MX2015006424A - Anticuerpos monoclonales contra una proteina activada c (apc). - Google Patents

Abstract

En la presente memoria se proporcionan anticuerpos, fragmentos de anticuerpos de unión a antígenos (Fabs) y otras proteínas de andamiaje, dirigidos contra proteína C activada humana (aPC) con unión mínima a su zimógeno de Proteína C (PC). Asimismo, estas proteínas de unión a aPC podrían bloquear potencialmente la actividad anticoagulante de aPC para inducir la coagulación. En la presente memoria se describen los usos terapéuticos de estos unidores así como también los métodos de selección y cribado de anticuerpos específicos.

Description

ANTICUERPOS MONOCLONALES CONTRA UNA PROTEÍNA ACTIVADA C (aPC) CAMPO DE LA INVENCIÓN Se proveen anticuerpos monoclonales aislados y sus fragmentos que se unen preferentemente a la forma activada de la proteína humana C (aPC).

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El zimógeno de la proteína humana C (PC) es sintetizado en el hígado como un precursor de 461 residuos de aminoácidos y segregado en la sangre (como se muestra en la SEQ ID NO: 1). Antes de la secreción, el precursor de polipeptido de cadena simple es convertido en un heterodímero por remoción de un dipéptido (Lys156-Arg157) y un preprolíder de 42 residuos de aminoácidos. La forma heterodimérica (417 residuos) consiste en una cadena liviana (155 aa, 21 kDa) y la cadena pesada (262 aa, 41 kDa) unidas por un puente disulfuro (como se muestra en la SEQ ID NO: 2). El zimógeno de la PC contiene el sitio de escisión de la trombina, que lleva a la remoción del “péptido de activación” y la activación de la PC a la forma activada de la PC (aPC) (405 residuos) mostrada en la SEQ ID NO: 3. La Figura 1 provee una ilustración esquemática de la PC humana y su forma activada, la aPC. La PC humana contiene 9 residuos de Gla y 4 sitios potenciales para la glicosilación ligada a N. La cadena liviana contiene el dominio Gla y 2 dominios tipo EGF. La cadena pesada aloja un dominio serina proteasa activo.

La PC circula normalmente a 3-5 ug/ml (~65 nM) en la sangre humana sana y su vida media es de 6 a 8 horas. La forma predominante del zimógeno de la PC circulante es la forma heterodimérica. La cadena liviana de la PC contiene un dominio rico en ácido gamma-carboxi glutámico (Gla) (45aa), dos dominios tipo EGF (46aa) y las secuencias ligadoras. La cadena pesada de la PC aloja un “péptido de activación” altamente polar de 12 aa y un dominio catalítico con una tríada catalítica de serina proteasa típica.

La PC humana sufre amplias modificaciones postraduccionales incluyendo la glicosilación, la gamma-carboxilación dependiente de la vitamina K y la gamma-hidroxilación (1-2). Contiene 23 % de carbohidratos (en peso) y 4 sitios de glicosilación ligada a N potenciales (uno en la cadena liviana Asn97 y tres en la cadena pesada Asn248/313/329). Su dominio Gla contiene 9 residuos Gla y es responsable de la ligadura dependiente de calcio de la PC a las membranas de fosfolípidos cargadas negativamente. El dominio Gla también puede unirse al receptor de la proteína C endotelial (EPCR), que alinea la trombina y la trombomodulina en la membrana endotelial durante la activación de la PC.

El zimógeno de la proteína C es convertido normalmente a su enzima activa -la proteína activada C (aPC) para tener potencia biológica. La actividad de la vía de la PC es controlada por la tasa de activación de la PC e inactivación de la aPC. La activación de la PC ocurre en la superficie de las células endoteliales en un proceso de dos etapas. Requiere la unión de la PC (vía dominio Gla) a la EPCR en las células endoteliales, seguido por la activación proteolítica de la PC a través de los complejos trombina/ trombomodulina. Una sola escisión en Arg12 de la cadena pesada de la PC humana, que es catalizada por la trombina/trombomodulina en la superficie celular endotelial, libera la AP de 12 aa y convierte el zimógeno de la PC en la aPC, una serina proteasa activa. Así, la principal diferencia entre las secuencias de aminoácidos de la PC y la aPC es la presencia de un péptido de activación de 12 aa en la PC que está ausente en la APC. La activación de la PC a la aPC también induce cambios conformacionales; en consecuencia sólo la aPC, no la PC, puede ser marcada por benzamidina o con el inhibidor de péptidos clorometilcetona (CMK) en su sitio activo enzimático. La estructura cristalina de la aPC sin el dominio Gla en un complejo con el inhibidor de CMK se resolvió recientemente. El principal inactivador de la aPC en el plasma humano es el inhibidor de la proteína C (PCI) presente en 100 nM en el plasma humano, un miembro de la superfamilia de la serpina. Bajo condiciones fisiológicas, la aPC circula a una concentración muy baja (1-2 ng/ml o 40 pM) en la sangre humana con una vida media de 20-30 min.

La vía de la proteína C sirve como un mecanismo de defensa natural contra la trombosis. Difiere de otros anticoagulantes en que es un sistema como se requiera que puede amplificar la respuesta del anticoagulante a medida que aumenta la respuesta del coagulante. Despues de una lesión, la trombina es generada para la coagulación. Al mismo tiempo, la trombina también activa una respuesta anticoagulante mediante la unión a la trombomodulina que se encuentra sobre la superficie vascular y esto promueve la activación de la proteína C. Así, la generación de la aPC es aproximadamente proporcional a la concentración de trombina y los niveles de PC.

La importancia fisiológica de la vía de la proteína C como regulador clave del proceso de coagulación se demuestra por 3 hallazgos clínicos: (a) severas complicaciones trombóticas asociadas con la deficiencia de la proteína C y la capacidad para corregir el defecto del suplemento de la proteína C, (b) trombofilia familiar asociada con deficiencias del cofactor de la proteína C (proteína S); y (c) riesgo trombótico asociado con las mutaciones heredadas en su sustrato (Factor V Leiden R506Q) que lo hacen resistente a la escisión por la aPC (Bernard, GR et.al. N Engl J Med 2001, 344:699-709 revisión).

Al contrario que los otros factores de coagulación dependientes de la vitamina K, la aPC funciona como un anticoagulante por la inactivación proteolítica de dos cofactores de coagulación, el Factor Va y el Villa, inhibiendo de este modo la generación de trombina. Como resultado de los niveles disminuidos de trombina, las respuestas inflamatoria, procoagulante y antifibrinolítica, inducidas por la trombina, son reducidas. La aPC también contribuye directamente a la respuesta fibrinolítica aumentada por la formación del complejo con los inhibidores del activador del plasminógeno (PAI).

Además de sus funciones anticoagulantes, la aPC induce efectos citoprotectores, incluyendo las actividades antiinflamatorias y antiapoptóticas y la protección de la función de barrera endotelial. Estos efectos citoprotectores directos de la aPC sobre las celulas requieren la EPCR y el receptor acoplado a la proteína G, el receptor-1 activado por proteasa (PAR-1). Así, la aPC promueve la fibrinólisis e inhibe la trombosis y la inflamación. Las funciones anticoagulantes y citoprotectoras de la aPC parecen ser separables. La mayoría de los efectos citoprotectores son principalmente independientes de la actividad anticoagulante de la aPC y se han generado mutantes de aPC con mínima actividad anticoagulante y actividad citoprotectora anormal. Igualmente, también se han informado mutantes de la aPC hiperanticoagulantes pero no citoprotectoras.

El extremo terminal C de la cadena liviana de aPC también es una región altamente cargada que comprende los residuos Gly142-Leu155 en el lado opuesto del sitio activo en el dominio de proteasa. La E149A-aPC tenía una actividad amidolítica que no se puede distinguir de la aPC tipo salvaje, pero tenía un aumento de más de 3 veces de la actividad anticoagulante en los ensayos de coagulación del tiempo de tromboplastina parcial activada (aPTT) debido a la mayor sensibilidad a la actividad del cofactor de la proteína S. La E149A-aPC mostró una actividad anticoagulante hiperactiva en los ensayos de coagulación plasmáticos así como también una potencia antitrombótica hiperactiva in vivo. Esta muíante también tenía actividades citoprotectora y de reducción de la mortalidad reducidas en un modelo murino de endotoxemia letal inducido por LPS. Esto sugiere que la actividad citoprotectora de la aPC es requerida para reducir la mortalidad en el modelo murino. Por contraste, la actividad anticoagulante de la aPC no es necesaria ni suficiente para la reducción de la mortalidad. La aPC se ha usado para tratar la sepsis, una condición de riesgo para la vida asociada con hipercoagulación y reacciones inflamatorias generalizadas. Un efecto colateral severo de la terapia con aPC en la sepsis es una importante hemorragia que ocurre en el 2 % de los pacientes. Este severo efecto colateral limita su uso clínico.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Se proveen anticuerpos monoclonales a la proteína C humana activada (aPC). En por lo menos una forma de realización, los anticuerpos monoclonales anti-aPC presentan una unión mínima a la proteína C, que es el zimógeno de la aPC.

En algunas formas de realización, los anticuerpos monoclonales a la aPC provistos han sido optimizados, por ejemplo, para aumentar la afinidad, para aumentar la actividad funcional o para reducir la divergencia de una secuencia de línea germinal.

Tambien se proveen epítopes específicos en la aPC humana unidos por un anticuerpo monoclonal aislado. Se proveen además moléculas de ácidos nucleicos aisladas que los codifican.

También se proveen composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos monoclonales anti-aPC y métodos de tratamiento de deficiencias genéticas y adquiridas o defectos en la coagulación tales como hemofilia A y B. También se proveen métodos para acortar el tiempo de sangrado administrando un anticuerpo monoclonal anti-aPC a un paciente que lo necesita. También se proveen métodos para producir un anticuerpo monoclonal que se une a la aPC humana.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS El experto en la téenica comprenderá que los dibujos descriptos más abajo tienen un propósito ilustrativo solamente. Los dibujos no pretenden limitar el alcance de las presentes enseñanzas de ningún modo.

La Figura 1 muestra un dibujo esquemático de la proteína C humana activada en su forma heterodimérica madura.

La Figura 2 muestra un alineamiento de secuencias de aminoácidos de CDR de cadena pesada y cadena liviana entre 10 Fabs anti-aPC identificados de la biblioteca de anticuerpos Fab humanos.

La Figura 3 ilustra un gráfico que caracteriza Fabs anti-APC por ELISA directo. Una placa de ELISA fue recubierta con PC humana (hPC), aPC humana (hAPC), aPC de perro (dAPC), aPC de ratón (mAPC) a 100 ng por cavidad. Los Fabs purificados indicados en el eje X se agregaron a la placa a 20 nM (1 ug/ml). El Fab ligado fue detectado por el anticuerpo secundario (Fab-HRP antihumano) seguido por un sustrato de HRP AmplexRed. Los Fabs purificados se unen preferentemente a la aPC humana y, con la excepción de Fab R41C17, muestran poca unión, o ninguna, a la PC humana. Un Fab T46J23 también mostró una reducida unión a la aPC de ratón.

La Figura 4 muestra una selectividad de unión de los Fabs anti-aPC por ELISA.

La Figura 5 ilustra un gráfico que muestra la inhibición de la formación de coágulos de plasma humano normal de una manera dependiente de la dosis por aPTT por distribución en la aPC humana. El 50 % del plasma normal humano reunido formó coágulos en 52 segundos. La preincubación de la aPC humana a 100, 200, 400, 800 ó 1600 ng/ml con el plasma prolongó el tiempo de coagulación de una manera dependiente de la dosis. Se observó una potencia casi idéntica para la aPC humana recombinante (rh-APC) y la aPC humana derivada de plasma (pdh-APC).

La Figura 6 ilustra gráficos que muestran que los Fabs anti-aPC inhiben la aPC humana e inducen la formación de coágulos en el plasma normal humano. La aPC humana a 400 ng/ml prolongó el tiempo de coagulación plasmático de 52 segundos a 180 segundos. La incubación de un anticuerpo control (Control) o su Fab (Control-Fab) o Fabs seleccionados a 0, 0,5, 1, 2, 5, 10 ó 20 ug/ml con aPC redujo el tiempo de coagulación de una manera dependiente de la dosis (panel superior). Tres Fabs (R41E3, C22J13, Control-Fab) también fueron testeados a 40 ug/ml para determinar un efecto mayor (panel inferior).

La Figura 7 muestra que Fabs anti-aPC inhiben la aPC de perro e inducen la formación de coágulos en aPTT.

La Figura 8 muestra el efecto de los Fabs anti-aPC en la actividad amidolítica de la aPC. La proteína aPC humana (20 nM) fue preincubada primero con un volumen igual de Fab anti-aPC (1-3000 nM) a temperatura ambiente durante 20 min antes de agregar el sustrato cromógeno SPECTROZYME PCa a la mezcla de reacción hasta 1 mM. La actividad amidolítica de la aPC humana a una concentración final de 10 nM fue medida en presencia de los Fabs. Las tasas de hidrólisis fueron inhibidas en presencia de los Fabs, alcanzando una reducción máxima del 80 %.

La Figura 9 muestra el efecto de los Fabs anti-aPC sobre la actividad de inactivación del Factor Va (FVa) de aPC.

La Figura 10 muestra la especificidad de unión de las lgG1 humanas anti-aPC y muestra la reactividad cruzada de especies de las lgG1 humanas anti-aPC por ELISA. Una placa de ELISA fue recubierta con PC humana (hPC), aPC humana (hAPC), aPC de perro, aPC de ratón, aPC de conejo a 1 ug/ml. IgG purificadas (20 nM) fueron agregadas a la placa. Se detectó IgG humana por el anticuerpo secundario (IgG-HRP antihumana) seguido por el sustrato HRP AmplexRed. Cinco lgG1 humanas anti-aPC reaccionan en forma cruzada con aPCs de perro y de conejo y una lgG1 tambien se une a la aPC de ratón.

La Figura 11 muestra el efecto de IgG anti-aPC sobre la actividad amidolítica de las aPCs de las especies - (a) humana, (b) de conejo, (c) de perro y (d) de ratón. La proteína aPC (20 nM) se preincubó primero con un volumen igual de hlgG1 anti-aPC (1-1000 nM) a temperatura ambiente durante 20 min antes de agregar el sustrato cromógeno SPECTROZYME PCa a la mezcla de reacción hasta 1 mM. La actividad amidolítica de la aPC a una concentración final de 10 nM se midió en presencia de los Fabs. Las tasas de hidrólisis fueron inhibidas en presencia de las IgG. Se usó un anticuerpo control negativo (anti-CTX-hlgG1).

La Figura 12 muestra que las hlgG1 anti-aPC acortan el tiempo de coagulación e inducen la coagulación en los ensayos de coagulación de plasma humano (aPTT).

La Figura 13 muestra el efecto de la lgG1 anti-aPC sobre el plasma de un paciente con hemofilia severa. En presencia de celulas endoteliales y trombomodulina, la PC es activada a la aPC y reduce la generación de trombina. A diferencia del Ab control, el anticuerpo anti-aPC inhibe rápidamente esta aPC recién generada y aumenta la generación de trombina 5 a 10 veces. La mayor generación de trombina llevará a una coagulación mejorada en pacientes con coagulopatía.

La Figura 14 muestra un perfil de actividad de variantes del anticuerpo anti-aPC. En forma similar al anticuerpo parental, C25K23, tales variantes (a) se unen a la aPC con alta afinidad, (b) inhiben en forma potente la actividad de la aPC en el sistema purificado y (c) acortan el tiempo de coagulación llevando a la coagulación en el ensayo de coagulación del plasma humano.

La Figura 15 muestra un esquema que ilustra que la estructura compleja fue refinada a un Rtrabajo= 0,201, Riibre = 0,241 final. Los paneles izquierdo y derecho muestran la misma estructura compleja con un cambio de rotación de 90°. El bucle HCDR3 del Fab C25K23 tiene amplias interacciones con la cadena pesada de la aPC.

