ES2728675T3 - Variantes de semaforina 3C, composiciones que comprenden dichas variantes y métodos de utilización de las mismas - Google Patents

Abstract

Una variante de Semaforina 3C para uso en la inhibición de la linfangiogénesis en un sujeto, en donde dicha variante tiene al menos un 80%, 90%, 95%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID NO: 1, en donde dicha variante comprende al menos una modificación en el sitio 2 de escisión de proproteína convertasa de tipo furina consistente en los restos de aminoácidos 549-552, y en donde dicha modificación hace que dicha variante sea resistente a la escisión en dicho sitio 2 de escisión.

Description

DESCRIPCIÓN

Variantes de semaforina 3C, composiciones que comprenden dichas variantes y métodos de utilización de las mismas

Campo de la invención

La presente invención se relaciona, entre otros, con usos médicos de variantes de la Semaforina 3C (Sema3C) que tienen modificaciones de aminoácidos en sitios de escisión de proproteína convertasa de tipo furina, que hacen que estos sitios sean resistentes a la escisión.

Antecedentes de la invención

Las semaforinas son una familia de proteínas unidas a membrana y solubles clasificadas en ocho subclases en base a sus dominios estructurales. Las semaforinas regulan principalmente el montaje/desmontaje de la adhesión focal e inducen la remodelación citoesquelética, afectando así a la forma de la célula, a la unión de la célula a la matriz extracelular, a la motilidad celular y a la migración celular. Aunque originalmente se las identificó como factores de guía de los axones que controlan el desarrollo del sistema nervioso central, se ha visto que diferentes Semaforinas participan en otros muchos procesos, tales como la respuesta inmune, la angiogénesis y la linfangiogénesis.

Las siete Semaforinas de la clase 3 (Sema3), designadas por las letras A-G, son las únicas Semaforinas segregadas por los vertebrados. Las Neuropilinas (Nrp) y las Plexinas de la familia de tipo A/D (Plexina-A1, -A2 y -A3 y Plexina-D1) actúan como receptores para las Sema3. Cada miembro de la familia Sema3 muestra una preferencia de unión distinta para las Nrp. Cada complejo Sema3-Nrp se asocia con plexinas específicas para mediar en la señalización cadena abajo.

Se sabe que la Semaforina 3C (Sema3C), una Semaforina de la clase 3, afecta a la migración neuronal, tal como proporcionando señales quimiorrepulsivas a las neuronas simpáticas o señales quimioatractivas a las neuronas GABAérgicas. Además de su función que afecta a la migración neuronal, Sema3C ha mostrado tener funciones adicionales. Contrariamente a la mayoría de las Semaforinas de la clase 3, que se vio que funcionaban como inhibidores de la migración y proliferación de las células endoteliales y como inhibidores de la angiogénesis (Neufeld et al., 2008, Nat. Rev. Cancer, 8: 632-645), varios estudios indican que Sema3C tiene un papel distinto en la promoción de la angiogénesis, la guía de las células endoteliales y la morfogénesis vascular. Por ejemplo, Sema3C ha mostrado inducir la proliferación y adhesión de células endoteliales glomerulares de ratón (MGEC). Adicionalmente, Sema3C ha mostrado inducir un aumento en la migración direccional de MGEC y estimular la formación de redes de tipo capilar MGEC sobre geles de Colágeno I (Banu N. et al., 2006, FASEB J., 20: 2150-2152).

También se ha sugerido que Sema3C está implicada en la progresión de tumores, que promueve la migración de tumores y que se expresa en elevados niveles en células tumorales metastáticas. Por ejemplo, Sema3C mostró expresarse en elevados niveles en células neoplásicas de cáncer gástrico. Además, tumores de estómago primarios, así como tumores de hígado metastáticos, se suprimían significativamente por silenciación inducida por miARN de Sema3C en ratones desnudos (Miyato, H. et al., 2012, Cancer Sci., 103: 1961-1966).

Las siete Semaforinas de la clase 3 contienen sitios de escisión de proproteína convertasas de tipo furina (FPPC) conservados. La actividad funcional de las Semaforinas de la clase 3 está sujeta a regulación por escisión en los sitios de escisión FPPC. Las proproteína convertasas de tipo furina (FPPC) son una familia de enzimas proteolíticas que convierten proteínas de su forma inmadura inactiva en su forma activa por escisión de las proteínas inmaduras en los sitios de escisión FPPC. La furina y otros seis miembros de esta familia (PC2, PC1/3, PACE4, PC4, PC5/6 y PC7) poseen una fuerte preferencia por sustratos que contienen la unidad de escisión multibásica Arg-X-Arg/Lys-Arg-X (Becker et al., 2010, J. Med. Chem., 53(3): 1067-1075). La furina y sus análogos son responsables de la maduración de un gran número de precursores de proteínas inactivas y están, por lo tanto, implicados en muchos procesos fisiológicos normales. La expresión de FPPC está frecuentemente regulada a más en tumores y metástasis (Seidah N.G. et al., 2012, Nat. Rev. Drug. Discov., 11: 367-383).

En algunos casos, se vio que la escisión de las Semaforinas de la clase 3 en los sitios de escisión FPPC daba lugar a la completa inhibición de la actividad biológica, como en el caso de Sema3B (Varshavsky et al., 2008, Cancer Res., 68: 6922-6931). En otro caso, se vio que la escisión en los sitios de escisión FPPC de Sema3E daba lugar a actividad prometastática de Sema3E. Se vio que el procesamiento proteolítico de Sema3E no tenía ningún papel en la regulación de su actividad inhibitoria hacia células endoteliales (Casazza et al., 2012, EMBO Mol. Med., 4: 234-250).

Sema3C comprende sitios de escisión FPPC conservados y además comprende un sitio de escisión para la metaloproteasa extracelular ADAMTS1. La Sema3C natural está presente como una mezcla de las formas escindidas y no escindidas por FPPC. Se ha visto que la escisión de la Semaforina 3C inducida por ADAMTS1 promueve la migración celular in vitro (Esselens C. et al., 2009, J. Biol. Chem., 285: 2463-2473). Sin embargo, no se han caracterizado las propiedades funcionales de las diversas formas escindidas y no escindidas por FPPC de Sema3C.

La Publicación de Solicitud de Patente Estadounidense N° US2013/0028896 describe métodos, usos y composiciones farmacéuticas para el tratamiento del cáncer de próstata usando un inhibidor de Sema 3C que se puede seleccionar de: un anticuerpo, un péptido Sema 3C, un ARN antisentido, un ARNpi, un ARNhc o una molécula pequeña.

La Publicación de Solicitud de Patente Estadounidense N° US2012/0101029 de algunos de los inventores de la presente invención describe un método de tratamiento del cáncer en un sujeto que lo necesite, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una Semaforina 3E resistente a proproteína convertasas.

Esselens et al., (2009) Journal of Biological Chemistry, vol. 285, n° 4, páginas 2463-2473, describen que la escisión de Semaforina 3C inducida por ADAMTS1 promueve la migración celular.

