MXPA00003561A - Vectores para el suministro de genes y sus usos - Google Patents
Vectores para el suministro de genes y sus usosInfo
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Abstract
La presente invención se refiere a preparaciones de partículas virales infecciosas que incluyen partículas virales las cuales pueden actuar como un virus auxiliador para el virus adeno asociado (AAV), y que incluye partículas que comprenden en ADN (i) que in cluye al menos una secuencia deácidos nucléicos elegida para el suministro a las células huésped de blanco u objetivo, y que codifica además las proteínas y las funciones de replicación las cuales conjuntamente son suficientes, cuando las partículas de la preparación infectan las primeras células huésped de blanco u objetivo, para el montaje y la liberación, desde las primeras células de blanco u objetivo, de las partículas de AAV recombinantes infecciosas que comprenden la secuencia deácidos nucléicos elegida por lo cual las partículas de AAV recombinantes infecciosas son capaces a su vez de infectar las segundas células huésped de blanco u objetivo, y provocar la expresión del ADN (i) en las segundas células huésped de blanco u objetivo.
Description
VECTORES PARA EL SUMINISTRO DE GENES Y SUS USOS
Campo de la Invención
Esta invención se refiere a vectores para el suministro de los genes, a procesos y compuestos intermedios para su preparación, y a procesos en los cuales los mismos son utilizados. La invención en ciertas modalidades proporciona nuevas preparaciones para el suministro del ADN elegido a las células de blanco u objetivo. En ciertas modalidades también se proporcionan nuevos procesos de alto rendimiento para la producción de partículas de virus adeno asociado (AAV) recombinante que llevan el ADN deseado, especialmente el ADN heterólogo. La invención también proporciona nuevas preparaciones de partículas de AAV recombinantes que llevan el ADN elegido para el suministro a las células.
Antecedentes de la Invención y Técnica Previa
Los amplicones del herpes viral ya son conocidos, asi como los vectores basados en ellos: los ejemplo asi como las citas a los documentos publicados Ref.119431 más recientes se dan en la especificación WO 96/29421 (Lynxvale Ltd y Cantab Pharmaceuticals Research Ltd; S Efstathiou, SC Inglis y X Zhang) . Los amplicones del HSV retienen el origen de replicación del HSV y empacan la señal orisS-pac. Se sabe bien que los plásmidos del amplicon del HSV, una vez introducidos junto con el HSV como el virus auxiliador, pueden ser amplificados y empacado en las partículas del HSV. El virus adeno asociado (AAV) se conoce como un parvovirus humano no patógeno y ha sido propuesto para su uso como un vector de transferencia del gen.. Los AAVs recombinantes también ya son conocidos, como se describe por ejemplo en la Patente US 4,797,368 (DHHS: BJ Cárter y JD Tratschin); Patente US 5,139,941 (Univ Florida Res Foundation, N Muzyczka et al); Patente US 5,474,935 (DHSS; S Chatterjee y K K Wong) ;' Patente WO 95/06743 (UAB Research Foundation; J Dong y RA Frizzell) ; y Patente US 5,589,377 (Rhone Poulenc Rorer; J Lebkowski et al). Sin embargo los problemas todavía enfrentaN el desarrollo del rAAV (AAV recombinante) para el suministro de los genes; estos problemas incluyen la baja eficiencia de los sistemas de empacado comunes para la generación de la materia prima de rAAV, y problemas de purificación del virus auxiliador.
M Fend et al, Nature Biotechnology (1997) 15:866-870, describe un par de vectores adenovirales para el suministro y la expresión de los genes, de modo que las células infectadas con ambos vectores liberaron el retrovirus recombinante que luego infectó las células circundantes. Subsiste una necesidad de sistemas de suministro de genes adicionales, especialmente aquellos basados en el virus adeno asociado: y la presente invención busca proporcionar tales sistemas, que tienen varias características de las modalidades y ventajas como se menciona posteriormente.
Breve Descripción de la Invención
De acuerdo con la invención se provee, en primer lugar, una preparación infecciosa de partículas virales de un primer tipo de virus, capaz de actuar como un virus auxiliador para la producción de partículas del virus adeno asociado (AAV) (por ejemplo el virus del herpes simplex o adenovirus) , en las cuales el componente del ácido nucleico incluye una secuencia de ácido nucleico elegida para el suministro a las células de blanco u objetivo, y las cuales codifiquen además a las proteínas y repliquen las funciones las cuales conjuntamente son suficientes, en las primera células infectadas, para ser células infectadas por dicha preparación viral, para permitir el montaje y liberación de partículas infecciosas adicionales del tipo viral, tales como el AAV recombinante, diferentes del primer tipo viral, las partículas adicionales comprenden proteínas y la secuencia del ácido nucleico elegida, y son capaces a su vez de infectar a las segundas células infectadas y provocar la expresión del ácido nucleico elegido en las mismas. En un aspecto la invención proporciona una preparación de . partículas virales infecciosas que incluyen partículas que pueden actuar como un virus auxiliador para el virus adeno asociado (AAV) , e incluye partículas que comprenden el ADN (i) que incluye al menos una secuencia de ácido nucleico elegida para el suministro a las células huésped de blanco u objetivo, y que codifica además las proteínas y que replica las funciones las cuales conjuntamente son suficientes, cuando las partículas de la preparación infectan las primeras células huésped de blanco u objetivo, para el montaje y liberación, desde las primeras células de blanco u objetivo, de las partículas de AAV recombinantes que comprenden la secuencia de ácido nucleico elegida, por lo cual las partículas de AAV recombinantes infecciosas son capaces a su vez de infectar las segundas células huésped de blanco u objetivo, y provoca la expresión del ADN (i) en las segundas células huésped de blanco u objetivo infectadas. Las partículas virales pueden consistir de, o incluir, las partículas del virus del herpes las cuales puedan ser el virus del herpes defectuoso en la replicación, por ejemplo los virus del herpes inhabilitados genéticamente que carecen de la función de un gen esencial para la producción de nuevas partículas del virus del herpes infecciosas cuando el virus del herpes infecta una célula huésped normal, véase por ejemplo WO 92/05263 (Immunology Ltd: SC Inglis et al) y WO 94/21807 (Cantab Pharmaceuticals: Inglis et al). Una célula huésped normal generalmente es una célula que no contiene elementos recombinántes propuestos para suplementar las funciones del virus defectuoso, las cuales son no naturales para las células del tipo paternal de la célula huésped. Tales partículas de AAV recombinantes defectuosas en la replicación como se describieron y refirieron aquí, que contienen el ADN heterólogo para el suministro a una célula de blanco u objetivo, normalmente no son capaces de ocasionar una generación adicional de partículas de AAV cuando las mismas infectan una célula de blanco u objetivo, la cual es usualmente una célula huésped normal, por ejemplo una célula de un tejido de un mamífero humano o no humano tratado. La invención en ciertas modalidades puede proporcionar o contribuir a los siguientes objetivos: Los ejemplos de la presente invención pueden proporcionar la ubicación como blanco del ADN elegido para una gama de células de blanco del huésped que rodean las células de blanco del huésped infectadas inicialmente por la preparación del vector, para permitir la expresión de dicho ADN en las células circundantes. Los ejemplos del sistema pueden proporcionar el suministro y la expresión de los genes del ADN elegido en las células que no llegan a ser infectadas inicialmente por las partículas virales de la propia preparación. Los ejemplos del sistema pueden hacer posible la expresión del ADN elegido en las células que por sí mismas no llegan a ser infectadas por las partículas virales de la propia preparación administrada, y por lo tanto no son infectadas por las partículas virales del mismo tipo que las partículas de la preparación administrada, y por lo tanto no llegan a ser el blanco, o no el blanco primario, de cualquier respuesta inmune contra las partículas virales de la preparación administrada, por ejemplo una respuesta inmune anti herpes. Los ejemplos de la invención hacen posible que la infección por rAAV se lleve a cabo en la ausencia de la administración sistémica de las partículas de rAAV, y esto puede ayudar al escape inicial al menos de las células de blanco u objetivo primarias de una respuesta inmune anti AAV. Los ejemplos de la invención pueden proporcionar productos de rAAV libres o virtualmente libres de las partículas del virus auxiliador, por ejemplo libres de partículas del virus auxiliador competentes en la replicación. Los ejemplos de las técnicas son aplicables al suministro de partículas únicas de más de un componente que va a ser suministrado a las células de blanco u objetivo. Los ejemplos de la técnica son aplicables para proporcionar la inmunoestimulación del suministro de los genes de citocina sin la necesidad de transfectar/infectar las células de larga vida con los genes de citocina, es decir asegurando que las células que expresan el inmunoestimulante sean células infectadas por una infección del virus, por ejemplo con rAAV, que asegurarán la muerte celular.
