MXNL04000106A - Formulado granular bioinsecticida de bacillus thuringiensis israelensis a base de polimeros naturales. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a la preparacion de un formulado granular bioinsecticida de Bacillus thuringiensis israelensis lo cual incluye la incorporacion de esporas y cristales toxicos de esta bacteria embebidos en una matriz de polimero natural seleccionado, incluyendo ademas sustancias protectoras de la toxina, asi como acarreando inerte lo que da por resultado un formulado granular el cual se usa aplicandolo a los diversos cuerpos de agua como charcas, lagunas y recipientes artificiales, lugares turisticos, como lagos o lagunas, donde se desee controlar las poblaciones de mosquitos dipteros, sin dano para otras especies de insectos, invertebrados o vertebrados, ni tampoco para el ambiente.

Description

FORMULADO GRANULAR BIOINSECT!CIDA DE BACILLUS THURINGIENSIS ISRAELENSIS A BASE DE POLIMEROS NATURALES CAMPO DE LA INVENCION Se refiere a la preparación de nuevos formulados de Bacillus thuringiensis israelensis, incluyendo diversos ingredientes como polímeros naturales, además fotoprotectores de la luz ultravioleta y material acarreador inerte que se usan en el control de larvas de mosquitos vectores de enfermedades.

ANTECEDENTES Las larvas de mosquitos Aedes aegypti, Culex sp y Anopheles sp son peligrosos transmisores de enfermedades importantes como el dengue, fiebre amarilla, filariasis, virus del Nilo Occidental y malaria, por lo tanto en todo el mundo se lucha contra estos vectores de enfermedad y una considerable cantidad de insecticidas químicos se destinan a este propósito. Sin embargo, estos químicos causan importantes riesgos toxicológicos debido a que destruyen también otros insectos no blanco u otros organismos que perturban la cadena alimenticia para peces y pájaros, además la aplicación repetida de tales químicos ha provocado la aparición de resistencia por parte de las poblaciones tratadas, fenómeno que se ha observado en algunos países como Cuba, Brasil, Venezuela, Colombia (Rodríguez-Coto et al 2000, Braga et al 2000, Molina de Fernández et al 2000, De Silva et al. 1997). Algunas alternativas a estos químicos se han usado, como las preparaciones microbianas basadas en las toxinas de Bacillus thuríngiensls israelensis (Bti) y Bacillus sphaericus quienes han probados ser efectivos en la lucha contra estos vectores, entre las ventajas que tienen son su selectividad hacia los insectos blanco y son seguros para otros insectos, invertebrados y mamíferos. En 1977, Godberg y Margalit aislaron la cepa de Bacillus thuringiensis israelensis y a partir de este hecho se inició su rápido desarrrollo comercial con las primeras formulaciones comerciales producidas por Laboratorios Abbott, Sandoz y Biochem Pproducts. Una de estas formulaciones, en forma de pellets flotantes, conteniendo ingrediente activo de Bacillus thuringiensis israelensis, azúcar en polvo y polvo de polipropileno, en proporción 1 :1 :1.33 respectivamente se probaron contra larvas de Culex quinquefasciatus y proporcionaron un completo control hasta antes de la tercera semana de aplicación, cuando ya los ingredientes sedimentaron al fondo del recipiente (Lacey et al. 1984). Otra formulación, en forma de briqueta, probada también por los anteriores investigadores, proporcionó control completo por tres s emanas aproximadamente, aunque su efectividad declinó conforme los constituyentes de la briqueta se hundieron. La limitante de estas formulaciones es que el azúcar es altamente soluble en agua, lo que provoca una rápida liberación del ingrediente activo en el agua y posterior sedimentación y perdida del efecto, además no contiene sustancias protectoras de la luz ultravioleta, la cual hace que la toxina se degrade y pierda su efecto. También se han descrito formulaciones encapsuladas de Bacillus thuríngiensis israelensis en polietileno