MXPA00001975A - Metodos y composiciones para la curacion mejorada de las heridas - Google Patents

Abstract

Esta invención proporciona un método para el mejoramiento de la curación de las heridas, que comprende administrar un inhibidor del flujo de eosinófilos en un sitio de la herida, suficiente para dar como resultado la curación de la herida.

Description

MÍTODO Y COMPOSICIONES PARA LA CURACIÓN MEJORADA DE LAS HERIDAS La solicitud de las ' reivindicaciones en beneficio de la Solicitud Provisional Norteamericana No. 60/057,108, registrada el 27 de Agosto de 1997.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona en general al tratamiento del daño epitelial.

AwTHcebE TES -pt ¿Aj:«Ufc<üc.?o»-J- La curación de las heridas es un proceso critico para la supervivencia de las especies después de una herida. Hace veinte años, se mostraba que los eosinófilos son componentes del infiltrado inflamatorio en heridas de incisiones cutáneas (Bassett et al., 1977, Br, J. EXP. Pathol . , 58:581-605); sin embargo la importancia de la presencia de los restos de eosinófilos no es clara. Los eosinófilos han estado implicados en la regulación del metabolismo del colágeno (Hibbs et al., 1982, Biochem J. , 207: 621-624) y se han mostrado para elaborar la transformación del factor de crecimiento alfa (TGF-a) (Elovic et al, 1990, Am J. Pathol . , 137: 1425-1434; Wong et al., 1990, J. Exp. Med. , 172: 679-81) y la transformación del factor de crecimiento beta 1 (TFG-ßl); Wong et al., Blood, 1991, 78: 2702-2707), dos citocinas multifuncionales de importancia en la curación de heridas (Schreiber et al., 1986, Science , 232: 1250-1253; Pierce et al., 1989, J. Cell. Biol. , 109: 429-440; Quanglino et al., 1990 Lab. Invest . , 63: 307-319) . En un modelo de hámster, se ha demostrado que la infiltración de eosinófilos prominentemente en heridas abiertas de la piel, donde están presentes una fuente celular de TGF-a y TGF-ßl en ambos ARNm y los niveles de proteínas (Wong et al., 1993 Am . J. Path. , 143: 130-142), y la marcación de TGF-a y TGF-ßl por medio de eosinófilos en heridas bucales se han caracterizado en detalle (Yang et al, 1996, Am. J. Phvsiol.. 270: G191-G202).

Los eosinófilos son una estirpe distinta de los granulocitos que se originan en la médula ósea, circulan en la sangre y emigran dentro de los tejidos periféricos (Spry, 1988, Eosinófilos , ed. C. Spry Oxford University Press, Nueva York) . Aunque los eosinófilos normalmente comprenden solo el -3% de los leucocitos circulantes en humanos, gran número de eosinófilos maduros son especialmente abundantes cerca de las superficies mucosas de los tractos gastrointestinal, respiratorio, y genitourinario (Spry and Tai, 1976, Clin. Exp. Immunol . , 24: 423-434). Además, se incrementa grandemente el número de eosinófilos que aparecen en la sangre y tejidos asociados con la respuesta inmune o procesos de enfermedad tales como infecciones parasitarias helmínticas, enfermedades alérgicas, y otros estados patológicos con causas menos definidas (Weller, 1991, N. Enal. J. Med. , 324: 1110-1118) .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención abarca un método de curación mejorada de las heridas, que comprende administrar a un mamífero en necesidad de una cantidad suficiente de un inhibidor de influjo de eosinófilos dentro de un sitio con heridas para originar la curación de una herida.

Como se utiliza aqui, el término "herida" se define como cualquier rompimiento en el epitelio. Este rompimiento puede resultar de un corte, abrasión, adhesión, incisión quirúrgica, quemaduras por fricción térmica, química, o ulcerosa, y puede ser externa o interna .

El término "mejorada", cuando se usa aqui en referencia a la curación de heridas, se define como el incremento en la velocidad a la cual ocurre la curación, en donde la "curación" se define como la cerrada de la herida por la re-epitelialización, tal que la aplicación de ligera presión a la herida no origina en gran medida el derrame hacia el exterior de un fluido corporal, por ejemplo, sangre o fluido linfático.

Como se usa aqui, el término "epitelio" se refiere a las superficies interna y externa del cuerpo.

Como se utiliza aqui, el término "mamífero" se refiere a cualquier miembro de la Clase Mammalia, incluyendo un humano.

Como se utiliza aquí, el término "inhibidor" se define como cualquier sustancia que bloquea el influjo de eosinófilos dentro del sitio de la herida, si directamente o al inhibir una trayectoria de señalización resulta esta infiltración. El término "inhibidor" se define además como que bloquea o regresa los efectos de la infiltración de eosinófilos una vez que esta infiltración ha ocurrido. Este bloqueo o regreso puede ocurrir en el nivel de síntesis de una sustancia producida por un eosinófilo. Alternativamente, puede ser la actividad nativa de esta sustancia que se bloquea o se regresa, directamente, o por la inhibición de moléculas blanco corriente abajo, por ejemplo, en una cascada de señalización o trayectoria biosintética . Un inhibidor puede ejercer una función opuesta (por ejemplo, la activación de un receptor que es opuesto por la sustancia que se inhibe, o de un receptor que regula una señalización en cascada que resulta con una función opuesta a la que se controla por medio de un receptor activado por la sustancia) . Un inhibidor puede modificar la sustancia producida por el eosinófilo infiltrante, por ejemplo alterando su estado de fosforilación o glucosilación o división de la sustancia. Un inhibidor, tal como un anticuerpo, puede unirse a una sustancia y estéricamente bloqueando un sitio activo o carga de conformación de la sustancia; también puede, en el caso en donde la sustancia actúa en forma dimerizada o uí t imerizada, ser un monómero inactivo que se une a la sustancia y se adhiere en una unidad no funcional, que puede permanecer en el lugar o puede degradarse por mecanismos celulares.

Preferentemente, el inhibidor inhibe una citocina que influencia la maduración de los eosinófilos, en donde el inhibidor de la citocina resulta en la inhibición del influjo de eosinófilo en la herida; más preferentemente, este inhibidor inhibe un Factor de Estimulación de la Colonia (CSF); más preferentemente, este inhibidor inhibe la IL-5.

Como se utiliza aquí, el término "maduración" se refiere a los procesos en los cuales las células de contención hematopoyét ica se vuelven eosinófilos.

Preferentemente, el inhibidor es un anticuerpo anti-IL-5.

Otras características y ventajas de la invención serán totalmente aparentes en la siguiente descripción de las modalidades y dibujos aquí, y con las reivindicaciones .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 representa la progresión de la curación de la herida en la piel dorsal de hámster.

La Figura 2 presente una comparación de la densidad del eosinófilo en las heridas cutáneas el en día 9 de hámsteres tratados con el anticuerpo monoclonal anti-IL-5 o un anticuerpo monoclonal de control.

La Figura 3 muestra la detección de la infiltración de eosinófilo en las heridas cutáneas del día 9 de hámsteres tratados con el anticuerpo monoclonal anti-IL-5 o un anticuerpo monoclonal de control.

La Figura 4 representa el efecto del tratamiento del anticuerpo monoclonal anti-IL-5 en la cinética de la cicatrización de la herida epitelial del hámster.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Esta invención se basa en el reconocimiento de que a inhibición del influjo de eosinófilo en una herida resulta en la curación de la herida mejorada. Se describen aquí los modelos de animales para la curación de heridas por vía de la inhibición de la infiltración del eosinófilo en el sitio de la herida.

Inhibidores Usados de Acuerdo a la Invención La curación de heridas mejorada de acuerdo a los métodos de la invención, e.g. bloqueando el efecto de la eosinofilia en el tejido herido, puede llevarse a cabo mediante la intervención de dos niveles.

Primero, la invención proporciona un medio mediante el cual se contrarresta la inhibición del desarrollo del amplio grupo de células categorizadas como leucocitos, de las que los eosinófilos representan un miembro. Su desarrollo a partir de varias células madre hematopoyét icas se regula por la familia de proteínas del Factor de Estimulación de Colonia (CSF) . La administración de un inhibidor del CSF se cree que es efectivo en el desarrollo y función del bloqueo de leucocitos, el subgrupo de tipos de células de leucocitos afectadas se determina por la identidad de la molécula del CSF inhibida. Los inhibidores directos apropiados incluyen análogos del CSF (que competirían con un CSF dado para enlazarse a sitios en receptores y otras moléculas) , ARN antisentido, ribozimas específicos de ARNm del CSF y anticuerpos dirigidos a proteínas del CSF. Por métodos similares, la función del CSF puede inhibirse indirectamente, i.e. bloqueando la síntesis o actividades de las moléculas blanco corriente abajo, tal como moléculas de señalización o factores de crecimiento, que .participan en la ruta de inducción de leucocitos .

Un CSF, interleucina-5 (IL-5), regula positivamente la ruta que resulta en la maduración, la diferenciación terminal y la liberación de eosinófilos (Yamaguchi et al., 1988, J. EXP. Med. , 167: 1737-1742); por lo tanto, la inhibición de la producción de esta molécula por cualquiera de los métodos anteriores, podría realizarse de acuerdo a los métodos de la invención para negar el impacto de la infiltración del eosinófilo en la curación de heridas. Un inhibidor específico de IL-5 es TRKF-5 (suministrado para estos experimentos por Schering-Plough Research Institute), un anticuerpo monoclonal de murino dirigido contra IL-5 de humano. Este anticuerpo es heteroespecíficamente reactivo; 'en otras palabras, aunque el anticuerpo se originó contra una proteína humana, además reconoce los homólogos de IL-5 en otras especies. Su uso para inhibir la eosinofilia en un modelo animal de la curación de heridas se ejemplifica posteriormente en el Ejemplo 2. Observar que al menos otro anticuerpo monoclonal de ratón dirigido contra IL-5 de humano está comercialmente disponible (catálogo # MAB205, R & D Systems, Minneapolis, MN), y se espera que este anticuerpo pueda usarse de acuerdo a los métodos de la presente invención sin la indebida experimentación o incertidumbre sobre la parte de alguna promedio del experto en el arte. También es posible generar un anticuerpo anti-IL-5 mediante los métodos bien conocidos en el arte (ver posteriormente). La proteína IL-5 recombinante, purificada contra la cual es posible se aumentan los anticuerpos está comercialmente disponible; por ejemplo, el IL-5 de humano puede obtenerse de R & D Systems, Minneapolis, MN (Cat. No. 205-IL), como también IL-5 de ratón (Cat. No. 405-ML).