Los ejemplos de la técnica son aplicables a la verificación de la expresión del (de los) gene(s) suministrado (s) por la preparación del vector, por ejemplo cuando el ADN heterólogo de la preparación del vector comprende un gen reportero. Las preparaciones de acuerdo con los ejemplos de la invención son aplicables al suministro de los genes sobre una gama útil y amplia de los huéspedes. Los ejemplos de las preparaciones pueden dar un rendimiento útil del rAAV o su producto de expresión de la segunda generación en aproximadamente 24-48 horas desde la infección por el virus del herpes o el amplicon. Los ejemplos alternativos de las preparaciones pueden estar basados en el adenovirus recombinante. Los ejemplos de las preparaciones de acuerdo con la invención pueden ser utilizadas en terapia, para infectar las células in vivo y para producir la expresión de tal ácido nucleico elegido, por ejemplo para expresar un antígeno para el cual un gen de codificación está presente en la preparación, para evocar una respuesta inmune. Las técnicas de terapia de los genes provistas por los ejemplos de la invención pueden ser por ejemplo una terapia correctiva del gen o técnicas de suministro de los genes para reemplazar un gen defectuoso o faltante en una célula de blanco u objetivo, o pueden ser técnicas '#-*•
de in unoterapia del gen para expresar un gen propuesto para evocar o modular una respuesta inmune deseada. El ADN elegido para el suministro a, y la expresión en, las células de blanco u objetivo, puede
comprender el ADN que codifica uno o más genes heterólogos, por ejemplo los genes que codifican los antígenos, tales como los antígenos específicos para el tumor, o que codifican las citocinas u otros agentes inmunoestimulatorios u otras proteínas
inmunomodulatorias; por ejemplo como se mencionó y se citó en WO 96/26267 (Cantab Pharmaceuticals; Inglis et al) . El ADN elegido puede codificar si se desea un gen terapéutico, por ejemplo un gen propuesto para que sea suministrado y expresado para corregir una deficiencia
genética en una célula o tejido de blanco u objetivo. El ADN elegido también puede codificar una secuencia de ADN regulatoria, tal como un factor de transcripción, o una secuencia promotora específica del tejido (por ejemplo el promotor de albúmina el cual dirige la expresión del gen
específica del hígado, o el promotor de enolasa de las neuronas, el cual dirige la expresión del gen específica de las neuronas), siempre que el tamaño del inserto de ADN heterólogo completo sea de un tamaño capaz de ser empacado en las partículas de rAAV, por ejemplo
usualmente hasta aproximadamente 4.5kb. La presencia de una secuencia promotora específica del tejido para dirigir la expresión del ADN de blanco u objetivo a los tipos de célula específicos puede ser altamente útil, porque el propio vector del virus adeno asociado tiene un tropismo del tejido amplio. En ciertas modalidades, la invención proporciona por ejemplo una preparación de partículas virales de un primer tipo de virus el cual es una preparación del herpes viral o una preparación del amplicon del herpes viral el cual (a) es defectuoso en la replicación con respecto a la producción de nuevas partículas del herpes viral infecciosas o nuevas partículas del amplicon del herpes viral, y el cual (b) comprende (i) el ADN el cual es heterólogo con respecto a AAV, por ejemplo hasta aproximadamente 4.5 kb de tamaño, y flanqueado por la secuencias de ITR de AAV, y (ii) el ADN que codifica los genes rep y cap codificados al menos en parte en una posición diferente de aquella flanqueada por las secuencias de ITR de AAV, en donde tanto (i) como (ii) están colocados con relación a un origen de replicación del herpes viral (oriS) y opcionalmente también una señal de empaque del herpes viral (pac) de modo que los mismos sean replicables dentro de una célula infectada por la preparación, de tal modo que cuando las primeras células son infectadas con la preparación, las mismas no puedan conducir a nuevas partículas infecciosas del virus del herpes o del amplicon del herpes viral, pero las mismas puedan conducir a partículas de AAV recombinantes que comprenden el ADN como se describió anteriormente en (i), empacadas en la proteína de recubrimiento de AAV, que constituye las partículas de AAV recombinantes, y de tal modo que dichas partículas de AAV recombinantes, después de su liberación de las primeras células, puedan infectar las segundas células, pero no puedan conducir a nuevas partículas del virus infecciosas desde las segundas células. En tal preparación, el ADN (i) y el ADN (ii) pueden ser codificados por los mismos o diferentes amplicones del herpes viral incluyendo las secuencias oriS y pac. El resultado en tales ejemplos, puede ser que el (los) gen (es) para el suministro todos pueden codificados en el ADN del amplicon. El ADN (i) y el ADN (ii) pueden ser codificados por ejemplo en el mismo amplicon del herpes viral. Alternativamente, el ADN (i) puede ser codificado por un primer amplicon del herpes viral y el ADN (ii) codificado por un segundo amplicon del herpes viral. Sin embargo, no es necesario utilizar amplicones. Una clase alternativa de preparación de acuerdo con la invención puede comprender el ADN ( i ) indicado anteriormente y el ADN (ii) indicado anteriormente, ambos codificados por el virus del herpes mutante infeccioso (por ejemplo los diferentes virus del herpes mutantes respectivos para el ADN (i) y (ii), que tienen un genoma mutante que carece de un gen esencial para la producción de nuevas partículas del virus del herpes, pero generalmente no esenciales para la expresión de las proteínas del herpes viral en una célula infectada por el virus del herpes. En una alternativa adicional, rep y cap pueden ser codificados en un mutante del herpes viral DISC, es decir uno que carece de un gen esencial para la producción de nuevas partículas del virus del herpes infecciosas, el virus del herpes mutante, con otro ADN para el suministro codificado en un amplicon; por consiguiente, el ADN (i) puede ser codificado por un amplicon del herpes viral y el ADN (ii) codificado por un mutante del herpes viral DISC, o viceversa. Los elementos de (i) y/o (ii), en donde los mismos son codificados en el mutante del virus del herpes DISC, pueden ser insertados en el sitio de deleción del gen herpesviral esencial. En ciertos ejemplos importantes, un gen inmunoestimulador por ejemplo un gen que codifica la IL-2 u otra citocina, u otro gen inmunomodulatorio, o un gen que codifica un antígeno, o un gen que codifica una proteína terapéutica, por ejemplo que codifica el Factor VIII o IX, para el suministro a y la expresión en una célula que carece de tal gen, y/o un gen reportero, por ejemplo gfp o Lac Z, también puede ser insertado, especialmente por ejemplo en el virus del herpes mutante o el (los) amplicon (es) herpesvirales . Ciertos ejemplos de la invención pueden incorporar la funcionalidad de integración, por ejemplo en la forma de una preparación como se describió anteriormente, en donde el ADN (i) el cual es heterólogo con respecto a AAV, por ejemplo de hasta aproximadamente 4.5 kb de tamaño, y flanqueado por secuencias de ITR del AAV, está acompañado por el gen rep de AAV o por una subsecuencia del gen rep que es suficiente para provocar la integración de dicho ADN (i) en el ADN de las segundas células infectadas por las partículas de AAV recombinantes . De acuerdo con un aspecto de la invención, también se proporciona una preparación de los genomas de AAV (virus adeno asociado) recombinantes que comprenden el ADN heterólogo y empacados en la proteína de recubrimiento de AAV, los cuales pueden estar libres por ejemplo del virus auxiliador, y/o libres del adenovirus. Las preparaciones pueden estar libres por ejemplo del virus auxiliador competente para la replicación, infeccioso. Las mismas pueden contener el virus del herpes defectuoso en la replicación pero preferentemente están libres del virus del herpes competente en la replicación. La invención también proporciona un . método de producción de los genomas de AAV recombinantes, por ejemplo uno que está libre del virus auxiliador competente en la replicación, que comprende el ADN heterólogo y empacados en la proteína de recubrimiento de AAV, que comprende los pasos de:' (i) proporcionar un virus del herpes con un genoma que carece de un gen que es esencial para la producción de nuevas partículas del virus del herpes infecciosas, pero no esenciales para la expresión general de las proteínas herpesvirales, y las cuales se han hecho crecer por cultivo sobre células hechas recombinantes y capaces de expresar la función del gen viral que está faltando en el genoma herpesviral;
(ii) proporcionar un amplicon herpesviral que comprende un gen rep y cap de AAV, y los ITRs colocados para flanquear el ADN heterólogo que se desea que sea incorporado en una partícula de AAV recombinante; (iü) utilizar el virus del herpes de (i) y el amplicon de (ii) para infectar las células que no expresan la función del gen que está faltando en el genoma herpesviral, y (iv) colectar de las células infectadas en (iii) los genomas de AAV recombinantes que comprenden el ADN heterólogo y empacado en la proteína de recubrimiento de AAV, preferentemente libre del virus auxiliador competente en la replicación. La invención también proporciona varias preparaciones de las partículas de AAV recombinantes, por ejemplo: una preparación de gen?mas de AAV recombinantes que comprende el ADN heterólogo por ejemplo de hasta aproximadamente 4.5 kb de tamaño, flanqueada por secuencias de ITR de AAV y empacadas en la proteína de recubrimiento de AAV, por ejemplo libre del virus auxiliador, y/o libre del adenovirus, y/o libre del virus auxiliador competente en la replicación, infeccioso, y/o que contiene el virus del herpes defectuoso en la replicación pero libre del virus del herpes competente en la replicación u otro virus auxiliador.
La invención también proporciona procesos para la producción de partículas de AAV recombinantes, por ejemplo un método de producción de genomas de AAV recombinantes (por ejemplo libres del virus auxiliador competente en la replicación) que comprenden el ADN heterólogo por ejemplo de hasta aproximadamente 4.5 kb de tamaño, flanqueado por las secuencias de ITR de AAV y empacados en la proteína de recubrimiento de AAV, en el cual el proceso comprende los pasos de: (i) proporcionar un virus del herpes con un genoma que carece de un gen que es esencial para la producción de las. partículas del virus del herpes nuevas, infecciosas, pero no esenciales para la expresión general de las proteínas herpesvirales, y las cuales se han hecho crecer por el cultivo sobre células hechas recombinantes y capaces de expresar la función del gen viral que está faltando en el genoma herpesviral; (ii) proporcionar al menos un amplicon herpesviral que comprende además de un gen rep y cap de AAV, las secuencias de ITR de AAV colocadas para flanquear el ADN heterólogo que se desea que sea incorporado en una partícula de AAV recombinante; (iii) utilizar el virus del herpes de (i) y el amplicon de (ii) para infectar las células que no expresan la función del gen que está faltando en el genoma herpesviral, y (iv) colectar de las células infectadas en
(iii) los genomas de AAV recombinantes que comprenden el ADN heterólogo y empacadas en la proteína de recubrimiento de AAV, preferentemente libres del virus auxiliador competente en la replicación. De acuerdo con las modalidades alternativas de la invención, los ejemplos tales co o aquellos con las características que se describieron anteriormente, pueden ser llevados a cabo utilizando el adenovirus como el virus auxiliador, en lugar del virus del herpes. Los ejemplos de los procesos y materiales útiles con relación a llevar a cabo la presente invención son descritos de manera adicional posteriormente, a manera de ilustración solamente y no para limitación. Los ejemplos de las líneas celulares y los virus que se pueden utilizar con relación a la invención son como sigue: las células Vero y BHK se pueden obtener de la European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC
No. 88020401 y No. 85011423 respectivamente; Portón Down,
UK) . La construcción de las células CR-1 y BHK,TK',gH+ ha sido descrita por MEG Boursnell et al, (1997) J Infect
Dis 175(1) pp.16-25; y X Zhang et al, (1998) J Gen Virol 79(1) pp.125-131. Estas líneas celulares incorporan el gH que codifica el gen de HSV-1 y pueden servir por lo tanto como células de complemento para hacer crecer el HSV delecionado en gH el cual, en las células que no son de complemento, es un virus de un solo ciclo infeccioso, inhabilitado (DISC-HSV) . Las células de CR-1 se pueden hacer crecer en el suero del bovino fetal DMEM (FCS) y las células BHK se pueden hacer crecer en el Medio de Eagle Modificado de Glasgow suplementado con caldo de triptosa al 5% (GMEM) y FCS al 10%. Las células 293 se pueden obtener de ATCC (CRK 1573) y se pueden hacer crecer en DMEM suplementado con FCS al 10%. La cepa SC16 de HSV-1 es un material aislado clínico bien conocido. Entre las cepas de HSV inhabilitadas genéticamente que pueden ser utilizadas como el virus auxiliador para generar los materias primas tanto de rAAV como del amplicon, está un mutante dé la deleción derivado utilizando la técnica conocida per se de la cepa SC16 de HSV-1, y que tiene una deleción que cubre la región gH y par del gen de timidina cinasa (TK) . Los materias primas del virus DISC se pueden hacer crecer y se titulan o concentran sobre las células CR-1. Un adenovirus delecionado en Ela y E3 mutante, es un mutante bien conocido, y se puede hacer crecer y se titula o concentra sobre las células 293.