La Figura 16 muestra en el panel izquierdo una vista ampliada de interacciones alrededor del residuo Trp104 en el bucle CDR3 de la cadena pesada del Fab C25K23. Bloquea la accesibilidad del sitio activo de la aPC (residuos catalíticamente importantes His57, Asp102 y Ser195). El panel derecho muestra que el Fab C25K23 inhibe la actividad de la aPC de una manera similar al inhibidor PPACK debido a que Trp104 y PPACK ocupan la misma región en el sitio activo.

La Figura 17 muestra un gráfico que ilustra anticuerpos anti-aPC, en las formas Fab e IgG, uniéndose o no a la aPC bloqueada en el sitio activo por ELISA.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Como se comentó más arriba, la presente divulgación provee anticuerpos, incluyendo anticuerpos monoclonales y otras proteínas de unión que se unen específicamente a la forma activada de la proteína C humana (aPC), pero presentan comparativamente poca reactividad o no presentan reactividad contra la forma de zimógeno de la proteína C humana (PC).

A los fines de este documento de patente, se usará la siguiente terminología con las definiciones indicadas a continuación.

Definiciones Cuando sea apropiado, los terminos usados en singular también incluirán el plural, y viceversa. En el caso de que cualquier definición indicada más abajo entre en conflicto con el uso de esa palabra en cualquier otro documento, incluyendo cualquier documento incorporado en la presente por referencia, la definición indicada más abajo será siempre el control a los fines de la interpretación de esta memoria y sus reivindicaciones asociadas a menos que se entienda claramente un sentido contrario (por ejemplo, en el documento en el cual se usó originalmente el término). El uso de "o" significa "y /o" a menos que se indique de otra manera. El uso de “un” en la presente significa “uno o más” a menos que se indique de otra manera o en donde el uso de “uno o más” es claramente inapropiado. El uso de “comprende”, “comprenden”, “que comprende”, “incluyen”, “incluye” y “que incluye” es indistinto y no es limitativo. Por ejemplo, la expresión “que incluye” debe significar “que incluye, pero sin limitación a”.

La expresión “proteína C” o “PC”, como se usa en la presente se refiere a cualquier variante, isoforma y/o especie homologa de la proteína C en su forma de zimógeno que es expresada naturalmente por células y presente en el plasma y es distinta de la forma activada de la proteína C.

La expresión “proteína C activada” o “aPC”, como se usa en la presente se refiere a una forma activada de la proteína C que está caracterizada por la ausencia de un peptido de activación de 12 aminoácidos presente en la proteína C.

Como se usa en la presente, un “anticuerpo” se refiere a un anticuerpo entero y cualquier fragmento de unión a antígenos (es decir, “porción que se une a un antígeno”) o una cadena simple de estos. El término incluye una molécula de inmunoglobulina de longitud completa (por ejemplo, un anticuerpo IgG) que se produce naturalmente o formado por procesos de recombinación de fragmentos de genes de inmunoglobulina normales, o una porción inmunológicamente activa de una molécula de inmunoglobulina, tal como un fragmento de anticuerpo que retiene la actividad de unión específica. Independientemente de la estructura, un fragmento de anticuerpo se une con el mismo antígeno que es reconocido por el anticuerpo de longitud completa. Por ejemplo, un fragmento de anticuerpo monoclonal anti-aPC se une a un epítope de aPC. La función de unión a antígenos de un anticuerpo puede ser realizada por fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Ejemplos de fragmentos de unión comprendidos en el término “porción de unión a antígenos” de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CHI; (ii) un fragmento F(ab’)2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fag unidos por un puente disulfuro en la región de bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CHI; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), que consiste en un dominio VH; (vi) una región determinante de complementariedad aislada (CDR); (vii) minicuerpos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y cuerpos kappa (ver, por ejemplo, III et al., Protein Eng 1997;10:949-57); (viii) IgG de camello; y (ix) IgNAR. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, son codificados por genes separados, pueden ser unidos, usando métodos recombinantes, por un ligador sintético que les permite ser hechos como una sola cadena de proteína en la cual las regiones VL y VH se aparean para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena única (scFv); ver por ejemplo, Bird etal. (1988) Science 242:423-426; y Huston et al (1988) Proc. Nati. Acad.

Sc¡. USA 85:5879-5883). Tales anticuerpos de cadena única tambien están comprendidos en la expresión “porción de unión a antígenos” de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpos son obtenidos usando téenicas convencionales conocidas por los expertos en el arte y los fragmentos son analizados con respecto a la utilidad de la misma manera que los anticuerpos intactos.

Además, se considera que un fragmento de unión a antígenos puede estar comprendido en un anticuerpo-mimético. La expresión “anticuerpo-mimético” o “mimético”, como se usa en la presente significa una proteína que presenta una unión similar a un anticuerpo pero es un anticuerpo alternativo más pequeño o una proteína que no es un anticuerpo. Tal anticuerpo-mimético puede estar comprendido en un andamio. El término “andamio” se refiere a una plataforma de polipéptidos para la ingeniería de nuevos productos con funciones y características a medida.

Como se usa en la presente, la expresión “anticuerpo anti-aPC” se refiere a un anticuerpo que se une específicamente a un epítope de aPC. Cuando se unen in vivo a un epítope de aPC, los anticuerpos anti-aPC divulgados en la presente aumentan uno o más aspectos de la cascada de coagulación sanguínea.

Como se usan en la presente, las expresiones “inhibe la unión” y “bloquea la unión” (por ejemplo, con referencia a la inhibición/bloqueo de la unión del sustrato de aPC a la aPC) se usan en forma indistinta y comprenden tanto la inhibición o el bloque parcial como el completo de una proteína con su sustrato, tal como una inhibición o bloqueo por al menos aproximadamente 10 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 %, aproximadamente 99 %, o aproximadamente 100 %. Como se usa en la presente, “aproximadamente” significa +/- 10 % el valor numérico indicado.

Con referencia a la inhibición y/o el bloqueo de la unión del sustrato de aPC a la aPC, los terminos inhibición y bloqueo también incluyen cualquier disminución mensurable en la afinidad de unión de la aPC a un sustrato fisiológico cuando se encuentra en contacto con un anticuerpo anti-aPC en comparación con la aPC que no está en contacto con un anticuerpo anti-aPC, por ejemplo, el bloqueo de la interacción de aPC con sus sustratos, incluyendo el Factor Va o con el Factor Villa, por al menos aproximadamente 10 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 %, aproximadamente 99 %, o aproximadamente 100 %.

Las expresiones “anticuerpo monoclonal” o “composición de anticuerpo monoclonal”, como se usa en la presente, se refiere a un preparado de moléculas de anticuerpos de composición molecular simple. Una composición de anticuerpo monoclonal presenta una sola especificidad de unión y afinidad por un epítope particular. Por consiguiente, el término “anticuerpo monoclonal humano” se refiere a anticuerpos que presentan una sola especificidad de unión que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulinas de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulinas de la línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis al azar o específica de un sitio in vitro o por mutación somática in vivó).

Un “anticuerpo aislado”, como se usa en la presente, se refiere a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otras moléculas biológicas, incluyendo anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une a la aPC está sustancialmente libre de anticuerpos que se unen a antígenos distintos de la aPC). En algunas formas de realización, el anticuerpo aislado es al menos aproximadamente 75 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 99 %, aproximadamente 99,9 % o aproximadamente 100 % puro en peso seco. En algunas formas de realización, la pureza puede ser medida por un metodo tal como cromatografía en columna, electroforesis en gel de poliacrilamida o análisis de HPLC. Un anticuerpo aislado que se une a un epítope, isoforma o variante de la aPC humana puede tener, sin embargo, reactividad cruzada con otros antígenos relacionados, por ejemplo, de otras especies (por ejemplo, aPC de homólogos de especies). Además, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o sustancias químicas. Como se usa en la presente, “unión específica” se refiere a un anticuerpo que se une a un antígeno predeterminado. Normalmente, un anticuerpo que presenta una “unión específica” se une a un antígeno con una afinidad de por lo menos aproximadamente 105 M 1 y se une a ese antígeno con una afinidad que es mayor, por ejemplo, por lo menos dos veces mayor, que su afinidad de unión por un antígeno irrelevante (por ejemplo, BSA, caseína). Las frases “un anticuerpo que reconoce un antígeno” y “un anticuerpo específico para un antígeno” se usan en forma intercambiable en la presente con la expresión “un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno”.

Como se usa en la presente, la expresión “unión mínima” se refiere a un anticuerpo que no se une y/o presenta baja afinidad por un antígeno especificado. Normalmente, un anticuerpo que tienen una unión mínima a un antígeno se une a ese antígeno con una afinidad que es menor que aproximadamente 102 M 1 y no se une a un antígeno predeterminado con mayor afinidad que lo que se une a un antígeno irrelevante.

Como se usa en la presente, la expresión “alta afinidad” por un anticuerpo, tal como un anticuerpo IgG se refiere a una afinidad de unión de por lo menos aproximadamente 107M 1, en por lo menos una forma de realización por lo menos aproximadamente 108M 1, en algunas formas de realización por lo menos aproximadamente 109M 1, 101°M 1, 1011M 1 o más, por ejemplo, hasta 1013M_1 o más. Sin embargo, la unión de “alta afinidad” puede variar para otros isotipos de anticuerpos. Por ejemplo, unión de “alta afinidad” para un isotipo IgM se refiere a una afinidad de unión de por lo menos aproximadamente 107M·1. Como se usa en la presente, “isotipo” se refiere a la clase de anticuerpo (por ejemplo, IgM o lgG1) que está codificada por los genes de la región constante de la cadena pesada.

“Región determinante de complementariedad” o “CDR” se refiere a una de tres regiones hipervariables dentro de la región variable de la cadena pesada o la región variable de la cadena liviana de una molecula de anticuerpo que forma la superficie que se une al antígeno N-terminal que es complementaria a la estructura tridimensional del antígeno ligado. Procediendo del extremo N terminal de una cadena pesada o una cadena liviana, estas regiones determinantes de complementariedad se denotan como “CDR1”, “CDR2” y “CDR3”, respectivamente [Wu TT, Kabat EA, Bildesky H, Proc Nati Acad Sci U S A. 1975 Dec; 72(12):5107 y Wu TT, Kabat EA, J Exp Med. 1970 Aug 1 ;132(2):211]. Las CDR están involucradas en la unión antígeno-anticuerpo y la CDR3 comprende una única región específica para la unión antígeno-anticuerpo. Un sitio de unión al antígeno, por lo tanto, puede incluir seis CDR, que comprenden las regiones CDR de cada una de una región V de la cadena pesada y la cadena liviana.

El término “epítope” se refiere al área o región de un antígeno a la cual un anticuerpo se une específicamente o interactúa, que en algunas formas de realización indica en donde el antígeno se encuentra en contacto físico con el anticuerpo. A la inversa, el término “paratopo” se refiere al área o región del anticuerpo a la cual se une específicamente el antígeno. Se dice que los epítopes caracterizados por unión competitiva se superponen si la unión de los anticuerpos correspondientes es mutuamente exclusiva, es decir, la unión de un anticuerpo excluye la unión simultánea de otro anticuerpo. Se dice que los epítopes son separados (únicos) si el antígeno es capaz de acomodar la unión de ambos anticuerpos correspondientes simultáneamente.

La expresión “anticuerpos competitivos”, tal como se usa en la presente, se refiere a anticuerpos que se unen a aproximadamente, sustancialmente o esencialmente el mismo, o incluso el mismo epítope que un anticuerpo contra la aPC, como se describió en la presente. “Anticuerpos competitivos” incluye los anticuerpos con especificidades de epítope superpuestas. Los anticuerpos competitivos son así capaces de competir efectivamente con un anticuerpo como se describió en la presente para unirse a una aPC. En algunas formas de realización, el anticuerpo competitivo puede unirse al mismo epítope que el anticuerpo descripto en la presente. Visto alternativamente, el anticuerpo competitivo tiene la misma especificidad por el epítope que el anticuerpo descripto en la presente.

Como se usa en la presente, “sustituciones conservadoras” se refiere a modificaciones de un polipéptido que involucra la sustitución de uno o más aminoácidos para los aminoácidos que tienen propiedades bioquímicas similares que no dan por resultado la pérdida de una función biológica o bioquímica del polipéptido. Una “sustitución de aminoácidos conservadora” es una en la cual el residuo de aminoácido es reemplazado con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares han sido definidas en el arte. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales con ramificaciones beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Los anticuerpos de la presente divulgación pueden tener una o más sustituciones de aminoácidos conservadoras, pero retienen la actividad ligante de antígenos.

Para los ácidos nucleicos y polipéptidos, el término “homología sustancial” indica que dos ácidos nucleicos o dos polipéptidos, o sus secuencias designadas, cuando están óptimamente alineadas y comparadas, son idénticas, con inserciones o deleciones de nucleótidos o aminoácidos apropiadas, en por lo menos aproximadamente 80 % de los nucleótidos o aminoácidos, usualmente por lo menos aproximadamente 85 %, en algunas formas de realización aproximadamente 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 % o 95 %, en por lo menos una forma de realización por lo menos aproximadamente 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,1 %, 99,2 %, 99,3 %, 99,4 % o 99,5 % de los nucleótidos o aminoácidos. Alternativamente, la homología sustancial para los ácidos nucleicos existe cuando los segmentos se hibridarán bajo condiciones de hibridación selectivas al complemento de la hebra. Tambien están incluidas las secuencias de ácidos nucleicos y las secuencias de polipéptidos que tienen homología sustancial con respecto a las secuencias de ácidos nucleicos específicas y las secuencias mencionadas en la presente.

La identidad por ciento entre dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de homología = # de posiciones idénticas / número total de posiciones x 100), teniendo en cuenta el número de gaps y la longitud de cada gap, que tienen que ser introducidas para el alineamiento óptimo de las secuencias. La comparación de las secuencias y la determinación de la identidad por ciento entre dos secuencias se puede lograr usando un algoritmo matemático, tal como sin limitación el módulo AlignX™ de VectorNTI™ (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). Para AlignX™, los parámetros por defecto del alineamiento múltiple son: penalización por apertura del gap: 10; penalidad para la extensión de un gap: 0,05; rango de penalización para la separación de gaps: 8; % de identidad para el retardo de alineamiento: 40. (detalles adicionales se pueden hallar en http:bwww.invitroaen.com/site/us/en/home/LINNEA-Online-Guides/LINNEA-Communities/Vector-NTI-Communitv/Sequence-analvsis-and-data-manaqement-software-for-PCs/AlignX-Module-for-Vector-NTI-Advance.req.us.html).

Otro método para determinar la mejor adaptación general entre una secuencia problema (una secuencia de la presente divulgación) y una secuencia sujeto, también denominada alineamiento de secuencia global, puede ser determinada usando el programa de computadora CLUSTALW (Thompson et al., Nucleic Acids Research, 1994, 2(22): 4673-4680), que se basa en el algoritmo de Higgins et al., (Computer Applications in the Biosciences (CABIOS), 1992, 8(2): 189-191). En un alineamiento de secuencias las secuencias problema y sujeto son ambas secuencias de ADN. El resultado de dicho alineamiento de secuencias global está en identidad por ciento. Los parámetros que se pueden usar en un alineamiento CLUSTALW de las secuencias de ADN para calcular la identidad por ciento vía alineamientos de a pares son: Matriz = IUB, k-tuple = 1, Número de Diagonales superiores = 5, Penalización del gap = 3, Penalidad abierta del gap = 10, Penalización para la extensión del gap = 0,1. Para alineamientos múltiples, se pueden usar los siguientes parámetros CLUSTALW: Penalización por apertura del gap = 10, parámetro de extensión del gap = 0,05; rango de penalización para la separación del gap = 8; % de identidad por el retardo del alineamiento = 40.

Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en celulas enteras, en un lisado de células, o en una forma parcialmente purificada o sustancialmente pura. Un ácido nucleico es “aislado” o “hecho sustancialmente puro” cuando es purificado aparte de otros componentes celulares con los cuales normalmente está asociado en el ambiente natural. Para aislar un ácido nucleico, se pueden usar téenicas estándar, tales como las siguientes: tratamiento alcalino/SDS, formación de bandas CsCI, cromatografía en columna, electroforesis en gel de agarosa y otros bien conocidos en la técnica.

