MXPA00000196A

MXPA00000196A - Genes y proteinas de telomerasa de vertebrado y usos de los mismos

Info

Publication number: MXPA00000196A
Application number: MXPA/A/2000/000196A
Authority: MX
Inventors: Andrzej Kilian; David Bowtell
Original assignee: David Bowtell; Cambia Biosystems Llc; Andrzej Kilian
Priority date: 1997-07-01
Filing date: 2000-01-03
Publication date: 2001-11-21

Abstract

La presente invención se refiere a moléculas deácido nucleico que codifican telomerasa de vertebrado. También se proporcionan productos de gene, vectores de expresión y células huésped adecuadas para expresar telomerasa. Se describen métodos para identificar inhibidores de actividad de telomerasa y composiciones de inhibidor.

Description

GENES Y PROTEÍNAS DE TELOMERASA DE VERTEBRADO Y USOS DE LOS MISMOS CAMPO TÉCNICO Esta invención se refiere de manera general a telomerasas, y de manera particular al gene y proteína de telomerasa humana y usos para diagnóstico y terapia.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los cromosomas no circulares requieren un mecanismo especializado para mantener los extremos del cromosoma después de cada división celular porque las polimerasas responsables de la replicación de DNA cromosóm ico son incapaces de replicar completamente moléculas de DNA lineales, creando un "problema de replicación de extremos". Para satisfacer este reto, las células eucarióticas dependen de una enzima , telomerasa , para adicionar repeticiones relativamente conservadas, normalmente ricas en G , cortas, sobre los extremos cromosómicos. Estas estructuras de repetición son llamadas telómeros. La presencia de telómeros es esencial para viabilidad celular. La ausencia de incluso un solo telómero conduce a la detención del ciclo celular en levadura , una célula eucariótica (Sandell y Zakian , Cell 75: 729, 1993) . Los telómeros se acortan durante la replicación ; la telomerasa restaura los telómeros. Así, como se espera, la actividad de telomerasa es detectada principalmente en células que se dividen activamente. Como tal, la actividad de telomerasa es constitutiva en organismos unicelulares y ^H|^-a3--¡- es regulada en organ ismos más com plejos, relativamente abundante en línea de germen y células y tejidos embrión icos así como células de tumor. En contraste, la actividad de telomerasa es difícil de detectar en tejidos humanos somáticos normales. Más aún , en lugar de la cesación de la replicación que resulta en telomerasa dism inuida, datos recientes indican que la inhibición de telomerasa podría ser uno de los casos críticos en esta transición . La correlación aparentemene directa de las actividades de telomerasa/replicación ha impulsado mucha especulación de que inh ibidores de telomerasa podrían ser un terapéutico de cáncer "universal" , efectivo esencialmente para todos tipos de tumor, mientras que los estimuladores de telomerasa podrían superar la senescencia natural observada de células normales. Estimulada por estos modelos, la caracterización de telomerasa para culminación en aislamiento y clonación de telomerasa ha sido una alta prioridad. Se ha mostrado que el mecanismo de alargamiento de telómero centra en el filamento rico en G de las repeticiones teloméricas. Este filamento rico en G , el cual se extiende hasta el extremo 3' del cromosoma , es extendido por telomerasa, una ribonucleoproteína, del com ponente de RNA, el cual actúa como una plantilla. Varios componentes de este com plejo han sido aislados y clonados. El componente de RNA del complejo ha sido aislado y clonado a partir de muchos organismos diferentes, incluyendo humanos (Feng et al . Science 269: 1 236, 1 995), ratones y otras especies de mam íferos, Saccharomyces cerevisiae, Tetrahymena, Euplotes y Oxytricha (ver, Singer y Gottschl ing , Science, 266: 404, 1 994; Lingner et al . Genes & Develop. 8: 1 984, 1 994; y Romero y Blackburn , Cell 67: 343, 1 994) . Los componentes de proteínas han sido relativamente refractarios a aislam iento. Recientemente, se han determinado las secuencias de nucleótidos de varios componentes de proteína (una proteína dimérica de 80 kD/95 kD de Tetrahymena, WO 96/1 9580; y una proteína de 67 kD de humanos, WO 97/08314). La presente invención describe secuencias de nucleótidos y aminoácidos de telomerasa , usos de estas secuencias para usos diagnósticos y terapéuticos, y proporciona además otras ventajas relacionadas.

BREVE DESCRI PCIÓN DE LA I NVENCIÓN En un aspecto, esta invención generalmente proporciona moléculas de ácidos nucleicos aisladas codificando telomerasa de vertebrado (incluyendo variantes de las mismas). Ejemplos representativos de vertebrados incluyen mam íferos, tales como, humanos, monos del viejo mundo (macacos, chimpancés y mandriles) , perros, ratas y ratones, así como organismos no mam íferos, tales como, aves. En una modalidad preferida , se proporciona la molécula de ácido nucleico que codifica una telomerasa de vertebrado, en donde la molécula de ácido nucleico com prende la secuencia preesentada en la Figura 1 , o se hí brida bajo cond iciones severas al com plemento de la secuencia presentada en la Figura 1 , siempre que la molécula de ácido nucleico no sea EST AA281 296. En otras modalidades preferidas, la molécula de ácido nucleico comprende cualq uiera de las secuencias presentada en la Figura 1 1 o codifica cualquiera de las secuencias de aminoácidos presentada en la Fig ura 1 1 , o se híbrida bajo condiciones severas normales al complemento de las secuencias de la misma, siempre que la molécu la de ácido nucleico no sea EST AA281 296. En otras modalidades, la molécula de ácido nucleico comprende cualquiera de las secuencias presentadas en la Figura 1 0, o se híbrida bajo condiciones de severidad normales al complemento de las secuencias de las mismas. En otro aspecto, la invención proporciona un oligon ucleótido comprendiendo desde 1 0 hasta 100 nucleótidos contiguos de la secuencia presentada en la Figura 1 o su complemento y desde 1 0 hasta 1 00 nucleótidos contiguos de las secuencias presentadas en la Figura 1 0 o los complementos de las m ismas. Los oligonucleótidos pueden ser marcados con una marca detectable. Todavía en otra modalidad, se proporciona un vector de expresión , comprend iendo un promotor' heterólogo operablemente enlazado a una molécula de ácido nucleico de telomerasa humana. El vector puede ser seleccionado del grupo q ue consiste de vectores bacterianos, vectores retrovirales, vectores adenovirales y vectores de levadura. También se proporcionan células huésped conteniendo tales vectores. En otro aspecto, la invención proporciona una proteína aislado comprendiendo una proteína de telomerasa humana. La proteína puede comprender la secuencia de aminoácidos presentada en la Figura 1 o variante de la misma o cualquiera de las secuencias de aminoácidos presentadas en la Figura 1 1 o variante de las mismas. En un aspecto relacionado, la proteína es una porción de una proteína de telomerasa *%£ humana, la cual puede derivarse de las secuencias presentadas en las Figuras 1 o 1 1 . En modalidades preferidas, la porción es desde 1 0 hasta 1 00 aminoácidos de largo. En otros aspectos, se proporcionan anticuerpos que se unen específicamente a proteína o porciones de telomerasa humana . En un aspecto preferido, se proporciona un oligonucleótido (por ejemplo, una sonda de ácido nucleico o iniciador) que es capaz de hibridar específicamente a una molécula de ácido nucleico que codifica una telomerasa humana bajo condiciones de severidad normal . Dentro de ciertas modalidades, la molécula de ácido nucleico tiene una marca detectable. Dentro de ciertas modalidades, la molécu la de ácido nucleico se selecciona de manera que no híbrida a nucleótidos 1624-201 2 presentados en la Figura 1 . Dentro de ciertas modalidades de la invención , la sonda de ácido nucleico o iniciador puede diferir de una secuencia de telomerasa de tipo natural por uno o más nucleótidos. En un aspecto relacionado, la invención proporciona u n par de iniciadores de oligonucleótidos capaz de amplificar específicamente toda o una porción de una molécula de ácido nucleico que codifica telomerasa humana. En modalidades específicas, la molécula de ácido nucleico comprende la secuencia presentada en la Figura 1 , Figura 1 1 , o complementos de la misma. En modalidades preferidas, el par de iniciadores es capaz de amplificar específicamente la secuencia com prendiendo toda o una parte de región 1 , región a, región ß, región 2 , región 3, región X o región Y. En un aspecto relacionado, la invención proporciona un olígonucleótido que híbrida específicamente a una secuencia de ácido nucleico en la reg ión 1 , región a, región ß, región 2, región 3, región x o región Y. También se proporcionan métodos para diagnosticar cáncer en un paciente. Estos métodos comprenden preparar cDNA de tumor y amplificar el cDNA de tumor usando iniciadores que amplifican específicamente la secuencia de ácidos nucleicos de telomerasa humana, en donde la detección de secuencias de ácidos nucleicos de telomerasa es ind icativa de un diagnóstico de cáncer. La cantidad de secuencias detectadas puede ser comparada con la cantidad de secuencia de telomerasa amplificada a un control, en donde aumentan las secuencias de ácidos nucleicos de telomerasa sobre el control es indicativo de un diagnóstico de cáncer. Todavía en otro aspecto, se proporciona un método para determ inar un patrón de expresión de RNA de telomerasa en células, comprendiendo preparar cDNA a partir de mRNA aislado de las células, amplificando el cDNA usando iniciadores de acuerdo a la reivindicación 35, determinando a partir de él , el patrón de expresión de RNA de telomerasa. En modalidades preferidas, el método comprende además detectar el producto amplificado por hibridación con un oligonucleótido que tiene toda o parte de la secuencia de región 1 , región a, región ß, región 2 , región 3, región X o reg ión Y. Estos métodos pueden usarse para diag nosticar cáncer en un paciente, en donde el patrón es indicativo de un diagnóstico de cáncer.

La invención también proporciona animales transgénicos no humanos cuyas célu las contienen un gene de telomerasa humana que está operablemente enlazado a un promotor efectivo para la expresión del gene. En modalidades preferidas, el animal es un ratón y el promotor es específico de tejido. En un aspecto relacionado, la invención proporciona un ratón, cuyas células tienen un gene de telomerasa endógeno roto por recombinación homologa con un gene de telomerasa no funcional , en donde el ratón es incapaz de expresar telomerasa endógena. La invención también proporciona inhibidores de actividad de telomerasa humana , así como ensayos para identificar inh ibidores de actividad de telomerasa, en donde el inhibidor se une a telomerasa y no es un análogo de nucleósido. El inhibidor puede ser un ácido nucleico antisentido complementario a mRNA de telomerasa humana, una ribozíma y sim ilares. Los inhibidores pueden ser usados para tratar cáncer. También se proporcionan métodos para identificar un efector de actividad de telomerasa, comprendiendo los pasos generales de (a) adicionar un efector candidato a una mezcla de proteína de telomerasa, com ponente de RNA y plantilla, en donde la proteína de telomerasa es codificada por una molécula de ácido nucleico aislada como se describió antes; (b) detectar la actividad de telomerasa, y (c) comparar la cantidad de actividad en el paso (b) a la cantidad de actividad en una mezcla de control sin efector candidato, identificando de ah í un efector. Dentro de modalidades adicionales, el efector es un inhibidor. Todavía con otras modalidades, la molécula de ácido nucleico codifica telomerasa humana . Estos y otros aspectos de la presente invención se volverán evidentes sobre la referencia a la siguiente descripción detallada y dibujos adjuntos. Además, se exponen más adelante varias referencias que describen con más detalle ciertos procedimientos o composiciones (por ejemplo, plásmídos, etc.), y en consecuencia se incorporan por referencia en su totalidad.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las Figuras 1A-E presentan una secuencia de DNA (SEQ ID No: ) y secuencia de aminoácidos predicha (SEQ ID No: ) de telomerasa humana. La Figura 2 presenta una alineación de Euplotes aediculatus p123 (SEQ ID No: ), levadura (EST2) (SEQ ID No: ) y secuencias de proteína (aminoácidos 29-1132) de telomerasa humana (HT1). Se indican los motivos de transcriptasa inversa. Se define la región de alta homología entre las tres proteínas como la región de telomerasa. Las secuencias se alinean con ClustalW. La Figura 3 es una imagen escaneada de un análisis Northern mostrando que la subunidad catalítica de telomerasa se expresa en células de carcinoma de colon LIM 1215 pero no en fibroblastos primarios CCD.

Un mRNA de aproximadamente 3.8 kb híbrida a la sonda hT1. Un mRNA de hibridación cruzada adicional de mayor peso mlecular es indicado por la punta de flecha superior. Se indica la hibridación cruzada a RNA ribosomal presente en la preparación de RNA poliA+. La misma mancha también se híbrida a una sonda del gene GAPDH como un control de carga (panel inferior). Los tamaños de los marcadores están indicados en kb. La Figura 4 es una imagen escaneada de un análisis Southern que muestra que la subunidad catalítica de telomerasa es codificada por un gene simple y no es amplificada en las células LIM 1215. El DNA genómíco aislado de la sangre humana periférica y línea celular LIM 1215 es sondeada con una sonda hT1. La mancha también contiene diluciones de plásmido de sonda para controlar la sensibilidad de la detección. El plásmido es diluido a aproximadamente 10, 5 y 1 equivalentes de genoma. H, Hind lll; E, Eco Rl; P, Pst I; X, Xba I; B, Bam Hl. La Figura 5 muestra los resultados de la amplificación de cDNAs sintetizados a partir de varios tejidos. La amplificación se realiza usando iniciadores de la secuencia de cDNA de hT1 que conectan un intrón en el gene hT1, y los productos se manchan y sondean con un oligonucleótido radiomarcado de la secuencia de hT1. La amplificación también se realiza en las mismas muestras con un par de iniciadores del gene ß-actina como un control de carga. a:control de cDNA de hT1; b: control de DNA genómico humano; C. control sin plantilla; d: RNA de colon normal; e: RNA de testes normal; f: RNA de linfocito normal; g: RNA de melanoma (metástasis cerebral); h: RNA de melanoma (metástasis de tobillo subcutánea); i: RNA de melanoma (metástasis de hígado); j: RNA de melanoma (metástasis de pulmón); k: RNA de melanoma (metástasis de nodulo linfático axilar); I: RNA de melanoma (metástasis de piel); m: RNA de carcinoma de pecho; n: RNA de carcinoma de pecho, o: RNA de carcinoma de pecho; p: RNA de carcinoma de pecho. La Figura 6 presenta resultados que muestran la expresión de hT1 en células pre-crisis y líneas de células post-crisis. Panel superior: amplificación anidada usando iniciadores dentro del EST original. Panel inferior: RT-PCR de control usando iniciadores de ß-actina. A: paso BET-3K (p) 7 (pre-crisis); b: BET-3K p32 (post-crisis); c:BFT-3K p14 (pre- crisis); d: BFT-3K p 22 (post-crisís); e: BFT-3B p15 (pre-crisis); f: BFT-3B p29 (post-crisís); g: GM897 (ALT); h: IIICF/c (ALT); i: IIICF-T/B1 (ALT); j: control sin plantilla. Las Figuras 7A-C muestran algunos patrones de empalme alternativos del transcripto hT1. A, representación esquemática de seis variantes de empalme. B, combinaciones de algunas variantes de RNA identificadas. C, secuencias de uniones putativas de exón/intrón de variantes de RNA. Las variantes se marcan como en la parte A. Se presenta una secuencia de DNA completa (con traslación de proteína) (SEQ ID No: ) de variante 3. Los aminoácidos correspondientes a un sitio de unión c-Abl/SH3 potencial están subrayados. Las uniones putativas de exón/intrón se marcan con | y coordinados de secuencia son como en la Figura 1. Los exones empalmados putativos están en la casilla inferior y los intrones no empalmados putativos están en negritas. La Figura 8 muestra varios patrones de empalme del transcripto hT1 en diferentes muestras de tumores. La amplificación anidada (14 ciclos) se realiza usando los iniciadores HT2026F y HT2482R en los productos de RT-PCR primarios generados con iniciadores HT1875F y HT2781R. a: carcinoma de pulmón; b: linfoma; c: carcinoma de pulmón; d: meduloblastoma; e: linfoma; f: linfoma; g: T47D; h: feocromocitoma; i: linfoma; j: glioma; k: linfoma; I: control sin plantilla. La Figura 9 muestra los resultados de la amplificación en cDNA sintetizado a partir de cDNA de LIM 1215. Como se muestra, el motivo de transcriptasa inversa A es suprimido de variantes empalmadas conteniendo la secuencia a. Las combinaciones de iniciadores son: a, HTM2028F + H52356R; b, HT2026F + H52482R; c, HTM2028F + HT2482R; d , HT2026F + HT2482R. Las Fig uras 1 0A-B presentan secuencias de DNA de regiones variantes de telomerasa. Las Figuras 1 1 A-W presentan secuencias de DNA y aminoácidos de ejemplos de proteínas de telomerasa variantes. La Figura 1 2 es una imagen escaneada de un ensayo de actividad de telomerasa. Las Figuras 1 3A-D presentan un d iagrama esq uemático de pAK1 28.4 de plásmido y la secuencia de DNA del plásmido. Las Figuras 14A-E presentan un diagrama esquemático del plásmído pAK1 28.7 y la secuencia de DNA del plásmido. Las Figuras 1 5A-D presentan un diagrama esquemático del plásmido pAK1 28. 14 y la secuencia de DNA del plásmido.

DESCRI PCIÓN DETALLADA DE LA I NVENCI ÓN Antes de exponer la invención, puede ser útil para el entendimiento de la m isma, definir ciertos términos usados en la presente. Como se usa en la presente, "telomerasa de ti po natural" generalmente se refiere a un polipéptido que sintetiza enzimáticamente secuencias de ácido nucleico comprendiendo secuencias de repetición simple (por ejemplo, CCCTAA, ver Zakian , Science 270: 1 601 , 1 995) a extremos de cromosomas. Se ha deducido la secuencia de aminoácidos de una telomerasa de tipo natural representativa de humano y se presenta en la Figura 1 (SEQ I D No. ). Dentro del contexto de esta invención, se debería entender que las tetomerasas de esta invención incluyen no solo proteína de tipo natural, si no también variantes (i ncluyendo alelos) de la secuencia de proteína de tipo natural . Tales variantes no necesariamente pueden exhibir función enzimática. Brevemente, tales variantes pueden resultar de polimorfismos naturales, incluyendo variantes de empalme de RNA, generadas por recombinación genética , o sintetizarse por metodología recombinante, y más aún, pueden diferir de la proteína de tipo natural por una o más substituciones, inserciones, supresiones, rearreglos de aminoácidos o similares. Normalmente, cuando el resultado de la síntesis, substituciones de am inoácidos son conservadoras, es decir, la substitución de aminoácidos dentro de los grupos de aminoácidos polares, no polares, aromáticos, cargados, etc. en la región de homolog ía a la secuencia de tipo natural en las variantes de regiones de motivo de RTasa , preferiblemente tendrán al menos 90% de identidad de secuencia de aminoácidos, y dentro de ciertas modalidades, mayor que 92% , 95% o 97% de identidad . Fuera de la región de motivo de RTasa, las variantes preferiblemente tendrán 75% de identidad de am inoácidos y dentro de ciertas modalidades, al menos 80% , 85% , 90% , 95% o 97% de identidad . Como se apreciará por aquéllos expertos en la técn ica, una secuencia de nucleótidos codificando telomerasa puede diferir de la secuencia de tipo natural presentada en las Figuras; debido a las degeneraciones de codones, polimorfismos de nucleótidos o diferencias de aminoácidos. En otras modalidades, las variantes preferiblemente deberían hibridar a la secuencia de nucleótidos de tipo natural en cond iciones de severidad normal, la cual es aproximadamente 25-30°C debajo de Tm del duplo natural (por ejemplo, Na+ 1 M a 65°C; 5X SSPE, 0.5% SDS, 5X solución de Denhardt, a 65°C o condiciones equivalentes; ver, de manera general, Sambrook et al . , Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Clonación molecular: un manual de laboratorio) , 2a ed. , Cold Spring Harbor Press, 1 987; Ausubel et al . , Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing , 1 987). Tm para otros oligonucleótidos cortos puede calcularse mediante la fórmula Tm=81 .5 + 0.41 %(G+C) - log(Na+). Las hibridaciones de baja severidad se realizan en condiciones aproximadamente 40°C por debajo de Tm , y las hibridaciones de alta severidad se realizan en condiciones de aproximadamente 1 0°C por debajo de Tm . Las variantes preferiblemente tienen al menos 75% de identidad de nucleótidos a la secuencia de tipo natural en la región de motivo de RTasa, de preferencia al menos 80%, 85% , y m uy preferiblemente al menos 90% de identidad de nucleótidos. Como se usa en la presente, un "promotor" se refiere a una secuencia de nucleótidos que contiene elementos que dirigen la transcripción de un gene en lazado. Como m ínimo, un promotor contiene un sitio de unión de polimerasa de RNA. De manera más normal, en eucariotes, las secuencias de promotor contienen sitios de unión para otros factores de transcripción que controlan la proporción y el desarrollo en el tiempo de la expresión de genes. Tales sitios incluyen la casi lla TATA, casilla CAAT, casilla Pou , sitio de unión AP 1 y similares. Las regiones promotoras también pueden contener elementos intensificadores. Cuando un promotor es enlazado a un gene, con el fin de habilitar la transcripción del gene, está "operablemente enlazado" .

