MXPA00002491A

MXPA00002491A - Secuencias aminoacidas para la terapia y profilaxis de enfermedades provocadas por las toxinas de clostridium difficile

Info

Publication number: MXPA00002491A
Application number: MXPA/A/2000/002491A
Authority: MX
Inventors: Eichelstreiber Christoph Von; Michael Moos
Original assignee: Eichelstreiber Christoph Von Dr 55444 Schweppenhausen De
Priority date: 1997-09-10
Filing date: 2000-03-10
Publication date: 2001-11-21

Abstract

La presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales, que pueden reconocer y neutralizar los epítopes de los dominios de ligantes, dominios de traslocación o dominios catalíticos de la enterotoxina (toxina A) o la citotoxina (toxina B) de Clostridium difícil, asícomo su producción y su uso en la terapia y profilaxis de enfermedades provocadas por esas toxinas.

Description

SECUENCIAS AMINOACIDAS PARA LA TERAPIA Y PROFILAXIS DE ENFERMEDADES PROVOCADAS POR LAS TOXINAS DE CLOSTRIDIÜM DIFFICILE Campo de la Invención, La invención se refiere a secuencias aminoácidas (péptidos) que neutralizan el efecto de la enterotoxina de Clostridium difficile. Además se describen las regiones ipervariables de esos anticuerpos. Antecedentes de la Invención Se conoce que con la introducción de los antibióticos macrólidos como clindamicina se han presentado fuertes enfermedades intestinales que se presentan en forma de diarrea y que con el transcurso del tiempo producen colitis pseudo embranosa (PMC) eventualmente mortal. Esta relación dio a la enfermedad el nombre de "diarrea estucado con clindamicina" . Hoy se sabe que casi todos los antibióticos utilizados en las clínicas y también los citostáticos pueden provocar el cuadro clínico de PMV. Clínicamente el PMC esta caracterizado por fuerte diarrea, que entre otros, debido a la fuerte perdida de electrólitos y líquidos puede conducir a la muerte. Dependiendo de la gravedad del cuadro patológico se presentan dolores abdominales, diarrea con sangre, fiebre y leucocitosis. Hasta ahora se realiza el tratamiento retirando el antibiótico que provocaba la enfermedad por medio de la administración de vancomicina así como por la compensación de la perdida de líquidos y electrólitos. El agente etiológico de la colitis pseudomembranosa forrando mucho tiempo fue desconocido. Hasta 1977 pudo encontrarse en las deposiciones una actividad tóxica hasta ese entonces desconocida, que ejercía un efecto citotóxico sobre las células CHO (células de carcinoma de ovario de conejillo de indias) . Por medio de otros estudios pudo determinarse finalmente que la colitis pseudomembranosa era provocada por Clostridium difficile y sus toxinas . Clostridium difficile es una bacteria en forma de bacilo gram positiva, anaerobica, que forma esporas ovaladas subterminales . Bioquímicamente esta caracterizada porque puede fermentar monosacáridos como glucosa, N-acetilglucosamina y ácido N-acetilneuramínico, pero no mañosa, xilosa o arabinosa. Clostridium difficile tampoco puede disociar esos monosacáridos de las cadenas laterales de la mucina gastrointestinal, ya que le faltan enzimas tales como neuraminidasa, ß-galactosidasa o sialidasa. Debido a estas inaccesibilidades bioquímicas no puede establecerse el Clostridium difficile en el intestino de pacientes sanos . En el caso de perturbaciones en la flora intestinal por la adición de antibióticos o citostáticos se presenta un substitución de la flora intestinal por Clostridium difficile y como consecuencia PMC.

