MX2014015028A

MX2014015028A - Fragmentos o variantes de fibronectina modificada y usos de los mismos.

Info

Publication number: MX2014015028A
Application number: MX2014015028A
Authority: MX
Inventors: Woei-Jer Chuang; Yung-Sheng Chang
Original assignee: Univ Nat Cheng Kung
Priority date: 2012-06-07
Filing date: 2013-06-07
Publication date: 2015-08-06
Also published as: EP2859113A4; JP2015521588A; TWI580692B; KR20150041619A; CN104968796A; WO2013185027A2; IN2015MN00027A; AU2013271445A1; US9969791B2; SG11201408163VA; US20150218251A1; EP2859113A2; TW201412770A; IL236098A0; AU2013271445B2; JP6297543B2; BR112014030716A2; CA2876135A1

Abstract

La presente invención proporciona polipéptidos aislados que comprenden un fragmento de fibronectina modificada que comprende FNIII 10 y que, opcionalmente, además comprende FNIII 9. También se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden los polipéptidos, y métodos para elaborar y utilizar los polipéptidos.

Description

FRAGMENTOS O VARIANTES DE FIBRONECTINA MODIFICADA Y USOS DE LOS MISMOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona en general con la biología celular y, en particular, con la función e interacción de proteínas de matriz extracelular con integrinas. Más específicamente, la presente invención se refiere a fragmentos de fibronectina humana y/o variantes de los mismos como antagonistas específicos de integrinas, en particular, la integrina a5b1 e integrina anb3. El archivo txt de secuencias sometido con la presente se incorpora para referencia en su totalidad.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las integrinas son una familia de receptores de glicoproteínas de membrana que median interacciones célula-matriz y célula-célula. Las integrinas son heterodímeros, que constan de subunidades a y b. Hasta la fecha se han descrito al menos 24 heterodímeros de integrina distintos, incluyendo 18 subunidades a y 8 b. Las integrinas median el anclaje y la migración de células a través de interacción específica con diferente matriz extracelular (ECM) de proteínas. Además, la supervivencia celular, la división y la diferenciación también se basan en asociaciones de células-ECM eficaces (Morgan et al 2009, IUBMB vida, 61 :. 731-38).

Las integrinas a5b1 y anb3 se localizan en los contactos de adhesión de células cultivadas. La integrina-ECM complejo no sólo sirve para sostener interacciones célula-célula y célula-matriz necesarios para el anclaje y la migración, la formación del complejo célula-ECM también activa la señalización intracelular mediada por la integrina mediante el reclutamiento de enzimas y adaptadores en complejos dinámicas dentro de una célula. Las señales intracelulares aguas abajo de la integrina pueden influir en la expresión génica, la supervivencia celular, la diferenciación y la proliferación. Las integrinas han sido implicadas en muchas condiciones patológicas tales como la angiogénesis y la progresión tumoral.

Varias integrinas se sabe que interactúan con la fibronectina a través de el motivo Arg-Gly-Asp (RGD) presente en la fibronectina. Estas integrinas incluyen 5 integrinas 5an (anb1 , anb3, anb5, anb6 y anbd) y dos integrinas b1 (a5b1 y a8b1) (Smith, W., 2008,/Allergy Clin Immunol 121:... S375-S379). La fibronectina es un alto peso molecular (aproximadamente 440 kDa) glicoproteína de la matriz extracelular que se une a integrinas, así como otras proteínas de la matriz extracelular. La fibronectina existe como un dímero de dos monómeros unidos por enlaces disulfuro en el extremo C-terminal. Cada monómero de fibronectina tiene un peso molecular de 230- 250 kDa que contiene tres tipos de dominios: tipo I, II, y III. Tipo I y II dominios son estabilizadas por puentes disulfuro intracadena, mientras que los dominios de tipo III no contienen enlaces disulfuro. La ausencia de enlaces disulfuro puede resultar en la flexibilidad en la estructura de FN de tipo III de dominio.

Cada dominio contiene una serie de módulos organizados para formar regiones funcionales y de unión a proteínas a lo largo de la longitud de un monómero de fibronectina. Por ejemplo, los módulos de tipo I dominios se requieren para la iniciación de montaje de la matriz de fibronectina, y los módulos, tanto en tipo I y tipo III dominios son importantes para la asociación con otras moléculas de fibronectina. El motivo RGD se encuentra en el módulo 10 de la III dominio tipo (FNIII 10), y constituye el sitio de unión de la fibronectina a integrinas a5b1 y anb3. La secuencia en el módulo de tipo III de dominio 9 (FNIII 9), especialmente el bucle sinergia PHSRN, facilita la unión de la fibronectina a la integrina a5b1. Integrina anb3 unión de fibronectina no requiere el efecto sinérgico de módulo 9.

Debido a los papeles de integrinas 1 en la regulación de una variedad de funciones celulares, la viabilidad de utilizar antagonistas de integrina como tratamientos de enfermedades ha sido estudiado. Por ejemplo, los antagonistas de la integrina aIP> b3, la integrina que activa la agregación de plaquetas, se experimentó como un anti-coagulante para el tratamiento de enfermedades vasculares isquémicas relacionadas con la trombosis (Coller et al, 2008, Blood, 112:.3011-25). Desintegrina, tales como Rhodostomin, es una familia de pequeñas antagonistas de la proteína integrina que se encuentran naturalmente en el veneno de serpiente que inhibe la agregación plaquetaria mediada por la integrina y la adhesión celular. Desintegrina, sin embargo, es no específica y altamente inmunogénica. Compite con fibronectina para la unión a integrinas b1- y que contiene p3-sobre la superficie celular y no discriminadamente inhibe las actividades de las integrinas a5b1, anb3 y integrina aI^b3. Por lo tanto, el uso de desintegrina como un antagonista de integrinas a5b1 y mensajes anb3 un alto riesgo de hemorragia debido a su actividad antagonista de aI^b3 que previene la agregación plaquetaria y la coagulación de la sangre.

Del mismo modo, la proteína de Yersinia pseudotuberculosis invasina es una proteína de unión a integrina. La proteína invasina bacteriana facilita la entrada de bacterias en las células mediante la unión a integrinas. El uso de invasina como un antagonista de integrina es problemático porque la proteína bacteriana es probable altamente inmunogénica y porque la especificidad de la proteína invasina no está definido.

En altas concentraciones, FNIII 9-10 a algunos imita medida la actividad biológica de la molécula de fibronectina de longitud completa (van der Walle et al, 2002, Protein Engineering 15:. 1021-1024). FNIII9-10 compite con otras proteínas ECM para la unión a integrinas. Tal molécula de fibronectina truncado o fragmento que comprende el dominio de unión de la integrina, por ejemplo, FNIII 10 o FNIII 9-10, es menos inmunogénica en seres humanos y tiene mayor especificidad, en comparación con distintegrinas, y por lo tanto no causa hemorragia. Sin embargo, existen dificultades al usar fibronectina truncada como antagonistas de integrina. Una de las dificultades es la estabilidad y solubilidad. FNIII Humano 9 o FNIII 9-10 solo es estructuralmente inestable (véase van der Walle, supra). Además, FNIII 9-10 a alta concentración es insoluble, lo que presenta grandes desafíos a su preparación a gran escala y la producción. Por lo tanto, hay una necesidad de un antagonista de integrina mejor diseñado con baja inmunogenicidad, alta especificidad, y una mayor estabilidad y solubilidad.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La invención proporciona, entre otras cosas, los antagonistas de la integrina y usos de los mismos que no se ven obstaculizados por las limitaciones que se encuentran en la téenica anterior.

Se descubrió inesperadamente por los presentes inventores que la fibronectina humana mutante o modificado fragmentos (FN) descritos en este documento exhiben actividad antagonista de la integrina. Además, los FNIII 10 o FNIII 9-10 mutantes o variantes descritas en este documento mostraron aumento de la solubilidad y la estabilidad en comparación con los fragmentos de FN con secuencias del tipo silvestre.

En FN humana, el motivo RGD se encuentra en un bucle de tipo III de dominio 10 que es en gran medida desordenado y móvil, la flexibilidad, presumiblemente, es importante para su función. Los presentes inventores descubrieron inesperadamente que, el aumento de la rigidez intradominio mediante la introducción de un enlace di-sulfuro de diseñado dentro de FNIII 10 que confieren una mejor solubilidad y la estabilidad y/o actividad antagonista mantenido o mejorado para la integrina a5b1 y/o la integrina anb3. En ciertas realizaciones particulares, los fragmentos FNIII de la invención demuestran una solubilidad de al menos desde aproximadamente 20 a aproximadamente 24 mg/ml en una solución a pH 7,0. En ciertas otras formas de realización particulares, los fragmentos FNIII de la invención demuestran una solubilidad de al menos desde aproximadamente 7 a aproximadamente 27 mg/ml. En ciertas realizaciones particulares, la solubilidad se logra en la ausencia de libre de amino ácidos Arg y Glu. En ciertas otras realizaciones, las FNIII fragmentos de la invención demuestran un aumento de la solubilidad en desde aproximadamente 10% a aproximadamente 300%, en particular desde aproximadamente 20% a aproximadamente 280%, 25% a aproximadamente 250%, 30% a aproximadamente 200%, 20% a aproximadamente 150%, en comparación con FNIII fragmentos que tienen las secuencias del tipo silvestre humanos.

Aunque no es necesario para la unión a integrina anb3, se cree que el módulo 9 para proporcionar una mejora sinérgica de la unión a la integrina a5b1. Los presentes inventores sorprendentemente descubrieron que, en presencia de FNIII 9, un enlace di-sulfuro introdujo en el módulo 10 a través de dos sustituciones de Cys que flanquean el motivo RGD, por ejemplo que comprende la fórmula Cys-Cys-X8, aún más, por ejemplo, que comprende la fórmula Cys1490X2RGDX3Cys1499, puede mejorar la solubilidad y estabilidad de los FNIII 9-10 variantes y aumentar su integrina a5b1 actividad antagonista. Además, los presentes inventores descubrieron inesperadamente que un enlace di-sulfuro de diseñado en el módulo FNII1 10 flanquean el motivo RGD, por ejemplo que comprende la fórmula Cys-Cys-X7, aún más, por ejemplo, que comprende la fórmula Cys1491 XRGDXaCys 1499, puede mejorar la solubilidad y estabilidad de la FNIII 10 variantes y su actividad antagonista para anb3 integrina. Además, los presentes inventores sorprendentemente descubrieron que, en el contexto de FNIII 9-10, variantes con las sustituciones de Cys que comprenden la fórmula, por ejemplo, Cys-Cys-X7 y, además, por ejemplo Cys1491XRGDX3Cys1499 exhibe especificidad de unión para la integrina anb3 lugar de a5b1 integrina.

Por lo tanto, en un aspecto, la invención proporciona polipéptidos aislados que comprenden un fragmento de fibronectina humana modificada que comprende fibronectina de tipo III humano módulo de dominio 10 (FNIII 10), en el que el FNIII 10 comprende un motivo Arg-Gly-Asp (RGD) y dos sustituciones de Cys para formar un enlace disulfuro, en el que una sustitución Cys es N-terminal con el motivo RGD y la otra sustitución Cys es C-terminal con el motivo RGD, y en el que el FNIII 10 comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 98% homologa a SEQ ID NO: 2. En ciertas realizaciones, el polipéptido o inhibe es capaz de inhibir la integrina a5b1 integrina o anb3 actividad y no inhibir la actividad de la ¡ntegrina allb 3. A lo largo de la presente solicitud, el fragmento de fibronectina humana modificada puede comprender además opcionalmente otros módulos y/o dominios de fibronectina humana. En ciertas realizaciones, la fibronectina humana modificada comprende además módulo de tipo III de dominio 9, y el módulo de dominio de fibronectina de tipo III humano 9 y 10 (FNIII 9-10) comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 98% homologa a SEQ ID NO: 4. En ciertas otras realizaciones, el FNIII 9-10 opcionalmente comprende además la Leu a la sustitución de Pro en la posición de aminoácido 1408 en el módulo 9.

En ciertas realizaciones, las sustituciones de dos Cys están separados por aproximadamente 6 a aproximadamente 9 residuos de aminoácidos, que flanquean el motivo RGD. En ciertas otras realizaciones, las dos sustituciones de Cys están separados por 7 u 8 residuos de aminoácidos. En ciertas realizaciones, los dos sustituciones de Cys se encuentran dentro de las posiciones de aminoácidos 1487-1501. En ciertas otras realizaciones, el FNIII 10 comprende, además, la sustitución de al menos un ácido amino en la posición de aminoácido 1491, 1492, 1496, 1497 o 1498, y en el que la sustitución de aminoácido en la posición 1491 es Arg o lie, la sustitución de aminoácido en la posición 1492 es Ala o Pro, la sustitución de aminoácido en la posición 1496 es Met, Asn o Trp, la sustitución de aminoácido en la posición 1497 es Asn, y la sustitución de aminoácido en la posición 1498 es Asp o Glu. La numeración de los aminoácidos utilizados en toda la aplicación se basa en la numeración de aminoácidos de la proteína fibronectina humana de longitud completa (SEQ ID NO: 74). Por ejemplo, el residuo Thr en la posición de aminoácido 1491 en base a la secuencia de SEQ ID NO: 74 se refiere al residuo Thr en la posición del aminoácido 76 de FNIII 10 como se muestra en SEQ ID NO: 2.

En ciertas realizaciones particulares, las sustituciones son Cys Thr a la sustitución de Cys en la posición de aminoácido 1491 (T1491C) y Ser a Cys sustitución en la posición de aminoácido 1499 (S1499C). En ciertas realizaciones, el FNIII 10 comprende la fórmula C1491XÍ (n) RGDX2 (n) C1499 en el que dicho n es 1 , 2 o 3, en el que Xi y X2 pueden representar los mismos o diferentes restos de aminoácidos. En ciertas realizaciones particulares, la FNIII 10 comprende la fórmula C Xi (i) RGDX2 (3) C. En ciertas realizaciones particulares, el polipéptido inhibe la actividad de la integrina anb3.

En aún otras realizaciones, el FNIII 10 comprende la fórmula Cys1491 -Xi-Arg-Gly-Asp-X2-X3-X4-Cys1499, en el que Xi es Gly, Ala o Pro; X2 es Ser, Met, Asn o Trp; X3 es Pro o Asn; y X4 es Ala, Asp o Glu. En ciertas realizaciones particulares, Xi es Pro, X2 es Met, X3 es Pro, y X4 es Asp. En ciertas otras formas de realización particulares, Xi es Pro, X2 es Trp, X3 es Asn, y X4 es Glu. En aún otras realizaciones particulares, Xi es Ala, X2 es Asn, X3 es Pro, y X4 es Asp. En ciertas realizaciones particulares, Xi es Gly, X2 es Ser, X3 es Pro, y X4 es Ala En ciertas otras realizaciones, el polipeptido tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 12. En ciertas realizaciones particulares, el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. En ciertas otras formas de realización particulares, el polipéptido inhibe o es capaz de inhibir selectivamente la actividad de la integrina anb3 selectivamente.

En ciertas otras formas de realización, en el que el fragmento de fibronectina humana modificada comprende además de fibronectina de tipo III humano módulo de dominio 9 (FNIII 9) que comprende opcionalmente a la sustitución de Leu Pro en la posición de aminoácido 1408, y en el que el FNIII 9 y 10 FNIII (FNIII 9-10 ) comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 98% homologa a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. En ciertas realizaciones, el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, o SEQ ID NO: 26. En ciertas realizaciones particulares, el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20.