Una "molécula de ácido nucleico aislada" se refiere a una molécula de polinucleótido en la forma de un fragmento separado o como un componente de un constructo de ácido nucleico mayor, que se ha separado de su célula fuente (incluyendo el cromosoma en que normalmente reside) al menos una vez en una forma substancialmente pura. Las moléculas de ácido nucleico pueden estar comprendidas por una amplia variedad de nucleótidos, incluyendo DNA, RNA, análogos de nucleótidos o alguna combinación de estos.

I . TELOMERASA, GENES DE TELOMERASA Y PRODUCTOS DE GENES Como se notó antes, la invención proporciona composiciones que se refieren a genes de telomerasa de vertebrado y productos de genes, y métodos para el uso de los genes y productos de genes. Dada la descripción proporcionada en la presente, un gene de telomerasa puede ser aislado de una variedad de tipos de células que expresan telomerasa, incluyendo células inmortalizadas o transformadas. Como se ejemplifica en la presente, se identifican , aislan y caracterizan un cDNA y variantes que codifican telomerasa a partir de células humanas. La proteína de telomerasa es producida entonces fácilmente por células huésped transfectadas con un vector de expresión que codifica telomerasa.

A. Aislamiento de gene de telomerasa Como se describe en la presente, la invención proporciona genes que codifican telomerasa. Dentro de una modalidad de la invención, un gene q ue codifica telomerasa humana puede ser identificado por amplificación de una genoteca de cDNA usando un par de iniciadores diseñado a partir de una secuencia EST. La secuencia EST Gen Bank Acceso No. AA281 296, es identificada por identidad de secuencia y similitud a un gene de telomerasa de Euplotes aediculatus (GenBank Acceso no. U95964; Lingner et al. , Science 276: 561 , 1 997) . Las comparaciones de secuencias entre el gene de telomerasa de euplotes y EST muestran aproximadamente 38% de identidad de aminoácidos y 59% de similitud de aminoácidos. Los genes de telomerasa pueden aislarse del DNA genóm ico ocDNA.

Se prefiere DNA genómico cuando se desean la región promotora u otras reg iones flanqueantes. Las genotecas de DNA genómico construidas en vectores cromosómicos, tales como, YACs (cromosomas artificiales de levadura), vectores de bacteriófagos, tales como, ?EM BL3, ?gt1 0, cósmidos o plásm idos, y genotecas de cDNA construidas en vectores de bacteriófagos (por ejemplo, ?ZAPI I), plásm idos, u otros, son adecuados para clasificación . Tales genotecas pueden ser construidas usando métodos y técnicas conocidas en la técnica (ver Sam brook et al . , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 1 989) o comprarse de fuentes comerciales (por ejemplo, Clontech , Palo Alto, CA). El DNA puede ser aislado de células de vertebrado, tales como, células humanas, células de ratón , células de otro roedor o primate , células de aves y similares. Dentro de una modalidad , el gene de telomerasa es aislado por amplificación usando DNA de genoteca de cDNA como plantillas. Usando la secuencia EST reportada , puede aislarse la telomerasa humana . Brevemente, conjuntos de iniciadores de amplificación se diseñan basándose en la secuencia de nucleótidos de EST. Ejemplos de tales iniciadores se presentan en la Tabla 2 (ver tam bién Ejemplo 1 ). Se prefiere la amplificación de genotecas de cDNA hechas a partir de células con actividad de telomerasa. Los iniciadores descritos en la presente amplifican un fragmento que tiene una longitud predicha a partir de la secuencia EST de una genoteca de cDNA LI M 1 21 5. LI M 1 21 5 es una línea de célu las de cáncer de colon humano. La confirmación de la naturaleza del frag mento se obtiene mediante análisis de secuencia de DNA. Los fragmentos de DNA que abarcan la secuencia adicional son ampl ificados en reacciones que usan un iniciador que híbrida una secuencia de vector en conj unción con una de los iniciadores de EST. Al usar iniciadores de vector de cualq uier lado del sitio de clonación, en combinación con los iniciadores de EST, se aisla un fragmento de 1 .6 kb derivado de la región 3' de h-TEL (telomerasa humana) y un fragmento de 0I7 kb derivado de la región 5'. Estos fragmentos son verificados como que contienen una secuencia de codificación de telomerasa por am plificación con un par de iniciadores internos a la secuencia EST. Los dos fragmentos se clonan en pBluescript y se someten a análisis de secuencia de DNA. La secuencia de DNA adicional se obtiene por C-RACE y procedim ientos de amplificación para obtener el extremo 5' de un cDNA, así como por hibridación y aislam iento de clones de la genoteca de cDNA.

La secuencia de DNA compilada y secuencia de aminoácidos predicha de una telomerasa humana de referencia se presentan en la Figura 1 . Como se muestra, la región de codificación de la telomerasa de referencia es 3396 bases de largo y tiene una región sin trasladar 3' de aproximadamente 620 bases de largo. La secuencia de aminoácidos predicha es 1 1 32 aminoácidos de largo y puede delinerase en cuatro dom inios principales: N-terminal , básico, transcriptasa inversa (RT) y C-terminal . Adicionalmente, la telomerasa humana contiene regiones de homología a otras telomerasas (por ejemplo, de Euplotes y S. pombe) y transcriptasas inversas. Estos motivos son identificados en la presente y en Kil ian et al . (Human Molecular Genetics, 1 2: 201 1 -201 9, 1 997) como los domin ios 1 , 2, A, B, C y D, en Nakamura et al. , (Science 277 : 955-959) como los dominios 1 , 2, A, B' , C, D y E, y en Meyerson et al . (Cell, 90: 785-795, 1 997) como los motivos 1 -6. Sin importar el nombre usado, estos motivos abarcan los aminoácidos 621 -626 (motivo 1 ) y 631 -634 (motivo 2) , 708-720 (motivo A), 827-839 (motivo B), 863-871 (motivo C) y 895-902 (motivo D) . Debido a que los l ímites de estos motivos se basan en similitud e identidad con otras telomerasas, el l ím ite funcional de cada motivo puede ser diferente. Además, se obtienen variantes de la secuencia de telomerasa de referencia por amplificaciones, las cuales se describen en la presente. Su DNA y secuencias de aminoácidos predichas se presentan en la Figura 1 1 y se discuten con mayor detalle más adelante. Brevemente, algunas de estas variantes codifican las proteínas truncadas y otras tienen secuencias C-terminales diferentes. Estas variantes probablemente resultan del em palme de RNA alternativo debido a que la telomerasa parece ser u n gene de copia simple en humanos (ver Ejem plo 2) .

De manera alternativa, pueden usarse otros métodos para obtener una molécula de ácido nucleico que codifica telomerasa. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que codifica telomerasa puede obtenerse a partir de una genoteca de expresión al clasificar con un anticuerpo o anticuerpos reactivos a telomerasa (ver, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed . , Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1 987 ; Ausu bel et al. Current Protocols in Molecular Biology, Green Publ ishing Associates y Wiley-l nterscience, NY, 1 995) . En otra modalidad, las moléculas de ácido nucleico que codifican telomerasa pueden aislarse por clasificación por hibridación de genotecas de cDNA o genómico. Los oligonucleótidos para clasificción por hibridación pueden diseñarse basándose en la secuencia de DNA de la telomerasa humana presentada en la presente. Los oligonucleótidos para clasificación normalmente son al menos 1 1 bases de largo y más usualmente al menos 20 o 25 bases de largo. En una modalidad, el oligonucleótido es 20-30 bases de largo. Tal oligonucleótido puede sintetizarse en una manera automatizada. Para facilitar la detección, el oligonucleótido puede marcarse conven ientemente, generalmente en el extremo 5' , con una molécula reportadora , tal como, un radionúcleido (por ejemplo, 32P) , marca enzimática, marca de proteína, marca fluorescente o biotina. Una genoteca generalmente se platina como colonias o fagos, dependiendo del vector, y el DNA recom binante es transferido a nylon o mem branas de nitrocel ulosa. Las condiciones de hibridación son adaptadas a la longitud y contenido de GC del oligonucleótido. Siguiendo la desnaturalización , neutralización y fijación del DNA a la membrana, las membranas se hibridan con la sonda marcada. Las condiciones de hibridación adecuadas pueden encontrarse en Sambrook et al . , supra, Ausubel et al . , supra, y adicionalmente, las soluciones de hibridación pueden contener aditivos, tales como, cloruro de tetrametilamonio u otros reactivos caotrópicos o reactivos hibotrópicos para incrementar la especificidad de hibridación (ver, por ejemplo, PCT/US97/17413). Siguiendo la hibridación, los métodos de detección adecuados revelan colonias o fago de hibridación q ue son , entonces, aislados y propagados. Los clones cand idatos o fragmentos am plificados pueden ser verificados como que contienen DNA de telomerasa por cualquiera de varios medios. Por ejemplo, los clones candidatos pueden ser hibridados con una segunda sonda no traslapante o someterse a análisis de secuencia de DNA. En estas formas, se aislan clones que contienen un gene o fragmento de gene de telomerasa, los cuales son adecuados para usarse en la presente invención. También puede obtenerse DNA de telomerasa por amplificación de cDNA o DNA genóm ico. Los iniciadores de ol igonucleótidos para am pl ificación de un cDNA de long itud completa son derivados, de preferencia, de secuencias en los extremos 5' y 3' de la región de cod ificación . La amplificación de secuencias genómicas usarán iniciadores que conectan secuencias intrónicas y pueden usar condiciones que favorecen productos de amplificación larga (ver catálogo Promega). Brevemente, los oligonucleótidos usados como iniciadores de amplificación preferiblemente no tienen secuencias atuo-com plementarias ni tienen secuencias complementarias en su extremo 3' (para evitar la formación de d ímero de iniciadores) . De preferencia, los iniciadores tienen un contenido de GC de aproximadamente 50% y contienen sitios de restricción para facilitar la clonación. Generalmente, los iniciadores están entre 15 y 50 nucleótidos de largo, y de manera más usual entre 20 y 35 nucleótidos de largo. Los i niciadores se templan a cDNA o DNA genóm ico y ciclos de amplificación suficientes se realizan para producir un producto detectable, de preferencia uno que se visualice fácilmente por electroforesis en gel y manchado. El fragmento amplificado es purificado e insertado en un vector (por ejemplo, un vector viral , fagom ido o plásmido, tal como, ?gt1 0 o pBS(M 1 3+)) y se propaga. Los genes de telomerasa de una multitud de especies pueden aislarse usando las composiciones proporcionadas en la presente. Para especies estrechamente relacionadas, la secuencia humana o porción de la m isma puede utilizarse como una sonda o una genoteca de cDNA o genómico. Por ejemplo, un fragmento del gene de telomerasa que abarca el sitio catal ítico (aproximadamente correspondiente a los am inoácidos 605-91 5 de la Figura 1 ) pueden marcarse y usarse como una sonda en una genoteca construida a partir de especies de ratón, primate, rata, perro, u otro vertabrado, de sang re caliente o mam ífero. Una hibridación inicial a severidad normal puede producir clones o fragmentos que codifican telomerasa . Si no se observa ninguna hibridación , pueden perseguirse hibridaciones de severidad relajada (baja). Las líneas de guía para variar la severidad de la hibridación puede adquirirse de Sambrook et al . , supra y otras fuentes bien conocidas. Tales sondas tam bién pueden usarse en genotecas de especies evolucionariamente diversas, tales como, Drosophila, aunque las condiciones de hibridación normalmente serán más relajadas. Otros métodos pueden usarse de manera alternativa para aislar genes de telomerasa a partir de especies no humanas. Estos métodos incluyen, pero no están limitados a, amplificación usando iniciadores derivados de áreas conservadas (por ejemplo, motivos de RTasa) , amplificación usando iniciadores degenerados de varias regiones de telomerasa incluyendo la región de RTasa , sondeando anticuerpos de genotecas de expresión , sondeando RNA de telomerasa de genotecas de expresión y sim ilares. Se identifica una secuencia de genes como una telomerasa por similitud de aminoácidos y/o identidad de ácidos nucleicos. De manera general, se prefiere la similitud de aminoácidos, la cual permite diferencias conservadoras, para identificar una telomerasa. De diversas especies, la similitud de aminoácidos generalmente es al menos 30% y preferiblemente al menos 40% o al menos 50% . La identidad de ácidos nucleicos puede ser menor y de esta manera difícil de valorar. Varios programas de anál isis por computadora fácilmente disponi bles , tales como BLASTN Y BLASTP, son útiles para determinar la afinidad de genes y productos de genes. Los genes de telomerasa candidatos son examinados por su actividad de enzima por uno de los ensayos funcionales descritos en la presente u otros ensayos equivalentes.

B. Genes de telomerasas variantes Las variantes (incluyendo alelos) de la secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos de telomerasa proporcionada en la presente, pueden ser aisladas fácilmente de variantes naturales (por ejemplo, polimorfismos, variantes de empalme, mutantes) , sintetizadas o construidas. Depend iendo del uso pretend ido, los mutantes pueden ser construidos para exhibir función de telomerasa alterada o deficiente. Los genes de telomerasa particularmente útiles codifican una proteína que carece de actividad enzímática pero que tiene un fenotipo negativo dom inante. Más aún, las variantes de telomerasa pueden carecer de una o más de las actividades de telomerasa conocidas, incluyen actividad de transcriptasa inversa, actividad nucleolítica, actividad de unión de telómero, actividad de unión de dNTP y actividad de unión de RNA de telomerasa (hTR) . Un experto en la técnica reconoce q ue muchos métodos han sido desarrollados para generar mutantes (ver, de manera general, Sambrook et al . , supra ; Ausubel et al . , su pra) . Brevemente, los métodos preferidos para generar unas pocas substituciones de nucleótidos utilizan un oligonucleótido que conecta la base o bases a ser sometidas a mutación y contiene la base o bases con mutación. El oligonucleótido es hibridado a un ácido n ucleico de filamento simple complementario y la síntesis de segundo filamento es iniciada desde el oligonucleótido. De manera similar, las supresiones y/o inserciones pueden construirse mediante cualquiera de una variedad de métodos conocidos. Por ejemplo , el gene puede se digerido con enzimas de restricción y religarse de manera q ue alguna secuencia es suprimida o ligada con un fragmento aislado teniendo extremos cohesivos, de manera que se hace una inserción o substitución larga. En otra modalidad, las variantes son generadas por "entremezclado de exones" (ver la patente estadounidense no. 5,605,793) . Las secuencias variantes también pueden ser generadas mediante técnicas de "evol ución molecular" (ver la patente estadounidense no. 5,723,323) . Otros medios para generar las secuencias variantes pueden encontrarse, por ejem plo, en Sambrook et al . (supra) y Ausubel et al . (supra) . La verificación de secuencias variantes normalmente se logra por mapeado de enzimas de restricción , análisis de secuencias, o hibridación de sondas, aunque pueden usarse otros métodos. El ácido nucleico de doble filamento se transforma en células huésped , normalmente E. coli, pero de manera alternativa , pueden usarse otros procariotes, levadura o eucariotes superiores. Los protocolos de clasificación estándar, tales como, hibridación de ácidos nucleicos, amplificación y análisis de secuencia de DNA, identificarán secuencias mutantes. En modalidades preferidas, las telomerasas variantes son inactivas con respecto a la actividad enzimátíca e imparten un fenotipo negativo dominante a una célula huésped . Sin importar el mecanismo actual , cuando se expresa una telomerasa negativa dominante en u na célula, la telomerasa activa natural se vuelve inactiva . En el domin io catal ítico, los motivos de RTasa com parten residuos de ácido aspártico conservados. La telomerasa humana también contiene estos residuos críticos: Asp 712, Asp 71 8, Asp 868 y Asp 869. La mutación de uno o más de estos residuos de Asp a un aminoácido no conservador (por ejem plo, alanina) , probablemente destruirá la actividad enzimática y/o afectará el encogimiento del telómero. Para cada uno de estos mutantes, se ensaya la negatividad dominante. Los mutantes preferidos son negativos dominantes e inducen un fenotipo de senescencia en ciertas modalidades.

Oras variantes negativas dom inantes pueden ser generadas por supresión de uno o más de los motivos de RTasa o alteración de la región involucrada en la iniciación de DNA (tal como, motivo E), sitio de unión para el componente de RNA, el sitio de unión de plantilla, el sitio de unión de ion metálico (tal como, motivo C) y sim ilares. En otras modalidades, la molécula de ácido nucleico que codifica telomerasa puede fusionarse a otra molécula de ácido nucleico. Como se apreciará, el gene compañero de fusión puede contribuir, dentro de ciertas modalidades, a una región de codificación . Así, puede ser deseable usar solamente el sitio catalítico de telomerasa (por ejemplo, aminoácidos 609-91 5), motivos de RTasa individuales (descritos antes), cualquiera de las telomerasas variantes de em palme descritas en la presente, el sitio de unión de RNA de telomerasa y sim ilares. La elección del com pañero de fusión depende, en parte, de la aplicación deseada. El compañero de fusión puede ser usado para alterar la especifidad de la telomerasa, proporcionar una función reportadora, proporcionar una secuencia de marbete para identificación o protocolos de purificación y sim ilares. El reportador o marbete puede ser cualquier proteína que permita la medición conveniente y sensible o facilite el aislamiento del producto de gene y no interfiera con la función de la telomerasa. Para la función reportadora , ß-g lucoronidasa (patente estadounidense no: 5, 268,463) , proteína fluorescente verde y ß-galactosidasa están fácilmente disponibles como secuencias de DNA. Un marbete de péptido es una secuencia corta, usualmente derivada de una proteína natural , la cual es reconocida por u n anticuerpo u otra molécula. Los marbetes de péptido incluyen FLAG®, marbete Glu-Glu (Chiron Corp. , Emeryville , CA) , marbete KT3 (Chiron Corp. ) , marbete T7 gene 1 0 (I nvitrogen, La Jolla , CA) , marbete de proteína de capsíde mayor T7 (Novagen, Madison , Wl), His6 (Hexa-His), y marbete HSV (Novagen). Además de los marbetes, pueden usarse otros tipos de proteínas o péptidos, tales como, glutationa-S-transferasa.

C. Fragmentos y oligonucleótido derivados de genes de telomerasa Además, pueden aislarse o construirse porciones o fragmentos de gene de telomerasa para usarse en la presente invención . Por ejemplo, pueden aislarse fragmentos de restricción mediante técnicas bien conocidas a partir de DNA de plantilla, por ejemplo, DNA de plásmido y fragmentos de DNA, incluyendo fragmentos de restricción , pueden generarse por amplificación . Adicionalmente, pueden sintetizarse o aislarse olígonucleótidos a partir de moléculas de DNA recombinante. Un experto en la técnica apreciará que otros métodos están disponibles para obtener moléculas de DNA o RNA teniendo al menos una porción de una secuencia de telomerasa. Más aún , para aplicaciones particulares, estos ácidos nucleicos pueden ser marcados mediante técnicas conocidas en la técnica con una radiomarca (por ejemplo, 32P, 33P, 35S , 125l , 1 31 l , 3H , 14C), marca fluorescente (por ejemplo, FITC, Cy5, RITC, rojo Texas) , marca quimíoluminíscente, enzima, biotina y similares. Los métodos para obtener fragmentos son bien conocidos en la técnica . Porciones que son particularmente útiles dentro del contexto de esta invención contienen el sitio catal ítico, motivos de RTasa individuales, las secuencias intrónicas putativas (ver Fig ura 1 0) y similares. Los m¡ ^ oligonucleótidos generalmente son sintetizados de forma automatizada; los métodos y aparatos para síntesis están fácilmente disponibles (por ejem plo, Applied Biosystems I nc, CA). Los oligon ucleótidos pueden contener nucleótidos que ocurren de manera no natural , tales como, análogos de nucleótidos, un esqueleto modificado (por ejemplo, esqueleto de péptido) , derivados de nucleótidos (por ejemplo, nucleótido biotinilado) , y sim ilares. Como se usa en la presente, los oligonucleótidos se refieren a una secuencia de ácidos nucleicos de al menos aproximadamente 7 nucleótidos y generalmente no más de aproximadamente 1 00 nucleótidos. Usualmente, los olígonucleótidos están entre aproximadamente 1 0 y aproximadamente 50 bases, más frecuentemente entre aproximadamente 1 8 y aproximadamente 35 nucleótidos de largo. Los oligonucleótidos pueden ser de filamento simple o en algunos casos, de filamento doble. Como se usa en la presente, porciones de un ácido nucleico se refiere a un poli nucleótido que contiene menos de la secuencia de ácido nucleico paternal completa. Por ejemplo, una porción de secuencia de codificación de telomerasa contiene menos de una secuencia de telomerasa de longitud completa. Una "porción" generalmente es al menos aproximadamente de siete nucleótídos, y puede ser tanto como 1 0, 20, 25 o más nucleótidos de longitud . Un frag mento se refiere a una molécula de poli nucleótidos de cualquier longitud y puede abarcar un oligonucleótido, aunque más usualmente, pero no se limita a, el término oligon ucléotido se usa para denotar polinucleótidos cortos y el término fragmento se usa para denotar polinucleótidos más grandes.