Herman et al., (2007) International Journal of Oncology, vol. 30, n° 5, páginas 1231-1238, describen que el aumento en la expresión de semaforina de la clase 3 modula las propiedades invasivas y adhesivas de las células del cáncer de próstata.

Miyato et al., (2012) Cancer Science, vol. 103, n° 11, páginas 1961-1966, describen que la Semaforina 3C está implicada en la progresión del cáncer gástrico.

Casazza et al., (2012) EMBO Molecular Medicine, vol. 4, n° 3, páginas 234-250, describen la inhibición del crecimiento tumoral y la actividad antimetastática de una isoforma de Semaforina 3E resistente a furina mutada.

Banu et al., (2006) The Faseb Journal, vol. 20, n° 12, páginas 2150-2152, describen que la Semaforina 3C regula la función de las células endoteliales aumentando la actividad de las integrinas.

Dietrich et al., (2007) The American Journal of Pathology, vol. 171, n° 1, páginas 361-372, describen la inhibición de la linfangiogénesis inflamatoria por bloqueo de la Integrina a5.

Aún queda, sin embargo, la necesidad de un método eficiente de supresión del crecimiento de un tumor inducido por cáncer y/o de reducción de la aparición de metástasis.

Compendio de la invención

La presente invención se relaciona con variantes de Semaforina 3C (Sema 3C) que comprenden modificaciones en los sitios de escisión de proproteína convertasa de tipo furina (FPPC), de tal forma que las modificaciones hacen que los sitios sean resistentes a la escisión. La presente invención también se relaciona con variantes de Semaforina 3C y/o Semaforina 3C de tipo salvaje para uso en la inhibición de la linfangiogénesis en un sujeto.

La presente invención se basa en parte en el inesperado descubrimiento de que la Semaforina 3C de tipo salvaje, así como las variantes de Sema 3C de la invención, son capaces de inhibir la formación de vasos sanguíneos in vitro y de inducir colapso de las células endoteliales linfáticas, como se ejemplifica aquí más adelante. Tal como se ejemplifica, una forma truncada de Semaforina 3C (Sema3C-p65-FC, como se indica en la SEQ ID NO: 6) no era capaz de inducir estos efectos. La presente invención se basa además en el sorprendente descubrimiento de que las variantes de Semaforina 3C de la invención eran capaces de reducir el tamaño de tumores inducidos en ratones y de prevenir la metástasis en los ganglios linfáticos centinela, como se ejemplifica aquí más adelante. Sin desear inclinarnos por teoría o mecanismo alguno, la capacidad de la Semaforina 3C de tipo salvaje y de las variantes de Semaforina 3C para inhibir la linfangiogénesis puede contribuir en gran medida a su capacidad para reducir la propagación de metástasis a los ganglios linfáticos, así como para tratar otras enfermedades, tales como la diabetes, la EII y las enfermedades oculares corneales.

Tal como se usan aquí, los términos "las variantes de Semaforina 3C de la invención", "variantes de Semaforina 3C", "las variantes de la invención" y "las variantes" se usan de manera intercambiable. Tal como se usan aquí, los términos "Semaforina 3C" y "Sema 3C" se usan de manera intercambiable.

Según un aspecto de la invención "Semaforina 3C de tipo salvaje" incluye también Semaforina 3C que tiene al menos un 80%, 90%, 95%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID NO: 1.

Por consiguiente, la presente invención proporciona una variante de Semaforina 3C para uso en la inhibición de la linfangiogénesis en un sujeto, en donde la variante tiene al menos un 80%, 90%, 95%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID NO: 1, en donde la variante comprende al menos una modificación en el sitio 2 de escisión de proproteína convertasa de tipo furina (FPPC) consistente en los restos de aminoácidos 549-552; y en donde la modificación hace que la variante sea resistente a la escisión en el sitio 2 de escisión.

En una realización, la modificación es una modificación de al menos un resto de Arginina en dicho sitio 2 de escisión de proproteína convertasa de tipo furina.

En una realización, la variante comprende además al menos una modificación en un dominio básico de dicha variante, teniendo el dominio básico una secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID NO: 5.

En una realización, la al menos una modificación en el sitio 2 de escisión es una modificación como se indica en la SEQ ID NO: 13.

En una realización, la al menos una modificación es una truncación de al menos parte del extremo C de dicha variante como se indica en la SEQ ID NO: 34.

En una realización, la variante comprende además una modificación que es una truncación de al menos parte del extremo C de dicha variante como se indica en la SEQ ID NO: 34.

En una realización, la modificación hace que dicha variante sea resistente a la escisión en dicho sitio de escisión por miembros de las proproteína convertasas de tipo furina.

La presente invención también proporciona un complejo que comprende una variante de Semaforina 3C como se ha definido anteriormente, y un resto no proteico o proteico, para uso en la inhibición de la linfangiogénesis en un sujeto.

En una realización, el resto proteico es un péptido, un polipéptido o una inmunoglobulina o una parte de ella. En una realización, la inmunoglobulina es una región Fc.

La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende como principio activo una cantidad terapéuticamente efectiva de Semaforina 3C de tipo salvaje como se indica en la SEQ ID NO: 1 o que tiene al menos un 80%, 90%, 95% o 99% de identidad de secuencia con el aminoácido indicado en la SEQ ID NO: 1 para uso en la inhibición de la linfangiogénesis en un sujeto.

Según algunas realizaciones, una modificación que hace que un sitio de escisión FPPC sea resistente a la escisión previene la escisión de al menos un 80% de variantes de Sema3C que albergan la modificación, posiblemente de al menos un 90% de dichas variantes, de manera alternativa de al menos un 95% de dichas variantes, en comparación con la escisión de la Sema3C de tipo salvaje. Tal como se usan aquí, las frases "una modificación que hace que una variante sea resistente a la escisión" y "una modificación que previene que una variante se escinda" se usan indistintamente. Tal como se usa aquí, una variante no escindible se refiere a una variante resistente a la escisión en un sitio de escisión de proproteína convertasa de tipo furina. Según algunas realizaciones, una variante de Sema3C que es no escindible debido a una modificación que hace que un sitio de escisión FPPC sea resistente a la escisión conserva escisión residual. Según algunas realizaciones, escisión residual es escisión de la variante a un grado de hasta el 30%, posiblemente hasta el 20%, posiblemente hasta el 10%, de manera alternativa hasta el 5%, en comparación con la escisión de la Sema3C de tipo salvaje. Según algunas realizaciones, escisión residual es escisión de menos del 50%, posiblemente menos del 40%, de manera alternativa menos del 30%, típicamente menos del 20%, de la variante. Según algunas realizaciones, la variante comprende al menos una modificación en el sitio 3 de escisión de proproteína convertasa de tipo furina consistente en los restos de aminoácidos 742-745 de Sema3C como se indica en la SEQ ID NO: 1, en donde la modificación hace que la variante sea resistente a la escisión en el sitio de escisión.