En ciertas otras realizaciones, las sustituciones son Cys Val a la sustitución de Cys en la posición de aminoácido 1490 (V1490C) y Ser a la sustitución de Cys en la posición de aminoácido 1499 (S1499C), en el que el fragmento de fibronectina humana modificada opcionalmente comprende además de fibronectina de tipo III humano módulo de dominio 9 que opcionalmente comprende además la Leu a la sustitución de Pro en la posición del aminoácido 1408. en ciertas realizaciones, el FNIII 10 comprende la fórmula Cys1490-X1-X2-Arg-Gly-Asp-X3-X4-Pro-Cys1499, en el que, Xi es Thr, Arg o mentira; X2 es Gly, Ala o Pro; X3 es Phe, Arg, Asp, Ser, Met o Asn; y X4 es Ala o Asp. En ciertas realizaciones particulares, Xi es Arg, X2 es Ala, X3 es Asn, y X4 es Asp. En ciertas otras realizaciones, el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109 o SEO ID NO: 110. En ciertas realizaciones particulares, el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109 o la SEQ ID NO: 110. En ciertas formas de realización particulares, el polipéptido selectivamente inhibe o es capaz de inhibir selectivamente la actividad de la integrina a5b1. En cierta realización, las sustituciones son Cys Val a la sustitución de Cys en la posición de aminoácido 1490 (V1490C) y Ser a la sustitución de Cys en la posición de aminoácido 1499 (S1499C), en el que el fragmento de fibronectina humana modificada opcionalmente comprende además de fibronectina de tipo III humano módulo de dominio 9 que opcionalmente comprende además la Leu a la sustitución de Pro en la posición de aminoácido 1408 y opcional la sustitución de Asn a Ala en la posición de aminoácido 1341, el HIS Pro sustitución en la posición de aminoácido 1377, el Pro a la sustitución de Lys en el aminoácido 1376, o el Pro a la sustitución de Asp en la posición del aminoácido 1376. en ciertas realizaciones particulares, el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: III, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113 o la SEQ ID NO: 114.ln cierto en particular formas de realización, el polipéptido inhibe o es capaz de inhibir selectivamente la actividad de la integrina a5b1 selectivamente.

Se pensaba Flexibilidad de la vinculación entre dominios FNIII 9-10 para permitir grandes cambios conformacionales en la proteína FN humana. Parcial desacoplamiento estructural de FNIII 9 y FNIII 10 por la extensión del enlazador en la interfaz FNIII 9-10 conducido a la pérdida de la unión sinérgica de módulo 9 (Altroff et al, 2004,/Biological Chemistry, 279:.. 55995-56.003 ). Los resultados anteriores mostraron que la rigidez interdomain introducido por un enlace disulfuro través de la unión de módulos 9 y 10 abolió la actividad de adhesión celular sinérgica de FNIII 9-10 través de la unión a la integrina a5b1, y redujeron su afinidad con FNIII integrina 9-independiente anb3 vinculante (Altroff et al., supra).

Los presentes inventores, sin embargo, sorprendentemente descubrieron que un enlace entre dominios entre los módulos 9 y 10 creadas por un enlace no covalente mantuvo su afinidad de unión a integrinas a5b1. El enlace no covalente puede proporcionar la orientación adecuada para FNIII 9 y FNIII10 y facilitar la unión a la integrina a5b1.

Por lo tanto, en otro aspecto, la invención proporciona polipéptidos aislados que comprenden un fragmento de fibronectina humana modificada que comprende fibronectina de tipo III humano de dominio módulo 9 y fibronectina humana de tipo III de dominio módulo 10 (FNIII 9-10), en el que FNIII 9 comprende opclonalmente a la sustitución de Leu Pro en la posición de aminoácido 1408, en el que FNIII 9 y/o FNIII 10 comprende al menos una sustitución de aminoácido, en el que los residuos de aminoácidos en FNIII 9 y FNIII 10 forma un enlace no covalente, y en donde FNIII 9 y FNIII 10 comprenden un amino secuencia de ácido que es al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 98% homologa a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 y que no es la SEQ ID NO: 64. En ciertas realizaciones particulares, el polipéptido inhibe o es capaz de inhibir la actividad de la integrina a5b1.

De acuerdo con este aspecto de la invención, en ciertas realizaciones, las sustituciones de aminoácidos en FNIII 9 y 10 FNIII formar un enlace disulfuro entre dominios. En ciertas otras realizaciones, las sustituciones de aminoácidos en FNIII 9 y 10 FNIII formar un puente de hidrógeno entre dominios. En ciertas realizaciones particulares, la sustitución de aminoácidos en FNIII 9 es Ala a la sustitución de Asp en la posición del aminoácido 1340 (A1340D) y la sustitución de aminoácidos en FNIII 10 es Val a la sustitución de Lys en la posición de aminoácido 1442 (V1442K) (Figura 4). En ciertas realizaciones adicionales, el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40. En ciertas otras realizaciones, la sustitución de aminoácidos en FNIII 10 es Thr a la sustitución de Arg en la posición de aminoácido 1491 (T1491R). En ciertas realizaciones particulares, el enlace se forma entre dominios no covalente entre Asn en la posición de aminoácido 1341 y el residuo de aminoácido en la posición 1491. En ciertas realizaciones adicionales, el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 72.

En un aspecto adicional, la invención proporciona polipéptido aislado que comprende un fragmento de fibronectina humana modificado que comprende fibronectina de tipo III humano módulo de dominio 10 (FNIII 10) que comprende la fórmula Val1490-Xi-X2-Arg-Gly-Asp-X3-X4-X5- Xe-Ser1500, en el que Xi es Thr o Arg; X2 es Ala o Pro; X3 es Met, Trp o Asn; X4 es Pro o Asn; X5 es Asp o Glu; y X6 es Ser o Gly, en el que el fragmento de fibronectina modificada comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 98% homologa a SEQ ID NO: 2 y SEQ ID no es NO: 50. En cierta realización particular, X! es Thr; X2 es Pro; X3 es Met; X4 es Pro; X5 es Asp; y X6 es Ser. En cierta otra realización particular, Xi es Thr; X2 es Ala; X3 es Asn; X4 es Pro; X5 es Asp; y X6 es Ser. En realizaciones adicionales, Xi es Arg; X2 es Ala; 3 es Asn; X4 es Pro; X5 es Asp; y Cb es Ser. En ciertas realizaciones particulares, el polipéptido inhibe o es capaz de inhibir la integrina a5b 1 actividad y/o la integrina anb3 actividad. En ciertas otras realizaciones, el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 52 o SEQ ID NO: 54. En ciertas realizaciones particulares, el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48.

De acuerdo con este aspecto de la invención, en ciertas realizaciones, el fragmento de fibronectina modificado comprende además de fibronectina de tipo III humano módulo de dominio 9 (FNIII 9) que comprende opcionalmente a la sustitución de Leu Pro en la posición de aminoácido 1408, y en el que el FNIII 9 y FNIII 10 (FNIII 9-10) comoprises una secuencia de aminoácidos que es al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 98% homologa a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. En ciertas realizaciones particulares, el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60 o SEQ ID NO: 62. En ciertas realizaciones particulares, el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 60 o SEQ ID NO: 62.

Todas las realizaciones descritas en este documento se pueden combinar con otras realizaciones menos que esté claro por el contexto que no pueden. Por ejemplo, un fragmento de fibronectina modificada que comprende FNIII 9-10 que comprende un enlace disulfuro intradominio puede comprender, además, un enlace entre dominios FNIII diseñado entre 9 y FNIII 10. Otras combinaciones también se entiende que estén abarcados por la presente invención.

En un aspecto adicional, se proporcionan composiciones que comprenden los polipéptidos descritos en el presente documento. En aún otro aspecto, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden los polipéptidos de la invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable, diluyente o vehículo. En ciertas realizaciones particulares, las composiciones farmacéuticas comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de los polipéptidos descritos en diversos aspectos descritos anteriormente.

En un aspecto adicional, la invención proporciona procedimientos de inhibición mediada por la ¡ntegrina adhesión celular, el crecimiento, la migración o la diferenciación, que comprende la etapa de poner en contacto una célula con una cantidad eficaz del polipéptido de la presente invención, en el que la ¡ntegrina comprende anb3 y/o a5b1 ¡ntegrina. De acuerdo con estos aspectos de la invención, en ciertas realizaciones de la ¡ntegrina es anb3 ¡ntegrina. En ciertas realizaciones adicionales, el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 44 o SEQ ID NO: 56. En ciertas realizaciones particulares, el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. En ciertas otras realizaciones adicionales, la ¡ntegrina es ¡ntegrina a5b1, y el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56 o SEQ ID NO: 58. En ciertas realizaciones particulares, el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32.

En aún otro aspecto, la invención proporciona métodos para inhibir la adhesión celular mediada por la ¡ntegrina, el crecimiento, la migración o la diferenciación en un mamífero, que comprende la etapa de administrar a un mamífero en necesidad del mismo una composición farmacéutica que comprende los polipéptidos de la invención descritos en este documento, en el que la integrina es anb3 o a5b1. En otros aspectos, la invención proporciona métodos para inhibir o tratar el crecimiento tumoral, la progresión tumoral o la metástasis tumoral en un mamífero, que comprende la etapa de administrar a un mamífero una composición farmacéutica que comprende los polipéptidos de la invención descritos en este documento, en el que el tumor expresa anb3 o a5b1. En ciertas realizaciones, la composición farmacéutica comprende una cantidad terapéutica eficaz de los polipéptidos de la invención descritos en este documento. De acuerdo con estos aspectos, en ciertas realizaciones, la integrina es anb3 integrina, y el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 48 o SEQ ID NO: 56. En ciertas otras realizaciones, la integrina se integrina a5b1, y el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62 o SEQ ID NO: 72. En ciertas realizaciones particulares, el mamífero es un humano.

En aún un aspecto adicional, la invención proporciona procedimientos de inhibición de una enfermedad relacionada con la angiogénesis en un mamífero que comprende administrar a un mamífero en necesidad del mismo composiciones farmacéuticas que comprenden los polipéptidos de la invención descrito en el presente documento, en el que la enfermedad relacionada con la angiogénesis es el cáncer, degeneración macular, edema o artritis. De acuerdo con este aspecto, en ciertas realizaciones particulares, la enfermedad relacionados con la angiogénesis comprende una enfermedad mediada por la integrina anb3 y/o a5b1; En ciertas otras realizaciones, la composición farmacéutica comprende un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62 o SEQ ID NO: 72.

En aún otro aspecto, la invención proporciona polinucleótidos aislados que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de la invención descrito en el presente documento. En ciertas realizaciones, los polinucleótidos comprenden una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: II, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 51 , SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, o SEQ ID NO: 61. En ciertas realizaciones particulares, los polinucleótidos comprenden una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59 o SEQ ID NO: 61.

En otros aspectos, la invención proporciona vectores de expresión que comprenden los polinucleótidos de la invención descritos en este documento, o células huésped que comprenden los vectores de expresión. En un aspecto adicional, la invención proporciona métodos de preparación de un polipéptido que comprende las etapas de (a) cultivar la célula huésped proporcionada en el presente documento en condiciones eficaces para permitir la expresión del polipéptido codificado a partir del vector de expresión; y (b) recuperar el polipéptido del cultivo. En ciertas formas de realización particulares, los polipéptidos aislados se recuperan en un tampón sin libre Arg y/o Glu.

Las realizaciones específicas de la presente invención resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción más detallada de ciertas realizaciones preferidas y las reivindicaciones.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es una ilustración de un FNIII 10 humano ejemplar modificado con un enlace disulfuro intradominio diseñado formado en la región del bucle RGD entre las sustituciones T 1491 C y S1499C.

La Figura 2 muestra la alineación de secuencia de aminoácidos del tipo silvestre humana FNIII 9-10 (SEQ ID NO: 4) con ortólogos de diferentes especies de mamíferos: Chimpancé (GenBank Número de Acceso: XP_003309506) (SEQ ID NO: 66); Cow (DAA32456) (SEQ ID NO: 67); Verraco (XP_003133691) (SEQ ID NO: 68); Mouse (BAE28040) (SEQ ID NO: 69); y la rata (EDL75262) (SEQ ID NO: 70). Clave: "*" idéntico; Sustitución conservada; sustitución semi-conservador.

Las Figuras 3A-3C muestran la termoestabilidad y la solubilidad del tipo silvestre y mutantes fragmentos de FN como se muestra por RMN (Fig. 3A), diferencial de barrido caliometry y sulfato de amonio de precipitación (Fig. 3B, 3C). En la Fig. 3B: FNIII 9-10 L1408P- pico central, cuadrado; FNIII 9-10 L1408P (RARGDNPD) - pico izquierda, triángulo; y FNIII 9-10 L1408P (CRARGDNPDQ- pico derecha, círculo En la Figura 3C: FNIII 10- pico medio, círculo; FNIII 10 (PRGDMPD) proteína (SEQ ID NO:.. 48) - pico izquierdo, cuadrado, y FNIII 10 (CPRGDMPDC) proteína (SEQ ID NO: 6) - pico derecha, triángulo.

La Figura 4 muestra una ilustración de un ejemplo de modificar FNIII 9-10 con un puente de hidrógeno entre dominios de diseñado formado entre la sustitución A1340D en el módulo 9 y la sustitución V1422K en el módulo 10.

La Figura 5A presenta modelos informáticos que muestran la interacción entre la superficie FNIII 9 con la subunidad de integrina CC5 (panel derecho). Los posibles puntos de interacción se indican.

La Figura 5B muestra los modelos de conexión para equipo de FNIII 9-10 L1408P-CRA (SEQ ID NO: 32) de unión a integrina complejos y selectividad de unión de la integrina sobre la base de la energía calculada de acoplamiento.

Las Figuras 6A-6C muestran los resultados de purificación de diferentes FNIII 9-10 variantes por Ni2 + - cromatografía de quelación. El perfil de elución se analizaron por la medición de A280 (absorbancia) (izquierda) e imágenes de tinción con azul de Coomassie de electroforesis en gel de SDS (derecha) de FNIII 9-10 variantes en la forma de monómeros o dímeros formados por enlace SS intermolecular en presencia o ausencia de el agente reductor 2- mercaptoetanol.

Las Figuras 7A-7D muestran los resultados de los efectos de diversos fragmentos FNIII sobre la migración celular, la supervivencia celular y el crecimiento celular. Figura 7A el panel de la izquierda presenta un gráfico de barras que resume el efecto inhibidor de FNIII 9-10 L1408P (CRARGDNPDC) (SEQ ID NO: 32) en las células A549 migración y el panel derecho presenta un gráfico de barras que resume el efecto inhibidor de FNIII 10 (CPRGDMPDC) proteína (SEQ ID NO: 6) en las células A375. Figura 7B presenta un gráfico de barras que muestra que varias variantes FNIII inducidos detención Gl en células de melanoma A375. Las Figuras 7C y 7D son gráficos de barras que muestran que varios fragmentos FNIII indujeron apoptosis en células A375 y células A549, repectively.

Las Figuras 8A-8B presentan la termoestabilidad (8A) y solubilidad (8B) de las variantes 9 FNIII 9-10.

Las Figuras 9A-9B presentan la termoestabilidad (A) y la solubilidad (B) de FNIII 10 variantes.

Las Figuras 10A-10B muestran la inhibición actual de formación de tubo inducida por VEGF (A) por FNIII 9-10 variante, un antagonista de integrina a5 ¡-específica y no la inhibición de la formación de tubos inducida por bFGF por 9 10Fn3 variante (B).

La Figura 11 presenta la inhibición de la angiogénesis inducida por VEGF por FNIII 9-10 (CRARGDNPDC) variante (SEQ ID NO: 32), AN-a5pl específico del receptor de integrina.

La Figura 12 presenta la inhibición de la angiogénesis inducida por bFGF por FNIII 10 (CPRGDMPDC) variante (SEQ ID NO: 6), un antagonista de integrina-ccvP3 específica.

La Figura 13 presenta la inhibición del crecimiento tumoral en A375-cojinete NOD-SCID ratones por FNIII 9-10 (CRARGDNPDC) variante (SEQ ID NO: 32) de una manera dependiente de la dosis.

Las Figuras 14A-14C presenta la inhibición del crecimiento tumoral en A549-cojinete NOD-SCID ratones por FNIII 10 (CPRGDMPDC) variante (SEQ ID NO: 6) de una manera dependiente de la dosis.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patentes citadas en este documento se incorporan expresamente para referencia para todos los propósitos.

Dentro de esta aplicación, a menos que se indique lo contrario, las téenicas utilizadas se pueden encontrar en cualquiera de varias referencias conocidas como: Clonación molecular: (. Sambrook, et al, 1989, Coid Spring Harbor Laboratory Press) A Laboratory Manual y Protocolos de PCR: Una guía para Métodos y Aplicaciones (Innis, et al. 1990. Academic Press, San Diego, CA). A menos que se proporcionan definiciones específicas, la nomenclatura utilizada en relación con, y los procedimientos y técnicas de la biología molecular, diseñado genética, química analítica, química orgánica sintética, y la química medicinal y farmacéutica descrita de laboratorio en el presente documento son aquellos bien conocidos y utilizados comúnmente en el art. Las técnicas estándar se pueden utilizar para síntesis químicas, análisis químicos, preparación farmacéutica, formulación, y la entrega, y el tratamiento de los pacientes.