Suministro del gen in vitro:
El suministro del gen utilizando las construcciones del vector de acuerdo con las modalidades de la invención se puede llevar a cabo por ejemplo como sigue: El suministro de genes utilizando los vectores descritos aquí puede ser llevado a cabo por ejemplo in vitro, por ejemplo utilizando el DISC-AAV-gfp, un virus del herpes inhabilitado recombinante que contiene las secuencias de rAAV y también el gen reportero de gfp; o utilizando el amplicon pHAV6.6 , un plásmido del amplicon de AAV que lleva los genes rep y cap y los ITRs, y los cuales también contienen el gen de GFP. La construcción de ambos de estos vectores se describe con mayor detalle aquí. El gen de GFP es útil para propósitos de investigación, y para otros propósitos análogos de los vectores pueden ser construidos fácilmente utilizando los genes deseados correspondientes diferentes de GFP, por ejemplo un gen terapéutico, por ejemplo un gen que codifica el factor IX (flX) . Las células Vero pueden ser infectadas con 5 pfu/célula de DISC-AAV-gfp de la unidad de infección 5
(IU) por célula de la materia prima del amplicon pHAV-6.6. El paso de infección se puede llevar a cabo durante 20 minutos a 37 °C. Las células pueden ser centrifugadas entonces y lavadas dos veces con 50 mi del medio. Las células infectadas pueden volver a ser suspendidas y mezcladas con las células Vero no infectadas a una relación de 1:100. Las células mezcladas pueden volver a ser sembradas en los recipientes para el cultivo del tejido con el medio que contiene 0.5% de FCS. Las células pueden ser verificadas con microscopía fluorescente de UV, por ejemplo diariamente, para verificar la aparición de la fluorescencia verde y la dispersión de la fluorescencia a las células circundantes. El día uno después de que las células mezcladas son sembradas nuevamente, muchas células fluorescentes únicas pueden ser observadas dispersas a través del campo en su mayoría oscuro del microscopio de fluorescencia. Estas células normalmente son aquellas infectadas originalmente por el GFP que contiene los vectores de HSV, y pueden ser llamadas las células de siembra. Estas células pueden utilizarse para producir la progenie de rAAV. En el día dos, la configuración de fluorescencia es similar a aquella observada en el día uno. Sin embargo, en el día tres después del sembrado de las células, las células que rodean estas células de siembra se puede observar que empiezan a mostrar una emisión fluorescente verde. Esta difusión de fluorescencia ocurre en las células a través de las capas múltiples de las células próximas, con las células más cercanas a las células de siembra que tienen la emisión fluorescente más intensa. Bajo el microscopio la configuración fluorescente total de un número de especímenes de prueba parece que tiene algo la forma de un manojo de uvas. Esta configuración fluorescente se puede observar que permanece sin cambio para los siguientes pocos días si un cultivo de prueba es mantenido sin pasar, y antes de que la vida de las células en el cultivo de prueba no pasado, expire. Tanto el DISC-AAV-gfp recombinante como el amplicon pHAV-6.6 no tienen la propiedad de difusión de célula a célula en el cultivo de las células Vero: la dispersión fluorescente verde observada en el arreglo de prueba descrito justo arriba es una evidencia de la dispersión del rAAV producido de las células designadas anteriormente como las células de siembra, rAAV las cuales se introducen entonces en las células próximas y suministran el gen de FGP en estas células. La conformación adicional de esto puede ser obtenida por pruebas en las cuales los vectores que contienen rAAV, pero sin una secuencia de rep-cap, pueden ser empleados para llevar a cabo el experimento correspondiente. En este caso ningún rAAV es producido de aquellas células infectadas inicialmente por análogos de cualquiera del DISC-AAV-gfp o pHAV-6.6 los cuales carecen de los genes rep y cap. En las pruebas llevadas a cabo hasta la presente solicitud, la difusión o dispersión de la fluorescencia como en el experimento descrito anteriormente no es observada. Como se esperaba, no se observó ninguna difusión fluorescente durante hasta 5 días después de que el cultivo celular mezclado inicial es establecido. Este resultado confirma adicionalmente la conclusión de que el rAAV producido de las células de siembra infectadas de la primera etapa (utilizando los vectores rep + cap) se dispersaron a las células circundantes. Por. consiguiente el suministro de genes de dos etapas puede ser mostrado in vitro.
Suministro de genes de dos etapas in vivo:
El suministro de genes de dos etapas puede ser mostrado en el tejido viviente llevando a cabo un análogo del procedimiento precedentes in vivo utilizando el ratón como un modelo de animal . Un procedimiento ex vivo se puede llevar a cabo como sigue: En este procedimiento, una línea celular de fibroblastos del ratón L929 puede ser infectado in vitro con 5 pfu/célula de cualquiera de DISC-AW-gfp, DISC-AW-fiX, o las construcciones de amplicon pHAV-6.6 y pHAV-6.8, respectivamente. La infección se puede hacer a 37 °C durante 20 minutos. Luego las células pueden ser lavadas completamente con el medio. Después de esto las células tratadas pueden ser inyectadas en los ratones subcutáneamente. La expresión del gen puede ser verificada ya sea por ejemplo examinando las secciones del tejido para GFP bajo la microscopía fluorescente de UV en el caso de tratamiento con las construcciones que contienen el gen de GFP, o por medio de teñido inmunohistoquímico para la proteína del factor IX en el caso del tratamiento con las construcciones que contienen el gen del factor IX. La expresión del gen del factor IX también puede ser verificada por el ensayo de ELISA de rutina para el factor IX sobre las muestras de sangre colectadas de los animales experimentales. El suministro del gen de dos etapas in vivo puede ser mostrado ya sea por la aparición de una configuración de difusión de GFP similar a aquella mostrada in vitro, o por la expresión del factor IX a largo plazo en la sangre colectada de los animales.
Utilización de DISC-AAV y amplicon-AAV para la generación de la materia prima de rAAV:
Las construcciones de DISC-AAV y del a plicon-WA como se describen aquí pueden ser utilizadas para generar materias primas del virus adeno asociado recombinante (rAAV) de alta concentración, las cuales pueden estar libres o virtualmente libres de la contaminación del virus auxiliador. Un problema que enfrenta el desarrollo del rAAV
(AAV recombinante) para la terapia de genes humanos ha sido la eficiencia baja de los sistemas de empacados disponibles comunes para la generación de materias primas de rAAV. Un método utilizado comúnmente para la generación de los vectores de rAAV comprende la cotransfección de un vector rec?mbinante que contiene la secuencia de rAAV junto con un plásmido de empaque, en las células tales como las células 293 bien conocidas y disponibles. Las células son infectadas subsiguientemente con el adenovirus, para servir como un virus auxiliador para la fase lítica del AAV de la infección. El plásmido del vector puede contener un gen de interés y los elementos de control de la transcripción, flanqueados por los ITRs. El plásmido de empaque puede contener las secuencias del genoma de AAV excepto que la secuencia de ITR. En las células transfectadas, el genoma de rAAV flanqueado por los ITRs es escindido, replicado, y encapsidado en las partículas virales compuestas de las proteína cap provistas en trans a partir del plásmido de empaque. El virus auxiliador utilizado en este sistema de empaque ha sido por ejemplo el mutante de la delección del adenovirus El. Los problemas con tal sistema de empaque común incluyen: (1) el mismo puede dificultar la generación de materias primas con una concentración elevada de rAAV. Un campo típico de rAAV de este sistema puede ser de aproximadamente 105 unidades formadoras de colonias (cfu) por placa de cultivo de 10 cm. Por lo tanto, para obtener una cantidad suficiente del rAAV para un estudio de rutina, típicamente más de 100 placas puede ser necesario que sean transfectadas, lo cuál puede consumir mucho tiempo y un trabajo intenso. El virus colectado puede tener que ser concentrado por cromatografía en columna de modo que la concentración pueda ser lo suficientemente elevada para su uso. (2) Las materias primas generadas de esta manera no pueden ser expandidas normalmente por el paso adicional. Cada materia prima normalmente tiene que ser generada ab initio, es decir por transfección. (3) La contaminación del adenovirus auxiliador infeccioso (con la contaminación potencial del adenovirus wt): puede significar en la práctica que se requieren procedimientos de separación extensos a continuación de la preparación de la materia prima. Rutinariamente, tres rondas de ultracentrifugación de densidad flotante pueden ser requeridas para remover el virus auxiliador contaminado a un nivel no detectable. Tal procedimiento de purificación no solamente es consumidor de tiempo, sino que también provoca la pérdida significativa de la concentración del rAAV. Una dificultad parece que radica en la forma de establecer las líneas celulares de empaque, parece que está basado en la citoxicidad de las proteínas rep. Recientemente, las líneas celulares que expresan rep bajo los promotores inducibles (el promotor de metalotionenina o el promotor inducible de Ad) han sido reportadas. Aún en tal línea celular, el adenovi'rus auxiliador todavía es requerido y por lo tanto la contaminación del virus auxiliador permanece como un problema. De acuerdo con una cierta modalidad de la presente invención, el virus del herpes inhabilitado genéticamente tal como el virus que se describió en WO 92/05263 (Immunology Limited: Inglis et al) puede ser utilizado como un virus auxiliador para rAAV (en lugar del adenovirus, porque tanto el adenovirus como el HSV pueden servir como el auxiliador para la infección lítica del AAV) y los amplicones herpesvirales o el virus del herpes inhabilitado pueden llevar genes que codifican el rep de AAV y los capsidos para proporcionar (en trans) la función del empaque de rAAV. Las materias primas de rAAV iniciales pueden ser generadas a través de la transfección o infección viral, por ejemplo y preferentemente por transfección con el ADN del plásmido del amplicon en las células de complemento para DISC-HSV, tales como las líneas celulares de complemento de BHK o Vero. Tales materias primas, de acuerdo con un aspecto de la invención, pueden ser expandidas fácilmente por pasadas subsiguientes a través de la infección de más células de complemento, y esto frecuentemente proporciona una ventaja en la producción. Tales materias primas pueden hacer pasar entonces eventualmente en las células que no son de complemento para el auxiliador herpesviral defectuoso, tales como las células Hela o Vero (que no son de complemento) . Después de una sola pasada en tales células que no son de complemento, el empaque de rAAV no es afectado, pero el virus del herpes defectuoso, infeccioso y los amplicones en tal etapa son retirados fácilmente, de modo que una materia prima puede ser preparada la cual está libre o virtualmente libre de las partículas del virus auxiliador infeccioso. Se contempla que este sistema puede superar las problemas tales como aquellos mencionados anteriormente. Un ejemplo .de un procedimiento experimental detallado útil para la fabricación de las modalidades de la presente invención es como sigue:
las materias primas de rAAV pueden ser generadas de las construcciones de amplicones como sigue: las células BHK,TK-, gH+ pueden ser transfectadas con pHAV-5.8 por lipofectamina (de Gibco BRL). 2 µg del ADN del plásmido del amplicon pueden ser agregados a 200 µl de H20 estéril y 10 µl de lipofectamina pueden ser diluidos 20 veces con H20 estéril. Las soluciones del ADN y la lipofectamina así obtenidas son mezcladas conjuntamente de manera suave y se dejan a temperatura ambiente durante 30 minutos. Luego se pueden agregar 1.6 mi del medio Optimem (como se provisto por el fabricante) a la mezcla de ADN-lipofectamina. Las células pueden ser enjuagadas con un medio libre del suero y la mezcla de ADN-lipofectamina puede ser depositada suavemente sobre las células. Después de la incubación durante 5 horas a 37 °C, la solución de la transfección puede ser removida y reemplazado con 5 mi de GMEM más 5 % de FCS. Las células pueden ser incubadas entonces a 37 °C durante otras 16 horas. Las células resultantes pueden ser infectadas entonces con 1 pfu/célula del HSV defectuoso genéticamente, (particularmente (en donde las células gH+ son utilizadas) el virus gH- HSV1 tal como aquel descrito aquí o en WO 92/05263), durante otras 24 horas. Los virus pueden ser colectados y titulados o concentrados por ensayos en placas para la titulación o concentración del virus auxiliador. Esta materia prima del virus puede ser pasada adicionalmente en las células BHK,TH",gH+ 2-3 veces con la última pasada en las células Vero. Para cada pasada, las células pueden ser infectadas con 1 pfu/célula del virus (con base en la concentración de PS1) . Luego la concentración o titulación de rAAV puede ser concentrada o titulada por ejemplo para propósitos de evaluación infectando las células Vero con una solución del virus diluido en serie y las células positivas a GFP pueden ser contadas bajo microscopía fluorescente de UV. Los resultados preliminares han mostrado que el rAAV con una concentración tan elevada como 1 x 109 puede ser generada a partir del primer paso, es decir la transfección del pHAV-6.6 seguido por superinfección del gH-HSVl. Las materias primas de rAAV también pueden ser generadas a partir del virus recombinante de gH- HSV -AAV, por ejemplo como sigue: las células Vero o Hela pueden ser infectadas con gH- HSV1 que contiene las secuencias AAV-gfp (descritas posteriormente) a 1 pfu/célula durante 1 hora. Luego el medio que contiene 1% de FCS es agregado y la infección es dejada durante otras 24 horas. La colección del virus es titulada o concentrada por el ensayo de placas para verificar la apariencia de DISC-HSV. La titulación o concentración de rAAV puede ser cuantificada de una manera similar como se describió anteriormente. La construcción del vector para los virus del herpes recombinantes se puede llevar a cabo como sigue: El virus adeno asociado AAV recombinante puede ser obtenido utilizando como el material de partida el plásmido pAVl, el cual contiene el genoma de AAV-2 completo, y está disponible públicamente en una base comercial de The American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, bajo el número de depósito ATCC No. 37215. Las siguientes manipulaciones del ADNr pueden ser efectuadas de una manera conocida per se. El genoma de AAV-2 completo puede ser escindido completamente del plásmido pAVl con las enzimas de restricción Bgll y PvuII y clonados en el plásmido puc 119. El plásmido resultante es designado pucAVl. El plásmido pucAVl puede ser digerido conjuntamente con SnaBI y PpuMI, para remover la secuencia de codificación de AAV pero para dejar tanto el 5' ITR (nucleótidos 1-191 de la secuencia de AAV) como el 3' ITR (nucleótidos 4494-4675) intactos. La secuencia resultante puede ser utilizada para construir un plásmido que contiene una secuencia de rAAV con un gen marcador que codifica la proteína fluorescente verde (GFP) . El plásmido pEGFP-Nl, que contiene una versión mejorada de GFP, está disponible comercialmente de Clontech (cat: 6085-1) . Un fragmento del ADN de 3755 pb puede ser generado de la digestión conjunta de pEGFP-Nl utilizando Asel y Bsal, y contiene el promotor de CMV-GFP-poliA así como el cásete de neomicina. Este puede ser clonado por la unión de extremos sin punta en el pucAVl el cual ha sido digerido como se describió anteriormente con SnaBI y PpuMI, de modo que el GFP y el fragmento de ADN que contiene la neomicina sean flanqueados por' los ITRs de AAV. Este plásmido resultante está designado como pTR-CMVgfp. El producto de la digestión de pucAVl también puede ser utilizado para construir un plásmido que contiene rAAV junto con un gen terapéutico de elección. Un gen terapéutico tal como el gen (conocido y disponible per se) que codifica el factor IX de coagulación (para el tratamiento de la hemofilia B) puede ser clonado en el cásete de ITR de rAAV de una manera análoga a aquella descrita anteriormente para GFP. En donde esto es llevado a cabo utilizando el gen para el factor IX, el plásmido resultante puede ser designado pTR-flX. Más generalmente, las secuencias de rAAV se pueden hacer como fragmentos de ADN los cuales contienen, en el siguiente orden, el AAV 5' LTR, un promotor de mamífero adecuado de selección, un gen de interés (tal como el gen de GFP o para el factor IX en los ejemplos descritos hasta ahora) , una señal poli-A y un AAV 3' LTR. Los plásmidos del amplicon de HSV que contienen las secuencias de rAAV pueden ser construidos como sigue: las secuencias de rAAV, hechas como se describieron ante.riormente, con (por ejemplo) ya sea GFP o el factor IX, pueden ser escindidas completamente de los plásmidos respectivos que los llevan por digestión con tanto el pVUI como Asel, y unidos con extremos sin punta en el sitio SapI único én el plásmido pW7TK del amplicon el cual puede ser obtenido como se describe en la solicitud de patente WO 96/29421 (Lynxvale Ltd y Cantab Pharmaceuticals Research Ltd: Efstathiou, Inglis y Zhang) . Los plásmidos del amplicon resultantes pueden ser designados pHAV-5.6 y pHAV-5.8, respectivamente. Los amplicones de HSV que contienen tanto las secuencias de rAAV como las secuencias de codificación de rep y cap de AAV pueden ser construidas por ejemplo como sigue:
Los plásmidos adecuados pueden ser construidos como sigue: Las secuencias de AAV que cubren la región para la codificación de los productos de los genes rep y cap pueden ser retiradas por corte de pAVl por la digestión de Ball y clonados en el sitio Scal de pHAV-5.6 y el sitio de SapI único de pHAV-5.8. Los plásmidos del amplicon resultante pueden ser designados pHAV-6.6 y pHAV-6.8, respectivamente. Las materias primas del amplicon pueden ser generadas como sigue: Inicialmente el ADN del plásmido del amplicon de ya sea pHAV-6.6 o pHAV-6.8 puede ser transfectado en las células CR-1 (células de mamífero de complementación recombinante de gH+ capaces de hospedar el virus gH- HSV1) ya sea por precipitación del fosfato de calcio o por lipofectamina (de Gibco BRL) . Las células pueden ser sembradas un día antes de la transfección en cajas de petri de 5 cm. Para la precipitación del fosfato de calcio, se pueden mezclar 8 µg del ADN con 0.5 mi de solución salada amortiguada con Hepes (HEBS) de pH 7.5 y 70 µl de CaCl2 2M a temperatura ambiente durante 30 minutos. El medio de cultivo puede ser removido y el ADN precipita agregado a las células. Las células pueden ser incubadas a 37 °C durante 40 minutos antes de la remoción de la mezcla de transfección y su reemplazo con 4 mi de GMEM más 5% de FCS. Las células pueden ser incubadas a 37 °C durante otras cuatro horas antes de ser tratadas con 1 mi de DMSO al 25% en HEBS durante exactamente 4 minutos. La solución de DMSO podría ser removida entonces y las células lavadas con un medio libre de suero. 