Los oligonucleótidos para usarse como iniciadores para amplificación y sondas para clasificación por hibridación pueden diseñarse basándose en la secuencia de DNA de telomerasa humana presentada en la presente. Los iniciadores de oligonucleótidos para amplificación de un cDNA de longitud completa generalmente se derivan de secuencias en los extremos 5' y 3'. Los iniciadores para amplificación de regiones específicas son eleg idas para generar productos de un tamaño fácilmente detectable. En modalidades preferidas, se eligen los iniciadores que flanquean las secuencias sujetos a empalme de RNA alternativo. En modalidades preferidas, se elige un conjunto de iniciadores de manera que tanto el producto que conecta empalmado en secuencia, así como el producto que conecta empalmado fuera de la secuencia, sean tamaños adecuados a ser detectados bajo las m ismas cond iciones de reacción . En otras modal idades, dos conj untos de iniciadores se usan para detectar los RNAs empalmados alternativos. Por ejemplo, un conjunto de i niciadores flanquea la unión de empalme con el fin de detectar un producto empalmado fuera. El seg undo conjunto de iniciadores puede derivarse muy cerca de la unión (de manera q ue un producto de amplificación empalmado fuera es del mismo tamaño o escasamente más g rande que la longitud de d ímero-inicíador) o uno o más del conjunto puede derivarse de la secuencia empalmada dentro (de manera que el RNA empalmado fuera no produciría ning ún producto) . Los iniciadores de amplificación preferiblemente no tienen secuencias auto-complementarias ni tienen secuencias com plementarias en su extremo 3' (para evitar la formación de dímero-in iciador) . De £S J--?- , preferencia, los iniciadores tienen un contenido de GC de aproximadamente 50% y pueden contener sitios de restricción para facilitar la clonación . Los iniciadores de ampl ificación usualmente son al menos 1 5 bases y usualmente no más largas que 50 bases, aunque en algunas circunstancias y condiciones pueden usarse longitudes más cortas o más largas. Más usualmente, los iniciadores son desde 1 7 hasta 40 bases de largo, 17 a 35 bases de largo, o 20 a 30 bases de largo. Los iniciadores son tem plados a un cDNA o DNA genóm ico y ciclos de ampl ificación suficiente, generalmente 20-40 ciclos, se real izan para producir un producto fácilmente visualizado por electroforesis en gel y manchado o por hibridación . El fragmento am plificado puede ser purificado e insertado en un vector, tal como, ?gt1 0 o pBS(M 1 3+) y propagado, aislado y sometido a análisis de secuencia de DNA, sometido a hibridación, o simi lares. Una sonda de hibridación de oligonucleótido adecuada para clasificar cDNA, genómico u otros tipos de genotecas (por ejemplo, secuencias de telomerasas mutantes), sondeado southern , northern o northwestern blots, productos de amplificcción y similares, pueden diseñarse basados en las secuencias proporcionadas en la presente. Los ol igonucleótidos para hibridación normalmente son al menos 1 1 bases de largo, generalmente menos de 100 bases de largo y preferiblemente al menos 1 5 bases de largo, al menos 20 bases de largo, al menos 25 bases de largo y preferiblemente 20-70, 25-50, o 30-40 bases de largo. Para facilitar la detección , el oligonucleótido puede ser marcado convenientemente, de manera general en el extremo 5' , con una molécula reportadora , tal como, un radionucleido, (por ejemplo , 32P) , marca enzimática, marca de proteína, marca fluorescente o biotina (ver Ausubel et al . , y Sambrook et al. , supra). Una genoteca generalmente se platina como colonias o fagos, dependiendo del vector, y el DNA recombinante es transferido a nylon o membranas de nitrocelu losa. Siguiendo la desnaturalización , neutralización y fijación del DNA a la membrana, las membranas se híbridan con una sonda marcada y se lavan . Los métodos de detección adecuados revelan colonias o fagos de hibridación que son, entonces, aislados y propagados. Los métodos para transferir ácidos nucleicos a membranas y realizar hibridaciones son bien conocidos. En ciertas modalidades, los aditivos para la solución de hibridación , tal como, un caótropo (por ejemplo, cloruro de tetrametilamonio) o un hibotropo (por ejemplo, tricloroacetato de amonio; ver PCT/US97/1 741 3) se adicionan para aumentar la sensibilidad y especificidad de la hibridación . Una sonda híbrida específicamente a un ácido nucleico si permanece detectablemente templado después de lavarse bajo condiciones equivalentes a condiciones de hibridación (expresadas en la presente como el número de g rados menores q ue Tm) .

D. Variantes de empalme de telomerasa humana Además de las secuencias de DNA de telomerasa de referencia y proteínas presentadas en las Figuras 1 , se observan varias variantes de em palme de RNA. Aunque algunas de las variantes pueden reflejar mRNA incompletamente procesado, vale la pena notar que tales variantes son abundantes en una muestra de RNA (LI M 1 21 5) preseleccionada para m RNA poliadenilado. Estos hallazgos, junto con su amotonamiento en el dominio RT, sugieren que las variantes de inserción más probablemente reflejan la regulación de la expresión de proteína hT1 . Por ejemplo, las vanantes en las cuales se suprimen los exones (ver a, ß, fig . 7), probablemente son alternativas maduras que codifican proteínas variantes. La evidencia adicional en soporte de proteínas alternativas, viene del análisis de secuencia de clones de cDNA identificados en una genoteca de cDNA Ll M 1 21 5 que contenían tanto supresiones como inserciones comparadas con la secuencia de referencia. Al menos siete intrones putativos diferentes parecen ser retenidos en m RNAs (ver Figura 7, la muestra exh ibe 6 de los 7 intrones) . Los intrones pueden ser retenidos independientemente, así, un mRNA particu lar puede tener, ninguno, uno, dos, etc, hasta siete intrones. El número máximo de m RNAs d iferentes que resultan de siete intrones empalmados independientemente es 27, o 128 mRNAs diferentes. Las secuencias de DNA de estos intrones se presentan en la Fig ura 1 0. El intrón más hacia 5', llamado secuencia "X", es una longitud desconocida y solo se presenta una secuencia parcial . La secuencia de telomerasa de referencia (Figura 1 ) incluyen intrón a, intrón ß. En la siguiente discusión , el efecto de presencia/ausencia y ubicación de cada intrón se presenta en la base de que es la ún ica alteración . Se apreciará que un intrón particular puede alterar la secuencia del producto trasladado, sin importar si otros intrones son empalmados dentro o fuera. Por ejemplo, la presencia de intrón 1 resulta en un desplazamiento de marco y proteína truncada, sin im portar si los intrones a, ß, 2 o 3 son empalmados dentro o fuera.

La presencia del intrón "X" resulta en una proteína truncada que contiene aproximadamente 600 aminoácidos N-terminales y carece de todos los motivos de RTasa. La presencia del intron "Y" en la base 222, resulta en una proteína de marco desplazado que termina dentro de tres codones después del intrón . Como el intrón Y es m uy rico en GC , aproximadamente 78%, lo cual es difícil de secuenciar, es posible que el intrón Y provoque una inserción de aproximadamente 35 am inoácidos y no un desplazamiento de marco. El intrón 1 en el nucleótido 1 950 es 38 bp y su presencia en mRNA provoca un desplazam iento de marco y ú ltima traslación de una proteína truncada (codón de paro en nt 1 973). Esta proteína truncada contiene solo los dominios 1 y 2 de RTasa. El intrón a, ubicado de las bases 21 31 -2166, es observado frecuentemente empalmado fuera del m RNA de telomerasa. Una proteína trasladada de tal RNA es suprimida por 1 2 aminoácidos, removiendo el motivo A de RTasa. Este motivo parece ser crítico para la función de RT; una mutación de aminoácido simple dentro de este dominio en la proteína EST2 de levadura resulta en una proteína que funciona como un negativo dominante y resulta en senescencia celular y encogimiento de telómero. Otra de las secuencias variantes, la supresión del exón ß en la base 2286-2468, codifica una proteína truncada, debido a un marco de desplazamiento en la base 2287, que se une a la base 2469, y subsecuentemente un codón de terminación en la base 2605. Esta proteína variante tiene los dom inios de RTasa 1 , 2, A, B y parte de C, pero carece de otro motivo; además de los motivos de dominio de RTasa, otro motivo de secuencia (AVRI RGKS) identificado en la i nserción ß de hT1 iguala un consenso de motivo de rizo P AXXXXGK(S) (Saraste et al . , Trends Biochem. Sci. 15, 430-434, 1990). Este motivo es encontrado en un gran número de familias de proteínas, incluyendo un número de cinasas, dnaA bacteriana, recA, recF, mutS y helicasas de un ión de ATP (Devereaux et al. , Nucleic Acids Res. , 12, 387-395, 1 984). De esta manera, el rizo P está presente solo en una subpoblación de los mRNAs de h-TEL en la mayoría de las muestras de RNA analizadas y completamente ausente de varias m uestras de tumor (Figura 8). El intrón 2 en la base 2843 contiene un codón de terminación enmarco, resultando en una proteína truncada que tiene la región de dominio de RTasa completa , pero carece del extremo C. Como el extremo C puede jugar un papel regulador, la actividad de proteína probablemente será afectada. Cuando se retiene el intrón 3, una proteína más pequeña tam bién es producida debido a que el intron contiene un codón de paro enmarco. Así, la proteína tiene una secuencia C-terminal alterada. Que actividad pudieran tener tales proteínas es actualmente desconocida. La estructura cristalina de la transcriptasa inversa de HIV-1 demuestra que una forma corta de la proteína (p51 ) que carece del dominio de RNasa es inh ibida por la 'conexión' C-terminal que se dobla en la hendidura catal ítica. Si hT1 es asumida para adoptar una estructura sim ilar a H IV-RT, entonces las variantes de proteína hT1 C-terminal pueden reflejar un mecan ismo sim ilar de regulación . Además de las variantes que carecen del dom inio C-terminal de referencia, una variante con intrón 3 en la base 21 57 expresa un dom inio C-terminal alternativo. Adicionalmente, la región de codificación donada por el intrón 3 tiene un sitio de unión S H3 potencial, SGQPEM EPPRRPSGCV, que iguala el péptido de unión SH3 c-Abl de consenso (PXXXXPXXP) encontrado en proteínas, tales como, ataxia telagiectasia con mutación (ATM) . Un segundo ejemplo de este motivo se encuentra dentro del extremo N-term inal de la proteína hT1 en el péptido HAGPPSTSRPPRPWDTG. Otros dominios C-terminales alternativos son encontrados en los cDNAs de telomerasa; EST1 2462 (Gen Bank Acceso No. AA299878) tiene aproximadamente 50 bases de secuencia idéntica hasta la base 21 57 y entonces diverge de la secuencia de telomerasa de referencia así como del intrón 3. Esta nueva secuencia tiene un codón de paro interno en 50 bases que resultaría en un extremo C truncado. La variante detectada en una l ínea de células ALT (Fig . 6, campo i) abre la posibilidad de que el dominio básico de hT1 puede contribuir al mecanismo de ALT en al menos algnas líneas de células ALT. De manera interesante, esta l ínea de céulas ALT expresa el gene hTR. Un posible mecanismo de ALT podría involucrar componentes de telomerasa disregulado que están inactivos en el ensayo TRAP. La siguiente tabla resume las variantes de empalme y proteínas resultantes. Por simplicidad, solo una variante simple es listada para cada proteína resultante. Adicionalmente, como se notó antes, la presencia del intrón Y parece provocar un desplazamiento de marco que resulta en una proteína truncada , pero puede provocar una inserción . Así, cada marco de lectura del intrón Y es presentado y la marca es construida como si la inserción no provocara una proteína truncada. Una clasificación independiente de estos intrones conocidos conduciría a 1 28 secuencias de m RNA diferentes. Las secuencias de aminoácidos y DNA para las variantes en la Tabla 1 se presentan en la Figura 1 1 .

Tabla 1 Í-M-H-ßß- E. Vectores, células huésped y medios para expresar y producir proteína La proteína de telomerasa puede ser expresada en una variedad de organismos huésped. En una modalidad , la telomerasa es producida en bacterias, tales como, E. coli, para la cual se han desarrollado muchos vectores de expresión y están fácilmente disponibles. Otros organismos huésped adecuados incluyen otras especies bacterianas, y eucariotes, tales como, levadura (por ejem plo, Saccharomyces cerevisiae) , celias de mam ífero (por ejemplo, CHO y COS-7) y células de insectos (por ejemplo, Sf9) . Una secuencia de DNA que codifica telomerasa, una porción de la misma, una variante, proteína de fusión o similar, es introducida en un vector de expresión apropiado para el huésped . En ciertas modalidades, la telomerasa es insertada en un vector, de manera que se produce una proteína de fusión. La secuencia de telomerasa es derivada de un fragmento existente, clon de cDNA o es sintetizada . Un med io preferido de síntesis es ia ampl ificación del gene a partir de cDNA usando un conju nto de iniciadores que flanq uean la región de codificación o la porción deseada de la proteína. Como se discutió antes, la secuencia de telomerasa puede contener codones alternativos para cada ami noácido con codones múltiples. Los codones alternativos pueden ser eleg idos como "óptimos" para la especie huésped . Los sitios de restricción son incorporados normalmente en las secuencias de iniciadores y son elegidos con respecto al sitio de clonación del vector. Si es necesario, los codones de in iciación y terminación de traslación pueden ser diseñados en las secuencias de iniciadores. Como m ínimo, el vector debe contener una secuencia promotora . Pueden incluirse otras secuencias reguladoras. Tales secuencias incluyen una secuencia de señal de terminación de transcripción, secuencia de señal de secreción , origen de replicación , marcador seleccionable y similares. Las secuencias reguladoras están operacionalmente asociadas una con otra para permitir la transcripción o traslación . Los plásmidos usados en la presente para expresión de telomerasa incluyen un promotor diseñado para expresión de las proteínas en una célula huésped (por ejemplo, bacteriana) . Los promotores adecuados están am pliamente disponibles y son bien conocidos en la técnica. Se prefieren los promotores inducibles o constitutivos. Tales promotores para expresión en bacterias incluyen promotores del fago T7 otros fagos, tales como, T3, T5 y SP6, y los operones trp, Ipp y lac. Los promotores híbridos (ver, patente estadounidense no. 4, 551 ,433), tales como, tac y tre, también pueden ser usados. Los promotores para expresión en células eucarióticas incluyen el promotor de gene P1 0 o polihedron de sistemas de expresión de baculovirus/células de insectos (ver, por ejemplo, patentes estadounidenses nos. 5,243, 041 , 5,242, 687 , 5,266, 31 7, 4, 745, 051 y 5, 1 69, 784) , MMTV LTR, promotor CMV I E , RSV LTR, SV40, promotor de metalotioneína (ver, por ejemplo, la patente estadounidense no. 4, 870, 009) y otros promotores inducibles. Para la expresión de las proteínas, un promotor es insertado en enlace operativo con la región de codificación para la proteína de telomerasa.

La transcripción controladora de promotor de la telomerasa puede ser controlada por sí misma por un represor. En algunos sistemas, el promotor puede ser desreprimido al alterar las condiciones fisiológicas de la célula, por ejemplo, mediante la adición de una molécula que competitivamente se une al represor, o al alterar la temperatura del medio de crecimiento. Las proteínas represoras preferidas incluyen, pero no están l im itadas a, el represor lacl de E. coli, la cual es responsable de la inducción de IPTG, el represor ?cl857 sensible a la tem peratura, y similares. Se prefiere el represor lacl de E. coli. En otras modalidades preferidas, el vector también incluye una secuencia de terminador de transcripción, el cual tiene ya sea una secuencia que proporciona una señal que termina la transcripción por la polimerasa que reconoce el promotor seleccionado y/o una secuencia de señal para poliadenilación . De preferencia , el vector es capaz de replicación en las células huésped. Así, cuando la célu la huésped es una bacteria, el vector preferiblemente contiene un origen bacteriano de replicación . Los orígenes bacterianos preferidos de replicación incluyen los orígenes de replicación fl-ori y col E 1 , especialmente el ori derivado de plásmidos pUC. En la levadura, las secuencias ARS o CEN pueden ser usadas para asegurar la repl icación. Un sistema bien usado en células de mamífero es ori de SV40. Los plásmidos también incluyen, de preferencia, al menos un marcador seleccionable q ue es funcional en el huésped . Un gene marcador seleccíonable incluye cualquier gene que confiera un fenotipo en el huésped , que permite a las células transformadas ser identificadas y crecer de manera selectiva. Los genes marcadores seleccionables adecuados para huéspedes bacterianos incluyen el gene de resistencia a am picilina (Ampr) , gene de resistencia a la tetraciclina (Tcr) y el gene de resistencia a la canamicína (Kanr) . El gene de resistencia a la canamicina es actualmente preferido. Los marcadores adecuados para eucariotes usualmente requieren una deficiencia complementaria en el huésped (por ejemplo, cinasa de tim idina (tk) en huespedes de tk-). Sin embargo, tam bién están disponibles los marcadores de medicamentos (por ejemplo, resistencia a G41 8 y resistencia a la higromicina) . La secuencia de nucleótidos que codifican la telomerasa también puede incluir una señal de secreción , por la cual el péptido resultante es una proteína sintetizada como proteína precursora y es subsecuentemente procesada y secretada. La proteína procesada resultante puede ser recuperada de espacio periplásmico o medio de fermentación . Las señales de secreción adecuadas para usarse están am pliamente d isponi bles y son bien conocidas en la técnica (von Heijne, J. Mol. Biol. 1 84: 99- 1 05, 1 985) . Pueden emplearse señales de secreción procariótica y eucariótica que son funcionales en E. coli (u otro huésped) . Las señales de secreción actualmente preferidas incluyen, pero no están limitadas a , aquéllas codificadas por los siguientes genes de E. coli: pelB (Lei et al . , J. Bacterio!. 169:4379, 1987), phoA, ompA, ompT, ompF, ompC, beta-lactamasa y fosfatasa alcalina. Alg u ien experto en la técnica aprecia que existe una am plia veriedad de vectores adecuados para expresión en células bacterianas y los cuales son fácilmente obtenibles. Vectores tales como la serie pET (Novagen, Madison, Wl), la serie tac y tre (Pharmacia, Uppsala, Suecia), pTTQ18 (Amersham International pie, Inglaterra), pACYC 177, serie pGEX, y similares, son adecuados para expresión de una telomerasa. Los vectores de baculovirus, tales como, pBlueBac (ver, por ejemplo, las patentes estadounidenses nos. 5,278,050, 5,244,805, 5,243,041, 5,242,687, 5,266,317, 4,745,051 y 5,169,784; disponibles de Invitrogen, San Diego) pueden usarse para expresión de la telomerasa en células de insectos, tales como, células sf9 de Spodoptera frugiperda (ver, patente estadounidense no. 4.745,051). La elección de un huésped para la expresión de una telomerasa es dictada en parte por el vector. Los vectores comercialmente disponibles son emparejados con huésped adecuados. Una amplia variedad de vectores adecuados para expresión en células eucarióticas está disponible. Tales vectores incluyen pCMVLacl, pXT1 (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA); serie pCDNA, serie pREP, pEBVHis (Invitrogen, Carlsbad, CA). En ciertas modalidades, el gene de telomerasa es clonado en un vector enfocador de gene, tal como, pMCIneo, un vector de la serie pOG (Stratagene). La proteína de telomerasa es aislada mediante métodos estándares, tales como, cromatografía por afinidad, cromatografía por exclusión de tamaño, cromatografía de ¡ones metálicos, cromatografía de intercambio ¡ónico, HPLC y otros métodos de aislamiento de proteína conocidos, (ver, de manera general, Ausubel et al., supra; Sambrook et al., supra). Una proteína purificada aislada proporciona una banda simple en SDS-PAGE cuando se mancha con azul Coomassie. En una modalidad, la proteína de telomerasa es expresada como una proteína de fusión hexa-his y es aislada por cromatog rafía conteniendo metal , tal como, perlas acopladas con n íquel . Brevemente, una secuencia que codifica His6 puede ser posicionada en cualquier lado en la molécula, de preferencia está enlazada en el extremo 3' justo antes del codón de term inación. La fusión H is-hT1 puede ser construida mediante cualquier variedad de métodos. Un método conveniente es la am plificación del gene TEL usando un iniciador corriente abajo que contiene los codones para His6.