A menos que sea requerido por el contexto, los términos singulares incluirán pluralidades y plural términos incluirán el singular. Por ejemplo, la referencia a un "polipéptido" significa uno o más polipéptidos.

Como se describe a continuación, la invención proporciona polipéptidos aislados que comprenden un fragmento de fibronectina humana modificada que comprende fibronectina de tipo III humano módulo de dominio 10 (FNIII 10), en el que el FNIII 10 comprende un motivo Arg-Gly-Asp (RGD), en el que la fibronectina humana modificada fragmento comprende al menos una sustitución de aminoácidos, y en donde el fragmento de fibronectina humana modificada comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, o al menos 98% homologa a SEQ ID NO: 2. En ciertas realizaciones, el fragmento de fibronectina humana modificada comprende además FNIII 9, que comprende además opcionalmente a la sustitución de Leu Pro en la posición de aminoácido 1408, y en el que el fragmento de fibronectina humana modificada comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 98% homologa a SEQ ID NO: 4. La numeración de los aminoácidos utiliza en esta solicitud sigue la numeración de aminoácidos de longitud completa maduro fibronectina humana (SEQ ID NO: 74). Las secuencias de ADNc y proteína de fibronectina humana de longitud completa se basan en GenBank números de acceso NM_212476 (SEQ ID NO: 73) y NP_997641 (SEQ ID NO: 74) respectivamente.

También se incluyen dentro de la presente invención son polipéptidos aislados que comprenden modificados fragmentos de fibronectina que comprende, además de la inventiva modificado FNIII 10 o modificados FNIII 9-10, módulos y dominios de fibronectina adicionales, incluyendo, sin limitación módulo 6, el módulo 7 y/o módulo 8 de fibronectina de tipo III de dominio. De longitud completa polipéptidos FN con el uno o más inventivas mutaciones descritas en este documento también se incluyen dentro del alcance de la invención.

Fibronectina humana se une la ¡ntegrina a5b1 y anb3 integrina a través del motivo RGD, que reside en FNIII 10. Véase la Figura 1. solos FNIII 10, sin embargo, muestra sólo una baja afinidad por anb3 integrina. Los presentes inventores descubrieron inesperadamente que la introducción en el bucle RGD un enlace di-sulfuro de ¡ntracatenarios formado entre dos sustituciones de Cys dentro de FNIII 10 mejoró la unión a integrina y/o antagonista de la actividad de FNIII 10. Además, se descubrió inesperadamente que las sustituciones de Cys que comprende la fórmula Cys1491 -X--RGD-X2-X3-X4-Cys1499 mejoró la integrina anb3 actividad antagonista en el contexto de cualquiera de FNIII 10 o FNIII 9-10. Por otro lado, modificado FNIII 9-10 que comprende la fórmula Cys1490-Xi-X2-Arg-Gly-Asp-X3-X4-Pro-Cys1499 exhibió integrina igual o superior a5b1 actividad antagonista en comparación con FNIII 9-10 con la naturaleza secuencia de tipo. En ciertas otras realizaciones, otras mutaciones, incluyendo sustituciones conservadoras de aminoácidos pueden ser introducidos en el fragmento de fibronectina de la invención modificado descrito en el presente documento sin afectar a la actividad deseable del fragmento de fibronectina modificado.

Se cree que la actividad biológica en una concentración elevada, FNIII 9-10 en algunos imita medida de longitud completa FN. FNIII 9-10 o FNIII 10 se sabe que son estructuralmente inestables en solución. Se informó previamente de que un Leu a Pro sustitución en la posición de aminoácido 1408 (L1408P) la mejora de la estabilidad de FNIII 9. Véase van der Walle et al., Supra. También se informó previamente que un Asp Asn a la sustitución en la posición de aminoácido 1422 (D1422N) dentro de FNIII 10 mejoró la estabilidad de FNIII 10 (Koide A., et al Bioquímica 2001, 40:. 10326-10333). Los presentes inventores, sin embargo, descubrieron inesperadamente que un enlace di-sulfuro de diseñado formado dentro del bucle RGD, que comprende por ejemplo la fórmula Cys1491XRGDX3Cys1499 aumenta la estabilidad y la solubilidad del fragmento de FN FNIII 9-10 y FNIII 10, independientemente de la presencia de la L1408P y/o por la sustitución D1422N. También se descubrió por los inventores instantáneos que un enlace di-sulfuro de diseñado formado dentro del bucle RGD que comprende la fórmula Cys1490X2RGDX3Cys1499 aumenta la estabilidad y la solubilidad del fragmento de FN 9-10 FNIII.

A diferencia de algunos otros integrina natural b1 proteína de unión tales como invasina de Yersinia pseudotuberculosi, la superficie de interacción de la integrina a5b1 de FNIII 9-10 es menos flexible debido a la mínima interacción entre los dos módulos. Ver hamburguesa y otros, Science, 1999, 286:. 291. Flexibilidad estructurales entre módulo FN 9 y el módulo 10 se ha sugerido para ser importante en mantener la función biológica FN. Ver Altroff et al., Supra; Van Nhieu et al. 1996,/. Biol. Chem. 271: 7665-72: y Biochemistry 37: 10945 (1998). Sorprendentemente, se ha descubierto por los presentes inventores, sin embargo, que restringe el movimiento entre dominios FNIII entre 9 y 10 FNIII no afectó a la integrina a5b1 actividad antagonista de FNIII 9-10.

De acuerdo con este aspecto de la invención, en ciertas realizaciones, la invención proporciona polipéptidos aislados que comprenden un fragmento de fibronectina humana modificada que comprende fibronectina de tipo III humano de dominio módulo 9 y fibronectina humana de tipo III de dominio módulo 10 (FNIII 9-10), en el que el FNIII 9 comprende opcionalmente a la sustitución de Leu Pro en la posición de aminoácido 1408, en el que el FNIII 9 y el FNIII 10 cada uno comprende al menos una sustitución de aminoácidos, en el que las sustituciones de aminoácidos en la FNIII 9 y la forma FNIII 10 un enlace no covalente, y en el que el FNIII 9 y 10 FNIII comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 98% homologa a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 y que es no SEQ ID NO: 64. En ciertas realizaciones particulares, el polipéptido inhibe la actividad de la integrina a5b1.

Mediante el uso de modelo de acoplamiento tridimensional asistido por ordenador, los presentes inventores identificaron restos de aminoácidos de FNIII 9 que están involucrados en la interacción con la subunidad CC5 integrina (Figura 5 A, panel derecho). El modelo de acoplamiento también muestra que FNIII 9 no interactúa con el ALLB o AV subunidad. Modelo de acoplamiento generada por ordenador de FNIII 9-10 L1408P CRARGDNPDC (SEQ ID NO: 32) demuestra que esta variante FNIII muestra selectiveity para la integrina a5b1 de unión como se evidencia por la energía de acoplamiento favorable (Figura 5B, panel inferior).

Además de las diversas realizaciones descritas en el presente documento, polipéptidos que comprenden fragmento de FN modificado que comprende sustituciones de aminoácidos adicionales que no afectan a la actividad antagonista deseable y en el que el fragmento de FN modificada es al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 98% homologa a la secuencia del tipo silvestre correspondiente FN también se incluyen dentro del presente invento. La secuencia de aminoácidos de FN está altamente conservada entre diferentes especies de mamíferos. A modo de ejemplo, la Figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos alineación de FNIII 9-10 de humano y FNIII 9-10 de otros indicaron especies de mamíferos, las secuencias de los cuales están disponibles en el (Centro Nacional de Información Bioteenología) base de datos NCBI. Las secuencias de larga duración FN también están disponibles al público. Por lo tanto, está dentro de la capacidad de un experto en la materia para determinar si FN variantes de la invención con mutaciones adicionales, incluyendo, sin limitación de inserción (s), eliminación (s), y la sustitución (s), que son al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 98% homologa a SEQ ID NO: 2 (o SEQ ID NO: 4), y que habría mantenido la actividad deseada de los fragmentos de FN basado en la conservación de las secuencias entre las diferentes especies de mamíferos.

El término "proteína aislada" o "polipéptido aislado" tal como se utiliza aquí, se refiere a una proteína codificada por un ácido nucleico que incluye, entre otras cosas, ADN genómico, ADNc, ADN recombinante, ARN recombinante, o ácido nucleico de origen sintético o alguna combinación de los mismos, que (1) está libre de al menos algunas proteínas con las que normalmente se encontraría, (2) es esencialmente libre de otras proteínas de la misma fuente, por ejemplo, de la misma célula o especie, (3) se expresa por una célula de una especie diferente, (4) se ha separado de al menos aproximadamente 50 por ciento de polinucleótidos, lípidos, carbohidratos u otros materiales con los que se encuentra naturalmente cuando se aísla a partir de la célula de origen, (5) no está vinculado (por enlaces covalentes o interacción no covalente) a la totalidad oa una parte de un polipéptido al que la ''proteína aislada" está unido en la naturaleza, (6) está unido operativamente (por interacción covalente o no covalente) a un polipéptido con el que no está unido en la naturaleza, o (7) no se produce en la naturaleza. Preferiblemente, la proteína aislada está sustancialmente libre de otras proteínas o polipéptidos contaminantes u otros contaminantes que se encuentran en su entorno natural que interferirían con su uso terapéutico, de diagnóstico, profiláctico o de investigación.

Tal como se utiliza aquí, los términos "polinucleótido", "nucleótidos", "oligonucleótido" y "ácido nucleico" se pueden utilizar indistintamente para referirse a ácido nucleico que comprende ADN, ARN, derivado del mismo, o combinación de los mismos.

Tal como se utiliza aquí, los términos "polipéptido" y "proteína" se pueden utilizar indistintamente para referirse a las proteínas producidas por las células de origen natural y no recombinantes, por las células genéticamente manipuladas o recombinantes, o por síntesis química, y comprenden moléculas que tienen la secuencia de aminoácidos de la proteína nativa, o secuencias que tienen deleciones, adiciones y/o sustituciones de uno o más aminoácidos de la secuencia nativa. De acuerdo con la presente invención, el polipéptido o proteína modificado específicamente abarca fibronectina o fragmentos de los mismos humana o variantes de los mismos. En ciertas realizaciones particulares, el polipéptido o proteína abarca fragmentos de fibronectina humanos o variantes de los mismos que inhiben la actividad de la integrina. En ciertas realizaciones particulares, la integrina se integrina a5b1 o anb3. En ciertas otras realizaciones particulares, la integrina no es aII?b3.

El término "antagonista de integrina" o "antagonista de integrina" tal como se utiliza aquí, se refiere a una molécula capaz de inhibir, bloquear, neutralizar, reducir, abrogar o interferir con las actividades de la integrina. En ciertas realizaciones, el antagonista inhibe las actividades de integrina mediante la unión a la integrina y el secuestro de la integrina de la unión a otras moléculas, por ejemplo, otras proteínas de ECM. En ciertas otras realizaciones, el antagonista inhibe las actividades de integrina mediante la unión a integrina y la prevención de la integrina de eventos de activación de señalización corriente abajo en las células.

El término "inhibición" o "inhibir" en el contexto de la actividad de integrina como se utiliza aquí se refiere a una propiedad de un antagonista de integrina que reduce la actividad de integrina como se ha analizado mediante diversos ensayos funcionales, incluyendo sin limitación, ensayos de unión, ensayos de migración, apoptosis ensayos y ensayos de adhesión celular. En ciertas realizaciones de la invención, el polipéptido que comprende un fragmento de fibronectina modificado inhibe la actividad de la integrina a5b1 , en ciertas realizaciones particulares, la integrina se integrina. En ciertas otras realizaciones particulares, la integrina se integrina anb3. En ciertas realizaciones adicionales, el polipéptido inhibe la actividad de la integrina por desde aproximadamente 0% a aproximadamente 100% en comparación con el control en ausencia del antagonista del polipéptido.

El término "inhibir selectivamente", "inhibición selectiva", "diferencialmente inhibir" o "inhibición diferencial" tal como se utiliza aquí, se refiere a la propiedad de un antagonista que muestra especificidad diferencial para una molécula diana particular. Por ejemplo, un polipéptido que comprende un fragmento de FN modificado que inhibe la actividad de la integrina anb3 pero no inhibe la actividad de la integrina a5b1 inhibe selectivamente anb3 integrina. En ciertas realizaciones, el polipéptido que comprende un fragmento de fibronectina modificada que comprende FNII1 10, que comprende de manera óptima más FNIII 9, inhibe selectivamente actividades anb3 integrina; En ciertas otras realizaciones, el polipéptido que comprende un fragmento de fibronectina modificada que comprende FNIII 9-10 inhibe selectivamente las actividades de la integrina a5b1. En ciertas realizaciones alternativas, el polipéptido que comprende un fragmento de fibronectina modificada que comprende FNIII 9-10 inhibe específicamente ambas actividades anb3 y a5b1 integrina integrina.

El término "natural" como se usa aquí, se refiere a un objeto que se puede encontrar en la naturaleza, por ejemplo, una secuencia de polipéptido o polinucleótido que está presente en un organismo (incluido un virus) que puede aislarse de una fuente en la naturaleza y que no ha sido modificada intencionadamente por el hombre. El término "de origen natural" o "nativo" cuando se usa en conexión con materiales biológicos tales como moléculas de ácido nucleico, polipéptidos, células huésped, y similares, se refiere a materiales que se encuentran en la naturaleza y no son manipulados por el hombre. Del mismo modo, "recombinante", "no natural" o "no nativo" tal como se utiliza aquí, se refiere a un material que no se encuentra en la naturaleza o que ha sido modificado estructuralmente o sintetizado por el hombre.

El término "tipo silvestre" en el contexto de secuencia de ácido nucleico o secuencia de polipéptido tal como se utiliza aquí se refiere a secuencias nativas o naturales que no han sido modificados intencionalmente por el hombre. Las secuencias de aminoácidos de fibronectina humana del tipo silvestre se exponen en la SEQ ID NO: 74. Se entiende que pueden existir variantes alélicas naturales que tienen secuencias de aminoácidos variación de la secuencia del tipo silvestre. La secuencia de aminoácidos FN humana del tipo silvestre se expone en la SEQ ID NO: 74 como una referencia a la numeración de residuos de aminoácidos utilizados en toda la aplicación.

El término "fragmento de proteína" o "fragmento de polipéptido" tal como se utiliza aquí se refiere a un polipéptido o proteína que tiene una secuencia de aminoácidos menos que la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la proteína del tipo silvestre correspondiente. Un fragmento de una proteína puede contener truncamiento (s) de la proteína de longitud completa de la terminal N 'y/o desde el terminal C, o truncamiento (s) de la parte interna de la proteína de longitud completa. En ciertas realizaciones, el fragmento de un polipéptido que conserva la actividad deseable del polipéptido de longitud completa. En otras ciertas realizaciones, el fragmento de un polipéptido adquiere actividad adicional o alterado deseable en comparación con la proteína de longitud completa. En ciertas realizaciones particulares, el fragmento de proteína es un fragmento de fibronectina humana, que comprende un dominio de fibronectina humana modificada III módulo 10 (FNIII 10) o los módulos 9 y 10 (FNIII 9-10) que comprende una o más de las modificaciones de la invención descritas en este documento. En otras ciertas realizaciones, los polipéptidos que comprende la fibronectina humana modificada que comprende además la inserción (s) adicional, deleción (s), o sustitución (s) y retención de las actividades deseables también se abarcados por la presente invención.

El término "variante", "mutante" de "modificado", como se usa aquí, se refiere a una secuencia, ya sea polinucleótido o secuencia de polipéptido, que contiene al menos una sustitución o variación diferente de una secuencia del tipo silvestre. En ciertas realizaciones, la variante comprende un fragmento de fibronectina humana modificado que comprende fibronectina de tipo III humano módulo de dominio 10 (FNIII 10) que contiene al menos una sustitución de aminoácidos. Modificado FN variantes que comprende además modificaciones post traduccionales también se contemplan y comprendidos dentro del alcance de la invención. Humano de longitud completa FN comprende la sustitución correspondiente inventiva aminoácido (s) descritos aquí, también se contempla y abarcados por la presente invención.