Según algunas realizaciones, se selecciona la modificación del grupo consistente en: al menos una sustitución de aminoácidos, al menos una deleción de aminoácidos y una combinación de éstas. Según algunas realizaciones, la modificación es una deleción de aminoácidos que comprende al menos parte de los aminoácidos en el sitio de escisión de proproteína convertasa de tipo furina. Según algunas realizaciones, la modificación es una modificación de al menos un resto de Arginina en un sitio de escisión de proproteína convertasa de tipo furina. Según algunas realizaciones, la modificación es una modificación de al menos un resto de Arginina en un sitio de escisión de proproteína convertasa de tipo furina a un resto de Lisina. Según otras realizaciones, la modificación es una modificación de todos los restos de Arginina en un sitio de escisión de proproteína convertasa de tipo furina.

Según algunas realizaciones, la variante comprende al menos una modificación en el sitio 2 de escisión de proproteína convertasa de tipo furina consistente en los restos de aminoácidos 549-552 de Sema3C como se indica en la SEQ ID NO: 1 y al menos una modificación en el sitio 3 de escisión de proproteína convertasa de tipo furina consistente en los restos de aminoácidos 742-745 de Sema3C como se indica en la SEQ ID NO: 1, en donde las modificaciones hacen que la variante sea resistente a la escisión en los sitios de escisión. Según algunas realizaciones, la al menos una modificación en el sitio 2 de escisión es una modificación de la secuencia RSRR como se indica en la SEQ ID NO: 3 a la secuencia KSKKcomo se indica en la SEQ ID NO: 13. Según algunas realizaciones, la al menos una modificación en el sitio 3 de escisión es una truncación de al menos parte del extremo C de dicha variante como se indica en la SEQ ID NO: 34. Según algunas realizaciones, la al menos una modificación en el sitio 3 de escisión es una truncación de todo el extremo C de dicha variante como se indica en la SEQ ID NO: 34. Según algunas realizaciones, la variante es una variante de la Semaforina 3C como se indica en la SEQ ID NO: 1, en donde la variante comprende una modificación en el sitio 2 de escisión de proproteína convertasa de tipo furina (FPPC) como se indica en la SEQ ID NO: 13 y una truncación de la sección del extremo C de dicha variante como se indica en la SEQ ID NO: 34. Según algunas realizaciones, la variante comprende además al menos una modificación en un dominio básico de dicha variante, teniendo el dominio básico una secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID NO: 5. Tal como se usa aquí, el dominio básico de Sema3C como se indica en la SEQ ID NO: 5 consiste en los aminoácidos 724-745 de Sema3C como se indica en la SEQ ID NO: 1.

Según algunas realizaciones, la variante comprende al menos una modificación en el sitio 2 de escisión de proproteína convertasa de tipo furina consistente en los restos de aminoácidos 549-552 de Sema3C como se indica en la SEQ ID NO: 1, o tiene al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, más preferiblemente al menos un 95%, incluso más preferiblemente al menos un 99%, de identidad de secuencia con el aminoácido indicado en la SEQ ID NO: 1, y al menos una modificación en el sitio 3 de escisión de proproteína convertasa de tipo furina consistente en los restos de aminoácidos 742-745 de Sema3C como se indica en la SEQ ID NO: 1, en donde las modificaciones hacen que la variante sea resistente a la escisión en los sitios de escisión. Según algunas realizaciones, la al menos una modificación en el sitio 2 de escisión es una modificación de la secuencia RSRR como se indica en la SEQ ID NO: 3 a la secuencia KSKK como se indica en la SEQ ID NO: 13. Según algunas realizaciones, la al menos una modificación en el sitio 3 de escisión es una truncación de al menos parte del extremo C de dicha variante como se indica en la SEQ ID NO: 34. Según algunas realizaciones, la al menos una modificación en el sitio 3 de escisión es una truncación de todo el extremo C de dicha variante como se indica en la SEQ ID NO: 34. Según algunas realizaciones, la variante es una variante de Semaforina 3C como se indica en la SEQ ID NO: 1, en donde la variante comprende una modificación en el sitio 2 de escisión de proproteína convertasa de tipo furina (FPPC) como se indica en la SEQ ID NO: 13 y una truncación de la sección del extremo C de dicha variante como se indica en la SEQ ID NO: 34. Según algunas realizaciones, la variante comprende además al menos una modificación en un dominio básico de dicha variante, teniendo el dominio básico una secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID NO: 5. Tal como se usa aquí, el dominio básico de Sema3C como se indica en la SEQ ID NO: 5 consiste en los aminoácidos 724-745 de Sema3C como se indica en la SEQ ID NO: 1.

Según algunas realizaciones, la modificación hace que la variante sea resistente a la escisión por miembros de las proproteína convertasas de tipo furina. Según algunas realizaciones, se seleccionan los miembros de las proproteína convertasas de tipo furina del grupo consistente en: furina, PC 1/3, PC2, PC4, PC 5/6, PACE4, PC7, Sitio-1 Proteasa, NARC-1 y una combinación de éstos.

Otras realizaciones, características, ventajas y la totalidad del alcance de aplicabilidad de la presente invención resultarán evidentes por la descripción detallada y los dibujos que se dan a continuación.

Breve descripción de las figuras

Las FIG. 1A-B representan (A) una representación esquemática de la Sema3C de tipo salvaje (marcada como "Sema3C") y una variante no escindible de Sema3C, denominada UNCL-Sema3C/FC (marcada como "UNCL-Sema3C/FC"), como se describe en el Ejemplo 1 aquí más adelante (DB = Dominio Básico; 1,2,3 = sitios 1, 2 y 3 de escisión FPPC, respectivamente; Fc = marcador FC), y (B) un análisis western blot, usando un anticuerpo anti-FC, analizando medios condicionados de células HEK293 transfectadas con un vector de expresión vacío (NC), una construcción codificante de Sema3C de tipo salvaje marcada con FC (Sema3C-wt) o una construcción codificante de UNCL-Sema3C/FC (UNCL-Sema3C).

Las FIG. 2A-I muestran micrografías que representan cultivos de células endoteliales derivadas de la vena umbilical humana (HUVEC) que se incubaron con medios condicionados de células HEK293 transfectadas con un vector de expresión vacío (Fig. 2A-C, denominado "Vector Vacío"), una construcción codificante de una variante marcada con FC de Sema3C escindida en el sitio FPPC 2 (Fig. 2D-F, denominada "Sema3C-p65-FC") o una construcción codificante de Sema3C de tipo salvaje marcada con FC (Fig. 2G-I, denominada "Sema3C-wt") a las 6,5, 13 ó 16,5 horas después de la incubación.

Las FIG. 3A-I muestran micrografías que representan Células Endoteliales Linfáticas (LEC) que se trataron durante 30 min con sema3E purificada (H) o medio condicionado de células HEK293 transfectadas con un vector vacío (A) o una construcción codificante de sema3A (D), sema3B (E), sema3C (B), sema3D (F), sema3F (C), sema3G (G) o sema6A (I). Tras el tratamiento con semaforina, se fijaron las células y se inmunotiñeron para actina y vinculina.

