estaba faltando del frag mento de 301 bp. Las diferencias aparentes entre inidivudos con respecto a las cantidades relativas de estos dos productos pueden haber sido provocadas ya sea por genotipos diferentes conteniendo números de copias que difieren de la secuencia de gene KIT, diferencias individuales en niveles de expresión de mRNA o efectos de RT-PCR aleatorios. Los dos frag mentos superiores presentes en cerdos Large White representan heterodúplex entre los fragmentos de 301 y 424 bp (Fig . 2) . Esto fue mostrado mediante u n experimento donde estos fragmentos q ue m igran lento fueron generados al extraer homodúplex de 424 y 301 bp, que fueron desnaturalizados entonces con calor y se enfriaron a 25°C. Más aún , la clonación de la fracción de heterodúplex menor de un cerdo Large White resultó en clones con longitud de inserción correspondiente a cualquiera de los dos homodúplex.

Ejemplo 2 Am plificación de PCR y secuenciación del Exón 1 7-intrón 1 7 de KIT (sitio de empalme 5') i . PCR para producir la plantilla de secuenciación de DNA Una región de 1 75 bp incluyendo el l ímite entre el exón 1 7 y el intrón 1 7 del gene KIT se amplificó para el análisis de secuencia usando el iniciador hacia delante KIT21 (5'-GTA TTC ACÁ GAG ACT TGG CGG C-3') e iniciador hacia atrás KIT35 (5'-AAA CCT GCA AGG AAA ATC CTT CAC GG-3'). Se realizó PCR sobre un ciclizador térmico de DNA (Perkin Elmer 9600) en un volumen total de 20 µl conteniendo 25 ng de DNA genómico, 1 .0 m M MgCI2, 50 mM KCl , 1 0 mM Tris-HCl , pH 8.3, 200 µM dNTPs, 0.5 U Am pliTaq Gold (Perkin Elmer) y 1 0 pmol de amobs iniciadores KIT21 y KIT35. Para activar AmpliTaq Gold, se realizó la desnaturalización de color inicial a 94°C durante 1 0 minutos, seguido por 32 ciclos, consistiendo cada uno de 45 s a 94°C, 45 s a 55°Cy 45 s a 72°C. La extensión final duró 7 min a 72°C. Los productos de PCR se clonaron en el vector pUC 1 8 usando el conj unto de ligación SureClone (Pharmacia Biotech) . ¡i . Preparación del DNA de plásm ido El DNA del plásmido se purificó a partir del cultivo bacteriano durante la noche usando el conjunto Jetstar plasmid midi (Genomed) y el DNA resultante diluido a 1 50 ng/µl. iii. Secuenciación del DNA de plásmido El DNA se secuencíó como en el ejemplo 1 , sección iii. iv. Resultados Se determinó una porción de la secuencia de DNA del exón 17 e intrón 1 7 del gene KIT y se comparó entre animales con cada uno de estos tres alelos. La fig ura 3 muestra q ue el alelo / porta una mutación de sitio de empalme en la posición 1 del intrón 1 7. Esta substitución de base de G a A está presente en una de las dos copias de genes portadas en cada cromosoma. La substitución de base ocurre en el dinucleótido GT invariable, el cual caracteriza los lím ites del exón/intrón 5' . El análisis del alelo lp mostró que la mutación de sitio de empalme no estuvo presente ni en la copia normal (KIT1 ) o duplicada del gene (KIT2) . Hemos encontrado que la mutación de sitio de empalme es única para los alelos /, y en consecuencia hace posible disting uir las secuencias de I-KIT2.