El término "homología" o "homólogo" como se usa aquí se refiere al nivel de similitud de secuencia global y/o identidad entre fragmentos de fibronectina correspondientes. Alta homología de secuencia sugiere la conservación de la actividad de la proteína. Un número de algoritmos disponibles públicamente o programas de software se puede utilizar para determinar la homología de secuencia. Está dentro de la capacidad de un experto en la téenica para determinar la idoneidad de sustituciones de aminoácidos conservativas o no conservativas adicionales y el nivel de homología de secuencia.

La frase "N-terminal a'1 o "C-terminal a" se entiende normalmente por un experto en la técnica para referirse a las ubicaciones relativas de dos o más residuos de aminoácidos en una proteína o fragmento de la misma. Por ejemplo, un residuo de aminoácido en una secuencia de péptido N-terminal a un residuo de aminoácidos de referencia se entiende a residir en una posición de la secuencia de péptido que está más cerca del extremo N-terminal de la secuencia peptídica que el residuo de aminoácidos de referencia es a la N-terminal. Del mismo modo, se entiende un residuo de aminoácido C-terminal a un residuo de aminoácidos de referencia a residir en una posición de la secuencia de péptido más cerca de la C-terminal de la secuencia peptídica que el residuo de aminoácidos de referencia es a la C-terminal.

Los humanos FNIII 10 y FNIII 9-10 variantes se resumen en la Tabla 1 a continuación: Tabla 1 Como se usa en el presente documento, los veinte aminoácidos convencionales y sus abreviaturas siguen el uso convencional. Ver INMUNOLOGÍA -A SÍNTESIS, 2a edición, (ES Golub y DR Gren, Eds.), 1991, Sinauer Associates, Sunderland, Mass., Que se incorpora aquí como referencia para cualquier propósito. Según ciertas realizaciones, las sustituciones de aminoácidos simples o múltiples (en determinadas realizaciones, sustituciones de aminoácidos conservativas) pueden ser hechas en la secuencia de origen natural (en ciertas realizaciones, en la porción del polipéptido fuera del dominio (s) que forman contactos intermoleculares o que comprende dominios funcionales). En ciertas realizaciones, una sustitución de aminoácidos conservativa no cambia sustancialmente las características estructurales de la secuencia parental (por ejemplo, un aminoácido de sustitución no debe alterar la estructura secundaria que caracteriza a los padres o proteína nativa, tal como una hélice). Ejemplos de polipéptidos reconocidas en la téenica estructuras secundarias y terciarias se describen en las proteínas, ESTRUCTURAS y moleculares PRINCIPIOS (Creighton, Ed.), 1984, WH Nueva York: Freeman and Company; INTRODUCCIÓN A l_A ESTRUCTURA DE PROTEÍNAS (Branden y Tooze, eds.), 1991, Nueva York: Garland Publishing;. y Thornton et al, 1991, Nature 354: 105, que se incorporan cada una en el presente documento para referencia.

Restos de origen natural pueden dividirse en clases basadas en las propiedades comunes de las cadenas laterales: 1) hidrofóbicos: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Él; 2) hidrófila neutra: Cys, Ser, Thr, Asn, Gin; 3) ácidos: Asp, Glu; 4) básica: His, Lys, Arg; 5) residuos que influyen orientación de la cadena: Gly, Pro; y 6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

Sustituciones conservadoras de aminoácidos pueden abarcar residuos de aminoácidos no natural, que se incorporan típicamente mediante síntesis peptídica química en lugar de mediante síntesis en sistemas biológicos. Estos incluyen peptidomiméticos y otras formas de restos de aminoácidos invertidos o invertidos.

En contraste, las sustituciones no conservativas pueden implicar el intercambio de un miembro de una de estas clases por un miembro de otra clase. Tales residuos sustituidos pueden ser introducidos en regiones homologas o no homologas o no conservadas de la molécula.

Al hacer dichos cambios, según ciertas realizaciones, el índice hidropático de aminoácidos puede ser considerado. Cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático sobre la base de sus características de hidrofobicidad y carga. Ellos son: isoleucina (+4,5); valina (4.2); leucina (3,8); fenilalanina (2,8); cisteína/cistina (2,5); metionina (1,9); alanina (1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina (-4,5) (Kyte et ai, 1982/Mol Biol 157:... 105-131).

La importancia del índice hidropático de los aminoácidos para conferir función biológica interactiva a una proteína se entiende en la téenica (véase, por ejemplo, Kyte et ai, 1982, ibid.). Se sabe que ciertos aminoácidos pueden ser sustituidos por otros aminoácidos que tienen un índice o valor hidropático similar y todavía conservan una actividad biológica similar. Al hacer cambios basados en el índice hidropático, en ciertas realizaciones, la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos están dentro de ± 2 está incluido. En ciertas realizaciones, los que están dentro de ± 1 están incluidos, y en ciertas realizaciones, se incluyen aquellos dentro de ± 0,5.

También se entiende en la técnica que la sustitución de aminoácidos similares puede realizarse eficazmente sobre la base de hidrofilicidad, particularmente cuando la proteína o péptido biológicamente funcional creada de este modo está destinado al uso en realizaciones inmunológicas, como en el presente caso. En ciertas realizaciones, la mayor hidrofilicidad promedio local de una proteína, como se rige por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con su inmunogenicidad y o inmunogenicidad de unión a antígeno, es decir, con una propiedad biológica de la proteína.

Como se describe en la Patente US No. 4.554.101, los siguientes valores de hidrofilicidad se han asignado a estos residuos de aminoácidos: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 ± 1); glutamato (3,0 ± 1); serina (0,3); asparagina (0.2); glutamina (0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 ± 1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisterna (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1 ,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); de tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5) y triptófano (-3,4). Al hacer cambios basados en valores de hidrofilicidad similares, en ciertas realizaciones, la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad están dentro de ± 2 se incluye, en ciertas realizaciones, los que están dentro de ± 1 están incluidos, y en ciertas realizaciones, los que están dentro de ± 0.5 están incluidos. Sustituciones de aminoácidos ilustrativas se exponen en la Tabla 2.

Tabla 2 Un experto en la téenica puede determinar variantes adecuadas del polipéptido que se define en el presente documento usando técnicas bien conocidas. En ciertas realizaciones, un experto en la técnica puede identificar áreas adecuadas de la molécula que se pueden cambiar sin destruir la actividad por regiones no cree que son importantes para la actividad de orientación. En ciertas realizaciones, se pueden identificar residuos y porciones de las moléculas que se conservan entre polipéptidos similares (por ejemplo, por análisis de alineación de secuencias). En ciertas realizaciones, incluso las áreas que son importantes para la actividad biológica o para la estructura pueden ser objeto de sustituciones conservativas de aminoácidos sin destruir la actividad biológica o sin afectar adversamente la estructura de polipéptido.

Adicionalmente, un experto en la técnica puede identificar los residuos de aminoácidos en polipéptidos similares o relacionados que son importantes para la actividad o el mantenimiento de la estructura. En vista de tal comparación, uno puede predecir la importancia de residuos de aminoácidos en una proteína que corresponde a los residuos de aminoácidos importantes para la actividad o estructura en proteínas similares. Un experto en la técnica puede optar por sustituciones de aminoácidos químicamente similares para tales residuos de aminoácidos importantes predichos. Una secuencia de aminoácidos alineación de FNIII 9-10 de diferentes especies de mamíferos se muestra en la Figura 2.

Un experto en la téenica también puede analizar la estructura tridimensional y la secuencia de aminoácidos en relación con esa estructura en polipéptidos similares. En vista de dicha información, un experto en la técnica puede predecir la alineación de residuos de aminoácidos de un polipéptido con respecto a su estructura tridimensional. En ciertas realizaciones, un experto en la técnica puede elegir no hacer cambios radicales a los residuos de aminoácidos predichos a estar en la superficie de la proteína, ya que tales residuos pueden estar Involucrados en importantes interacciones con otras moléculas. Además, un experto en la técnica puede generar variantes de ensayo que contienen una única sustitución de aminoácido en cada residuo de aminoácido deseado. Las variantes pueden ser seleccionados utilizando ensayos de actividad conocidos por los expertos en la técnica. Tales variantes pueden usarse para recopilar información sobre variantes adecuadas. Por ejemplo, si se descubrió que un cambio a un residuo de aminoácido particular dio como resultado destruida, indeseablemente reducido, o actividad inadecuada, las variantes con tal cambio puede ser evitado. En otras palabras, basándose en la información recopilada a partir de tales experimentos de rutina, un experto en la técnica puede determinar fácilmente los aminoácidos en los que otras sustituciones se deben evitar ya sea solo o en combinación con otras mutaciones.

Estereoisómeros (por ejemplo, ácidos, D-aminoácidos) de los veinte aminoácidos convencionales, de origen no natural aminoácidos tales como a- , ácidos a-disustituidos, aminoácidos N-alquilo, ácido láctico, y otros aminoácidos no convencionales también pueden ser componentes adecuados para los polipéptidos de la presente invención. Ejemplos de aminoácidos no convencionales incluyen, pero no se limitan a: 4-de hidroxiprolina, g-carboxiglutamato, e-N, N, N-trimetillisina, e-N-acetil-lisina, 0-fosfoserina, N-acetilserina, de N-formilmetionina, 3- metilhistidina, 5-hidroxilisina, s-N-metilarginina, y otros aminoácidos similares y iminoácidos (por ejemplo, 4-hidroxiprolina). En la notación de polipéptidos usada en el presente documento, la dirección de la izquierda es la dirección amino terminal y la dirección de la derecha es la dirección carboxi-terminal, de acuerdo con el uso estándar y la convención.

En ciertas otras formas de realización, el polipéptido que comprende fragmento de fibronectina humana comprende además una entidad heteróloga para formar una proteína de fusión. La entidad heterólogo puede facilitar la detección de y/o purificación del fragmento de fibronectina humana recombinante sintetizada. Entidad heteróloga adecuado incluye, sin limitación, una etiqueta multi-histidina, GFP (proteína fluorescente verde) etiqueta, GST (glutatión S transferasa) tag y maltosa vinculante etiqueta proteínas, BANDERA etiqueta o etiqueta de HA. Está dentro de la capacidad de un experto en la téenica, la selección de una etiqueta adecuada y la construcción de un vector de expresión que expresa la proteína de interés con una etiqueta heterólogo (o etiqueta de epítopo). La proteína diana ligada a una etiqueta epítopo deseado puede ser creado por PCR, en el que la secuencia que codifica la etiqueta de epítopo se incorpora en la secuencia del cebador. Vector de expresión diseñados para la expresión recombinante de una proteína de interés conjugado con una etiqueta heteróloga está disponible comercialmente, por ejemplo, pGEX-2KS (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ) y pET21a (Novagen). En ciertas realizaciones, la entidad o la etiqueta epítopo heterólogo se elimina mediante, por ejemplo, proteasa de escisión en un built-in proteasa sitio de escisión después de la purificación del polipéptido recombinante sintetizada.

El término "vector de expresión" se refiere a un vector que es adecuado para la transformación de una célula huésped o una célula diana y contiene secuencias de ácidos nucleicos que dirigen y/o controlan la expresión de secuencias de ácidos nucleicos heterólogas insertadas. Expresión incluye, pero no se limita a, procesos tales como transcripción, traducción, y empalme de ARN, si están presentes intrones. En ciertas realizaciones, un vector de expresión comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un fragmento de fibronectina humana o variante de la misma. En ciertas realizaciones particulares, el vector de expresión comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un fragmento de fibronectina humana hexa-histidina-conjugado o variante de la misma.

Típicamente, los vectores de expresión utilizados en cualquiera de las células huésped o células diana contienen secuencias para el mantenimiento del vector y para la clonación y expresión de secuencias de nucleótidos exógenas. Tales secuencias, denominadas colectivamente como "secuencias flanqueantes" en ciertas realizaciones se incluyen típicamente uno o más de las siguientes secuencias de nucleótidos: un promotor, una o más secuencias potenciadoras, un origen de replicación, una secuencia de terminación transcripcional, una secuencia intrón completa que contiene un sitio donante y aceptor de empalme, una secuencia que codifica una secuencia líder a la secreción del polipéptido, un sitio de unión al ribosoma, una secuencia de señal de poliadenilación, una región que comprende uno o polienlazador una pluralidad de sitios de endonucleasa de restricción para la inserción de ácido nucleico que codifica el polipéptido a expresar, y un elemento marcador seleccionable.

El término "transducción" se utiliza para referirse a la transferencia de genes de una bacteria a otra, normalmente mediante un fago. "Transducción" también se refiere a la adquisición y transferencia de secuencias celulares eucariotas por virus tales como retrovirus.

El término "transfección" se utiliza para referirse a la captación de ADN extraño o exógeno por un celular, y de una célula se ha "transfectado" cuando el ADN exógena ha sido introducido dentro de la membrana celular. Un número de téenicas de transfección son bien conocidos en la técnica y se describen en el presente documento. Véase, por ejemplo, Graham et al., 1973, Virology 52: 456; Sambrook et al. 2001, CLONACIÓN MOLECULAR:.

A LABORATORY MANUAL, 3d ed, Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, Nueva York;. Davis et al, 1986 MÉTODOS BÁSICOS EN BIOLOGÍA MOLECULAR (Elsevier);. y Chu et al, 1981, Gene 13: 197. Tales téenicas pueden usarse para introducir uno o más restos de ADN exógeno en células huésped adecuadas.

El término "transformación" tal como se utiliza aquí, se refiere a un cambio en las características genéticas de una célula, y una célula se ha transformado cuando se ha modificado para contener un nuevo ADN. Por ejemplo, una célula se transforma cuando se modifica genéticamente a partir de su estado nativo. Después de la transfección o transducción, el ADN transformante puede recombinarse con el de la célula por integración física en un cromosoma de la célula, puede ser mantenido transitoriamente como un elemento episomal sin ser replicado, o puede replicarse independientemente como un plásmido. Una célula se transforma de manera estable cuando el ADN se replica con la división de la célula.

El término "célula huésped" se utiliza para referirse a una célula en la que se ha introducido, o que es capaz de haber introducido, una secuencia de ácido nucleico y luego de expresar un gen de interés. El término incluye la progenie de la célula parental, sea o no la progenie es idéntica en morfología o en composición genética al progenitor original, siempre y cuando el gen está presente. En realizaciones preferidas, la célula huésped es una célula eucariota, más preferiblemente una célula de mamífero y más preferiblemente un roedor o una célula humana.

En otro aspecto, la invención proporciona procedimientos de inhibición mediada por la integrina adhesión celular, el crecimiento, la migración o la diferenciación, que comprende la etapa de poner en contacto una célula con una cantidad terapéuticamente eficaz del polipéptido de la presente invención, en el que la integrina es anb3 y/o a5b1 integrina. En aún otro aspecto, la invención proporciona métodos para inhibir o tratar el crecimiento tumoral, la progresión tumoral o la metástasis tumoral en un mamífero, que comprende la etapa de administrar a un mamífero una composición farmacéutica que comprende los polipéptidos de la invención descritos en este documento, en el que el tumor expresa anb3 y/o a5b1. Ejemplos no exhaustivos de tumores adecuados incluyen carcinoma de pulmón, tumor de mama, tumor de colon, osteosarcoma, tumor de páncreas, tumor de ovario, tumor cervical, glioblastoma, tumor de próstata, tumor de hígado y melanoma. En ciertas realizaciones, el tumor expresa integrina a5b1 , y los ejemplos no exhaustivos de tumores adecuados incluyen pulmón, mama, colon, melanoma, osteosarcoma y tumor de próstata. En ciertas otras realizaciones, el tumor expresa anb3 integrina, y los ejemplos no exhaustivos de tumores adecuados incluyen mama, melanoma, de páncreas, de ovario, glioblastoma tumor de cuello uterino y de próstata.

En un aspecto adicional, la invención proporciona métodos de inhibición de una enfermedad relacionada con la angiogénesis en un mamífero que comprende administrar a un mamífero en necesidad del mismo composiciones farmacéuticas que comprenden los polipéptidos de la invención descritos en este documento, en el que la enfermedad relacionada con la angiogénesis es el cáncer, degeneración macular, edema, artritis, esclerosis múltiple, malformaciones vasculares, la obesidad, psoriasis, verrugas, dermatitis alérgica, sarcoma de Kaposi en SIDA, retinopatía diabética, hipertensión pulmonar primaria, asma, fibrosis quística, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad periodontal, cirrosis hepática, endometriosis, quistes ováricos, uterino sangrado, osteomielitis o la nefropatía diabética. De acuerdo con este aspecto, en ciertas realizaciones particulares, la enfermedad relacionados con la angiogénesis comprende una enfermedad mediada por la integrina anb3 y/o a5b1.