Las FIG. 4A-F muestran micrografías que representan Células Endoteliales Linfáticas (LEC) que se incubaron con medios condicionados de células HEK293 transfectadas con un vector de expresión vacío (Fig. 4A-B, denominadas "Control"), una construcción codificante de Sema3C de tipo salvaje marcada con FC (Fig. 4C-D, denominadas "Sema3C-wt") o una construcción codificante de una variante marcada con FC de Sema3C escindida en el sitio FPPC 2 (Fig. 4E-F, denominadas "Sema3C-p65-FC") al comienzo de la incubación (Tiempo cero) y 1 hora después de la incubación.

Las FIG. 5A-M muestran micrografías (A-L) y un gráfico de barras (M). Las Fig. 5A-L representan micrografías de ganglios linfáticos centinelas aislados que estaban adyacentes a tumores inducidos por células LM2-4 en ratones visualizados usando contraste de fases (A-D, I-J, marcado como "contraste de fases") o un microscopio fluorescente que detecta fluorescencia rojo tomate (E-H, K-L, marcado como "fluorescencia rojo tomate"). Las Fig. 5A-H muestran ganglios linfáticos extraídos de ratones en los que se indujeron tumores por células LM2-4. Las Fig. 5I-L muestran ganglios linfáticos extraídos de ratones en los que se indujeron tumores por células LM2-4 que expresan la construcción no escindible UNCL-Sema3C/myc-His, como se describe en el Ejemplo 1. La Fig. 5M muestra un gráfico de barras que compara los pesos tumorales de tumores extraídos de ratones a los que se inyectaron células LM2-4 (marcados como "control") o células LM2-4 que expresan la construcción no escindible UNCL-Sema3C/myc-His, como se describe en el Ejemplo 1 (marcados como "Sema3C").

La FIG. 6 muestra un gráfico de barras que compara la densidad de vasos linfáticos asociados a tumores en secciones de tumores extraídos de ratones a los que se inyectaron células LM2-4 (marcado como "control") o células LM2-4 que expresan la construcción no escindible UNCL-Sema3C/ myc-His, como se describe en el Ejemplo 1 (marcado como "UNCL-Sema3C").

La FIG. 7 muestra un gráfico de barras que compara los pesos tumorales de tumores extraídos de ratones a los que se inyectaron células MDA-MB-231 que expresan el VEGF-C humano (marcado como "VEGFC+Control") o células MDA-MB-231 que expresan el VEGF-C humano y la construcción no escindible UNCL-Sema3C/myc-His, como se describe en el Ejemplo 1 (marcado como "VEGF-C+Sema3C").

La FIG. 8 muestra un gráfico de barras que compara la cuantificación por PCR en tiempo real de la expresión para PlexinaA1, PlexinaA2, PlexinaA3, PlexinaA4, Plexina D1, NP1 y NP2 en Células Endoteliales Linfáticas cultivadas (marcado como "LEC") frente a Células Endoteliales derivadas de la Vena Umbilica1Humana cultivadas (marcado como "HUE").

Las FIG. 9A-D muestran micrografías que representan Células Endoteliales Linfáticas (LEC) que se incubaron con tampón de elución (A), UNCL-Sema3C-FC (B), Semaforina 3E-FC (C) o Sema3C-p65-FC (d ). Se tiñeron las células con Faloidina y un anticuerpo anti-Vinculina y se visualizaron usando un microscopio fluorescente (aumento: X40).

Las Fig. 10 A-F muestran micrografías y gráficos que representan células HUVEC o LEC. A: Se sembraron HUVEC o LEC en placas de 12 pocillos (2x104 y 5x104 células/pocillo, respectivamente) en medio de crecimiento LEC en presencia de vehículo (control) o FR-sema3C/Fc (2 |ig/ml). Se fotografiaron las células después de 72 h. B. Se sembraron LEC y HUVEC en placas de 96 pocillos revestidas de fibronectina y se midió el efecto de FR-sema3C/Fc (2 |ig/ml) sobre su proliferación usando el kit de ensayo de proliferación WST-1. Se muestra la media de N experimentos independientes. C. Se incubaron placas de 6 pocillos confluentes que contenían LEC con vehículo o FR-Sema3C-Fc y se estimularon con VEGF-C. Se sometieron entonces los extractos celulares a análisis western blot usando anticuerpos dirigidos contra VEGFR-3 fosforilado, ERK1/2 fosforilado y AKT fosforilado. Se extrajeron entonces los blots y se volvieron a sondear con anticuerpos contra VEGFR-3, ERK1/2 y AKT. Se muestra un experimento representativo de varios que se realizaron con resultados similares. F. Se sembraron LEC silenciadas para la expresión de los receptores indicados o células de control que expresaban un ARNph no diana (control ph) en los pocillos de la máquina xCELLigence (2x104 células/pocillo) y se cultivaron durante 24 h. Se las estimuló a continuación con FR-sema3C/Fc (1 |ig/ml). Se midió entonces la contracción celular en el tiempo. Se determinó la contracción máxima como se describe en la Fig. 10E. Los *** indican P<0,001. D. Se silenció la expresión de los receptores indicados en LEC usando vectores lentivíricos codificantes de especies de ARNph apropiadas. Se preparó ARN total a partir de células infectadas con un ARNph no diana (Control ph) o a partir de células en las que se silenció la expresión de los receptores indicados. Se usó PCR invertida cuantitativa para determinar el grado de silenciación. E. Se sembraron las células en los pocillos de una placa E 24 h antes del experimento. En este ejemplo, se estimularon luego las células con FR-sema3C/Fc (1 |ig/ml) o con vehículo (Control). Se definió la diferencia entre la respuesta al vehículo y a FR-sema3C/Fc como la contracción máxima y como se muestra por la flecha de doble punta.

Las Fig. 11 A-E muestran micrografías y gráficos que muestran que FR-sema3C/myc no afecta a las células LM2-4 cultivadas: A. Se sometieron el medio condicionado de células LM2-4 que expresan RFP rojo tomate y o bien un vector vacío (control) o bien un vector lentivírico codificante de FR-Sema3C/myc a análisis western blot usando anticuerpos anti-myc. B. Se sembraron HUVEC y LM2-4 en placas de 12 pocillos revestidas de gelatina (104 células/pocillo). Después de 24 horas, se cambió el medio por medios condicionados de células LM2-4 infectadas con lentivirus vacíos (control) o por medio condicionado de células LM2-4 que expresan FR-sema3C/myc y se estudió la contracción celular (aumento x10). C. Se sembraron células LM2-4 infectadas con FR-Sema3C/myc o con vectores lentivíricos vacíos (Control) en placas de 24 pocillos (1x105 células/pocillo). Se determinó el número de células adherentes después de la siembra (Día 0) o a los 3 días usando un contador Coulter. Las barras de error representan el error estándar de la media derivado de tres experimentos independientes. D. Se midió la migración de células LM2-4 infectadas con vector lentivírico vacío (control) o con lentivirus que dirigen la expresión de FR-sema3C/myc usando la máquina xCELLigence. E. Se examinó la expresión de la neuropilina-1 (NP1), neuropilina-2 (NP2) y plexina-D1 en los tipos celulares indicados usando análisis western blot.

