MXNL06000028A - Metodo para la deteccion y cuantificacion multiple y simultanea de patogenos mediante la reaccion en cadena de la polimerasa en tiempo real - Google Patents
Metodo para la deteccion y cuantificacion multiple y simultanea de patogenos mediante la reaccion en cadena de la polimerasa en tiempo realInfo
- Publication number
- MXNL06000028A MXNL06000028A MXNL/A/2006/000028A MXNL06000028A MXNL06000028A MX NL06000028 A MXNL06000028 A MX NL06000028A MX NL06000028 A MXNL06000028 A MX NL06000028A MX NL06000028 A MXNL06000028 A MX NL06000028A
- Authority
- MX
- Mexico
- Prior art keywords
- seq
- identified
- probe
- fluorophore
- oligonucleotide
- Prior art date
Links
- 230000001717 pathogenic Effects 0.000 title claims abstract 13
- 244000052769 pathogens Species 0.000 title claims abstract 13
- 238000011002 quantification Methods 0.000 title claims abstract 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract 4
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 title abstract 2
- 229920000272 Oligonucleotide Polymers 0.000 claims abstract 27
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract 9
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract 8
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims abstract 8
- 241000589875 Campylobacter jejuni Species 0.000 claims abstract 7
- 229940015062 Campylobacter jejuni Drugs 0.000 claims abstract 7
- 241000186781 Listeria Species 0.000 claims abstract 7
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 claims abstract 7
- 229940076185 Staphylococcus aureus Drugs 0.000 claims abstract 7
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 claims abstract 7
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims abstract 7
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 claims abstract 4
- 230000002255 enzymatic Effects 0.000 claims abstract 4
- 241001646719 Escherichia coli O157:H7 Species 0.000 claims abstract 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims 44
- 230000005284 excitation Effects 0.000 claims 9
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims 8
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 claims 5
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 claims 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims 4
- UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 4-[4-[[2,5-dimethoxy-4-[(4-nitrophenyl)diazenyl]phenyl]diazenyl]-N-methylanilino]butanoic acid Chemical group COC=1C=C(N=NC=2C=CC(=CC=2)N(C)CCCC(O)=O)C(OC)=CC=1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims 3
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 claims 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims 2
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 claims 1
- 230000000295 complement Effects 0.000 claims 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 abstract 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 abstract 1
Abstract
Un método para la detección y cuantificación múltiple y simultánea de cualquier combinación de Listeria sp, Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni y/o Escherichia coli O157:H7, en una o más muestras de ensayo mediante reacción de amplificación múltiplex empleando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real, los pasos del método son (a) extraer ADN presente en la muestra o muestras de ensayo;(b) preparar una mezcla de reacción específica para los patógenos a detectar y cuantificar, tal que la mezcla de reacción contiene los reactivos necesarios para la amplificación enzimática del ADN extraído e identificación de los patógenos a detectar y cuantificar;(c) amplificar, mediante reacción de amplificación múltiplex empleado PCR, la mezcla de reacción;y (d) determinar simultáneamente la presencia o ausencia y cuantificación de los patógenos en la muestra o muestras de ensayo;el método tiene la particularidad de que (i) la mezcla de reacción para la amplificación enzimática del ADN cuenta juegos de pares de iniciadores oligonucleótidos identificados como SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 y SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO:8, y SEQ ID NO:10 y SEQ ID NO:11, y sondas con secuencias oligonucleótidas identificadas como SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:9 y SEQ ID NO:12;(ii) la presencia o ausencia y cuantificación de dichos patógenos en cualquier combinación se determina por una señal fluorescente o emisión de fluorescencia especifica de cada patógeno.