de baja densidad,, adicionadas con extracto de levadura en proporción 1 :28:1 , estas partículas tenían un diámetro de 20-500 mieras y se probaron contra larvas de Aedes aegypti, en condiciones d e laboratorio simulando condiciones n aturales. Esta formulación fue efectiva por 5 días en agua lodosa a la concentración 0.02 ppm de ingrediente activo, mientras que a concentración de 0.4 ppm mantuvo su efectividad por al menos 37 días (Margalit et al. 984). El inconveniente de esta formulación es que aunque proporcionó un control efectivo relativamente largo (37 días) el componente del formulado es un polímero no biodegradable y por esta razón es poco factible su uso. Se han descrito también diferentes formulaciones de plaguicidas y agentes de control biológico, tales com virus bacterias y hongos, utilizando diferentes matrices poliméricas tales como Eudragit L, Eudragit S, poliacrilatos, ácidos poliacrílicos, polímeros de acrilato cíclicos o mezclas adicionadas con sustancias protectoras de la luz ultravioleta, como benzofenonas, á cido p araaminobenzoico, b enzil y mezclas, l as m icrocáosulas retienen e l agente dentro de la cápsula y son fácilmente preparadas (Patente U.S. 4,948,586). Algunas formulaciones de este tipo fueron preparadas por Murat-Elcin ( 995), con Bacillus sphaerícus y alginato de sodio, un ,poIisacarido soluble en agua, agregado a las formulaciones en proporción del 1 , 1.5 y 2% p/p, de esta manera observó que la viabilidad de las esporas se mantenía alrededor del 40% después de 60 días de almacenamiento en medios ácidos, mientras que en las esporas no formuladas su viabilidad declinó a cero. En un estudio de semicampo, llevado a cabo por Alí et al. (1994) evaluaron distintas formulaciones granulares de Bti y maíz (Corncob) desarrolladas por Laboratorios Abbott para proporcionar diferentes características de liberación del ingrediente activo y se probaron contra larvas de /Aedes (Ochlerotattus) taeniorhynchus, en recipientes de prueba, las cuales produjeron 92 % de mortalidad larval acumulada durante seis días posteriores a la aplicación, mientras que una de las formulaciones(79-976-BD) causó el 75% de mortalidad larval a los 9 días después de aplicado, para después provocar solo 12-4% de mortalidad al cabo de 10 días. Se han evaluado también diferentes formulaciones de Bacillus thuríngiensis israelensis y B. sphaerícus, desarrolladas por Laboratorios Abbott (ahora Valent Biosciences Inc.) como las denominadas WDG (granulos dlspersibles en agua) compuestas de alkil poliglucósido y un dispersante aniónlco polimérico (patente WO 00/01234) formuladas con una potencia de 4,000 Unidades tóxicas Internacionales/mg (UTI/mg), cuando se probaron contra larvas de Culex sp. El formulado de Bti mostró significativa reducción de larvas hasta el día 7 después de la aplicación, aunque posteriormente perdió su eficicacia hacia el día 12, mientras que el formulado de B. sphaericus mantuvo control de las larvas de mosquito hasta 20 días después de aplicado(Su y Mulla, 1999). Estas formulaciones aunque son efectivas en los primeros días para reducir las poblaciones larvales de mosquitos, pierden su efectividad en 9-12 días después de aplicadas en campo, además la potencia inicial es muy alta y disminuye muy rrápidamente en pocos días. En l a patente U .S. 6 ,303,117 B 1 ( Octubre 1 6 d el 2001) se d escribe el p rocedimiento d e preparación de gránulos de hielo, conteniendo la toxina de Bti y B. sphaericus en la proporción de 1-200 g para 1 Kg de agua, además incluye 10-100 g/l de adyuvantes, mezclado también con un acarreador mineral (arena) formando gránulos bifásicos de 2-20 mm de diámetro, con un peso, específico > 1 g/cm3 . En la patente WO 01/89297 A2 se describe la preparación de una formulación bioinsecticída de Bacillus thurlngiensls israelensis, compuesta por la endotoxina de d ¡cha bacteria, también incluye sustancias secantes seleccionadas