Las Fig. 12 A-G muestran micrografías y gráficos que demuestran que FR-sema3C inhibe el desarrollo de tumores, la angiogénesis tumoral y la linfangiogénesis tumoral: A. Se implantaron células LM2-4 que expresaban RFP rojo tomate y o bien vector vacío (control) o bien un vector lentivírico codificante de FR-Sema3C/myc (2x106 células en 50 |il de PBS) en los cojinetes grasos mamarios de ratones scid/nod. Se cortaron los tumores al cabo de 30 días. Se muestran los pesos tumorales medios de N tumores obtenidos de tres experimentos independientes. B. Sección de parafina representativa teñida con hematoxilina y un anticuerpo dirigido contra LYVE-1. Las flechas indican vasos linfáticos intratumorales. C. Se escaneó toda la sección transversal derivada de cada tumor y se fotografió. Se determinó la razón entre el área media de tinción LYVE-1 y el área media de las secciones tumorales (derivadas de N tumores) usando ImagePro. D. Sección de parafina representativa de un tumor de control teñido con hematoxilina y un anticuerpo dirigido contra CD31. Los vasos sanguíneos intratumorales están indicados (flechas). E. Se determinó la razón entre el área media de tinción CD31 por sección tumoral de tumores de control y que expresan FR-sema3C/myc como se describe en C. F. Se prepararon suspensiones de una sola célula a partir de tumores de control y que expresan FR-sema3C/myc. Se incubaron entonces las células con anticuerpos dirigidos contra CD31. Se realizó una citometría de flujo y se analizaron los resultados y se cuantificaron con Summit Versión 4.3. Se muestra el porcentaje de células positivas a CD31 de la población celular total del tumor. G. Se incubaron las suspensiones de una sola célula descritas en C con anticuerpos dirigidos contra F4-80, CD11c y CD206. Se realizó una citometría de flujo y se analizaron los resultados y se cuantificaron con Summit Versión 4.3. Se muestra el porcentaje de células positivas a CD11c y células positivas a CD206 del total de células positivas a F4-80. Las barras de error representan el error estándar de la media entre diferentes tumores.

Las Fig. 13 A-D muestran que FR-sema3C inhibe la metástasis espontánea de las células LM2-4 a los ganglios linfáticos: A. Se implantaron células LM2-4 que expresan RFP rojo tomate y o bien vector vacío (control) o bien un vector lentivírico codificante de FR-Sema3C/myc en los cojinetes grasos mamarios. Se extrajeron los ganglios linfáticos axilares, aórticos lumbares y subilíacos apropiados después de 30 días. Se cuantificó el tamaño de las metástasis en los ganglios linfáticos extraídos usando el sistema de imagen IVIS-200. Se muestran los ganglios linfáticos que contienen metástasis (flechas amarillas) o no (flechas verdes). B. Se muestra una sección histológica representativa derivada de un ganglio linfático que contiene metástasis derivado de un ratón que albergaba un tumor de control a dos diferentes aumentos (a: 10x y b: 40x). También se muestra una sección histológica de un ganglio linfático limpio de un ratón que albergaba un tumor que contenía células LM2-4 que expresan FR-sema3C/myc (c: x10 y d: x40). Se tiñeron las secciones con anticuerpos Anti-HLA-1 humano y se contratiñeron con hematoxilina. C. Se representa el porcentaje de ratones que contenían metástasis detectables en sus ganglios linfáticos en dos experimentos independientes. D. Se determinó la concentración relativa de células LM2-4 que expresan rojo tomate en ganglios linfáticos que contenían metástasis usando el sistema IVIS-200 por medición de la densidad fotónica normalizada (fotón/seg/cm2/sr) emitida.

Descripción detallada de la invención

La presente invención describe variantes de Semaforina 3C (Sema 3C) que tienen modificaciones en sitios de escisión de proproteína convertasa de tipo furina (FPPC), de tal forma que las modificaciones hacen que los sitios sean resistentes a la escisión. Inesperadamente, se vio que las variantes no escindibles de Sema 3C suprimían el crecimiento de un tumor inducido por cáncer de mama y prevenían la diseminación de metástasis a los ganglios linfáticos centinelas que rodean al tumor. Sorprendentemente, se vio además que las variantes de Sema 3C reducían la formación de vasos linfáticos asociados a tumores.

Por consiguiente, la presente invención proporciona una variante de Semaforina 3C para uso en la inhibición de la linfangiogénesis en un sujeto, en donde la variante tiene al menos un 80%, 90%, 95%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID NO: 1, en donde la variante comprende al menos una modificación en el sitio 2 de escisión de proproteína convertasa de tipo furina (FPPC) consistente en los restos de aminoácidos 549-552, y en donde la modificación hace que la variante sea resistente a la escisión en el sitio 2 de escisión.

Tal como se usan aquí, los términos "Semaforina 3C" y "Sema 3C" se usan indistintamente y se refieren a Semaforina 3C humana como se indica en la SEQ ID NO: 1. La secuencia polinucleotídica codificante de Sema3C (como se indica en la SEQ ID NO: 1) se indica en la SEQ ID NO: 15. La Semaforina 3C humana, como se indica en la SEQ ID NO: 1, comprende tres sitios de escisión de proproteína convertasa de tipo furina (FPPC), a los que se hace aquí referencia como sitio 1, sitio 2 y sitio 3:

1. Tal como se usan aquí, los términos "sitio 1", "sitio 1 de escisión" y "sitio 1 de escisión de proproteína convertasa de tipo furina" se usan indistintamente y se refieren a un sitio que tiene la SEQ ID NO: 2, consistente en los aminoácidos 144-147 de la SEQ ID NO: 1.

2. Tal como se usan aquí, los términos "sitio 2", "sitio 2 de escisión" y "sitio 2 de escisión de proproteína convertasa de tipo furina" se usan indistintamente y se refieren a un sitio que tiene la SEQ ID NO: 3, consistente en los aminoácidos 549-552 de la SEQ ID NO: 1.

3. Tal como se usan aquí, los términos "sitio 3", "sitio 3 de escisión" y "sitio 3 de escisión de proproteína convertasa de tipo furina" se usan indistintamente y se refieren a un sitio que tiene la SEQ ID NO: 4, consistente en los aminoácidos 742-745 de la SEQ ID NO: 1 en el dominio básico de Sema 3C.

Tal como se usa aquí, el dominio básico de Sema 3C (al que también se hace aquí referencia como "el dominio básico"), como se indica en la SEQ ID NO: 5, consiste en los aminoácidos 724-745 de la SEQ ID NO: 1.