Tal como se utiliza aquí, el término "cantidad eficaz" o una "amoun terapéuticamente eficaz" de un polipéptido aislado se refiere a una cantidad suficiente para lograr el resultado deseado indicado, por ejemplo, la inhibición de la adhesión celular mediada por la integrina, el crecimiento, la migración o la diferenciación, o inhibir o tratar el crecimiento tumoral, la progresión tumoral o la metástasis tumoral. la cantidad de un polipéptido o compuesto que constituye una "cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" variará dependiendo del polipéptido o compuesto, el trastorno y su gravedad, y la edad del sujeto a tratar, pero se puede determinar rutinariamente por un experto ordinario en la téenica en ciertas realizaciones, el sujeto es un mamífero, en ciertas realizaciones particulares, el mamífero es un humano.

"Tratar" o "tratamiento" como se usa en este documento cubre el tratamiento de una enfermedad o trastorno descrito en la presente memoria, en un mamífero, por ejemplo un humano, e incluye: (i) la inhibición de una enfermedad o trastorno, es decir, detener su desarrollo; (ii) aliviar una enfermedad o trastorno, es decir, provocar la regresión de la enfermedad; (iii) retardar la progresión de la enfermedad; y/o (iv) inhibir, aliviar, o ralentizar la progresión de uno o más síntomas de la enfermedad o trastorno.

Las vías de administración para las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen por vía oral, a través de inyección por vía intravenosa, intraperitoneal, intracerebral (intraparenquimal), intracerebroventricular, subcutánea, intramuscular, intraocular, intraarterial, intraportal, o intralesional; por sistemas de liberación sostenida o mediante dispositivos de implantación. Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar por inyección de bolo o continuamente mediante infusión, o mediante dispositivo de implantación. La composición farmacéutica también se puede administrar localmente a través de implantación de una membrana, esponja u otro material apropiado sobre el que la molécula deseada se ha absorbido o encapsulado. Cuando se utiliza un dispositivo de implantación, el dispositivo puede ser implantado en cualquier tejido u órgano adecuado, y la entrega de la molécula deseada puede ser mediante difusión, bolo de liberación temporizada, o una administración continua.

Los polipéptidos de la invención se pueden formular de acuerdo con métodos conocidos para preparar composiciones farmacéuticas, en el que el pollpéptido a administrar está combinado con un portador farmacéuticamente aceptable, diluyente o excipiente. Portador adecuado, diluyente y excipiente y la preparación de los mismos se describen, por ejemplo, en Genaro, AO "Remington: La Ciencia y Práctica de Farmacia." Lippincott Williams & Wilkins (2005).

Para las composiciones farmacéuticas acuosas utilizadas in vivo, se prefiere el agua estéril libre de pirógenos. Tales formulaciones contendrán una cantidad eficaz del polipéptido junto con una cantidad adecuada de portador farmacéuticamente aceptable, diluyente o excipiente con el fin de preparar composiciones farmacéuticamente aceptables adecuadas para la administración a un mamífero, especialmente humano. Está dentro del conocimiento de un experto en la téenica o el médico y, además, se enseña en la presente solicitud, la cantidad eficaz de la composición a administrar a un mamífero, preferiblemente un humano para lograr el efecto terapéutico deseable.

En ciertas realizaciones, la composición que comprende fragmentos de FN modificada de la invención pueden comprender además otros fármacos contra el cáncer, anti-angiogénesis y la quimioterapia para proporcionar efectos terapéuticos.

Los fragmentos de FN modificadas de la invención pueden ser modificados químicamente para prevenir o reducir la degradación proteolítica. Métodos para la modificación chemcial o la optimización de proteína o fragmentos de los mismos son bien conocidos en la téenica, incluyendo sin limitación la sustitución de los residuos de aminoácidos naturales con restos de aminoácidos no naturales, aminoácido de sustitución de bonos, bloqueando N o extremos C-terminales por N-acilación, N-piroglutamato, y/o C-amidación, y N-terminal de esterificación o de pegilación modificaciones. Véase, por ejemplo Vlieghe et al, 2010, Drug Discovery Today., 15: 40-56.

En un aspecto adicional, se proporcionan kits que comprenden la composición de polipéptidos, o composición farmacéutica de la invención descrita en este documento. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden estar en la forma de una emulsión, gel, solución, suspensión, etc. Las composiciones de la presente invención también se pueden liofilizar para producir una composición en una forma seca para la facilidad en el transporte y almacenamiento. Las composiciones de la presente invención se pueden almacenar en un vial sellado, recipiente, ampolla o similar. En el caso en el que la composición está en una forma seca, la composición se disuelve o resuspende (por ejemplo, en agua destilada esterilizada o un tampón) antes de la administración. Un vehículo inerte tal como solución salina o solución salina tamponada con fosfato o cualquier portador, en la que la composición tiene una solubilidad adecuada, puede ser utilizado.

Los ejemplos, que siguen, son ilustrativos de realizaciones específicas de la invención, y diversos usos de los mismos. Ellos se exponen únicamente con fines explicativos, y no deben ser tomados como limitativos de la invención.

EJEMPLOS Ejemplo 1. Construcción de vectores de expresión que expresan del tipo silvestre y variantes de FNIII Fragmentos Del tipo silvestre FN humana III 9-10 fue clonado y expresado en el vector pET21a (Novagen). Las variantes FNIII de codificación de ADN se componen de codones utilizados preferentemente en E. coli. Del tipo silvestre FNIII 9-10 secuencia de codificación se amplificó mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con el cebador directo 5'-CATATGCATATGCACCACCACCACCACCACGGTCTTGATTCCCCAACT-3 '(SEQ ID NO: 75) que tenía el sitio de reconocimiento Nde I y seis residuos de histidina para la purificación por afinidad. El cebador inverso es 5‘-AAGCTTAAGCTTTCATGTTCGGTAATTAATGGAAATTGG-3 '(SEQ ID NO: 76) con el sitio de reconocimiento Hind III y un TOA (o TTA) codón de parada. El producto de PCR se purificó y luego se ligó en los sitios Nde I y Hind III del vector de recombinación de E. coli, pET21a (Novagen). El plásmido recombinante se utilizó para transformar la cepa de E. coli DH5a, y las colonias se seleccionaron en placas de agar con LB (1% de triptona, extracto de levadura 0,5%, 1 ,0% NaCI, 1 ,0% de agar a pH 7.4) y 100 g/ml de ampicilina antibiótico.

FNIII 9-10 variantes se sintetizaron y se amplificaron mediante PCR utilizando una estrategia de oligonucleótido de solapamiento con los cebadores que contienen sitios de restricción Nde I y Hind III. Las secuencias de nucleótidos de diversos cebadores utilizados para sintetizar o confirmar variantes se enumeran en la Tabla 3.

Las reacciones en cadena de la polimerasa se realizaron de acuerdo con el procedimiento descrito en US2008/0188413, que se incorpora aquí para referencia en su totalidad. Brevemente, la reacción se lleva a cabo a 95 ° C durante 1 min, 55 ° C durante 1 min, y 72 0 C durante 1 min durante 25 ciclos. Una mezcla de cebadores también se utilizó para la generación de múltiples sitios de mutación. Los productos de PCR se separaron en 2% electroforesis en gel de agarosa y se visualizaron por tinción con bromuro de etidio. Los productos de PCR deseados se purificaron y se ligan a continuación en los sitios Eco Rl y Sac II de la transferencia vector de levadura pPICZ alfa A. El plásmido recombinante se utilizó para transformar una cepa de Escherichia coli XI l-azul y las colonias se seleccionaron en placas de agar que contiene antibiótico zeocina. ADN plásmido de colonias zeocina-positivos se amplificó y aislados, y las secuencias FNIII contenidas en los plásmidos se confirmó por secuenciación de ADN.

Tabla 3 Ejemplo 2. Expresión y purificación de FNIII 9-10 y FNIII 10 Variantes Expresión de la proteína del tipo silvestre FNIII 9-10, FNIII 10 o variantes del mismo se llevó a cabo utilizando el Kit de Transformación de Pichia Easycomp™ (Invitrogen) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante con modificaciones menores. Brevemente, un total de 10 g plásmidos que contienen ADN que codifica FNIII 9-10, FNIII 10 o variantes de los mismos fueron digeridos con Sac I para linealizar los plásmidos. Cepa de Pichia X33 se transformó con los constructos linealizado mediante un procedimiento de choque térmico, usando el kit de Pichia Easycomp™. El constructo linealizado se integró en el locus AOX^ 5 'por un solo cruce. Células de Pichia se lisaron mediante la liticasa (Sigma) y se analizaron por PCR para verificar la integración de las secuencias FNIII en el genoma de Pichia. Las colonias se seleccionaron en placas de agar que contienen YPD (extracto de levadura al 1%, 2% de peptona, 2% de glucosa, y 2% de agar) y 100 mg/ml de zeocina. Se seleccionaron un número de colonias con múltiples copias de las inserciones FNIII para el más alto FNIII 9-10 o FNIII 10 expresión de la proteína.

Recombinante FNIII 9-10, FNII1 10 y las variantes se produjeron de la siguiente manera: colonias seleccionadas se cultivaron en el medio YPD (extracto de levadura al 1%, 2% de peptona, y 2% de dextrosa) que contiene 100 mg/ml de zeocina a 30 ° C. después de 48 horas, las células se recogieron por centrifugación y se cultivaron en 1 litro de medio mínimo de metanol (que contiene 1 ,34% de base nitrogenada de levadura con sulfato de amonio sin aminoácidos y 4 x 10 "5% biotina). se añadió un total de 1% de metanol una vez cada 24 horas para inducir la expresión de FNIII o variantes de los mismos durante 2 días. El sobrenadante se recogió por centrifugación y se dializó dos veces contra 5 litros de tampón a (EDTA 5 mM, urea 8 M y 10 mM de tampón de fosfato de Na, pH 7,7). La final solución se cargó en una columna quelante de níquel y se eluyó con un gradiente de imidazol 200 mM. El recombinante FNIII 9-10, FNIII 10 y variantes de las mismas se purificaron adicionalmente por HPLC (fase inversa C18 HPLC). El FNIII recombinante purificada tenía una pureza de más de 95% como se juzga por tricina-SDS-PAGE. Expresión y pureza de varios FNIII variantes se muestran en la Figura 6. perfil representativo de HPLC y la pureza de la FNIII 9-10 variantes que tienen la secuencia de CPRGDMPDC (SEQ ID NO: 20, L1408P (CARGDNPDC) proteína (SEQ ID NO: 22 y L1408P, la sustitución V1442K (SEQ ID NO: 28) se muestran en las Figuras 6A-C, respectivamente.

Ejemplo 3. FNIII 10 Enlace disulfuro intradominio mayor estabilidad y solubilidad de FNIII 9- 10 y 10 FNIII Se ha demostrado previamente que un Leu a Pro sustitución en la posición de aminoácido 1408 mejoró la estabilidad de FNIII 9-10 (van der Walle et al, 2002, Protein Engineering 15: 1021-1024). La estabilidad de intradominio mutaciones enlace disulfuro en el módulo 10 se ensayó por análisis de espectro de RMN unidimensional en tampón a diferentes valores de pH. La presencia de la mutación L1408P mejoró la estabilidad de FNIII 9- 10 a pH 5,0 en comparación con el tipo silvestre FNIII 9-10 en una solución que contiene 50 mM de arginina libre y glutamina. Arginina y glutamina libre se añadieron con el fin de aumentar la concentración de proteína máxima alcanzable y imporiving estabilidad de la muestra a largo plazo contra la precipitación y degradación (ver Golovanov AP, et al. J. Am. Chem. Soc. 126 (2004) 8933 a 8939). Sin embargo, la estabilidad de L1408P mutante disminuyó a pH más alto, por ejemplo, pH 6,0 (Fig. 3A, panel inferior derecho), o más bajo pH, por ejemplo, pH 3,5, en ausencia de arginlna y glutamina libre. Por otro lado, enlace disulfuro intradominio estabilizado FNIII 9-10 en tampón de fosfato a pH 7,5, incluso sin la necesidad de la mutación L1408P y sin la necesidad de arginina libre y glutamina. Como se muestra en la Figura 3A, panel superior derecho, FNIII 9-10 (CPRGDMPDC, SEQ ID NO: 20) con el enlace disulfuro intradominio y sin la mutación L1408P mantenido estable a pH 7,5, en una solución sin arginina y glutamina. El enlace disulfuro intradominio también aumentó la estabilidad y la solubilidad de FNIII 9-10 variantes (Fig.3B).

También se ha demostrado que la sustitución de Asp a Asn en el módulo 10 en la posición 1422 (SEQ ID NO: 65) la mejora de la estabilidad de FNIII 10 en presencia de 50 mM de arginina y glutamina libre a pH 5. La estabilidad del mutante D1422N, sin embargo, disminuye cuando el pH se aumentó a 5,4 y 6. Véase la Figura 3A, panel inferior izquierdo. Como se muestra en la Figura 3C, el enlace disulfuro intradominio presente en FNIII 10 (CPRGDMPDC) proteína (SEQ ID NO: 6) la mejora de la estabilidad y solubilidad de FNIII 10 sin la necesidad de la mutación D1422N (Fig 3C.).

Ejemplo 4. FNIII 9-10 o FNIII 10 Variantes inhibido integrina Accesorio Celular a5b1- o mediada por ocvP3 La actividad antagonista de la integrina de variantes FNIII se evaluaron por ensayos de inhibición de adhesión celular como se describió previamente (Zhang, et al, 1998/Biol Chem 273:. 7345-7350). Brevemente, placas de 96 pocilios lmmulon-2 de microtitulación (Costar, Corning, NY) se recubrieron con 100 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS: tampón fosfato 10 mM, NaCI 0,15 M, pH 7,4) sustratos que contienen en una concentración de 50- 500 nm, y se incubó durante la noche a 4 ° C. Los sustratos para recubrimiento incluyen: fibrinógeno (FG) 50 mg/ml para a5b1 , vitronectina (VN) 10 mg/ml para anb3, y fibronectina (FN) 25 mg/ml para aI^b3. Sitios de unión de proteína no específica se bloquearon por incubación de cada pocilio con 200 pl de 1% de albúmina de suero bovino desnaturalizado por calor (BSA, Calbiochem) a temperatura ambiente (25 0 C) durante 1 ,5 horas. Después, el BSA desnaturalizado por calor bloqueo se desechó y cada pocilio se lavó dos veces con 200 mI de PBS.

Células de ovario de hámster chino (CHO) que expresan anb3 (CHO-Ctt L 3) y a5b1 L HO-a5b1) integrinas se mantuvieron en 100 mI de Modified Médium (DMEM) medio de Eagle de Dulbecco. Tanto CHO-co L 3 y CHO-C L I eran amables dones del Dr. Y. Takada (Instituto de Investigación Scripps) establecido por transfección estable con un gen resistente a la neomicina. Células CHO que crecen en fase logarítmica se separaron mediante tripsinización y se utilizaron en el ensayo a 3 x 105 células/ml. FNIII 9-10, FNIII 10 y variantes de los mismos se añadieron a las células cultivadas en las concentraciones de 0,001 -500 mM y se incubaron a 37 ° C en 5% de C02 durante 15 minutos. Las células tratadas se añaden entonces a la placa recubierta y se incubaron a 37 ° C en 5% de C02 durante 1 hora. A continuación, la solución de Incubación se desechó y las células no adheridas se eliminaron por lavado dos veces con 200 mI PBS.

Las células unidas se cuantificaron por tinción con violeta cristal. Brevemente, el pozo se fijó con 100 ml de 10% de formalina durante 10 minutos y se seca. Cincuenta microlitros de 0,05% de cristal violeta después se añadieron en el pozo a temperatura ambiente durante 20 minutos. Cada pocilio se lavó con 200 mI de agua destilada cuatro veces y se secó. Coloración se llevó a cabo mediante la adición de 150 mI de la solución de colorear (50% de alcohol y ácido acético al 0,1%). La absorbancia resultante se lcyó a 600 nm y las lecturas se correlacionaron con el número de células adherentes. La inhibición se define como% de inhibición = 100- [OD6O0 (del tipo silvestre o FNIII variant- muestra tratada)/OD60o (muestra no tratada)] x 100. IC50 se define como la concentración (nM) necesaria para una inhibición del 50% de la adhesión celular. Por lo tanto, menor IC50 indica especificidad rallador o la potencia de la variante en la inhibición de la actividad de adhesión celular de integrina respectiva. Los resultados se resumen en las Tablas 4 y 5 a continuación.