Anticuerpos monoclonales contra la proteína C activada La aPC es conocida por sus propiedades anticoagulantes. Los trastornos hemorrágicos en donde la homeostasis está desregulada en la hemofilia o en pacientes con traumas en donde la herida resulta en una pérdida temporal de la hemostasis, pueden ser tratados con los inhibidores de la aPC. Anticuerpos, sus fragmentos que se unen a antígenos y otros andamios de proteínas específicos de la aPC pueden ser usados para proveer especificidad de direccionamiento para inhibir un subconjunto de funciones de las proteínas de aPC mientras conservan el resto. Dada la diferencia de por lo menos 1000 veces en la concentración plasmática de aPC (<4 ng/ml) versus PC (4 ug/ml), la mayor especificidad de cualquier terapéutica con un inhibidor de aPC potencial ayuda a bloquear la función de la aPC en presencia de un alto exceso circulante de PC.

Los anticuerpos específicos de aPC que bloquean la función anticoagulante de la aPC se pueden usar como una terapéutica para los pacientes con trastornos hemorrágicos, incluyendo, por ejemplo, hemofilia, pacientes con hemofilia que reciben inhibidores, coagulopatía inducida por traumas, pacientes con hemorragia severa durante el tratamiento de sepsis por aPC, hemorragia resultante de una cirugía electiva tal como trasplante, cirugía cardiaca, cirugía ortopédica, o hemorragia excesiva por menorragia.

Los anticuerpos anti-aPC que tienen una vida media circulante prolongada pueden ser útiles en el tratamiento de las enfermedades crónicas como la hemofilia. Los fragmentos de anticuerpos aPC o andamios de proteínas que se unen a aPC con vidas medias más cortas pueden ser más efectivos para el uso agudo (por ejemplo uso terapéutico en trauma). Como la aPC es una proteína multifunción, los bloqueadores selectivos de la función de la aPC (SAFB) incluyendo los anticuerpos, los fragmentos de anticuerpos que se unen a antígenos, los andamios de proteínas específicos de aPC con mayor afinidad y especificidad de direccionamiento pueden bloquear selectivamente sólo una función de la aPC sin afectar otras funciones de la aPC.

Los anticuerpos que se unen a la aPC fueron identificados por paneo y rastreo de bibliotecas de anticuerpos humanos contra la aPC humana. Los anticuerpos identificados no presentaron una unión a la PC humana, o sólo presentaron una unión mínima. La región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena liviana de cada anticuerpo monoclonal aislado fue secuenciada y se identificaron sus regiones CDR. Los números identificadores de secuencias (“SEQ ID NO”) que corresponden a las regiones de la cadena pesada y de la cadena liviana de cada uno de los anticuerpos monoclonales específicos de aPC se resumen en la Tabla 1.

Tabla 1. Anticuerpos anti-aPC humanos En una forma de realización, se provee un anticuerpo monoclonal aislado que se une a proteína C activada humana (aPC, por sus siglas en ingles Human Activated Protein C) e inhibe la actividad anticoagulante pero tiene unión mínima a la proteína C no activada, en donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID Nos: 14-23.

En otra forma de realización, se provee un anticuerpo monoclonal aislado que se une a proteína C activada humana (aPC) e inhibe la actividad anticoagulante pero tiene unión mínima a proteína C no activada, en donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID Nos: 4-13.

En otra forma de realización, se provee un anticuerpo monoclonal aislado que se une a proteína C activada humana (aPC) e inhibe la actividad anticoagulante pero tiene unión mínima a proteína C no activada, en donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID Nos: 14-23 y una región variable de cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID Nos: 4-13.

En otras formas de realización, el anticuerpo comprende regiones variables de cadenas pesadas y livianas que comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 y una región variable de cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; (b) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 y una región variable de cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; (c) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 y una región variable de cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; (d) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 y una región variable de cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; (e) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 y una región variable de cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; (f) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 y una región variable de cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; (g) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 y una región variable de cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; (h) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 y una región variable de cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; (i) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 y una región variable de cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; y (j) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 y una región variable de cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13.

En la Tabla 2, se ilustra un resumen de SEQ ID Nos para las regiones CDR (“CDR1”, “CDR2” y “CDR3”) de cada cadena pesada y liviana de los anticuerpos monoclonales que se unen a aPC humana.

Tabla 2. Identificadores de secuencia para las regiones CDR de anticuerpos anti- aPC humana 5 En una forma de realización, se provee un anticuerpo monoclonal aislado que se une a proteína C activada humana (aPC), en donde el anticuerpo comprende una CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NOs: 94-103. Estas CDR3s se identifican a partir de las cadenas pesadas de los anticuerpos identificados durante la selección y el cribado. En otra 0 forma de realización, este anticuerpo además comprende: (a) una CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NOs: 74-83, (b) una CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NOs: 84-93, o (c) tanto una CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que 5 consiste en SEQ ID NOs: 74-83 como una CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NOs: 84-93.

En otra forma de realización, se proveen anticuerpos que comparten una CDR3 de una de las cadenas livianas de los anticuerpos identificados durante la selección y 0 el cribado. Por ende, tambien se provee un anticuerpo monoclonal aislado, en donde dicho anticuerpo se une a proteína C activada e inhibe la actividad anticoagulante pero tiene unión mínima a proteína C no activada, en donde dicho anticuerpo comprende una CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NOs: 64-73. En otras formas de realización, el anticuerpo además comprende: (a) una CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NOs: 44-53, (b) una CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NOs: 54-63, o (c) tanto una CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NOs: 44-53 como una CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NOs: 54-63.

En otra forma de realización, el anticuerpo comprende una CDR3 de una cadena pesada y una cadena liviana de los anticuerpos identificados del cribado y la selección. Se provee un anticuerpo monoclonal aislado, en donde dicho anticuerpo se une a proteína C activada e inhibe la actividad anticoagulante pero tiene unión mínima a proteína C no activada, en donde dicho anticuerpo comprende una CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NOs: 94-103 y una CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NOs: 64-73. En otra forma de realización, el anticuerpo además comprende (a) una CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NOs: 74-83, (b) una CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NOs: 84-93, (c) una CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NOs: 44-53, y/o (d) una CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NOs: 54-63.

En algunas formas de realización, el anticuerpo comprende regiones variables de cadenas pesadas y livianas, que comprenden: (a) una región variable de cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NOs: 44, 54 y 64 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NOs: 74, 84 y 94; (b) una región variable de cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NOs: 45, 55 y 65 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NOs: 75, 85 y 95; (c) una región variable de cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NOs: 46, 56 y 66 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NOs: 76, 86 y 96; (d) una región variable de cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NOs: 47, 57 y 67 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NOs: 77, 87 y 97; (e) una región variable de cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NOs: 48, 58 y 68 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NOs: 78, 88 y 98; (f) una región variable de cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NOs: 49, 59 y 69 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NOs: 79, 89 y 99; (g) una región variable de cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NOs: 50, 60 y 70 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NOs: 80, 90 y 100; (h) una región variable de cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NOs: 51 , 61 y 71 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NOs: 81, 91 y 101; (i) una región variable de cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NOs: 52, 62 y 72 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NOs: 82, 92 y 102; y (j) una región variable de cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NOs: 53, 63 y 73 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NOs: 83, 93 y 103.

Tambien se provee un anticuerpo monoclonal aislado que se une a proteína C activada e inhibe la actividad anticoagulante pero tiene unión mínima a proteína C no activada, en donde dicho anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 99,5 % de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos establecidas en SEQ ID NO: 4-13.

También se provee un anticuerpo monoclonal aislado que se une a proteína C activada e inhibe la actividad anticoagulante pero tiene unión mínima a proteína C no activada, en donde dicho anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 99,5 % de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos establecidas en SEQ ID NO: 14-23.

El anticuerpo puede ser específico de especie o reaccionar de forma cruzada con múltiples especies. En algunas formas de realización, el anticuerpo puede específicamente reaccionar o reaccionar de forma cruzada con una aPC de humano, ratón, rata, conejo, cobayo, mono, cerdo, perro, gato u otra especie de mamífero.

El anticuerpo puede ser cualquiera de las varias clases de anticuerpos, tales como, sin limitación, un anticuerpo de lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgM, lgA1, lgA2, IgA secretorio, IgD e IgE.

En una forma de realización, se provee anticuerpo monoclonal completamente humano aislado contra proteína C activada humana.

Variantes optimizadas de anticuerpos anti-aPC En algunas formas de realización, los anticuerpos seleccionados y cribados pueden ser optimizados, por ejemplo para incrementar la afinidad a aPC, para reducir adicionalmente cualquier afinidad a PC, para mejorar la reactividad cruzada con diferentes especies, o para mejorar la actividad de bloqueo de aPC. Dicha optimización se puede llevar a cabo, por ejemplo, al utilizar mutagenesis de saturación en sitio de las CDR o residuos de aminoácidos en estrecha proximidad con las CDR, es decir aproximadamente 3 ó 4 residuos adyacentes a las CDR, de los anticuerpos.

También se proveen anticuerpos monoclonales que tienen alta afinidad, o afinidad incrementada a aPC. En algunas formas de realización, los anticuerpos anti-aPC tienen afinidad de unión de al menos aproximadamente 107M 1 ; en algunas formas de realización, al menos aproximadamente 108M 1; en algunas formas de realización, al menos aproximadamente 109M 1, 1010M 1, 1011M 1 o más, por ejemplo, hasta 1013M 1 o más.

En algunas formas de realización, es posible introducir modificaciones de aminoácidos adicionales para reducir la divergencia respecto de la secuencia de línea germinal. En otras formas de realización, es posible introducir modificaciones de aminoácidos para facilitar la producción de anticuerpos para procesos de producción en gran escala.

En algunas formas de realización, se proveen anticuerpos monoclonales anti-aPC aislados que se unen específicamente a proteína C activada humana; dichos anticuerpos comprenden una o más modificaciones de aminoácidos. En algunas formas de realización, el anticuerpo comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 o más modificaciones.

Por consiguiente, en algunas formas de realización, se provee un anticuerpo monoclonal aislado que se une a proteína C activada humana, en donde el anticuerpo comprende una cadena liviana que comprende la secuencia de aminoácidos ilustrada en SEQ ID NO: 8, en donde la secuencia de aminoácidos comprende una o más modificaciones de aminoácidos. En algunas formas de realización, la modificación de la cadena liviana es una sustitución, una inserción o una deleción. En algunas formas de realización, las modificaciones se ubican en las CDR de la cadena liviana. En otras formas de realización, las modificaciones se ubican fuera de las CDR de la cadena liviana.

En algunas formas de realización, la modificación de la cadena liviana de SEQ ID NO:8 se encuentra en una posición seleccionada entre G52, N53, N54, R56, P57, S58, Q91, Y93, S95, S96, L97, S98, G99, S100 y V101. La modificación puede ser, por ejemplo, una de las siguientes sustituciones: G52S, G52Y, G52H, G52F, N53G, N54K, N54R, R56K, P57G, P57W, P57N, S58V, S58F, S58R, Q91R, Q91G, Y93W, S95F, S95Y, S95G, S95W, S95E, S96G, S96A, S96Y, S96W, S96R, L97M, L97G, L97R, L97V, S98L, S98W, S98V, S98R, G99A, G99E, S100A, S100V, V101Y, V101L o V101E. Asimismo, en algunas formas de realización, el anticuerpo puede comprender dos o más sustituciones entre G52S, G52Y, G52H, G52F, N53G, N54K, N54R, R56K, P57G, P57W, P57N, S58V, S58F, S58R, Q91R, Q91G, Y93W, S95F, S95Y, S95G, S95W, S95E, S96G, S96A, S96Y, S96W, S96R, L97M, L97G, L97R, L97V, S98L, S98W, S98V, S98R, G99A, G99E, S100A, S100V, V101Y, V101L o V101E.

En algunas formas de realización, las cadena liviana de SEQ ID NO:8 además comprende una modificación en una o más de las posiciones seleccionadas entre A10, T13, S78, R81 y S82. En algunas formas de realización, la modificación en la posición A10 en la cadena liviana es A10V. En algunas formas de realización, la modificación en la posición T13 en la cadena liviana es T13A. En algunas formas de realización, la modificación en la posición S78 en la cadena liviana es S78T. En algunas formas de realización, la modificación en la posición R81 en la cadena liviana es R81Q. En algunas formas de realización, la modificación en la posición S82 en la cadena liviana es S82A. En algunas formas de realización, la cadena liviana de SEQ ID NO:8 comprende dos o más de las modificaciones A10V, T13A, S78T, R81Q y S82A. En algunas formas de realización, la cadena liviana de SEQ ID NO:8 comprende todas las modificaciones A10V, T13A, S78T, R81Q y S82A.

En otras formas de realización, se provee un anticuerpo monoclonal aislado que se une específicamente a una forma activada humana de proteína C, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos ilustrada en la SEQ ID NO: 18, en donde la secuencia de aminoácidos comprende una o más modificaciones de aminoácidos. En algunas formas de realización, la modificación de la cadena liviana es una sustitución, una inserción o una deleción.

En algunas formas de realización, la cadena pesada de SEQ ID NO:18 además comprende una modificación en la posiciones N54 o S56. En algunas formas de realización, la modificación en la posición N54 de la cadena pesada es N54G, N54Q o N54A. En algunas formas de realización, la modificación en la posición S56 de la cadena pesada es S56A o S56G.

En algunas formas de realización, es posible realizar modificaciones de aminoácidos con el objeto de facilitar la producción de anticuerpos para procesos de producción en gran escala. Por ejemplo, en algunas formas de realización, es posible realizar modificaciones para reducir la región de superficie hidrófoba de anticuerpos para las propiedades biofísicas mejoradas (por ejemplo agregación/pegajosidad mínima). En algunas formas de realización, es posible realizar modificaciones adicionales en la cadena liviana de SEQ ID NO: 8. En algunas formas de realización, la modificación de la cadena liviana de SEQ ID NO:8 está en la posición Y33. En algunas formas de realización, la modificación y Y33 en la cadena liviana es Y33A, Y33K o Y33D. En algunas formas de realización, las modificaciones adicionales se realizan en la cadena pesada de SEQ ID NO:18. En algunas formas de realización, las modificaciones de la cadena pesada de SEQ ID NO:18 se encuentran en una o más de las posiciones Y32, W33, W53 o W110. En algunas formas de realización, la modificación en la cadena pesada de SEQ ID NO:18 se selecciona entre Y32A, Y32K, Y32D, W33A, W33K, W33D, W53A, W53K, W53D, W110A, W110K o W110D.

En algunas formas de realización, se provee un anticuerpo monoclonal aislado que se une a proteína C activada humana, en donde el anticuerpo comprende una cadena liviana que tiene la secuencia de aminoácidos ilustrada en la SEQ ID NO: 108. En algunas formas de realización, se provee un anticuerpo monoclonal aislado que se une a proteína C activada humana, en donde el anticuerpo comprende una cadena liviana que tiene la secuencia de aminoácidos ilustrada en SEQ ID NO: 110. En algunas formas de realización, se provee un anticuerpo monoclonal aislado que se une a proteína C activada humana, en donde el anticuerpo comprende una cadena liviana que tiene la secuencia de aminoácidos ilustrada en SEQ ID NO: 112. En algunas formas de realización, se provee un anticuerpo monoclonal aislado que se une a proteína C activada humana, en donde el anticuerpo comprende una cadena liviana que tiene la secuencia de aminoácidos ilustrada en SEQ ID NO: 114. En algunas formas de realización, se provee un anticuerpo monoclonal aislado que se une a proteína C activada humana, en donde el anticuerpo comprende una cadena liviana que tiene la secuencia de aminoácidos que se ilustra en SEQ ID NO: 116. En algunas formas de realización, se provee un anticuerpo monoclonal aislado que se une a proteína C activada humana, en donde el anticuerpo comprende una cadena liviana que tiene la secuencia de aminoácidos que se ilustra en SEQ ID NO: 118.