Según algunas realizaciones, los sitios de escisión FPPC son escindibles por proproteína convertasas de tipo furina. Según algunas realizaciones, se seleccionan proproteína convertasas de tipo furina (FPPC) capaces de escindir los sitios de escisión FPPC según la presente invención del grupo consistente en: furina, PC 1/3, PC2, PC4, PC 5/6, PACE4, PC7, Sitio-1 Proteasa, NARC-1 y una combinación de éstas.

La Sema3C natural está presente como una mezcla de las formas escindidas y no escindidas por FPPC. Como se ejemplifica aquí más adelante, la Sema 3C escindida en el sitio 2 es incapaz de inducir contracción de las Células Endoteliales Vasculares (CEV) y/o de las Células Endoteliales Linfáticas (c El ). Según algunas realizaciones, la Sema 3C escindida en el sitio 2 no posee propiedades antiangiogénicas y/o propiedades antilinfangiogénicas. Sin desear inclinarnos por teoría o mecanismo alguno, la escisión de Sema 3C en el sitio 2 de escisión FPPC por FPPC segregadas por células, tales como células de tumores malignos, da como resultado pérdida o disminución de las propiedades antiangiogénicas y/o antilinfangiogénicas poseídas por variantes no escindibles de Sema 3C. Se contempla, por lo tanto, que la capacidad de la Sema3C natural (a la que también se hace aquí referencia como Sema3C de tipo salvaje) para inhibir las propiedades angiogénicas y linfangiogénicas se atribuye a la forma no escindida de Sema3C. Según algunas realizaciones, la parte N-terminal de Sema 3C que ha sufrido en el sitio 2 se denomina Sema 3C-p65, como se indica en la SEQ ID NO: 6. Hay que entender que variantes de Sema3C que se escinden en el sitio 2, tales como Sema3C-p65, no se incluyen en las variantes de la invención.

El término "variante", tal como se usa aquí, se refiere a una secuencia polipeptídica que posee alguna propiedad estructural modificada de la Sema3C nativa, o bien como se indica en la s Eq Id NO: 1, o que tiene al menos un 80%, 90%, 95% o 99% de identidad de secuencia con el aminoácido indicado en la SEQ ID NO: 1.

Según algunas realizaciones, el término "variante", tal como se usa aquí, se refiere a Sema3C nativa como se indica en la SEQ ID NO: 1 que posee al menos una modificación en el sitio FPPC 2 que hace que la variante sea resistente a la escisión. Tal como se usan aquí, los términos "polipéptido" y "proteína" se usan indistintamente y se refieren a un polímero de restos de aminoácidos.

Una variante para uso en la invención comprende al menos una modificación en el sitio 2 de escisión de proproteína convertasa de tipo furina consistente en los restos de aminoácidos 549-552 de Sema3C como se indica en la SEQ ID NO: 1, en donde la modificación evita que la variante se escinda en el sitio 2 de escisión. Según algunas realizaciones, la variante comprende al menos una modificación en el sitio 2 de escisión de proproteína convertasa de tipo furina consistente en los restos de aminoácidos 549-552 de Sema3C como se indica en la SEQ ID NO: 1, en donde la modificación evita que la variante se escinda en el sitio 2 de escisión por proproteína convertasas de tipo furina (FPPC).

Según algunas realizaciones, la variante es una variante de Sema3C como se indica en la SEQ ID NO:1, que comprende una modificación de sitio 2 de escisión de proproteína convertasa de tipo furina de RSRR (como se indica en la SEQ ID NO: 3) a RSKR (como se indica en la SEQ ID NO: 11), preferiblemente a KSKR (como se indica en la SEQ ID NO: 12), lo más preferiblemente a KSKK (como se indica en la SEQ ID NO: 13). Según algunas realizaciones, la variante es una variante de Sema3C como se indica en la SEQ ID NO:1, que comprende una modificación de sitio 2 de escisión de proproteína convertasa de tipo furina de RSRR (como se indica en la SEQ ID NO: 3) a KSKK (como se indica en la s Eq ID NO: 13). Según algunas realizaciones, la variante comprende una deleción de al menos parte del sitio 2 de escisión de proproteína convertasa de tipo furina consistente en los restos de aminoácidos 549-552 de Sema3C como se indica en la SEQ ID NO: 1.

Según algunas realizaciones, la variante para uso según la invención comprende al menos una modificación en el sitio 2 de escisión de proproteína convertasa de tipo furina consistente en los restos de aminoácidos 549-552 de Sema3C como se indica en la SEQ ID NO: 1, y al menos una modificación en el sitio 3 de escisión de proproteína convertasa de tipo furina consistente en los restos de aminoácidos 742-745 de Sema3C como se indica en la SEQ ID NO: 1, en donde las modificaciones hacen que la variante sea resistente a la escisión en los sitios de escisión.

Según algunas realizaciones, la variante comprende al menos una modificación en el sitio 3 de escisión de proproteína convertasa de tipo furina consistente en los restos de aminoácidos 742-745 de Sema3C como se indica en la SEQ ID NO: 1, en donde la modificación hace que la variante sea resistente a la escisión en el sitio 3 de escisión. Según algunas realizaciones, la variante comprende al menos una modificación en el sitio 3 de escisión de proproteína convertasa de tipo furina consistente en los restos de aminoácidos 742-745 de Sema3C como se indica en la SEQ ID NO: 1, en donde la modificación evita que la variante se escinda en el sitio 3 de escisión por proproteína convertasas de tipo furina (FPPC). Según algunas realizaciones, una modificación en el sitio 3 de escisión de proproteína convertasa de tipo furina de Sema3C como se indica en la SEQ ID NO: 1, que evita la escisión en el sitio 3, es una modificación seleccionada del grupo consistente en: al menos una sustitución de aminoácido en el sitio 3, al menos una deleción de aminoácido en el sitio 3 y una combinación de éstas.

Según algunas realizaciones, la variante comprende una deleción de al menos parte del sitio 3 de escisión de proproteína convertasa de tipo furina consistente en los restos de aminoácidos 742-745 de Sema3C como se indica en la SEQ ID NO: 1. Según algunas realizaciones, la variante comprende una deleción del sitio 3 de escisión de proproteína convertasa de tipo furina consistente en los restos de aminoácidos 742-745 de Sema3C como se indica en la SEQ ID NO: 1.

Según algunas realizaciones, la variante comprende una truncación de al menos parte del extremo C de Sema3C como se indica en la SEQ ID NO: 34. Según algunas realizaciones, la variante comprende una truncación de al menos parte del extremo C de Sema3C desde el sitio 3 de escisión FPPC y secuencia abajo, como se indica en la SEQ ID NO: 36. Según algunas realizaciones, la variante comprende una truncación del extremo C de Sema3C como se indica en la SEQ ID NO: 34. Según algunas realizaciones, la variante comprende una truncación del extremo C de Sema3C desde el sitio 3 de escisión FPPC y secuencia abajo, como se indica en la SEQ ID NO: 36. Según algunas realizaciones, una truncación del extremo C de Sema3C como se indica en la SEQ ID NO: 34 comprende el sitio FPPC 3. Según algunas realizaciones, una truncación del extremo C de Sema3C como se indica en la SEQ ID NO: 36 comprende el sitio FPPC 3. Según algunas realizaciones, la variante comprende una truncación de al menos parte del extremo C de dicha variante, de tal forma que al menos el sitio 3 de escisión FPPC esté truncado.