F. Péptidos y proteínas de telomerasa En un aspecto de la presente invención , se proporcionan péptidos q ue tienen secuencia de telomerasa. Pueden usarse péptidos como inmunógenos para criar anticuerpos, como inhibidores o intensificadores de la función de telomerasa, en ensayos descritos en la presente y similares. Los péptidos generalmente son cinco a 1 00 am inoácidos de largo, y más usualmente 10 a 50 aminoácidos. Los péptidos son sintetizados químicamente de manera fácil en una forma automatizada (Sintetizador de Péptido Perkin Elmer ABI) o pueden obtenerse comercialmente. Los péptidos pueden ser purificados adicionalmente mediante una variedad de métodos, incluyendo cromatografía líq uida de alto rendim iento. Además, los péptidos y proteínas pueden contener aminoácidos diferentes a los 20 aminoácidos que ocurren de manera natural o pueden contener derivados y mod ificaciones de los am inoácidos.

Los péptidos de particular interés dentro del contexto de esta invención tienen la secuencia de las secuencias de intrones (Figura 1 0) , los motivos de RTasa y similares. En ciertas modalidades, las proteínas de telomerasa tienen las secuencias de aminoácidos presentadas en las Fig ura 1 u 1 1 , o una porción de las m ismas, la cual es al menos 8 am inoácidos de longitud (y puede ser 1 0, 1 5, 20 o más ami noácidos de longitud) . En otras modalidades, la proteína tiene una o más substituciones, adiciones, supresiones de aminoácidos. Todavía en otras modal idades, la proteína tiene una secuencia de aminoácidos determinada por una secuencia de ácidos nucleico que híbrida bajo condiciones de severidad normal al complemento de cualquiera de las secuencias en la Figura 1 1 . Como se indicó antes, variantes de telomerasa incluyen variantes alélicas.

I I . ENSAYOS DE TELOMERASA Está disponible una variedad de ensayos para determinar la actividad y expresión de telomerasa. Tales ensayos incluyen ensayos in vitro que miden la capacidad de la telomerasa para extender un substrato de DNA telomérico, actividad nucleol ítica, actividad de unión de iniciador (telómero) , actividad de un ión de d NTP, actividad de unión de RNA de telomerasa (hTR) , ensayos de ganacia-de-función in vivo, ensayos de pérdída-de-funcíón in vivo, hibridación in situ, protección de sonda de RNasa, análisis Northern, amplificación de cDNA, manchado de anticuerpos y similares.

A. Ensayos para actividad catalítica Se describen varios ensayos para actividad catalítica en las patentes estadounidenses nos. 5,629,154; 5,639,613; 5,645,986 entre otras. En un ensayo convencional para actividad de telomerasa, se usan un iniciador de DNA de filamento simple teniendo la secuencia del telómero huésped (por ejemplo, [TTAGGG]n) y la enzima de telomerasa (ver Shay et al., Methods in Molecular Genetics (Métodos en genética molecular) 5:263, 1994; Greider y Blackburn, Cell 43:405, 1985; Morin, Cell 59:521, 1989; patente estadounidense no. 5,629,154). Un ensayo preferido incorpora una extracción basada en detergente con un ensayo basado en amplificación. Este ensayo, llamado TRAP (protocolo de amplificación de repeticiones teloméricas), ha mejorado la sensibilidad (Kim et al., Science 266: 2011, 1994). Brevemente, en TRAP, la telomerasa sintetiza productos de extensión, los cuales sirven entonces como plantillas para amplificación. Los productos de telomerasa son amplificados con un iniciador derivado de una región no telomérica del oligonucleótido y un iniciador derivado de la región telomérica. Cuando se analizan los productos de amplificación, tal como por electroforesis en gel, se observa una escalerilla de productos cuando está presente la actividad de telomerasa. Se han descrito permutaciones de este ensayo (Krupp et al., Nucí. Acids Res. 25: 919, 1997; Savoysky et al., Nucí. Acids Res. 24: 1175, 1996). También están disponibles otros ensayos de telomerasa (Faraoni et al., J. Chemother 8: 394, 1 996, describiendo un ensayo de quimiosensibilidad in vitro; Tatematsu et al . , Oncogene 1 3: 2265, 1 996, describiendo un "ensayo de PCR de alargamiento" ; Lin y Zakian , Cell 81 : 1 1 27, 1 995, describiendo un ensayo in vitro para Saccharomyces) . Además, pueden medirse actividades catal íticas u otras actividades por un sistema de reconstitución in vitro (ver Ejemplos). Brevemente, los ensayos, tales como aquéllos descritos en la presente, se realizan usando prote ína de telomerasa purificada, que es producida por medios recom bi nantes y otros componentes necesarios, tales como el componente de RNA de telomerasa, otras proteínas tales como se describe en WO 98/14593.

B. Ensayos para otras actividades La actividad nucleolítica puede valorarse mediante protocolos descritos, por ejemplo, en Collins y Grieder, Genes and Development 7: 1 364, 1 993) . La actividad nucleolítica es la excisión de un nucleótido (G de la repetición telomérica TTAGG) del extremo 3' de una secuencia de nucleótidos que es colocada en el l ím ite 5' de la plantilla de DNA.

Brevemente, la actividad puede ser medida por una reacción que usa una plantilla de ácido nucleico con un nucleótido 3' que está bloqueando, es decir, no puede servir como un iniciador para una polimerasa, a menos que se remueva por actividad nucleol ítica. La actividad y ensayos de unión de telómero son descritos en, por ejemplo, Harri ngton et al . , J. Biol. Chem. 270: 8893, 1 995. En general, puede usarse cualquier ensayo tal como un ensayo de desplazam iento de gel , que detecta interacciones de proteína-ácído nucleico. Los ensayos de actividad de u nión de RNA y DNTP son descritos en Morin, Eur. J. Cáncer 33:750, por ejemplo.

C. Ganancia y pérdida de función Pueden realizarse ensayos de ganancia-de-función in vivo al transfectar un vector de expresión que codifica telomerasa en células que no tiene o tiene poca actividad endógena detectable. Entonces se mide la actividad mediante un ensayo in vitro, tales como aquéllos descritos en la presente. Otro ensayo de ganancia-de-función puede realizarse en células de tumor u otras células que expresan telomerasa o transcri ptasa inversa . Un gene de telomerasa es transfectado en las células, expresado en altos niveles y estas células son tratadas con in hibidores de transcriptasa inversa. La actividad de telomerasa es observada entonces según dism inuyó la sensibi lidad a tales inhibidores. Adicionalmente, puede medirse el rescate de función en el mutante de telomerasa de levadura EST2. La pérdida de función puede medirse en células que expresan altos niveles de actividad de telomerasa, tales como, células LI M 1 21 5 u otras células de tumor. En este ensayo, se introducen moléculas de ol igonucleótidos anti-sentido en las células, generalmente en u n vector de expresión. El gene de telomerasa es verificado por actividad de telomerasa disminuida. En otro ensayo, anticuerpos para telomerasa que inhiben la función pueden usarse para demostrar una molécu la funcional .

D. Expresión de telomerasa La expresión de telomerasa en varias células pueden ensayarse mediante ensayos estándares usando las secuencias proporcionadas en la presente. Por ejemplo, puede usarse hibridación in situ con sondas radioactivas o marcadas con substancias fluorescentes (fragmentos u oligonucleótidos) en secciones de tejido o células fijas. De manera alternativa, puede aislarse RNA a partir de las células y usarse en ensayos de protección de sonda de RNasa, Northern, y similares. Las sondas para reg iones particulares y sondas que son variantes específicas generarán perfiles de expresión de los diversos transcriptos de telomerasa. En una modalidad preferida, la expresión de telomerasa es ensayada por ampl ificación. Los pares de iniciadores para telomerasa , incluyendo pares de iniciadores para variantes particulares, se usan para amplificar cDNA sintetizado a partir de RNA celular. El cDNA puede ser sintetizado a partir ya sea de RNA total o RNA poli(A) + . Son bien conocidos los métodos y protocolos para aislamiento de RNA. El cDNA puede ser in iciado por un iniciador oligo(dT) , iniciadores aleatorios (por ejem plo, d N6) , iniciador específico de telomerasa y similares. La elección de un iniciador dependerá al menos en parte de la cantidad de RNA y el propósito del ensayo. Los iniciadores de amplificación son diseñados para ampl ificar cualquiera de, combinaciones particu lares, o todas las variantes presentes en células de vertebrados. Las condiciones para la ampl ificación se eligen para ser proporcionadas con la longitud del iniciador, contenido de bases, longitud del producto amplificado y similares Varios sistemas de ampl ificación están d ispon ibles (ver Lee et al . , Nucleic Acid Amplification Technologies (Tecnolog ías de amplificación de ácidos nucleicos) , BioTechniques Books, Eaton Pu blishing , Natick, MA, 1 997 ; Larrick, The PCR Technique: Quantitative PCR (La técnica de PCR: PCR cuantitativa) , BioTechniques Books, Eaton Publishing , Natick, MA, 1 997). Otros ensayos para medir la expresión cualitativa y cuantitativamente son bien conocidos. Los análisis Northern y de protección de sonda de RNasa son tratables cuando la cantidad de m RNA de telomerasa es suficiente. Cuando están d ispon ibles m uy pocas células, es deseable un análisis de célula simple, o cuando la fracción de RNA de telomerasa en la muestra e smuy baja, se prefiere un protocolo de amplificación. La protección de sonda de RNasa, en particular, está bien adecuada para detectar variantes de empalme, mutación , así como para cuantificar estos RNAs. Como se discutió antes, en modalidades preferidas, se monitorea la expresión de las diversas especies de RNA. Las d iferentes especies pueden valorarse mediante cualquier método, el cual disting ue una de las especies sobre las otras. Así, la determinación de longitud por Northern, protección de sonda de RNasa, clonación y amplificación son algunos de los métodos disponibles. En las modalidades preferidas, se usan la protección de sonda de RNasa y am plificación. Para la protección de sonda de RNasa, la sonda generalmente será u n fragmento derivado de la unión de la secuencia de referencia y la secuencia de intrón, o derivada de la secuencia que rodea el sitio de inserción de intrón . Por ejemplo, un fragmento de la telomerasa de referencia que conecta nucleótidos 1 950- 1 951 (por ejemplo, nucleótidos 1 91 0-1 989) protegerá la secuencia de referencia como un fragmento de 71 bases, pero protegerá una telomerasa con el intrón 1 como dos frag mentos de 41 y 30 bases. En contraste, un fragmento que contiene los nucleótidos 1 91 0-1 950 y 30 bases del intrón 1 protegerá una variante de intrón 1 como un fragmento de 71 bases y la telomerasa de referencia como un fragmento de 41 bases. Los fragmentos para protección de sonda de RNasa son eleg idos usualmente en el rango de 30 a 400 bases y se colocan para producir productos de protección fácilmente d istinguibles. Otro método que puede ser usado para distinguir variantes es la am plificación . El diseño y estrategia de iniciadores de ampl ificación son descritos antes. Brevemente, se prefieren los in iciadores que amplificarán individualmente cada variante empalmada dentro o empalmada fuera. Pueden realizarse reacciones múltiples para identificar variantes con más de un caso de empalme dentro o empalme fuera. Los métodos para medir la proteína de telomerasa tam bién son úti les dentro del contexto de la presente invención . A manera de ejemplo, los anticuerpos para telomerasa pueden ser usados para manchar secciones de tej ido o células permeabilizadas. Los anticuerpos también pueden ser usados para detectar la proteína por inmunoprecipitación , Western blot y simi lares. Adicionalmente, la localización subcelular de telomerasa y variantes de telomerasa puede determinarse usando los anticuerpos descritos en la presente.

E. Anticuerpos para telomerasa Los anticuerpos para las proteínas, fragmentos o péptidos de telomerasa discutidos en la presente pueden prepararse fácilmente. Tales anticuerpos pueden reconocer específicamente la proteína de telomerasa de tipo natural y no una proteína mutante (o variante) , proteína de telomerasa mutante (o variante) y proteína de tipo no natural, o igualmente reconcer tanto la forma mutante (o variante) como la de tipo natural . Los anticuerpos pueden ser usados para aislamiento de la proteína , inhibición de la actividad (antagonista) de la proteína, o intensificación de la actividad (agonista) de la proteína. Además, los ensayos para molécu las pequeñas que interactúan con telomerasa serán facilitados por el desarrollo de anticuerpos. Dentro del contexto de la presente invención , se entiende que los anticuerpos incluyen anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos antí-idiopáticos, fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, Fab, y F(ab')2, regiones varialbes F , o regiones determinantes de complementaridad) . Los anticuerpos son aceptados generalmente como específicos contra la proteína de telomerasa si se unen con una Kd mayor q ue o igual a 1 0"7 M , de preferencia mayor que o igual a 1 0"8 M . La afinidad de un anticuerpo monoclonal o compañero de unión puede determinarse fáci lmente por alguien de habilidad ordinaria en la técnica (ver Scatchard, Ann. N. Y. Acad. Sci. 51 :660-672, 1949). Brevemente, una preparación de anticuerpo policlonal puede generarse fácilmente en una variedad de animales de sangre caliente, tales como, conejos, ratones o ratas. Normalmente, un animal es inmunizado con proteína de telomerasa o péptído de la misma, que preferiblemente se conjuga con una proteína portadora, tal como hemocianina de lapa de bocallave. Las rutas de adm inistración incluyen inyecciones intraperitoneaies, intramusculares, intraoculares o subcutáneas, usualmente en un auxiliar (por ejem plo, auxiliar com pleto o incompleto de Freund). Los antisueros policlonales particularmente preferidos demuestran la unión en un ensayo que es al menos tres veces mayor q ue el soporte. Los anticuerpos monoclonales también pueden ser generados fácilmente de líneas de células de hibridoma usando técnicas convencionales (ver las patentes estadounidenses nos. RE 32,01 1 , 4, 902 ,614, 4, 543,439 y 4,41 1 , 993; ver también Antibodies: A Laboratory Manual (Anticuerpos: un manual de laboratorio) , Harlow y Lañe (eds. ), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1 988). Brevemente, dentro de una modalidad, un sujeto animal , tal como una rata o ratón , es inyectado con telomerasa o una porción de la misma. La proteína puede ser adm in istrada como una em u lsión en un auxiliar, tal como el auxiliar completo o incompleto de Freund , con el fin de incrementar la respuesta inmune. Entre una y tres semanas después de la inmunización inicial, generalmente el animal es reforzado y puede probarse por reactividad a la proteína utilizando ensayos bien conocidos. El bazo y/o nodu los linfáticos son recolectados e inmortalizados. Pueden usarse varias técnicas de inmortalización, tales como, mediada por virus epstein-Barr o fusión para producir un hibridoma. En una modalidad preferida, la inmortalización ocurre por fusión con una l ínea de células de mieloma adecuada para crear un hibridoma que secreta el anticuerpo monoclonal. Las líneas de mieloma adecuadas incluyen, por ejemplo, NS-1 (ATCC No. TIB 18), y P3X63 - Ag 8.653 (ATCC No. CRL 1580). Los compañeros de fusión preferidos no expresan los genes de anticuerpos endógenos. Siguiendo la fusión, las células son cultivadas en un medio conteniendo un reactivo que permite selectivamente el crecimiento de células de mieloma y bazo fusionadas, tales como HAT (hípoxantina, aminopterina y timidina). Después de aproximadamente siete días, los hibridomas pueden ser clasificados por la presencia de anticuerpos que son reactivos contra una proteína de telomerasa. Puede utilizarse una amplia variedad de ensayos, incluyendo por ejemplo, inmuno-electroforesis contracorriente, radioinmunoensayos, radioinmunoprecipitaciones, ensayos inmuno-absorbentes enlazados a enzimas (ELISA), ensayos dot blot, western blots, inmunoprecipitación, ensayos de inhibición o competencia y ensayos "sandwich" (ver las patentes estadounidenses nos. 4,376,110 y 4,486,530; ver también Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y Lañe (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988). También pueden utilizarse otras técnicas para construir anticuerpos monoclonales (ver Huse et al., Science 246:1275-1281, 1989; Sastry et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:5728-5732, 1989; Alting-Mees et al., Strategies in Molecular Biology (Estrategias en biología molecular) 3:1-9, 1990; describiendo técnicas recombinantes). Brevemente, el mRNA es aislado de una población de células B y se utiliza para crear genotecas de expresión de cDNA de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera en vectores adecuados, tales como, ?lnmunoZap(H) y ?lnmunoZap(L). Estos vectores pueden ser clasificados individualmente o co-expresarse para formar anticuerpos o fragmentos Fab (ver Huse et al. , supra; Sastry et al . , supra) . Las placas positivas pueden convertirse subsecuentemente a un plásmido no l ítico que perm ite un alto nivel de expresión de fragmentos de anticuerpos monoclonales de E. coli. De manera sim ilar, porciones o fragmentos, tales como, fragmentos Fab y Fv, de anticuerpos también pueden ser construidos utilizando técnicas de DNA recombinante o digestión enzimática convencional para producir regiones variables aisladas de un anticuerpo. Dentro de una modalidad , los genes que codifican la región variable de un híbridoma produciendo un anticuerpo monoclonal de interés, son amplificados usando iniciadores de nucleótidos para la región variable. Estos iniciadores pueden ser sintetizados por alguien de habilidad ordi naria en la técnica, o pueden comprarse a partir de fuentes comercialmente disponibles (por ejemplo, Stratacyte, La Jolla, CA) . Los productos de amplificación son insertados en vectores, tales como, l mmunoZAPMR H o l m munoZAPM L (Stratacyte) , los cuales son i ntroducidos entonces en E. coli, levadura o sistemas basados en mam íferos para la expresión . Util izando estas técnicas, pueden producirse grandes cantidades de una proteína de cadena simple conteniendo una fusión de los dominios VH y VL (ver Bird et al. , Science 242: 423-426, 1 988) . Además, pueden utilizarse técnicas para cam biar un anticuerpo de "m urino" a un anticuerpo "humano" , sin alterar la especificidad de unión del anticuerpo. Una vez que se han obtenido anticuerpos adecuados, pueden aislarse o purificarse por muchas técnicas bien conocidas para aquéllos de habilidad ordinaria en la técnica (ver Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y Lañe (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1 988) . Las técnicas adecuadas incluyen colum nas de afinidad de péptidos o proteínas, HPLC o RP-HPLC, purificación en columnas de proteína a o proteína G, o cualquier combinación de estas técnicas.