Ejemplo 3 Prueba para la presencia de la mutación de sitio de empalme con PCR RFLP Para probar fácilmente la presencia de la m utación de sitio de empalme de G a A, se usó la endonucleasa de restricción Nla\ \ \ (CATG) para explotar la substitución puntual identificada en la posición 1 del intrón 1 7 (Fig ura 3) . Los sitios de reconocim iento de Nla\ \ \ en el frag mento amplificado de KIT y los productos de restricción esperados se ilustran en la Figura 4A y 4B, respectivamente. i. Preparación de DNA para la prueba de RFLP Puede prepararse DNA a partir de cualquier fuente de tejido conteniendo n úcleos celulares, por ejemplo, glóbulos blancos, fol ículos pilosos, muescas de orejas y músculo. El presente procedimiento se refiere a preparaciones de células sangu íneas; otros tejidos pueden ser procesados de manera similar al suspender directamente material en el amortig uador K y entonces proceder de la misma etapa del procedimiento sangu íneo. El método aquí señalado produce un lisado celular conteniendo DNA crudo, el cual es adecuado para amplificación de PCR. Sin embargo, cualquier método para preparar DNA purificado, o crudo, debería ser igualmente efectivo. Se recolectó sangre en 50 mM EDTA pH 8.0 para prevenir la coagulación. Se dispensaron 50 µl de sangre en un tubo de microcentrífuga pequeño (0.5 ml Eppendorf o equivalente) . Se adicionaron 450 µl de amortiguador TE para lisar los glóbulos rojos (los g rupos hemo inh iben PCR) y la mezcla se agitó vortiginosamente durante 2 segundos. Los glóbulos blancos intactos y los rojos residuales fueron centrifugados entonces durante 1 2 seg undos a 1 3,000 g en una microcentrífigua. El sobrenadante fue removido mediante aspiración suave usando un sistema de bomba de vacío de baja presión . Entonces se agregaron 450 µl" adicionales de amortiguador TE para lisar los glóbulos rojos restantes y los glóbu los blancos se recolectaron mediante centrifugación como antes. Si había cualquier color rojizo todavía en la pella, este proceso se repitió hasta que la pella era blanca. Después de la remoción de la última gota de sobrenadante de los góbulos blancos peletizados, se adicionaron 100 µl de amortiguador K conteniendo proteinasa K, y la mezcla se incubó a 55°C durante 2 horas. Entonces la mezcla se calentó a 95- 1 00°C durante 8 minutos, y los usados de DNA se almacenaron a -20°C hasta que fue necesario.

Reactivos Amortiguador T.E. 10 mM TRIS-HCI pH 8.0 1 mM EDTA Amortiguador K: 50 mM KCl 10 mM TRIS-HCI pH 8.3 2.5 mM MgCI2 0.5% Tween 20 ii. Digestión de enzima de restricción y electroforesis El producto de amplificación de PCR es 175 bp en longitud. Para probar el polimorfismo en la posición 1 del ¡ntrón 17, las reacciones de digestión se fijaron como se expone a continuación: 3.0 µl de DNA amplificado por PCR 1.0 µl 10 X NEBuffer 4 0.1 µl BSA 100 µg/ml 0.1 µl NlaUl 10 U/µl 5.8 µl dH2O (1 X NEBuffer 4 (New England Biolabs) contiene 50 mM acetato de potasio, 20 mM Tris acetato, 10 mM acetato de magnesio y 1 mM DTT). Siguiendo la incubación a 37°C durante 90 minutos, cada volumen de reacción de 10 µl tuvo 2 µl de colorante de carga adicionado, y la mezcla careada en un gel de poliacrilamida natural 8% (Protogel, 37.5:1 acrilamida:bisacrilamida, National Diagnostics, Atlanta) en 0.5 X TBE (44.5 mM Tris pH 8.0, 44.5 mM ácido bórico y 0.5 mM EDTA) y se sometió a electroforesis durante 3 horas a 200V en una unidad de placa vertical (SE600 Hoefer Scientific I nstruments) . Los productos fueron visualizados mediante manchado con brom uro de etidio. iíi . Resultados Se diseñó un protocolo de PCR RFLP para probar la presencia de la mutación de sitio de empalme conforme ocurre la substitución dentro del sitio de reconocim iento para la endonucleasa de restricción Nla\ \ \ . La Fig ura 4B ilustra q ue la presencia de la substitución de base G a A en la posición 1 del intrón 1 7 de KIT resulta en la restricción en cada uno de los dos sitios de reconocim iento de Nla\ \ \ dentro del fragmento de DNA de 1 75 bp. Siguiendo la electroforesís, esta resulta en fragmentos de tamaños de 80 bp, 54 bp y 41 bp. Sin embargo, donde está ausente la mutación del sitio de empalme, la incubación con Nla\ \ \ resulta en la d igestión solamente en el sitio de reconocimiento 1 . Sig uiendo la electroforesis, esta resulta en los fragmentos de 1 34 bp y 41 bp. El sitio de reconocim iento de ?//al l l invariable 1 sirve como un control interno para aseg urar que la digestión completa ha tenido lugar. Los resu ltados de este análisis de PCR RFLP están ¡lustrados en la Figura 4C. El análisis se realizó en los fragmentos amplificados de los clones, los cuales ya sea portan la mutación de sitio de empalme (campo 2) o portan la secuencia del sitio de empalme normal (campo 3) . El campo 4 muestra el resultado del análisis, donde se usó el DNA amplificado del DNA genómico de un animal de color. El campo 5 muestra las bandas resultantes donde se probó un animal blanco. La prueba se usó para analizar 1 21 individuos de siete d iferentes razas de cerdos. La m utación de sitio de empalme se encontró solamente en los 97 animales con el fenotipo blanco dominante (//- o l*(i) y ninguno de los 24 ejemplos coloreados (lp o /') (Tabla 2). Este análisis confirma que / e /* son únicos, ya que son los únicos alelos que portan la mutación de sitio de empalme.