Según algunas realizaciones, una variante es una variante de Sema3C como se indica en la SEQ ID NO: 1, comprendiendo además la variante una truncación de parte del dominio básico, de tal forma que se elimina el sitio 3 de escisión de proproteína convertasa de tipo furina. Según algunas realizaciones, la variante en la que el extremo C como se indica en la SEQ ID NO: 34 está truncado carece tanto del sitio 3 de escisión de proproteína convertasa de tipo furina como del sitio 1 de escisión ADAMTS.

Hay que entender que la secuencia exacta de aminoácidos del sitio 1 de escisión ADAMTS en Sema3C es desconocida, aunque se cree que está dentro de los 13 aminoácidos C-terminales como se indica en la SEQ ID NO: 34 (Esselens C. et al., 2009, J. Biol. Chem., 285: 2463-2473). Según algunas realizaciones, la variante comprende al menos una modificación del sitio 1 de escisión ADAMTS. Según algunas realizaciones, la variante comprende al menos una modificación del sitio 1 de escisión ADAMTS que hace que el sitio no sea escindible. Según algunas realizaciones, la variante comprende al menos una modificación del sitio 1 de escisión ADAMTS que hace que el sitio no sea escindible por miembros de las metaloproteasas extracelulares ADAMTS. Según algunas realizaciones, la variante comprende una deleción de al menos parte del sitio 1 de escisión ADAMTS. Según algunas realizaciones, la variante comprende una deleción del sitio 1 de escisión ADAMTS.

Según algunas realizaciones, una variante para uso según la invención es una variante de Sema3C como se indica en la SEQ ID NO:1, que comprende una modificación del sitio 2 de escisión de proproteína convertasa de tipo furina desde RSRR (como se indica en la SEQ ID NO: 3) hasta KSKK (como se indica en la SEQ ID NO: 13) y que comprende además una truncación C-terminal de la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID NO: 34. Según algunas realizaciones, la variante es una variante de Sema3C como se indica en la SEQ ID NO:1, que comprende una modificación del sitio 2 de escisión de proproteína convertasa de tipo furina desde RSRR (como se indica en la SEQ ID NO: 3) hasta KSKK (como se indica en la SEQ ID NO: 13) y que comprende además una truncación C-terminal de al menos parte de la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID NO: 34. Según algunas realizaciones, la variante es una variante de Sema3C como se indica en la SEQ ID NO:1, que comprende una modificación del sitio 2 de escisión de proproteína convertasa de tipo furina desde RSRR (como se indica en la SEQ ID NO: 3) hasta KSKK (como se indica en la SEQ ID NO: 13) y que comprende además una truncación C-terminal de la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID NO: 34; en donde dicha variante es como se indica en la SEQ ID NO: 35.

Según algunas realizaciones, la variante es una variante de Sema3C como se indica en la SEQ ID NO:1, que comprende una modificación del sitio 2 de escisión de proproteína convertasa de tipo furina desde RSRR (como se indica en la SEQ ID NO: 3) hasta KSKK (como se indica en la SEQ ID NO: 13) y que comprende además una truncación C-terminal de la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID NO: 36. Según algunas realizaciones, la variante es una variante de Sema3C como se indica en la SEQ ID NO:1, que comprende una modificación del sitio 2 de escisión de proproteína convertasa de tipo furina desde RSRR (como se indica en la SEQ ID NO: 3) hasta KSKK (como se indica en la SEQ ID NO: 13) y que comprende además una truncación C-terminal de al menos parte de la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID NO: 36.

Según algunas realizaciones, se hace aquí referencia a una variante de Sema3C como se indica en la SEQ ID NO:1, que comprende una modificación del sitio 2 de escisión de proproteína convertasa de tipo furina desde RSRR (como se indica en la SEQ ID NO: 3) hasta KSKK (como se indica en la SEQ ID NO: 13) y que comprende además una truncación C-terminal de la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID NO: 34 como "UNCL-Sema3C", también denominada aquí "FR-Sema3C". Según algunas realizaciones, UNCL-Sema3C comprende un marcador C-terminal. Según algunas realizaciones, UNCL-Sema3C comprende un marcador FC C-terminal, que tiene una secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 8. Según algunas realizaciones, UNCL-Sema3C comprende un marcador myc-6His C-terminal, que tiene una secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 9.

Bioactividad de las variantes de Sema 3C, tal como se usa aquí, se refiere a la capacidad de las variantes de Sema3C para provocar al menos una de las respuestas biológicas de Sema 3C, tales como, aunque sin limitación, la capacidad de inhibir la migración celular o la capacidad de inducir colapso del citoesqueleto celular en HUVEC. Según algunas realizaciones, las variantes para uso en la invención son bioactivas. Se puede estudiar la bioactividad de las variantes de Sema 3C por cualquier método conocido en la técnica, tal como, aunque sin limitación, inducción de la contracción de HUVEC, ensayos de migración celular, inmunotinción de células para marcadores citoesqueléticos y similares.

Según algunas realizaciones, la modificación en un sitio de escisión FPPC según la presente invención es una modificación que hace que dicho sitio sea resistente a la escisión. Según algunas realizaciones, la modificación en un sitio de escisión FPPC según la presente invención es una modificación que hace que dicho sitio sea resistente a la escisión por proproteína convertasas de tipo furina (FPPC).

Según algunas realizaciones, se selecciona la modificación del grupo consistente en: al menos una sustitución de aminoácidos, al menos una deleción de aminoácidos y una combinación de éstas. Según algunas realizaciones, la modificación es al menos una sustitución de aminoácidos. Según algunas realizaciones, la modificación es al menos una deleción de aminoácido. Según algunas realizaciones, la modificación es una modificación que previene la escisión en un sitio de escisión de proproteína convertasa de tipo furina. Según algunas realizaciones, la modificación es una deleción de aminoácidos que comprende al menos parte de los aminoácidos de un sitio de escisión FPPC. Según algunas realizaciones, la modificación es una truncación que comprende al menos parte de los aminoácidos del sitio de escisión FPPC.

Según algunas realizaciones, la modificación es una truncación de aminoácidos. Según algunas realizaciones, una modificación del sitio 3 de escisión de proproteína convertasa de tipo furina que hace que este sitio no sea escindible es una truncación de al menos parte del dominio básico como se indica en la s Eq ID NO: 5. Según algunas realizaciones, la variante comprende una truncación de al menos parte del dominio básico de Sema3C como se indica en la SEQ ID NO: 5. Según algunas realizaciones, la variante de Sema3C comprende una truncación completa del dominio básico. Según algunas realizaciones, la variante comprende al menos una modificación en el dominio básico de Sema3C como se indica en la SEQ ID NO: 5.