F. Proteínas que interactúan con telomerasa Las proteínas que interactúan directamente con telomerasa pueden ser detectadas por un ensayo, tal como, un sistema de unión de ligadura de 2 híbridos de levadura . Brevemente, en un sistema de dos híbridos, una fusión de una proteína de dom inio de telomerasa de unión conDNA (por ejemplo, fusión de GAL4-telomerasa) es construidos y transfectado en una célula conteniendo un sitio de unión GAL4 en lazado a un gene marcador seleccionable. La proteína de telomerasa entera o su bregiones de telomerasa pueden usarse. También se construye y co-transfecta una genoteca de cDNAs fusionada al dominio de activación de GAL4. Cuando el cDNA en la fusión de dom inio de activación cDNA-GAL4 codifica una proteína q ue interactúa con telomerasa , el marcador seleccionable es expresado. Las células que contienen el cDNA se hacen crecer entonces, el constructo es aislado y caracterizado. También pueden usarse otros ensayos para identificar las proteínas de i nteracción. Tales ensayos incluyen E LISA, Western blotting, co-inm unoprecipitaciones y similares. l l l . I N H I BI DORES E I NTENSI FICADORES DE ACTIVI DAD DE TELOMERASA Los inhibidores e intensificadores cand idatos (colectivamente referidos como "efectores") pueden ser aislados o procurados a partir de una variedad defuentes, tales como, bacterias, hongos, plantas, parásitos, genotecas de qu ímicos (por ejemplo, genotecas de combinaciones) , péptidos aleatorios o similares. Los efectores también pueden ser péptidos o péptidos variantes de telomerasa, variantes de telomerasa, ácidos nucleicos antisentido, anticuerpos de telomerasa, inhibidores de la actividad promotora de telomerasa y sim ilares. Los inh ibidores e intensificadores tam bién pueden ser diseñados racionalmente, basados en la estructura de proteína determinada por cristalog rafía de rayos X (ver, Livnah et al . , Science 273:464, 1 996) . En ciertas modalidades preferidas, el inhibidor enfoca una telomerasa específica, tal como, una variante. Un inh ibidor puede actuar al prevenir la unión de telomerasa a otros componentes del complejo de ribonucleoproteína o al telómero, al provocar la d isociación de las proteínas unidas, o por otro mecan ismo. U n inhibidor puede actuar directa o indirectamente. En modalidades preferidas, los inhibidores interfieren en la un ión de la proteína de telomerasa a ya sea el RNA de telomerasa o a los telómeros. En otras modalidades preferidas, los inhibidores son moléculas pequeñas. En una modalidad muy preferida, los inhibidores provocan que una célula cese de replicar. Los inhibidores deberían tener un m ínimo de efectos laterales y preferiblemente son no tóxicos. Se prefieren inhibidores que pueden penetrar células. En otras modalidades preferidas, un efector es una proteína o péptido de telomerasa que actúa en una manera negativa dominante (ver, Ball et al. , Current Biology 6: 84, 1 996). Por ejemplo, un péptido de telomerasa que inhibe competitivamente la un ión de telomerasa a telómeros romperá el alargamiento de telómeros. Generalmente, estos péptidos tienen secuencia natural , pero las variantes pueden tener actividad i ncrementada (ver, Ball et al . , supra) . Las variantes pueden ser construidas por los métodos descritos en la presente. Otros péptidos pueden unir telomerasa e inhibir una o más de sus actividades, pero no tienen la secuencia de aminoácidos de telomerasa. Tales péptidos pueden ser identificados por los ensayos descritos en la presente. Las proteínas o péptidos tam bién pueden incrementar la actividad de telomerasa. Para una i nhibición efectiva , los inhibidores de péptidos preferiblemente son expresados a partir de vectores transfectados o infectados en células huésped , pero también pueden ser introducidos por otros medios, tales como, fusión mediada por liposomas y similares. Los vectores eucarióticos son bien conocidos y fácilmente disponibles. Los vectores incluyen plásmidos, vectores basados en virus y similares. En otra modalidad preferida, el inhibidor es una ribozima. "Ribozima" se refiere a una molécula de ácido nucleico que es capaz de cortar una secuencia de ácidos nucleicos de telomerasa. Las ribozimas pueden estar compuestas por DNA, RNA, análogos de ácidos nucleicos, o cualquier combinación de éstos (por ejemplo, h íbridos de DNA/RNA). Un "gene de ribozima" se refiere a una molécu la de ácido nucleico la cual, cuando se transcribe en RNA, produce la ribozima , y un "vector de ribozima" se refiere a u n montaje que es capaz de transcribir un gene de ribozima de interés y puede estar compuesto ya sea por DNA o RNA. Dentro de ciertas modalidades de la invención, el vector puede incluir uno o más sitios de restricción y marcadores seleccionables. Además, dependiendo de la elección del vector y célula huésped, elementos adicionales tales como, un origen de replicación, sitio de poliadenilación e intensificadores pueden ser incluidos en los vectores descritos en la presente. Como se notó antes, la presente invención también proporciona ribozimas teniendo la capacidad de inhibir la expresión del gene de telomerasa. Brevemente, puede generarse una amplia variedad de ribozimas para usarse dentro de la presente invención, incluyendo por ejemplo, ribozimas de horquilla (ver, por ejemplo, Hampel et al., Nucí. Acids Res. 18:299-304, 1990, EPO 360,257 y patente estadounidense no. 5,254,678), ribozimas de cabeza de martillo (ver, por ejemplo, Rossi, J.J. et al., Pharmac. Ther. 50:245-254, 1991; Forster y Symons, Cell 48:211-220, 1987; Haseloff y Gerlach, Nature 328:596-600, 1988; Walbot y Brueníng, Nature 334:196, 1988; Haseloff y Gerlach, Nature 334:585, 1988; Haseloff et al., patente estadounidense no. 5,254,678), ribozimas de virus delta de hepatitis (ver, por ejemplo, Perrotta y Been, Biochem. 31:16, 1992), ribozimas de intrón grupo I, tales como aquéllas basadas en el RNA ribosomal de Tetrahymena (ver, por ejemplo, Cech et al., patente estadounidense no. 4,987,071), ríbozimas P de RNasa (ver, por ejemplo, Takada et al., Cell 35:849, 1983); así como una variedad de otras estructuras de ácidos nucleicos con la capacidad de cortar una secuencia objetivo deseada o seleccionada (ver, por ejemplo, WO 95/29241 y WO 95/31551). Dentro de ciertas modalidades de la invención, las ribozimas pueden ser alteradas de su estructura tradicional con el fin de incluir tetrarizos u otras estructuras que aumenten la estabilidad (ver, por ejemplo, Anderson et al., Nucí. Acids Res. 22:1096-1100, 1994; Cheong et al., nature 346:680-682, 1990) o las cuales hacen a la ribozima resistente a actividad de endonucleasa o RNasa (ver, por ejemplo, Rossi et al., Pharmac. Ther. 50:245-254, 1991) Dentro de una modalidad de la invención, se proporcionan ribozimas de horquillas y cabezas demartillo con la capacidad de cortar secuencias de ácidos nucleicos de telomerasa. Brevmente, las ribozimas de horquilla son generadas de manera que reconocen la secuencia objetivo N3XN*GUC(N>6), en donde N es G, U, C o A, X es G, C o U, y * es el sitio de corte. De manera similar, las ribozimas de cabeza de martillo son generadas de manera que reconocen la secuencia NUX, en donde N es G, U, C o A. Los nucleótidos adicionales de la ribozima de cabeza de martillo o ribozima de horquilla son determinados por los nucleótidos flanqueantes objetivo y la secuencia de consenso de cabeza de martillo (ver Ruffner et al, Biochemistry 29:10695-10702, 1990). La preparación y uso de ciertas ribozimas es descrita en Cech et al. (patente estadounidense no. 4,987,071). Las ribozimas son expresadas, de preferencia desde un vector introducido en las células huésped. Las ribozimas de la presente invención, así como DNA que codifica tales ribozimas pueden generarse fácilmente utilizando protocolos publicados (por ejemplo, Promega, Madison Wis., Heidenreich et al., J. FASEB 70:90-6, 1993; Sproat, Curr. Opin. Biotechnol. 4:20-28, 1993). De manera alternativa, las ribozimas pueden ser generadas a partir de una molécula de DNA o cDNA, la cual codifica una ribozima y la cual está operablemente enlazada a un promotor de polimerasa de RNA (por ejem plo, SP6 o T7). Una ribozima de RNA es generada sobre la transcripción de la molécula de DNA o cDNA. En otras modalidades preferidas, los inhibidores d isminuyen la actividad promotora de la telomerasa . U n promotor eucariótico comprende secuencias un idas por polimerasa de RNA y otras proteínas participantes en el control de la unidad de transcripción. La transcripción de telomerasaparece estar altamente regulada; la proteína es expresada principalmente en cél ulas de base, em briónicas y de cáncer, y se expresa en niveles m ucho menores, si acaso, en la mayoría de las células somáticas. Así, el promotor es un objetivo potencial para inhibidores. Los inhibidores pueden romper o evitar la un ión de uno o más de los factores q ue controlan la transcripción de I telomerasa, provocando que la transcripción disminuya o cese. Los niveles de transcripción necesitan caer solo a un nivel suficientemente bajo si al menos un telómero se vuelve ausente. Otro inhibidor de la presente invención es DNA o RNA antisentido para una secuencia q ue codifica o no codifica telomerasa. Se ha mostrado que ácidos nucleicos antisentido dirigidos a una molécula de mRNA particular inhiben la expresión de proteína de la proteína cod ificada. Basados en las secuencias de telomerasa presentadas aqu í, se diseña una secuencia antisentido y de preferencia se inserta en un vector adecuado para transfección en células huésped y expresión del antisentido. El antisentido puede unirse a cualquier parte de hTI RNA. En ciertas modalidades, el antisentido es diseñado para unirse específicamente a una o más variantes. Unión específica significa que bajo ciertas condiciones fisiológicas, el antisentido se une a RNAs que tienen la secuencia complementaria, pero no a otros RNAs. Debido a que los RNAs de telomerasa que contienen cualquier secuencia de intrón particular puede ser un grupo heterogéneo de variantes debido a la clasificación independiente de variantes de empalme, más de una especie de RNA puede unirse e ¡nactivarse. Los polinucleótidos antisentido en la presente son al menos de 7 nucleótidos de longitud y generalmente no mayores que 100 a 200 bases, y más normalmente son al menos 10 a 50 bases de largo Las consideraciones para diseño de moléculas antisentido y medios para la introducción en células se encuentran en las patentes estadounidenses nos. 5,681,747; 5,734,033; 5,767,102; 5,756,476; 5,749,847; 5,747,470; 5,744,362; 5,716,846). Además, son deseables los intensificadores de actividad o expresión de telomerasa en ciertas circunstancias. A veces, incrementar el potencial de proliferación de las células tendrá un efecto terapéutico. Por ejemplo, la regeración de órganos o diferenciación de lesiones o enfermedades, crecimiento de células nerviosas o células cerebrales siguiendo lesiones, proliferación de células de base hematopoyéticas usadas en transplantes de médula ósea u otras células de base de órganos y similares, puede ser limitante y de esta manera beneficiarse de un intensificador de telomerasa. Los intensificadores pueden estabilizar la proteína endógena, aumentar la transcripción o traslación o actuar a través de otros mecanismos. Como es evidente para alguien de habilidad en la técnica, muchas de las líneas guía presentadas antes se aplican también al diseño de intensificadores.

Los ensayos de clasificación para inhibidores e i ntensificadores variará de acuerdo al tipo de inhibidor y naturaleza de la actividad que está siendo inhibida. Los ensayos incluyen el ensayo o variación TRAP, un ensayo de polimerasa basado en no amplificación , dos h íbridos de levadura , liberación de represión el levadura transfectada con una telomerasa de vertebrado, y similares. Para compuestos de clasificación que interactúen con el promotor para telomerasa, es conveniente un ensayo conducido por un gene reportador.

IV. USOS PARA TELOMERASA La secuencia de nucleótidos para telomerasa y proteína de telomerasa se usa en una variedad de contextos en esta invención . En modalidades preferidas, las composiciones de la presente invención se usan ya sea como reactivos de diagnóstico o como terapéuticos.

A. Diagnóstico La expresión de m RNA codificando telomerasa y/o prote ína puede usarse para la detección de células que se dividen , especialmente célu las de tumor y células de base. Los métodos de detección incluyen manchado de anticuerpo o compuestos de unión de telomerasa con marbete para la detección de proteína , hibridación de ácidos nucleicos in situ para m RNA, hibridación en "hojuelas" de DNA, análisis Nothern, protección de sonda de RNasa , amplificación por PCR u otro método, amplificación med iada con ligasa y sim ilares. Adicionamente, la expresión de variantes de empalme de RNA puede ensayarse convenientemente por amplificación , protección de sonda de RNasa, otros métodos descritos y similares. En particular, los iniciadores de oligonucleótidos que rodean el sitio de variantes de em palme frecuente, tales como los iniciadores descritos en la presente (por ejemplo, Htel I ntron T y HT 248R) pueden ser usados para detectar varia ntes de empalme en varios tipos de célu las. Como se muestra en los ejemplos, varios tipos de células de tumores exh iben variacionees de empalme de RNA diferentes. Puede determinarse la correlación del patrón de variantes de em palme con estapa de tumor, metástasis potencial y similares. Como tales, los ensayos para las variantes particulares pueden ser usados como un diagnóstico. Las células con actividad de telomerasa incrementada, tales como células de cáncer o células híperprliferativas, pueden identificarse al ensayar cualitativa o cuantitativamente por cualquiera de los ensayos descritos en la presente. Normalmente, la actividad o expresión de telomerasa será comparada entre células sospechosas y células de contraparte normal del mismo o diferente ind ividuo. La actividad incrementada indicativa de una proliferación de tumor o excesisva es establecida por comparación directa o al detectar actividad en células que se sabe que de otra manera está ausente en la actividad o expresión de telomerasa. Adeás, mon itorear la progresión de cáncer o respuesta a la terapia puede realizarse usando los ensayos descritos en la presente y comparar la actividad o expresión sobre el curso del tiem po. La variante detectada en una l ínea de células ALT, la cual expresa telomerasa, sugiere que el dom in io básico de hT1 puede contribuir al mecanismo ALT en al menos algunas de las líneas de células ALT. Un posible mecanismo de ALT podría involucrar componentes de telomerasa disregulados que están inactivos en el ensayo TRAP. Así, la identificación de las variantes pueden ser útiles para la siguiente tumorigénesis. El empalme de m RNA alternativo es un mecanismo común para regular la expresión de genes en eucariotes superiores y existen muchos ejem plos de alteraciones específicas de tejido, específicas de desarrollo y específicas de sexo en casos de empalme. De manera importante, 1 5% de las mutaciones enlazadas a estados de enfermedad en mam íferos afectan los patrones de empalme (Horowitz y Krainer Trends Genet. 1 0, 1 00- 1 06, 1 994) . Los cambios en fisiolog ía cel ular también puede ind ucir patrones de empalme alterados. En realidad, se ha sugerido que la tumorigénesis por sí misma intensifica la expresión de variantes empalmadas de mRNA al comprometer los mecanismos de empalme alternativos. Aunque otras variantes hT1 empalmadas alternativamente menores, novedosas, pueden jugar un papel en el desarrollo de tumor, los niveles de expresión relativos alterados de los transcriptos principales encontrados en varios tumores comparados con células normales, y en l íneas de células post-crisis comparadas con células pre-crisis de conexión de vida limitada, probablemente juegan un papel mayor en el establecim iento y progresión de cánceres. Además, la existencia de las variantes empalmadas alternativas de hT1 que se ven tanto en cripta colón ica y testes, así como l íneas de células de tumor, sugiere la regulación compleja de este gene en el desarrollo normal . La expresión de los productos de hT1 mayores es encontrada en la mayoría de los tumores y en todas las l íneas de células inmortalizadas de telomerasa positiva. El control de transcripción de hT1 puede, en consecuencia, ser un aspecto principal de la regulación de actividad de la telomerasa, además de otras funciones. Por ejemplo, la telomerasa puede estar invol ucrada en la curación de las rupturas del cromosoma, además de su papel para mantenerla longitud del telómero en la l ínea de germen . La composición de telomerasa puede variar de acuerdo a estos papeles funcionales. En consecuencia, las secuencias de intrones pueden ser especialmente útiles para aplicaciones de diagnóstico. Por ejemplo, la detección e identificación de enfermedades, tales como cáncer, envejecim iento, curación de heridas, regeneración neuronal, células regenerativas (por ejem plo, células de base) , pueden ser importantes prelud ios para determinar la terapia efectiva. A este respecto, la detección de la curación de heridas puede facilitar el desarrollo e identificación de u n compuesto mejorador. Actualmente, los ensayos de curación de heridas son costosos y lentos, mientras que una amplificación o ensayo basado en hibridación sería rápido y efectivo en cuanto a costo. En cualq uiera de estas aplicaciones, la detección puede ser cuantitativa o cualitativa. En un ensayo cualitativo, una par de i niciadores de am pl ificación particular o sonda de hibridación para una de las secuencias variantes (por ejem plo, ¡ntrones que son em palmados variablemente) pueden usarse para detectar la presencia o ausencia de la secuencia variante. Las sondas útiles en el contexto de la presente invención incluyen moléculas de ácidos nucleicos que hibridan a las secuencias presentadas en la Figura 1 0 o a sus com plementos. Las sondas para hibridación generalmente son al menos de 24 bases, pero pueden variar desde 1 2 hasta la secuencia de longitud completa. Las sondas pueden comprender una secuencia adicional que no híbrida a DNA o RNA de hT1 . Las sondas generalmente son DNA, pero pueden ser RNA, PNA o derivados de los mismos. Las condiciones de hibridación serán elegidas de manera apropiada por la longitud de la sonda y método de hibridación (por ejemplo, en soporte de nylon, en hojuela basada en silicio) . Las condiciones son bien conocidas en la técnica. Una de las secuencias en la figura 1 0 es una secuencia genómica , no encontrada en m RNA de telomerasa . U na sonda derivada de esta secuencia puede ser usada para detectar DNA genóm ico en preparaciones de RNA y reacciones de am plificación . Las sondas de hibridación pueden ser marcadas con una radiomarca, marca quimíoluminiscente o cualquiera de las otras inn umerables marcas conocidas. La hibridación puede realizarse en preparaciones de mRNA, preparaciones de cDNA, fijarse en un soporte sólido, en solución , o tej idos in situ y similares. U n tipo de análisis de hibridación es templar a oligonucleótidos inmovil izados en un substrato solido, tal como, una hojuela de silicio o portaobjetos de vidrio funcionalizado. Tales hojuelas pueden ser procuradas comercialmente o hechas de acuerdo a los métodos y procedimientos expuestos en , por ejemplo, PCT/US94/1 2282; patente estadounidense no. 5,405, 783; patente estadounidense no. 5,41 2,087 ; patente estadounidense no. 5,424, 1 86; patente estadounidense no. 5,436, 327; patente estadounidense no. 5,429, 807; patente estadounidense no. 5, 51 0,270; WO 95/35505; patente estadounidense no. 5,474 , 796. Los oligonucleótidos generalmente se arreglan en una forma de arreglo, de manera que la posición de cada secuencia de oligonucleótido puede ser determ inada . Para los ensayos de ampl ificación , son deseables los pares de iniciadores q ue ya sea flanquean los intrones o requieren la presencia del intrón para la amplificación . Muchos de tales pares de iniciadores se describen en la presente. Otros pueden diseñarse a partir de las secuencias presentadas aqu í. De manera general, los pares de iniciadores son diseñados para perm itir solo la amplificación de un intrón simple, sin embargo, en algunas circunstancias, puede preferirse la detección de m últiples intrones en la misma preparación de RNA. Otros ensayos diagnósticos, tales como, hibridación in situ , protección de RNasa y similares, puede usarse de manera alternativa o además de los ensayos discutidos antes. Los principios q ue gu ían estos ensayos son proporcionados por la presente invención , mientras que las técnicas son bien conocidas. Los ratones transgénícos y ratones que son todos mutantes nulos (por ejemplo, "ratones de knockout") pueden construirse para facilitar la prueba de inhibidores candidatos. El gene de telomerasa está preferiblemente bajo control de un promotor específico de tejido para constructos de vectores de ratones transgénicos. Los ratones q ue sobre-expresan telomerasa pueden ser usados como un sistema modelo para probar los inhibidores. En estos ratones, se espera que las células que sobre-expresan telomerasa proliferen continuamente. La administración de inhibidores candidatos es seguida por observación y medición del crecim iento celular. Los inhibidores que retardan o disminuyen el crecimiento son agentes terapéuticos candidatos. La telomerasa también puede ser transfectada en célu las para inmortalizar varios tipos de células. La inmortalizacíón transiente puede log rarse por transfección no estable de un vector de expresión conteniendo telomerasa. De manera alternativa , la proliferación de transformantes estables de gene de telomerasa bajo control de un promotor inducíble puede encenderse y apagarse por la adición y ausencia del i nductor. De manera sim ilar, la presencia y ausencia de un inhibidor de actividad de telomerasa puede usarse para inmortalizar células selectivamente. La expresión de parte o toda la proteína en levadura puede actuar como un negativo dominante, ya que muchas proteínas humanas pueden ¡nteractuar con componentes de un complejo en levadura, pero lo hacen de manera imperfecta y en consecuencia improductivamente. Como tales, estos genes actúan como negativos dom inantes. Así, la levadura eventualmente envejecerá . Tales células pueden ser usadas en clasificaciones para medicamentos inh ibitorios, los cuales permitirán el crecimiento de levadura pasado el tiempo de senescencia. La proteína de telomerasa purificada, proteína variante de referencia o fragmentos, pueden usarse en ensayos para clasificar med icamentos inhibitorios. Estos ensayos normalmente serán realizados in vitro y utlizarán cualq uiera de los métodos descritos antes o que son conocidos en la técn ica. La proteína también puede ser cristalizada y sometida a análisis de rayos X para determinar su estructura tridimensional .