5 mi de GMEM más 5% de FCS pueden ser agregados y las células incubadas a 37 °C durante otras 16 horas. La transfección de lipofectamina puede ser llevada a cabo de acuerdo con las instrucciones del proveedor: 2 µg del ADN del plásmido del amplicon pueden ser agregados a 200 µl de H20 estéril y 10 µl de lipofectamina son diluidos 20 veces con H20 estéril. Las soluciones de ADN y de lipofectamina pueden ser mezcladas de manera conjunta suavemente y se dejan a temperatura ambiente durante 30 minutos. Luego se pueden agregar 1.6 mi del medio Optimem (como se suministró por el fabricante) a la mezcla del ADN-lipofectamina. Las células pueden ser enjuagadas con un medio libre del suero y la mezcla de ADN-lipofectamina se depositan suavemente sobre las células. Después de la incubación durante 5 horas a 37 °C la solución de la transfección puede ser removida y reemplazada con 5 mi de GMEM más 5% de FCS. Las células pueden ser incubadas a 37 °C durante otras 16 horas y luego infectadas con 1 pfu/célula de PS1 durante otras 24 horas. Los virus pueden ser colectados y titulados o concentrados entonces por ensayos de placas. Esta materia prima del virus puede ser pasada adicionalmente en células BHK, TK~, gH+ 2-3 veces. Para cada pasada, las células pueden ser infectadas con 3-5 pfu/célula del virus (basado en la concentración de PS1) durante 1 hora. Luego se puede agregar un medio de selección que contiene 0.6 mM de metotrexato y 1 x TGAG (40 x TGAG: 0.6mM Timidina, 3.8 mM Glicina, 9 mM Adenosina, 1.9 mM Guanosina) y las células infectadas cultivadas a 37 °C durante 24-28 horas antes de la colección y si desea la titulación o concentración. El virus de gH- HSV1 recombinante que contiene las secuencias de codificación tanto de rAAV como de rep-cap de AAV puede ser construido como sigue: Como una etapa intermedia en la construcción de los ejemplos de los vectores de acuerdo con la presente invención, puede ser conveniente construir el virus de HSV delecionante que carece de un gen esencial, por ejemplo gH- HSV-1. En el presente ejemplo, un HSV1 delecionante es fabricado, el cual carece del gen gH de HSV1, y contiene un sitio de Pací en el lugar o locus gH, para facilitar la inserción posterior del ADN heterólogo deseado en el locus o lugar del gen de gH delecionado. Un sitio de restricción de Pací va a ser preferido aquí por su conveniencia a causa de que el mismo no corta el genoma de HSV1 del tipo silvestre. Tal gH- HSV1 mutante puede ser utilizado para los presentes propósitos ya sea para llevar las secuencias rAAV y rep-cap, o como un virus auxiliador para la generación de la materia prima del amplicon. El ADN extraño que va a ser insertado es flanqueado (utilizando las técnicas de manipulación del ADNr conocidas per se) por los sitios de restricción que corresponden a un sitio de restricción conveniente elegido e insertado si es necesario en el sitio de inserción propuesto en el virus (aquí el mismo es un sitio Pací), y puede ser unido entonces en el genoma de gH- HSV1 para generar un nuevo virus recombinante deseado. (Las vacunas basadas en el virus del herpes defectuoso genéticamente que carecen de un gen esencial para la producción de nuevas partículas del virus infecciosas son descritas en WO 92/05263 (Immunology Limited; Inglis et al) y publicaciones más recientes. El gen gH es un ejemplo preferido de un gen de la glicoproteína H (gH) esencial para la deleción en tal virus mutante. Véase también Forrester et al., J. Virol. 66, 341-348, 1992. Una materia prima infecciosa de gH-HSV1 se puede hacer crecer en las células de complemento las cuales expresan el gH endógeno, también descrito en los documentos citados. Las partículas del virus de la progenie pueden resultar de la infección de las células normales (es decir, las células que no son de complemento que no están hechas para expresar el gH viral) pero estas no son infecciosas) . Los plásmidos que van a ser utilizados para la generación de un mutante de deleción de gH- HSV1 pueden ser construidos como sigue: Inicialmente, las secuencias de flanqueo sobre cada lado del gen gH de HSV pueden ser amplificadas del ADN viral de la cepa KOS (M) del HSV-1 por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), utilizando la polimerasa del ADN Vent, y los productos clonados en pUC119 cortados en EcoRI-HindIII. El plásmido resultante puede ser designado plMMB25, y los detalles de un plásmido adicional que va a ser utilizado pueden ser para el plásmido plMMB25 descrito en WO 96/29421, citado anteriormente, e incorporado aquí para referencia) . Un oligonucléotido sintético que comprende las secuencias JMl Oligo 5' CGA TTA ATT AAG TTA ACT AGA AGA CAA TAG CAG GCA TGC TGG GGA TGC GGT TAA TTA AGA3' ; y JM2 Oligo 5' TCT TAA TTA ACC GCA TCC CCA GCA TGC CTG CTA TTG TCT TCT AGT TAA CTT AAT TAA TCG 3'), el cual contiene en su parte media dos sitios de la enzima de restricción Pací, pueden ser clonados en el sitio Hpal de plMMB25, el cual a su vez está localizado en la parte media de las secuencias de flanqueo de gH. El plásmido resultante puede ser designado plMMB-lacZPac. Un cásete de ADN que contiene el promotor de CMV, el gen lacZ y una señal de poliA pueden ser cortados de pAMP-lacZ-ci y clonados en el sitio HapI en plMMB-lacZPac de modo que el mismo esté flanqueado por los sitios Pací. El plásmido resultante puede ser designado plMX-18. El virus recombinante puede ser construido por la transfección del ADN viral del HSV del tipo 1 (cepa se 16) con el plásmido plMX-18. El ADN viral puede ser purificado sobre un gradiente de yoduro de sodio (como se describió en (1976) Virology 74, 256-258). La recombinación se puede llevar a cabo como sigue: una mezcla de transfección puede ser preparada mezclando 5 µg del ADN viral, 0.5 µg del ADN del plásmido linearizado
(linearizado por digestión con la enzima de restricción Scal) en 1 mi de solución amortiguadora HEBS (137 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.7 mM Na2HP04, 5.5 mM glucosa, 20 mM Hepes, pH 7.05). 70 µl de CaCl2 2M pueden ser agregados por goteo, y mezclados suavemente. El medio puede ser removido de un disco o plato de 5 cm subconfluente de CR1 o de células de CR1 y se agregan 500 µl de la mezcla de transfección a cada uno de los dos platos o discos. Las células pueden ser incubadas a 37 °C durante 40 minutos, luego se agregan 4 mi del medio de crecimiento que contiene 5 % de suero de bovino fetal (FCS) . 4 horas después de la adición de la mezcla de transfección, el medio puede ser removido y las células lavadas con el medio libre de suero. Las células pueden ser "sometidas a choques" entonces con 500 µl por plato de 15% de glicerol durante dos minutos. El glicerol es removido entonces, las células lavadas dos veces con el medio libre del suero y el medio de crecimiento que contiene el FCS al 5% agregado . Después de 4-7 días o cuando se observa un efecto citopático viral completo (CPE) , las células pueden ser raspadas del medio, centrifugadas a 2500 rpm durante 5 minutos a 4 °C, y resuspendidas en 120 µl del medio esencial mínimo de Eagles (EMEM) . Este produce ahora una materia prima del virus crudo que contiene el virus recombinante y del tipo silvestre. La materia prima puede ser congelada, licuada y sometida a la acción del sonido y filtrada para los materiales recombinantes sobre las células de CRl en un intervalo usual de diluciones. Después de la adición de las diluciones del virus, las células pueden ser depositadas con el medio que contiene agarosa abajo de la temperatura de gelificación al 1%. Después de la aparición de las placas virales aproximadamente a los 3 días, se puede agregan una segunda deposición de la agarosa que contiene 330 µg/ml de Xgal. Las placas azules pueden ser tomadas, dentro del intervalo de 48 horas, y transferidas a discos de 24 cavidades (1 cm2 por cavidad) que contiene las células CE1. Las placas se puede permitir que crezcan hasta CPE total y se colectan por el raspado del medio. Las rondas múltiples de purificación de la placa se pueden llevar a cabo hasta que una materia prima pura del virus es obtenida o se alcance otra etapa de purificación deseada. La estructura del material recombinante puede ser conformada como sigue: Se puede preparar el ADN viral purificado con yoduro de sodio como anteriormente, y se digiere con BamHI. Esta digestión puede ser separada sobre un gel de agarosa y transferida a una membrana de nilón. Esta es sondeada con un fragmento de ADN radioetiquetado homólogo a las secuencias de cualquier lado del gen gH. El virus gH- HSV1 así obtenido, que contiene un sitio de Pací único en su locus ' o lugar de gH, puede ser designado DISC-HSVPac. La inserción tanto de rep-cap como rAAV en el virus de DISC-HSVPac puede ser llevada a cabo como sigue. Un plásmido que contiene sitios dobles de Peal se pueden hacer con la ayuda del mismo enlazador que se utilizó para construir DIS-HSVP ac, el cual es primero ligado en pRCC/CMV cortado con NruI y Sacl. El plásmido resultante puede ser designado plMJl. Una secuencia rep-cap puede ser clonada en plMJl como sigue: El fragmento Bal de un plásmido tal como pAVl (el cual contiene la secuencia rep-cap completa de AAV-2) puede ser finalizada sin puntas por el tratamiento con polimerasa y unida en el sitio de Hpal único de plMJl de modo que la secuencia de rep-cap esté flanqueada por los sitios Pací en el nuevo plásmido. Este plásmido puede ser designado plMJ-repcap. Un plásmido que contiene las secuencias tanto rAAV como rep-cap flanqueadas por los sitios Pací se pueden hacer entonces por el corte de las secuencias rAAV que contienen ya sea GFp o el factor IX de los plásmidos pTR-CMVgfp y pTR.flX, utilizando las enzimas de restricción pvul y Asel, y el extremo sin puntas ligado en el sitio Bbsl en plMJ-rep-cap de modo que el cásete rAAV esté a continuación de la secuencia rep-cap y también esté flanqueado por los sitios Pací. Estos plásmidos son designados pAAV-Pac-gfp y pAAV-Pac-fiX, respectivamente . Las secuencias rAAV y rep-cap pueden ser insertadas en el virus DISC-HSVPac como sigue: El cásete rAAV-repcap puede ser cortado de pAAV-Pac-gfp o pAAV-Pac-fiX, y se unen en el virus DISC-HSVPac. El procedimiento completo puede ser análogo al método de inserción descrito anteriormente. Por consiguiente, las secuencias de rAAV que contienen los virus de DISC se pueden hacer insertando las secuencias del vector rAAV en el locus o lugar gH de DISC-HSV. Por ejemplo un cásete de GFP flanqueado por AAV TRs puede ser removido de pTR-EGFP (como se describió anteriormente) por la digestión con Pvul y Bsal, y se clonó en un plásmido plMJ-1 de modo que la secuencia del vector AAV llegue a estar flanqueada por las secuencias de reconocimiento para el Pací de la enzima de restricción. La secuencia del vector AAV puede ser escindida entonces con Pací, y clonada por ejemplo en un virus DISPac en el locus o lugar de gH (deleción) . El ADN ligado puede ser transfectado en las células de CR-1, y el virus recombinante puede ser recuperado por la purificación de la placa secuencial. La progenie viral puede ser seleccionada para el virus recombinante por hibridación de Southern con sondas hechas tanto de la secuencia de ADN de rep-cap como de la secuencia de ADN que contiene GFP, o el factor GFP, dependiendo del caso de que se trate. Los virus recombinados construidos recientemente son designados DISC-AAV-gfp (que contiene el GFP derivado de un cásete de rAAV respectivo) y DISC-AAV-fiX (que contiene el gen del factor IX derivado de un cásete de rAAV respectivo) . Las materias primas del virus pueden ser almacenadas a -70 °C, y pueden ser utilizadas en las preparaciones y métodos mencionados anteriormente.