Segundo, contrarrestar los efectos de los eosinófilos que han infiltrado una herida en el tejido en tal sitio, compensará su efecto negativo en la velocidad de curación. Pare realizar esto, la invención proporciona la inhibición de los productos de eosinófilos, ya sea directa o indirectamente. Las proteínas específicas de tipo celular primero deben identificarse, y sus asociaciones con la curación de las heridas verificadas. La inhibición de estas proteínas se espera que resulte en una total o parcial reversión de la represión inducida por eosinófilos de la curación de heridas. Como se estableció anteriormente, las citocinas TGF-a y TGF-ßl se producen por eosinófilos en el tejido herido (Wong et al. 1993, supra), y son, como resultado, buenas candidatas de moléculas blanco para la inhibición del tratamiento de heridas. Aunque, no es conocido el mecanismo mediante el cual los eosinófilos influencian la velocidad de la curación de heridas, aquellos en la fase post-aguda de la curación de heridas elaboran la TGF-ßl, que es anti-proliferat iva a queratinocitos (Wong et al., 1993, supra), que sugiere un mecanismo posible mediante el cual esta proteína específica de eosinófilo inhibe la curación de heridas.

Un inhibidor de una citocina u otro producto de eosinófilos podría comprender un análogo de tal molécula, que puede competir con el producto para el enlazamiento de los sitios en un receptor u otra molécula, un ARN antisentido complementario a o una ribozima diseñada para romper el mensaje que codifica el producto o un anticuerpo dirigido contra el producto. Cualquiera de estas varias clases de inhibidores, pueden utilizarse alternativamente para bloquear un blanco corriente abajo del producto de eosinófilo, e.g. en una transducción de señal o ruta de biosíntesis, por cual se inhibe su acción indirectamente. Los anticuerpos dirigidos contra los productos de la eosinófilos son de particular uso de acuerdo a los métodos de la invención. Por ejemplo, los anticuerpos dirigidos contra las citocinas TGF-a y TGF-ßl están comercialmente disponibles; los anticuerpos adicionales pueden hacerse mediante los métodos bien conocidos en el arte (ver posteriormente ) Un anticuerpo policlonal TGF-a anti-humano de cabra está comercialmente disponible (Cat. No. AB239NA; R & D Systems, Minneapolis, MN) , como un anticuerpo monoclonal dirigido a los aminoácidos 34-50 del término C de TGF-a de humano (Cat. No. TGF-a; Ab-2; GF-10; Oncogene Science, Uniondale, NY) . El último se usó en la detección de TGF-a en el tejido herido, como se describe en el Ejemplo 4. Deberían fracasar estos anticuerpos como inhibidores de la función TGF-a, y llegar a ser necesario elevar los anticuerpos adicionales, la proteína TGF-a puede derivarse de al menos dos líneas celulares disponibles en ATCC: No. de catálogo CRL-2109 (FAT7), una línea de carcinoma de células escamosas de rata, y No. de catálogo CRL-2254 (AML), una línea hepatocita de hígado de ratón transformado que produce las proteínas TGF-a de ratón y humano.

En los experimentos de detección descritos en el Ejemplo 4, se usó un anticuerpo policlonal TGF-ßl antihumano de conejo (Cat. No. AB-20-PB; R & D systems, Minneapolis, MN) . También disponible en R & D Systems están Cat. No. MAB240, un anticuerpo monoclonal TGF-ßl anti-humano de ratón y AB246NA, un anticuerpo monoclonal TGF-ßl anti-humano de cabra. Estos anticuerpos deberían demostrar ineficiencia en la inhibición de los efectos de la eosinofilia, otros pueden prepararse (ver anteriormente). Dos líneas celulares comercialmente disponibles que producen TGF-ßl son como sigue: ATCC Nos. de Catálogo CRL-2159 (LS411N) y CRL-2134 (LS513), la última de esta es una línea celular derivada de tejido cecal (colónico).

Generación de Anticuerpos Las proteínas recombinantes o las derivadas de las fuentes naturales, pueden usarse para generar anticuerpos usando las técnicas estándares, bien conocidas en el campo. Por ejemplo, las proteínas se administran para estimular a un mamífero tal como un mono, una cabra, un conejo o un ratón. Los anticuerpos resultantes pueden colectarse como sueros policlonales o las células que producen anticuerpos de los animales estimulados pueden inmortalizarse (e.g. mediante fusión con una pareja de fusión inmortalizada) para producir los anticuerpos monoclonales.

Preparación de los Anticuerpos 1. Anticuerpos policlonales La proteína del antígeno podrían conjugarse a un vehículo convencional para aumentar su inmunogenicidad, y se aumenta un antisuero al conjugado transportador del péptido. El acoplamiento de un péptido a una proteína transportadora y las inmunizaciones podrían realizarse como se describió (Dymecki et al., 1992, J . Biol . Chem. , 267: 4815-4823). El suero se titula contra el antígeno de proteína por ELISA o alternativamente por teñido de punto (Boersma and Van Leeuwen, 1994, J. Neurosci . Methods , 51: 317) . Al mismo tiempo, el antisuero podría usarse en secciones de tejido. El suero se muestra que reacciona fuertemente con los péptidos apropiados por ELISA, por ejemplo, siguiendo los procedimientos de Green et al., 1982, Cell, 28: 477-487. 2. Anticuerpos monoclonales Las técnicas para preparar los anticuerpos monoclonales son bien conocidas, y los anticuerpos monoclonales podrían prepararse usando cualquier antígeno candidato cuyo nivel va a medirse en el tejido herido, tal como Factor del Estimulación de Colonia (e.g. IL-5) o, como se discute posteriormente, una citocina (e.g. TGF-a o TGF-ßl), preferentemente enlazado a un transportador, como se describe por Arnheiter et al., Nature, 294, 278-280 (1981) .

Los anticuerpos monoclonales so obtiene típicamente de cultivos de tejido de hibridoma o de fluido de ascitis obtenido de animales en los que el tejido de hibridoma se introdujo. Sin embargo, los anticuerpos monoclonales podrían describirse como "elevados hacia" o "inducidos por" una proteína.

Las pruebas inmunológicas particularmente preferidas dependen del uso de los anticuerpos monoclonales o policlonales e incluyen las inmunopruebas enlazadas por enzimas (ELISA), inmunoteñido y inmunoprecipitación (ver Voller, 1978, Diagnost ic Horizons , 2: 1-7, Microbiological Associates Quaterly Publicaction, Wal kersvi 1 le , MD; Voller et al., 1978 J. Clin. Pathol . , 31: 507-520; Patente Republicada U.S. No. 31,006; Patente UK 2,019,408; Butler, 1981, Methods Enzvmol . , 73: 482-523; Maggio, E. (ed.), 1980, Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Ratón FL) o radioinmunopruebas (RÍA) (Weintraub, B., Principies of radioimmunoassavs , Seventh training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March 1986, pp . 1-5, 46-49 y 68-78) . Para analizar los tejidos heridos para la presencia de una proteína que también va a actuar contra un inhibidor candidato de acuerdo a la presente invención, se usan preferentemente las técnicas inmunohistoquímicas . Será aparente para un experto en el arte que la molécula de anticuerpo tendrá marcado para facilitar la fácil detección de una proteína blanco. Las técnicas para marcar las moléculas de anticuerpos son bien conocidas para los expertos en el arte (ver Harlour and Lañe, 1989, Antibodies , Cold Spring Harbor Laboratory, pp . 1-726) .

Alternativamente, pueden usarse otras técnicas para detectar las proteínas blanco, que incluyen métodos cromatográficos tal como SDS PAGE, enfocamiento isoeléctrico, Western b'lotting, HPLC y electroforesis capilar .

Los hibridomas que producen anticuerpos monoclonales (o sueros policlonales) pueden cribarse para el enlazamiento del anticuerpo a la proteína blanco. Por anticuerpos, se incluyen construcciones que usan la región de enlazamiento (variable) de tales anticuerpos, y otras modificaciones de anticuerpos. De esta manera, un anticuerpo usado en la invención podría comprender anticuerpos enteros, fragmentos de anticuerpos, agregados de anticuerpos polifuncionales o en general cualquier sustancia que comprende uno o más sitios de enlazamiento específicos de un anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpos podrían ser fragmentos tal como fragmentos Fv, Fab y F(ab')2 o cualquier derivado de los mismos, tal como fragmentos Fv de cadena simple. Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos podrían ser no recombinantes, recombinantes o humanizados. El anticuerpos podría ser cualquier isotipo de inmunoglobulina, e.g., IgG, IgM etcétera. Además, los agregados, polímeros, derivados y conjugados de inmunoglobulinas o sus fragmentos pueden usarse en donde sea apropiado.

Métodos para Probar la Inhibición de Eosinofilia Para probar la eficiencia de los inhibidores del influjo del eosinófilo en un sitio herido, el inhibidor candidato se prueba en un modelo animal de la curación de heridas. Se conocen en el arte varios modelos de animales usados de acuerdo a la invención. Se demuestra un primer requerimiento de tal modelo que prueba que los eosinófilos, en vez de esto, infiltran la curación de tejidos en el organismo. Tal resultado se ha obtenido en varios sistemas de mamíferos. Los eosinófilos se ha encontrado que se asocian con las heridas subcutáneas en la rata (Bassett et al., 1977, supra; Hibbs et al., 1982 supra), el conejo (Erjefalt et al., 1996, Am . J. Respir. Crit . Care Med. , 153: 1666-74), el hámster (Wong et al., 1993, supra; Yang et al., 1996, supra) y el cerdo (datos no publicados) . Dado que tales observaciones también se han hecho en los humanos (ver posteriormente), los resultados de la prueba del inhibidor realizada en cualquiera de estos varios sistemas será aplicada al tratamiento clínico de las heridas superficiales en humanos. Si existe incert idumbre como si la curación en un sitio anatómico dado es seguida por el influjo de eosinófilo, esto puede determinarse mediante los métodos descritos en el arte posterior.