En algunas formas de realización, se provee un anticuerpo monoclonal aislado que se une a proteína C activada humana, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos que se ¡lustra en SEQ ID NO: 109. En algunas formas de realización, se provee un anticuerpo monoclonal aislado que se une a proteína C activada humana, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos que se ilustra en SEQ ID NO: 111. En algunas formas de realización, se provee un anticuerpo monoclonal aislado que se une a proteína C activada humana, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos que se ilustra en SEQ ID NO: 113. En algunas formas de realización, se provee un anticuerpo monoclonal aislado que se une a proteína C activada humana, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos que se ilustra en SEQ ID NO: 115. En algunas formas de realización, se provee un anticuerpo monoclonal aislado que se une a proteína C activada humana, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos que se ilustra en SEQ ID NO: 117. En algunas formas de realización, se provee un anticuerpo monoclonal aislado que se une a proteína C activada humana, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos que se ilustra en SEQ ID NO: 119.

En algunas formas de realización, se provee un anticuerpo monoclonal aislado que se une a proteína C activada humana, en donde el anticuerpo comprende una cadena liviana que tiene la secuencia de aminoácidos que se ilustra en SEQ ID NO: 12, en donde la secuencia de aminoácidos comprende una o más modificaciones de aminoácidos. En algunas formas de realización, la modificación de la cadena liviana es una sustitución, una inserción o una deleción. En algunas formas de realización, las modificaciones se ubican en las CDR de la cadena liviana. En otras formas de realización, las modificaciones se encuentran fuera de las CDR de la cadena liviana.

En algunas formas de realización, la modificación de la cadena liviana de SEQ ID NO: 12 se encuentra en una posición seleccionada entre T25, D52, N53, N54, N55, D95, N98 o G99. La modificación puede ser, por ejemplo, una de las siguientes sustituciones: T25S, D52Y, D52F, D52L, D52G, N53C, N53K, N53G, N54S, N55K, D95G, N98S, G99H, G99L o G99F. Asimismo, en algunas formas de realización, el anticuerpo puede comprender dos o más sustituciones entre T25S, D52Y, D52F, D52L, D52G, N53C, N53K, N53G, N54S, N55K, D95G, N98S, G99H, G99L o G99F.

En otra forma de realización, se provee un anticuerpo monoclonal anti-aPC aislado que se une a la forma activada humana de Proteína C, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos que se ilustra en SEQ ID NO: 22, en donde la secuencia de aminoácidos comprende una o más modificaciones de aminoácidos. En algunas formas de realización, la modificación de la cadena liviana es una sustitución, una inserción o una deleción.

Epítopes Tambien se provee un anticuerpo monoclonal aislado que se une a un epítope de proteína C activada humana, en donde el epítope comprende uno o más de los residuos de la cadena pesada de aPC humana que se ilustra en SEQ ID NO:3.

En algunas formas de realización, el epítope puede incluir el sitio activo de aPC humana. En algunas formas de realización, el sitio activo puede comprender el residuo aminoácido S195 de aPC humana.

En algunas formas de realización, el epítope puede comprender uno o más residuos seleccionados entre D60, K96, S97, T98, T99, E170, V171, M172, S173, M175, A190, S195, W215, G216, E217, G218 y G218 de human proteína C activada que se ilustra en SEQ ID NO:3.

También se proveen anticuerpos que pueden competir con cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente para la unión a proteína C activada humana. Por ejemplo, dicho anticuerpo de competencia puede unirse a uno o más de los epítopes descritos con anterioridad. Ácidos nucleicos, vectores v células huésped También se proveen moléculas de ácido nucleico aislado que codifican cualquiera de los anticuerpos monoclonales tal como se describieron con anterioridad.

Por ende, se provee una molécula de ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo que se une a proteína C activada humana.

En algunas formas de realización, se proveen moléculas de ácido nucleico aislado que codifican un anticuerpo que se une a proteína C activada e inhibe la actividad anticoagulante pero tiene unión mínima a proteína C no activada, en donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID Nos: 34-43.

En algunas formas de realización, se proveen moléculas de ácido nucleico aislado que codifican un anticuerpo que se une a proteína C activada e inhibe la actividad anticoagulante pero tiene unión mínima a proteína C no activada, en donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena liviana que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID Nos: 24-33.

En algunas formas de realización, se proveen moléculas de ácido nucleico aislado que codifican un anticuerpo que se une a proteína C activada e inhibe la actividad anticoagulante pero tiene unión mínima a proteína C no activada, en donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID Nos: 14-23.

En algunas formas de realización, se proveen moléculas de ácido nucleico aislado que codifican un anticuerpo que se une una proteína C activada e inhibe la actividad anticoagulante pero tiene unión mínima a proteína C no activada, en donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID Nos: 4-13.

En otra forma de realización, se proveen moléculas de ácido nucleico aislado que codifican un anticuerpo que se une a proteína C activada e inhibe la actividad anticoagulante pero tiene unión mínima a proteína C no activada, en donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID Nos: 14-23 o una región variable de cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID Nos: 4-13 y una o más modificaciones de aminoácidos en la región variable de cadena pesada o región variable de cadena liviana.

Asimismo también se proveen vectores que comprenden las moléculas de ácido nucleico aislado que codifican cualquiera de los anticuerpos monoclonales tal como se describieron con anterioridad y las células huésped que comprenden dichos vectores.

Métodos de preparación de los anticuerpos a la aPC El anticuerpo monoclonal puede ser producido en forma recombinante expresando una secuencia de nucleótidos que codifica las regiones variables del anticuerpo monoclonal de acuerdo con una de las presentes formas de realización en una célula huésped. Con la ayuda de un vector de expresión, un ácido nucleico que contiene la secuencia de nucleótidos puede ser transfectado y expresado en una célula huésped adecuada para la producción. Por consiguiente, también se provee un método para producir un anticuerpo monoclonal que se une con la aPC humana que comprende: (a) transfectar una molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo monoclonal en una célula huésped, (b) cultivar la célula huésped de modo de expresar el anticuerpo monoclonal en la célula huésped y opcionalmente aislar y purificar el anticuerpo monoclonal producido, en donde la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo monoclonal.

En un ejemplo, para expresar los anticuerpos, o sus fragmentos de anticuerpos, los ADNs que codifican las cadenas pesada y liviana parciales o de longitud completa obtenidos por téenicas de biología molecular estándar son insertados en vectores de expresión de tal modo que los genes son unidos operativamente a secuencias control transcripcionales y traduccionales. En este contexto, la expresión “operativamente unidos” significa que un gen de anticuerpo está unido en un vector de tal modo que las secuencias control transcripcionales y traduccionales dentro del vector sirven a su función pretendida de regular la transcripción y traducción del gen del anticuerpo. El vector de expresión y las secuencias control de expresión son elegidas para ser compatibles con la célula huésped de expresión usada. El gen de cadena liviana del anticuerpo y el gen de cadena pesada del anticuerpo pueden ser insertados en vectores separados o, más habitualmente, ambos genes son insertados en el mismo vector de expresión. Los genes de anticuerpos son insertados en el vector de expresión por métodos estándar (por ejemplo, ligadura de los sitios de restricción complementarios en el vector y el fragmento del gen del anticuerpo, o ligadura del extremo romo si no hay sitios de restricción presentes). Las regiones variables de cadena liviana y de cadena pesada de los anticuerpos descriptos en la presente se pueden usar para crear genes de anticuerpos de longitud completa de cualquier isotipo de anticuerpo insertándolos en vectores de expresión que ya codifican regiones contantes de cadena pesada y regiones constantes de cadena liviana del isotipo deseado de tal modo que el segmento VH está unido operativamente a los segmentos CH dentro del vector y el segmento VL está unido operativamente al segmento CL dentro del vector. Adicionalmente o alternativamente, el vector de expresión recombinante puede codificar un péptido señal que facilita la secreción de la cadena del anticuerpo de una célula huésped. El gen de la cadena del anticuerpo puede ser clonado en el vector de tal modo que el péptido señal es unido en marco al extremo amino del gen de la cadena del anticuerpo. El péptido señal puede ser un péptido señal de inmunoglobulina o un péptido señal heterólogo (es decir, un péptido señal de una proteína que no es una inmunoglobulina).

Además de los genes que codifican las cadenas de los anticuerpos, los vectores de expresión recombinantes llevan secuencias reguladoras que controlan la expresión de los genes de las cadenas de los anticuerpos en una célula huésped. La expresión “secuencia reguladora” incluye promotores, intensificadores y otros elementos de control de expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación) que controlan la transcripción o la traducción de los genes de las cadenas de los anticuerpos. Tales secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel; Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990).

Los expertos en el arte apreciarán que el diseño del vector de expresión, incluyendo la selección de secuencias reguladoras puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped a ser transformada, el nivel de expresión de la proteína deseada, etc. Ejemplos de secuencias reguladoras para la expresión de la célula huésped de mamíferos incluyen los elementos virales que dirigen altos niveles de expresión de proteínas en células de mamíferos, tales como promotores y/o intensificadores derivados de citomegalovirus (C V), virus del simio 40 (SV40), adenovirus, (por ejemplo, el promotor tardío principal del adenovirus (AdMLP)) y el polioma. Alternativamente, se pueden usar secuencias reguladoras no virales, tales como el promotor de ubiquitina o el promotor de b-globina.

Además de los genes de las cadenas de los anticuerpos y las secuencias reguladoras, los vectores de expresión recombinantes pueden llevar secuencias adicionales, tales como secuencias que regulan la replicación del vector en las células huésped (por ejemplo, orígenes de replicación) y genes marcadores seleccionables. El gen marcador seleccionable facilita la selección de células huésped en las cuales se ha introducido el vector (ver, por ejemplo, las patentes U.S. Nros. 4.399.216, 4.634.665 y 5.179.017, todas de Axel et al.). Por ejemplo, normalmente el gen marcador seleccionable confiere resistencia a los fármacos, tales como G418, higromicina o metotrexato, en una célula huésped en la cual se ha introducido el vector. Ejemplos de genes marcadores seleccionables incluyen el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) (para usar en células huésped dhfr con selección/amplificación de metotrexato) y el gen neo (para la selección G418).

Para la expresión de las cadenas livianas y pesadas, el o los vectores de expresión que codifican las cadenas pesadas y livianas son transfectados en una célula huésped por téenicas estándar. Las diversas formas del término “transfección” comprenden una amplia variedad de técnicas comúnmente usadas para la introducción de ADN exógeno en una célula huésped procariótica o eucariótica, por ejemplo, electroporación, precipitación con fosfato de calcio, transfección con DEAE-dextrano, y similares. Aunque es teóricamente posible expresar los anticuerpos en células huésped procarióticas o eucarióticas, la expresión de los anticuerpos en las células eucarióticas, incluyendo las células huésped de mamíferos, es típica porque es más probable que tales células eucarióticas y en particular las células de mamíferos, en lugar de las células procarióticas, se reúnan y segreguen un anticuerpo y inmunológicamente activo plegado apropiadamente.

Ejemplos de células huésped de mamíferos para expresar los anticuerpos recombinantes incluyen células de ovario de hámster chino (células CHO) (incluyendo células dhfr-CHO, descriptas en Urlaub y Chasin, (1980) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, usadas con un marcador seleccionable DHFR, por ejemplo, como se describe en R. J. Kaufman y P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621), células de mieloma NSO, células COS, células HKB11 y células SP2. Cuando vectores de expresión recombinantes que codifican genes de anticuerpos son introducidos en células huésped de mamíferos, los anticuerpos son producidos cultivando las células huésped durante un período de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células huésped o la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en el cual se cultivan las células huésped. Los anticuerpos pueden ser recuperados del medio de cultivo usando métodos de purificación de proteínas estándar, tales como ultrafiltración, cromatografía de exclusión de tamaño, cromatografía de intercambio de iones y centrifugación.

Uso de secuencias de anticuerpos parciales para expresar anticuerpos intactos Los anticuerpos interactúan con antígenos objetivo predominantemente a través de residuos de aminoácidos que están ubicados en las seis CDR de las cadenas pesadas y livianas. Por esta razón, las secuencias de aminoácidos dentro de las CDR son más diversas entre los anticuerpos individuales que las secuencias fuera de las CDR. Como las secuencias de las CDR son responsables por la mayoría de las interacciones anticuerpo-antígeno, es posible expresar los anticuerpos recombinantes que imitan las propiedades de anticuerpos específicos que existen naturalmente construyendo los vectores de expresión que incluyen las secuencias de CDR de los anticuerpos específicos que ocurren naturalmente injertados en secuencias marco de un anticuerpo diferente con propiedades diferentes (ver, por ejemplo, Riechmann, L. et al., 1998, Nature 332:323-327; Jones, P. et al., 1986, Nature 321:522-525; y Queen, C. etal., 1989, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A.86:10029-10033). Tales secuencias marco se pueden obtener de las bases de datos de ADN públicas que incluyen secuencias de genes de anticuerpos de la línea germinal. Estas secuencias de la línea germinal diferirán de las secuencias de los genes de anticuerpos maduros porque no incluirán genes variables completamente armados, que están formados por V(D)J que se unen durante la maduración de la celula B. No es necesario obtener toda la secuencia de ADN de un anticuerpo particular para recrear un anticuerpo recombinante intacto que tiene propiedades de unión similares a las del anticuerpo original (ver WO 99/45962). La secuencia parcial de las cadenas pesadas y livianas que abarcan las regiones CDR es normalmente suficiente para este propósito. La secuencia parcial se usa para determinar qué segmentos de genes de unión y variables de la línea germinal contribuyeron a los genes variables de anticuerpos recombinados. La secuencia de la línea germinal se usa luego para llenar las partes que faltan de las regiones variables. Las secuencias conductoras de las cadenas pesadas y livianas son escindidas durante la maduración de la proteína y no contribuyen a las propiedades del anticuerpo final. Por esta razón, es necesario usar la secuencia conductora de la línea germinal correspondiente para los constructos de expresión. Para agregar secuencias faltantes, las secuencias de cADN clonadas pueden ser combinadas con oligonucleótidos sintéticos por unión o amplificación por PCR. Alternativamente, toda la región variable puede ser sintetizada como un conjunto de oligonucleótidos cortos, superpuestos y combinada por amplificación por PCR para crear un clon de la región variable completamente sintético. Este proceso tiene algunas ventajas tales como la eliminación o inclusión o los sitios de restricción particulares, o la optimización de codones particulares.

Las secuencias de nucleótidos de los transcriptos de las cadenas pesadas y livianas se usan para designar un conjunto superpuesto de oligonucleótidos sintéticos para crear secuencias V sintéticas con capacidades de codificación de aminoácidos idénticas a las secuencias naturales. Las secuencias sintéticas de las cadenas pesadas y livianas pueden diferir de las secuencias naturales. Por ejemplo: hileras de bases de nucleótidos repetidas son interrumpidas para facilitar la síntesis de oligonucleótidos y la amplificación por PCR; los sitios de iniciación de traducción óptimos son incorporados de acuerdo con las reglas de Kozak (Kozak, 1991, J. Biol. Chem. 266:19867-19870); y los sitios de restricción son creados por ingeniería genetica corriente arriba o corriente abajo de los sitios de iniciación de traducción.

Para las regiones variables de las cadenas pesadas y las cadenas livianas, la codificación optimizada y la no codificación correspondiente, las secuencias de las hebras se rompen en 30-50 secciones de nucleótidos a aproximadamente el punto central del oligonucleótido no codificador correspondiente. Así, para cada cadena, los oligonucleótidos pueden ser reunidos en conjuntos de doble hebra superpuestos que abarcan segmentos de 150-400 nucleótidos. Los pools se usan luego como modelos para producir los productos de amplificación por PCR de 150-400 nucleótidos. Normalmente, un solo conjunto de oligonucleótidos de región variable será dividido en dos pools que son amplificados separadamente para generar dos productos de PCR que se superponen. Estos productos que se superponen son combinados luego por amplificación por PCR para formar la región variable completa. También puede ser deseable incluir un fragmento superpuesto de la región constante de las cadenas pesadas o las cadenas livianas en la amplificación por PCR para generar fragmentos que pueden ser clonados fácilmente en los constructos de vectores de expresión.