TABLA 2 Distribución de la m utación de sitio de empalme entre las diferentes razas y fenotipo de piel Raza Color de Genotipo Animales KIT normalmente Mutación de piel supuesto1 probados empalmado2 empalme2 Large White Blanco l/- 33 33 33 Landrace Blanco l/- 56 56 56 Hampshire Coloreado i/i 5 5 0 Duroc Coloreado i/i 5 5 0 Pietrain Coloreado í/i 8 8 0 Meishan Coloreado i/i 5 5 0 Jabalí Coloreado i/i 1 1 0 Jabalí Blanco VI- 8 8 8 x Large White Totales Blanco l/- 89 89 89 Blanco l*/- 8 8 8 Coloreado i/i 24 24 0 Los animales blancos pueden ser homócigos o heterócigos para el alelo I 2 Presencia de la mutación de sitio de empalme determinada por la prueba de PCR RFLP con Nla\ \ \ Ejemplo 4 Como la mutación de sitio de empalme está presente solo en una de las regiones duplicadas de / y no en la región duplicada de lp, puede esperarse que los diversos genotipos tengan los atributos descritos en la Tabla 3.

TABLA 3 Genotipo Copias de KIT Copias de KIT Proporción de KIT normal conten iendo la normal a KIT mutante m utación de em palme de em palme l/l 2 2 1 : 1 l/i 2 1 2: 1 i/i 2 0 2: 0 l/lp 3 1 3: 1 l /i 3 o 3:0 Debido a la dominancia del alelo /, tres de los genotipos en la Tabla 2 son portados por animales blancos, y en consecuencia no pueden ser identificados por la caracterización fenotípica. La cuantificación de las cantidades relativas del gene KIT normal y el gene KIT mutante de empalme permite que se calcule la proporción entre los dos, y por lo tanto, que se pueda predecir el genotipo de animales individuales. Esto se logró mediante la cuantificación de dos fragmentos de DNA sig uiendo la digestión de Nla\ \ \ . La cantidad de fragmento de 1 34 bp, representativo del gene KIT normalmente empalmado, y del fragmento de 54 bp, representativo del KIT mutante de empalme, se midió siguiendo la electroforesis usando el programa de cómputo GeneScan. i . PCR para producir DNA para cuantificación Como se describió en el ejemplo 2, sección i. El in iciador inverso KIT35 es marcado con el colorante fluorescente de AB l FAM en el extremo 5' . ii . Digestión de enzima de restricción Como se describió en el ejemplo 2 , sección ii. ¡ii . Electroforesis y cuantificación de los fragmentos de DNA Siguiendo la digestión , se mezclaron 0.5 µl del volumen de reacción con 2.5 µl de formamida deionizada, 0.5 µl de DNA GS350 estándar (ABl) y 0.4 µl de solución de dextrano azul antes de ser calentada a 90°C durante 2 minutos y enfriarse rápidamente en hielo. Entonces se cargaron tres µl de esta mezcla sobre un secuenciador 377 ABl Prism y los fragmentos de DNA se separaron en un gel de poliacrilamida 6% en 1 X amortiguador TBE durante 2 horas a 700 V, 40 mA, 32 W. El área pico de los fragmentos representativos de ambas formas de KIT normal y mutante de empalme, se cuantificaron usando el programa de cómputo GeneScan (ABl) . iv. Cálculos de proporciones El valor de área pico del fragmento de 1 34 bp (KIT normal) se dividió por dos veces el valor de área pico del fragmento de 54 bp (KIT de mutante de empalme) con el fin de calcular el valor de proporción para cada muestra. v. Resultados El análisis se realizó en animales h íbridos de jabal í sueco/Large White para la cual se han determinado los genotipos en / medíante experimentos de cruza convencionales con marcadores enlazados. La Fig ura 5 y la Tabla 4 muestran la proporción de KIT normal a mutante para anímales de cada una de las tres clases de genotipos, /// (proporción esperada 1 : 1 ) , /// (proporción esperada 2 : 1 ) e l/lp (proporción esperada 3: 1 ) . Los resultados son completamente consistentes con los valores de proporciones esperadas e indican q ue las tres clases de genotipos pueden disting uirse usando este método.