Teniendo primero seleccionado el organismo experimental y el sitio herido, el área superficial, la profundidad, la forma y la posición de la herida que puede monitorearse fácilmente para el cambio y la cual se curará durante un curso de tiempo conveniente, se decide, como es un método de curación (e.g. por medio de abrasión, incisión, quemado por químicos, radiación, etc.). Se prefieren las heridas circulares, como una medición simple del diámetro, es todo lo que se requiere para verificar la contracción de la herida. Después de establecer los parámetros para la curación de las heridas en un sujeto no tratado, un experimento de curación de heridas típico comprende los grupos de prueba y control de animales que son heridos co parablemente el mismo día. Por " comparablemente" , se entiende que las heridas de la misma forma, el área y la profundidad se hacen en la misma localización anatómica. Un grupo recibe una dosificación apropiada del inhibidor candidato en un transportador compatible, mientras que el otro se dosifica solo con el transportador, y la curación, como se define posteriormente en el Ejemplo 1, se monitorea durante el transcurso de muchos días. En un punto siguiendo la fase aguda inicial de la herida, cuando se reduce la inflamación y la curación está en progreso, se sacrifica la mitad de los animales en los dos grupos. Las heridas se cosechan, se seccionan y se someten a biopruebas, algunas diseñadas para medir la densidad de los eosinófilos que han infiltrado el tejido y otros dirigidos en los análisis de los marcadores de proteínas que se expresan localmente. Los resultados dentro de cada grupo se colectan y después se comparan con los derivados del otro grupo. Un resultado positivo, i.e. uno en el que los eosinófilos se observa que se reducen en el tejido herido de los sujetos de prueba con relación a los controles, o en donde existe una diferencia estadísticamente significativa en la expresión de los marcadores bioquímicos asociados de eosinófilos, tal como las citocinas TGF-a o TGF-ßl, entre los dos grupos, indica que el compuesto candidato es usado terapéuticamente de acuerdo a la invención. Una reducción del pliegue de 2 a 200 en la densidad del tejido herido que infiltra eosinófilos se requiere para que un resultado sea considerado positivo. Preferentemente, la reducción está en el rango de 200 a 1000 del pliegue, o aún de 2000 a 10,000 pliegues. Se asume una relación lineal entre la densidad del eosinófilo y los niveles de los marcadores producidos del eosinófilo en el tejido herido, tal que el grado de reducción en los niveles de los productos de los eosinófilos se correlacione con el mismo grado de curación mejorada que se observaría siguiendo la observación directa de una reducción de la magnitud comparable en la densidad del eosinófilo.

Los niveles de citocinas, e.g. TGF-a o TGF-ßl, u otros marcadores producidos de eosinófilos presentes en el tejido herido del epitelio externo, podrían probarse mediante cualquiera de varios medios, como se describe por Wong et al. (1993 supra) . Estos métodos, que pueden realizarse usando el modelo de curación de heridas cutáneas de hámsteres del Ejemplo 1, se describen en el Ejemplo 4, mientras que los métodos aplicados a la detección de las proteínas de eosinófilos y ácidos nucleicos en el tejido herido del epitelio interno se discuten en los Ejemplos 5 al 8. Estos métodos pueden resumirse brevemente, como sigue: a) Análisis Northern del ARNm asociado de eosinófilo en tejido herido seccionado. b) hibridación in si t u de sondas de ácidos nucleicos marcados para detectar las transcripciones asociadas de eosinófilos en secciones fijas de tejido herido. c) análisis de PCR del ARNm asociado de eosinófilo en tejido herido. d) Análisis inmunoci toquímico en tejido herido fijo, seccionado de proteínas producidas por eosinófilos .

Análisis Western de productos de proteínas de eosinófilos extraídos del tejido herido.

En la herida de un sujeto de prueba no tratado, los niveles observados del ARNm o proteínas asociados de eosinófilos deberían elevarse con relación a los encontrados en el tejido no herido derivado de la misma localización anatómica en un animal de control comparado. En este caso "comparable" se refiere a un segundo animal de la misma especie, cepa genética, edad, género y peso aproximado conforme el sujeto de prueba que se ha criado bajo condiciones similares en el laboratorio y que no se ha dañado en el sitio que se compara antes del tejido cosechado.

Después del establecimiento de los niveles de la línea base promedio del marcador de proteína o ARNm asociado con eosinófilos de interés, pueden probarse derivados de un número estadísticamente significativo de tal prueba y las mediciones de control hechas usando un número correspondiente de individuos de prueba y control, inhibidores candidatos de eosinofilia. Una reducción significativa en la concentración del marcador después de la línea base es indicativo de la eficiencia para la inhibición de la infiltración de eosinófilo en el tejido herido, la producción mediante tales eosinófilos como están presentes en una herida de la proteína marcadora dada o ARNm y/o la eliminación de tal proteína o ARNm de la herida.

Administración, Dosificación y Formulación Farmacéutica de un Inhibidor a. Administración Como se discutió anteriormente, los inhibidores candidatos deberían dirigirse ya sea en los eosinófilos mismos o en los productos específicos del eosinófilo. Dependiendo del blanco destinado del inhibidor, podrían usarse diferentes rutas de administración. En el primer caso, se debe intentar la inhibición en una de dos etapas críticas: (a) el desarrollo y/o liberación de los eosinófilos maduros, lo cual requiere que el inhibidor sea dirigido en las células madre hematopoyét icas por vía de la administración sistémica del fármaco o (b) reclutamiento de los eosinófilos al sitio herido. Mientras que el último proceso aún no se entiende, se anticipa que cuando se elucida el mecanismo expuesto, los compuestos inhibidores deberían dirigirse al mismo sitio herido, lo cual puede realizarse por la administración sistémica o tópica del compuesto candidato. En el segundo caso, dado que se asume que los productos para infiltrar eosinófilos, están localmente presentes en el sitio herido, ya sea la administración sistémica o tópica es, nuevamente, apropiada.

En los casos en los cuales la actividad del inhibidor se requiere a un sitio que es remoto con relación al de 1 a herida, la administración sistémica de un fármaco es en general apropiada. Los métodos de la liberación de fármacos a todo el cuerpo son bien conocidos en el arte. Estos incluyen, pero no se limitan a, goteo o inyección intravenosa, inyección subcutánea, intramuscular, intraperitoneal, intracraneal y espinal, ingestión por la ruta oral, inhalación, difusión trans-epitelial (tal como por vía de un parche adhesivo, impregnado de fármaco) o mediante el uso de un dispositivo de liberación de fármaco de tiempo liberado, implantable, que podría comprender una reserva de inhibidor producido exógenamente o, en vez de esto, podría comprender células que producen y secretan la sustancia inhibidora.

Alternativamente, la administración sistémica es ventajosa cuando el inhibidor debe liberarse a una herida que es accesible a la aplicación tópica, pero en la cual el ambiente (tal como el tracto digestivo), debe establecer la actividad nativa del inhalador, e.g. mediante enzimas digestivas o extremos de pH . 2. Aplicación Tópica del Inhibidor Se contempla que la administración global del inhibidor a un animal no se necesita para lograr un efecto altamente localizado. Dado que un herida epitelial es, por definición, sobre una superficie de un organismo, es posible la administración tópica de una composición farmacéutica. Por ejemplo, los antibióticos se aplican comúnmente a las heridas superficiales como una alternativa para la administración oral o intravenosa, estos métodos necesitan una dosificación absoluta mucho mayor para cuantificar el efector de la dilución enzimática, resultando en los posibles efectos colaterales en los tejidos no afectados y en el aumento de costo.

Las composiciones tópicas que comprenden un inhibidor pueden tomar cualquiera de varias formas físicas, como se resume a continuación: (i) un líquido, tal como una tintura o loción, que podría aplicarse vertiendo, goteando o "pintando" (i.e. rociando manualmente o con una brocha u otro aplicador tal como una espátula) . (ii) un ungüento o crema, que podría esparcirse ya sea manualmente o con una brocha u otro aplicador (e.g. una espátula), o podría ser extruida a través de una boquilla u otra abertura pequeña de un recipiente tal como un tubo colapsado. (iii) un polvo seco, que podría agitarse o colarse en la herida o, alternativamente, aplicarse como un atomizado nebulizado. (iv) Un aerosol de base líquida, que podría repartirse desde un recipiente seleccionado del grupo que comprende botellas atomizadoras accionadas por presión (tal como se activan por apretamiento), atomizadores naturales (o botellas de "atomizado por bomba" que trabajan sin un impulsor comprimido) o recipientes presurizados . (v) Una preparación de carbowax o glicerina, tal como un supositorio, que podría usarse para la administración rectal o vaginal de un inhibidor.

En un caso especializado, la superficie interna es la de un pulmón. Las lesiones epiteliales al pulmón a menudo resultan de la inhalación de humo u otras formas de quemado térmico o químico. En tal caso la ruta de administración más apropiada para el inhibidor es la vía de inhalación, ya sea de un aerosol líquido de (d) o un polvo nebulizado de (c) . La liberación del fármaco por inhalación, para la distribución tópica o sistémica, es bien conocida para el tratamiento de asma, bronquitis y anafilaxis. En particular, se ha demostrado que es posible liberar una pr teína por vía de la inhalación de aerosol, de modo que retiene su actividad i n vi vo (ver Hubbard et al., 1989, J. Clin. Invest . , 84: 1349-1354).

Observar que en algunos casos, la superficie en cuestión es interna, por ejemplo, el revestimiento gástrico, en tal caso, la aplicación tópica comprendería tomar el fármaco por vía de una ruta oral, ya sea en la forma de un líquido, gel o sólido. b. Dosificación La dosificación se calcula en la dosificación sistémica que se demuestra que es efectiva. Por ejemplo, los hámsteres de los Ejemplos 2 y 3, posteriores, tres recibieron dosificaciones de 5 mg durante un período de una semana; cada dosificación fue, por lo tanto de aproximadamente 58.8 mg/kg del peso corporal total al tiempo de la administración, basado en un peso corporal de 85 g. Tomando en cuenta la vida media de la actividad nativa de un inhibidor dado en el suero sanguíneo, la dosificación circulante media a través de toda la semana se estima en mg/kg del peso corporal total. Tal dosificación podría encontrarse en el rango de 10 µm a 100 mg ; preferentemente, de 100 µg a 10 mg . Después se calcula el volumen de las células que van a tratarse. Si la administración va a ser tópica, entonces V = área superficial de la herida x profundidad de las capas de células afectadas; asimismo, se estima el volumen total del cuerpo del individuo que va a tratarse. Esta figura se convierte a kg, asumiendo una densidad aproximadamente igual a l, y la dosificación del cuerpo total se divide por tal número. La concentración del inhibidor en la composición transportadora elegida, después se ajusta, de modo que la dosificación requerida se libera en un volumen conveniente. c. Formulación Farmacológica En el caso de líquidos, ungüentos y aerosoles basados en líquidos, el disolvente preferido es un medio acuoso con un balance iónico que imita los niveles de la sal fisiológica para preservar la actividad del inhibidor y para evitar los cambios en la presión osmótica para las células que se ponen en contacto con la composición. Un ejemplo de tal medio es una solución salina de baja fuerza iónica.

También deberían formularse lípidos, otros hidrocarburos, fluorocarburos o medios basados en halógenos, de modo que mantengan un balance de sal fisiológica. Mientras que tales medios podrían usarse de acuerdo a los métodos de la invención, se contraindica el uso sobre las heridas que resulta de la lesión térmica de lípidos y otros medios basados en hidrocarburos. En tales casos, los medios basados en fluorocarburos se han mostrado que son particularmente ventajosos (ver Oxynoid et al., 1994, Art. Cells, Blood Subs., and Immob . Biotech., 22(4) : 1331-1336) .