Las regiones variables de las cadenas pesadas y las cadenas livianas reconstruidas son combinadas luego con secuencias de promotores clonados, iniciación de traducción, regiones constantes, 3’ no traducidos, poliadenilación y secuencias de terminación de transcripción para formar constructos de vectores de expresión. Los constructos de expresión de las cadenas pesadas y livianas pueden ser combinados en un solo vector, cotransfectadas, transfectadas serialmente o transfectadas por separado en células huésped que son fusionadas luego para formar una célula huésped que expresa ambas cadenas.

Así, en otro aspecto, las características estructurales de un anticuerpo anti-aPC humano se usan para crear anticuerpos anti-aPC humanos relaciones estructuralmente que retienen la función de unirse a la aPC. Más específicamente, una o más CDR de las regiones de las cadenas pesadas y livianas identificadas específicamente de los anticuerpos monoclonales pueden ser combinadas en forma recombinante con regiones marco humanas conocidas y CDR para crear anticuerpos anti-aPC humanos, creados por ingeniería genetica en forma recombinante, adicionales.

Composiciones farmacéuticas También se proveen composiciones farmacéuticas que comprenden cantidades terapéuticamente efectivas de anticuerpos monoclonales anti-aPC y un vehículo farmacéuticamente aceptable. “Vehículo farmacéuticamente aceptable” es una sustancia que se puede agregar al ingrediente activo para ayudar a formular o estabilizar la preparación y no causa efectos toxicológicos adversos significativos para el paciente. Ejemplos de tales vehículos son bien conocidos por los expertos en el arte e incluyen agua, azúcares, tales como maltosa o sacarosa, albúmina, sales, tales como cloruro de sodio, etc. Otros vehículos se describen, por ejemplo, en Remington’s Pharmaceutical Sciences de E. W. Martin. Tales composiciones contendrán una cantidad terapéuticamente efectiva de por lo menos un anticuerpo monoclonal anti-TFPI.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. El uso de tales medios y agentes para las sustancias farmacéuticamente activas es conocido en el arte. En algunas formas de realización la composición es formulada para inyección parenteral. La composición puede ser formulada como una solución, microemulsión, liposoma, u otra estructura ordenada adecuada para una alta concentración de fármaco. El vehículo puede ser un solvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares) y mezclas adecuadas de estos. En algunos casos, incluirá agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composición.

Las soluciones inyectables estériles pueden ser preparadas incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados más arriba, como se requiera, seguido por esterilización por microfiltración. En general, las dispersiones son preparadas incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados más arriba. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, algunos métodos de preparación son secado al vacío y secado por congelamiento (liofilización) que dan un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional de una solución de estos previamente filtrada en forma estéril.

Usos farmacéuticos El anticuerpo monoclonal puede ser usado para fines terapéuticos para el tratamiento de las deficiencias genéticas y adquiridas o los defectos en la coagulación. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales en las formas de realización descriptas más arriba se pueden usar para bloquear la interacción de la aPC con su sustrato, que puede incluir el Factor Va o el Factor Villa.

Los anticuerpos monoclonales tienen uso terapéutico en el tratamiento de los trastornos de la hemostasis tales como trombocitopenia, trastornos de las plaquetas y trastornos hemorrágicos (por ejemplo, hemofilia A, hemofilia B y hemofilia C). Tales trastornos se pueden tratar administrando una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo monoclonal anti-aPC a un paciente que lo requiere. Los anticuerpos monoclonales también tiene un uso terapéutico en el tratamiento de las hemorragias incontroladas en indicaciones tales como trauma y el accidente cerebrovascular hemorrágico. Así, también se provee un método para acortar el tiempo de sangrado que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo monoclonal anti-aPC a un paciente que lo necesita.

En otra forma de realización, el anticuerpo anti-aPC puede ser útil como un antídoto para los pacientes tratados con aPC, incluyendo, por ejemplo, en donde la aPC se usa para el tratamiento de sepsis o un trastorno hemorrágico.

Los anticuerpos se pueden usar como monoterapia o en combinación con otras terapias para solucionar un trastorno hemostático. Por ejemplo, la coadministración de uno o más anticuerpos con un factor de coagulación tal como el factor VI la, el factor VIII o el factor IX se cree que es útil para el tratamiento de la hemofilia. En una forma de realización, se provee un metodo para el tratamiento de deficiencias genéticas y adquiridas o defectos en la coagulación que comprenden la administración de (a) una primera cantidad de un anticuerpo monoclonal que se une al inhibidor de la vía del factor tisular humano y (b) una segunda cantidad de factor VIII o factor IX, en donde dichas primera y segunda cantidades juntas son efectivas para tratar dichas deficiencias o defectos. En otra forma de realización, se provee un método para el tratamiento de las deficiencias genéticas y adquiridas o los defectos de la coagulación que comprende la administración de (a) una primera cantidad de un anticuerpo monoclonal que se une al inhibidor de la vía del factor tisular humano y (b) una segunda cantidad del factor VIII o del factor IX, en donde dichas primeras y segundas cantidades juntas son efectivas para el tratamiento de dichas deficiencias o dichos defectos y además en donde el factor Vil no es coadministrado. También está incluida una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de la combinación de un anticuerpo monoclonal y un factor VIII o un factor IX, en donde la composición no contiene el factor Vil. El “Factor Vil” incluye el factor Vil y el factor Vlla. Estas terapias combinadas probablemente reduzcan la frecuencia de infusión necesaria del factor de coagulación. Por co-administración o terapia combinada se entiende la administración de los dos fármacos terapéuticos cada uno formulado separadamente o formulados juntos en una composición, y, cuando son formulados separadamente, son administrados o bien aproximadamente al mismo tiempo o en tiempos diferentes, pero durante el mismo período terapéutico.

En algunas formas de realización, uno o más anticuerpos descriptos en la presente pueden ser usados en combinación para solucionar un trastorno hemostático. Por ejemplo, la coadministración de dos o más de los anticuerpos descriptos en la presente se cree que es útil para el tratamiento de la hemofilia u otro trastorno hemostático.

Las composiciones farmaceuticas pueden ser administradas en forma parenteral a sujetos que padecen de hemofilia A o B a una dosis y una frecuencia que puede variar con la severidad del episodio de sangrado o, en el caso de una terapia profiláctica, puede variar con la severidad de la deficiencia de coagulación del paciente.

Las composiciones pueden ser administradas a pacientes que lo necesitan como un bolo o por infusión continua. Por ejemplo, una administración de un bolo de un anticuerpo de la invención presente como un fragmento Fab puede ser en una cantidad de 0,0025 a 100 mg/kg de peso corporal, 0,025 a 0,25 mg/kg, 0,010 a 0,10 mg/kg o 0,10-0,50 mg/kg. Para una infusión continua, un anticuerpo de la invención presente como un fragmento Fab puede ser administrado a 0,001 a 100 mg/kg de peso corporal/minuto, 0,0125 a 1,25 mg/kg/min, 0,010 a 0,75 mg/kg/min, 0,010 a 1,0 mg/kg/min o 0,10-0,50 mg/kg/min, durante un período de 1-24 horas, 1-12 horas, 2-12 horas, 6-12 horas, 2-8 horas, o 1-2 horas. Para la administración de un anticuerpo de la invención presente como un anticuerpo de longitud completa (con regiones constantes completas), las cantidades de las dosis pueden ser de aproximadamente 1-10 mg/kg de peso corporal, 2-8 mg/kg, o 5-6 mg/kg. Tales anticuerpos de longitud completa serían administrados normalmente por infusión extendiéndose durante un período de treinta minutos a tres horas. La frecuencia de la administración dependería de la severidad de la condición. La frecuencia podría oscilar entre tres veces por semana y una vez cada dos semanas a seis meses.

Adicionalmente, las composiciones pueden ser administradas a pacientes vía inyección subcutánea. Por ejemplo, una dosis de 10 a 100 mg de un anticuerpo anti- aPC puede ser administrada a los pacientes por inyección por vía subcutánea semanal, bisemanal o mensualmente.

Como se usa en la presente, “cantidad terapeuticamente efectiva” significa una cantidad de un anticuerpo monoclonal anti-aPC o de una combinación de tal anticuerpo y un factor VIII o un factor IX que se necesita para aumentar efectivamente el tiempo de coagulación in vivo o causar de otro modo un beneficio mensurable in vivo a un paciente que lo necesita. La cantidad precisa dependerá de numerosos factores, incluyendo, pero sin limitación, los componentes y características físicas de la composición terapéutica, la población de pacientes prevista, las consideraciones individuales del paciente y similares y puede ser determinada fácilmente por un experto en la téenica.

Ejemplos Aspectos de la presente divulgación pueden comprenderse mejor a la luz de los siguientes ejemplos, que no deberían interpretarse como limitativos del alcance de las presentes enseñanzas de ninguna manera.

Ejemplo 1. Materiales y métodos Rastreo de ligadores específicos de la aPC humana Preparación de las placas modelo: se produjeron placas modelo tomando 1880 clones por estrategia de paneo en placas de 384 cavidades (ThermoFisher Scientific, Weltham, MA, Estados Unidos) conteniendo medio de crecimiento (2XYT/1 % de glucosa/100 mg/ml de carbenicilina) usando el captador de colonias Qpix2 (Genetix, Boston, MA, Estados Unidos). Las placas se cultivaron durante la noche a 37 °C con agitación.

Producción de placas de expresión: usando el manipulador de líquido Evolution P3 (Perkin Elmer, Waltham, MA, Estados Unidos) se transfirieron 5 ml de medio de las placas modelo a placas de 384 cavidades que contenían medio de expresión (2XYT/0,1 % de glucosa/100 ug/ml de carb) y se incubaron a 30 °C. Cuando los cultivos alcanzaron una OD 600 de 0,5, se agregó IPTG a una concentración final de 0,5 mM. Las placas se devolvieron luego a 30 °C para el cultivo durante la noche.

ELISA primario: Placas Maxisorp de 384 cavidades (ThermoFisher Scientific, Rochester, NY, Estados Unidos) fueron recubiertas con aPC humana recombinante o PC humana (Mol. Innovation) a 1 mg/ml en DPBS con Ca/Mg y se incubaron durante la noche a 4 °C. Las placas de ELISA recubiertas se lavaron tres veces con DPBST (PBS + 0,05 % de TWEEN) y se bloquearon con MDPBST (PBS + 0,05 % de TWEEN + 5 % de leche) durante 1 h a TA. Las placas bloqueadas fueron aspiradas y se transfirieron 15 ml de medio de expresión y se transfirieron 30 pl de MDPBST a cada cavidad. Las placas de ELISA se incubaron a temperatura ambiente durante 1 h, seguido por lavado 5 veces con DPBST. Se agregó HRP anti-hFab (Jackson ImmunoResearch, 1 :10.000 dilución en DPBST) a cada cavidad y se incubó durante 1 h a temperatura ambiente. Las placas se lavaron luego 5 veces con DPBST. Se agregó el sustrato Amplex Red (Invitrogen) y las placas se lcyeron a una excitación de 485 nm y una emisión de 595 nm.

ELISA de confirmación: usando el captador de colonia Qpix2, se reordenaron los clones positivos putativos de las placas modelo en placas de 96 cavidades profundas (Qiagen) conteniendo 1 mi de medio de cultivo y se cultivaron durante la noche a 37 °C. Las placas de expresión fueron inoculadas de las placas modelo e inducidas con IPTG a 0,5 mM de concentración final cuando los cultivos alcanzaron una OD600 de 0,5. ELISA se realizó luego en el medio de expresión como se indicó más arriba.

Selecciones de la biblioteca con aPC biotinilada (paneo en solución) Se llevaron a cabo dos metodos: depleción de ligadores de PC y no depleción para ligadores de PC total y aPC. Dynabeads M280 de estreptavidina fueron acopladas a 100 nM de biotina-TF (factor tisular, para la no depleción) o 100 nM de biotina-PC (depleción) y capturadas por un dispositivo magnético. 1-7,5x1012 cfu de Fab de la biblioteca de fagos, pre-bloqueados con DPBS/3 % de BSA/0,05 % de TWEEN 20, fueron incubado con biotina-TF o biotina-PC acoplada a perlas de estreptavidina en un aparato de rotación a temperatura ambiente durante 2 horas. Las perlas de biotina-TF (no depleción) o biotina-PC (depleción)/estreptavidina fueron capturadas y descartadas. Los sobrenadantes de fagos resultantes fueron incubados con 100 nM (primera vuelta), 50 nM (segunda vuelta) o 10 nM (tercera vuelta) biotina-aPC en 1ml de DPBS/3 % de BSA/0,05 % de TWEEN 20/1 mM de CaCI2 durante 2 horas a TA o 40 °C durante la noche. 100 ul de perlas magneticas acopladas con estreptavidina se agregaron a la solución de fago-aPC y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las perlas del complejo fago-aPC fueron capturadas en un dispositivo magnético y lavadas varias veces en DPBS con 3 % de BSA o 0,05 % de TWEEN 20 dependiendo de las vueltas de paneo. El fago ligado fue eluido con 1 mg/ml de tripsina y neutralizado con aprotinina. El fago eluido se usó luego para infectar 10 mi de E. coli HB101F’ que crecía exponencialmente y se amplificó para la siguiente vuelta de selección. El stock de fagos también fue analizado en una titulación de CFU (salida de paneo).

Selecciones de biblioteca con aPC inmovilizada (paneo en fase sólida) Cinco cavidades de una placa Maxi-sorp de 96 cavidades fueron recubiertas con 400 ng/cavidad de aPC recombinante en DPBS a 4 °C durante la noche. Igual que en el paneo en solución, la biblioteca de fagos fue pretratada con biotina-TF para no depleción o biotina-PC para depleción. El fago resultante fue agregado luego a las cavidades recubiertas con aPC y se incubó en un agitador durante 1-2 horas a temperatura ambiente. Fago no ligado fue retirado por lavado varias veces en DPBS con 3 % de BSA o 0,05 % de TWEEN 20 dependiendo de las vueltas de paneo. El fago ligado fue eluido con 1 mg/ml de tripsina y neutralizado con aprotinina. El fago eluido se usó luego para infectar 10 mi de HB101F de E. coli que crecía exponencialmente y fue amplificado para la siguiente vuelta de selección. El stock de fagos también fue analizado en una titulación CFU (salida de paneo).

Amplificación de pools de fagos seleccionados: stocks de fagos eluidos fueron amplificados en HB101F’ usando un fago helper M13K07 para la vuelta de selección 2, 3 y4.

Un volumen de 10 mi de HB101F’ que crecía exponencialmente fue infectado con fago eluido de cada vuelta de selección e incubado a 37 °C durante 45 minutos, 50 rpm. Las bacterias fueron resuspendidas luego en 2 x medio YT y esparcidas en dos placas de agar de 15 cm que contenían 100 mg/ml de carbocinína, 15 pg/ml de tetracielina y 1 % de glucosa seguido por la incubación durante la noche a 30 °C. El cesped de bacterias de las placas fue recogido con un total de 8 mi 2 x YT/carb/tet.

Aproximadamente 10 mI de células fueron resuspendidos en 10 mi de 2 x YT/carb/tet (OD600 es aprox. 0,1 -0,2) e incubadas a 37 °C hasta que se alcanzó una OD600 de 0,5-0, 7. Se agregaron 5 x 1010 cfu de M13K07 fago helper a las células y se incubó durante 45 minutos a 37 °C. Las células infectadas fueron resuspendidas luego en 15 mi de 2 x YT/carb/kanamicina fresca (50 pg/ml)/tet y se agitó durante la noche a 30 °C para producir fagos. El sobrenadante del fago fue recogido por centrifugación y filtración a través de un filtro de 0,45 pm. 900 mI del sobrenadante se usaron para la siguiente vuelta de selección.