Clostridrium difficile produce dos factores de patogenicidad principales, la enterotoxina (toxina A) y la citotoxina (toxina B) . Su obtención, purificación y sus propiedades así como su uso para preparar anticuerpos monoclonales se han descrito en los escritos de patente europeos 153 519 y 209 273, el los escritos de patente de norteamericanos 4 8769 218 y 5 098 826 así como la solicitud de patente internacional WO 91/18 293. En la protección de las consecuencias de una infección con Clostridium difficile los anticuerpos tiene un papel claramente importante. En pacientes que están enfermos con PCM, puede determinarse la concentración de anticuerpos contra la toxina A y B. Los cobayos desarrollan después del tratamiento con antibióticos y la infección con cepas de C. difficile formadoras de toxinas, el cuadro clínico de PMC, con el cual mueren. Una inmunización previa de los animales con las toxinas mencionadas los protege de las enfermedades . Una neutralización de las toxinas puede lograrse por medio de los anticuerpos contra los cuales están dirigidos los dominios de ligantes repetitivos de terminal C, los dominios de translocación centrales o los dominios catalíticos terminal N ( sobre la estructura de los dominio ver bibliografía [l] ) . Los primeros evitan el enlace de las toxinas a los receptores celulares, los últimos bloquean la reacción de glucosilación promovida por las toxinas, mientras que los anticuerpos dirigidos contra los dominios de translocación central inhiben la introducción de las toxinas en las células . Los anticuerpos neutralizantes de la toxina A ofrecen así la posibilidad de la terapia y/o profilaxis de enfermedades con C. difficile, con lo cual no se eliminan las bacterias, sino que se bloquea el efecto de las toxinas formadas. De esta manera puede evitarse la presentación de síntomas patológicos originados por las toxinas. Si se toma por ejemplo toxina A, entonces la familia celular DSM ACC 2322 produce un anticuerpo TTC9, que no solo se enlaza con la toxina A, sino que su efecto biológico sirve también para neutralizarla. El punto de enlace de TTC8 a la toxina A se localizaron dentro de los dominios de ligantes repetitivos . Por el enlace de anticuerpos a la toxina se inhibe su interacción en los receptores celulares . Los puntos de enlace del mAk TTC8 se encuentra dentro de los aminoácidos 2480-2539 de la toxina A, con la secuencia de antígenos (mas probable) TINGKKYYF. Un mAb PCG-4 conocido por la patente norteamericana 4879218 se liga al fragmento de proteína definido por los aminoácidos 2098 a 2141 de la toxina A. En el caso de los anticuerpos monoclonales PVG-4 como también en el anticuerpo monoclonal TCC9 se trata de anticuerpos de ratón que no se utilizan en la terapia humana, pero que son adecuados como auxiliares de diagnostico. A continuación se presentan anticuerpos monoclonales que fueron generados en el laboratorio del inventor, y sus reactividades: Dirigidos contra Toxina al Toxina"1 Dominios catalíticos"1 1212 2612, 2688, 3110, 1502, 1115 Dominios de traslocación1b) 2825, 2836, 2703, 2740, 5288 2747, 2754, 5288, 2784, 2788 Dominios de ligantes"1 2620, TTC8 2912, 2914, 2916, 2926, 2562 ! 2CV Observaciones : a) Los anticuerpos reconocen proteína recombinante de las regiones presentadas en Western Blot . b) La reposición de aminoácidos de los dominios en las toxinas A y (B) son: dominios catalíticos: 1-879 (1- 877) ; dominios de traslocacion: 880-1848 (878-1850) : dominios de ligantes 1849-2681 (1851-2360) . Todos los anticuerpos monoclonales específicos a la toxina hasta ahora generados y descritos, se obtuvieron de ratones. El uso terapéutico y profiláctico de ese tipo de anticuerpos en otras especies exceptuando el ratón (humanos y otros animales) no es posible ya que los anticuerpos pon reconocidos como de una especie extraña. Su adaptación a otras especies, en especial su humanización hasta ahora no había sido posible, ya que sus regiones variables e hipervariables no habían sido secuenciadas, esto es definidas. Sumario de la Invención El objeto de la invención era el de poner a disposición péptidos que posean propiedades neutralizantes de las toxinas, pero que no presenten ninguna fracción fuertemente inmunogena, de tal forma que los péptidos sean adecuados para el uso en medicina humana y veterinaria. La neutralización del efecto de las toxinas se basa en el enlace de anticuerpos, promovida por la anexión de las regiones variables del anticuerpo a la toxina en cuestión. Ese enlace se determina por medio de las regiones hipervariables (CDR: región determinante de complementariedad) . Por lo tanto se presento la tarea de identificar las regiones (variables e hipervariable (CDR) ) . Responsables del enlace y la neutralización de las toxinas y estas ajustarías de tal forma que ya no provoquen inmunoreacciones . Esos péptidos pueden utilizarse tanto para la terapia de enfermedades ya presentes provocadas por Clostridium difficile como también para la protección de ese tipo de enfermedades en el campo de la medicina humana y también veterinaria. Los resultados científicos hasta ahora existentes pueden resumirse de la siguiente forma, en que por un lado la toxina A de Clostridium difficile puede provocar todos los síntomas de la colitis pseudomembranosa (PMC) , por otro lado el anticuerpo TTC8 monoclonal dirigido contra esa toxina in vivo (en ratón) puede neutralizar el efecto de esa toxina. El mAk TTC9 es un anticuerpo de la clase IgG 2b. El reconocimiento específico entre mAk TTC8 y la toxina A de Clostridium difficile se determina por medio de las regiones hipervariables de la cadena pesada y ligera. Esto quiere decir que secciones exactamente transcritos del anticuerpo (en otras palabras péptidos) son los responsables del reconocimiento del antígeno. El conocimiento de las regiones hipervariables, permite, trasladar esos péptidos (estructuras) a secuencias de anticuerpos de otras especies, que entonces por ejemplo en el humano, en forma de anticuerpos monoclonales humanizados, son adecuados para la terapia y profilaxis de enfermedades provocadas por C. difficile y que no tienen los efectos secundarios indeseados de los anticuerpos de especies extrañas, que por lo regular se obtienen de ratón. Descripción Detallada de la Invención Se propuso la tarea de determinar la secuencias nucleótidas y las secuencias aminoácidas de ellas derivadas del anticuerpo monoclonal neutralizante de las toxinas hipervariables, para poderlos utilizar en forma de semipéptidos o como anticuerpos humanizados (introducidos en genes de anticuerpos humanos) para la terapia y profilaxis en humanos. Una determinación de secuencia de ese tipo se realizó por ejemplo a partir de las células DSSM 2322, que producen los anticuerpos monoclonales TTC8, que neutralizan el efecto biológico de la enterotoxina A por medio del bloqueo del dominio de ligantes. Esa tarea se resuelve por que para la familia células DSM ACC 2322 con las secuencias SEQ ID NO. 1-12 y/o SEQ ID no 13-15 se determinan las secuencias de péptidos hipervariables y variables, que ejercen la actividad neutralizante del mAk TTC8. El conocimiento de los anticuerpos neutralizantes de las regiones variables permite producir péptidos que por el enlace a una anterotoxina y/o citotoxina de Clostridium difficile, mantienen sus efectos biológicos . Esas secuencias de péptidos como las secuencias SEQ ID No. 14 y/o SEQ ID no. 16 del protocolo de secuencia, como tales o incluidas en inmunoglobulinas, pueden utilizarse para la terapia de las enfermedades provocadas por Clostridium difficile. Cuando se pretenda la terapia en los humanos, en inmunoglobulinas humanas, para uso en la medicina veterinaria debe realizarse la introducción de las secuencias en los genes de inmunoglobulina de la especie tratada. Derivados de esos péptidos pueden obtenerse manteniéndose la actividad biológica por medio de deleccion, inserción, adición o intercambio de aminoácidos, esto es por medio de variación de alelos . Esos derivados pueden mantener sus efectos biológicos de los péptidos originales por medio de enlace a la entertoxina y/o citoxina de Clostridium difficile y con esto utilizarse para la terapia y profilaxis de enfermedades provocadas por Clostridium difficile. Las siguientes regiones hipervariables (CDRs = regiones determinantes de complementariedad) se determinaron en mAk TTC8, que se aisló de la familia celular de hibridoma DSM ACC 2322 depositada en la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares GmbH (DSMZ) . Estos poseen las siguientes secuencias aminoácidas: CDR de la cadena pesada: CDR-l: -Asn-Tyr-Trp-Met-Asn- (SEQ. ID No. 2) CDR-2 : -Arg-Ile-Tyr-Pro-Gly-Asp-Gly-Asp-Ala-His-Tyr-Asn-Gly- Lys-Phe-Lys-Gly- (SEQ. ID. No. 4) CDR-3 : -Gly-Gly-Asn-Tyr-Asp-Asp-Arg-Val-Phe-Asp-Tyr- (SEQ. ID. No. 6) CDR de la cadena ligera: CDR-4: -Lys-Ala-Ser-Gln-Asn-Val-Gly-Thr-Asn-Val-Ala- (SEQ. ID No. 8) CDR-5 : -Ser-Pro-Ser-Tyr-Arg-Tyr-Ser- (SEQ. ID. No. 10) CDR-3 : -Gln-Gln-Tyr-Asn-Ser-Tyr-Pro-Leu-Thr- (SEQ. ID. No. 12) Para la determinación de esas secuencias se procedió de la siguiente forma: primero se repararon todo el ARN de las células de hibridoma que forman mAk TTC8, por medio de un procedimiento conocido. Del ARN total en un segundo paso se separo el mARN. Esto se realizó con la ayuda de granulos de poliestireno magnéticas, en las cuales están ligadas de manera covalente las cadenas Oligo (dT)23. Del mARN purificado se sintetizo después cADN y con la ayuda de la reacción de cadenas de polimerasa (PCR) se amplificaron el gen VH y el VL de mAk TTC8, que codifican a la cadena ligera (VL) o la pesada (VH) del anticuerpo TTC8. Aquí tenía un significado decisivo el que se seleccionen cebadores que presenten los puntos de corte de restricción adecuados , para facilitar la subsecuente clonación. Después los genes VH y VL obtenidos de mAk TTC8 se clona en el vector pUC 19 y luego se secuencia. Así encontraron las secuencias nucleótidas (SEQ. ID No. 13 y 15) y la secuencias aminoácidas derivadas correspondientes SEQ ID NO. 14 y SEQ. ID. No. 16. Con la ayuda de una comparación con el gen de germen V 102 pueden identificarse las regiones hipervariables. Del gen de la cadena pesada (SEQ. ID. No. 13) puede reconocerse que CDR-l de la cadena pesada contiene 5 aminoácidos y empieza en la posición 30 de la secuencia. El CDR-2 de la cadena pesada empieza en la posición 49 y abarca 187 aminoácidos. La región hipervariable CDR-3 inicia en la posición 98 y abarca 11 aminoácidos. En total el gen VH del mAk TTC8, abarca 36 mutaciones puntuales en comparación con el gen V 102. Tres de las mutaciones se encuentran en la región de enlace del cebador PCR y pueden por lo tanto provocadas por la secuencia del cebador. Casi todas las mutaciones en las regiones hipervariables conducen a una modificación de la secuencia aminoácida, mientras que casi la mitad de todas las mutaciones en las regiones de la estructura son mudas . En el gen de la cadena ligera (SEQ ID No. 15) pueden determinarse las regiones hipervariables de la siguiente manera: El CDR-4 inicia en la posición 22 y abarca 11 aminoácidos. CDR-5 abarca 7 aminoácidos se inicia en la posición 48. La región CDR-6 inicia en la posición 87 y abarca 9 aminoácidos. El gen VL del mAk TTC9 presenta en comparación con mAk A23 solo 9 mutaciones. De ellos 4 se encuentran en la región de enlace del cebador PCR. De las otras cinco diferentes en la secuencia nucleótida hay dos mutaciones en el plano de proteína que son mudas. De las mutaciones que conducen a una modificación de la secuencia aminoácida, una se encuentra en CDR-4, las otras dos en las regiones de estructura 2 y 3. El uso terapéutico de uno de los anticuerpos monoclonales derivados del ratón produce en los humanos una inmunoreaccion. Para superar ese problema, pueden ajustarse esos anticuerpos a la especie a tratar (aquí el humano) , esto es humanizarse. Para esto hay varios procedimientos, que se basan en substituir la fracción de murina de los anticuerpos monoclonales por medio de las fracciones de un anticuerpo humano. Estos se conocen por ejemplo de las solicitudes de patente europeas 184 187, 171 496 y 1273 494. Los anticuerpos monoclonales humanizados obtenidos por medio de un procedimiento de ese tipo son mas adecuados para el uso terapéutico en humanos que los anticuerpos obtenidos de ratón. Esos métodos para humanizar los anticuerpos pueden utilizarse en anticuerpos monoclonales neutralizantes de maK TTC8 y toxina A dan un anticuerpo monoclonal humanizado, que representa una quimera de las regiones hipervariables (por ejemplo para TTC8 : SEQ ID: no. 1-12) del mAk TTC 8 neutralizante insertado en la región de estructura de una inmunoglobulina humana. Esta ultima puede ser del subtipo IgG (preferentemente par a la aplicación parenteral) o del subtitpo IgA (preferentemente para la aplicación peroral) .