Los polvos secos que comprenden una proteína o carbohidrato podrían producirse por vía de aire seco de un precipitado o por liofilización; en algunos casos, un inhibidor podría ser una sal orgánica o inorgánica, comercialmente conocida y disponible como un polvo seco o como cristales. En cualquier caso, es deseable componer el inhibidor con un agente voluminoso, tal como se conocen comercialmente en el arte, para la facilidad de manej o .

Un inhibidor de influjo de eosinófilo en una herida podría comprender una proteína, carbohidrato u otra sustancia bio-degradable; por lo tanto, dependiendo de la ruta de administración, podría ser necesario encapsularlo o amortiguarlo de tal manera que se proteja de la degradación (por ejemplo, mediante enzimas digestivas, ácidos o bases), al menos hasta que alcance su blanco, mediante tales métodos como se conocen en el arte farmacológico.

La invención se ilustra por los siguientes ejemplos no limitantes en donde se emplean los siguientes materiales y métodos. La descripción completa de cada una de las siguientes referencias de la literatura citadas posteriormente se incorporan aquí por referencia .

El Ejemplo 1 describe el establecimiento de un modelo de herida de la piel abierta de hámster. El Ejemplo 2 describe el uso de una preparación de anticuerpo monoclonal anti-IL-5 (TRFK-5) para neutralizar las actividades de IL-5 i n vi vo y su efecto en el proceso de curación de heridas epiteliales en un modelo de hámster. El Ejemplo 3 presenta la evidencia para la especificidad del efecto de los anticuerpos dirigidos en IL-5 sobre la infiltración de la herida por los eosinófilos. El Ejemplo 4 presenta los métodos adicionales mediante los cuales puede probarse la eficiencia de los inhibidores candidatos de eosinofilia.

Mientras que los Ejemplos 1 a 4 se refieren a la prueba de un inhibidor de eosinofilia para su eficiencia en el mejoramiento de la curación de las heridas cutáneas externas, además se presentan lesiones epiteliales. Tales heridas podrían comprender úlcera gástrica, intestinal, nasal, oral y t raqueobronquial , abrasiones vaginal o anal y quemaduras térmicas o químicas a las vías nasales, sinusitis, tubos traqueobronquiales , pulmones, esófago, estómago o tracto intestinal, así como heridas por cortaduras o perforaciones, tal como de un objeto puntiagudo ingerido, o una herida de un disparo o cuchillo, incluyendo una incisión quirúrgica. Cada Ejemplo 5 a 8 presenta un modelo de animal diferente en el cual un inhibidor candidato se administra por vía de cualquiera de las varias rutas sistémicas o tópicas detalladas anteriormente y verificadas para la eficiencia en el mejoramiento de la curación de heridas del epitelio interno .

EJEMPLO 1 Establecimiento de un Modelo de Herida de la Piel Abierta de Hámster Hámsteres Syrian Machos (cepa LVG, 81 a 90 g de peso corporal) se obtuvieron del Charles River Laboratory (Wilmington, MA) . Todos los hámsteres fueron acompañados de un reporte médico, que certificó que estuvieron libres de patógenos (antígeno viral libre /patógeno específico libre) e incluyó una lista de los perfiles de serología, bacteriología, parasitología así como de patología de los hámsteres. No hay valor que exceda el rango normal. Durante el transcurso de los estudios no existieron indicaciones de infecciones helmínticas u otros parásitos, como fue evidente por la ganancia consistente en el peso corporal y el consumo de alimento/agua. Todos los animales se trataron de acuerdo a la Guide for the Care and Use of Laboratorv Animáis (DHHS No. de Publicación NIH 85-23, revisado en 1985). Cada hámster se mantuvo en una caja separada a través de todo el experimento Catorce mm de heridas en la piel circulares sencillas de espesor total se crearon en la espalda de los hámsteres entre las escápulas. Estas heridas abiertas se curaron por re-epitelialización y la contracción de la herida se muestra en la Figura 1 (Pincus et al., 1981, Blood, 58: 1175-1181), que presenta la progresión clínica del cierre de la herida en un hámster. Estas fotografías (aumento 1:1) se tomaron con una cámara Yashica Dental Eye orientada perpendicularmente por encima de la herida. La periferia de la herida abierta se marca por las flechas negras en cada cuadro.

El cierre epitelial se presentó en -15 días. Cada uno de las heridas cutáneas del hámster se documentó diariamente usando las fotografías, tomadas como se describió anteriormente. Se incluyó una regla milimétrica en cada fotografía para proporcionar una referencia para las mediciones. Los márgenes de la herida se trazaron subsecuentemente y el área superficial de las heridas abiertas se cuantificó por planimetría usando los elementos de programación Metamorph (versión 1.1D18, Universal Imaging Corp., West Chester, PA) en una sistema por computadora Image-1. Desde el 5to día hacia adelante, existió una disminución estacionaria en la abertura de la herida hasta que se completó el cierre epitelial mediante ~el día 15. El cierre de la herida se definió cuando la aplicación de presión de un algodón estéril se cambiaba alrededor de la herida no incluía sangrado. Las características clínicas e histológicas de la curación de heridas cutáneas del hámster son similares a las descritas en los humanos y otros modelos de mamíferos (Ruldolph et al., 1992, Wound Contraction and Sear Contracture in Wound Healins, Biochemical and Clinical Aspects, eds . Cohén, I.K., Dielgelmann, R.F. and Lindblad, W.B. Saunders Company, Philadelphia, pp . 96-114) . Es decir, las fases continua y de recubrimiento de la inflamación, proliferación y remodelación del tejido podrían ser idénticas .

EJEMPLO 2 El efecto del inhibidor en los eosinófilos asociados con las heridas y la curación de heridas.

Siguiendo el establecimiento del modelo de la herida de la piel del hámster, se probó un inhibidor candidato de la curación de heridas cutáneas. Se desconoce la función biológica de los eosinófilos que infiltran una herida, no se podría predecir si ayudaría un cambio en su número, dificultar o no tener efecto en el proceso de curación. Adoptamos un método experimental que emplea el anticuerpo monoclonal anti-IL-5, TRFK-5 (suministrado por el Dr. Robert Egan, Schering Plough Research Institute) . Los estudios han mostrado que la administración de TRFK-5 en 1-2 mg por semana en ratones, puede disipar la eosinofilia normalmente observada con infecciones parásitas helmínticas (Coffman et al., 1989, Science, 245: 308-310; Herndon and Kayes, 1992, J. Immunol, 149: 3642-3647; Sher et al., 1990, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A., 87: 61-65; Sher et al., 1990, J. Immunol . , 145: 3911-3916) y para reducir la eosinofilia que acompáñala hipersensibilidad de vía aérea estimulada por alérgeno (Mauser et al., 1995, Am. J. Respir. Crit. Care Med., 152: 467-472; Van Oosterhout et al., 1993, Am. Rev. Respir. Dis., 147: 548-552) .

Un anticuerpo monoclonal de ratón (TRFK-5) dirigido a IL-5 de humano y anti-LFA-3 de control (antígeno-3 de función leucocito) se proporcionaron amablemente por el Dr. Robert Egan en Schering-Plough Research Institute. Los antibióticos se prepararon de los sobrenadantes de los cultivos libres de suero y fueron mayores de 95% puros. Los anticuerpos purificados se dializaron en solución salina amortiguada con fosfato, se concentraron de 10 a 20 mg/ml, y se esterilizaron por filtraron. Treinta y dos hámsteres se dividieron aleatoriamente en dos grupos de dieciséis animales para este estudio. El protocolo de la administración del anticuerpo para los dieciséis hámsteres en cada grupo fue como sigue: 1) 5 mg de TRFK-5 o 2) 5 mg de anti-LFA3 de control se inyectó intraperitonealmente (ver Coffman et al., 1989, supra) en tres diferentes tiempos, se crearon cada uno antes de las heridas. En el caso de la infección por parásitos, se necesita un período de 7 a 11 días para observar la reducción significativa de la eosinofilia en la sangre después de la administración de TRFK-5 (Coffman et al., 1989, supra); por lo tanto, se administró el anticuerpo 7 y 4 días y en el mismo día antes de la herida. La relación de este horario fue para optimizar el efecto de la administración del anticuerpo monoclonal anti-IL-5 en cada una de los animales que experimentaron el proceso de curación de heridas cutáneas normal completo que se llevó a cabo durante un período de aproximadamente 15 días .

Las heridas cutáneas circulares de espesor total simple, 14 mm de diámetro, se crearon al nivel de la grasa subcutánea en la espalda entre las escápulas en cada uno de los dos grupos de hámsteres después de tres dosificaciones de tratamiento del anticuerpo, respectivamente. Las heridas se dejaron abiertas al aire. Para cada uno de los dos grupos de 16 hámsteres, 8 animales en cada grupo se sacrificaron en el día 9, cuando la infiltración de eosinófilo en los picos de curación de las heridas cutáneas del hámster (Wong et al., 1993, supra), para evaluar la efectividad del uso de los anticuerpos dirigidos contra IL-5 para reducir los eosinófilos. Cada una de las ocho heridas cosechadas se fijó inmediatamente en paraformaldehído al 4% preparado frescamente a 4 " C durante 2 horas, después se deshidrató por medio de porcentaje aumentados de etanol, después xileno y finalmente empotrados en un soporte seccionado. Podría haberse usado una variedad de medios de soporte seccionados, incluyendo parafina, polímeros plásticos o una mezcla de parafina/medio de polímero (e.g. Paraplas t®Plus Tissue Embedding Médium, sumistrado por Oxford Labware) . En este caso, se empleó Para?last®Plus . Se dio cuidado particular para asegurar la orientación óptima para permitir la identificación de varias puntos destacados de heridas tal como los bordes y la base de la herida, y el exudado para el análisis histológico. Los hámsteres restantes en cada grupo se monitorearon hasta y/o después de que se observó el cierre epitelial completo.

Los eosinófilos se cuantificaron en la herida de la piel del hámster como se describió previamente (Wong et al., 1993, supra) . Brevemente, las secciones de 8 µm de espesor se cortaron y se montaron sobre portaobjetos de vidrio. Las primeras dos secciones del centro de cada una de las heridas cosechadas, se usaron para la cuantificación de eosinófilos. Se cuantificó el número absoluto de eosinófilos en la herida apropiada. Cada herida se examinó usando una malla óptica en el aumento total de 250x. El borde de la capa de granulación se definió superficialmente por la capa de exudado, sobre los lados por la transición entre la mucosa oral normal y el epitelio regenerativo asociado con la herida, y en la base por la capa muscular. Un campo adyacente a cada uno de los bordes laterales de la capa de granulación se incluyó en la cuantificación. Para determinar la densidad de los eosinófilos en cada herida (eosinófilos por mm2) , el área de cada una de las heridas se determinó usando una pieza ocular al aumento de lOx, calibrada contra un micrómetro de etapa. La identificación de los eosinófilos, basado en su fluorescencia de anaranjado-rojo característica después del teñido Fisher Giemsa, se realizó mediante el uso de microscopía de fluorescencia de rodamina (Wong et al., 1993 supra) .