Análisis de secuenciación de ADN de anticuerpos aPC Se preparó un plásmido usando téenicas de biología molecular. Los siguientes cebadores se usaron para la secuenciación de ADN de clones de anticuerpos seleccionados. a) Cebador A: 5’ GAAACAGCTATGAAATACCTATTGC 3’ b) Cebador B: 5’ GCCT GAGCAGT GGAAGT CC 3’ c) Cebador C: 5’ T AGGT ATTT C ATT AT GACT GTCTC 3’ d) Cebador D: 5’ CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG 3’ Purificación de ¡a proteína C del plasma.

Un litro de plasma de perro o conejo fue adquirido como 20 x 50 mi de stocks congelados con heparina incluida como anticoagulante (Bioreclamation, Inc., Westbury, NY). El método de purificación fue descripto por el laboratorio de Esmon (12) con modificaciones. El plasma fue descongelado a 4 °C y diluido 1:1 con 0,02 M de Tris-HCI, pH 7,5, heparina 1U/ml final, HCI de benzamidina 10 mM final, a TA antes de cargarlo en una columna de Q-Sepharose para capturar la proteína C y otras proteínas dependientes de la vitamina K. La columna se lavó con 0,15 M de NaCI con tampón y la proteína C fue eluida con 0,5 M de NaCI con tampón. Los eluyentes fueron recalcificados con 10 mM de Ca++ y 100 U/ml de heparina y luego cargados en una columna de afinidad HCP4-Affigel-10. La columna se lavó con tampón que contenía Ca y se eluyó con tampón que contenía EDTA. La PC purificada fue dializada durante la noche en un tampón PBS, congelada instantáneamente y almacenada a -80 como alícuotas de 0,5 mi. El rendimiento de la purificación fue de 1,75 mg de un litro de plasma de perro. La PC purificada tenía 98 % de pureza como se determinó por SDS-PAGE y SEC analítico.

Expresión y purificación de Fab Para la expresión de Fab, se inocularon 5 ml de stock de glicerol E. coli sFab en 1 mi de medio de cultivo (LB, 1 % de glucosa, 100 mg/ml de ampicilina) y el cultivo creció a 37 °C durante la noche con agitación a 250 rpm. El cultivo de la noche 500 pl fue inoculado luego en 10 mi de medio de inducción precalentado (37 °C) (LB, 0,1 % de glucosa, 100 pg/ml de ampicilina) y se cultivó a 37 °C a una OD500 de 0,6-0, 7 a 250 rpm. Se agregó IPTG al cultivo a 0,5 mM de concentración final para la expresión de Fab y el cultivo creció durante la noche a 30 °C con agitación a 250 rpm. El día siguiente, el cultivo de la noche fue centrifugado a 3.000 g durante 15 min a 4 °C para separar el medio de las células. Tanto el sobrenadante como el pellet fueron recuperados para la purificación de Fab. La expresión de Fab en el sobrenadante y el pellet puede ser confirmada por análisis de transferencia western usando anticuerpo anti-His.

Para la purificación de Fab, se usó la columna de proteína A (MabSure) como recomienda el protocolo Biolnvent. El sobrenadante fue filtrado a través de un filtro de 0,45 um para remover los desechos y se mezcló con una tableta de inhibidores de proteasa completos (Roche 11873580001) antes de cargar en una columna de proteína A equilibrada con tampón. Fab fue eluido con tampón a pH 2-3, luego se intercambió el tampón a PBS, pH 7,0. Para liberar el Fab de los pellets celulares, se agregó 1 mi de tampón de lisis al pellet. La mezcla fue incubada durante 1 h para lisis a 4 °C en una plataforma oscilante, luego se centrifugó a 3.000 g durante 30 min a 4 °C. El sobrenadante claro fue transferido a un tubo nuevo y se cargó en la columna de proteína A. El tampón de lisis contiene 1 mg/ml de lisozima recien preparada (Sigma L-6876) en una solución de sacarosa fría (20 % de sacarosa (p/v), 30 mM de TRIS-HCL, 1 mM de EDTA, pH 8,0), 2,5 U/ml de benzonasa (Sigma E1014) (25 KU/ml, solución stock 1/10,000) y 1 tableta de inhibidores de proteasa completos (Roche 11873580001). La pureza del Fab purificado fue confirmada por SDS-PAGE y cromatografía de exclusión de tamaño analítica (SEC). Los niveles de endotoxina también se monitorearon.

Análisis de transferencia Western de PC y aPC.

La proteína purificada (100 ng/banda) se mezcló con 4x de SDS-PAGE cargando colorante con DTT (reductor) o sin DTT (no reductor), se calentó a 95 °C durante 5 min, luego se cargó en 4-12 % de geles NuPAGE. Las proteínas fueron transferidas a membranas de nitrocelulosa por i-Blot (Life technologies, Carlsbad, CA). Los pasos de sondeo fueron realizados con SNAP-id (Millipore). Después del bloqueo con 5 % de leche/PBS durante 10 min, las membranas se incubaron con varios reactivos (por ejemplo, estreptavidina-HRP para la detección de aPC biotinilada, el anticuerpo monoclonal HCP-4 de PC antihumano de ratón y el anticuerpo policlonal de cabra anti-PC para la detección de la aPC de perro). El sondeo fue seguido por incubación con anticuerpo secundario HRP durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de lavar las transferencias con PBS con 0,1 % de TWEEN-20, la señal de HRP fue detectada usando un sustrato quimioluminiscente (ECL) (Pierce, Rockford, IL) y exposición a una película de rayos x.

ELISA de Fab Las proteínas del antígeno (PC humana, PC humana, APC de ratón, APC de perro) fueron recubiertas en una placa de ELISA a 100 ng/100 ul/cavidad en tampón PBS/Ca (Life technologies) durante la noche a 4 °C. El día siguiente, la placa se lavó 3x y se bloqueó con 5 % de PBS/Ca/BSA/Tween 20 durante 1 h a TA. Se agregó Fab soluble a cada cavidad y se incubó durante 1 h a TA. Despues de agregar el lambda-anticuerpo-HRP antihumano como anticuerpo de detección, la placa fue incubada a temperatura ambiente durante 1 h, se lavó extensamente y luego se desarrolló usando un sustrato Amplex Red como describió el fabricante del kit. La señal se midió como RFU usando un lector de placas fluorescente (SpectraMax 340pc, Molecular Devices, Sunnyvale, CA). La curva estándar fue adaptada a un modelo de cuatro parámetros y los valores de los desconocidos fueron extrapolados de la curva.

Ejemplo 2. Paneo del anticuerpo aPC de la biblioteca El paneo y rastreo de una biblioteca de anticuerpos Fab completamente humanos contra la proteína C activada humana se realizó usando los métodos como se describió en el Ejemplo 1. La secuenciación de ADN se realizó en los clones del anticuerpo positivos dando por resultado 10 secuencias de anticuerpo únicas. Un alineamiento de las cadenas pesadas y las cadenas livianas de los anticuerpos se muestra en la Figura 2. Secuencias CDR3 de cadenas pesadas idénticas se hallaron en 5 Fabs (C7I7, C7A23, T46J23, C22J13, C25K23).

Los Fabs purificados fueron caracterizados por un panel de ensayos funcionales para evaluar: a) su especificidad de unión (aPC vs. PC); afinidad de unión (por ELISA y Biacore); y la reactividad cruzada de especies (es decir, unión a aPCs de especies de diferentes orígenes incluyendo humano, de perro y de ratón). También usó la aPC de conejo más tarde para el formato IgG; b) su selectividad de unión contra otros factores de coagulación dependientes de la vitamina K (por ejemplo, Fila, FVIIa, FlXa, FXa); c) su potencia de inhibición de la actividad anticoagulante de aPC en el ensayo de coagulación plasmática aPTT; y d) su efecto sobre la actividad enzimática proteasa de la aPC en tampón usando el ensayo de actividad amidolítica (en un sustrato de péptido pequeño) y el ensayo de inactivación de FVa (en el sustrato de proteína FVa).

Ejemplo 3. Afinidad de unión de anticuerpos específicos de aPC y reactividad cruzada de las especies Las actividades de unión a los antígenos de estos Fabs anti-aPC purificados fueron determinadas por ELISA directo como se muestra en la Figura 3. Los antígenos fueron recubiertos directamente en placas de ELISA. Los antígenos de recubrimiento incluían PC humana (derivada de plasma), aPC humana (recombinante), aPC de perro (derivada de plasma) y aPC de ratón (recombinante) a 100 ng/cavidad en tampón PBS/Ca. Despues de bloquear la placa con 5 % de leche/PBS y lavar la placa con PBS-Tween20, se agregaron Fabs solubles (1 ug/ml, 20 nM) a la placa y se incubaron durante 1 h a TA con agitación. La unión de Fab fue detectada con Fab antihumano (lambda) anticuerpo-HRP y Amplex red como sustrato. Los datos del ELISA mostraron que todos los Fabs se unen específicamente a la aPC humana pero no a la PC humana. Un Fab, R41C17, mostró unión mínima a la PC humana. Por contraste, el R41C17 se une tanto a la APC humana como a la PC humana. También se muestra en la Figura 3 la reactividad cruzada de las especies de Fabs por ELISA. Entre los 8 ligadores específicos de aPC, 4 de ellos (C7I7, C7A23, C25K23, T46J23) también mostraron reactividad cruzada con aPC de perro. Además, un Fab, T46J23, mostró una cierta unión a la aPC de ratón.

En la Tabla 3 se muestra la ECso medida por ELISA de anticuerpos anti-aPC a la aPC humana y a la aPC de perro.

Tabla 3. Análisis ELISA de Fabs anti-aPC La afinidad de los Fabs anti-aPC fue determinada por Biacore y se muestra en la Tabla 4.

Tabla 4. Análisis ELISA de Fabs anti-aPC Ejemplo 4. Selectividad de unión de los Fabs anti-aPC Para determinar la selectividad de unión de estos fabs, sus actividades de unión a la proenzima PC humana, a trombina (Fila) y al Factor II activado (Fila, trombina), al Factor Vil (FVIIa), al Factor IX (FlXa) y al Factor X (FXa), tambien se evaluaron por ELISA. Brevemente, una placa de ELISA fue recubierta con aPC humana a 1 ug/ml, PC de ratón a 10 ug/ml, PC de perro a 10 ug/ml, otros factores de coagulación (Fila, FVIIa, FlXa, FXa) a 5-10 ug/ml. Los Fabs anti-aPC fueron agregados a las cavidades a 20 nM (1 ug/ml). Los Fabs unidos fueron detectados por el anticuerpo secundario (Fab-HRP antihumano) seguido por el sustrato de HRP AmplexRed. Como control positivo se usó un anticuerpo control específico para cada antígeno para demostrar que el antígeno de recubrimiento estaba presente.

Como se muestra en la Figura 4, hasta una concentración de 20 nM, ninguno de los Fabs mostró unión a los factores lia, Vlla, IXa o Xa. La unión a la proenzima PC de ratón o PC de perro tampoco se pudo detectar.

Ejemplo 5. Fabs anti-aPC inhiben la aPC e inducen la formación de coágulos en el plasma humano normal La aPC humana es un anticoagulante potente y esta función puede ser demostrada fácilmente por el ensayo de coagulación plasmática (aPTT) como se muestra en la Figura 5. En los ensayos aPTT, 50 % del plasma reunido humano normal formó coágulos en 52 segundos después de agregar CaCIs (iniciador) a la mezcla de plasma y fosfolípidos. La preincubación de la aPC humana a 100, 200, 400, 800 ó 1600 ng/ml con plasma prolongó el tiempo de coagulación de una manera dependiente de la dosis. Como se muestra en la Figura 5, se obtuvo una potencia casi identica para la aPC derivada de plasma y la aPC recombinante. Como el ajuste máximo del tiempo de coagulación para el instrumento Stago fue de 240 segundos, la actividad anticoagulante de la aPC humana en este ensayo funcional alcanzó su máximo a 800 ng/ml de aPC.

Para evaluar los efectos inhibidores potenciales de los Fabs anti-aPC sobre la actividad anticoagulante de aPC, se usaron 400 ng/ml de aPC en los ensayos aPTT para un bueno rango de ensayo (Figura 6). El tiempo de coagulación plasmático se extendió de 52 segundos a 180 segundos debido a la actividad anticoagulante de la PC administrada. La incubación de un anticuerpo APC antihumano de ratón herramienta (control) o su Fab (Fab control) o Fab C7A23 a 0, 0,5, 1, 2, 5, 10 ó 20 ug/ml con aPC (es decir, 1 ,5x a 60x veces en exceso de Fab sobre aPC) redujo el tiempo de coagulación de una manera dependiente de la dosis. El Fab C7A23 fue 4-5 veces más potente que el Fab control para revertir la actividad anticoagulante de la aPC humana. Por contraste, el Fab control negativo (Fab lambda humano) no tuvo efecto sobre el tiempo de coagulación. En la Figura 6, el anticuerpo control de longitud completa (bivalente) era 10 veces más potente que el Fab control (monovalente) en el ensayo aPTT. Este resultado era consistente con sus valores ECso [control (0,56 nM) vs. Fab control (6,56 nM)] en el ELISA directo para la unión a aPC (datos no mostrados). Sugiriendo así una molécula más potente cuando los Fabs anti-aPC son convertidos en el formato IgG. Los resultados del aPTT sugieren que los Fabs anti-aPC inhibieron significativamente la actividad anticoagulante de aPC y acortaron el tiempo de coagulación. Todos los Fabs testeados fueron evaluados en el ensayo de coagulación plasmática aPTT en comparación con el Fab control (Figura 6). En el gráfico superior de la Figura 6, se usó un Fab humano no específico como control negativo y no afectó el tiempo de coagulación como se esperaba. Los controles positivos (control y Fab control) acortaron el tiempo de coagulación de una manera dependiente de la dosis.

Los Fabs C7A23, C7I7, C25K23, T46J23 y T46P19 a 5 ug/ml (15 veces en exceso molar con respecto a la aPC distribuida) causaron 80-93 % de inhibición de la actividad de la aPC humana y aumentaron la formación de coágulos. Fueron claramente más potentes que el Fab control. Por contraste, el Fab R41 E3 sólo produjo una inhibición de 30-40 % de la actividad de la aPC bajo identicas condiciones. La débil actividad del R41E3 en el aPTT probablemente resultó de su menor afinidad de unión al aPC como se determinó por ELISA y Biacore. Un aumento en la concentración de R41E3 Fab a 40 ug/ml (100 veces en exceso molar con respecto a la aPC) causó realmente 80 % de inhibición de la aPC humana como se muestra en el gráfico inferior de la Figura 6. Igualmente, una alta dosis (40 ug/ml) de C22J13 Fab produjo 80 % de inhibición de la aPC humana. El Fab C26B9 fue más potente que el Fab control en este ensayo. En el gráfico inferior, el Fab R41C17 no tuvo efecto sobre la actividad de la aPC, porque une a ambas, PC y aPC y es más de 1000 veces más abundante la PC que la aPC en el plasma humano. Estos datos también indican que el Fab R41C17 tiene un epítope de unión diferente de los otros Fabs.

Como se indica por los datos del ELISA de aPC de las especies, los 4 Fabs (C7A23, C7I7, C25K23, T46J23) también se unen al aPC de perro a una afinidad nanomolar, estos Fabs fueron evaluados por aPTT usando aPC de perro distribuido en 50 % de plasma normal humano reunido como se muestra en la Figura 7. El aPC de perro presentó una actividad anticoagulante idéntica que la aPC humana por el aPTT (datos no mostrados). La aPC de perro a 300 ng/ml aumentó el tiempo de coagulación de 47 segundos a 117 segundos. La incubación del anticuerpo control o del FAb control a 0, 0,5, 1, 2, 5, 10 ó 20 ug/ml con aPC de perro no afecto el tiempo de coagulación porque no reaccionan en forma cruzada con la aPC de perro por ELISA. Sin embargo, el Fab C7A23 redujo significativamente el tiempo de coagulación de una manera dependiente de la dosis e inhibió la actividad de la aPC de perro hasta 80 % a 5 ug/ml o 85 % a 20 ug/ml. Además, el C7A23 mostró una potencia comparable para bloquear la aPC humana y la aPC de perro en los ensayos de aPTT. Los Fabs C7A23, C717, C25K23 inhibieron claramente la actividad de la aPC de perro de una manera dependiente de la dosis. A una concentración de 20 ug/ml de Fab, estos 3 Fabs causan una inhibición del 80-90 % de la aPC y acortan el tiempo de coagulación. El Fab T46J23 dio sólo 40 % de inhibición a una dosis alta, consistente con su unión más débil a la aPC de perro (KD = 22 nM) que los C7A23, C7I7, C25K23 (KD = 1-5 nM) por ELISA y Biacore. Por contraste, los Fabs T46P19 y R41E3 no tuvieron efecto sobre la aPC de perro en el APTT como se esperaba ya que no pudieron unirse a la aPC de perro por el ELISA.