AAV recombinante por medio del adenovirus:
En los ejemplos alternativos de la invención, la construcción del vector para los adenovirus recombinantes adecuados para su uso como virus y vectores auxiliadores para la generación del rAAV se puede llevar a cabo como sigue: Las manipulaciones del ADNr se puede efectuar de la manera conocida per se: El adenovirus del tipo 2 puede ser obtenido del
ATCC (Cat. No. VR-846) y utilizado para infectar por ejemplos las células HeLa, y el ADN aislado de las células infectadas por la extracción del fenol seguido por la precipitación con etanol. El ADN del Ad-2 puede ser digerido entonces con la enzima de restricción SacII, y un fragmento de 358 pb resultante aislado utilizando la electrofóresis del gel. Este fragmento de 358 pb, que contiene el origen de la replicación de Ad-2 y la señal de empaque, pueden ser unidos entonces en el sitio de restricción de Smal único del plásmido pneb-193 y el plásmido resultante designado pADV-1. El plásmido pneb-193 está disponible de New England BioLab bajo el número de catálogo 305-1.
Las secuencias de AAV recombinantes y los genes de rep y cap del AAV pueden ser insertadas entonces en ?ADV-1 como sigue: Los plásmidos pTR-fiX (descritos anteriormente) y el pTR-EGFP que contiene las secuencias de rAAV, y estas secuencias de rAAV pueden ser aisladas por digestión de cualquiera de estos plásmidos utilizando las enzimas de restricción pvul y Asel. El plásmido pTR-fiX puede ser construido como se describió al inicio y el plásmido pTR-EGFP puede ser construido como sigue: el cásete de GFP puede ser removido del plásmido pEHFP-Nl (Clontech, Cat. No. 6085-1) y clonado en puc AVI utilizando Pvul y Bsal, seguido por digestión completa con PpuMI y SnaBI para crear el pTR-EGFP. La secuencia de AAV resultante puede ser clonada entonces por la unión con extremos sin punta en el sitio de BamHI único y el plásmido pADV-1. El plásmido resultante puede ser designado pADV-2. Las secuencias de AAV que cubren la región que codifica los productos del gen rep y cap pueden ser cortadas de pAVI por la digestión de Ball y clonados con extremos sin punta en el sitio de BamHI único de pADV-1. El plásmido resultante puede ser designado pADV-3. Las materias primas de AAV recombinantes pueden ser generadas como sigue: Inicialmente las células 293 pueden ser sembradas un día antes de la transfección en cajas de petri de 5 cm. Las células 293 pueden ser transfectadas entonces con los plásmidos pADV-2 y pADV-3 utilizando Lipofectamina (TM) , de acuerdo con las instrucciones del proveedor como se describió anteriormente. Veinticuatro horas después de la transfección del plásmido, las células 293 pueden ser infectadas con el virus auxiliador Ad-2 en una multiplicidad de sitios de infección (MOI) 2. Finalmente, aproximadamente 2-3 días después de la infección con el virus auxiliador Ad-2, las células 293 producen una materia prima del virus crudo que contiene el rAAV y que contamina el adenovirus. La materia prima puede ser sometida a calentamiento a 56 °C durante una hora para inactivar el adenovirus contaminante. La concentración de rAAV resultante puede ser determinada infectando una monocapa de células HeLa con diluciones en serie de las muestras de la materia prima de rAAV producida, seguido por la infección con el adenovirus en una multiplicidad de sitios de infección (MOI) 2. Otras construcciones también se pueden hacer y utilizar de acuerdo con la invención. Los ejemplos adicionales del plásmido y las construcciones del virus recombinante basadas en el virus del herpes recombinante y los amplicones herpesvirales que se pueden hacer y utilizar en relación con las preparaciones y los métodos mencionados anteriormente incluyen: Las construcciones adicionales de los genes rep y cap para su uso en las técnicas se pueden hacer como sigue: pucAVl puede ser digerido parcialmente con PpuMI (en dos sitios, uno en nt 191 y otro en nt 351) y luego se digiere completamente con SnaBI. Los fragmentos de PpuMl-SnaBI los cuales contienen las secuencias rep y cap pueden ser aisladas y clonadas ya sea en el sitio SapI de pW7TK (un plásmido del amplicon) o en el sitio Hpal de plMJl (un pcull9, diferente del amplicon, derivado del plásmido) . Estos plásmidos construidos recientemente pueden ser designados pHAV-7.3 (amplicon que contiene la longitud completa de 4303 pb del fragmento PpuMI-SnaBI, y los genes de rep y cap intactos), el pHAV-7.3del (amplicon que contiene el fragmento de 4143 pb truncado, cap intacto y rep delecionado N-terminalmente) y pHAV-5.6 (plásmido diferente del amplicon que contiene los genes rep y cap intactos), respectivamente. En un procedimiento adicional para la construcción de los plásmidos del vector AAV, el cásete de GFP puede ser removido de pEGFP-Nl (CLONTECH. Cat No: 6085-1) con Asel y Bsal y clonado en pucAVl, digerido totalmente con PpuMI y SnaBI para crear el plásmido pTR-EGFP. La secuencia que codifica el GFP y flanqueado por AAV TRs puede ser removido de pTR-EGFP con Pvul y Bsal y clonado en ya sea pHAV-7.3 para crear pHAV-4.1 (amplicon que contiene tanto la secuencia del vector AAV como los genes de rep y cap) o en el sitio SapI de pW7-TK para crear pHAV-5 (amplicon que contiene solamente la secuencia del vector AAV) . Para construir un plásmido diferente del amplicon que contiene tanto las secuencias del vector AAV como los genes de rep-cap, el PpuMI-SnaBI de 4303 pb de longitud completa puede ser clonado fuera de las secuencias de TR de pTR-EGFP para crear pHAV-9.8.
Producción de rAAV
Para las preparaciones de rAAV a escala pequeña, 2.5xl05 células pueden ser sembradas un día antes de que las mismas sean requeridas para uso adicional en placas de 6 cavidades de modo que las mismas lleguen a ser confluentes al 70-80% en el día de la transfección. Las células pueden ser transfectadas entonces con complejos de LIPOFECT7AMINE™/DNA (Life
Technologies) . Para la transfección de las células de BHK
(gH+ o gH"), 1 µg del ADN del plásmido (en 100 µl de OPTI- MEM®, Life Technologies) puede ser mezclado con 10 µl del lípido LIPOFECTAMINE® (en 100 µl de OPTI-MEM®) y la mezcla dejada a temperatura ambiente durante 30 minutos. Al final de este período de tiempo, el volumen total se puede componer hasta 1 mi con OPTI-MEM®, y la mezcla aplicada a las células lavadas con OPTI-MEM® en una placa de 6 cavidades. Cinco horas después, la mezcla de la transfección puede ser removida y se agregan 2 mi del medio de crecimiento que contiene 10% de FCS. Las células pueden ser infectadas el siguiente día con 3 unidades formadoras de placa (pfu) por célula de DISC-HSV. Mientras que se completa el proceso citopático (24-36 horas), el virus puede ser colectado por el raspado de las células fuera de la placa. Para las células 293, la transfección puede ser efectuada de la misma manera excepto que las células pueden ser infectadas con el adenovirus por ejemplo el tipo 5 del Adenovirus del tipo silvestre, en una multiplicidad de sitios de infección (MOI) de 2 por célula y los virus pueden ser colectados usualmente a las 48-72 horas. En ambos casos, las células pueden ser colectadas por centrifugación a velocidad baja en una máquina centrífuga superior de banco y resuspendidas en 1 mi de medio libre de suero. El virus puede ser liberado de las células colectadas por la acción del sonido durante 1 minuto en un aplicador de sonido de baño de agua. Los usados celulares pueden ser microcentrifugados brevemente para remover los desechos insolubles, y los sobrenadantes colectados. Las partículas del amplicon y del HSV contaminantes pueden ser inactivadas completamente por incubación a 56 °C durante 20 minutos (lo cual puede ser confirmado por el ensayo de la placa) . Los complejos de transfección de ADN (LID) /péptido de ubicación del blanco de LIPOFECTIN®/Integrina se pueden hacer como se describió por Hart et al, 1998) . Para la transfección de las células de BHK, los complejos se pueden hacer por el mezclado suave de tres componentes: el péptido 6 ( [K16]GACRRETAWACG) , el ADN del plásmido y LIPOFECTIN® (Life Technologies) en la proporción en peso de 0.75:4:1. Para concentrar o titular el rAAV, las diluciones del usado celular crudo o el virus purificado fueron agregadas a las células sembradas en las placas de 6 cavidades. Las células pueden ser infectadas con ya sea 3 pfu/célula de DISC-HSV o si se utilizan las células 293, el adenovirus en un MOI de 2. Las células positivas de GFP pueden ser contadas 16 horas después de la superinfección. Si el rAAV va a ser titulado o concentrado sin la superinfección de los virus auxiliadores, las células positivas de GFP pueden ser contadas dos a tres días después de la infección de rAAV inicial.
Purificación de rAAV para una aplicación in vivo:
Para la generación de materias primas altamente purificadas, 107 células de BHK pueden ser transfectadas (complejos de LIPOFECTAMINE™/ADN) como se describió anteriormente utilizando DISC-HSV como un virus auxiliador, y los amplicones separados que codifican el genoma del vector y los genes rep y cap (pHAV5 y pHAV7.3). 24-36 horas más tarde, mientras que se completa el proceso lítico, las células pueden ser colectadas por centrifugación, y Usadas por congelamiento-licuado repetido. Las materias primas del vector AAV pueden ser purificadas a partir de gradientes de cloruro de cesio secuenciales, dializados contra la solución salada amortiguada con HEPES, concentradas por ultrafiltración
(Microcon 30) , y calentadas a 56 °C durante veinte minutos para inactivar el DISC HSV residual. La concentración de la transducción puede ser determinada por la coinfección de las células HeLa con las diluciones en serie triplicadas de rAAVgfp y el Ad5 del tipo silvestre en un MOI de 2. 24 horas más tarde, las células de gfp + pueden ser evaluadas por microscopía de fluorescencia. La concentración de rAAV en un total de 2 mi del lisado celular crudo pueden ser por ejemplo de 1 x 109 tu por mi. Después de la purificación y ultracentrifugación, la concentración en un volumen total de 200 µl puede ser por ejemplo de IxlO9 tu por mi.