Una cuantificación comparativa de la curación de heridas entre los grupos experimentales y los de control se llevó a cabo usando los siguientes parámetros. Primero, se realizó la cuantificación de los eosinófilos en el punto del tiempo de cosecha. Sólo se midieron las secciones de la herida central. Se calcularon la desviación media y estándar de las densidades del eosinófilo (número de células por mm2) en las heridas de 8 hámsteres en cada grupo. Conforme se determinó por este método, las densidades de los' eosinófilos que se infiltraron en las heridas del día 9 fueron significativamente inferiores (p<0.01) en el grupo experimental (0.05 ± 0.03) que en el grupo de control (24 ± 13) . Esto se muestra en la Figura 2, en la cual el promedio (±SD) de la densidad del eosinófilo, se grafican los números por mm2, de cada uno de los ocho animales.

Los eosinófilos asociados con las heridas en cada uno de los hámsteres tratados con el anticuerpo monoclonal anti-IL-5 se redujeron al nivel comparado con el observado en la piel del hámster sin heridas, normal.

Para el propósito de comparación lado a lado, la Figura 3 muestra una superposición de imagen en el espejo construida de mitades de una herida tratada con anti-IL-5 en el día 9 (lado derecho) y una herida de control (lado izquierdo) . Las Figuras 3A y 3B presentan dos ampliaciones (4x y lOOx, respectivamente) de esta superposición, en la cual la ampliación original fue de lOOx. Las secciones se tiñeron para contarse mediante colorante Giemsa y se visualizaron por microscopía fluorescente de rodamina para detectar los eosinófilos del tejido mediante su fluorescencia citoplásmica (Wong et al. 1993, supra) . Los centros de la herida se marcan con flechas blancas. La Figura 3A, la cual proporciona la orientación de las heridas en el campo luminoso, sirve para representar la arquitectura de la herida. La Figura 3B presenta las regiones idénticas del tejido seccionado, teñido fotografiado bajo la óptica de fluorescencia de rodamina para resaltara los eosinófilos del tejido. Los cuerpos celulares fluorescentes identificados como eosinófilos aparecen en esta ampliación. Su identidad se confirmó por examinación de alta potencia (600X) de estos campos (Figura 3C, región de soporte de la Figura 3A; Figura 3D, región de soporte de la Figura 3B), como se desarrolló por Wong et al. (1993, supra) . Los eosinófilos se encontraron que se infiltran prominentemente alrededor de las heridas del día 9 en el hámster de control (izquierda) y se observaron en grupos que rodean los vasos sanguíneos y tejidos adiposos. Pocos, si algunos, eosinófilos se encontraron en la capa del coágulo o en el músculo en la base de la herida. En contraste, el número de eosinófilos asociados con la herida en los hámsteres tratados con anti-IL-5 mAb se redujeron al nivel que se observó en la piel del hámster no herido, normal ( derecha ) .

La planimetría y contracción de la herida se usaron a través de todo el experimento para monitorear la re-epitelialización del fenotipo en los grupos experimental y de control. El área de las heridas abiertas se monitoreó y se tabuló cada día. Esto se hizo por foto-documentación de cada herida a la misma ampliación seguido por planimetría. Se calculó el porcentaje medio de las heridas que permanecieron abiertas en cada grupo, y se probaron las diferencias para la significación mediante la prueba U de Mann-Whitney. La Figura 4 presenta una gráfica que representa el perfil de re-epitelialización en los dos grupos. Cada punto representa el porcentaje promedio (±SD) del tamaño de la herida para 8 hámsteres del grupo tratado o de control, que se verificaron a cada uno de los puntos de tiempo indicados. Las heridas en todos los hámsteres en el grupo experimental anti-IL-5 mAb se cerraron en el día 13. En contraste, las heridas en todos los hámsteres de control requirieron un adicional de cuatro días para cerrarse (día 17). Esta diferencia es significativa (p<0.05) . No se observaron diferencias significativas en la contracción de la herida entre los dos grupos (no se muestran datos) . Además, midiendo el área de los tejidos de la granulación entre los 2 grupos, no existe diferencia obvia (p<0.05).

La densidad del eosinófilo infiltrado en las heridas fue significativamente inferior en el grupo experimental que en el grupo de control (p<0.01) . Los eosinófilos asociados con la herida en hámsteres tratados con TRFK-5 se abolieron al nivel de la piel del hámster no herida, normal. La progresión del cierre de la herida por re-epitelialización en hámsteres tratados con TRFK-5 fue 4 días más rápido que en el grupo de control (p<0.01) .

En resumen, los resultados descritos en este Ejemplo representan la primera demostración de que la reducción de la infiltración del eosinófilo en las heridas de la piel puede realizarse exitosamente mediante el uso del anticuerpo anti-IL-5 monoclonal, TRFK-5, que inhibe las rutas dependientes de IL-5 de la diferenciación y maduración del eosinófilo in vi vo . El uso de un anticuerpo monoclonal dirigido contra IL-5 disminuyó el número de eosinófilos en las heridas de la piel del hámster a un nivel encontrado en la piel sin heridas. Más importantemente, este tratamiento se asocia con una re-epitelialización de las heridas cutáneas, con el cierre que se presenta cuatro días más rápido que en los animales de control no tratados (p<0.05) . Este experimento se ha desarrollado dos veces con el mismos resultado. La aceleración significativa de la re-epitelialización mediante el tratamiento anti-IL-5 mAb, se cree que tiene implicaciones clínicas. En vez de esto, las aplicaciones terapéuticas de anti-IL-5 mAb se cree que es aplicable para facilitar la re-epitelialización en humanos en las determinaciones clínicas selectivas. En una úlcera oral no curada crónica (granuloma ulcerativa traumática con eosinofilia de estroma TUGSE) en donde existe crónicamente una abundancia de eosinófilos del tejido, existe siempre una mucosa ulcerada, no curada (Elovic et al., 1993, Oral Sura. Oral Med. Oral Path., 81: 672-681). Además, los eosinófilos también infiltran las heridas epiteliales traqueales (Erjefalt et al., 1996, Am. J. Respir. Crit.

Care Med. 153: 1666-74) EJEMPLO 3 Especificidad del efecto del inhibidor en los eosinófilos .

Para determinar la abundancia relativa de todos los leucocitos que se infiltran en las heridas, también se cuantifican otras célula inflamatorias y mastocitos basados en los criterios his toquímicos y morfológicos después de teñir las mismas secciones del tejido usadas para la cuantificación de los eosinófilos, anteriormente, con colorante Giemsa como per Wong et al. (1993, supra) . Mientras que los eosinófilos se identificaron mediante su fluorescencia de rodamina y morfología nuclear, los mastocitos residentes, así como las células inflamatorias que incluyen neutrófilos, linfocitos y macrofagos cargados de pigmento, se identificaron mediante sus características histoquímicas y morfológicas como sigue: Los neutrófilos se identificaron por sus núcleos multi-lóbulo y la carencia de fluorescencia de rodamina. Las células que indican núcleos hipercrómicos y bajo volumen citoplásmico se clasificaron como linfocitos. Los mastocitos se identificaron mediante su teñido metacromát ico . Los macrofagos de los monocitos /tej ido no son fácilmente ident ificables mediante estos métodos, dado que las características morfológicas entre los monocitos/macrofagos y los fibroblastos y/o las células endoteliales en la tejido de granulación pueden ser difíciles para diferenciar. Sin embargo, se podría identificar fácilmente los macrofagos que cargan pigmento. Por lo tanto, se cuantificaron estos macrofagos los cuales demostraron actividad fagocítica. Para determinar si el infiltrado inflamatorio global de las otras células inflamatorias se afectaron por el tratamiento del anticuerpo monoclonal anti-IL-5, las diferencias en las densidades medias de las células inflamatorias asociadas con la herida y los mastocitos entre los dos grupos se calcularon y probaron para la significación mediante la prueba U de Mann-Whitney. Los resultados de esta cuantificación de las células inflamatorias en las heridas de la piel de hámster del día 9 se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1 **: Prueba U de Mann-Whitney í í : Densidad celular (Número de células por mm2) ; Media ± Desviación estándar §§: Macrofagos cargados de pigmento Los resultados sugieren que los eosinófilos se reducen específicamente en heridas de la piel del día 9 del hámster tratado con TRFK-5 (p<0.01) con relación a los otros tipos de células inflamatorias (macrofagos cargados de pigmento, linfocitos y neutrófilos), en suyos números de tratamiento con TRFK-5 tuvo un efecto insignificante. Las densidades de los macrofagos se encontraron en el rango de 89 a 139 células/mm2, mientras que la infiltración de los linfocitos y neutrófilos se observaron para varían de 27 a 67 y 60 a 112 células/mm2, respectivamente. También es de interés observar que los mastocitos se encontraron que eran más abundantes (p<0.05) en los hámsteres tratados con TRFK-5 de las heridas de la piel del día 9 (104 ± 27) que en los animales de control (96 ± 26) . Mientras que la importancia de entre descubrimiento permanece incierta, los resultados no excluyen una papel compensatorio para el cierre de la herida epitelial entre los mastocitos residentes y los eosinófilos asociados con la herida en la curación de heridas cutáneas. El uso de un modelo de mastocito deficiente para los estudios de curación de las heridas podría dirigirse a esta cuestión.

EJEMPLO 4 En el Ejemplo 2, se demostró la eficiencia de un inhibidor de la infiltración de eosinófilo en las heridas cutáneas; sin embargo, es necesario ser capaz de probar otras composiciones que podrían ser de uso de acuerdo a los métodos de la invención. Mientras que el presente método anterior servirá para cualquier inhibidor diseñado específicamente para bloquear la eosinofilia misma, es menos adecuado para probar las composiciones destinadas no sólo a bloquear el influjo de eosinófilo en el sitio de la herida o a la eliminación de tales células que ya han aparecido en el tejido herido, sino que en lugar de bloquear un efecto de tales células, deberían estar presentes en una herida. Para hacer esto, un sistema de modelo animal, tal como cualquiera de los discutidos anteriormente, se selecciona, se prueba y los animales de control se hieren, el inhibidor candidato se administra mediante cualquier ruta apropiada (ver anteriormente) y se diseña un procedimiento de detección para revelar la presencia y/o se realiza la concentración en el tejido herido del blanco contra el cual el inhibidor se dirige (e.g. un producto celular de eosinófilos, tal como un ARNm o proteína específica de tipo celular) en ambos sujetos animales tratados y sin tratar a varios intervalos a través de todo el tiempo de transcurso del proceso de curación normal. La detección de una reducción en la molécula blanco en el tejido herido de los animales tratados con relación a los sujetos de control sin tratar es indicativo de ' la eficiencia del inhibidor candidato. Ejemplos de varios métodos, que son aplicables en la presente invención para detectar ARNm o proteínas en el tejido cutáneo herido, se proporcionan aquí posteriormente. Los métodos, que se han usado previamente para detectar dos productos de citocina de eosinófilos, TGF-a y TGF-ßl (Wong et al., 1993, supra), podrían aplicarse a cualquier proteína o mensaje deseado. a. Análisis de ARNm de TGF-a y TGF-ßl en el tejido herido de un modelo de animal.