TABLA 4 Proporción de las dos formas de KIT en d iferentes genotipos blancos dominantes en un híbrido de jabalí/Large White Genotipo Fenotipo Proporción esperada Proporción observada Número (normal: mutante) (normal: mutante) ±SE probado Blanco T? 1 .1 5+0.075 ?3 l/lp Blanco 3: 1 3.1 1 ±0.084 1 2 l/i Blanco 2: 1 2.23±0. 1 09 14 La Figura 5 ilustra que el rango de valores de proporción calculados para los dos genotipos /// el/lp no se traslapan . Esto permite identificar animales que portan el alelo de lp y determ inar la frecuencia del alelo dentro de diferentes razas de cerdos. Se calcularon los valores de proporciones para 56 animales Landrace y 33 Large White, y los resultados se muestran en la Figura 6. Se observa una distribución claramente bimodal con 7 individuos Landrace y 3 Large White, teniendo un valor de proporción de aproximadamente 3 o mayor, sugiriendo que son portadores heterócigos para el alelo lp (genotipo ///") . Esto significa que lp tiene estimados de frecuencia de genes de 6.25% (7/1 1 2 cromosomas probados) y 4.5% (3/66 cromosomas probados) dentro de las razas Landrace y Large White, respectivamente.

Ejem plo 5 Análisis por la presencia y cuantificación de la mutación de empalme de KIT porcina usando la q u ímica PE ABl Taq Man Método i. Preparación de DNA de plantilla para PCR Se preparó DNA como en el ejemplo 3, sección i ii. Reacciones de PCR de TaqMan® Las reacciones de PCR de TaqMan® se fijaron como se muestra en la tabla 5.

TABLA 5 Mezcla de PCR para TaqMan® basada en prueba de mutación de empalme Reactivo Conc. finala Volumen 10x Amortiguador A TaqMan® (Perkin Elmer) 1x 2.50 µl 25mM Sola MgCI2 5mM 5.00 µl DATP 200µM 0.50 µl DCTP 200µM 0.50 µl DGTP 200µM 0.50 µl DUTP 200µM 0.50 µl Amplitaq GoldMR (5U/µl) (Perkin Elmer) 0.05U/µl 0.25 µl AmpEraseMR N-Glycosylase (1 U/µl) (Perkin Elmer) 0.01U/µl 0.25 µl KITTM-NEST-F (5µM) 500nM 2.50 µl KITTM-NEST-R (5µM) 500nM 2.50 µl KITTM FAM (5µM) 100nM 0.50 µl KITTM TET (5µM) 100nM 0.50 µl % glicerol 8% 8.00 µl DNA genómico porcino 1.00 ul 25.00 µl Los iniciadores de PCR usados fueron como se describe a continuación: KITTM-Nest-F (5'-CTC CTT ACT CAT GGT CGA ATC ACA-3') y KITTM-Nest-R (5'-CGG CTA AAA TGC ATG GTA TGG-3') .