Claims (45)
1. Un método para la detección y cuantificación múltiple y simultánea de cualquier combinación de patógenos, tales como Listeria sp, Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni y/o Escherichia coli 0157:H7, en una o más muestras de ensayo mediante reacción de amplificación múltiplex empleando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real, el método comprende los pasos de: a) extraer ADN presente en dicha muestra o muestras de ensayo; b) preparar una mezcla de reacción específica para dichos patógenos a detectar y cuantificar, comprendiendo dicha mezcla de reacción los reactivos necesarios para la amplificación enzimática del ADN extraído e identificación de dichos patógenos a detectar y cuantificar; c) amplificar, mediante reacción de amplificación múltiplex empleado PCR, dicha mezcla de reacción; y d) determinar simultáneamente la presencia o ausencia y cuantificación de dichos patógenos en dicha muestra o muestras de ensayo; en donde dicho método se caracteriza porque i) dicha mezcla de reacción para la amplificación enzimática del ADN extraído e identificación de cualquier combinación de Listeria sp, Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuní y/o Escherichia coli 0157.?7 a detectar y cuantificar comprende: un primer par de iniciadores oligonucleótidos identificados como SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 y una sonda identificada como SEQ ID NO: 3, los cuales se cruzan o se atan a un primera secuencia objetivo de ácido nucleico de Listeria sp; un segundo par de iniciadores oligonucleótidos identificados como SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5 y una sonda identificada como SEQ ID NO: 6, los cuales se cruzan o se atan a una segunda secuencia objetivo de ácido nucleico de Staphylococcus aureus; un tercer par de iniciadores oligonucleótidos identificados como SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8 y una sonda identificada como SEQ ID NO: 9, los cuales se cruzan o se atan a una tercera secuencia objetivo de ácido nucleico de Campylobacter jejuni; y/o un cuarto par de iniciadores oligonucleótidos identificados como SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11 y una sonda identificada como SEQ ID NO: 12, los cuales se cruzan o se atan a una cuarta secuencia objetivo de ácido nucleico de Escherichia coli 0157:1-17; ii) la presencia o ausencia y cuantificación de dichos patógenos en cualquier combinación de Listeria sp, Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni y/o Escherichia coli 0157:H7 en dicha muestra o muestras de ensayo se determina por una señal fluorescente o emisión de fluorescencia específica de cada patógeno.
2. El método de la reivindicación 1, en el cual dicha muestra o muestras de ensayo es una muestra de alimentos procesados o de ambiente.
3. El método de la reivindicación 1, en el cual el paso de extraer ADN presente en dicha muestra o muestras de ensayo, incluye los pasos de: colocar dicha muestra de ensayo en una solución salina estéril; remover los elementos solubles en agua; y obtener un concentrado.
4. El método de la reivindicación 1, en el cual dicha mezcla de reacción comprende: aproximadamente 200 pmol del iniciador oligonucleótido identificado como SEQ ID NO: 1; aproximadamente 200 pmol del iniciador oligonucleótido identificado como SEQ ID NO: 2; aproximadamente 50 pmol del oligonucleótido de la sonda identificada como SEQ ID NO: 3; aproximadamente 200 pmol del iniciador oligonucleótido identificado como SEQ ID NO: 4; aproximadamente 200 pmol del iniciador oligonucleótido identificado como SEQ ID NO: 5; aproximadamente 50 pmol del oligonucleótido de la sonda identificada como SEQ ID NO: 6; aproximadamente 300 pmol del iniciador oligonucleótido identificado como SEQ ID NO: 7; aproximadamente 200 pmol del iniciador oligonucleótido identificado como SEQ ID NO: 8; aproximadamente 350 pmol del oligonucleótido de la sonda identificada como SEQ ID NO: 9; aproximadamente 200 pmol del iniciador oligonucleótido identificado como SEQ ID NO: 10; aproximadamente 200 pmol del iniciador oligonucleótido identificado como SEQ ID NO: 11; y/o aproximadamente 50 pmol del oligonucleótido de la sonda identificada como SEQ ID NO: 12.
5. . El método de la reivindicación 1, el cual incluye una o más sondas para detectar producto o productos amplificados de PCR, en donde cada sonda se caracteriza por ser complementaria a una secuencia dentro de la secuencia a detectar de cualquier combinación de Listeria sp, Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni y/o Escherichia coli 0157:1-17.
6. El método de la reivindicación 5, en donde una primera sonda se caracteriza por comprender: un oligonucleótido identificado como SEQ ID NO: 3; y al menos un marcador.
7. El método de la reivindicación 6, en donde dicha primera sonda se caracteriza por estar marcada en su extremo 5' con fluoróforo o un colorante capaz de emitir energía y en su extremo 3' con un apagador o un colorante capaz de capturar la energía emitida de la excitación de dicho fluoróforo.
8. El método de la reivindicación 7, en donde dicho fluoróforo es TET.
9. El método de la reivindicación 7, en donde dicho apagador es BHQ-1.
10. El método de la reivindicación 5, en donde una segunda sonda se caracteriza por comprender: un oligonucleótido identificado como SEQ ID NO: 6; y al menos una marcador.
11. El método de la reivindicación 10, en donde dicha segunda sonda se caracteriza por estar marcada en su extremo 5' con fluoróforo o un colorante capaz de emitir energía y en su extremo 3' con un apagador o un colorante capaz de capturar la energía emitida de la excitación de dicho fluoróforo.
12. El método de la reivindicación 11, en donde dicho fluoróforo es TxR.
13. El método de la reivindicación 11, en donde dicho apagador es BHQ-2.
14. El método de la reivindicación 5, en donde una tercera sonda se caracteriza por comprender: un oligonucleótido identificado como SEQ ID NO: 9; y al menos un marcador.