Preparación de las sondas de ácido nucleico.

Para monitorear la producción de un ARNm por eosinófilos, se generan los oligonucleótidos complementarios a su secuencia para el uso ya sea para la síntesis del ácido nucleico principal en la transcripción inversa y PCR o al uso como sondas ya sea en el análisis Northern o en experimentos de hibridación in si tu .

Análisis de PCR en un mensaje asociado con el eosinófilo de un tejido herido de un modelo animal.

El ARN total se aisla del tejido herido mediante los métodos estándares. Los cebadores apropiados se diseñan con base en la complementariedad a la secuencia de ARNm blanco. Podría usarse cualquier protocolo de RT-PCR común, tal como ARN-PCR (No. de estuche N808-0017; Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT) . Los cebadores podrían optimizarse para la eficiencia de la fijación térmica, y seleccionarse de modo que la estructura secundaria y el riesgo del cebado promiscuo se minimizan por el investigador, con base en la naturaleza de la secuencia blanco; este proceso complejo podría ayudarse por computadora, usando los programas de diseño de oligonucleótidos, e.g. OLIGO™ 4.0 (National Biosciences, Inc.) . Después de la síntesis del cebador, treinta ciclos de PCR se realizan usando una unidad de ciclización térmica, tal como un ciclizador térmico Perkin-Elmer Cetus DNA, con temperaturas de fijación térmica optimizadas para los oligonucleótidos que van a usarse .

Mediante este método, las heridas de la piel del hámster de los días 0, 5, 7 y 24 se prueban para la composición del ARNm. Después del aislamiento del ARN total de las heridas del tejido y la reacción subsecuente de ARN-PCR subsecuente para la amplificación del ARNm blanco, las muestras de PCR se someten a electroforesis en geles de agarosa al 29% seguido por análisis Southern blot usando sondas de ácidos nucleicos marcadas complementarias a la secuencia de tal mensaje. µg del ARN total de cada una de las muestras de las heridas se hibridiza en un Northern blot a una sonda de ácido nucleico marcada complementaria a un gen interno, tal como gliceraldehído-3-fosfat o deshidrogenasa, como un control para demostrar la calidad y la cantidad relativa del ARN usado. Observar que esta prueba no es sensibilidad suficiente no sólo para detectar la presencia o ausencia de estos mensajes asociados con el eosinófilo en el tejido herido, sino que para indicar los cambios en sus niveles a través de todo el transcurso de tiempo del experimento. Tal modulación observada es importante para la verificación de la eficiencia de las moléculas inhibidoras que van a probarse para el uso de acuerdo a la invención, dado que un inhibidor candidato podría esperarse que regule los cambios en el nivel de un producto de eosinófilo o en el tiempo de su expresión.

Hibridación i n si t u La hibridación in si t u , que también podría usarse para monitorear los mensajes producidos por los eosinófilos, también podría desarrollarse en el tejido herido cosechado (como se describió en el Ejemplo 1) usando las ribosondas de sentido y antisentido marcadas 35S bajo las condiciones que se han determinado previamente para permitir la detección específica de los ARNsm en los eosinófilos (Elovic et al., 1990, supra; Wong et al., 1991, supra). La examinación de las secciones heridas obtenidas a varios puntos de tiempo en el proceso de curación revela la presencia y/o concentración de los mensajes expresados por la infiltración de los eosinófilos, por cualquiera, y proporciona un medio mediante el cual probar un inhibidor candidato de la eosinofilia.

Mediante este método, el tejido herido obtenido de os animales de prueba para el cual se ha administrado un inhibidor candidato de eosinofilia en general, o de un producto de eosinófilos en particular, puede compararse con los cosechados de los animales de control a intervalos durante el transcurso del proceso de curación y comparado con la intensidad del marcado del mensaje blanco. Una reducción significativa en el nivel de la señal del mansaje o en la duración de una señal observable, es indicativo de la eficiencia de un inhibidor contra la molécula blanco. b. Análisis de proteínas en el tejido herido de un modelo animal .

Detección inmunolósica de las moléculas de blanco por los inhibidores candidatos.

En lugar de emplear los métodos que se diseñan para detectar los ARNsm producidos por los eosinófilos, es posible probar las proteínas asociadas con el eosinófilo presentes en los tejidos heridos de animales tratados con un inhibidor candidato mediante los métodos descritos anteriormente por comparación con los presentes en las heridas de los animales de control sin tratar. Una reducción en la cantidad de la proteína blanco in indicativo de la eficiencia del inhibidor candidato que va a probarse. Se realiza la detección inmunológica de una proteína blanco en una muestra de proteínas preparada del tejido herido en un Western blot mediante los métodos bien conocidos en el arte; este procedimiento emplearía los anticuerpos específicos para la molécula de interés. Los ejemplos de tales anticuerpos, que pueden dirigir los productos de eosinófilos, tal como las citocinas TGF-a y TGF-ßl, se describen anteriormente, como son los métodos generales de la preparación de anticuerpos. Alternativamente, el procedimiento de detección podría realizarse inmunohistoquímicamente mediante la ampliación directa hacia una sección del tejido herido de los anticuerpos específicos para una proteína asociada con los eosinófilos. Un ejemplo de tal técnica inmunohistoquímica, es este caso realizada en el tejido herido y no herido de los animales tratados, se proporciona aquí para el propósito de ilustración.

Detección inmunohistoquímica de TGF-a y TGF-ßl en un modelo animal.

La inmunohistoquímica se usa para detectar las proteínas asociadas con los eosinófilos en el modelo de curación de heridas cutáneas del hámster. Los anticuerpos primarios dirigidos contra la proteína de interés (tal como TGF-a o TGF-ßl) podría obtenerse comercialmente o podría hacerse mediante los métodos descritos anteriormente. Un anticuerpo de control derivado de la misma especie animal como en la cual el anticuerpo primario se originó, tal como la proteína ant i-bacteriana ß-galactosidasa (Ab-1; OB02; Oncogene Science, Uniondale, NY) o la fracción IgG de un conejo normal no inmune (1-5006; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO ) se aplica a la misma concentración como el anticuerpo primario para servir como un control negativo. La inmunohistoquímica se realiza como se describió previamente (Elovic et al., 1990, supra; Wong et al., 1990; supra; Wong et al., 1991 supra) . En breve, las secciones introducidas con parafina de 6 µm de espesor se preparan del tejido herido fijo como en los Ejemplos anteriores, y -se incuba con un anticuerpo primario apropiado; las secciones congeladas o empotradas con plástico también podrían usarse ventajosamente. Después de la incubación y el lavado, se detectan los complejos de anticuerpo enlazado/ant í geno usando un anticuerpo secundario dirigido contra IgG de las especies huésped en las cuales se originaron los anticuerpos primarios, conjugados para la fosfatasa alcalina (e.g. el encontrado en el estuche VECTASTAIN® ABC; Vector Laboratories, Burlingame, CA) y un sustrato de fosfatasa alcalino, tal como sustrato I de fosfatasa alcalina (No. de catálogo SK-5100, Vector Laboratories, Burlingame, CA) , después de lo cual se monitorea el desarrollo de color. Una reducción en la cantidad de la proteína asociada con el eosinófilo de interés en las muestras de prueba derivadas de los animales tratados con el inhibidor candidato con relación a los controles no tratados es indicativo de la eficiencia del fármaco en la inhibición del eosinófilo o un efecto del mismo.

Las secciones podrían contarse por teñido con azul anilina al 0.2% (Sigma, Cl 42755), este colorante se conoce que visualiza los eosinófilos mediante la microscopía de fluorescencia ultravioleta (McCrone et al., 1988, J. Immunol. Methods, 114: 79-88), durante 10 minutos para permitir la identificación de eosinófilos.

EJEMPLO 5 En los humanos, la eficiencia de los fármacos que ayudaron en la curación de las heridas superficiales internas, se mide ya sea por examinación visual directa (por ejemplo, en el caso de las heridas orales; ver Khandwala et al., 1997, Oral Sura. Oral Med. Pathol. Oral Radiol. Endo., 83: 222-230) o mediante cualquiera de varios medios visuales indirectos. Un método indirecto es la endoscopia de fibra óptica, que se ha usado exitosamente para verificar la curación de las úlceras traqueobronquiales que resultan de la tuberculosis (Rikimaru et al., 1993, Nippon Kvobu Shikkan Gakkai Zasshi, 31: 426-430). La ultrasonografía endoscópica, también conocida como endoscopia de contraste de colorante, se ha usado para aventajar, con relación a los procedimientos endoscópicos tradicionales, para verificar el efecto de los fármacos que ayudan a la curación y la prevención de la reincidencia de úlceras pépticas en humanos (Nebiki et al., J. Gastroenterolosy and Hepatolosv, 12: 109-114). Otras técnicas incluyen radiografía de metales pesados (tal como exploración con bario) y formación de imagen de resonancia magnética, entre otras.

Mientras que es posible administrar un fármaco a los sujetos de prueba, e.g. un cohorte de pacientes con úlcera, y para medir sus velocidades del cierre del tejido por comparación con los sujetos de control no tratados, un modelo animal para la curación de las heridas es útil para la prueba preliminar.

Cualquiera de varios mamíferos ya conocidos que exhiben infiltración de eosinófilos de las heridas superficiales (ratas, conejos, hámsteres y cerdos, ver anteriormente) podrían servir como el modelo experimental. Varios de tales sistemas que ayudaron en la producción de heridas internas y la verificación de la curación, se presentan aquí y posteriormente, en los Ejemplos 6 a 8. En cada caso, los inhibidores candidatos de eosinofilia o sus efectos pueden administrarse mediante cualquiera de las rutas descritas anteriormente. Los valores de la línea base para los varios parámetros mediante los cuales se juzga la velocidad de curación, se establecen en cada modelo. Los animales de prueba y control después se hieren por estos métodos. Un mej oramiento estadísticamente significativo en un índice mediante el cual la velocidad de curación se verifica de acuerdo a un modelo dado es indicativo de la eficiencia del inhibidor en el mejoramiento de la curación de heridas internas.