B. Terapéuticos Las composiciones y métodos descritos en la presente también pueden ser usados como terapéuticos en el tratamiento de enfermedades y desórdenes para efectuar cualquiera de las actividades de telomerasa en una célula. Tratamiento significa cualquier mejora de la enfermedad o desorden, tal como, aliviar los síntomas de la enfermedad o desorden, reducción de masa celular de tumores y similares. Por ejemplo, inhibidores de actividad enzimática pueden ser usados para restringir la proliferación de células. M uchas de las enfermedades y desórdenes están estrechamente asociados con la proliferación y potencial proliferativo. Una de las enfermedades más evidentes q ue involucran la proliferación no deseada es el cáncer. Los métodos y composiciones descritos en la presente pueden usarse para tratar cánceres, tales como melanomas, otros cánceres de piel , neuroblastomas, carcinomas de pecho, carcinomas de colon , leucem ias, linfomas, osteosarcomas y similares. Otras enfermedadesy desórdenes receptivos de tratamiento dentro del contexto de la presente invención incluyen aquéllos de proliferación excesiva de células (proporción de proliferación incrementada sobre células de contraparte normal del mismo o diferente individuo) , tales como h iperplasias de células de m úsculo suave, crecimientos de piel y sim ilares. Todavía otras enfermedades y desórdenes se beneficiarían de la actividad de telomerasa incrementada. Los intensificadores de telomerasa pueden ser usados para estimular la proliferación de células de base y posiblemente diferenciación.

Como tal , la expansión de las células de base hematopoyéticas podría ser administrada en el contexto de transplante de médula ósea. Además, muchos tejidos tienen células de base. La proliferación de estas células puede ser benéfica para curación de heridas, crecimiento de cabello, tratamiento de enfermedades, tales como, tumor de Wílm y sim ilares. Ciertos de los inhibidores o intensificadores pueden ser administrados a manera de un vector de expresión. Muchas técnicas para la introducción de ácidos nucleicos en célu las son conocidos. Tales métodos incluyen vectores retrovirales e infección de retrovirus subsecuente, adenovirales o vectores virales adeno-asociados y subsecuente infección, complejos de ácido nucleico con un agente de condensación (por ejem plo, polí-lisina) , estos com plejos o vectores virales pueden ser enfocados a tipos de células particulares por medio de un ligando incorporado. Muchos ligandos específicos para células de tumor y otras células son bien conocidos en la técnica. Como se notó antes, dentro de ciertos aspectos de la presente invención , los ácidos nucleicos que codifican ribozimas, antisentido, telomerasas negativas dom inantes, porciones de telomerasa y similares, pueden ser utilizados para inhibir la actividad de telomerasa al introducir un gene funcional a una célula de interés. Esto puede lograrse ya sea al entregar un gene sintetizado a la célula o mediante entrega de DNA o cDNA capaz de transcribir in vivo el producto del gene. De manera más específica, con el fin de elaborar productos in vivo, una secuencia de ácido nucleico que codifica el producto es colocada bajo el control de un promotor eucariótico (por ejemplo, un promotor pol l l l , promotor CMV o SV40). Donde se desea controlar de manera más específica la transcripción, el gene puede ser colocado bajo el control de un promotor específico de célula o tejido (por ejemplo, para enfocar células en el hígado) o un promotor inducible. Una amplia variedad de vectores puede ser utilizada dentro del contexto de la presente invención, incluyendo, por ejemplo, plásmidos, virus, retrotransposons y cósmidos. Ejemplos representativos incluyen vectores adenovirales (por ejemplo, WO 94/26914, WO 93/9191; Yei et al., Gene Therapy 1:192-200, 1994; Kolls et al., PNAS 91 (1 ):215-219, 1994; Kass-Eisler et al, PNAS 90(24):11498-502, 1993; Guzman et al., Circulation 88(6): 2838-48, 1993; Guzman et al., Cir. Res. 73(6): 1202-1207, 1993; Zabner et al., Cell 75(2):207-216, 1993; Li et al., Hum Gene Ther. 4(4):403-409, 1993; Caillaud et al., Eur. J. Neurosci. 5(10):1287-1291, 1993), vectores adeno-asociados tipo 1 ("AAV-1") o adeno-asociados tipo 2 ("AAV-2") (ver WO 95/13365; Flotte et al., PNAS 90(22):10613-10617, 1993), vectores de hepatitis delta, virus delta atenuados, vivos, y vectores virales de herpes (por ejemplo, patente estadounidense no. 5,288,641), así como vectores los cuales son descritos dentro de la patente estadounidense no. 5,166,320. Otros vectores representativos incluyen vectores retrovirales (por ejemplo, EP 0 415 731; WO 90/07936; WO 93/11230; WO 93/10218. Para métodos y otras composiciones, ver las patentes estadounidenses nos. 5,756,264; 5,741,486; 5,733,761; 5,707,618; 5,702,618; 5,702,384; 5,656,465; 5,547,932; 5,529,774; 5,672,510; 5,399,346 y 5,712,378).

Dentro de ciertos aspectos de la invención, las moléculas de ácidos nucleicos pueden ser introducidas en una célula huésped utilizando un vehículo o por varios métodos físicos. Ejemplos representativos de tales métodos incluyen transformación usando precipitación de fosfato de calcio (Dubensky et al., PNAS 81:7529-7533, 1984), microinyección directa de tales moléculas de ácidos nucleicos en células objetivo intactas (Acsadi et al., nature 352:815-818, 1991) y electroporación por la cual las células suspendidas en una solución conductora son sometidas a un campo eléctrico intenso con el fin de polarizar transientemente la membrana, permitiendo la entrada de las moléculas de ácido nucleico. Otros procedimientos incluyen el uso de moléculas de ácidos nucleicos enlazadas a adenovirus inactivos (Cotton et al., PNS 89:6094, 1990), lipofección (Felgner et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:7413-7417, 1989), bombardeo de microproyectiles (Williams et al., PNAS 88:2726-2730, 1991), compuestos de policación, tales como, polilisina, ligandos específicos de receptor, liposomas que atrapan las moléculas de ácidos nucleicos, fusión de esferoplasto por el cual E. coli conteniendo las moléculas de ácidos nucleicos son desmontadas de sus paredes celulares exteriores y fusionadas a células animales usando polietilenglicol, transducción viral, (Cline et al., Pharmac. Ther. 29:69, 1985; y Friedmann et al., Science 244:1275, 1989) y ligando de DNA (Wu et al., J. of Biol. Chem. 264:16985-16987, 1989), así como virus inactivados con psoralen, tales como Sendai o Adenovirus. En una modalidad, la molécula de ácido nucleico es introducida en la célula huésped usando un líposoma. ^&- : La administración de efectores generalmente seguirá protocolos establecidos. Los compuestos de la presente invención pueden ser administrados ya sea solos o como una composición farmacéutica. Brevemente, las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden com prender u no o más de los inhibidores o intensificadores como se describieron en la presente, en combinación con uno o más portadores, diluyentes o excipientes farmacéutica o fisiológicamente aceptables. Tales composiciones pueden comprender amortigaudores, tales como, solución salina amortiguada neutral , solución salina amortiguada con fosfato y sim ilares, carbohidratos, tales como, glucosa, mañosa , sacarosa o dextranos, mannitol, proteínas, polipéptidos o aminácidos, tales como, glicina, antíoxidantes, agentes quelantes, tales como EDTA o glutationa, auxil iares (por ejemplo, hidróxido de aluminio) y conservadores. Además, las com posiciones farmacéuticas de la presente invención también pueden contener uno o más ing redientes activos adicionales. Pueden acoplarse además efectores con una porción enfocadora que une un receptor de superficie celular específica a las células en proliferación . Pueden form ularse composiciones de la presente invención para la manera de administración indicada, incluyendo, por ejemplo, administración oral, nsal, venosa, intracranial, i ntraperitoneal, subcutánea o intramuscular. Dentro de otras modalidades de la invención , las com posiciones descritas en la presente pueden ser adm inistradas como parte de un implante de l iberación sosten ida . Todavía dentro de otras modalidades, las composiciones de la presente invención pueden formularse como un liofilizado, utilizando excipientes apropiados, los -¿?íí , . cuales proporcionan estabilidad como un liofilizado y subsecuente a rehidratación . Como se notó antes, también se proporcionan composiciones farmacéuticas por esta invención. Estas composiciones contienen cualquiera de las ribozimas, moléculas de DNA, proteínas, q u ímicos, vectores o células huésped antes mencionados o portadores, excipientes o diluyente fisiológicamente aceptables. De manera general, tales portadores no deberían ser tóxidos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas. De manera ordinaria, la preparación de tales composiciones acarrea combinar el agente terapéutico con amortiguadores, antioxidantes, tales como, ácido ascórbído, polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 1 0 residuos), proteínas, am inoácidos, carbohidratos incluyendo glucosa , sacarosa o dextrinas, agentes quelantes tales como EDTA, glutationa y otros estabilizantes y excipientes. La solución salina amortig uada neutral o solución salina mezclada con albúmina de suero no específico son ejemplos de diluyentes apropiados. Además, las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden prepararse como medicamentos para la administración por una variedad de diferentes rutas, incluyendo, por ejemplo, de manera intraarticular, intracranial , intradérm ica, intrahepática, intram uscular, intraocular, intraperitoneal , intrahecal, intravenosa , subcutánes o i ncluso directamente en un tumor. Además, las composiciones farmacéutics de la presente invención pueden colocarse dentro de receptores, junto con mateiral de empaque, el cual proporciona instrucciones con respecto al uso de tales composiciones farmacéuticas. De manera general, tales instrucciones incluirán una expresión tangible describiendo la concentración de reactivo, así como dentro de ciertas modalidades, cantidades relativas de ingredientes excipientes o diluyentes (por ejemplo, agua, solución salina o PBS), que pueden ser necesarias para reconstituir la composición farmacéutica. Las composiciones farmacéuticas son útiles tanto para fines terapéuticos como diagnósticos. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden ser administradas en una manera apropiada para la enfermedad a ser tratada (o prevenida). La cantidad y frecuencia de administración será determinada por factores tales como la condición del paciente y el tipo y severidad de la enfermedad del paciente. Las dosificaciones pueden ser determinadas de manera más precisa durante pruebas clínicas. Los pacientes pueden ser monitoreados para efectivadad terapéutica mediante tecnología apropiada, incluyendo signos de exacerbación clínica, imagenología y similares. Los siguientes ejemplos son ofrecidos a manera de ilustración y no a manera de limitación.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 IDENTIFICACIÓN Y AISLAMIENTO DEL GENE DE TELOMERASA HUMANA Un gene de telomerasa humana es identificado en una genoteca de cDNA construida a partir de una línea de células de cáncer. El cDNA es sometido a análisis de secuencia de DNA (Kil ian et al. , su pra) . Una secuencia EST, GenBank Acceso No. AA281296, es identificada como secuencia de gene de telomerasa parcial por una búsqueda BLAST contra la secuencia de telomerasa de Euplotes, GenBank Acceso No. U95964 (p=3.2 x 1 0"6) . La ¡dentidiad de secuencia de am inoácidos entre las dos secuencias es aproximadamente 38% y la sim ilitud de secuencia de am inoácidos es aproximadamente 60% . Para obtener clones más grandes de hT1 , un número de genotecas de cDNA preparadas a partir de células de tumor se clasifican por ampl ificación usando iniciadores desde dentro de la secuencia EST. Los iniciadores HT1 553F y HT1 920R, basados en la secuencia EST, se usan para amplificar un fragmento de aproximadamente 350 bp en una variedad de genotecas de cDNA. La reacción de amplificación se real iza bajo condiciones de "inicio caliente" . Los ciclos de amplificación son de 4 min a 95°C; 1 min a 80°C, 30 cíelos de 30 s a 94°C, 30 s a 55°C, 1 min a 72°C; y 5 min a 72°C. Un producto amplificado del tamaño esperado (-350 bp) es detectado solo en 3 de las 1 2 genotecas clasificadas. N ing ún fragmento es detectable en una genoteca de cDNA de testes, genotecas de células somáticas y una variedad de genotecas de cDNA de células de cáncer. Sin em bargo, un frag mento de 350 bp abundante es detectado en u na genoteca de cDNA a partir de células LI M 1 21 5, una línea de célu las de cáncer de colon . En esta genoteca, y en varias más, se am plificó un fragmento adicional de alrededor de 1 70 bp.

Se sig uieron dos aproximaciones para obtener clones más largos a partir de la genoteca LI M 1 21 5: placas de clasificación con una sonda EST 32P-marcada y amplificación en DNA de genoteca. Una placa positiva simple, designada 53.2 , con una inserción de 1 .9 kb es obtenida por hibridación de la genoteca con la sonda EST. El anál isis de secuencia de DNA de este clon demuestra que se extiende tanto en 5' como 3' de la secuencia EST, pero no contiene un marco de lectura abierto simple (ORF) . Un fragmento obtenido del análisis de amplificación de la genoteca es sim ilar en secuencia al fragmento 53.2, pero también contiene dos secuencias adicionales de 36 bp y >300 bp. Ambas inserciones dem uestran las características de secuencias aceptoras y donadoras de empalme en sus l ím ites con relación a la secuencia 53.2 y pueden representar intrones no empalmados. La amplificación usando iniciadores T7 y HT1 553F, produce un fragmento de aproximadamente 1 .6 kb; y usando los iniciadores T3 y HT1 893R, produce un fragmento de aproximadamente 0.7 kb. Cada uno de estos fragmentos soporta la amplificación de un fragmento de 320 bp usando los iniciadores HTEL1 553F y HT1 893R. Clones más largos también pueden ser obtenidos por amplificación de muestras de m RNA. La PCR de transcri ptasa inversa (RT-PCR) en mRNA de LI M 1 21 5 identifica un número de productos de PCR adicionales, icluyendo uno con una inserción de 1 82 bp relativa a 53.2 que resulta en un marco de lectura abierto simple (ORF) . cDNA es sintetizado a partir de los RNAs aislados de tejidos normales y de tumor. Se realiza RT-PCR seguida por amplificación anidada usando el sistema de RT-PCR Titán (Boehringer-Mannheim) . Las condiciones de am plificación son como sigue: 95°C durante 2 min , dos ciclos de 94°C durante 30 s, 65°C durante 30 s y 68°C durante 3 min , 2 cíelos de 94°C durante 30 s, 63°C durante 30 s, 68°C durane 3 min, 34 ciclos de 94°C durante 30 s, 60°C durante 30 s y 68°C durante 3 mín. Los productos de RT-PCR son diluidos 100 veces, y se usa 1 µl para amplificación an idada usando polimerasa Taq con amortiguador Q (Qiagen). Las condiciones de amplificación son como antes, excepto que el paso final es de 14 ciclos. Para tejidos normales y tumores, los productos de amplificación se resuelven por electroforesis en 1 .5% gel de agarosa , se transfieren a la mem brana Zetaprobe y son sondeados con el oligonucleótido radiomarcado HT1691 F. La secuencia de DNA también se extiende en 5' y 3' usando una combinación de cRACE y 3' RACE, respectivamente, en m RNA de LI M 121 5 para dar un fragmento de 3871 bp designado hT1 (Figura 1 ). Se realizan dos vueltas de cRACE para extender la secuencia de hT1 y mapear el sitio de iniciación de transcripción . Se usan 500 ng de RNA poliA+ de LI M 1 21 5 como la plantilla. La síntesis de cDNA de primer filamento es iniciada usando el iniciador HT1 576R. La primera vuelta de am plificación en el producto de ligación (usando el sistema XL-PCR) emplea los iniciadores HT1 1 57R y HT1 262F. Los productos de amplificación son purificados usando columnas Qiagen , y son amplifiedos adícionalmente usando los iniciadores HT1 1 14R y HT1 553F. Una banda de 1 .4 kb resultante es sometida a análisis de secuencia de DNA y un nuevo conjunto de iniciadores son diseñados basados en esta secuencia. Para la segunda vuelta de cRACE, el cDNA de primer filamento es iniciado con el iniciador HT220R. La primera vuelta de amplificación utiliza los iniciadores HT0142R y HT0141 F. Los productos son purificados como antes y amplificados usando los iniciadores HT0093 y HT01 63F. Un producto de 1 00 bp es observado y sometido a análisis de secuencia en dos experimentos independienes para definir el extremo 5' del transcripto hT1 . El extremo 5' del transcripto también es obtenido por am pl ificación usando el iniciador HtelfulcodT 5'-AGGAGATCTCGCGATGCCGCGCGCTC-3' y HtelFulcodB 5'-TCCACGCGTCCTGCCCGGGTG-3' en RNA de LI M 1 21 5. El producto amplificado resultante fue digerido con M lu I y Bgl I I y se ligó a la secuencia de cDNA de telomerasa restante. La mayoría de secuencias 3' del transcripto son obten idas por dos vueltas de amplificación (sistema XL-PCR) usando EBHT1 8 en ambas vueltas como el iniciador inverso, y HT2761 F y HT31 14F como los iniciadores hacia delante en las vueltas primera y segunda, respectivamente. El tamaño de hT1 concuerda bien con el tamaño estimado del Northern blot (ver más adelante) para las especies de RNA más abundantes en RNA de LI M 1 21 5. Aproximadamente 3.9 kb de secuencia de DNA se presenta en la Figura 1 . La secuencia encontrada en EST está ubicada a partir de los nucleótidos 1 624-2012. La secuencia de aminoácidos predicha del marco de lectura abierto más largo también se presenta en la Figura 1 . Como se presentó, la proteína es de 1 1 32 aminoácidos.