Ejemplo 6. Efecto de Fabs anti-aPC sobre la actividad enzimática de aPC La proteína C activada es una serina proteasa. Su actividad catalítica se puede medir a través de dos métodos: a) ensayo de actividad amidolítica usando un sustrato de péptido pequeño y b) ensayo de degradación de FVa usando un sustrato de proteína fisiológico FVa.

La actividad amidolítica de aPC humana se investigó al usar sustrato de péptido cromogénico de aPC en tampón. La proteína aPC purificada a 10 nM se incubó con el sustrato cromogénico SPECTROZYME Pea (Lys-Pro-Arg-pNA, MW 773.9 Da) aat 1 mM durante 30 min. La conversión del sustrato en producto colorimétrico (es decir, actividad enzimática de aPC) se monitoreó mediante la lectura cinética de OD450 cada 5 minutos. Se generó una curva estándar con aPC humana recombinante. Para evaluar el efecto de de Fabs anti-aPC sobre la actividad amidolítica de aPC (Figura 8), la proteína aPC purificada (20 nM) se preincubó primero con igual volumen de Fab anti-aPC (1-1000 nM) a temperatura ambiente durante 20 min antes de agregar el sustrato cromogénico SPECTROZYME Pea a la mezcla de reacción hasta 1 mM. La actividad amidolítica de aPC humana a una concentración final de 10 nM se midió en presencia de Fabs. Las tasas de hidrólisis a una concentración de sustrato final de 1 mM se inhibieron parcialmente en presencia de los Fabs, alcanzando una reducción máxima de 80 %. Todos los Fabs excepto R41C17 inhibieron aPC de manera dependiente de la dosis. El valor IC50 se correlacionó con EC50 en el ensayo de unión ELISA, ya que los unidores de alta afinidad (C7I7, C7A23, T46P19, T46J23, C25K23) mostraron inhibición mucho más rápida en este ensayo que el resto de los unidores más débiles (R41E3, C22J13, C26B9). No obstante, el incremento de la concentración de Fabs por unidores más débiles también produjo inhibición máxima. Por ejemplo, R41E3 a 3.000 nM produjo aproximadamente 80 % de inhibición de la actividad de aPC y el mismo grado de inhibición fue alcanzado por los unidores de alta afinidad a 100 nM. Por ende, la mayoría de los unidores interactuó con el sitio activo de aPC, lo que causó la inhibición de su actividad amidolítica. De manera interesante, el anticuerpo de control causó inhibición parcial de aPC (40 %) y alcanzó una meseta en concentraciones superiores a 100 nM. No se observó efecto inhibidor cuando se usaron concentraciones crecientes de Fab R41C17. Como su afinidad de unión para aPC humana es comparable con los unidores de alta afinidad con un valor KD de 4,8 nM por Biacore, estos datos indican que R41C17 tiene un epítope de unión bien lejos del sitio activo enzimático de aPC.

La actividad de inactivación de FVa de aPC humana se puede medir al incubar aPC humana (180 pM) con su sustrato de proteína fisiológico FVa (1,25 nM), luego agregar FXa y protrombina a la mezcla de reacción para formar complejo de protrombinasa. El sustrato de péptido cromogénico de trombina se agregó para detectar la producción de trombina (Figura 9). La lectura es producción de trombina (Flla/seg). Los factores Va purificados (1,25 nM) se incubaron con aPC (180 pM) en presencia del rango de concentraciones de los Fabs (1-500 nM) y las actividades de FVa se evaluaron en el ensayo de protrombinasa/tenasa.

La influencia de los Fabs sobre la actividad de aPC hacia el sustrato biológico FVa se midió a través de un ensayo de generación de FXa y trombina utilizando FVa purificado. En este ensayo, se incubó FVa a 0,16 U/ml (1,25 nM) con aPC 180 pM en tampón de ensayo (20 mM TrisHCI, 137 nM NaCI, 10 ug/ml fosfolípidos, 5 mM CaCl2, 1 mg/ml BSA) en presencia o ausencia de anticuerpos. Después de la incubación durante 30 minutos, se transfirieron 25 ul de mezcla a las cavidades. Posteriormente, se agregaron 50 ul de FXa y protrombina humana en tampón de ensayo a las cavidades y se monitoreó la cinética de la hidrólisis del sustrato mediada por trombina a 30 °C a través de un lector de placas. Como la línea de base de la actividad de aPC, en ausencia de Fab agregado, la incubación de aPC cambió la lectura de 0,0022 nM Flla/seg a 0,0015 nM Flla/seg.

La adición de los Fabs a las mezclas de reacción generó una inhibición casi completa de proteólisis mediada por aPC de FVa y un rápido incremento en la generación de trombina de manera dependiente de la dosis. Tal como se ilustra en la Figura 9, los valores IC50 para la inhibición de proteólisis de FVa por aPC se encontraron en el rango nanomolar y fueron comparables para todos los Fabs evaluados. La mayoría de los Fabs fueron más potentes que el control positivo Fab. R41E3 tuvo un incremento más lento debido a su unión más débil a aPC humana. R41C17 mostró, de manera sorprendente, cierta actividad en este ensayo. Este Fab no tuvo efecto sobre la actividad anticoagulante de aPC por aPTT o sobre la actividad amidolítica de aPC cuando se usó el sustrato de péptido pequeño. Estos datos indican que el epítope de unión a R4117 difiere de manera significativa de aquellos de los otros Fabs.

Ejemplo 7. Expresión y Purificación de IgG anti-aPC Todos los 10 Fabs anti-aPC se convirtieron a lgG1 humana al clonar las secuencias de Fv en vectores de expresión de lgG1 humana. Los plásmidos fueron transfectados en células HEK293 para la expresión transitoria. Los anticuerpos fueron secretados en el medio de cultivo y purificados por columna de proteína A. Un anticuerpo T46J23-hlgG1 de alto rendimiento produjo 10,3 mg por 200 mi de cultivo. Algunos anticuerpos sólo produjeron 1 mg por 200 mi. Los niveles de endotoxina también fueron monitoreados (menos de 0,01 EU/mg).

En forma similar a los Fabs purificados, todas las IgG purificadas fueron caracterizadas por un panel de ensayos funcionales para evaluar: a) su especificidad de unión y afinidad de unión; b) su reactividad cruzada de especie (unión a aPCs de especies de diferentes orígenes con inclusión de aPC de conejo); c) sus efectos sobre la actividad enzimática de aPCs de especies usando ensayo de actividad amidolítica; y d) su potencia de inhibición de la actividad anticoagulante de aPC en el ensayo de coagulación en plasma aPTT usando plasma humano y plasma de ratón.

Ejemplo 8. Especificidad de unión y afinidad de unión de IgG anti-aPC Tal como se ¡lustra en la Figura 10, ELISA reveló que la mayoría de anticuerpos IgG retienen su especificidad de unión como Fabs ya que preferentemente se unen a aPC humana sobre PC humana. Por otro lado, R41C17 y 03E7 unen tanto aPC humana como PC humana. En forma sorprendente, T46J23 adquirió unión de PC humana despues de su conversión de Fab a IgG. El experimento de titulación mediante ELISA también reveló que, en general, la afinidad de unión de estas lgG1 bivalentes se incrementó entre 2 y 50 veces en comparación con los correspondientes Fabs monovalentes tal como se ilustra en la Tabla 5. En particular, el Fab R41E3 de baja afinidad incrementó la afinidad de unión casi en 50 veces después de la conversión Fab-lgG con valor ECso de 104 nM para Fab vs. 1,76 nM para IgG. Todas las IgG mostraron unión de alta afinidad a APC humana con valores EC50 de rango subnanomolar y rango nanomolar bajo. 03E7-lgG es la IgG más débil, con EC50 de 16,9 nM.

Tabla 5. Análisis ELISA de IgG anti-aPC También como se ¡lustra en Figura 10, la reactividad cruzada de especies de estas IgG se investigó usando aPCs y PCs de (a) humano, (b) conejo, (c) perro, (d) ratón. Entre 10 IgG contra aPC antihumanas, 5 IgG se unieron a aPC de conejo con alta afinidad (ECso = 0,6 - 7 nM) sin unión detectable a PC de conejo. Estas 5 IgG también se unieron a APC de perro con alta afinidad (ECso= 1,7 - 10 nM) y no se unieron a PC de perro. Un anticuerpo entre las 5 IgG, T46J23, también se unió a aPC de ratón con un valor ECso de 6 nM. T46J23 no se unió a PC de ratón.

Ejemplo 9. Efecto de IgG anti-APC sobre la actividad enzimática de APCs de especies en tampón usando ensayo de actividad amidolítica Las 5 IgG reactivas en forma cruzada de especies se evaluaron luego en cuanto a su efecto sobre la actividad amidolítica de APCs especies (Figura 11 ). En los ensayos de actividad amidolítica de aPC humana, la IgG de control negativo (anticuerpo anti-CTX) no tuvo efecto de inhibición. Las 5 IgG inhibieron, todas, aPC humana de manera dependiente de la dosis. Sus valores IC50 son 18 nM para T46J23-lgG; 27nM para C22J13; 64nM para C7I7; 78 nM para C7A23 y 131 nM para C25K23.

En los ensayos de actividad amidolítica de aPC de conejo, la IgG de control negativo anticuerpo (anti-CTX) tuvo efecto de inhibición. Las 5 IgG inhibieron, todas, aPC de conejo de manera dependiente de la dosis. Sus valores IC50 son 17 nM para T46J23-lgG; 24nM para C22J13; 29nM para C7I7; 25 nM para C7A23 y 74 nM para C25K23.

En los ensayos de actividad amidolítica de aPC de perro, la IgG de control negativo anticuerpo (anti-CTX) tuvo efecto de inhibición. Las 5 IgG inhibieron débilmente la aPC de perro de manera dependiente de la dosis. Sus valores IC50 son 625 nM para T46J23-lgG; 1300 nM para C22J13; 147 nM para C7I7; 49 nM para C7A23 y 692 nM para C25K23.

En los ensayos de actividad amidolítica de aPC de ratón, solamente T46J23 pudo inhibir aPC de ratón si bien necesitó de dosis alta (1000 nM). C7I7 y otras IgG no tuvieron efecto sobre aPC de ratón. Los efectos de inhibición de estos anticuerpos sobre la actividad de APC de especie se resumen en la Tabla 6.

Tabla 6. ELISA y Actividad amidolítica Tal como se ilustra en la Figura 14(b), en los ensayos de actividad amidolítica de aPC humana, dos variantes de C25K23 lgG1 conocidas como 2310-lgG2 y 2312-lgG2 mostraron potente inhibición de aPC en un sistema purificado. C25K23 lgG1 tiene una cadena liviana tal como se ilustra en SEQ ID NO: 108 y una cadena pesada tal como se ilustra en SEQ ID NO: 109. TPP-2031 es una C25K23 IgG modificada con una cadena pesada que comprende la modificación N54G. La variante 2310 es una C25K23 IgG modificada con una cadena liviana que comprende las modificaciones A10V, T13A, S78T, R81Q y S82Atal como se ilustra en SEQ ID NO: 112 y una cadena pesada que comprende la modificación N54Q tal como se ilustra en SEQ ID NO:113. La variante 2312 es una C25K23 IgG modificada con una cadena liviana que comprende las modificaciones A10V, T 13A, S78T, R81 Q y S82A tal como se ilustra en SEQ ID NO: 116 y una cadena pesada que comprende la modificación S56A tal como se ilustra en SEQ ID NO:117. Dichas variantes tambien despliegan una alta afinidad a aPC tal como se ilustra en Figura 14(a). TPP-2309 es una C25K23 lgG1 modificada con una cadena liviana que comprende las modificaciones A10V, T13A, S78T, R81Q y S82A tal como se ilustra en SEQ ID NO: 110 y una cadena pesada que comprende la modificación N54G tal como se ilustra en SEQ ID NO:111.

Ejemplo 10. IgG anti-aPC inhiben aPC e inducen formación de coágulos en plasma humano normal El efecto de IgG anti-aPC sobre la actividad anticoagulante de aPC se investigó primero en ensayos de coagulación en plasma humano (aPTT) tal como se ilustra en la Figura 12. Cincuenta por ciento (50 %) de plasma humano tenía un tiempo de coagulación en línea de base de 50-52 seg en ausencia de aPC. La adición de aPC humana al plasma incrementó el tiempo de coagulación a 190 seg según lo esperado, ya que la aPC es un anticoagulante ampliamente conocido. La preincubación de aPC con lgG1 de control negativo (anticuerpo anti-CTX) no alteró el tiempo de coagulación. Por el contrario, la preincubación de aPC con IgG específica anti-aPC acortó el tiempo de coagulación en forma significativa, de manera dependiente de la dosis. A una relación molar 1:1, tanto T46J23-lgG como C7l7-lgG a 1 ug/ml inhibieron actividad de aPC a ~50 % (a 400 ng/ml) y acortaron el tiempo de coagulación de 190 a 114 seg. A 20 ug/ml, todos los tres anticuerpos (T46J23, C7I7, C26B9) completamente revirtieron la actividad anticoagulante de aPC y restauraron la coagulación a normal. R41E3-lgG fue menos potente que estas tres 3 IgG para inhibir aPC. R41E3 restauró parcialmente el tiempo de coagulación a 75 seg e inhibió ~80 % de actividad de aPC a un exceso molar de 163 veces.

El efecto de las variantes modificadas de IgG anti-aPC tambien se investigó en un ensayo de aPTT tal como se ilustra en la Figura 14(c). Nuevamente, en forma similar a los resultados de la Figura 12, la preincubación de aPC con la IgG específica anti-aPC modificada acortó el tiempo de coagulación en forma significativa, de manera dependiente de la dosis.

Ejemplo 11. IgG anti-aPC inhiben aPC e inducen formación de coágulos en plasma de paciente con hemofilia severa.

El efecto de las IgG anti-APC sobre la actividad anticoagulante de aPC se investigó adicionalmente usando plasma de pacientes hemofílicos en ensayo de generación de trombina (TGA, por sus siglas en inglés Thrombin Generation Assay) tal como se ilustra en la Figura 13. Los daños sobre las células que revisten el vaso sanguíneo (células endoteliales) generan la exposición del factor del tejido, lo que conduce a una cantidad limitada de generación de trombina, conocida como vía de coagulación extrínseca. La trombomodulina sobre las células endoteliales contribuye a la generación de aPC y su actividad anticoagulante. El plasma de pacientes con hemofilia severa generó solamente ~50 nM de trombina total. La adición de anticuerpo anti-aPC al plasma de pacientes con hemofilia incremento la generación de trombina, de manera dependiente de la dosis.

Ejemplo 12. Estudios de co-cristales Preparación de anticuerpo y QC Los Fabs humanos anti-aPC recombinantes (C25K23 y T46J23) se expresaron en E. coli y purificaron hasta alcanzar homogeneidad mediante cromatografía de Proteína A. los Fabs purificados mostraron una pureza de >90 % y carencia de de agregación mediante SDS-PAGE y mediante cromatografía por exclusión de tamaño analítica. Sus funciones fueron caracterizadas mediante ensayo de unión a aPC (ELISA). Tanto C25K23Fab como T46J23Fab unen aPC humana de longitud completa y aPC sin dominio Gla a valores de ECso comparables de 2-4 nM tal como se midió a traves de ELISA. Se produjeron 10 miligramos de estos Fabs.