Como se describe para el anticuerpo TTC8 (de la familia celular DSM ACC 2322) , correspondientemente las regiones hipervariables de otros anticuerpos monoclonales dirigidos contra Clostridium difficile, pueden clonarse, secuenciarse y utilizarse para la preparación de anticuerpos humanizados. El objeto de la invención también los son anticuerpos monoclonales humanizados, en donde dentro de las regiones variables y/o constantes de las cadenas ligeras y/o pesadas de las inmunoglobulinas humanas, la secuencia aminoácida esta modificada por medio de variaciones de alelos, en tanto se mantengan constante la capacidad de enlace a la toxina A y/o la toxina B de Clostridium difficile. Todas las "bases constructivas" biológicas necesarias para los anticuerpos monoclonales como por ejemplo las familias celulares, los plasmidos, los promotores, los marcadores de resistencia, origines de replicación y otros fragmentos de vectores, en tanto no sean como los descritos aquí, hayan sido depositados, existan en el mercado o de obtención general. En caso de que no de indique otra cosa, solo se utilizan como ejemplos y no son decisivos para el desarrollo de la invención, sino que pueden substituirse por otras "bases constructivas"- Las células anfitrionas bacterianas se utilizan preferentemente para la amplificación de la secuencias de ADN nombradas de acuerdo con la invención, ejemplos de esto son E. coli o Bacillus spec. La preparación de anticuerpos humanizados puede realizarse en células eucarióticas como células de levadura, hongos o por ejemplo CHO (células de ovarios de conejillos de indias) . La producción en plantas puede realizarse en plantas monocotiledoneas o dicotiledóneas. Como ejemplo a continuación se describirá la preparación de anticuerpos en plantas. La preparación de otros organismos se realiza de manera análoga. La preparación de ciertos anticuerpos en plantas es conocido ya por [2] y la solicitud de patente internacional WO 91/06320. Para la preparación del anticuerpo monoclonal en plantas transgenicas se clonan en un vector de transformación vegetal los genes para el anticuerpo monoclonal total o para sus derivados recombinantes o el gen para un anticuerpo de una cadena bajo el control de uno o dos promotores activos en las plantas. Ya que el vector de transformación listo contiene todas las secuencias de ADN a transferir en las plantas . Estas se transfieren del vector a las células vegetales. Alternativamente los genes de las cadenas ligeras y pesadas también pueden introducirse en dos vectores de transformación vegetales y por separado se transfieren en células vegetales, para después reunirías en el anticuerpo ya terminado. La transformación de plantas puede realizarse con todos los procedimientos adecuados, por ejemplo con la ayuda de Agrobacterium tumefaciens o por medio de transferencia genética directa o con la ayuda de cañones de partículas . LA producción de los anticuerpos puede controlarse de acuerdo con el objetivo en compartimientos individuales de las células. En la separación de la secuencia codificante del péptido de señal se expresan los anticuerpos citoplasmaticamente . Para una alta expresión del anticuerpo se acopla en el extremo 5 ' del gen, una secuencia de ADN o se deja la natural, que codifica a un péptido de señal para el transporte en el retículo endoplasmatico. Para lograr una localización determinada en un compartimiento celular definido, las secuencias de ADN que codifican a las secuencias de péptido responsables ellas, pueden estar fusionadas en el gen. Por medio de la integración de una secuencia KDE puede obtenerse por ejemplo una retención en el retículo endoplasmatico. Por medio de la introducción del gen de anticuerpo en las plantas transgenicas se analiza y determina por medio de digestión de restricción adecuada del ADN vegetal genómico aislado y subsecuente hibridización Southern. La transcripción de los genes puede demostrarse por medio de Northern Blot. Los anticuerpos biosintetizados se determina con la ayuda de un anticuerpo policlonal o monoclonal secundario específico o dirigido contra la región constante o contra una secuencia policlonal dirigida a esa secuencia introducida para ese fin (llamada Tag-) en los extractos vegetales . Como plantas de producción son adecuadas tanto las plantas monocotiledoneas como por ejemplo como cebada y trigo como también plantas dicotiledóneas como por ejemplo papa, colza, zanahoria o chícharo. La expresión de los anticuerpos puede realizarse en diferentes órganos de las plantas como por ejemplo en las hojas, semillas, tubérculos u otros tejidos. La purificación del anticuerpo expresado en las plantas se realiza por ejemplo con métodos cromatograficos, que habitualmente también se utilizan para la purificación de los anticuerpos de líneas celulares de hibridoma. Además pueden purificarse los anticuerpos recombinantes, que contiene una secuencia Taq, también por medio de procedimientos de cromatografía de afinidad establecidos para esto, como por ejemplo cromatografía de quelato metálico. Los anticuerpos monoclonales humanizados pueden administrarse a pacientes humanos para la terapia y profilaxis de enfermedades que son provocadas por Clostridium difficile, de acuerdo con procedimientos conocidos. En general los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos pueden administrarse parenteralmente, sin embargo preferentemente per os. Como preparación "galénica especial " entra en consideración la ingestión peroral directa de plantas que contengan el anticuerpo en forma cruda. La dosificación adecuada de los anticuerpos debe ajustarse a cada paciente y depende por ejemplo de su peso corporal, su edad y su patología. Se determinara por parte de un médico experimentado y se encuentra habitualmente entre 0.1 mg/kg y 70 mg/kg, que se administra una o varias veces en un período de tiempo de varios días. Ejemplos Ejemplo 1: Obtención del ARN total de las células de hibridoma, que forman el mAk TTC8 (DSM ACC 2322) Para la purificación del ARN por medio de gradientes CsCl primero se abren las células inicialmente por medio de amortiguador de guanidinio-tiocinato y subsecuentemente de destruyen mecánicamente por completo con la ayuda de un Ultrathorax. Los grumos celulares se centrifugan y la solución se vierte sobre un cojín de CsCl previamente preparado (5.7 M) . Con la subsecuente centrifugación el ARN se forma en pelets en el fondo del tubo. Ese fondo se retira con un escápelo caliente y el pelet se disuelve por medio de la adición de H20. De la solución se purifica subsecuentemente el ARN por medio de precipitación. Al final se vierte en 100 µl de H20. La concentración del ARN preparado es por lo regular de 1.5-3 µg/µl .