Lesiones gástricas químicamente inducidas Las lesiones gástricas se producen de una manera controlada en las ratas de acuerdo a Okabe et al. (1971, Am . J. Dig. Dis., 16: 277-284) como se presentó previamente por Tominaga et al., 1997, Digest ive Diseases and Sciences, 42: 616-625. En breve, ratas Wistar macho de ocho semanas de edad criadas bajo las condiciones estándares, se sometieron a ayuno durante 12 horas, después de lo cual se anestesiaron y se sometieron a laparotomía. Un molde de plástico redondo (6 mm de diámetro) se coloca ligeramente sobre la superficie serosal anterior del borde ant ral-oxíntico . Se vierte ácido acético glacial (0.06 ml ) en el molde y se deja que permanezca contra la pared gástrica durante 60 segundos. La solución después se retira, la superficie del área deseada se limpia con papel absorbente y se cierra el abdomen. Las ratas de control se someten a cirugía simulada (laparotomía bajo anestesia con éter seguido por el cierre de la incisión sin el tratamiento ácido). Las lesiones similares podrían producirse mediante la aplicación de un irritante tópico, tal como etanol al 100% (Konturek et al., 1991, Eur. J. Pharmacol . , 195: 347); 1.5 ml de etanol se administra intragástricamente a través del tubo orogástrico, y las ratas se anestesian 1 hora después de las mediciones del área de las lesiones gástricas .

En las días 1, 3, 7, 11, 18, 32 y 60 después de la producción de una lesión gástrica, las ratas se sacrificaron por dislocación cervical y los tejidos ulcerados gástricos (paredes gástricas totales incluyendo el área ulcerada, pesaban 100-120 mg ) se cosecharon inmediatamente. Los tejidos gástricos intactos (de la misma región como los tejidos ulcerados) se cosecharon de las ratas operadas simuladas. Los tejidos se enjuagaron en solución salina, se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a - 80 ° C . Estos tejidos de prueba y control se usan para la medición de la curación de las heridas, que se miden mediante las reducciones en el área superficial a varios puntos de tiempo y se dice que se completa cuando la cicatrización se extiende sobre la herida total. También se usaron como fuentes de ARNm y como el sustrato para los estudios inmunohistoquímicos , como se describe posteriormente .

Análisis Inmunológico o molecular de la acción del inhibidor en un modelo de curación de heridas internas.

El éxito del inhibidor en la reducción del producto de eosinófilos, tal como una citocina, se mide ya sea mediante técnicas moleculares o bioquímicas que son bien conocidas en el arte. El análisis i n si tu del tejido de las heridas internas cosechadas se realiza como se describió anteriormente para el tejido interno. Un análisis de protocolo para Northern del ARNm que se ha aplicado ventajosamente al ARN derivado del tejido herido gástrico, se describe posteriormente, como es un procedimiento inmunohistoquímico optimizado para el tejido gástrico. Ambos son como se describieron previamente (Tominaga et al., 1997, supra) . También podría emplearse el análisis Western, realizado mediante las técnicas conocidas en el arte. a. El uso del análisis Northern para ajustar la eficiencia de un inhibidor de eosinofilia en un sitio herido .

El ARN total se aisla del tejido gástrico de ratas mediante los procedimientos bien conocidos en el arte (ver Kim et al., 1994, Kidnev Int . , 46: 1346-1358) .

Quince µm del ARN total se somete a electroforesis en un 1% de gel de formaldehído/agarosa y se transfirió a una membrana de nylon mediante los métodos estándares (ver Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning. A Laboratory Manual., 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) . Una sonda de ADNc marcada a un ARNm asociado con el eosinófilo y una segunda sonda marcada complementaria al ARNm del gen interno cuyo nivel de expresión no se afecta por el proceso de curación de la herida (e.g. gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa o GAPDH), que sirve cono un control aún para las hileras cruzadas cargadas del gel, se incuban con el filtro bajo condiciones que permitirán la hibridación específica de la sonda a la secuencia blanco, por ejemplo, formaldehído al 50%, solución de Denhardt 5x, SSPE 5x, SDS al 1% y la sonda marcada 32P 1-2 x 106 dpm/ml . Después de la hibridación, se realizan las placas en SSPE 2x a temperatura ambiente durante 30 minutos, dos veces en SSPE 2x/SDS al 2% a 65° durante 45 minutos y SSPE O.lx a temperatura ambiente durante 30 minutos. Otros protocolos de hibridación de ácido nucleico (e.g. el de Church and Gilbert, 1984, Proc . Nati. Acad. Sci. USA, 81: 1991-1995) también podrían emplearse ventajosamente.

Después de la hibridación y las placas, se detecta la sonda de enlazamiento mediante los métodos estándares, que incluyen aut orradiografí a o fosforimagen . La autorradiografía se realiza usando película Kodak XAR-5 u otra película de rayos X estándar. La cuantificación de la señal podría ser visual; alternativamente, podría realizarse la densitometría usando un densitómetro o cualquiera de un amplio número de exploradores ópticos, e.g. un explorador GT-8000 (Epson Corporation; Seoko, Tokyo, Japón) o un Argus II (AGFA), en conjunto con los programas de procesamiento de imagen tal como los elementos de programación NIH Image de dominio público (versión 1.5, Wayne Rosband, National Institutes of Health, Bethesda, MD) y una computadora personal. El nivel de expresión de un mensaje asociado con el eosinófilo se compara con el del mensaje de control en cada hilera, y los resultados numéricos se normalizan, de modo que puede hacerse una comparación directa de los niveles del mensaje de prueba en las heridas de los animales tratados y sin tratar. Una diferencia estadísticamente significativa en los niveles de expresión del mensaje de interés en los sujetos tratados y sin tratar es indicativo de la eficiencia del inhibidor contra la infiltración de eosinófilo en el sitio herido o un efecto del mismo. b. Detección inmunohist oauímica en el tejido epitelilal interno de las proteínas blanco de un inhibidor candidato.

Se obtienen o se preparan anticuerpos contra los blancos inhibidores, tal como los factores que estimulación la colonia o los productos de los eosinófilos, tal como citocinas u otras moléculas, como se describió anteriormente para el uso de acuerdo al siguiente protocolo.

El tejido gástrico de rata intacto, disecado y congelado como se describió anteriormente, se fija en solución de Carnoy de metilo o periodato-lisina-formaldehído durante 4-6 horas y se coloca en un medio de soporte seccionado de parafina o parafina/polímero, como se describió en el Ejemplo 2, anterior. Las secciones de 6 µm de espesor se toman, se fijan a portaobjetos de vidrio ("subcapa") recubiertos de ovalbúmina, desparafinados en xileno y rehidratados por medio de una serie de concentraciones disminuidas de etanol. Después de la inmersión durante 30 minutos a temperatura ambiente con un suero pre-inmune derivado de un animal de la misma especie como en el que se originó el anticuerpo que va a usarse para detectar la proteína blanco, las secciones se incuban durante 24 horas a 4 " C con el anticuerpo específico a una dilución apropiada, ya sea la recomendada por el abastecedor o una que se determina empíricamente por vía de la dilución serial del anticuerpo. La peroxidasa endógena se inactiva sumergiendo las secciones en 0.3% de H20-metanol durante 15 minutos después de la incubación con el anticuerpo primario. Después de lavar en solución salina amortiguada con fosfato '( PBS ) , las secciones se incuban con un anticuerpo biotinilado dirigido contra el IgG de las especies en las cuales el anticuerpo primario se originó (por ejemplo, con un anticuerpo primario originado en conejos, se podría usar un IgG de cabra anti conejo como un anticuerpo secundario) durante 45 minutos a temperatura ambiente. Después las secciones se lavan en PBS, se incuban con estreptavidina marcada con peroxidasa durante 30 minutos a temperatura ambiente y se revelan en solución de 0.03% de 3 , 3 ' -diaminobenzidina (DAB) con 0.005% de H202 y con solución de azida (65 mg/100 ml ) para inactivar la peroxidasa endógena. La revelación del color se monitorea visualmente y se documenta fotográficamente o serigráficamente . Una disminución significativa en la impresión del color en las muestras derivadas de los animales tratados con un inhibidor candidato es indicativo de la eficiencia contra una molécula blanco dada.

Lesiones gástricas inducidas por isquemia Las lesiones gástricas se producen en ratas como se describió previamente (Konturek et al., 1997, Eur . J.

Pharmacol . , 332: 73-77) . Brevemente, 180-220 g de ratas Wistar macho se someten a ayuno durante 18 horas, se anestesian usando un pentobarbital administrado intraperitonealmente (60 mg/kg), el abdomen se abre mediante una incisión de línea media y la arteria celiaca se sujeta durante 30 minutos, después de lo cual se permite el tiempo de reperfusión. A l, 24 y 48 horas después de la liberación del sujetador, los animales se anestesian nuevamente y sus abdómenes se abren. El estómago después se retira para medir el área de las lesiones gástricas usando planimetría computarizada (ver Konturek et al., 1991, supra) .

Un apresuramiento del cierre de la lesión gástrica tratada con un fármaco inhibidor candidato con relación a los animales control que dio sólo el vehículo, es indicativo de la eficiencia del inhibidor en el mejoramiento de la curación de heridas. Los análisis del ácido nucleico o proteínas para detectar el influjo de eosinófilos o los productos de eosinófilos en un sitio herido, si se desea, se realizan como se describió anteriormente .

EJEMPLO 7 Quemaduras corrosivas esofágicas Las quemaduras corrosivas se inducen y los efectos se miden en ratas mediante el método de Berthet et al. (1994, Brit. J. Surgerv, 81: 395-398). 320-380 g de ratas Wistar macho se anestesiaron con 2% de xilazina (15 mg/kg) y cetamina (100 mg/kg), se administraron subcutáneamente. Después de la laparotomía, el esófago abdominal se expone por vía de disección para 1 cm de longitud y se aisla entre dos agarraderas. Un catéter Silastic de diámetro interno 1.0 mm de diámetro externo 2.2 mm (Dow Corning; Midland, Michigan) después se avanza hacia la parte superior del esófago abdominal por vía de la boca y un segundo catéter Silastic de diámetro interno de 1.6 mm y un diámetro externo de 3.2 mm se introduce hasta la parte inferior por vía de gastrostomía . Una solución de NaOH 2.5 M se introduce a través del catéter superior durante 90 segundos. Durante los siguientes 15 segundos, el sitio de la quemadura se irriga con 2 ml de solución salina 0.9 M. Los catéteres después se retiran y los sitios de la gastrostomía y laparotomía se cierren. Post-operativamente, las ratas se alimentan a d l ibi tum con una dieta líquida oral estándar .