Las sondas TaqMan® usadas fueron : KITTM-A FAM (5'-TCA AAG GAA ACÁ TGA GTA CCC ACG CTC-3') y KITTM-G TET (5'-TCA AAG GAA ACG TGA GTA CCC ACG C-3') Las sondas Taq Man® fueron preparadas por Perkin Elmer y se marcaron con FAM y TET as í como el grupo de extinción estándar TAMRA. El amortiguador A 1 0x Taq Man®, Amplitaq GoldM R, AmpErase N-Glycosylase, NTP's y 25 mM MgCI2 usados fueron parte del conjunto de reactivos TaqMan® PCR Core, suministrados por Perkin-Elmer. Las reacciones fueron colocadas entonces en un Perkin Elmer ABl Prism 7700 Sequence Detector y la reacción se realizó usando el siguiente perfil térmico, 50°C d urante 2 minutos, 95°C durante 1 0 minutos, seguido por 40 ciclos de 95°C 1 5s, 62°C 60s. Las reacciones se realizaron bajo el control 'del programa de cómputo del 'Sequence Detector V. 1 .6' usando las opciones 'Sigle Repórter' y ' Real-Time' con la función 'Spectral Compensation' activada . Sobre la terminación de la corrida, se examinaron los perfiles de tiempos reales para cada muestra, se exam inaron en el ABI7700 para verificar cualquier m uestra dando perfiles altamente irregulares, los cuales fueron excluidos entonces. Los umbrales para ambos colorantes, Fam y Tet, fueron fijados de manera que interceptaban cada colorante durante la fase exponencial de PCR. Siguiendo la actualización de los cálculos en el programa de cómputo 'Sequence Detector V.1 .6', los resultados fueron exportados a MS Excel para análisis adicional. ni. Análisis de resultados Con base en el principio teórico subyacente que un ciclo de PCR da una duplicación en la cantidad de corte del colorante de extinción de la sonda específica de alelo, y por lo tanto duplica la señal , uno esperaría que los números de ciclos de umbral de los genotipos I I e l i analizados sea como se muestra a continuación : TABLA 6 Resultados teóricos para anál isis TaqMan® de genotipo en la mutación de empalme de KIT Genotipo Copias de KIT 1 Copias de KIT 2 Ct teórico Ct teórico (G) (A) TET (G) FAM (A) I I 2 2 X Y l i 2 1 X Y+ 1 En teoría , Ct para las señales de TET y FAM , representados como X y Y deberían ser iguales, ya que deberían estar presentes números iguales de copias de las secuencias objetivo en un animal //. Sin embargo, en la práctica esto no necesariamente ocurre debido a las diferencias en la hibridación y eficiencia de corte de las dos sondas y la variación en el ajusto del ciclo de umbral entre las dos señales de colorantes. La reducción en las secuencias conteniendo (A) de mutante de empalme en relación a aquéllas que no contienen la mutación de empalme (G) en los animales //', es decir una proporción G :A 2: 1 en lugar de 1 : 1 para el genotipo //, debería conducir a la señal de FAM alcanzando el umbral del ciclo 1 después que la señal TET en los animales de genotipo //'. Los resultados reales para las muestras probadas se muestran en la Tabla 7.