Tabla 2 Nombre Oligo secuencia HT0028F 5' - GCTGGTGCAGCGCGGGGACC HT 5*Met 5' - CACAAGCTTGAATTCACATCTCACCATGAAGGAGCTGGTGGCCCGAGT HT0093R 5' - GG?CGCACACCAGGCACTG HT0141F 5' - CCTGCCTGAAGGAGCTGGTG HT0142R 5' - GGACACCTGGCGGAAGGAG >« > ü>*' HT0163F 5' - CCGAGTGCTGCAGAGGCTGT - A '- * HT0220R 5' - GAAGCCGAAGGCCAGCACGTTCTT VpA HT1262F 5' - GTGCAGCTGCTCCGCCAGCACA > AA • ''»-' HT1114R 5* - GTTCCCAAGCAGCTCCAGAAACAG ->• , ' 3'- HT1157R 5' - GGCAGTGCGTCTTGAGGAGCA , . • HT1553F 5' - CAl GGCTGATGAGTGTGTAC HT1576R 5' - GACGTACACACTCATCAGCCAG "• HT1590F 5' - GGTCTTTCTTTTATGTCACGGAG *- HT1691F 5' - CACTTGAAGAGGGTGCAGCT HT1875F 5' - GTCTCACCTCGAGGGTGAAG HT1893R 5' - TTCACCCTCGAGGTGAGACGCT HT1920R 5' - TCGTAGTTGAGCACGCTGAAC HT2026F 5' - GCCTGAGCTGTACTTTGTCAA HT 2028F 5' - CTi lAGCTGTACTTTGTCAAGGACA HT2230F 5' - GTACATGCGACAGTTCGTGGCTCA HT2356R 5' - CATGAAGCGTAGGAAGACGTCGAAGA HT2482R 5' - CGCAAACAGCTTGTTCTCCATGTC HT2761F 5' - CTATGCCCGGACCTCCATCAGA HT2781R 5' - CTGATGGAGGTCCGGGCATAG HT3114F 5' - CCTCCGAGGCCGTGCAGT HT3292B 5' - CACCTCAAGCTTTCTAGATCAGTCCAGGATGGTCTTGAAGTCA HT3689R 5' - GGAAGGCAAAGGAGGGCAGGGCGA EBHT18 5' - CACGAATTCGGATCCAAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTT HT-RNA-F 5' - GGGTTGCGGAGGGTGGGC HT-RNA451R 5' - GCAGTGGTGAGCCGAGTCCTG HT-RNA598 5 ' - CGACTTTGGAGGTGCCTTCA HTel 5'T 5' GCTGGTGCAGCGCGGGGACC HTel979T 5' GAGGTGCAGAGCGACTACTCCA HTell335T 5' GTCTCACCTCGAGGGTGAAG HTel71T 5' GGCTGCTCCTGCGTTTGGTGGA HTel21B(Top)5' GCCAGAGATGGAGCCACCC ^ -, HTel21TBct) 5* GGGTGGCTCCATCTCTGGC . ,; HTel-7B 5' CCGCACGCTCATCTTCCACGT HTel+256B 5' GCTTGGGGATGAAGCGGTC HtelIntronT 5" CGCCTGAGCTGTACTTTGTCA Htel 3'CODB 5" CACCTCAAGCTTTCTAGATCAGCTAGCGGCCCAGCCCAACTCCCCT Htel 1210B 5* GCAGCACACATGCGTGAAACCTGT Htel 1274B 5' GTGTCAGAGATGACGCGCAGGAA Htel 1624b 5' ACCCACACTTGCCTGTCCTGAGT hTR TAC 5' ACTGGATCCTTGACAATTAATGCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAGGGTTGCGGAGGG TGGGC hTR 5'T7 5' CTGTAATACGACTCACTATAGGGTTGCGGAGGGTGGGC hTR 3'PstI 5' CACCTGCAGACATGCGTTTCGTCCTCACGGACTCATCAGGCCAGCTGGCGACGCATGTG GAGCCGAGTCCTG BT-177 5' GGATCCGCCGCAGAGCACCGTCTG BT-178 5' CGAAGCTTTCAGTGGGCCGGCATCTGAAC BT-179 5' CGAAGCTTTCACAGGCCCAGCCCAACTCC BT-182 5' GCGGATCCAGAGCCACGTCCTACGTC BT-183 5' GCGGATCCGTTCAGATGCCGGCCCAC EJEMPLO 2 SECUENCIA DE HT1 Y ALINEACIÓN CON OTRAS TELOMERASAS La alineación de múltiples secuencias demuestra que la proteína de hT1 predicha es co-linear con las subunidades catalíticas de telomerasa de Euplotes y S. cerevisae sobre las longitudes completas (Figura 2). Aunque la homología global entre las tres proteínas es relativamente baja (aproximadamente 40% de similitud en todas las combinaciones en forma de pares), la estructura global de la proteína parece estar bien conservada. Cuatro dominios principales: N-terminal, básico, transcriptasa inversa (RT) y C-terminal están presentes en las tres proteínas. El área más grande de similitud de secuencia está dentro del dominio de RT. Notablemente, todos los motivos característicos del dominio de RT de Euplotes están presentes y todos los residuos de aminoácidos implicados en la catálisis de RT se conservan en la secuencia de hT1 (Lingner et al., Science 276: 561-567, 1997). Recientemente, el tratamiento de fosfatasa 2A de proteína de extractos de células de cáncer de pecho humano ha mostrado inhibir la actividad de telomerasa (Li et al., J. Biol. Chem. 272: 16729-16732, 1997). No se sabe si este efecto es directo, pero eleva la posibilidad de regulación de la actividad de telomerasa mediante fosforilación de proteína. La proteína hT1 predicha contiene numerosos sitios de fosforilación potenciales, incluyendo dipéptidos 11 SP o TP, los cuales son sitios potenciales para cinasas dependientes del ciclo celular.

EJEMPLO 3 CARACTERIZACIÓN DEL GENE DE TELOMERASA Se realizan análisis Northern o análisis Southern para deteminar el tamaño del transcrito de telomerasa y si el gene de telomerasa es amplificado en células de tumor. Para análsis Northern, mRNA poliA es aislado de células LIM 1215 y de fibroblastos CCD. CCD es una línea de células de fibroblasto humana primaria. Brevemente, las células son usadas por homogeneización en una solución amortiguada (NaCI 0.1 M, Tris 10 mM, pH 7.4, EDTA 1 mM) conteniendo detergente (0.1% SDS) y 200 µg/ml de proteinasa K. Se adiciona SDS al lisado a una concentración final de 0.5%, y el lisado es incubado a 60°C durante 1 h y 37°C durante 20 minutos. El lisado es incubado entonces durante 1 h con una pasta de oligo dT-celulosa que ha sid pre-ciclizada en NaOH 0.1 M y equilibrada en NaCI 0.5 M, Tris 10 mM, pH 7.4, EDTA 1 mM, y SDS 0.1%. La resina es recolectada por centrifugación, se lava el lote en el amortigudor de equilibrio y se carga en una columna. El mRNA es levigado con amortiguador calentado (37°C) (Tris 10 mM pH 7.4, EDTA 0.1 mM) y etanol precipitado. Aproximadamente 3 µg de RNA poliadenilado es sometido a electroforesis en un gel 0.85% formaldehído-agarosa (ver Sambrook et al., supra) y se transfiere durante la noche a Genescreen plus (Bio-Rad, CA). La membrana es hibridada con una sonda específica de telomerasa marcada con 32P (inserción de 390 bp correspondiente a la secuencia EST). Después de lavar la mancha a alta severidad, se observa una prominante banda de -3.8 kb en mRNA a partir de LIM 1215, pero no en mRNA de los fibroblastos CCD (Figura 3). La hibridación subsecuente de la misma membrana con una sonda para deshidrogenado de gliceraldehído 6-fosfato demostró una banda equivalentemente fuerte en ambos mRNAs, indicado que cada campo contenía una cantidad similar de RNA de alta calidad. La presencia de transcriptos más largos (especialmente una banda heterodispersada de -8 kb) también es visible solamente en RNA de LIM1215 (Fig. 10, panel superior). Estos hallazgos proporcionan una indicación de mRNA específico de hT1 adicional y también que hT1 puede expresarse preferencialmente en células de tumor versus células normales. Para análisis Southern, el DNA es aislado de células mononucleares de sangre periférica humana y LIM 1215. Aproximadamente 10 µg de DNAs son digeridos con Hind lll, Xba I, Eco Rl, ßamHI y Pst\, se someten a electroforesis en un gel de agarosa 1% y se transfieren a una membrana de nylon. Para controles, el DNA de plásmido conteniendo telomerasa humana es titulado a aproximadamente el equivalente de 10 copias, 5 copias y 1 copia por 10 µg de DNA genómico y sometido a electroforesis en el mismo gel. Un fragmento de 390 bp de gene de telomerasa (conteniendo la secuencia EST) es marcado con 32P y es hibridado bajo condiciones de severidad normal. El filtro se lava en 2X SSC, 0.1% SDS a 55°C. Una imagen de substancia fosfórica escaneada se presenta en la Figura 4. Como se muestra, el gene de telomerasa no parece ser amplificado o rearreglado en Ll M 1215 ya que no existe una diferencia significativa en el patrón o intensidad de hibridación cuando se compara LIM 1215 con DNA de PBMC. Más aún, la telomerasa parece ser un gene de copia simple, ya que todas las digestiones excepto Pst I produjeron una banda simple.

EJEMPLO 4 PATRONES DE EXPRESIÓN DE HT1 Aunque se ha asociado ampliamente la actividad de telomerasa con las células de tumor y la l ínea de germen , solo recientemente se ha reconocido q ue ciertos tejidos de mamíferos normales expresan bajos niveles de actividad de telomerasa. La expresión de hT1 no es detectada en RNA de fibroblasto primario, y la amplificación de varias genotecas de cDNA comercialmente disponibles de pulmón , corazón , hígado, páncreas, hipocampo, cerebro fetal y testes usando iniciadores de la región EST, no reveló ning ún producto. Sin embargo, se exam ina la expresión de hT1 en tej idos normales que han demostrado previamente tener actividad de telomerasa (colon , testes y linfocitos de sangre periférica), así como un número de muestras de melanoma y cáncer de pecho. RNA es aislado a partir de colon, testes y linfocitos circulatorios humanos normales, y de secciones del tejido de muestras de tumor, y son sometidas a análisis de RT-PCR. Los productos de am plificación de cDNA se distinguen fácilmente de productos que resultan de la contaminación de DNA genómico, conforme se observa un producto de -300 bp usando cDNA como u na plantilla y un producto de 2.7 kb se observa usando DNA genómico como una plantilla. Los transcriptos de hT1 son detectados tanto en colon como testes, en la mayoría de las muestras de tumor, y muy débilmente en RNA de linfocito (Figura 5, panel superior). De manera interesante, dos de las muestras de cáncer de pecho son negativas para expresión de hT1 , a pesar de contener cantidades comparables de RNA con las otras muestras, según se j uzga por la amplificación de ß-actina como un control positivo (Figura 5, panel inferior) . La adquisición de actividad de telomerasa parece ser u n aspecto importante del proceso de inmortalízación. La expresión de hT1 en un número pares igualados de cultivos celulares pre-crisis y líneas celulares post-crisis se determina usando RT-PCR seguido por la amplificación de los in iciadores anidados (Figura 6, panel superior) . Estas l íneas de células son telomerasa negativas (l ínea cel ular pre-crisis) y positivas (l íneas celulares post-crisis) , respectivamente, usando el ensayo TRAP (Bryan et al . , EMBO J. 14: 4240-4248, 1 995). En los dos pares igualados, BFT-3B y BET-3K, hT1 es detectado solamente en las l íneas de células post-crisis (comparar los campos a y b, campos e y f). Mientras que la l ínea post-crisis (cam pos d , f) en el conjunto BFT-3K muestra una banda de hT1 abundante, un fragmento del mismo tamaño también está débilmente presente en la muestra de cultivo pre-crisis (cam pos c, e). Además, dos de las tres l íneas de células post-crisis demuestran la presencia de un fragmento inesperado adicional de 320 bp, y este producto también es observado cuando se analizan m RNA de colon y testes en geles de resolución alta. También se analizan tres l íneas de células telomerasa-negativas (ALT) inmortalizadas para expresión hT1 (Figura 6, campos g , h , i) . Dos de las l íneas parecen negativas para la expresión de hT1 , pero en una línea (IIICF-T/B1), un producto de aproximadamente 320 bp es amplificado nuevamente (Figura 6, campo i), similar a las muestras de colon y testes post-crisis. El análisis de secuencia de DNA del producto de 320 bp de la línea IIICF-T/B1 (ALT) revela la presencia de una inserción de 38 bp, relativa al producto esperado. La posibilidad de que esta sea una amplificación de DNA genómico en lugar de mRNA es descartada al realizar la amplificación con los mismos iniciadores, pero usando DNA genómico como la plantilla. Bajo estas condiciones, se amplifica un fragmento de 2.7 kb y su autenticidad es confirmada por análisis de secuencia parcial.

EJEMPLO 5 IDENTIFICACIÓN DE PATRONES DE EMPALME ALTERNATIVOS DE MRNA DE TELOMERASA El análisis de secuencia de DNA de clones de la genoteca de cDNA LIM1215 y los datos de RT-PCR presentados antes para los cultivos pre-crisis y post-crisis indicaron que existe un número de diferentes variantes de secuencia dentro del transcripto hT1. Para examinar sistemáticamente por variantes, se realiza RT-PCR usando pares de iniciadores que cubren la secuencia completa. No se observan variantes en los dominios N-terminl y básico, pero se observan varias variantes en el dominio RT y, en un menor grado, en el dominio C-terminal. Muy notablemente, existen varias variantes de RNA entre el motivo A de RT y el Motivo B de RT (Figura 7A).

Las muestras de mRNA se preparan a partir de varios tumores diferentes usando protocolos convencionales. Los tumores son: (1) Carcinoma de pulmón SLL, (2) Linfoma C, (3) Carcinoma de pulmón, (4) Meduloblastoma A, (5) Linfoma B, (6) Linfoma E, (7) Muestra de tumor 47D, (8) Feocromocistoma, (9) Linfoma F, (10) Glioma y (11) Linfoma G. Los mRNAs de estas muestras son transcritos de manera inversa primero a cDNAs y entonces se amplifican usando los iniciadores HT1875F y HT2781R, seguidos por la amplificación con iniciadores anidados HT20264 y HT2482R. Se observan varios productos amplificados diferentes en la Figura 8: 220 bp (banda 1), 250 bp (banda 2), 400 bp (banda 3) y 430 bp (banda 4). De modo impresionante, existe una considerable variación entre las muestras de tumor probadas tanto en el número total de productos amplificados y en la distribución cuantitativa entre los productos. Tres de estos productos son aislados de un número de tejidos de tumor y son sometidos a análisis de secuencia de Dna. Uno de ellos, un fragmento de 220 bp, es equivalente al cDNA 53.2 de la genoteca LIM1215. El fragmento de -250 bp (banda 2) contiene una inserción enmarco de 36 bp, la misma inserción que se identificó en un producto amplificado a partir de una genoteca de cDNA de LIM1215. Como el producto de RT-PCR tuvo la misma secuencia que el producto de la genoteca de cDNA, es evidentes que la inserción de 36 bp no es un artefacto generado durante la construcción de genotecas. El producto más grande (banda 4) contiene una inserción de 182 bp (la misma que el producto más grande amplificado antes para RNA de LIM1215) comparada con el amplicón de 250 bp. No se obtiene la secuencia no ambigua para la banda de 400 bp (banda 3) . Basado en su tamaño, puede contener la inserción de 1 82 bp pero faltando la inserción de 36 bp presente en las bandas 2 y 4 y ausente de la banda 1 . Para probar la hipótesis de que tal transcripto existe, un iniciador, HTM2028F es diseñado de manera que la amplificación resulta solo cuando estaba faltando el fragmento de 36 bp. La ampl ificación usando los iniciadores HTM2028F y HT2026F en combinación con HT2356R demuestra que los transcriptos conteniendo el fragmento de 1 82 bp, pero faltando el fragmento de 36 bp, están presentes en RNA de LI M 1 21 5 (Figura 9, campos a y b). Los mismos iniciadores de filamento superior (HTM2028F y HT2026F) en combinacón con un iniciador HT2482R amplifican un número de productos de RNA de LI M 1 21 5 (Figura 9, campos c y d), la mayoría de los cuales representan bandas 1 -4 según se determinan por análisis de secuencia directo de productos de PCR. Un fragmento amplificado de 650 bp, usando los iniciadores HTM2028F y HT2482R representa otro, todavía no caracterizado, variante de telomerasa empalmada alternativamente en la región RT-MotivoA/RT-Motivo B. Para claridad de presentación , la secuencia de proteína dando la mejor igualación con proteínas de Euplotes y S. cerevisiae se presenta en la Fig ura 1 como la secuencia de referencia. De manera específica, existen al menos siete inserciones o intrones que pueden estar presentes (o ausentes) del RNA de telomerasa. (1 ) La secuencia más hacia 5' (Y) está ubicada entre las bases 222 y 223. (2) La inserción (X) está ubicada entre las bases 1 766 y 1 767. Una secuencia parcial se determina y se presenta en la Figura 10. Los codones de term inación están presentes en los tres marcos de lectura. Así, se produciría una proteína truncada sin ning uno de los motivos de RTasa. (2) Una secuencia, indicada como "1 " en la figura 7, está ubicada entre las bases 1 950 y 1 951 . Esta secuencia intrónica es de 38 bp (Figura 1 0) y parece estar presente en ALT y la mayoría de las l íneas de tumores. La presencia de esta secuencia adiciona 13 aminoácidos y desplaza el marco de lectura, de manera que un codón de terminación (TGA) está en marco en el nucleótido 1 973. (3) Una secuencia, indicada como "a" en la figura 7, está ubicada entre las bases 21 30 y 21 67. Esta secuencia es de 36 bp (Fig ura 1 0) y su ausencia remueve el motivo "A" de RTasa , pero no altera el marco de lectura. (4) Una secuencia indicada como " ß" en la Figura 7 está presente entre las bases 2286 y 2469. La inserción es de 1 82 bases (Figura 10) y su ausencia provoca un desplazamiento en el marco de lectura y un codón de terminación en el motivo 5 de RTasa en el nucleótido 2604. (5) La secuencia "2" en la figura 7 está presente entre las bases 2823 y 2824. Su longitud es no determinada; su secuencia parcial es presentada en la Figura 1 0. La presencia en su inserción provoca una proteína de telomerasa truncada, como el primer codón de la inserción es un codón de terminación. (6) La secuencia "3" es una inserción de 1 59 bp (Figura 1 0) entre las bases 31 57 y 31 58. Su presencia conduce a una proteína de telomerasa con un extremo COOH alterado. La inserción contiene un codón de par. Más aún , la secuencia "3" tiene un sitio de unión putativo para el dom inio SH3 de c-abl (PXXXXPXXP; PEME PPRP).

El transcripto que se alinea más estrechamente con las telomerasas de Euplotes y levadura por similitud de aminoácidos contiene las secuencias A y B, y no contiene la secuencia C. Las secuencias de aminoácidos y nucleótidos de ocho variantes resultando de mRNAs que comprenden combinaciones de las secuencias A, B y C se presentan en la Figura 8.

EJEMPLO 6 EXPRESIÓN RECOMBINANTE DE TELOMERASA HUMANA La telomerasa humana se clona en vectores de expresión bacteriana.

La secuencia mostrada en la Figura 1 es amplificada de mRNA de LIM 1215 en dos piezas y entonces se ligan juntas. Para la amplificación, el cDNA de primer filamento es sintetizado y se usa en una reacción de amplificación (sistema Titán, Boehringer, IN) con una mezcla de DNA polimerasas, de manera que una enzima termoestable a prueba de lectura (por ejemplo, rTth) se usa con DNA polimerasa Taq. Como mucho del mRNA en LIM 1215 carece la secuencia B (Figura 9), los iniciadores de amplificación se diseñan de manera que un iniciador de cada par está dentro de la secuencia B, en otro lado del sitio Sac I en el nucleótido 2271 (Figura 1). La porción 5' se amplifica primero a partir de cDNA usando iniciadores HT2356R y HT0028F (condiciones del ciclo: 70°C, 2 min; entonces se adicionan secuencias de iniciadores equilibradas a 50°C; 50°C, 30 min; 95°C, 2 mín; 2 ciclos de 94°C, 30 s; 65°C, 30 s; 3 ciclos de 94°C, 30 s; 63°C, 30 s; 68°C, 3 min; 32 ciclos de 94°C, 30 s; 60°C, 30 s; 68°C, 3 min). La porción de extremo 5' del gene de telomerasa se liga entnces en pTTQ18 digerido con Eco Rl/Sac I (Amersham International pie, Buckinghamshire, Inglaterra) y pBluescriptlI KS + , y la secuencia se verificó. Para obtener el extremo 3', se amplifica cDNA de LIM 1215 usando HT2230F y un iniciador HT3292B que es complementario a la secuencia que codifica el extremo C de telomerasa. Los productos de amplificación son digeridos con Hind lll y saci I, y se insertan en pTTQ18 y pBluescript II KS + . Los extremos 5' y 3' también se clonan unidos en el sitio Sac I natural en pTTQ18 tanto como una proteína de fusión Hexa-His como una de no fusión. El plásmido pTTQ18-Htel es transfectado en células bacterianas (por ejemplo, BL21(DE3)). La sobre expresión de la proteína se logra sobre la inducción con IPTG. Las bacterias son recolectadas por centrifugación y son usadas en amortiguador de lisis (NaPO420 mM, pH 7.0, EDTA 5 mM, EGTA 5 mM, DTT 1 mM, 0.5 µg/ml de leupeptina, 1 µg/ml de aprotinina, 0.7 µg/ml de pepstatina). Esta mezcla es suspendida de manera uniforme vía un homogeneizador Polytron y las células se rompen por agitación con perlas de vidrio o paso a través de un microfluidizador. El lisado resultante es centrifugado a 50,000 rpm durante 45 min. El sobrenadante es diluido con NaPO4 20 mM, EDTA 1 mM, pH 7.0 (amortiguador A). El sobrenadante de lisado diluido es cargado entonces sobre una columna SP-Sepharose o equivalente, y se aplica un gradiente lineal de 0 a 30% de SP Amortiguador B (NaCI 1 M, NaPO4 20 mM, EDTA 1 mM, pH 7.0) en Amrotiguador A con un total de volúmenes de columna. Las fracciones conteniendo telomerasa se combinan. Pueden realizarse purificaciones adicionales. Para proteínas de fusión hexa-His, el usado es clarificado por centrifugación y el lote absorbido en una columna Ni-IDA-Sepharose. La matriz se vacía en una columna y se lava con amortigudor, normalmente ya sea Tris 50 mM pH 7.6, DTT 1 mM; MES 50 mM pH 7.0, o amortiguador IMAC (para fusiones de hexa-his). La proteína de telomerasa unida a la matriz es levigada en amortiguador conteniendo NaCl.