tales como diatomita, bentonita, fosfato de calcio o silica calcinada, cualquiera de ellas en proporción del 0.1-10% p/p, además se establece la adición de un agente dispersante, la metlcelulosa, en proporción del 0.1-10% p/p, mientras que como agente humectante/aglutinante se incluye el estearato d e p olioxietileno, e n p roporción d el 0.1-10% p/p, además se utiliza también u n agente neutralizante seleccionado, el bicarbonato de sodio, en proporción del 10-70% y agentes diluyentes como la celulosa micronizada y lactosa monohidratada en un rango de 10-70% p/p ambas, por último se agrega a la mezcla un agente lubrificante( Polietilenglicol 6000) en un rango de 1-5% p/p, mediante este proceso se puede obtener un polvo seco o bien en forma de tabletas, con los cuales se asegura la permanencia de los componentes activos en el área de aplicación por al menos 10 días y se mantiene la actividad tóxica del formulado en almacenamiento por al menos 6 meses. Según esta formulación la toxina se mantiene activa por al menos 10 días. Según la patente WO 02/065835 A2 se describe la preparación de una mezcla de Bacillus thuríngiensis israelensis y Bacillus sphaericus en diferentes proporciones de peso, tales como 1 :10 a 10:1 respectivamente de ambas cepas, así como las proporciones 1:2 a 2:1 y 1 :3 a 3:1 y por último la proporción 1 :1 de ambas cepas, las cuales son no genéticamente modificadas. También menciona que los cultivos finales de ambas cepas pueden someterse a secado por "spray-dry", para obtener un polvo ya sea jde las dos cepas juntas o separadamente. Estas preparaciones a base de Bacillus thuringiensis israelensis, aunque son efectivas al inicio, (1-3 días), tienen muy poca actividad residual en campo, debido a la sedimentación rápida de la toxina en el ambiente acuático donde se aplican, por lo tanto la toxina sedimentada estará fuera de la zona de alimentación larval, además esta toxina de Bacillus thuringiensis Israelensis pierde su actividad tóxica por degradación causada por la luz ultravioleta del sol, en ambientes naturales, por lo tanto se requiere una preparación efectiva, que se libere lentamente, que permanezca en la zona de alimentación larval y que tenga efecto residual más largo que las preparaciones que existen en el mercado DESCRIPCION DE LA INVENCION DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN El procedimiento para la preparación de la formulación bioinsecticida con actividad tóxica contra insectos dípteros se caracteriza por las siguientes fases: I.) Desarrollo del microorganismo Bacillus thuringiensis var.israelensis mediante una fermentación en un medio de cultivo conveniente, donde los nutrientes son no dañinos al medio a mbiente y m uy económicos d e t al m añera que p uedan s er u sados a una e scala industrial. El medio de fermentación incluye: a) Fuente de nitrógeno: una o más sustancias seleccionadas del grupo consistente de subproductos agroindustriales ricas en proteínas, como líquido de remojo de maíz y harina de soya. b) Fuente de carbono: Una o más sustancias seleccionadas del grupo consistente en harina de trigo ó pasta en polvo (subproducto de la fabricación de pastas para sopa). c) Fuente de micronutrientes: CaC03 y una mezcla de sales incluyendo MgS04, MnS04, FeS04, ZnS04. Los componentes del medio de fermentación se agregan en las proporciones siguientes: Líquido de remojo de maíz 1.0 - 1.5%, harina 0.5 -1 %, harina de trigo 1 - 2 % ó pasta en polvo (subproducto de la fabricación de pasta para sopa) 1-3% ,MgS04 0.03%, CaC03 0.1 % y una mezcla de sales (FeS04,ZnS04,MnS04 )agregada en concentración de 0.002% cada una, ajustada a pH 7.0 ± 2. 11.) La recuperación de la biomasa tóxica, o complejo de esporas y cristales obtenido en la fase 1 por medio de un conveniente proceso de recuperación a través de un procedimiento de secado por asperción, capaz de mantener la actividad tóxica del complejo.