Ejemplo 2: Aislado de mARN Para la purificación de mARN de las otras especies de ARN se hibridizo en granulos de oligo (dT)23 de acuerdo con el procedimiento descrito por Dynal . La capacidad de enlace de los granulos fue de 2 µg ARN por mg de granulado, la fracción de mARN en el ARN total fue de aproximadamente 1 5%, de tal forma que l mg de granulos fue recubierto con 80 µg de ARN total. La purificación se realizó de acuerdo con el protocolo de la Firma Dynal con las siguientes desviaciones. El mARN ligado se lavó dos veces con un amortiguador de la composición 10 mM Tris/HVl (pH 7.5), 0.15 mM LiCl, 1 mM EDTA, 1% SDS y después dos veces con un amortiguador derivado con una concentración reducida de sales [5 mM Tris/HCl (pH 7.5), 75 mM LiCl, 0.5 mM EDTA]. Todos los demás pasos correspondieron a los datos de Dynal . La adición de SDS y el paso de lavado adicional con una baja concentración de sales (alta estringencia) mejora la pureza del mARN de manera esencial . Ejemplo 3: Síntesis de cADN A partir de mARN purificado se sintetiza cADN utilizando transcriptasa LLMV (Virus de leucemia de murina Moloney) . Para esto se utilizo el cebador Oligo (dT) 12-18 en un exceso de 2x, para mantener alta la fracción de la molécula hibridizada de mARN-Oligo (dT) . En la reacción la concentración de los trifosfatos nucleótidos mayor a 1 mM.