Wild tipo FNIII 10 no competir eficazmente con FN para la unión a integrina anb3 y por lo tanto no mostró actividad antagonista anb3 integrina en el ensayo de adhesión celular. FNIII 10 con el PRGDWNEGSK secuencia en las posiciones de aminoácidos 1492 a 1451 (SEQ ID NO: 50) mostró la integrina anb3 actividad de unión, y compitió con longitud completa FN para la unión a integrina anb3. Ver Tabla 4 y Richards et al., J Mol Biol. 2003, 326 (5): 1475-1488.

Se descubrió inesperadamente que introducir en el bucle RGD un enlace di-sulfuro de entre dos sustituciones de Cys que flanquean el motivo RGD en una secuencia que comprende la fórmula de la Cys-Cys-X7, por ejemplo entre las sustituciones T1491C y S 1499C, mucho mayor anb3 integrina actividad antagonista (véase, por ejemplo, la Tabla 4, SEQ ID NO: 6, 8 y 10 en comparación con SEQ ID NO: 2). Además, el enlace di-sulfuro de diseñado mejora aún más la actividad antagonista de la integrina anb3 de una variante de FNIII 10 que ya exhibió integrina anb3 actividad antagonista. Por ejemplo, dos sustituciones de cisteína que flanquean el motivo RGD en el fondo de FNIII 10 PRGDMPD (es decir, SEQ ID NO: 6 con CPRGDMPDC) el aumento de la integrina anb3 afinidad de unión en comparación con la variante sin las sustituciones de Cys (SEQ ID NO: 48) por 7 veces, y por lo tanto la disminución de la concentración requerida para inhibir el 50% de la adhesión celular (comparar los resultados de SEQ ID NO: 6 con SEQ ID NO: 48).

En resumen, la introducción de un enlace disulfuro dentro del bucle RGD poco estructurado aumenta sustancialmente la afinidad de unión de FNIII variantes para anb3 integrina, y por lo tanto aumenta la actividad de la integrina anb3 antagonista según lo medido por el ensayo de adhesión celular.

Tabla 4 * Porcentajes entre paréntesis representan el porcentaje de inhibición en comparación con el control en ausencia de los fragmentos de FN Wild tipo FNIII 9-10 se une a la integrina a5b1 pero no integrina anb3. Ver resultados del tipo silvestre FNIII 9-10 (SEQ ID NO: 4) en la Tabla 5. Curiosamente, FNIII 9-10 variantes que tienen un enlace de di-sulfuro de diseñado que flanquean el motivo RGD en la fórmula C-X7-C exhibió una especificidad de unión alterada. Por ejemplo, FNIII 9-10 que tiene la secuencia de aminoácidos VCPRGDMPDCSK en posiciones de aminoácidos 1490 a 1501 (SEQ ID NO: 20) mostró, en lugar de la integrina a5b1, la integrina anb3 actividad antagonista, aunque FNIII 9-10 se ha considerado una integrina a5b 1 aglutinante. Ver Tabla 4, comparando los resultados de SEQ ID NOs: 6 y 20 con los de la Tabla 5, los resultados de SEQ ID NO: 4.

Por otra parte, un enlace de di-sulfuro de intradominio formado por sustituciones de Cys en una secuencia que comprende la fórmula C-X8-C no alterar la especificidad de unión de FNIII 9-10, y en algunos casos mejora la afinidad de unión a integrina a5b 1 (véase, por ejemplo, la Tabla 5, los resultados de SEQ ID NO: 32, en comparación con los resultados de SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 63).

Se ha demostrado previamente que un enlace di-sulfuro de entre dominios entre los módulos 9 y 10 (en el fondo de la sustitución L1408P), aunque estabilizado el fragmento FNIII 9-10, disminuyó el efecto sinérgico de módulo 9 de obligar a la integrina a5b1 (Altroff et al., supra). Los presentes inventores, sin embargo, inesperadamente descubrieron que FNIII 9-10 (en el fondo de la sustitución L1408P) con un enlace entre dominios formado entre un Asp diseñado y Lys en las posiciones 1340 y 1442 (A1340D y sustituciones V1442K) mantuvo la afinidad de unión en comparación a a5b1 integrina (véase la Tabla 5, los resultados de SEQ ID NO: 40, en comparación a los resultados de la SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 63).

En sirvieron, algunos de los FNIII 9-10 también variantes adquirieron afinidad de unión a integrina anb3 (véase la Tabla 4, los resultados de SEQ ID NO: 60, en comparación a los resultados de la SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 63).

Tabla 5 En resumen, un enlace di-sulfuro introducido en el bucle RGD de FNIII 9-10 en una secuencia que comprende la fórmula C-X8-C puede mejorar la integrina a5b1 actividad antagonista (Tabla 5, comparando los resultados de SEQ ID NO: 32 con SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 63 y SEQ ID NO: 62).

Ejemplo 5. FNIII 10 y FNIII 9-10 variantes no se unió a la integrina aIIob3 y no indujo la agregación plaquetaria La sangre venosa (9 partes) muestras de donantes sanos que no habían recibido ninguna medicación durante al menos dos semanas se recogieron en el 3,8% de citrato de sodio (1 parte). Las muestras de sangre se centrifugaron a 150 xg durante 10 minutos para obtener plasma rico en plaquetas (PRP) y se dejó en reposo durante 5 min, y se recogieron PRP. El plasma pobre en plaquetas (PPP) se preparó a partir de la sangre restante por centrifugación a 2000 xg durante 25 min. El recuento de plaquetas PPP se midió en un analizador de hematología y se diluyó a 250.000 plaquetas/pl. Una solución de 190 ml de PRP y 10 mI de FNIII 10 o FNIII 9-10 variantes a diferentes concentraciones o tampón PBS se incubaron durante 5 min en un Hema trazador 601 agregómetro a 37 ° C. Diez microlitros de 200 mM adenosina difosfato (ADP) se añadieron más para controlar la respuesta de la agregación plaquetaria por la transmisión de luz. Como se muestra en las Tablas 4 y 5, ninguno de los del tipo silvestre o variantes testeado con destino a la integrina aIP> b3 o agregación plaquetaria promovido.

Ejemplo 6. Los efectos de FNIII 10 o FNIII 9-10 Variantes sobre migración celular mediada por integrina supervivencia celular y el crecimiento celular Los efectos de FNIII 10 o FNIII 9-10 variantes se analizaron en proceso biológico mediada por la integrina. A375 células de melanoma humano A549 que expresan establemente o anb3 o a5b1 como se confirma por citometría de flujo se incubaron con FNIII 10 CPRGDMPDC (SEQ ID NO: 6 con CPRGDMPDC) o FNIII 9- 10 L1408P CRARGDNPDCSK (SEQ ID NO: 32) y los efectos sobre las células migración fue examinado por transwell ensayo. Ensayos de migración celular (Haptotaxis) se realizaron como se ha descrito previamente (Bisanz et al, 2005, Modelo Mol Ther 12:.... 4 634 a 643). Inserción (Falcon) con policarbonato de poro de 8 mih se recubrieron con 200mI de la fibronectina (50pg/ml) en la parte inferior de la membrana porosa a temperatura ambiente durante 2 h y después se somete a lavado y bloqueo con 1% (w/v) de calor BSA -denatured a temperatura ambiente durante 2 h seguido de dos lavados con PBS. Las cámaras se montan con DMEM libre de suero y luego Ix 105 células se colocaron en la cámara superior. Cada experimento fue acompañado por un control que consiste en un filtro de policarbonato recubierto en la parte inferior con PBS/1% (w/v) de BSA, y esto demostró consistentemente sin migración. Después de 6 h de incubación, las células se fijaron con formaldehído al 3,7% y se tiñeron con cristal violeta. Las células que quedan en la cámara superior se eliminaron con un bastoncillo de algodón y migración de las células se fotografiaron y cuantificados. La inhibición de la migración por variantes FN-lll se realizaron como anteriormente con la excepción de la adición de diferentes dosis de FN-lll variantes a las cámaras superiores en el momento de la siembra. Los resultados se resumen en la Figura 7A, que muestran que FN III variantes de la migración celular inhibida.

Además, los efectos de la FNIII 10 o FNIII 9-10 variantes en la detención del ciclo celular fueron examinados. Análisis del ciclo celular se realizaron como se ha descrito previamente (Brooks et al, 1994, Cell 79:. 1157-1164) con algunas modificaciones. Brevemente, las variantes FN-lll se añadieron 24 horas después de la siembra, cuando las células fueron bien distribuidos. 48 horas después del tratamiento, las células flotantes y unidas se lavaron y se recogieron en PBS. Las células se centrifugaron a 1000 rpm durante 10 min y se resuspendieron en 3 mi de PBS frío 70% antes de almacenados a -80 ° C durante la noche. Después de incubación a 4 ° C durante 45 min, se recogieron las células y se centrifugaron a 1300 rpm durante 10 min a 4 ° C. Posteriormente las células se resuspendieron en 1 mi solución de tinción Pl (200 mI de 1 mg/ml de yoduro de propidio, 200 ml RNasa A y 200 mI 5% de Tritón X-100 en 9,4 mi PBS) a 37 0 C durante 15 min. Fluorescencia celular se midió usando un citómetro de flujo FACScan (Becton-Dickinson) como se describió anteriormente. Los resultados se resumen en la Figura 7B. En resumen, el tratamiento de FNIII fragmentos del tipo silvestre causó aumento del porcentaje de células Gl en comparación con el control (PBS), y el tratamiento de FN III variantes indujo más detención Cyle celular.

Además, la abiltiy de FNIII o FNIII 9-10 variantes para inducir la apoptosis se analizó. Experimentos de apoptosis de las células se realizaron como se ha descrito previamente (Maubant et al, 2006, Blood 108:. 3.035 a 3.044) con algunas modificaciones. Brevemente, las variantes FN-lll se añadieron 24 horas después de la siembra, cuando las células fueron bien distribuidos. 48 horas después del tratamiento, se recogieron y se sometieron a las células flotantes y unidas 100 m L hhec?h V/yoduro de propidio (Pl) usando la tinción de anexina V-Alexa Fluor 488 (Molecular Probes) y Pl (Sigma) a 37 ° C durante 15 min. La fluorescencia resultante se midió por citometría de flujo. Tinción de las células con una combinación de anexina V y Pl reveló células nonapoptotic (anexina V VPT), primeras células apoptóticas (V7PI anexina "), células finales apoptóticas (anexina V Pl +), y las células necróticas (anexina V 7RG). Se resumen los resultados en las Figuras 7C-7D. en resumen, FNIII y variantes de la misma indujo apoptosis en las células integrina expressin.

Habiendo descrito la invención en detalle y para referencia a realizaciones específicas de la misma, será evidente que son posibles modificaciones y variaciones sin apartarse del alcance de la invención definida en las reivindicaciones adjuntas. Más específicamente, aunque algunos aspectos de la presente invención se identifican en este documento como particularmente ventajoso, se contempla que la presente invención no se limita necesariamente a estos aspectos particulares de la invención.

Ejemplo 6. termoestabilidad y la solubilidad de las variantes de la invención Termoestabilidad medido por calorimetría diferencial de barrido (DSC) Es importante para un bioterapéutico permanezca estable durante la fabricación, el almacenamiento y la entrega a los pacientes. La calorimetría diferencial de barrido (DSC) permite la medición exacta, rápida y fácil de Tm, el punto medio de transición térmica de una proteína, que se ha demostrado ser un buen indicador de la estabilidad relativa de bioterapéuticos en solución (Demarest et al., 2004; Sánchez-Ruiz et al., 1988; Vermeer y Norde, 2000).

En consecuencia, DSC se aplicó a: (1) buffers de pantalla y excipientes para la formulación; (2) cribar candidatos terapéuticos con una estabilidad razonable además de la actividad; y (3) predecir la proteína tendencia a la agregación. Por las razones anteriores, se caracterizó la estabilidad de nuestras proteínas diseñadas, Tm de 9 10Fn3 variantes y 10Fn3 variantes por DSC.

Se realizó un análisis DSC usando un microcalorímetro VP-DSC (MicroCal). Las muestras se dializaron en tampón preparado usando una membrana de corte de peso molecular de 3 kDa, y la concentración final de la muestra se ajustaron a ~ 0,7 mg/ml. Todos los experimentos se calentaron desde 20 hasta 110 ° C a una velocidad de barrido de 60 ° C/hr. Líneas de base Buffer-tampón se obtuvieron en las mismas condiciones experimentales y restan de los rastros de la muestra. El análisis de datos se realizó en Origen 7.0 (OriginLab Corp, Northampton, MA) equipado con el análisis DSC add-on (MicroCal). Cada curva de capacidad de calor exceso de proteína se corrigió por sustracción de referencia de una exploración tampón correspondiente seguido de concentración normalización de los datos. El punto medio de transición o temperatura de fusión (Tm aparente) se determinó mediante el cálculo del vértice de la curva de desnaturalización térmica a partir de los datos normalizados.

Calorimetría diferencial de dispersión (DSC) experimento ha sido utilizado para estudiar las transiciones térmicamente inducidas de macromoléculas biológicas mediante la supervisión de la capacidad calorífica exceso de una solución (Cp) de la molécula de interés como una función de la temperatura (Bruylants et al., 2005; Spink, 2008). Hemos llevado a cabo experimentos de DSC de una serie de nuestras proteínas de diseñado para la comparación estabilidad térmica en tampón PBS. Desde proceso de desnaturalización térmica para nuestras proteínas era irreversible, se utilizó la temperatura de fusión (Tm) en lugar de entalpia de transición (AH 0 m) para reflejar la estabilidad para nuestras proteínas. Despliegue de estas proteínas El calor inducido-produjo un perfil de DSC que consiste en una transición endotérmica. Deconvolución de la traza DSC utilizando un modelo de transición no-dos-estado dio un endoterma con una Tm. El ajuste del modelo fue confirmada por comparación de las huellas experimentales y calculados. Una curva de desnaturalización con sólo un pico se toma normalmente para indicar la presencia en la molécula de proteína de más de un dominio, con los diversos dominios de someterse a la desnaturalización no de forma independiente el uno del otro. Experimentos de DSC sobre tres proteínas representativas exhibieron un valor Tm de 62,4 ° C, 60,8 ° C y 58,7 ° C en FNIII 9-10 L1408P (CRARGDNPDC) variante (SEQ ID NO: 32), FNIII 9-10, L1408P (SEQ ID NO: 63) y FNIII 9-10 L1408P (RARGDNPD) variante (SEQ ID NO: 62), respectivamente (véase la Tabla 6 y la Figura 8A). Estabilidad de FNIII 10 del tipo silvestre (SEQ ID NO: 2), FNIII 10, 10 FNIII variante PRGDMPD (SEQ ID NO: 48) y FNIII 10 (CPRGDMPDC) variante (SEQ ID NO: 6) variantes es 80,7 ° C, 74,3 ° C y 85,0 ° C, respectivamente (véase la Tabla 7 y la Figura 9A). La presencia de una sola endotermia predominante confirmó la falta de heterogeneidad debido al producto, con o sin un enlace disulfuro. En este estudio, los valores de 7m de las transiciones de DSC fueron reproducibles y por lo tanto pueden ser asumidas para reflejar las estabilidades térmicas relativas de WT y sus mutantes.

Tabla 6: Después de la incorporación de un enlace disulfuro, FNIII 9- 10 variante aumentó su termoestabilidad (3,7 ° C) y solubilidad (~ 6 veces).

Tabla 7: Después de la incorporación de un enlace disulfuro, la variante FN-III10 aumentó su termoestabilidad (10,7 0 C) y solubilidad (~ 4 veces).