III.) La adición secuencial de los restantes Ingredientes de la formulación al polvo seco de esporas y cristales que contiene Bacillus thurínglensis ¡sraelensis en una proporción del 5-10% p/p, como polímeros naturales que son seleccionados de goma acacia 10-15%, pectina 5-15%, gelatina 10-15% y alginato de sodio 1-3% p/p, preferentemente goma acacia 10-15%, agentes protectores de luz ultravioleta que son seleccionados de entre rojo congo, carbón activado y verde de malaquita, preferentemente el verde de malaquita en una proporción del 1 % p/p.y material inerte acarreador es el corcho en una proporción del 79% p/p.

La aplicación a los cuerpos de agua del formulado granular bioínsecticida es de 3-5gfn2 .

La formulación bioinsecticida de Bacillus thuríngiensis israelensis elaborada se presenta en forma de gránulos flotantes de tamaño de 1-2 mm de diámetro, y un gramo de este formulado contiene de 95-120 gránulos de color verde. Esta preparación bioinsecticida mata las larvas de mosquitos vectores de enfermedades, por lo tanto se aplica a los cuerpos de agua que son criaderos de estos insectos. La preparación contiene el Ingrediente activo de Bacillus thuríngiensis israelensis constituido por los cristales tóxicos y las esporas(biomasa) en una proporción del 5- 0% p/p, además incluye también un polímero natural, como goma acacia, gelatina, p ectina o a lginato d e s odio en diferentes p roporciones; este i ngrediente funciona como una matriz en donde se va a distribuir uniformemente la toxina y esporas, que al disolverse lentamente en el agua hace que la toxina se vaya liberando lentamente también. Un tercer componente incluye una sustancia fotoprotectora para la toxina representada por el verde de malaquita al 1 % p/p, que protege a la toxina de la degradación causada por la luz ultravioleta del sol, en ambientes naturales, finalmente comprende un cuarto componente, el material inerte acarreador, el corcho, molido y tamizado a un tamaño uniforme de 1-2 mm de diámetro, que además va a funcionar como material flotante, para mantener los ingredientes sobre la superficie del agua o cercanos a ésta.. Este formulado bionsecticida contiene materiales biodegradables y ambientalmente seguros, como las toxinas de bti que son específicas para destruir las larvas de mosquitos, no son tóxicas para el humano, ni para otras especies de insecto, otros invertebrados o aun vertebrados, contiene también polímeros naturales como la goma acacia, pectina y gelatina, que son biodegradables, a diferencia de otras formulaciones que conlienen sustancias tóxicas como los insecticidas químicos y polímeros de acrilatos cíclicos o ácidos poliacrílicos. La formulación preparada puede permanecer sin cambio significativo en sus características tóxicas por 12 meses en condiciones de almacenamiento a temperatura de 20-35°C . Además tiene la ventaja de que en diversas pruebas de campo realizadas, ha presentado efecto tóxico residual por 28 días, mientras que otras formulaciones han mostrado efecto solo por 9-12 días después de la aplicación, por lo que nuestras formulaciones pueden presentar mayor efecto residual en campo. En la Tabla 1 se muestra el efecto del almacenamiento sobre la actividad insecticida de las mezclas Bti-polímeros. Los formulados de Bti-polímeros almacenados por distintos períodos de tiempo y probadas contra Ae. aegypti a la concentración 0.9 mg/l, mostraron los resultados de la Tabla 1 , donde se puede observar q ue presentaron actividad tóxica estable d urante ocho m eses aproximadamente, con ligeras variaciones posteriores, en donde la formulación con parafina presentó reducción significativa en la toxicidad de 19%, en comparación con los restantes formulados cuya variación no fue significativa.

MODALIDAD PREFERENTE DE LA INVENCION La formulación granular bioinsecticida se puede preparar e n proporciones de ingrediente activo del 5-10%, mientras que los polímeros usados pueden ser elegidos de entre goma acacia( 10-15% p/p) pectina (5-15%), o alginato de sodio (1-3%). La sustancia fotoprotectora (verde de malaquita) preferentemente al 1 % La cantidad de Ingrediente activo( esporas y cristales de Bacillus thuríngiensis israelensis) preferente es del 10% p/p. La proporción de la sustancia fotoprotectora( verde de malaquita) que se agrega a la formulación es del 1% p/p. La cantidad de material inerte o acarreador es del 79% p/p para completar 100% del peso total de la formulación. La forma de preparación de la formulación bioinsecticida de Bacillus thuríngiensis israelensis es como sigue: Se d isuelve la cantidad p esada y requerida del polímero e n a gua fría( aproximadamente 130-140 ml/g de polímero, mediante agitación continuada. La cantidad requerida de ingrediente activo( esporas y cristales de Bacillus thuríngiensis israelensis) se agregan lentamente a la mezcla anterior hasta que se incorporen completamente mediante agitación continuada.