Una destrucción prematura alta de ARN en la solución se contrarrestó por medio de la adición de inhibidor de ribonucleasa humana y de placenta. El ssADN así obtenido se utiliza en las reacciones PCR para la amplificación de las regiones variables del mAb TTC8. Ejemplo 4: LA reacción de cadena de polimerasa para la amplificación de cADN La amplificación de cADN se realizó de manera correspondiente al procedimiento conocido por el escrito de patente europeo 0 388 914. Con ayuda de una serie de publicaciones se desarrollaron algunos cebadores para la amplificación PCR de las regiones variables de los anticuerpos monoclonales de la especie del ratón. Estos son: Cadenas pesadas: (se subrayan unos puntos de corte Salí introducidos) VH5Prim: 5 ' -AGGTCGACCTGCAG/C/G)AGTC (A/T)GG-3 • VH3Prim: 5 ' -ACGGTGACAGTCGACCCTTGGCCCC-3 ' Cadenas ligeras: (se subrayan unos puntos de corte Sacl introducidos) VL5Prim: 5 ' -GACATTGAGCTCACCCAGTCTCCA-3 ' VL3Prim: 5 ' -GTTTGAGCTCCAGCTTGGTCCC-3 ' La concentración óptima de cebadores para la obtención de regiones variables fue de 0.5 µM, los dNTPs se utilizaron en una concentración final de 400µM.

Como segundo parámetro esencial se determinaron las temperaturas de PCR. Para la amplificación VH la secuencia de reacción fue la siguiente: desnaturalización l minutos 92°C; templado 1.5 minutos a 50°C; alargamiento 3 min a 72°C, durante 30 ciclos. Para la amplificación VL la secuencia fue la siguiente: desnaturalización 1 minuto a 92°C; templado 1.5 minutos a 60°C; alargamiento 3 minutos a 72°C, durante 30 ciclos. Ejemplo 5: La clonación del gen VH y VL de mAk TTC8 Para la clonación se cortaron los productos PCR con Salí (VH) o Sacl (VL) y se purificaron sobre gel de agarosa. La clonación se realizó en pUC19 en los puntos de corte homólogos . Como clones objetivo se identificaron las construcciones pV?T8 y pVLT8.10 por medio de procedimiento se control . Contenían los segmentos VH y VK en orientación positiva en relación al promotor pLac del pUC19. Ejemplo 6: La secuenciación de lo dominios variables del mAk TTC8 El inserto del pVHTd tiene un tamaño de 341 bp, el del clon pVLTd.10 uno de 312 bp. Ambos clones poseen cada uno un marcador de lectura, que se extiende en todo el inserto total . Las secuencias del cebador PCR y los puntos de corte pudieron identificarse bien. Por medio de la comparación de secuencias se obtiene la coordinación del segmento VH a la familia de múltiples genes J558. El grado mas alto de homología se dio a la secuencia de germen V102. El gen para la región VL del mAb TTV tiene una homología del 94% a una secuencia de un anticuerpo, que se suma al gen de germen vkl9d. De acuerdo con esto también la región VL del TTC8 esta coordinado a esa familia de genes. Ejemplo 7: Preparación de un anticuerpo monoclonal humanizado Para evitar durante la aplicación de anticuerpos de otras especies ( a continuación denominados como no humano) una reacción del sistema inmunológico humano, deben las regiones inmunogenicas de mAk se substituyen por medio de secuencias humanas homologas. Aquí hay en esencial dos posibilidades: a) la formación de anticuerpos quiméricos ratón/humano, en donde la región variable determinante del antígeno del anticuerpo quimérico del anticuerpo no humano, la región constante surge de un anticuerpo humano b) la humanización constante del mAk. Allí también las regiones de estructura en la región variable de mAKs se substituyen por las correspondientes secuencias humanas y luego solo se mantienen las regiones CDR en el original o como variantes alélicas. Para la realización práctica puede hacerse uso de una serie de métodos, que han sido publicados y son bien conocidos en la técnica. sobre a) Los anticuerpos quiméricos se obtienen al acoplar en un sistema de vector adecuado, las secuencias de las regiones constantes de un anticuerpo humano en las secuencias de la región variable del mAk no humanos . También puede prepararse un anticuerpo quimérico completo o también solo una parte del anticuerpo quimérico, un llamado fragmento Fab [3] . La preparación de anticuerpos quiméricos tiene la ventaja de que metódicamente presenta relativamente pocos problemas. Los anticuerpos así obtenidos presentan debido a la fracción de ratón que permaneció en la proteína, una inmunogenicidad ligeramente elevada, pero que en el caso de la aplicación peroral tiene un papel secundario. sobre b) Para la humanización completa de mAks no humana primero se identifica por medio de comparación de secuencias y modelado 3D, un anticuerpo humano, cuya estructura corresponde en algo al del anticuerpo original . A continuación por medio del uso de cinco cebadores oligonucleótidos, que se ligan en la secuencia de la región variable del anticuerpo humano (VL o VH) , así como tres oligonucleótidos, que incluyen las secuencias de las regiones CDR del anticuerpo de ratón, con la ayuda de amplificaciones PCR realizadas una sobre la otra se obtiene un gen humanizado completo para la fracción variable del anticuerpo [4] . Una segunda producción modificada consiste en preparar el gen de múltiples oligonucleótidos traslapados sintéticos, que codifiquen para la secuencia buscada [sobre la estrategia y realización ver 4] . Alternativamente existe también la posibilidad de, después de la identificación de un anticuerpo humano homólogo, compensar solo los aminoácidos en los cuales las regiones de estructura se diferencian ambos Ak, por medio de mutagenesisis dirigida [5] . Los anticuerpos así modicados pueden sufrir una modificación de su especificidad, que pueden compensarse por medio de transmutaciones [5] . La humanización completa de los anticuerpos de la forma mencionada al final produce un gasto metodológico relativamente alto, sobre todo esos anticuerpos no producen prácticamente respuesta inmunológica en los humanos [6] .