15. El método de la reivindicación 14, en donde dicha tercera sonda se caracteriza por estar marcada en su extremo 5' con fluoróforo o un colorante capaz de emitir energía y en su extremo 3' con un apagador o un colorante capaz de capturar la energía emitida de la excitación de dicho fluoróforo.
16. El método de la reivindicación 15, en donde dicho fluoróforo es Cy5.
17. El método de la reivindicación 15, en donde dicho apagador es BHQ-3.
18. El método de la reivindicación 5, en donde una cuarta sonda se caracteriza por comprender: un oligonucleótido identificado como SEQ ID NO: 12; y al menos un marcador.
19. El método de la reivindicación 18, en donde dicha cuarta sonda se caracteriza por estar marcada en su extremo 5' con fluoróforo o un colorante capaz de emitir energía y en su extremo 3' con un apagador o un colorante capaz de capturar la energía emitida de la excitación de dicho fluoróforo.
20. El método de la reivindicación 19, en donde dicho fluoróforo es FAM.
21. El método de la reivindicación 19, en donde dicho apagador es BHQ-1.
22. El método de la reivindicación 5, en donde dichas sondas se caracterizan por estar marcadas en su extremo 5' con fluoróforo p un colorante capaz de emitir energía, y en su extremo 3' con un apagador o un colorante capaz de capturar la energía emitida de la excitación de dicho fluoróforo.
23. El método de la reivindicación 22, en donde dicho fluoróforo es seleccionado del grupo que consiste de TET, TxR, Cy5 y FAM.
24. El método de la reivindicación 22, en donde dicho apagador es seleccionado del grupo que consiste de BHQ-1, BHQ-2 y BHQ-3.
25. Un oligonucleótido que se caracteriza por tener una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo formado por las secuencias identificadas como SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3.
26. Un oligonucleótido que se caracteriza por tener una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo formado por las secuencias identificadas como SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6.
27. Un oligonucleótido que se caracteriza por tener una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo formado por las secuencias identificadas como SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9.
28. Un oligonucleótido que se caracteriza por tener una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo formado por las secuencias identificadas como SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12.
29. Una sonda marcada que se caracteriza por comprender: un oligonucleótido identificado como SEQ ID NO: 3; y al menos un marcador.
30. La sonda marcada de la reivindicación 29, en donde dicha sonda se caracteriza por estar marcada en su extremo 5' con fluoróforo o un colorante capaz de emitir energía y en su extremo 3' con un apagador o. un colorante capaz de capturar la energía emitida de la excitación de dicho fluoróforo.
31. La sonda marcada de la reivindicación 30, en donde dicho fluoróforo es TET.
32. La sonda marcada de la reivindicación 30, en donde dicho apagador es BHQ-1.
33. Una sonda marcada que se caracteriza por comprender: un oligonucleótido identificado como SEQ ID NO: 6; y al menos un marcador.
34. La sonda marcada de la reivindicación 33, en donde dicha sonda se caracteriza por estar marcada en su extremo 5' con fluoróforo o un colorante capaz de emitir energía y en su extremo 3' con un apagador o un colorante capaz de capturar la energía emitida de la excitación de dicho fluoróforo.
35. La sonda marcada de la reivindicación 34, en donde dicho fluoróforo es TxR.
36. La sonda marcada de la reivindicación 34, en donde dicho apagador es BHQ-2.
37. Una sonda marcada que se caracteriza por comprender: un oligonucleótido identificado como SEQ ID NO: 9; y al menos un marcador.
38. La sonda marcada de la reivindicación 37, en donde dicha sonda se caracteriza por estar marcada en su extremo 5' con fluoróforo o un colorante capaz de emitir energía y en su extremo 3' con un apagador o un colorante capaz de capturar la energía emitida de la excitación de dicho fluoróforo.
39. La sonda marcada de la reivindicación 38, en donde dicho fluoróforo es Cy5.
40. La sonda marcada de la reivindicación 38, en donde dicho apagador es BHQ-3.
41. Una sonda marcada que se caracteriza por comprender: un oligonucleótido identificado como SEQ ID NO: 12; y al menos un marcador.
42. La sonda marcada de la reivindicación 41, en donde dicha sonda se caracteriza por estar marcada en su extremo 5' con fluoróforo o un colorante capaz de emitir energía y en su extremo 3' con un apagador o un colorante capaz de capturar la energía emitida de la excitación de dicho fluoróforo.
43. La sonda marcada de la reivindicación 42, en donde dicho fluoróforo es FAM.
44. La sonda marcada de la reivindicación 42, en donde dicho apagador es BHQ-1.
45. Un juego de diagnóstico para la detección y cuantificación múltiple y simultánea de cualquier combinación de patógenos, tales como Listeria sp, Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni y/o Escherichia coii 0157.?7, en una o más muestras de ensayo mediante reacción de amplificación multiplex empleando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real, en donde dicho juego se caracteriza por comprender: uno o más oligonucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 25 a la 28; una o más sondas marcadas según cualquiera de las reivindicaciones 29 a la 44; y otros reactivos o composiciones necesarias para llevar a cabo el ensayo.