Una vez homogenizada completamente la mezcla del polímero-ingrediente activo, se agrega la sustancia fotoprotectora( verde de malaquita) hasta lograr la incorporación completa. Finalmente el acarreador inerte (corcho molido y tamizado a un tamaño uniforme) se agregará a la mezcla, de tal manera que todas las partículas queden perfectamente impregnadas de la mezcla. Posteriormente se deja secar al aire o bien en campana de flujo laminar con aire filtrado por 2-3 días hasta que seque completamente. En la TABLA 1 se muestra actividad tóxica de extracto de Bti sin formular y mezclas ingrediente activo-polímero (gelatina, goma acacia, alginato de sodio y parafina) adicionados 1 :3, además de 1 % verde de malaquita, almacenados por varios períodos de tiempo bajo temperatura variable (20-35°C, 50-80% H. R.) y evaluados contra larvas de 4o estadio temprano de Aedes aegypti a 0.9 mg/l. En la FIGURA 1 se muestra la actividad residual comparativa de las formulaciones más tóxicas de cada uno de los 4 polímeros, así como la presentada por un producto comercial, Bactimos B riquetas, Lote o. 50831 y extracto de Bti sin formular, aplicados a la misma concentración que las formulaciones preparadas. Las formulaciones con gelatina y goma acacia al 10% p/p, presentaron mortalidades entre el 65-78% hasta por 14 días, en tanto la preparación con parafina al 5% mostró más del 50% de mortalidad hasta los 35 días postaplicación, en comparación con el formulado comercial (Bactimos Briquetas) que presentó entre 42-37% en los primeros 7-14 días postratamiento y el extracto sin formular que declinó su actividad hasta 2% en 14 días postaplicación. En la FIGURA.2 se muestra la población total larval de Aedes aegypti and Culex sp en contenedores de 200 I tratados con formulaciones de Bacillus thuringiensis subsp. israelensis incluyendo pectina (FP) y goma acacia (FA), comparados con ingrediente activo(polvo técnico) sin formular probados a la dosis 13.7 mg/l. Letras diferentes en un día de muestreo dado, indican diferencias significativas entre control y tratamientos. ANOVA, DMS, P= 0.05 Sin embargo, al día 7 postratamiento, el ingrediente activo sin formular (IA) perdió su efecto para reducir la población l arval, no así las formulaciones probadas, las cuales mostraron reducciones significativas del número de larvas totales en relación al control hasta antes del día 28 postratamiento, con un efecto similar para ambas formulaciones Como conclusión, el ingrediente activo sin formular (IA) mostró reducciones significativas en la población larval únicamente para los días 1-3 postratamiento, mientras que las dos formulaciones Bti-polímeros preparadas tuvieron efecto significativo para reducir la población larval hasta el día 63 postratamiento, fecha a la cual se descontinuó la prueba.

TABLA 1 Media % mortalidad larval1 Almacena 7 60 120 240 3 miento d di días días 6 í as 5 a s d í a s Extracto 1 10 100 100 1 de Bti 0 0 0 0 0 a lA- 1 10 100 100 1 gelatina o 0 a a 0 o 0 a IA- goma 1 10 9 acacia o 0 a a 8 o a IA- 1 10 92 a 98 a 9 alginato de o 0 5 sodio o a Al- 1 10 98 a 100 8 parafina o o a 1 o b promedio de 4 repeticiones. Medias seguidas por letras iguales no son significativamente diferentes. ANDEVA, DMS p<0.05

Claims (9)

REIVINDICACIONES Habiendo descrito suficientemente mi invención, considero como una novedad y por lo tanto, reclamo como de mi exclusiva propiedad, lo contenido en las siguientes cláusulas:

1. Un formulado granular bioinsecticida caracterizado porque comprende los siguientes componentes: Bacillus thurínglensis Isarelensis como ingrediente activo, polímeros naturales, agentes protectores de la luz ultravioleta y material inerte acarreador. .

2. Formulación granular bioinsecticida de acuerdo a la reivindicación 1 , donde el ingrediente activo es Bacilius thuringiensis israelensis en una proporción del 5- 0% p/p .

3. Formulación granular bioinsecticida de acuerdo a la reivindicación 1 , donde los polímeros naturales son seleccionados de goma acacia 10-15%, pectina 5-15%, gelatina 10-15% y alginato de sodio 1-3% p/p, preferentemente goma acacia 10-15%.

4. Formulación granular bioinsecticida de acuerdo a la reivindicación 1 donde el agente protector de la luz ultravioleta es el verde de malaquita al 1 % p/p,

5. Formulación granular bioinsecticida de acuerdo a la reivindicación 1 donde el agente protector de la luz ultravioleta es seleccionado de entre rojo congo, carbón activado y verde de malaquita, preferentemente el verde de malaquita en una proporción del 1 % p/p.

6. Formulación granular bioinsecticida de acuerdo a l a reivindicación 1 d onde e l m aterial inerte acarreador es el corcho en una proporción del 79% p/p.

7. Formulación granular bioinsecticida de acuerdo a I a reivindicación 1 d onde e I m aterial inerte acarreador es el corcho en una proporción del 79% p/p.

8. El uso del formulado de la reivindicación 1 para elaborar un bioinsecticida como agente de control de larvas de mosquitos en mantos acuiferos.

9. El uso del formulado de la reivindicación 1, que contiene Bacillus thuringiensis israelensis en una proporción del 5-10% p/p, goma acacia 10-15%,verde de malaquita en una proporción del 1 % p/p.y corcho en una proporción del 79% p/p, para elaborar un bioinsecticida como agente de control de larvas de mosquitos en mantos acuiferos, donde el formulado es administrado en forma granular en una concentración de. 3-5ofn2 .'