Bibliografía: [1] Eichel-Streiber, C.v. P. Boquet, M. Sauerborn y M. Thelestm. 1996. Large clostridial cyttotoxins- a family of glycosultransferasas modifying small GTP-bindings proteins. Trends iun Microbiology, 14: 375-382. [2] Düring, K (1988) "Wundindzierte expression und Sekretion von T4 Lysozum und Monoklonalen Antikórpern in Cotiana tabacum.", tesis de doctorado, Uniersidad de COlonia. [3] Skerra A., (1994), A general vector, pASK 84, fro cloning, bacterial production and single step purification of antibody Fab fragments. Gene 141:79-84. [4] Sato L., M. Tsuchiya, J. Saldanha, Y. Koishihjara, Y. Ohsugi, T. Kishimoto y M.M: Bending (1994) . Humanization of a mouse anti-human Interleukin-6- receptor antibody comparing two methods for selecting human framework regions. Mol. Immun. 31:371-381. [5] Benhar, I., E-A. Padlan, S:H: Lee, B. Lee y I. PAstan (1994) . Rapid humanization of the Fv of monoclonal antibody B3 by using framework exchange of the recombinant immunotoxin B3(Fv)-PE38. Prco. natl . Acad. Sci. US 91:12051-12055. [6] Stephens S., S. Emtage, O. Vetterlein, L. Chaplin, C. Bebbington, A. Nesbitt, M. Sopwith, D. Athwal . , C: Nowak y M. Bodmer 81995) . Comprehensive pharmacokinetics of a humanized antibody and analysius of residual anti-idiotyypic responses. Immunology 85:668-674. [7] ... reaction to genérate umanised monoclonal antibodies", GENE, vol. 101, no. 2, l. enero 1991, paginas 297-302. [8] Lyerly et al.: "Vaccination against lethal Clostridium difficile Enterocolitis with a non-toxic recombinant peptide of toxin A", CURRENT MICROBIOLOGY, vol. 21, julio 1990, paginas 29-32. [9] Corthier G. et al .: "Protection against experimental pseudomembranous colitis in gnotobiotic mice by use of monoclonal antibodies against Clostridium difficile toxin A", INFECTION AND IMMUNITY, vol. 59, no. 3, marzo 1991, paginas 1192-1195.