Preparación de antígenos y QC Se adquirió aPC-GD (del inglés aPC-Gla-domain-less) humana derivada de plasma a través de Enzyme Research Lab y se caracterizó mediante ELISA para confirmar que puede ser reconocida tanto por C25K23Fab como por T46J23Fab.

Formación de complejos Para la formación de complejos, se mezclaron 0,9 mg de aPC-GD con 1 ,05 mg de C25K23Fab y la mezcla de reacción se incubó a 4 °C durante 5 horas. La mezcla se cargó sobre una columna de filtración con gel para separar Fab libre o aPC-GD libre del complejo aPC-GD-Fab. Cada fracción fue recogida y analizada mediante SDS-PAGE bajo condición no reductora. Este proceso se repitió tres veces y las fracciones que contenían el complejo aPC-GD-Fab se reunieron y concentraron a 10 mg/ml.

La cristalización de los complejos aPC-Fab bajo diferentes condiciones de cultivo de cristales se realizó para producir cristales adecuados para la determinación de la estructura (resolución máxima < 3 A). Se utilizaron kits de cribado de cristalización de alto rendimiento y se identificaron 2 aciertos: a) 0,1 % n-Octil-3-D-glucósido, citrato sódico tribásico dihidratado 0,1 M PH 5,5, 22 % PEG 3350 b) 18 % 2-propanol, citrato sódico tribásico dihidratado 0,1 M PH 5,5, 22 % PEG4000 Recopilación de datos La determinación de estructura a resolución de 2,2 ángstrom fue exitosa en virtud de la imagen de difracción de cristales aPC-GD-C25K23Fab de Molecular Replacement con estructuras de rayos X para aPC y Fab informadas como modelos (por ejemplo código pdb 1aut de Mather et al., 1996), seguido de conformación y refinación del modelo. En la Figura 15, se ilustra una representación esquemática de la estructura de aPC y C25K23 Fab. Tal como se ilustra en la Figura 15, C25K23 utiliza el lazo CDR3 de su cadena pesada para entrar en contacto con el dominio catalítico de aPC. De manera muy significativa, tal como se ilustra en la Figura 16, la cadena lateral de W104 de C25K23 se inserta en el dominio catalítico de aPC, que tiene superposición esterica con un inhibidor de aPC anteriormente informado (inhibidor tri-peptídico PPACK).

A partir de su estructura, se determinó que el epítope de aPC unido por el anticuerpo está en la cadena pesada de aPC. Los residuos de contacto entre la cadena pesada de aPC y Fab incluyen los residuos de aPC D60, K96, S97, T98, T99, E170, V171, M172, S173, M175, A190, S195, W215, G216, E217, G218 y G218.

Específicamente para Fab C25K23, se determinó que el parátopo comprende los residuos S31, Y32, W53, R57, R101, W104, R106, F107, W110 de la cadena pesada que se ilustra en SEQ ID NO: 18 y K55 de la cadena liviana que se ilustra en SEQ ID NO:8.

Ejemplo 13. Unión de sitio activo Un inhibidor de sitio activo irreversible, biotina-PPACK, se usó para ocupar el sitio activo de aPC humana, véase la Figura 16. Biotina-PPACK-hAPC o aPC humana se colocó sobre una placa de 96 cavidades Maxisorp. Los anticuerpos anti-aPC (Fab e IgG) se diluyeron en serie a 1 :3 de 20 nM a 0,007 nM y se agregaron a las placas y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente. El Fab anti-aPC o IgG anti-aPC unidos se detectaron mediante anticuerpo Fab anti-ratón o antihumano F1RP-conjugado seguido de incubación con sustratos fluorogénicos (rojo amplex y FI2O2) para producir señales fluorescentes (RFU). La placa fue leída por un lector de microplacas con fluorescencia Gemini EM (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Las RFUs a concentración de anticuerpo de 20 nM se presentaron como el promedio de cavidades por triplicado (+/-SD) en el gráfico de barras.

Tal como se ilustra en la Figura 17, se identificaron al menos dos tipos de anticuerpos de la biblioteca. Primero, aquellos que presentan sitio activo dirigido que incluye T46J23 (Fab y hlgG) y C25K23 (Fab y hlgG) que ya no se unen a biotina-PPACK-hAPC (hAPC bloqueado a sitio activo). Segundo, aquellos que no presentan sitio activo dirigido R41C17 que se cree es un anticuerpo de dominio anti-Gla. Estos datos brindan evidencia sólida para la unión de sitio activo de T46J23 y C25K23 sobre aPC humana y explican las características funcionales de estos anticuerpos, es decir bloqueo completo de actividades de hAPC.

Si bien las presentes formas de realización han sido descritas con referencia a las formas de realización y los ejemplos específicos, debería entenderse que es posible realizar varias modificaciones y cambios y que los equivalentes pueden sustituirse sin alejarse del verdadero espíritu y alcance de las reivindicaciones que siguen. La memoria descriptiva y los ejemplos, por consiguiente, han de considerarse en el sentido ilustrativo en vez de restrictivo. Además, la divulgación de todos los artículos, libros, solicitudes de patentes y patentes que se mencionan en la presente se incorporan en la presente por referencia en su totalidad.

Claims (45)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo monoclonal aislado, caracterizado porque se une a proteína C activada e inhibe la actividad anticoagulante pero tiene unión mínima a proteína C no activada, en donde dicho anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID Nos: 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 109, 111, 113, 115, 117 y 119.

2. Un anticuerpo monoclonal aislado, caracterizado porque se une a proteína C activada e inhibe la actividad anticoagulante pero tiene unión mínima a proteína C no activada, en donde dicho anticuerpo comprende una región variable de cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID Nos: 4, 5, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 108, 110, 112, 114, 116 y 118.

3. El anticuerpo monoclonal aislado de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque además comprende una región variable de cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID Nos: 4, 5, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 108, 110, 112, 114, 116 y 118.

4. El anticuerpo monoclonal aislado de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el anticuerpo comprende regiones variables de cadenas pesada y liviana que comprenden: a) una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 y una región variable de cadena liviana que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; b) una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 y una región variable de cadena liviana que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; c) una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 y una región variable de cadena liviana que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; d) una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 y una región variable de cadena liviana que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; e) una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 y una región variable de cadena liviana que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; f) una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 y una región variable de cadena liviana que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 ; g) una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 y una región variable de cadena liviana que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; h) una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 y una región variable de cadena liviana que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; i) una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 109 y una región variable de cadena liviana que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 108; j) una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 111 y una región variable de cadena liviana que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 110; k) una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 113 y una región variable de cadena liviana que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 112; l) una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115 y una región variable de cadena liviana que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 114; m) una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117 y una región variable de cadena liviana que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 116; y n) una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 119 y una región variable de cadena liviana que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 118.

5. Un anticuerpo monoclonal aislado, caracterizado porque se une a proteína C activada e inhibe la actividad anticoagulante pero tiene unión mínima a proteína C no activada, en donde dicho anticuerpo comprende una CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NOs: 94, 95, 97, 98, 99, 101, 102 y 103.

6. El anticuerpo monoclonal aislado de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque además comprende: (a) una CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NOs: 74, 75, 77, 78, 79, 81, 82 y 83, (b) una CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NOs: 84, 85, 87, 88, 89, 91, 92 y 93, o (c) tanto una CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NOs: 74, 75, 77, 78, 79, 81 , 82 y 83 como una CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NOs: 84, 85, 87, 88, 89, 91, 92 y 93.

7. Un anticuerpo monoclonal aislado, caracterizado porque se une a proteína C activada e inhibe la actividad anticoagulante pero tiene unión mínima a proteína C no activada, en donde dicho anticuerpo comprende una CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NOs: 64, 65, 67, 68, 69, 71 , 72 y 73.

8. El anticuerpo monoclonal aislado de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque además comprende: (a) una CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NOs: 44, 45, 47, 48, 49, 51, 52 y 53, (b) una CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NOs: 54, 55, 57, 58, 59, 61, 62 y 63, o (c) tanto una CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NOs: 44, 45, 47, 48, 49, 51, 52 y 53 como una CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NOs: 54, 55, 57, 58, 59, 61, 62 y 63.

9. El anticuerpo monoclonal aislado de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque además comprende una CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NOs: 64, 65, 67, 68, 69, 71, 72 y 73.

10. El anticuerpo monoclonal aislado de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque además comprende: (a) una CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NOs: 74, 75, 77, 78, 79, 81, 82 y 83, (b) una CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NOs: 84, 85, 87, 88, 89, 91, 92 y 93, (c) una CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NOs: 44, 45, 47, 48, 49, 51 , 52 y 53 y (d) una CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NOs: 54, 55, 57, 58, 59, 61, 62 y 63.

11. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque comprende regiones variables de cadenas pesada y liviana que comprenden: a) una región variable de cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NOs: 44, 54 y 64 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NOs: 74, 84 y 94; b) una región variable de cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NOs: 45, 55 y 65 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NOs: 75, 85 y 95; c) una región variable de cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NOs: 47, 57 y 67 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NOs: 77, 87 y 97; d) una región variable de cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NOs: 48, 58 y 68 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NOs: 78, 88 y 98; e) una región variable de cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NOs: 49, 59 y 69 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NOs: 79, 89 y 99; f) una región variable de cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NOs: 51, 61 y 71 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NOs: 81, 91 y 101; g) una región variable de cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NOs: 52, 62 y 72 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NOs: 82, 92 y 102; y h) una región variable de cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NOs: 53, 63 y 73 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NOs: 83, 93 y 103.

12. El anticuerpo monoclonal aislado de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque además comprende una o más modificaciones de aminoácidos.

13. El anticuerpo monoclonal aislado de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque además comprende una o más modificaciones de aminoácidos.

14. Un anticuerpo monoclonal aislado, caracterizado porque se une a proteína C activada e inhibe la actividad anticoagulante pero tiene unión mínima a proteína C no activada, en donde dicho anticuerpo comprende una región variable de cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8, en donde dicha secuencia de aminoácidos comprende una o más modificaciones de aminoácidos.

15. El anticuerpo monoclonal aislado de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la modificación es una sustitución.

16. El anticuerpo monoclonal aislado de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la sustitución es una posición seleccionada entre el grupo que consiste en A10, T13, G52, N53, N54, R56, P57, S58, S78, R81, S82, Q91, Y93, S95, S96, L97, S98, G99, S100 y V101.

17. El anticuerpo monoclonal aislado de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la sustitución se selecciona entre el grupo que consiste en A10V, T13A, G52S, G52Y, G52H, G52F, N53G, N54K, N54R, R56K, P57G, P57W, P57N, S58V, S58F, S58R, S78T, R81Q, S82A, Q91R, Q91G, Y93W, S95F, S95Y, S95G, S95W, S95E, S96G, S96A, S96Y, S96W, S96R, L97M, L97G, L97R, L97V, S98L, S98W, S98V, S98R, G99A, G99E, S100A, S100V, V101Y, V101L y V101E.

18. Un anticuerpo monoclonal aislado, caracterizado porque se une a proteína C activada e inhibe la actividad anticoagulante pero tiene unión mínima a proteína C no activada, en donde dicho anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, en donde dicha secuencia de aminoácidos comprende una o más modificaciones de aminoácidos.

19. El anticuerpo monoclonal aislado de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la modificación es una sustitución.

20. El anticuerpo monoclonal aislado de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la sustitución es una posición seleccionada entre el grupo que consiste en N54 y S56.

21. El anticuerpo monoclonal aislado de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la sustitución se selecciona entre el grupo que consiste en N54G, N54Q, N54A, S56A y S56G.

22. Un anticuerpo monoclonal aislado, caracterizado porque se une a proteína C activada e inhibe la actividad anticoagulante pero tiene unión mínima a proteína C no activada, en donde dicho anticuerpo comprende una región variable de cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, en donde dicha secuencia de aminoácidos comprende una o más modificaciones de aminoácidos.

23. El anticuerpo monoclonal aislado de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la modificación es una sustitución.

24. El anticuerpo monoclonal aislado de conformidad con la reivindicación 23, en donde la sustitución es una posición seleccionada entre el grupo que consiste en T25, D52, N53, N54, N55, D95, N98 y G99.

25. El anticuerpo monoclonal aislado de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la sustitución se selecciona entre el grupo que consiste en T25S, D52Y, D52F, D52L, D52G, N53C, N53K, N53G, N54S, N55K, D95G, N98S, G99H, G99L y G99F.

26. Un anticuerpo monoclonal aislado, caracterizado porque se une a un epítope de proteína C activada humana (aPC humana, SEQ ID NO:3), en donde dicho epítope comprende residuos de una cadena pesada de aPC humana.

27. Un anticuerpo monoclonal aislado, caracterizado porque se une a un epítope de proteína C activada humana (aPC humana, SEQ ID NO:3), en donde dicho epítope comprende S195 de SEQ ID NO:3.

28. Un anticuerpo monoclonal aislado, caracterizado porque se une a un epítope de proteína C activada humana, en donde dicho epítope comprende uno o más residuos seleccionados entre el grupo que consiste en D60, K96, S97, T98, T99, E170, V171, M172, S173, M175, A190, S195, W215, G216, E217, G218 y G218 de SEQ ID NO:3.

29. Un anticuerpo monoclonal aislado, caracterizado porque se une al sitio activo de la proteína C activada.

30. Un anticuerpo monoclonal aislado, caracterizado porque dicho anticuerpo se une a proteína C activada e inhibe la actividad anticoagulante pero tiene unión mínima a proteína C no activada, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo completamente humano.

31. El anticuerpo monoclonal aislado de conformidad con las reivindicaciones 1 a 30, caracterizado porque el anticuerpo se selecciona entre el grupo que consiste en un anticuerpo lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgM, lgA1, lgA2, IgA secretorio, IgD, IgE y fragmento de anticuerpo.

32. El anticuerpo monoclonal aislado de conformidad con las reivindicaciones 1 a 30, caracterizado porque el anticuerpo se une a proteína C activada humana.

33. El anticuerpo monoclonal aislado de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque el anticuerpo además se une a una especie no humana de proteína C activada.

34. El anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 1 a 30, caracterizado porque el tiempo de coagulación de la sangre en presencia del anticuerpo se acorta.

35. Un anticuerpo, caracterizado porque competiría con el anticuerpo como el que se reclama en las reivindicaciones 1 a 30.

36. Una composición farmaceutica, caracterizada porque comprende una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo monoclonal como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

37. Un método para tratar deficiencias o defectos genéticos o adquiridos en la coagulación, caracterizado porque comprende el paso de administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición farmacéutica como la que se reclama en la reivindicación 36 a un paciente.

38. Un método para tratar coagulopatía, caracterizado porque comprende el paso de administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición farmacéutica como la que se reclama en la reivindicación 36 a un paciente.

39. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque la coagulopatía es hemofilia A, B o C.

40. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque la coagulopatía se selecciona entre el grupo que consiste en coagulopatía inducida por trauma o sangrado severo en pacientes.

41. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque además comprende el paso de administrar un factor coagulante.

42. El método de conformidad con la reivindicación 41 , caracterizado porque el factor coagulante se selecciona entre el grupo que consiste en Factor Vlla, Factor VIII o Factor IX.

43. Un metodo para acortar el tiempo de sangrado, caracterizado porque comprende el paso de administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición farmacéutica como la que se reclama en la reivindicación 36 a un paciente.

44. Una molécula de ácido nucleico aislado, caracterizada porque codifica un anticuerpo que se une a proteína C activada e inhibe la actividad anticoagulante pero tiene unión mínima a proteína C no activada, en donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID Nos: 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22 y 23.

45. Una molécula de ácido nucleico aislado, caracterizada porque codifica un anticuerpo que se une a proteína C activada e inhibe la actividad anticoagulante pero tiene unión mínima a proteína C no activada, en donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID Nos: 4, 5, 7, 8, 9, 11, 12 y 13.