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/MX2007/000052 WO2007123386A1 (es) | 2006-04-24 | 2007-04-19 | Método para la detección y cuantificación múltiple y simultánea de patógenos mediante la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real |
| DK07747198.5T DK2020449T3 (da) | 2006-04-24 | 2007-04-19 | Fremgangsmåde til detektion og multipel, simultan kvantificering af patogener ved hjælp af real-time polymerasekædereaktion |
| CN2007800147625A CN101432440B (zh) | 2006-04-24 | 2007-04-19 | 通过实时聚合酶链反应检测和多重、同时量化病原体的方法 |
| EP07747198A EP2020449B1 (en) | 2006-04-24 | 2007-04-19 | Method for detection and multiple, simultaneous quantification of pathogens by means of real-time polymerase chain reaction |
| ES07747198T ES2396453T3 (es) | 2006-04-24 | 2007-04-19 | Método para la detección y cuantificación múltiple y simultánea de patógenos mediante la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real |
| BRPI0710889-3A BRPI0710889A2 (pt) | 2006-04-24 | 2007-04-19 | método para a detecção e quantificação múltipla e simultánea de patogênicos mediante a reação em cadeia da polimerasa em tempo real |
| US12/298,298 US8206923B2 (en) | 2006-04-24 | 2007-04-19 | Method for detection and multiple, simultaneous quantification of pathogens by means of real-time polymerase chain reaction |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| MXNL06000028A true MXNL06000028A (es) | 2006-10-17 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kikuchi et al. | A rapid and precise diagnostic method for detecting the pinewood nematode Bursaphelenchus xylophilus by loop-mediated isothermal amplification | |
| Tsui et al. | Molecular techniques for pathogen identification and fungus detection in the environment | |
| McKillip et al. | Real-time nucleic acid–based detection methods for pathogenic bacteria in food | |
| US8206923B2 (en) | Method for detection and multiple, simultaneous quantification of pathogens by means of real-time polymerase chain reaction | |
| Lee et al. | Development and application of an oligonucleotide microarray and real-time quantitative PCR for detection of wastewater bacterial pathogens | |
| HRP20171356T1 (hr) | Izotermičko pojačavanje nukleinske kiseline | |
| EP1716257B8 (en) | New primers and probes for the detection of parvovirus b19 | |
| CN104685062A (zh) | 使用非干扰性噪音消除性多核苷酸鉴定标签的多重焦磷酸测序 | |
| CA2692633A1 (en) | Method for the simultaneous detection of multiple nucleic acid sequences in a sample | |
| KR102324117B1 (ko) | 가닥 침입에 기초한 증폭에 의한 핵산 검출 | |
| EP1910566B1 (en) | Methods of detecting viability-associated molecules | |
| Wang et al. | Detection of genetically modified crops using multiplex asymmetric polymerase chain reaction and asymmetric hyperbranched rolling circle amplification coupled with reverse dot blot | |
| US20220195499A1 (en) | Quantification of ngs dna by adapter sequence | |
| CN101608234A (zh) | 瓜类细菌性果斑病菌的padlock探针及检测方法 | |
| Wheatley et al. | Cas12a-based diagnostics for potato purple top disease complex associated with infection by ‘Candidatus Phytoplasma trifolii’-related strains | |
| CN105331528A (zh) | 一种基于核酸扩增技术的微流控检测芯片及其制备方法 | |
| WO2016203740A1 (ja) | 微生物の検査方法、微生物の検査キット、微生物検査用マイクロアレイ、カビ検出用担体、カビの検出方法、及びカビ検出用キット | |
| US20230090672A1 (en) | Rapid and sample-specific detection of viral pathogen for pooled testing in large-population screening | |
| MXNL06000028A (es) | Metodo para la deteccion y cuantificacion multiple y simultanea de patogenos mediante la reaccion en cadena de la polimerasa en tiempo real | |
| CN110564822B (zh) | 基于LAMP技术的转基因玉米Bt176相关基因检测方法及试剂盒 | |
| WO2017209599A1 (en) | Method and kit for simultaneous and rapid detection of prawn viruses | |
| JP2007189991A (ja) | 遺伝子の検出方法 | |
| US20210108251A1 (en) | Detection of endonuclease activity | |
| Ijaz et al. | Molecular phytopathometry | |
| US8580506B2 (en) | Method and composition for enhancing efficiency and sensitivity in polymerase chain reaction |