PROTOCOLO DE SECUENCIA (1) DATOS GENERALES (i) SOLICITANTE (A) NOMBRE: Dr. Christoph von Eichel-Streiber (B) CALLE: Bingerweg 15 (C) CIUDAD: Schweppenhausen (D) ESTADO: Renania-Palatinado (E) PAÍS: República Federal de Alemania (F) CÓDIGO POSTAL: 55444 (G) TLEFONO: 06724(3398 (H) TELEFAX: 06724/941078 (ü) TITULO DE LA INVENCIÓN: SECUENCIAS AMINOACIDAS PARA LA TERAPIA Y PROFILAXIS DE ENFERMEDADES PROVOCADAS POR LAS TOXINAS DE CLOSTRIDIUM DIFFICILE (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 16 (iv) EDICIÓN LEGIBLE POR COMPUTADORA: (A) MEDIO DE ALMACENAMIENTO DE DATOS: disco flexible (floppy) (B) COMPUTADORA: compatible con IBM PC (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: PatentIn Reléase #1.0, versión #1.30 (EPA) (vi) DATOS DE LA SOLICITUD ORIGINAL: (A) numero de solciitud: de 19739685.2 (B) FECHA DE SOLICITUD: 10 septiembre 1997 (2) DATOS SOBRE LA SEQ ID NO . 1 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 15 pares de bases (B) TIPO: nucleótidos (C) FORMA DE LA CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE LA MOLÉCULA: CADN (iii) HIPOTÉTICA: No (iv) ANTISENTIDO: NO (v) TIPO DEL FRAGMENTO: cadena pesada CDRl (vi) FUENTE ORIGINAL: (B) CEPA: anticuerpo monoclonal TTC8 (H) FAMILIA CELULAR: Hibridoma (vii) ORIGEN DIRECTO: (A) BIBLIOECA: DSM ACC 2322 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE : CDS (B) LONGITUD: 1..15 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO . 1 AAC TAC TGG ATC AAC Asn Tyr Trp Met Asn 1 5 (2) DATOS SOBRE LA SEQ ID NO . 2 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 5 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE LA MOLÉCULA: CDRl secuencia de proteínas de la cadena pesada (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 2 sn Tyr Trp Met Asn 5 (2) DATOS SOBRE LA SEQ ID NO . 3 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 51 pares de bases (B) TIPO: nucleótidos (C) FORMA DE LA CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE LA MOLÉCULA: cADN (iü) HIPOTÉTICA: No (iv) ANTISENTIDO: No (v) TIPO DEL FRAGMENTO: cadena pesada CDR2 (vi) FUENTE ORIGINAL: (B) CEPA: anticuerpo monoclonal TTC8 (H) FAMILIA CELULAR: Hibridoma (vii) ORIGEN DIRECTO: (A) BIBLIOECA: DSM ACC 2322 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE : CDS (B) LONGITUD: 1..51 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO . 3 CGG ATT TAT CCT GGA GAT GGA GAT GCT CAC TAC AAT GGG AAG TTC AAG Arg lie Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Ala His Tyr Asn Gly Lys Phe Lys 5 10 15 GGC 5 Gly (2) DATOS SOBRE LA SEQ ID NO . 4 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 17 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE LA MOLÉCULA: CDR2 - Secuencia de proteínas de la cadena pesada (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO . 4 Arg lie Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Ala His Tyr Asn Gly Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly (2) DATOS SOBRE LA SEQ ID NO. 5 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 33 pares de bases (B) TIPO: nucleótidos (C) FORMA DE LA CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE LA MOLÉCULA: cADN (iii) HIPOTÉTICA: No (v) TIPO DEL FRAGMENTO: cadena pesada CDR3 (vi) FUENTE ORIGINAL: (B) CEPA: anticuerpo monoclonal TTC8 (H) FAMILIA CELULAR: Hibridoma (vii) ORIGEN DIRECTO: (A) BIBLIOECA: DSM ACC 2322 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE : CDS (B) LONGITUD: 1..33 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO . 5 GGG GGG AAT TAC GAC GAC AGG GTC TTT GAC TAC Gly Gly Asn Tyr Asp Asp Arg Val Phe Asp Tyr 1 5 10 (2) DATOS SOBRE LA SEQ ID NO . 6 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 11 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE LA MOLÉCULA: CDR3 - Secuencia de proteínas de la cadena pesada (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO . 6 Gly Gly Asn Tyr Asp Asp Arg Val Phe Asp Tyr 1 5 10 (2) DATOS SOBRE LA SEQ ID NO . 7 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 33 pares de bases (B) TIPO: nucleótidos (C) FORMA DE LA CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE LA MOLÉCULA: CADN (v) TIPO DEL FRAGMENTO: región hipervariable (CDR) de cadena ligera (vi) FUENTE ORIGINAL: (B) CEPA: anticuerpo monoclonal TTC8 (H) FAMILIA CELULAR: Hibridoma (vii) ORIGEN DIRECTO: (A) BIBLIOECA: DSM ACC 2322 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LONGITUD: 1..33 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO . 7 AAG GCC AGT CAG AAT GTG GGT ACT AAT GTA GCC 5 10 (2) DATOS SOBRE LA SEQ ID NO . 8 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 11 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE LA MOLÉCULA: CDRl - Secuencia de proteínas de la cadena ligera (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 8 Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala 1 5 10 (2) DATOS SOBRE LA SEQ ID NO. 9 5 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 pares de bases (B) TIPO: nucleótidos (C) FORMA DE LA CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: desconocida 10 (ii) TIPO DE LA MOLÉCULA: CADN (iii) HIPOTÉTICA: no (v) TIPO DEL FRAGMENTO: cadena ligera CDR2 (vi) FUENTE ORIGINAL: (B) CEPA: anticuerpo monoclonal TTC8 15 (H) FAMILIA CELULAR: Hibridoma (vii) ORIGEN DIRECTO: (A) BIBLIOECA: DSM ACC 2322 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE : CDS 20 (B) LONGITUD: 1..21 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO . 9: TCG CCA TCC TC CGG TC AGT Ser Pro Ser Tyr Arg Tyr Ser 5 25 (2) DATOS SOBRE LA SEQ ID NO. 10 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 7 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE LA MOLÉCULA: CDR2 - Secuencia de proteínas de la cadena ligera (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 10: Ser Pro Ser Tyr Arg Tyr Ser 1 5 (2) DATOS SOBRE LA SEQ ID NO. 11 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 27 pares de bases (B) TIPO: nucleótidos (C) FORMA DE LA CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE LA MOLÉCULA: cADN (iii) HIPOTÉTICA: No (iv) ANTISENTIDO: No (v) TIPO DEL FRAGMENTO: cadena ligera CDR3 (vi) FUENTE ORIGINAL: (B) CEPA: anticuerpo monoclonal TTC8 (H) FAMILIA CELULAR: Hibridoma (vii) ORIGEN DIRECTO: (A) BIBLIOECA: DSM ACC 2322 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE : CDS (B) LONGITUD: 1..27 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 11 CAG CAA TATT AAT AGC TAT CCT CTT ACG Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr 5 (2) DATOS SOBRE LA SEQ ID NO. 12 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE LA MOLÉCULA: CDR3 - Secuencia de proteínas de la cadena ligera (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 12: Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr 1 5 (2) DATOS SOBRE LA SEQ ID NO. 13 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 341 pares de bases (B) TIPO: nucleótidos (C) FORMA DE LA CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE LA MOLÉCULA: CADN (iii) HIPOTÉTICA: No (v) TIPO DEL FRAGMENTO: región variable VH de la cadena pesada (vi) FUENTE ORIGINAL: (B) CEPA: anticuerpo monoclonal TTC8 (H) FAMILIA CELULAR: Hibridoma (vii) ORIGEN DIRECTO: (A) BIBLIOECA: DSM ACC 2322 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LONGITUD: 1..341 (IX) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE : primer enlace (B) LONGITUD: 1..21 (D) OTROS DATOS: /label=VH5PRIM (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE : primer enlace (B) LONGITUD: 325..341 (D) OTROS DATOS: /label=VH3PRIM (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 13 GTC GAC CTG CAG CAG TCT GGA CCT GAG CGT GTG AAG CCT GGG GCC TCA Val Asp Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Lou Val Lys Pro Gly Ala Ser 1 5 10 15 GTG AAG ATT TCC TGC AAA GCT TCT GGC TAC GCA TTC AGT AAC TAC TGG Val Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asn Tyr Trp 20 25 30 ATG AAC TGG GTG AAG CAG AGG CCT GGA AAG GGT CTT GAG TGG ATT GGA Mot Asn Trp Val Lys Gln Arg Pío Gly Lys Gly Leu Glu Trp He Gly 40 45 CGG ATT TAT CCT GGA GAT GGA GAT GCT CAC TAC AAT GGG AAG TTC AAG Arg He Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Ala His Tyr Asn Gly Kys Phe Lys 50 55 60 GGC AAG GCC ACÁ CTG ACT GCA GAC AAA TCC TCC AGC ACÁ GCC TAC ATG Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser THr Ala Tyr Met 65 70 75 80 CAA CTC AGC AGC CTG ACÁ TCT GAC GAC TCT GCG GTC TAC TTC TCT CCA Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala 85 90 95 AGA GGG GGG AAT TAC GAC GAC AGG GTC TTT GAC TAC IGG GGC CAA GGG Arg Gly Gly Asn Tyr Asp Asp Arg Val Phe Asp Tyr Trp Gly GÍn Gly 100 105 110 TGC AC Ser (2) DATOS SOBRE LA SEQ ID NO. 14 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 113 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE LA MOLÉCULA: Secuencia de proteínas de la región variable de la cadena pesada (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 14: Val Asp Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser 1 5 10 15 Val Lys He Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asn Tyr Trp 20 25 30 Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp He Gly 40 45 Arg ILe Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Ala His Tyr Asn Gly lys Phe Lys 50 55 60 Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met 65 70 . 75 Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Gly Asn Tyr Asp Asp Arg Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110 Ser (2) DATOS SOBRE LA SEQ ID NO. 15 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 312 pares de bases (B) TIPO: nucleótidos (C) FORMA DE LA CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE LA MOLÉCULA: cADN (iii) HIPOTÉTICA: No (v) TIPO DEL FRAGMENTO: región variable VH de la cadena ligera (vi) FUENTE ORIGINAL: (B) CEPA: anticuerpo monoclonal TTC8 (H) FAMILIA CELULAR: Hibridoma (vii) ORIGEN DIRECTO: (A) BIBLIOECA: DSM ACC 2322 (IX) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE : primer enlace (B) LONGITUD: 289..312 (D) OTROS DATOS: /label=VL5PRIM (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE : primer enlace (B) LONGITUD: 289..312 (D) OTROS DATOS: /label=VL3PRIM (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LONGITUD: 1..312 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 15 GAG CTC ACC CAG TCT CCA AAA TTC ATH TCC ACÁ TCA GTA GGA GAC AGG Glu Leu Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg 1 5 10 15 GTC ACC CTC ACC TCC AAG GCC AGT CAG AAT GTG GGT ACT AAT GTA GCC Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala 20 25 30 TGG TAT CAA CAG AAA CCA GGG CAA TCT CCT AAA ACÁ CTG ATT TAC TCG Tro Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Thr Leu He Tyr Ser 35 40 45 CCA TCC TAC CGG TAC AGT GGA GTC CCT GAT CGC TTC ACÁ GGC AGT GGA Pro Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly 50 55 60 TCT GGG ACÁ GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AAT GTG CAG TCT GTT GAC Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Asn Val Gln Ser Val Asp 65 70 75 80 TTG GCA GAG TAT TTC TGT CAG CAA TAT AAT AGT TAT CCT CTT ACG TTC Ley Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr Phe 85 90 95 GGC TCG GGG ACCC AAG CTG GAG CTC Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 (2) DATOS SOBRE LA SEQ ID NO. 16 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 104 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE LA MOLÉCULA: Secuencia de proteínas de la región variable de la cadena LIGERA (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 16: Glu Leu Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg 1 5 10 15 Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala 20 25 30 Tro Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Thr Leu He Tyr Ser 35 40 45 Pro Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Asn Val Gln Ser Val Asp 65 70 75 80 Ley Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr Phe 85 90 95 Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes : REIVINDICACIONES