EJEMPLO 7 EXPRESIÓN RECOMBINANTE DE COMPONENTE DE RNA DE TELOMERASA HUMANA El componente de RNA de telomerasa humana se aisla primero por amplificación de DNA genómico. Los iniciadores de amplificación son teIRNA T y teIRNA 598B (Figura 5). Las condiciones de amplificación son 95°C, 3 min; adición de polimerasa; 80°C, 2 min; 35 ciclos de 94°C, 30 s; 68°C, 2 min. El producto amplificado es insertado en pBluescript después de otra amplificación usando iniciadores hTR TAC (tiene una secuencia promotora tac) y hTR 3'Pst (tiene una secuencia de ribozima que actúa en cis). La inserción pBluescript es aislada entonces y se une a pACYC177.

EJEMPLO 8 EXPRESIÓN DE SUBREGIONES DE TELOMERASA HUMANA El dominio de RTasa de telomerasa humana es determinado por comparación de secuencias con transcriptasa inversa Moloney MuLV. La región de dedos/palma de la transcriptasa inversa Moloney MuLV forma una unidad estable para la cristalización (Georgiadis et al., Structure 3: 879, 1995). Un número de residuos y motivos se conservan en el sitio activo de ambas proteínas. Los iniciadores son diseñados para amplificar el dominio de RTasa y el dominio de dedos/palma para la inserción de un vector de expresión y aislamiento de proteína subsecuente.

Fragmento ID Iniciadores Aminoácidos Í BT-177/BT-178 AAEH...?...VQMPAH II BT-177/BT-179 AAEH...?...VGLGL III BT-182/BT-179 RATS...?...VGLGL IV BT-183/BT-179 VQMPAH...?...VGLGL El Fragmento I codifica el dominio de "dedos y palma" que corresponde a MoMuLV. La "conexión" y "pulgar" C-terminal (ver, Kohlstaedt et al., Science 256:1783, 1992) se suprimen. El Fragmento II codifica el dominio de transcriptasa inversa de telomerasa, así como el dominio de "conexión" C-terminal. El extremo N es elegido por comparación de tamaños con la estructura de RTasa MoMuLV. El Fragmento lll codifica el extremo C de la proteína. La secuencia RATS está ubicada dentro del dominio de RTasa (región de palma) de la proteína. El Fragmento IV codifica la región C-terminal conteniendo los dominios de "pulgar" y "conexión" y puede funcionar como un elemento ß ai^^tí^^^ ^^^^^^^^ i^ t ? m regulador. El dominio de conexión en HIV-1 es capaz de bloquear la hendidora catalítica de la HIV RTasa en la ausencia del dominio de RNasa (Kohlstaedt et al., supra). En una manera análoga, la región C-terminal puede ser útil como un fragmento regulador (inhibitorio). Más aún, la secuencia C tiene un sitio de unión putativo para el dominio SH3 de c-abl (PXXXXPXXP; PEMEPPRRP, ver secuencia variante 2 de la figura 8). La proteína c-abl interactúa directamente con la proteína ATM (ataxia telangiectasia) (Shafman et al., Nature 389: 520, 1997), una proteína aparentemente involucrada en el control del ciclo celular, recombinación meiótica, monitoreo de longitud de telómero y respuesta de daños de DNA. La unión de la proteína c-abl puede valorarse en métodos estándares de interacción proteína-proteína. Como tales, una interacción de telomerasa y c-abl u otras proteínas conteniendo el dominio SH3 (por ejemplo, erb2) y regulación por movimiento del extremo C de telomerasa dentro y fuera de la hendidura catalítica puede ser controlable usando los constructos y productos descritos en la presente. En un caso, la regulación puede ser mediada por reacciones de fosforilación/desfosforilación. Todos los iniciadores tienen ya sea un sitio Hind lll o Bam Hl. La reacción de amplificación se realiza en amortiguador Pfu 1X, dNTPs 250 µM, 100 ng de cada iniciador, el DNA de plantilla 53.2 de clon usando las siguientes condiciones de ciclizado: 94°C durante 2 min; 25 ciclos de ya sea 55°C, 60°C o 65°C durante 2 min, 72°C durante 2 min, 94°C durante 1 min; seguido por 72°C durante 10 min. Se obtienen los productos de la longitud predicha (966 bp para BT-177/BT-178; 1479 bp para BT-177/BT-179; 824 bp para BT-182/BT-179; 529 bp para BT-183/BT-179). Los productos amplificados se extraen con fenol : CHCI3 se precipitan con etanol. Los productos son resuspend idos y digeridos con la enzima apropiada que corta en la primera secuencia. Los productos digeridos se ligan a pBluescript que es digerido con enzimas que cortan extremos compatibles. Las inserciones son digeridas con Hind l l l y parcialmente digeridas con Bam H l para ligación para pGEX. El plásm ido es transfectado en las células BL21 (DE3) y seleccionado en placas de ampicilina. Las colonias se recolectan y hacen crecer durante la noche en caldo l íquido. Se diluye una alícuota en Terrific Broth con 1 00 µg/m l de am picilína. Las células se hacen crecer a 37°C y se inducen con IPTG 0.5 mM a aproximadamente O. D. 0.8. El crecimiento es continuado durante 5 horas. Las células se recolectan por centrifugación y pueden procesarse de manera inmediata o congelada a -70°C hasta que se necesiten. La proteína es purificada de células usadas. Las pellas de células son Usadas por agitación en vórtice en Tris 50 mM pH 8.0, 2-ME 1 0 mM, 1 mg/m l de lisozima, 0.5% Tritón X-100, 1 µg/ml de pepstatina, 10 µg/ml de leupeptina, 1 0 µg/ml de aprotinina, PMSF 0.5 mM y EDTA 2 mM y un ciclo de congelación/descongelación. Los lisados son clarificados por centrifugación. El sobrenadante es adicionado a una pasta al 50% de GSH-Sepharose, con rotación a 4°C durante 2 h. La matriz se lavó dos veces con amortiguador de lisis, seguido por Tris 50 mM, pH 8.0, 2-ME 1 0 mM . Para análisis por electroforesis en gel SDS-PAG E, se adiciona el amortiguador de muestra con 2-ME 1 50 m M y las m uestras se hierven .

EJEMPLO 9 AISLAMIENTO DE GENE DE TELOMERASA DE MURINO El gene de telomerasa de murino es aislado a partir de genoteca de cDNA o genómica. Una genoteca genómica de ratón es construida en el vector ?FIX II de la cepa 129 de DNA. La genoteca es platinada y las placas se levantan sobre membranas de nylon. Las membranas se hibridan con la inserción del clon 53.1 (1.9 kb) bajo condiciones de severidad normal. Se eligen seis placas de hibridación para análisis adicional.

EJEMPLO 10 DEMOSTRACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE TELOMERASA USANDO VARIANTES DE TELOMERASA Y HT-1 La secuencia de hT-1 de longitud completa se clona en un vector de expresión y la proteína resultante es valorada por actividad de telomerasa. El vector pRc/CMV2 (Invitrogen, Carlsbad, CA) es un vector de expresión eucariótica que tiene un sitio de múltiple clonación ubicado entre un promotor, el RSV LTR, y una señal de poliadenílación y secuencias de terminación de transcripción del gene de hormona de crecimiento de bovino. La secuencia de telomerasa en la cual el codón Leu49 fue convertido a un codón Met se insertó en pRc/CMV2. Un clon, phTC51, es elegido para estudio adicional. La secuencia de DNA de la unión 5' se determinó y confirmó la orientación de la inserción. Subsecuentemente, la secuencia de la unión 3' se determinó y mostró una supresión de la señal poliA, pero ninguna supresión de la secuencia de codificación de telomerasa. El clon es transfectado en las célu las HeLa G M847 en pasos 44 y 68, células SUSM-1 en el paso 1 8, y cél ulas RKF-T/A6 en el paso 40. Los extractos de células se ensaya para actividad de telomerasa por el ensayo TRAP como se describió en la presente. Como se muestra en la Figura 1 2, una escalerilla de productos indicativa de actividad de telomerasa es vista en la dilución 1 : 1 00 de extracto a partir de las células SUSM-1 y no se ve en células de control. Una escalerilla no es fácilmente detectable a la concentración mayor del extracto, lo cual puede deberse a la actividad de nucleasa en el extracto. Se construyen tres variantes de telomerasa: pAKI .4 es telomerasa con la región beta empalmada fuera (Figura 1 3) ; pAKI .7 es telomerasa con la inserción de extremo C alternativa 3 (Fig ura 14), y pAKI . 14 es la telomerasa con la región alfa empalmada fuera (Fig ura 1 5) . El extremo 5' del gene de telomerasa se insertó en cada uno de estos tres vectores y las inserciones se movieron al vector de expresión pCI neo. Las variantes, junto con la telomerasa de referencia en pCI neo se transfectan transientemente en las células GM847, las cuales son células ALT que no tienen actividad de telomerasa detectable, pero las cuales expresan la subunidad de RNA. Se probaron los extractos celulares en un ensayo TRAP. La telomerasa de referencia exhibe actividad , así como la telomerasa con la inserción 3 (inserción pAKI .7), pero las otras variantes no expresan actividad .

A partir de lo anterior, se apreciará que, aunque se han descrito en la presente modalidades específicas de la invención para fines de il ustración, pueden hacerse varias modificaciones sin desviarse del espíritu y alcance de la invención. De acuerdo a esto, la invención no es lim itada excepto por las reivindicaciones anexas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de ácido nucleico aislada, comprendiendo una secuencia correspondiente a una molécula de ácido nucleico que codifica una variante de empalme de una subunidad catalíta de una telomerasa de vertebrado, en donde la secuencia que codifica dicha telomerasa de vertebrado híbrida bajo condiciones de baja severidad al complemento de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica los aminoácidos 605-915 de la Figura 1.

2. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, en donde la molécula de ácido nucleico codifica una de las secuencias de aminoácidos presentada en las Figuras 11A, 11B-C, 11D-E, 11J-K, 11L-M, 11N-O, 11P-Q, 11 R-S u 11T-U, o una variante de las mismas.

3. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, comprendiendo una de las secuencias presentadas en las Figuras 11A, 11B-C, 11D-E, AAJ-K, 11L-M, 11N-O, 11P-Q, 11 R-S u 11T-U o una secuencia que híbrida bajo condiciones de severidad normal al complemento de una de las secuencias presentadas en las Figuras 11A, 11B-C, 11D-E, 11J-K, 11L-M, 11N-O, 11P-Q, 11R-S u 11T-U.

4. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, 2 o 3, en donde la variante de empalme de telomerasa de vertebrado carece de secuencia de nucleótidos codificando motivos de RTasa A, B, C y D.

5. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 , 2 o 3, en donde la variante de empalme de telomerasa de vertebrado carece de secuencia de nucleótidos que codifica el motivo RTasa A.

6. La molécula de ácido nucleico de cualq uier reivind icación precedente, en donde la variante de empalme de telomerasa de vertebrado carece de secuencia de nucleótidos que codifica un motivo de rizo P.

7. La molécula de ácido nucleico de cualquier reivindicación precedente, en donde la variante de empalme de telomerasa de vertebrado carece de un dom inio C-terminal.

8. La molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la variante de empalme de telomerasa de vertebrado tiene un extremo C alterado comprendiendo la secuencia que codifica un sitio de unión SH3 de consenso.

9. La molécula de ácido nucleico de cualquier reivindicación precedente, en donde dicha molécula es una molécula de DNA.

1 0. La molécula de ácido nucleico de cualq uiera de las reivídicaciones 1 a 8, en donde d icha molécu la es una molécula de RNA.

1 1 . La molécula de ácido nucleico de cualq uier reivindicación precedente, en donde dicha telomerasa de vertebrado es una telomerasa humana.

1 2. U n vector de expresión, comprendiendo un promotor operablemente enlazado a la molécula de ácido n ucleico de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 -1 1 .

1 3. El vector de expresión de la reivindicación 12, en donde el vector es seleccionado del grupo que consiste de vectores bacterianos, vectores retrovirales, vectores adenovirales y vectores de levadura.

14. Una célula huésped conteniendo un vector de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 2 o 1 3.

1 5. La célula huésped de la reivindicación 14, en donde la célula se selecciona del grupo que consiste de célula humana, célula de mono, célula de ratón, célula de rata, célula de levadura y célula bacteriana.

1 6. Una proteína codificada por la molécula de ácido nucleico de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 1 .

1 7. Un método para hacer una proteína de telomerasa de vertebrado, com prendiendo cultivar una célula huésped de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 14 o 1 5 bajo condiciones, y durante un tiempo suficiente, para producir la proteína de telomerasa de vertebrado.

1 8. Una molécula de ácido nucleico aislada de al menos 1 5 nucleótidos de longitud , que híbrida bajo condiciones de severidad normal a una secuencia, o com plemento de la misma, correspondiente a una molécula de ácido nucleico que codifica una telomerasa de vertebrado o una variante de empalme de la misma, en donde la molécula de ácido nucleico que codifica dicha telomerasa de vertebrado híbrida bajo condiciones de baja severidad al complemento de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica los aminoácidos 605-91 5 de la Figura 1 .

1 9. U na molécula de ácido nucleico aislada marcada que hí brida bajo condiciones de severidad normal a una secuencia, o complemento de la misma , correspondiente a una molécula de ácido nucleico que codifica una telomerasa de vertebrado, o una variante de empalme de la misma , en donde la molécula de ácido nucleico que codifica dicha telomerasa de vertebrado híbrida bajo condiciones de baja severidad al com plemento de una secuencia de ácido nucleicos que codifica los aminoácidos 605-91 5 de la Figura 1 .

20. La molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo ya sea a la reivindicación 1 8 o 1 9, en donde dicha telomerasa de vertebrado es u na telomerasa humana.

21 . La molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo a la reivindicación 1 9 o 20, en donde dicha molécula de ácido nucleico que codifica telomerasa se presenta en las Figuras 1 A-E (SEQ I D NO. 1) .

22. La molécula de ácido n ucleico aislada de acuerdo a la reivindicación 21 , en donde dicha telomerasa es una variante de empalme de la telomerasa de vertebrado presentada en las Fig uras 1 A-E (SEQ I D NO. 1) .

23. La molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo ya sea a la reivindicación 1 9 o 20, en donde dicha marca es una radiomarca, u na marca q uimiolum iniscente, una marca de enzima , una marca fluorescente o biotina.

24. La molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo a la reivindicación ya sea 1 9 o 20, en donde dicha molécula de ácido nucleico es al menos de 20, 25, 30, 40 o 50 nucleótidos de longitud.

25. Un par de iniciadores de oligonucleótidos capaces de amplificar específicamente toda o u na porción de u na molécula de ácido nucleico que codifica una telomerasa de vertebrado, o un complemento de la misma, o una variante de empalme de telomerasa de vertebrado, en donde dicha molécula de ácido nucleico que codifica telomerasa de vertebrado híbrida bajo condiciones de baja severidad al com plemento de una secuencia de ácido n ucleico que codifica los aminoácidos 605-91 5 de la Figura 1 .

26. El par de iniciadores de acuerdo a la reivindicación 25, en donde dicha telomerasa de vertebrado es telomerasa humana.

27. Los iniciadores de la reivindicación 26, en donde el par de iniciadores es capaz de amplificar específicamente una secuencia que comprende toda o una parte de región 1 , región a, región ß, región 2, región 3, región X o reg ión Y, como se presenta en las Fig uras 1 0A-B.

28. Los iniciadores de la reivindicación 27, en donde los iniciadores flanquean los nucleótidos 222, 1950, 21 31 -21 66, 2287-2468 o 31 57, como se presenta en las Fig uras 1 A-E.

29. Los iniciadores de la reivindicación 28, en donde uno de cada par de iniciadores flanquea el nucleótido 222, 1950, 2131 -2166, 2287-2468, 2843 o 31 57, como se presenta en las Figuras 1 A-E y el otro iniciador del par tiene la secuencia correspondiente a una de las secuencias presentadas en las Figuras 1 0A-B o com plementos de las mismas.

30. Un anticuerpo que se une específicamente a una proteína de telomerasa de vertebrado, en donde d icha telomerasa de vertebrado es codificada por una molécula de ácido nucleico que híbrida bajo condiciones de baja severidad al complemento de una secuencia de ácidos nucleicos q ue codifica los am inoácidos 605-91 5 de la Figura 1 .

31 . El anticuerpo de acuerdo a la reivindicación 30, en donde dicho anticuerpo se une específicamente a un polipéptído codificado por una secuencia seleccionada del grupo que consiste de la región 1 , región a, región ß o región 3, como se presenta en las Figuras 10A-B.

32. El anticuerpo de acuerdo a la reivindicación 31 , en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

33. Un hibridoma que produce el anticuerpo de acuerdo a la reivindicación 32.

34. Un método para detectar la proteína de telomerasa de vertebrado, o una variante de empalme de la m isma, en una muestra, comprendiendo mezclar una m uestra con un anticuerpo de telomerasa anti-vertebrado o compuesto de unión de telomerasa marcado, y determinar si dicho anticuerpo o com puesto marcado se une a telomerasa, detectar con ello dicha proteína de telomerasa de vertebrado, en donde dicha telomerasa de vertebrado es cod ificada por una molécula de ácido nucleico que híbrida bajo condiciones de baja severidad al complemento de una secuencia de ácido nucleico, que codifica los aminoácidos 605-91 5 de la Figura 1 .

35. Un método para detectar telomerasa de vertebrado en una muestra, comprendiendo amplificar los ácidos nucleicos de telomerasa de vertebrado en la muestra y/o mezclar la muestra con una molécula de ácido nucleico de acuerdo a la reivindicación 1 9 o 20, y detectar la hibridación específica bajo condiciones de severidad normal a una molécula de ácido nucleico contenida dentro de dicha muestra.

36. Un método para diagnosticar cáncer comprendiendo el método de acuerdo a la reivindicación 34 o 35, en donde la muestra es obtenida de u n paciente.

37. El método de acuerdo a la reivindicación 36, comprendiendo además comparar el valor obtenido de la muestra con un valor obtenido de células de contraparte normal.

38. El método de acuerdo a la reivindicación 36 o 37, comprendiendo determinar un patrón de expresión de RNA de telomerasa en células aisladas de un paciente, comprendiendo amplificar el ácido nucleico de telomerasa de cDNA sintetizado de RNA celular de paciente, y detectar el producto am plificado por hibridación con un oligonucleótido que tiene toda o parte de una secuencia de región 1 , región a, reg ión ß, región 2, región 3, región X o región Y, como se presenta en las Fig uras 1 0A-B, determinar de ah í el patrón de expresión de RNA de telomerasa, en donde el patrón es indicativo de un diagnóstico de cáncer.

39. Un inhibidor de actividad de telomerasa de vertebrado, en donde el inhibidor se une a proteína o ácido nucleico de telomerasa y no es un análogo de nucleósído, en donde dicha telomerasa de vertebrado es codificada por una molécula de ácido nucleico que híbrida bajo condiciones de baja severidad al complemento de una secuencia de ácido nucleico q ue cod ifica los aminoácidos 605-91 5 de la Figura 1 , o u na variante de empalme de la misma.

40. El inhibidor de la reivindicación 39, en donde el inhibidor comprende la secuencia de ácidos nucleicos antisentido complementaria a la región 1 , región a, región ß, región 2, región 3, región X, como se presenta en las Figuras 10A-B.

41 . El inhibidor de la reivindicación 40, en donde el inhibidor es una ribozima que corta específicamente una variante de empalme de telomerasa .

42. Una composición farmacéutica comprendiendo un inhibidor de actividad de telomerasa de acuerdo a las reivindicaciones 39-41 y un portador farmacéuticamente aceptable.

43. Un método para identificar un efector de actividad de telomerasa de vertebrado comprendiendo: (a) adicionar un efector candidato a una mezcla de proteína de telomerasa de vertebrado, componente de RNA y plantilla, en donde la proteína de telomerasa es codificada por una molécula de ácido nucleico aislado de acuerdo a cualq uiera de las reivindicaciones 1 a 1 1 ; (b) detectar la actividad de telomerasa; y (c) comparar la cantidad de actividad en el paso (b) a la cantidad de actividad en una mezcla de control sin efector cand idato, identificando de ah í un efector.

44. El método de la reivindicación 43, en donde el efector es un inhibidor. Í A