Generación de plásmidos del amplicon del herpes:
El rendimiento útil de las partículas de rAAV puede ser obtenido cuando tanto la secuencia del vector de rAAV como los genes rep y cap son incorporados en los vectores del amplicon de HSV, Una serie de plásmidos del amplicon derivados del HSV pueden ser construidos. Un vector de DISC-HSV que codifica la secuencia del vector de rAAV en el locus o lugar de gH también puede ser construida (DIS-AVE2.1) . Para obtener los genes rep y cap de AW el pucAAVl (el genoma de AAV del tipo 2 completo) puede ser digerido parcialmente con PpuMI y luego digerido completamente con SnaB?. Este puede generar dos fragmentos de ADN menos el TR del AAV un fragmento de 4303 pb (nt 191 a 4493 del genoma de wtAAV) el cual es inclusivo de un cásete de expresión de rep y cap intacto, y un fragmento de 4143 pb (nt 351-4493 del genoma wtAAV) en el cual el promotor p5 y la secuencia N-terminal de rep es delecionada. Ambos fragmentos de ADN pueden ser clonados en el plásmido del amplicon de HSV pW7TK para crear el pHAV7.3 y el pHAV7.3del, respectivamente. El pHAV-7.3del puede ser utilizado como un control rep-durante la producción de rAAV. Las secuencias que codifican un cásete de expresión de la proteína fluorescente verde (.gfp) pueden ser clonadas en el pucAAVl digerido previamente con PpuMI y SnaBI, de modo que no exista secuencia de superposición entre las construcciones del vector rAAV y del auxiliador de AAV que codifican rep y cap. El cásete flanqueado por TR puede ser clonado subsiguientemente en pW7TK para crear pHAV5 o en pHAV7.3 para crear pHAV-4.1 (en el cual tanto los genes rep y cap del AAV como la secuencia del vector de AAV son incorporados en un plásmido del amplicon único) . Además, el cásete de GFP flanqueado por TR puede ser insertado en el locus o lugar de gH delecionado de DISC-HSV-1 para crear DISC-AV2.1. Las construcciones paralelas basadas en los plásmidos convencionales también pueden ser construidas (pTR-EGFP, pHAV-5.6 y pHAV9.8).
Producción de rAAV a partir de los amplicones de HSV y el virus auxiliador de DISC-HSV:
Para probar la capacidad del HSV-AAV híbrido para generar las partículas de rAAV de transducción, las células productoras permisivas pueden ser transfectadas con las combinaciones del plásmido e infectadas con un virus auxiliador suficiente para asegurar la replicación y la lisis en cada célula. Los virus recombinantes pueden ser colectados mientras que se completa el proceso citopático (24 a 36 horas para el virus auxiliador de DISC-HSV en las células de BHK o 48 a 72 horas para el virus auxiliador de Ad en las células 293) . La cantidad del rAAV recuperado puede ser concentrado como las unidades de transducción de gfp+ (tu) en los Usados celulares crudos como se describió anteriormente. Se pueden obtener rendimientos más elevados utilizando el DISC-HSV como el virus auxiliador, y las construcciones del amplicon de HSV que codifican el genoma del vector y el genoma del AAV auxiliador ya sea separadamente (pHAV-5 y pHAV-7.3), o combinados sobre un solo amplicon (pHAV-4.1). Para la combinación del pHAV-5 y el pHAV-7.3, más de 1000 tu del rAAV pueden ser producidas por cada célula transfectada. Sin que se desee que esté limitado por alguna teoría, se cree que la incorporación del genoma del vector de AAV y el gemona del AAV auxiliador sobre los amplicones separados pueden contribuir ambos a una recuperación de rAAV mejorada. Se prefiere menos incorporar las secuencias tanto del vector rAAV como del genoma auxiliador de AAV sobre el mismo amplicon (pHAV-4.1) o incorporar el genoma del vector como parte del propio virus DISC (DISC-AV2.1) . Para mejorar la eficiencia de la transfección de las células productoras de BHK (las cuales promediaron entre 10%-15% con los complejos del ADN del amplicon/LIPOFECTAMINE™) , se puede utilizar un sistema de vectores de LID eficiente, conocido, para suministrar ambos plásmidos. Por este método, 25% de las células pueden ser transfectadas, y el rendimiento de rAAV puede ser de aproximadamente 4000 tu por célula transfectada, sugiriendo que la eficiencia de la transfección de cada célula también pueda ser mejorada. En ciertos ejemplos llevados a cabo hasta ahora, se encontró que el rendimiento . del rAAV recuperable de las células transfectadas con los plásmidos del amplicon-HSV e infectadas con DISC como el virus auxiliador puede ser mucho más elevado que el generado de las mismas construcciones en las células 293 utilizando el Ad como el auxiliador, y también pueden ser más elevadas que aquellas recuperadas de las células BHK transfectadas con los plásmidos convencionales.
Preparación de rAAV para la transducción de las células in vivo:
Para uso in vivo, el rAAV que codifica el gfp puede ser generado por ejemplo utilizando el pHAV-5, pHAV-7.3 y el virus DISC como el auxiliador. Después de la purificación del gradiente de cesio y ultracentrifugación, el rAAV puede ser obtenido a una concentración en un volumen total de 200 µl de aproximadamente lxlO9 tu por mi (medido por la coinfección de las células HeLa con Ad) . Las concentraciones de la transducción en la ausencia del AD pueden ser de aproximadamente 80 veces inferiores. Los vectores de acuerdo con la presente invención también pueden ser aplicados por ejemplo en formas análogas a aquellas descritas en la especificación WO 96/29421 (Linxvale Ltd & Cantab Pharmaceuticals Research Ltd: Efstathiou, Inglis, y Zhang: "Vectors for gene delivery") la cual es incorporada aquí para referencia en su totalidad para todos los propósitos, incluyendo los métodos del cultivo del amplicon descritos allí. La invención descrita aquí es susceptible de modificaciones y variaciones adicionales como será evidente para el lector con experiencia ordinaria en el campo. La presente descripción está propuesta para extenderse también a las combinaciones y subcombinaciones de las características mencionadas o descritas en la descripción precedente incluyendo las reivindicaciones anexas, y en las publicaciones citadas. Los documentos citados aquí son incorporados por la presente para referencia en su totalidad para todos los propósitos.
Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.
Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes
Claims (26)
1. Una preparación de partículas virales infecciosas que incluye partículas que pueden actuar como un virus auxiliador para el virus adeno asociado (AAV) , y que incluye partículas que comprenden el ADN (i) que incluye al menos una secuencia de ácidos nucleicos para el suministro a las células huésped de blanco u objetivo, y (ii) que codifican además las proteínas y las funciones de replicación, caracterizado porque el ADN (i) y (ii) son codificados ya sea (a) por el mismo virus, o (b) por el virus y al menos una partícula del amplicon herpesviral, o (c) por al menos una partícula del amplicon viral, y la expresión del ADN (i) y (ii) conjunta es suficiente, cuando las partículas de la preparación infectan las primeras células del huésped del blanco u objetivo, para el montaje y la liberación, desde las primeras células de blanco u objetivo, de las partículas de AAV recombinantes infecciosas que comprenden la secuencia del ácido nucleico elegida, por lo cual las partículas de AAV recombinantes infecciosas son capaces a su vez de infectar las segundas células huésped de blanco u objetivo, y provocar la expresión del ADN (i) en las segundas células huésped de blanco u objetivo.
2. Una preparación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque las partículas que comprenden el ADN (i) y (ii) comprenden los amplicones herpesvirales infecciosos y/o el virus del herpes mutante infeccioso que tiene un genoma mutante inhabilitado con respecto a un gen esencial para la producción de nuevas partículas del virus del herpes infecciosas, la preparación que codifica las proteínas y que replica las funciones de manera suficiente (en las primeras células huésped de blanco u objetivo cuando son infectadas por la preparación) para permitir el montaje y la liberación, a partir de las primeras células huésped de blanco u objetivo, de las partículas Infecciosas del virus adeno asociado recombinante que codifica la secuencia de ácidos nucleicos elegida, para el suministro a las segundas células de blanco u objetivo cuando son infectadas por el virus adeno asociado recombinante de modo que sean liberadas de las primeras células huésped de blanco u objetivo.
3. Una preparación de conformidad con las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada porque las partículas virales están libres de las partículas del virus capaces de producir nuevas partículas del virus infecciosas (diferentes de las partículas de AAV recombinantes) en una célula huésped normal.
4. Una preparación de partículas herpesvirales infecciosas recombinantes y/o partículas del amplicon herpesviral, caracterizada porque: (a) carece de una función del gen esencial para la producción de nuevas partículas herpesvirales infecciosas en una célula huésped normal, y (b) comprende (i) el ADN heterólogo para el AAV, por ejemplo hasta aproximadamente 4.5 kb de tamaño, flanqueado por las secuencias de ITR de AW, y (ii) el ADN que codifica los genes de rep y cap de AAV codificados al menos en parte en una posición diferente flanqueada por las secuencias de AAV ITR, en donde tanto el ADN ' (i) como el ADN (ii) son codificados ya sea (a) por el mismo virus del herpes, o (b) por el virus del herpes y al menos una partícula del amplicon herpesviral, o (c) al menos una partícula del amplicon herpesviral; y en donde tanto el ADN (i) como el ADN (ii) están colocados con relación a un origen herpesviral de replicación (oriS) y opcionalmente también una señal de empaque herpesviral (pac) de modo que los mismos sean replicables dentro de una célula infectada por las partículas del virus, de tal modo que cuando las partículas infecten las primeras células de blanco u objetivo, que son células huéspedes normales, no se produzcan nuevas partículas infecciosas del virus del herpes o del amplicon herpesviral, sino que las primeras células de blanco u objetivo infectadas con las partículas del virus puedan ocasionar partículas de AAV recombinantes que comprendan el ADN (i) empacado en la proteína de recubrimiento de AAV, y ser capaces, después de su liberación de las primeras células, de infectar las segundas células de blanco u objetivo y provocar la expresión del ADN (i) en las segundas células de blanco u objetivo infectadas, pero que no sean capaces de ocasionar nuevas partículas del virus infecciosas a partir de las segundas células de blanco u objetivo infectadas.
5. Una preparación de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque el ADN (i) y el ADN (ii) son codificados en la misma partícula del virus del herpes o en el mismo amplicon herpesviral.
6. Una preparación de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque el ADN (i) y el ADN (ii) son codificados por diferentes virus del herpes y al menos una partícula del amplicon herpesviral, o alternativamente por partículas del amplicon herpesviral diferentes .