1.- Secuencia aminoácida, caracterizada porque contiene completa o parcialmente las secuencias aminoácidas seleccionadas de entre SEQ. ID. No. l, SEQ. ID. No. 2, SEQ. ID. No. 4, SEQ. ID. No. 6, SEQ. ID. No. 8, SEQ. ID. No. 10 O SEQ. ID. No. 12, del protocolo de secuencia, y porque liga la toxina A de Clostridum difficile.

2. - Secuencia de ADN, caracterizada porque codifica a una o mas de las secuencias aminoácidas de la reivindicación 1.

3. - Secuencia de ADN de acuerdo con la reivindicación 2 , caracterizada porque contiene una o varias secuencias nucleótidas seleccionadas de SEQ. ID. No. l, SEQ. ID. No. 3, SEQ. ID. No. 5, SEQ. ID. No. 7, SEQ. ID. No. 9 O SEQ. ID. No. 11 del protocolo de secuencia.

4.- Secuencia aminoácida, caracterizada porque contiene o consiste de una secuencia seleccionada de SEQ. ID. No. 14 y SEQ. ID. No. 16 del protocolo de secuencia.

5. - Secuencia de ADN, caracterizada porque contiene o consiste de una secuencia nucleótida seleccionada de SEQ. ID. No. 13 y SEQ. ID. No. 15 del protocolo de secuencia.

6. - Secuencia aminoácida de acuerdo con la reivindicación 1 o 4, caracterizado porque contiene uno o mas derivados modificados por variaciones alélicas de las secuencias aminoácidas, que presentan un efecto biológico comparable con la secuencias aminoácidas de acuerdo con la reivindicación 1.

7. - Secuencia de ADN, caracterizado porque codifica a una o varias de las secuencias aminoácidas de acuerdo con la reivindicación 6.

8.- Familia celular de hibridoma DSM AC 2322.