Tabla 7 Valores de Ct del análisis de los genotipos II e l i Muestra Genotipo Ct FAM (A) Ct TET (G) Ct FAM - Ct TET 1 / 24.68 22.59 2.09 2 //' 25.98 23.62 2.36 3 li 26.54 25.57 0.97 4 li 37.37 24.78 2.59 5 li 24.94 21 .61 3.33 6 li 25.68 22. 1 3.58 l i promed io=2.49 7 II 22.05 23.78 -1 .73 8 II 24.22 24.59 -0.67 9 II 24. 1 9 23.85 0.34 1 0 II 23.66 23.51 0. 1 5 1 1 II 24.35 22.71 1 .64 1 2 // 22.82 21 .69 1 .1 3 1 3 // 22.84 22.7 0. 14 14 // 23.1 7 22.9 0.27 P romedio=0.20 Sin plantilla 35 35 0 Sin plantilla 35 35 0 Sin plantilla 35 35 0 Sin plantilla 35 35 0 A pesar de la variación alrededor de los valores promedio puede verse a partir de la Tabla 7, que hubo un retraso significativamente incrementado en la señal FAM alcanzando el nivel de umbral (aproximadamente 2 ciclos) en relación a la señal TET en animales //' com parado con animales // como se predijo, reflejando el número reducido de copias de la secuencia de mutante de empalme (A) presente en animales del genotipo //'. El graficado de las muestras individuales en una g ráfica de dispersión (Figura 7) muestra el agrupamiento de los dos genotipos con el grupo //' desplazados a lo largo del eje de Ct FAM debido al reducido número de copias de la secuencia de KIT2 (A) , para la cual es específica la sonda FAM .

Claims (9)

RE IVI N DI CACIONES

1 . Un método para determinar el genotipo de color de piel en un cerdo, el cual comprende: (a) obtener una muestra de ácido nucleico de cerdo; y (b) analizar el ácido nucleico obtenido en (a) para determinar si una mutación está presente o no en uno o más sitios de empalme de exón/intrón del gene KIT.

2. Un método como se reclama en la reivindicación 1 , en donde el análisis en el paso (b) es realizado para determinar si una mutación está presente o no en el l ímite de exón 1 7/intrón 1 7.

3. Un método como se reclama en la reivindicación 2 , en donde la mutación consiste de la substitución de G del par GT conservado por A.

4. U n método como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la muestra de ácido nucleico es amplificada antes del análisis.

5. Un método como se reclama en la reivindicación 4, en donde el ácido nucleico es DNA genómico.

6. U n método como se reclama en la reivindicación 5, en donde la amplificación se realiza usando PCR y al menos un par de iniciadores adecuados.

7. Un método como se reclama en la reivindicación 6, en donde el par de iniciadores adecuado es: 5'-GTA TTC ACÁ GAG ACT TGG CGG C-3'; y 5'-AAA CCT GCA AGG AAA ATC CTT CAC GG-3'.

8. Un método como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en donde después de la amplificación , el ácido nucleico es tratado con una enzima de restricción , seguido por análisis de las longitudes de los fragmentos.

9. Un método como se reclama en la reivindicación 8, en donde el ácido nucleico es tratado con la enzima de restricción ?//al l l . 1 0. Un método como se reclama en la reivindicación 8 o reivindicación 9, en donde se determina la proporción de las long itudes de fragmentos de restricción. 1 1 . Un método como se reclama en la reivindicación 4, en donde el ácido nucleico es mRNA. 1 2. Un método como se reclama en la reivindicación 1 1 , en donde el ácido nucleico es amplificado usando RT-PCR. 1 3. Un método como se reclama en la reivindicación 1 2, en donde se determina la longitud de producto de RT-PCR. 14. U n método para determinar el genotipo de color de piel en un cerdo, el cual comprende el paso de analizar una muestra de proteína KIT de cerdo para determinar si la proteína es la proteína variable de empalme. 1 5. Un conjunto para usarse para determinar el genotipo de color de piel de un cerdo, el cual comprende uno o más reactivos adecuados para determinar si una mutación está presente en uno o más sitios de empalme de exón/intrón del gene KIT. 1 6. Un conj u nto coo se reclama en la reivindicación 1 5, el cual comprende uno o más reactivos para realizar PCR y u no o más pares de iniciadores adecuados. 1 7. Un conjunto como se reclama en la reivindicación 1 6, el cual comprende el siguiente par de iniciadores: 5'-GTA TTC ACÁ GAG ACT TGG CGG C-3'; y 5'-AAA CCT GCA AGG AAA ATC CTT CAC GG-3'. RESU MEN Se proporcionan métodos para determinar genotipos de color de piel en cerdos. En particular, estos métodos se basan en determinar si una mutación está presente o no en uno o más sitios de empalme de exón/intrón del gene KIT. También se describen conjuntos para realizar tales métodos.