Solubilidad Medido por precipitación con sulfato amónico La solubilidad es una preocupación de las propiedades fisicoquímicas estudiadas durante preformulación farmacéutica. Para el desarrollo de una forma de dosificación líquida, datos de solubilidad precisos son esenciales para asegurar la robustez del producto acabado. Para las formas de dosificación sólidas, los datos de solubilidad son importantes en la determinación de si una cantidad adecuada de medicamento está disponible para la absorción in vivo. Si un compuesto tiene una baja solubilidad acuosa, puede estar sujeto a la velocidad de disolución o absorción limitada solubilidad limitada en el tracto gastrointestinal (Gl) tiempo de residencia. Los métodos que pueden ser utilizados para aumentar la solubilidad de la proteína son útiles en los estudios estructurales de alta resolución y aplicaciones farmacéuticas. Varios estudios han tenido éxito en el uso de mutagénesis dirigida al sitio de residuos en la superficie para mejorar la solubilidad de proteínas. Aquí, investigamos los determinantes intrínsecos de la solubilidad de la proteína mediante el estudio de cómo la mutación en bucle RGD de proteínas plegadas influye en sus solubilidades.

La precipitación de proteínas usando sulfato de amonio ha tenido éxito en la medición de la solubilidad de proteínas. (Treviño, SR, Scholtz, JM, y Pace, NC (2008). La medición y el aumento de la solubilidad de proteínas. Journal of Pharmaceutical Sciences 97, 4155 hasta 4166). Aunque la precipitación con sulfato de amonio puede dar información rápida y precisa sobre los valores de solubilidad relativas de las variantes de la misma proteína. Este método es experimental fiable ya que los factores que son difíciles de controlar, como el contenido de agua/tampón de proteína liofilizada o iones incidentales que podrían introducirse en el transcurso del experimento convertido enmascarado por la alta concentración de sal. Además, este método produce soluciones precipitó con fases acuosa y sólidos bien definidos, y requiere cantidades relativamente pequeñas de proteína (10 mg o menos) - incluso cuando se estudia una proteína altamente soluble.

Todas las mediciones se realizaron a temperatura ambiente (25 ° C) como se describe anteriormente (Treviño, SR, Scholtz, JM, y Pace, NC (2008). La medición y el aumento de la solubilidad de proteínas. Journal of Pharmaceutical Sciences 97, 4155 a 4166. En pocas palabras, tres soluciones (tampón de 50 mM, sulfato de amonio 3,0 M en tampón de 50 mM, y una solución de proteína de stock en tampón 50 mM) se mezclaron juntos en un tubo de PCR de 0,2 mi para un volumen de muestra final de 15 ml con el sulfato de amonio y la proteína deseada concentraciones, la muestra se dejó equilibrar durante> 1 min para los procesos de desplazamiento salino amorfos a continuación, la muestra se transfirió a 1,5 mi tubos Eppendorf y se centrifugó durante 1 min a 16.000 g para la eliminación de la agregación, el espectrofotómetro se blanqueó con 495 pl de una solución de sulfato de amonio 1 ,1 M. Después de la centrifugación, se añadieron 5 mI de la muestra al 495 mI blanking solución y se mezclaron para generar una dilución de 100 veces para las mediciones de absorbancia.

Determinación solubilidad de la proteína bt procedimiento del sulfato de amonio se utiliza para inducir la precipitación amorfa (Treviño, SR, Scholtz, JM, y Pace, NC (2008). La medición y el aumento de solubilidad de la proteína. Journal of Pharmaceutical Sciences 97, 4155-4166). Curvas de solubilidad en función de la concentración de sulfato de amonio para las proteínas se utilizan para indicar la solubilidad de la proteína de interés. Solubilidad de FNIII 9-10 L1408P (CRARGDNPDC) variante (SEQ ID NO: 32), proteína del tipo silvestre y FNIII 9-10 L1408P (RARGDNPD) variante es 24,4, 19,9 y 4,0 mg/ml (véase la Tabla 6 y la Figura 8B).. Solubilidad de FNIII 10, FNIII 10 del tipo silvestre (SEQ ID NO: 2), FNIII 10 (TPRGDMPD) variante (SEQ ID NO: 48) y FNIII 10 (CPRGDMPDC) variante (SEQ ID NO: 6) es 7,3, 5,3 y 27,8 mg/ml (véase el cuadro 7 y Fig. 9B). Cada valor de solubilidad se repitió tres veces y por lo tanto se puede suponer para reflejar la solubilidad relativa de WT y sus mutantes. Tomados en conjunto, la incorporación de un enlace disulfuro en la integrina a5b1 específico de FNIII 9-10 L1408P (CRARGDNPDC) variante (SEQ ID NO: 32) y la integrina ocvp3 específica FNIII 10 (CPRGDMPDC) variante (SEQ ID NO: 6) habían aumentado su la estabilidad y la solubilidad (ver Figs. 8B abd 9B).

Ejemplo 7. Los efectos sobre inducida por factor de crecimiento vascular en la formación del tubo Vitro Uno de los comunes utilizados en ensayos in vitro para modelar la etapa de reorganización de la angiogénesis es el ensayo de formación de tubo (Arnaoutova, I., y Kleinman, HK (2010) In vitro angiogénesis:.. La formación del tubo celular endotelial en extracto de la membrana basal gelificado protocolos Naturaleza 5, 628-635). El ensayo mide la capacidad de las células endoteliales, se sembraron a densidades subconfluentes con el apoyo de la matriz extracelular apropiado, para formar estructuras similares a capilares. Típicamente, la capacidad se puede cuantificar midiendo el número, la longitud, o el área de estas estructuras similares a capilares en imágenes de microscopio de la placa de cultivo. Dado que los compuestos son capaces de inhibir la formación de tubos, deben ser útiles en diversas enfermedades, como el cáncer, donde los tumores estimulan la nueva formación de vasos sanguíneos para recibir oxígeno y nutrientes para el crecimiento más allá de un tamaño relativamente pequeño. Aquí, se analizó la capacidad de nuestros mutantes diseñados para promover o inhibir la formación del tubo.

Para evaluar el efecto de los mutantes de Fn3 en bFGF o la formación del tubo endotelial mediada por VEGF in vitro, 15 pocilios m-diapositivas (ibidi GmbH) se recubrieron con 10 mE de Matrigel (BD Biosciences). HUVECs preincubó con mutantes de Fn3 para se añadieron 15 minutos a los pocilios en M199 que contiene FBS al 2% y suplemento de crecimiento celular endotelial, y finalmente con 50 ng/ml bFGF o 20 ng/ml de VEGF. La longitud total del tubo se midió utilizando software ImajeJ y se comparó con el control en los tiempos indicados. Las micrografías de la formación del tubo fueron tomadas y procesadas por un microscopio invertido (Leica DM IRE2) equipado con una N PLAN IOx/O.25 lente de objetivo y una cámara CCD (CoolSNAP fx; fotometrías).

La inhibición inducida por VEGF en la formación del tubo por FNIII 9-10 (CRARGDNPDC) Variante (SEP ID NO: 32) Se sabía que a5b1 integrina está implicado en la angiogénesis inducida por VEGF. Y el bloqueo de la integrina a5b1 podría inhibir la angiogénesis inducida por VEGF in vitro e in vivo. Para evaluar si nuestra integrina cc5pi específico antagonista puede suprimir la formación de tubo capilar y el ensayo de tapón de Matrigel. El análisis de citometría de flujo mostró que la integrina a5b1 se sobreexpresa en HUVECs. Elegimos FNIII 9- 10 L1408P (CRARGDNPDC) variante (SEQ ID NO: 32) para este estudio, ya que tenía la propiedad de unión más fuerte biofísico y robusto. FNIII 9-10 L1408P (CRARGDNPDC) variante (SEQ ID NO: 32) inhibió la formación de tubo capilar inducida por VEGF por HUVECs cultivadas en Matrigel, una matriz de membrana basal extracelular, con valores de CI50 de aproximadamente 1,6 mM (Kleinman et al., 1986) (Fig. 10A). Sin embargo, FNIII 9-10 L1408P (CRARGDNPDC) variante (SEQ ID NO: 32) no inhibió la formación del tubo capilar inducida por bFGF por HUVECs cultivadas en Matrigel (Fig 10B.). Los resultados sugieren que nuestra integrina a5b1 antagonista específico de puede dirigirse específicamente a la integrina a5b1 en las células HUVEC e interferir con su participación en la formación del tubo de inducción de VEGF.

No inhibición inducida por bFGF en la formación del tubo por FNIII 10 (CPRGDMPDC) Variante (ID de septiembre No hay: 6) 10Fn3 (CPRGDMPDC) variante (SEQ ID NO: 6) no inhibió VEGF-inducida y formación del tubo capilar inducida por bFGF por HUVECs cultivadas en Matrigel respectivamente. Sin embargo, FNIII 10 (CPRGDMPDC) variante (SEQ ID NO: 6) hizo inhibir la angiogénesis inducida por bFGF in vivo. Además de la formación del tubo, la migración HUVECs también está involucrado en el proceso de la angiogénesis. Por lo tanto, especuló que nuestro antagonista integrina-ccvP3 específico puede interferir con la migración, pero no la formación del tubo en condiciones bFGF inductores. Esto se confirmó en el ensayo de migración transwell inducida por bFGF.

Ejemplo 8. En vivo Ensayo Matrigel Plug Angiogénesis El Matrigel enchufe ensayo de angiogénesis es un simple téenica in vivo para detectar los vasos sanguíneos recién formados en los tapones de gel trasplantados en ratones desnudos). La composición de la matriz Matrigel es comparable a las proteínas de la membrana basal. Se puede inducir la diferenciación de una variedad de tipos de células tales como las células endoteliales. Los niveles de actividad de los compuestos angiogénicos o antiangiogénicos pueden ser evaluadas visualmente por diferencias de color en los tapones en comparación con los controles. Además cuantificación se puede realizar utilizando una variedad de métodos como la detección de la hemoglobina. En nuestro caso, los factores de crecimiento (VEGF o bFGF) con o sin proteínas se mezclan con el Matrigel a continuación, se inyecta en los ratones para determinar las actividades antiangiogénicas de las proteínas.

Para evaluar los efectos angiogénicos in vivo, reduce el factor de crecimiento Matrigel líquido (0,25 mi) que contenía heparina (500 U/ml) con combinaciones de 125 ng de bFGF/VEGF y mutantes de Fn3 se inyectaron subcutáneamente en ratones C57BL/6 cerca de la línea media abdominal. Cuatro días después de la implantación, los ratones fueron sacrificados y los tapones de Matrigel se eliminaron quirúrgicamente, fotografiado con una cámara CMOS (600D, Canon), y el contenido de hemoglobina de cada tapón de Matrigel se midió con el kit de ensayo colorimétrico de hemoglobina (Cayman).

La inhibición de la angiogénesis inducida por VEGF por FNIII 9-10 Variante (CRARGDNPDC) (SEQ ID NO: 32) A continuación mide la capacidad de la variante FNIII 9-10 L1408P (CRARGDNPDC) (SEQ ID NO: 32) para bloquear la angiogénesis in vivo usando un ensayo de tapón de Matrigel. (Passaniti, RM Taylor, R. Pili, Y. Guo, PV Long, JA Hancy, RR Pauly, DS Grant, Martin GR., Un método simple, cuantitativo para evaluar la angiogénesis y agentes antiangiogénicos usando membrana basal reconstituida, la heparina, y de fibroblastos factor de crecimiento., Lab. Invest., 67 (1992), pp. 519-528)). Sorprendentemente, FNIII 9-10 L1408P (CRARGDNPDC) variante (SEQ ID NO: 32) inhibe la angiogénesis a niveles cercanos a la del control negativo (ver Flg. 11). Se indica que la integrina a5b1 juegan un papel en la angiogénesis inducida por VEGF y este proceso biológico pueden ser bloqueados por nuestro antagonista-cc5p¡ específico diseñado.

La inhibición de la angiogénesis inducida por bFGF por FNIII 10 (CPRGDMPDC) Variante (SEQ ID NO: 6) También se midió la capacidad de la variante FNIII 10 (CPRGDMPDC) (SEQ ID NO: 6) para bloquear la angiogénesis in vivo usando un ensayo de Matrigel enchufe. Sorprendentemente, FNIII 10 (CPRGDMPDC) variante (SEQ ID NO: 6) inhibió la angiogénesis a niveles cercanos a la del control negativo (Fig. 12). Se indica que la integrina anb3 desempeñar un papel en la angiogénesis inducida por bFGF y este proceso biológico puede ser bloqueada por nuestra antagonista específico de anb3 diseñado.

Ejemplo 9. Los efectos sobre el crecimiento de xenoinjertos de tumor humano en ratones SCID La pantalla preclínica importante para el desarrollo de nuevas terapias contra el cáncer se ha de lograr por heterotransplantation de células humanas de cáncer en roedores inmunodeficientes (xenotrasplante modelsX Christopher L Morton & Peter J Houghton, PROTOCOLOS DE LA NATURALEZA. 2007 247-250). Estos modelos han identificado agentes clínicamente eficaces, y sigue siendo el 'workhorsel de la industria farmacéutica. Para descubrir el mecanismo propuesto de enfoques terapéuticos, las características moleculares del tumor pudieron ser identificados por tinción inmunohistoquímica de bioposies tumorales. En este estudio, hemos establecido dos modelos de xenoinjertos de probar las actividades antitumorales de dos antagonistas de integrinas respectivamente.

Para evaluar el efecto de FNIII muíante sobre la angiogénesis del tumor, los ratones NOD-SCID recibieron inyecciones dorsales subcutáneos de 1 x 106 células de carcinoma de melanoma/pulmón humano. Los ratones recibieron s.c. inyecciones de diversas cantidades de E. cob- expresaron FNIII mutantes (5 o 10 mg/kg de peso corporal) una vez al día. Los tumores se recogieron, se fotografiaron con una cámara (T30, Sony), y se seccionaron. Microvasos intratumorales y las células se detectaron utilizando la tinción IHC con Ab contra CD31 (BD Biosciences) y Ki-67 (Leica), respectivamente. Las imágenes fueron capturados utilizando un microscopio BX51 (Olympus, Tokio, Japón). Densidad microvascular intratumoral y las células fueron cuantificados. Brevemente, la densidad óptica integrada (IOD) de microvasos y las células se calculó en cada sección del tumor con una ampliación de lOx utilizando el software Image-Pro Plus.

Inmunohistoquímica.

Todas las secciones de tejido se deparaffmized, rehidratada y somete a calor inducida por la recuperación de antígenos en autoclave durante 6 min en 10 mM de tampón Tris-EDTA (pH 9,0). La incubación con 3% H202 en metanol durante 5 min, después de 2 lavados en TBS, las secciones de tejido se incubaron con el bloque de proteína (NovoLink™) durante 5 min. A continuación, las muestras se mezclaron con anticuerpos primarios en diluyentes de anticuerpos y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 min. Después de 3 lavados en TBS, las secciones se incubaron con anticuerpos secundarios a temperatura ambiente durante 10 min. Después de 3 lavados en TBS, las muestras fueron desarrolladas utilizando solución de DAB de trabajo (NovoLink ™) durante 3 min, a contratinción con hematoxilina 0,02% durante 5 min, y se montaron con xileno. Por último, las secciones se visualizaron utilizando un microscopio invertido (1X71; Olympus, Tokio, Japón).

El análisis estadístico. Los datos se expresan como media ± desviación estándar. Los valores de p <0,05 fueron considerados estadísticamente significativos.