Durante el período de observación, cada animal se pesa diariamente, la pérdida de peso se correlaciona con la severidad de la lesión y/o la duración del tiempo requerido para curarse. Similarmente, conforme la lesión produce hinchazón (estenosis) en el esófago, la severidad de la lesión se correlaciona con la contracción en el tamaño del hueco esofágico, conforme se midió usando un catéter Silastic introducido por vía de la boca. Finalmente, se realiza la examinación microscópica del tejido esofágico en el sitio de la herida. Los animales se sacrifican por medios aprobados en los días 2, 5 y 20 después de las heridas, y el esófago y el estómago se retiran en bl oc . El área quemada del esófago se divide en dos partes, una que se usa en el análisis histológico, la otra para el análisis bioquímico (tal como estudios de proteínas y ácidos nucleicos; ver posteriormente) . Los fragmentos del tejido se fijan en solución de formalina y se colocan en cera de parafina. Se toman tres secciones transversales del área quemada (partes superior, media e inferior) y después se lleva a cabo el teñido con hematoxilina-floxina-safron . El edema, la inflamación, la necrosis y la fibrosis en la pared esofágica se gradúan desde medio a severo. El espesor de la pared esofágica y el diámetro interno se verifican mediante la examinación con un microscopio ocular milimétrico. Se calcula el índice de estenosis (espesor de la pared: diámetro del lumen) . Una disminución en el edema, inflamación, necrosis, fibrosis o estenosis es indicativo de la curación; una reducción significativa en cualquiera de estos valores en los animales tratados con relación a los animales no tratados es indicativo de la eficiencia del inhibidor candidato en el mejoramiento de la curación de las heridas .

Si se busca una correlación entre la velocidad de curación y el nivel del blanco del inhibidor que va a probarse, la segunda mitad de la muestra de tejido herido puede servir como la fuente de ARN o proteínas, que pueden examinarse ya sea por análisis Northern o hibridación in si tu , o por Western blotting o inmunohistoquímica usando anticuerpos dirigidos contra la proteína blanco, como se describió anteriormente.

EJEMPLO 8 Colitis inducida químicamente.

Se ha usado recientemente sulfato de dextrano (DSS) para inducir la colitis en roedores experimentales (Okayasu et al., 1990, Gastroenterology, 66: 753-755). EL DSS en una gran molécula que no se absorbe fácilmente por el cuerpo; por lo tanto, se presume que actúa tópicamente en la superficie luminal de la mucosa colónica después de la administración oral. Para crear un modelo animal de la curación de la úlcera colónica y, consecuentemente, un medio para probar las sustancias inhibidoras candidatas para el mejoramiento de tal proceso, se sigue el procedimiento de Bjorck et al. (1997, Digestive Diseases and Sciences, 42: 824-832), estos autores han demostrado que las úlceras colónicas inducidas por DDS imitan las encontradas en los humanos, en las cuales la membrana de la mucosa en el lumen colónico es susceptible a la permeación por antígenos bacterianos y otras toxinas no celulares, lo cual se ilustra por la toma de azul de Evans (EB) por el tejido y el sitio herido. De acuerdo a los métodos de la presente invención, se crean las úlceras inducidas por DDS y se administra el inhibidor candidato, ya sea antes de o después de la herida. Las disminuciones en la cantidad absoluta de EB tomada hasta el sitio de la herida o en el número de días sobre el cual se toma en los animales tratados con el fármaco con relación a los que recibieron sólo el vehículo, es indicativo de la curación de la herida. El protocolo puede resumirse brevemente como sigue: Las ratas Sprague-D'awley macho que pesan 235-265 g se alimentan con 5% de DSS en su agua para tomar durante siete días bajo condiciones normales (22°C, un ciclo de luz/obscuridad controlado de 12 horas y acceso libre a una dieta de granulos estándar y agua) . Los animales se estudian en el octavo día en experimentos agudos usando instilación intraluminal de azul de Evans (EB; Sigma Chemical Co., St. Louis Missouri) y las subsecuentes biopsias quirúrgicas del colón. Los procedimientos quirúrgicos se realizan durante un período de 5-10 minutos de anestesia con éter.

En estos procedimientos, el íleon distal se liga a la articulación con el cecal. El cecal proximal se perfora con una aguja conectada a una jeringa de 50 ml llena con solución salina amortiguada con fosfato (PBS; NaCl 145 mM amortiguado a pH 7.2 con Na2P04 70 mM) a temperatura ambiente. El enjuagado suave del colón se realiza para evacuar los contenidos fecales. Una asa proximal (longitud 4 cm) , que incluye el colón ascendente y transversal, y una asa distal (longitud de 5 cm) , que incluye el colón descendente y el recto a un nivel de 4 cm proximal al orificio anal, se une con ligaduras de seda. Una solución de EB (3%) en PBS (volumen total de 1 ml ) se inyecta en cada asa a través de una jeringa de aguja fina (0.4 mm de diámetro externo) . Después el abdomen se cierra con suturas y las asas colónicas se exponen a EB durante 120 min. Los animales se sacrifican mediante los métodos aprobados bajo anestesia con éter, el colón se diseca rápidamente y la cantidad de EB que ha penetrado en la pared intestinal se verifica como sigue: Las asas colónicas se abren y se realizan tres enjuagados de un minuto del tejido en acet ilcis teína (KabiVitrum AB; Stockholm, Sweden) en PBS. Las porciones medias de cada asa (longitud 15-25 mm) después se retiran, se secan en papel filtro para remover el fluido en exceso, se pesan y se incuban con 4 ml de formaldehído (NH03) a 50°C durante 24 horas en un baño de agua con agitación. Se realizan las mediciones colorimétricas en un espectrofotómetro en la absorción del pico de 612 nm. Se realizan tres mediciones de cada muestra, y el valor medio se usa para los cálculos, con base en los estándares externos en formaldehído. Todos los análisis se realizan en un protocolo cegado.

Los especímenes se preparan de los controles no heridos y de los animales expuestos a DSS. Cuando va a probarse un inhibidor candidato, los animales expuestos a DSS que han recibido ya sea el fármaco candidato o un vehículo libre de fármaco serán incluidos en el análisis para comparación. Después de la perfusión con EB y el lavado subsecuente con ace t i lcisteína, las pequeñas biopsias de cada de cada asa colónica se congelan en nitrógeno líquido. Las secciones del criostato de 5 µm de espesor se cortan y se montan en un medio de montaje DPX después del secado. Las secciones después se observan en un microscopio de epifluorescencia, usando un filtro óptimo para la fluorescencia de EB roja (iluminador de halógeno de 100W, espejo dicroico de 580 nm, filtro de excitación de 510-560 nm y filtro de barrera de 590 nm) para analizar la permeación en los tejidos de control y experimentales. La absorción disminuida de EB en los animales de prueba es indicativo del curado mejorado atribuido a la acción del inhibidor candidato .

Detección inmunohistoquímica en el tejido colónico de proteínas blanco de un inhibidor candidato.

Como se usa para detectar la proteína blanco contra la cual se dirige un inhibidor candidato del influjo de eosinófilo en un sitio herido, o los efectos del mismo, podría aplicarse ventajosamente el protocolo de Bjorck et al. (1997, supra) . En breve, tres especímenes de cada asa colónica (como se define anteriormente) de las ratas que se han sometido a la inducción de las úlceras colónicas por medio de la aplicación de DSS al tracto gastrointestinal, se toman y se sumergen inmediatamente en paraformaldehído al 4% frío en PBS a pH 7.4. Después de 4 horas de fijación en este amortiguador, los especímenes se enjuagan varias veces en PBS y en PBS con sacarosa al 10%, el último para proporcionar la crioprotección a las estructuras finas durante el seccionado. Los especímenes después se congelan, se secciona el criostato a un espesor de 10 µm y se descongela en portaobjetos de microscopio recubiertos con gelatina. Después de la incubación con un anticuerpo primario apropiado dirigido contra el blanco del inhibidor, como se definió, obtenido y/o preparado como se describió anteriormente, el enlazamiento se prueba por vía del método indirecto de Coons (" Fluorescent antibody methods", in General Cvtochemical Methods, ed. J.F. Danielli, 1958, Academic Press, New York, pp . 399-422), en el que el anticuerpo secundario se acopla al isotiocianato fluorescente (FITC) . La intensidad de la señal, que es directamente proporcional a la cantidad del anticuerpo primario enlazado a la molécula blanco, puede observarse y fotografiarse bajo un microscopio fluorescente; alternativamente la imagen puede observarse y cuantificarse digitalmente usando un microscopio confocal asistido por computadora. Observar que también podría emplearse la estreptavidina/fosfatasa alcalina o un sistema de marcado de peroxidasa de rábano picante. Una reducción en la intensidad de la fluorescencia o el desarrollo de color para quienes han recibido solo el vehículo, es indicativo de la eficiencia del inhibidor contra la molécula blanco USO La invención es útil para facilitar la curación de las heridas superficiales administrando un inhibidor de la infiltración de eosinófilos a la herida mediante cualquier número de rutas después de la herida. Alternativamente, tal inhibidor puede administrarse como una medida preventiva antes de la herida en tales casos, por ejemplo, procedimientos quirúrgicos dirigidos, en donde se anticipa la herida. Además, la administración de un inhibidor del eosinófilo de ' infiltración a la herida podría ser útil para prevenir o reducir la severidad de recurrencia de las heridas que se presentan espontáneamente tal como úlceras. Desde el punto de vista de la carencia de animales deficientes de eosinófilos, el éxito de un anticuerpo monoclonal IL-5 anti-humano de ratón para bloquear los eosinófilos del hámster en las heridas de la piel, proporciona un modelo animal que es particularmente útil para evacuar el papel del eosinófilo en los procesos normales y patológicos.

OTRAS MODALIDADES Serán evidentes otras modalidades para los expertos en el arte. Debería entenderse que la descripción detallada anterior se proporciona sólo para claridad y es meramente ejemplar. El espíritu y alcance de la presente invención no se limitan a los ejemplos anteriores, sino que se abarcan por las siguientes reivindicaciones .

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes.

Claims (5)

REIVINDICACIONES

1. Un método para mejorar la curación de heridas, caracterizado porque comprende administrar a un mamífero con la necesidad del mismo una cantidad de un inhibidor del influjo de eosinófilo en un sitio herido suficiente para resultar en la curación de la herida.

2. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque el inhibidor inhibe una citocina que influencia la maduración de los eosinófilos, en donde la inhibición de la citocina resulta en la inhibición del influjo de eosinófilo en la herida.

3. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque el inhibidor inhibe un factor de estimulación de colonia (CSF), en donde la inhibición del CSF resulta en la inhibición del influjo de eosinófilo en la herida.

4. El método de la reivindicación 3, caracte izado porque el CSF es interleucina-5 (IL-5).

5. El método de la reivindicación 4, caracterizado porque el inhibidor de IL-5 es un anticuerpo anti-IL-5.