7. Una preparación de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque el ADN (i) es codificado por un primer amplicon herpesviral y el ADN (ii) es codificado por un segundo amplicon herpesviral.
8. Una preparación de conformidad con las reivindicaciones 5 o 6, caracterizada porque el virus del herpes es un virus del herpes mutante infeccioso que tiene un genoma mutante que carece de un gen esencial para la producción de nuevas partículas del virus del herpes infecciosas.
9. Una preparación de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque comprende el virus del herpes mutante infeccioso que carece de un gen esencial para la producción de nuevas partículas del virus del herpes infecciosas que codifican el ADN (ii), y que comprende además las partículas del amplicon herpesviral que codifican el ADN (i) .
10. Una preparación de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque comprende el virus del herpes mutante infeccioso que carece de un gen esencial para la producción de nuevas partículas del virus del herpes infecciosas que codifican el ADN (i), y además que comprenden las partículas del amplicon herpesviral que codifican el ADN (ii) .
11. Una preparación de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque el ADN (i) y/o el ADN (ii) son codificados por el virus del herpes mutante, e insertados en un sitio de deleción del gen esencial.
12. Una preparación de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque la secuencia del ácido nucleico ' elegida comprende un gen reportero, por ejemplo, un gen de gfp o gen de LacZ, o un gen que codifica un fragmento funcional del mismo.
13. Una preparación de partículas virales infecciosas que incluye partículas las cuales pueden actuar como un virus auxiliador para el virus adeno asociado (AAV) , y que incluyen partículas que comprenden el ADN (i) que incluye al menos una secuencia de ácidos nucleicos elegida para el suministro a las células huésped de blanco y objetivo, y (ii) que codifica además las proteínas y las funciones de replicación, las cuales conjuntamente son suficientes cuando las partículas de la preparación infectan las primeras células huésped de blanco u objetivo, para el montaje y la liberación, de las primeras células de blanco u objetivo, de las partículas de AAV recombinantes infecciosas que comprenden la secuencia del ácido nucleico elegida, por lo cual las partículas de AAV recombinantes infecciosas son capaces a su vez de infectar las segundas células huésped de blanco u objetivo, y provocar la expresión del ADN (i) en las segundas células huésped de blanco u objetivo infectadas, en donde la secuencia del ácido nucleico elegida comprende además el ácido nucleico heterólogo adicional, por ejemplo un promotor específico del tejido, por ejemplo un promotor de albúmina o promotor de la enolasa neuronal.
14. Una preparación de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizada porque el ADN elegido para el suministro a la célula de blanco u objetivo codifica un antígeno capaz de evocar una respuesta inmune en un animal o en un animal que no es un ser humano.
15. Una preparación de partículas virales infecciosas que incluyen las partículas las cuales pueden actuar como un virus auxiliador para el virus adeno asociado (AAV) , y que incluyen partículas que comprenden el ADN (i) que incluye al menos una secuencia de ácidos nucleicos elegida para el suministro a las células huésped de blanco y objetivo, y (ii) que codifica además las proteínas y las funciones de replicación, las cuales conjuntamente son suficientes cuando las partículas de la preparación infectan las primeras células huésped de blanco u objetivo, para el montaje y la liberación, de las primeras células de blanco u objetivo, de las partículas de AAV recombinantes infecciosas que comprenden la secuencia del ácido nucleico elegida, por lo cual las partículas de AAV recombinantes infecciosas son ' capaces a su vez de infectar las segundas células huésped de blanco u objetivo, y provocar la expresión del ADN (i) en las segundas células huésped de blanco u objetivo infectadas, en donde la secuencia del ácido nucleico elegida comprende además un gen que codifica una citocina u otra proteína inmunomodulatoria, por ejemplo la IL-2.
16. Una preparación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizada porque la secuencia del ácido nucleico elegida comprende un gen que codifica una proteína terapéutica, por ejemplo un factor IX.
17. Una preparación de partículas virales infecciosas que incluye las partículas las cuales pueden actuar como un virus auxiliador para el virus adeno asociado (AAV) , y que incluyen partículas que comprenden el ADN (i) que incluye al menos una secuencia de ácidos nucleicos elegida para el suministro a las células huésped de blanco y objetivo, y (ii) que codifica además las proteínas y las funciones de replicación, las cuales conjuntamente son suficientes cuando las partículas de la preparación infectan las primeras células huésped de blanco u objetivo, para el montaje y la liberación, de las primeras células de blanco u objetivo, de las partículas de AAV reco binantes infecciosas que comprenden la secuencia del ácido nucleico elegida, por lo cual las partículas de AAV recombinantes infecciosas son capaces a su vez de infectar las segundas células huésped de blanco u objetivo, y provocar la expresión del ADN (i) en las segundas células huésped de blanco u objetivo infectadas, para su uso en la infección de las células in vivo para expresar un antígeno o citocina o proteína inmunomodulatoria para evocar o modificar una respuesta inmune.
18. Una preparación de conformidad con la reivindicación 16, para su uso en un proceso de suministro de genes para reemplazar un gen defectuoso o faltante en una célula de blanco u objetivo.
19. Una preparación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-16, caracterizada porque incorpora el ADN el cual es heterólogo con respecto a AAV, por ejemplo hasta aproximadamente 4.5 kb de tamaño, flanqueado por las secuencias de ITR de AAV, y acompañado por el gen rep de AAV o por una subsecuencia del gen rep que es suficiente para provocar la integración del ADN en el ADN de las segundas células de blanco u objetivo cuando son infectadas por las partículas de AAV recombinantes producidas por las primeras células de blanco u objetivo.
20. Una preparación de genomas de AAV recombinantes infecciosas, caracterizada porque se puede producir por la infección de una célula huésped con una preparación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-16 la cual está libre del virus auxiliador, por ejemplo libre del virus auxiliador competente en la replicación, por ejemplo el virus del herpes mutante infeccioso que carece de un gen esencial para la producción de nuevas partículas del virus del herpes infecciosas.
21. Un método de producción de los genomas de AAV recombinantes, por ejemplo libres del virus auxiliador competentes en la replicación, que comprende el ADN heterólogo y empacado en la proteína de recubrimiento de AAV, caracterizado porque comprende los pasos de: (i) proporcionar un virus del herpes que comprende un genoma que carece de un gen esencial para la producción de nuevas partículas del virus del herpes infecciosas, y que se hacen crecer por el cultivo sobre las células hechas recombinantes y capaces de expresar la función del gen viral que está faltando en el genoma herpesviral; (ii) proporcionar un amplicon herpesviral que comprende un gen rep y cap de AAV, y que comprende además el ADN heterólogo que se desea que sea incorporado en una partícula de AAV recombinante, y los ITRs colocados para flanquear el ADN heterólogo; (iii) utilizar el virus del herpes de (i) y el amplicon de (ii) para infectar las células que no expresan la función del gen esencial faltante en el genoma herpesviral, y (iv) colectar de las células infectadas en (iii) los genomas de AW recombinantes que comprenden el ADN heterólogo y empacados en la proteína de recubrimiento de AAV, preferentemente libres del virus auxiliador competente en la replicación.
22. Una preparación de las partículas de AAV recombinantes de conformidad con la reivindicación 20, y caracterizada porque comprende una preparación de los genomas de AAV recombinantes que comprenden el ADN heterólogo, por ejemplo de hasta aproximadamente 4.5 kb de tamaño, flanqueados por secuencias de AAV y empacados en la proteína de recubrimiento de AAV, libre del virus auxiliador, y/o libre del adenovirus, y/o libre del virus auxiliador competente en la replicación infecciosa, y/o que contiene el virus del herpes defectuoso en la replicación pero libre del virus del herpes competente en la replicación o de otro virus auxiliador.
23. Un método de verificación de la expresión del gen en un cultivo de células, caracterizado porque comprende los pasos de: (i) administrar al sujeto o al cultivo una preparación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-16, en donde el ADN para el suministro a las células de blanco u objetivo comprende un gen reportero; y después de esto (ii) verificar las células del sujeto o del cultivo para la expresión del gen reportero in vivo o in vitro, por la detección de un producto del gen reportero correspondiente, por ejemplo por ELISA o detección de la fluorescencia, por ejemplo por microscopía de fluorescencia .
24. El uso de una preparación de conformidad con la reivindicación 1, en la fabricación de un medicamento adecuado para la administración a un paciente.
25. El uso de una preparación de partículas virales infecciosas que incluyen las partículas que pueden actuar como el virus auxiliador para el virus adeno asociado (AAV) , y que incluye las partículas que comprenden el ADN (i) que incluye al menos una secuencia de ácidos nucleicos elegida para el suministro a las células huésped de blanco u objetivo, y (ii) que codifican además las proteínas y las funciones de replicación, en la fabricación de un medicamento adecuado para la administración a un paciente, y después de la administración del medicamento al paciente, cuando las partículas de la preparación infectan primero las células huésped de blanco u objetivo in vivo, puede conducir al montaje y liberación, desde las primeras células de blanco u objetivo, de las partículas de AAV recombinantes infecciosas que comprenden la secuencia del ácido nucleico elegida, por lo cual las partículas de AAV recombinantes infecciosas son capaces a su vez de infectar las segundas células huésped de blanco u objetivo in vivo, y provocar la expresión de dicho ADN (i) en las segundas células huésped de blanco u objetivo infectadas .
26. El uso de una preparación de conformidad con las reivindicaciones 24 o 25, para el suministro de una secuencia de ácidos nucleicos elegida a las células huésped in vivo. VECTORES PARA EL SUMINISTRO DE GENES Y SUS USOS RESUMEN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a preparaciones de partículas virales infecciosas que incluyen partículas virales las cuales pueden actuar como un virus auxiliador para el virus adeno asociado (AAV) , y que incluye partículas que comprenden el ADN (i) que incluye al menos una secuencia de ácidos nucleicos elegida para el suministro a las células huésped de blanco u objetivo, y que codifica además las proteínas y las funciones de replicación las cuales conjuntamente son suficientes, cuando las partículas de la preparación infectan las primeras células huésped de blanco u objetivo, para el montaje y la liberación, desde las primeras células de blanco u objetivo, de las partículas de AAV recombinantes infecciosas que comprenden la secuencia de ácidos nucleicos elegida por lo cual las partículas de AAV recombinantes infecciosas son capaces a su vez de infectar las segundas células huésped de blanco u objetivo, y provocar la expresión del ADN (i) en las segundas cé?ulas huésped de blanco u objetivo.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB9721909.1 | 1997-10-17 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| MXPA00003561A true MXPA00003561A (es) | 2001-03-05 |
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