La inhibición del crecimiento de tumores A375 por FNIII 9-10 (CRARGDNPDC) Variante (SEQ ID NO: 32) La actividad antiangiogénica de FNIII 9-10 L1408P (CRARGDNPDC) variante (SEQ ID NO: 32) nos alentó a determinar si se podía suprimir la angiogénesis patológica. El crecimiento tumoral es dependiente de la angiogénesis, y la supresión de la angiogénesis se ha demostrado que inhibe el crecimiento del tumor. Para estudiar la posible actividad antitumoral de FNIII 9-10 L1408P (CRARGDNPDC) variante (SEQ ID NO: 32), se utilizó xenoinjertos de melanoma A375 humanos. El análisis de citometría de flujo mostró que la integrina a5b1 se sobreexpresa en las células tumorales A375. En la administración subcutánea vivo de FNIII 9-10 L1408P (CRARGDNPDC) variante (SEQ ID NO: 32) dio como resultado la supresión dependiente de la dosis del crecimiento tumoral. Después de un tratamiento de 3 semanas, se observó una reducción de los volúmenes tumorales y los pesos (ver Fig. 13). Para dilucidar las bases celulares de los defectos observados en la carga tumoral, evaluamos los efectos de FNIII 9-10 L1408P (CRARGDNPDC) variante (SEQ ID NO: 32) sobre la proliferación y la angiogénesis de tumores inducidos A375-realizando inmunohistoquímica en parafina secciones tumorales embebidos con los marcadores apropiados. Los tumores mostraron una muy leve defecto en estado de proliferación, como se refleja en la cuantificación de los niveles de expresión de K¡67 celulares. Es consistente con nuestros resultados in vitro que FNIII 9-10 L1408P (CRARGDNPDC) variante (SEQ ID NO: 32) mostraron una ligera inhibición sobre la proliferación de células tumorales. Otra posible explicación para los defectos de crecimiento observadas puede ser una incapacidad para reclutar eficientemente la vasculatura del tumor, como b1 integrina se ha implicado previamente en la promoción de la angiogénesis tumoral. Para probar esta posibilidad, se realizó un análisis inmunohistoquímico en los tumores mediante el uso de un anticuerpo anti-CD31. Curiosamente, los tumores tratados con proteínas exhibieron un patrón diferente de la tinción de CD31 en comparación con sus homólogos competentes. El número de píxeles CD31 -positivos observados de los vasos dentro de los tumores de proteínas totales tratados se redujo en casi un promedio de un veces. Neovascularización de FNIII 9-10 L1408P (CRARGDNPDC) variante (SEQ ID NO: 32) tumores tratados con se redujo significativamente en comparación con los tumores de control (véase Fig. 13). Estos resultados reflejan una disminución en el diámetro medio de los vasos tumorales-infiltrado observados en los tumores inducidos por A375-y sugirieron un suministro sanguíneo deficiente en general para estos tumores. Es de acuerdo con nuestra in vitro resulta que FNIII 9-10 L1408P (CRARGDNPDC) variante (SEQ ID NO: 32) mostró una supresión significativa en la formación del tubo y el ensayo de tapón de Matrigel. Colectivamente, estas observaciones indican que los defectos en el crecimiento del tumor inducida A375-y la progresión de la integrina a5b1 tratamiento antagonista se correlacionan con una reducción de la angiogénesis pero no la supervivencia de células tumorales.

La inhibición del crecimiento de tumores A549 por FNIII 10 (CPRGDMPDC) Variante (SEQ ID NO: 6) La actividad antiangiogénica de FNIII 10 (CPRGDMPDC) variante (SEQ ID NO: 6) nos alentó a determinar si se podía suprimir la angiogénesis patológica. Para estudiar la posible actividad antitumoral de 10Fn3 (CPRGDMPDC) variante (SEQ ID NO: 6), se utilizó xenoinjertos de melanoma A549 humanos. El análisis de citometría de flujo mostró que la integrina anb3 no se sobreexpresa en las células tumorales A549. Sorprendentemente, la administración subcutánea en vivo de FNIII 10 (CPRGDMPDC) variante (SEQ ID NO: 6) dio lugar a la supresión dependiente de la dosis del crecimiento tumoral. Después de un tratamiento de 3 semanas, se observó una reducción de los volúmenes tumorales y los pesos (ver Fig. 14). Para dilucidar la base celular para los defectos observados en la carga tumoral, se evaluaron los efectos de FNIII 10 (CPRGDMPDC) variante (SEQ ID NO: 6) sobre la proliferación y la angiogénesis de tumores inducidos A375-mediante la realización de inmunohistoquímica en secciones de tumor embebidos en parafina con los marcadores apropiados. Los tumores mostraron defecto dramático en estado de proliferación, como se refleja en la cuantificación de los niveles de expresión de Ki67 celulares (véase Fig. 14).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido aislado que comprende un fragmento de fibronectina humana modificada que comprende el módulo de dominio tipo III de fibronectina humana 10 (FNIII 10), en donde el FNIII 10 comprende un motivo Arg-Gly-Asp (RGD) y dos sustituciones Cys para formar un enlace disulfuro, en donde una sustitución Cys es en el extremo N terminal al motivo RGD, y la otra sustitución Cys es en el extremo C terminal al motivo RGD, y en donde el FNII1 10 comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 85% homologa a la SEQ ID NO: 2.

2. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 , en donde el polipéptido inhibe la actividad de integrina adb? o integrina anb3 y no inhibe la actividad de integrina aII?b3.

3. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 , en donde las dos sustituciones Cys se separan por aproximadamente 6 a aproximadamente 9 residuos de aminoácidos.

4. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 3, en donde las dos sustituciones Cys se separan por 7 u 8 residuos de aminoácidos.

5. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 , en donde el FNIII 10 además comprende por lo menos una sustitución de aminoácido en la posición del aminoácido 1491, 1492, 1496, 1497 o 1498, y en donde la sustitución de aminoácido en la posición 1491 es Arg o lie, la sustitución de aminoácido en la posición 1492 es Ala o Pro, la sustitución de aminoácido en la posición 1496 es Met, Asn o Trp, la sustitución de aminoácido en la posición 1497 es Asn, y la sustitución de aminoácido en la posición 1498 es Asp o Glu.

6. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 5, en donde las dos sustituciones Cys son una sustitución Thr a Cys en la posición del aminoácido 1491 y sustitución Ser a Cys en la posición del aminoácido en 1499, y en donde el FNIII 10 comprende la fórmula Cys1491-Xi-Arg-Gly-Asp-X2-X3-X4-Cys1499, en donde Xi es Gly, Ala o Pro; X2 es Ser, Met, Asn o Trp; X3 es Pro o Asn; y X4 es Ala, Asp o Glu.

7. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 6, en donde el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 12.

8. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 6, en donde X1 es Pro, X2 es Met, X3 es Pro y X4 es Asp.

9. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 8, en donde el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6.

10. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 6, en donde el fragmento de fibronectina humana modificada además comprende el módulo de dominio tipo III de fibronectina humana 9 (FNIII 9) que opcionalmente comprende la sustitución Leu a Pro en la posición del aminoácido 1408, y en donde el FNIII 9 y FNIII 10 (FNIII 9-10) comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 85% homologa a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4.

11. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 10, en donde el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 26.

12. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 11, en donde el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 20.

13. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 6, en donde el polipéptido inhibe la actividad de integrina anb3.

14. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 5, en donde el fragmento de fibronectina humana modificada además comprende el módulo de dominio tipo III de fibronectina humana 9 (FNIII 9) que opcionalmente comprende la sustitución Leu a Pro en la posición del aminoácido 1408, y en donde el FNIII 9 y FNIII 10 (FNIII 9-10) comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 85% homologa a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4.

15. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 14, en donde las dos sustituciones Cys son una sustitución Val a Cys en la posición del aminoácido 1490 y sustitución Ser a Cys en la posición del aminoácido 1499, y en donde el FNIII 10 comprende la fórmula Cys1490-XrX2-Arg-Gly-Asp-X3-Pro-X4-Cys1499, en donde Xi es Thr, Arg o lie; X2 es Gly, Ala o Pro; X3 es Phe, Arg, Asp, Ser, Met o Asn; y X4 es Ala o Asp.

16. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 15, en donde el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109 O SEQ ID NO: 110.

17. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 15, en donde X1 es Arg, X2 es Ala, X3 es Asn y X4 es Asp.

18. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 17, en donde el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 32.

19. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 15, en donde el polipéptido inhibe la actividad de integrina a5b1.

20. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 15, en donde el módulo de dominio tipo III de fibronectina humana 9 (FNIII 9) opcionalmente comprende la sustitución Asn a Ala en la posición del aminoácido 1341, sustitución His a Pro en la posición del aminoácido 1377, sustitución Pro a Lys en el aminoácido 1376, o sustitución Pro a Asp en la posición del aminoácido 1376.

21. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 20, en donde el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113 o SEQ ID NO: 114.

22. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 20, en donde el polipéptido inhibe la actividad de ¡ntegrina a5b1.

23. Un polipéptido aislado que comprende un fragmento de fibronectina humana modificada que comprende el módulo de dominio tipo III de fibronectina humana 9 y el módulo de dominio tipo III de fibronectina humana 10 (FNIII 9-10), en donde el FNIII 9 opcionalmente comprende la sustitución Leu a Pro en la posición del aminoácido 1408, en donde el FNIII 9 y el FNIII 10 comprenden, cada uno, por lo menos una sustitución de aminoácido, en donde la sustitución de aminoácido en el FNIII 9 y el FNIII 10 forman un enlace no covalente, y en donde el FNIII 9 y FNIII 10 comprenden una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 85% homologa a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 y que no es la SEQ ID NO: 60.

24. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 23, en donde las sustituciones de aminoácidos en el FNIII 9 y el FNIII 10 forman un enlace disulfuro entre dominios.

25. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 23, en donde las sustituciones de aminoácidos en el FNIII 9 y el FNIII 10 forman un puente de hidrógeno entre dominios.

26. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 24, en donde la sustitución de aminoácido en el FNIII 9 es una sustitución Ala a Asp en la posición del aminoácido 1340 y la sustitución de aminoácido en el FNIII 10 es una sustitución Val a Lys en la posición del aminoácido 1442.

27. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 26, en donde el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40.

28. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 24, en donde el polipéptido inhibe la actividad de integrina a5b1.

29. Un polipéptido aislado que comprende un fragmento de fibronectina humana modificada que comprende el módulo de dominio tipo III de fibronectina humana 9 (FNIII 9) y módulo de dominio tipo III de fibronectina humana 10 (FNIII 10), en donde el FNIII 9 comprende por lo menos una sustitución de aminoácido en la posición del aminoácido 1373 o 1379, y en donde el FNIII 9 y FNIII 10 (FNIII 9-10) comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 85% homologa a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4.

30. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 29, en donde el FNIII 9 además comprende una sustitución Leu a Pro en la posición del aminoácido 1408.

31. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 30, en donde la sustitución de aminoácido es una sustitución Asp a Arg en la posición del aminoácido 1373 o sustitución Arg a Asp en la posición del aminoácido 1379.

32. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 31 , en donde el FNIII 9 comprende tanto la sustitución Asp a Arg en la posición del aminoácido 1373 como la sustitución Arg a Asp en la posición del aminoácido 1379.

33. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 30, en donde el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44 o SEQ ID NO: 46.

34. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 33, en donde el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42.

35. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 29, en donde el polipéptido inhibe la actividad de integrina anb3.

36. Un polipéptido aislado que comprende un fragmento de fibronectina humana modificada que comprende el módulo de dominio tipo III de fibronectina humana 10 (FNIII 10) que tiene una secuencia de aminoácidos Val 1490-X1 -X2-Arg-G ly-Asp-X3-X4-X5-X6-Ser1500 , en donde Xi es Thr o Arg; X2 es Ala o Pro; X3 es Met, Trp o Asn; X4 es Pro o Asn; X5 es Asp o Glu; y X6 es Ser o Gly, en donde el FNIII 10 comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 85% homologa a la SEQ ID NO: 2 y no es la SEQ ID NO: 50.

37. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 36, en donde el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 52 o SEQ ID NO: 54.

38. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 37, en donde el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 48.

39. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 36, en donde el fragmento de fibronectina modificada además comprende el módulo de dominio tipo III de fibronectina humana 9 (FNIII 9) que opcionalmente comprende la sustitución Leu a Pro en la posición del aminoácido 1408, y en donde el FNIII 9 y FNIII 10 comprenden una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 85% homologa a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4.

40. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 39, en donde el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60 o SEQ ID NO: 62.

41. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 40, en donde el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 62.

42. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 36, en donde el polipéptido inhibe la actividad de integrina a5b1 y/o actividad de integrina anb3.

43. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva dei polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 42, y un excipiente, diluyente o portador farmacéuticamente aceptable.

44. Un método para inhibir la adhesión, crecimiento, migración o diferenciación celular mediada por integrinas, que comprende la etapa de poner en contacto una célula con una cantidad terapéuticamente efectiva del polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 42, en donde la integrina es anb3 o a5b1.

45. El método de conformidad con la reivindicación 44, en donde la integrina es integrina anb3.

46. El método de conformidad con la reivindicación 45, en donde el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 48 o SEQ ID NO: 60.

47. El método de conformidad con la reivindicación 44, en donde la integrina es integrina a5b1.

48. El método de conformidad con la reivindicación 47, en donde el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62 o SEQ ID NO: 72.

49. Un método para inhibir la adhesión, crecimiento, migración o diferenciación celular mediada por integrinas en un mamífero, que comprende la etapa de administrar a un mamífero la composición farmacéutica de la reivindicación 43, en donde la integrina es anb3 o a5b1.

50. El método de conformidad con la reivindicación 49, en donde la integrina es integrina anb3.

51. El método de conformidad con la reivindicación 50, en donde el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 48 o SEQ ID NO: 60.

52. El método de conformidad con la reivindicación 49, en donde la integrina es integrina a5b1.

53. El método de conformidad con la reivindicación 62, en donde el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60 o SEQ ID NO: 62.

54. Un método para inhibir el crecimiento celular tumoral o metástasis tumoral, que comprende poner en contacto una célula tumoral con una cantidad terapéuticamente efectiva del polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 42, en donde la célula tumoral expresa a5b1 o anb3.

55. El método de conformidad con la reivindicación 54, en donde el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62 de la SEQ ID NO: 68.

56. El método de conformidad con la reivindicación 54, donde el tumor es carcinoma pulmonar, tumor de mama, tumor de colon, osteosarcoma, tumor pancreático, tumor ovárico, tumor cervical, glioblastoma, tumor de próstata, tumor de hígado o melanoma.

57. Un método para inhibir el crecimiento tumoral o metástasis tumoral en un mamífero, que comprende administrar a un mamífero, en necesidad de ello, la composición farmacéutica de la reivindicación 43, en donde el tumor expresa a5b1 o anb3.

58. El método de conformidad con la reivindicación 57, en donde el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60 o SEQ ID NO: 62.

59. El método de conformidad con la reivindicación 57, donde el tumor es carcinoma pulmonar, tumor de mama, tumor de colon, osteosarcoma, tumor pancreático, tumor ovárico, tumor cervical, glioblastoma, tumor de próstata, tumor de hígado o melanoma.

60. Un método para inhibir la progresión tumoral en un mamífero, que comprende administrar a un mamífero, en necesidad de ello, la composición farmacéutica de la reivindicación 44, en donde la célula tumoral expresa anb3 o a5b1.

61. El método de conformidad con la reivindicación 60, en donde la integrina es anb3 y el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 48 o SEQ ID NO: 60.

62. El método de conformidad con la reivindicación 60, en donde la integrina es a5b1 y el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62 o SEQ ID NO: 72.

63. El método de conformidad con la reivindicación 60, donde el tumor es carcinoma pulmonar, tumor de mama, tumor de colon, osteosarcoma, tumor pancreático, tumor ovárico, tumor cervical, glioblastoma, tumor de próstata, tumor de hígado o melanoma.

64. Un método para inhibir la metástasis tumoral en un mamífero, que comprende administrar a un mamífero, en necesidad de ello, la composición farmacéutica de la reivindicación 43, en donde la célula tumoral expresa anb3 o a5b1.

65. El método de conformidad con la reivindicación 64, en donde la composición farmacéutica comprende un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60 o SEQ ID NO: 62.

66. El método de conformidad con la reivindicación 64, donde el tumor es carcinoma pulmonar, tumor de mama, tumor de colon, osteosarcoma, tumor pancreático, tumor ovárico, tumor cervical, glioblastoma, tumor de próstata, tumor de hígado o meianoma.

67. Un método para inhibir una enfermedad relacionada con angiogénesis en un mamífero, que comprende administrar a un mamífero, en necesidad de ello, la composición farmacéutica de la reivindicación 43, en donde la enfermedad relacionada con angiogénesis es cáncer, degeneración macular, edema o artritis.

68. El método de conformidad con la reivindicación 67, en donde la composición farmacéutica comprende un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62 o SEQ ID NO: 68.

69. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 42.

70. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 69, en donde el polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEO ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61 o SEQ ID NO: 71.

71. Un vector de expresión que comprende el polinucleótido de la reivindicación 69.

72. Una célula huésped que comprende el vector de expresión de la reivindicación 71.

73. Un método para preparar un polipéptido, que comprende las etapas de: (a) cultivar la célula huésped de la reivindicación 72 bajo condiciones efectivas para permitir la expresión del polipéptido codificado a partir del vector de expresión; y (b) recuperar el polipéptido a partir del cultivo.