Según algunas realizaciones, una modificación del sitio 3 de escisión de proproteína convertasa de tipo furina que hace que este sitio no sea escindible es una truncación de al menos parte del extremo C de Sema3C, el extremo C indicado en la SEQ ID NO: 34. Según algunas realizaciones, la variante comprende una truncación de al menos parte del extremo C de Sema3C, el extremo C indicado en la SEQ ID NO: 34. Según algunas realizaciones, la variante de Sema3C comprende una truncación completa del extremo C de Sema3C, el extremo C indicado en la SEQ ID NO: 34. Según algunas realizaciones, la variante comprende al menos una modificación en el extremo C de Sema3C, el extremo C indicado en la SEQ ID NO: 34.

Según algunas realizaciones, la modificación es una modificación de al menos un resto de Arginina en un sitio de escisión de proproteína convertasa de tipo furina. Son ejemplos no limitativos de modificaciones de al menos un resto de Arginina en el sitio 2 de escisión de proproteína convertasa de tipo furina modificaciones del sitio 2 desde RSRR (como se indica en la SEQ ID NO: 3) hasta RSKR (como se indica en la SEQ ID NO: 11), KSKR (como se indica en la SEQ ID NO: 12) o KSKK (como se indica en la SEQ ID NO: 13).

Según algunas realizaciones, la modificación es una modificación de al menos un resto de Arginina en un sitio de escisión de proproteína convertasa de tipo furina a un resto de Lisina. Según otras realizaciones, la modificación es una modificación de todos los restos de Arginina en un sitio de escisión de proproteína convertasa de tipo furina.

Según algunas realizaciones, la modificación evita que la variante se escinda en un sitio de escisión de proproteína convertasa de tipo furina. Según algunas realizaciones, la modificación evita que la variante se escinda en un sitio de escisión de proproteína convertasa de tipo furina por miembros de las proproteína convertasas de tipo furina (FPPC). Según algunas realizaciones, se seleccionan los miembros de las proproteína convertasas de tipo furina del grupo consistente en: furina, PC 1/3, PC2, PC4, PC 5/6, PACE4, PC7, Sitio-1 Proteasa, NARC-1 y una combinación de éstas. La presente invención también proporciona un complejo que comprende una variante de Semaforina 3C como se ha definido anteriormente, y un resto no proteico o proteico, para uso en la inhibición de la linfangiogénesis en un sujeto.

Según algunas realizaciones, la variante de Semaforina 3C comprende además un marcador proteico. Según algunas realizaciones, se selecciona el marcador proteico del grupo consistente en: un marcador proteico N-terminal, un marcador proteico C-terminal y una combinación de éstos. Según algunas realizaciones, la variante de Semaforina 3C se conjuga con un resto que prolonga la semivida de dicha variante. Según algunas realizaciones, la Semaforina 3C de tipo salvaje se conjuga con un resto que prolonga la semivida de dicha variante. Son ejemplos no limitativos de restos que pueden prolongar la semivida de las variantes de Semaforina3C polietilenglicol (PEG), polipéptidos tales como poliglicina y XTEN (Amunix), ácido hialurónico, albúmina y una inmunoglobulina o una parte de la misma, tal como, aunque sin limitación, la región Fc.

Según algunas realizaciones, la variante de Semaforina 3C comprende un marcador proteico en la producción, pero el marcador se escinde y/o elimina de la variante antes de la incorporación a la composición de la invención. Se puede realizar la escisión y/o la eliminación de un marcador proteico por cualquier método conocido en la técnica, tal como, aunque sin limitación, escisión enzimática y/o química, siempre que la variante de Sema3C permanezca funcional. Según algunas realizaciones, una variante funcional de Semaforina3C se refiere a una variante que es capaz de inhibir la linfangiogénesis. Son ejemplos no limitativos de variantes de Sema3C que comprenden un marcador proteico para uso según la presente invención: UNCL-Sema3C/FC (como se indica en la SEQ ID NO: 8) y UNCL-Sema3C/myc-6His (como se indica en la SEQ ID NO: 9), producidos como se describe aquí más adelante en el Ejemplo 1.

Según algunas realizaciones, la Semaforina 3C de tipo salvaje como se indica en la SEQ ID NO: 1 comprende además un marcador proteico. Según algunas realizaciones, la Semaforina 3C de tipo salvaje como se indica en la SEQ ID NO: 1 comprende un marcador proteico en la producción, pero el marcador se escinde y/o elimina de la variante antes de la incorporación en una composición farmacéutica.

Tal como se usa aquí, el término "marcador proteico" se refiere a una secuencia peptídica unida al extremo N o al extremo C de una proteína. Según algunas realizaciones, los marcadores proteicos pueden comprender glicoproteínas. Según algunas realizaciones, se pueden usar marcadores proteicos para la separación y/o purificación y/o visualización de las proteínas unidas. Son ejemplos no limitativos de marcadores proteicos: Fc, Myc, hemaglutinina de la influenza humana (HA), Flag, His, Glutatión-S-Transferasa (GST) y una combinación de éstos. Tal como se usa aquí, un marcador Fc se refiere a un marcador codificante de al menos parte de la región Fc de un anticuerpo de la clase inmunoglobulina G (IgG).

Según algunas realizaciones, la variante de Sema3C es una variante aislada. Tal como se usa aquí, el término "aislada" significa: 1) separada de al menos algunos de los componentes con los cuales se asocia normalmente en la naturaleza; 2) preparada o purificada mediante un procedimiento que conlleva la mano del hombre; y/o 3) que no aparece en la naturaleza.

Según algunas realizaciones, se pueden producir las variantes de Semaforina 3C por métodos sintéticos recombinantes o químicos. Según algunas realizaciones, se pueden producir las variantes de Semaforina 3C por métodos recombinantes a partir de células huésped genéticamente modificadas. Se puede usar cualquier célula huésped conocida en la técnica para la producción de proteínas recombinantes. En algunas realizaciones, la célula huésped es una célula procariótica. Como ejemplos no limitativos representativos de hospedadores procarióticos apropiados, se incluyen células bacterianas, tales como células de Escherichia coli y Bacillus subtilis. En otras realizaciones, la célula huésped es una célula eucariótica. En algunas realizaciones ejemplares, la célula huésped es una célula fúngica, tal como levadura. Como ejemplos no limitativos representativos de células de levadura apropiadas, se incluyen Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris. En realizaciones ejemplares adicionales, la célula huésped es una célula vegetal. Según otras realizaciones ejemplares, la célula huésped es una célula de mamífero en cultivo. Los siguientes son ejemplos no limitativos de métodos sintéticos recombinantes y químicos adecuados para la producción de las variantes de Semaforina 3C.

Expresión recombinante

Tal como se usa aquí, el término "gen" tiene un significado como se entiende en la técnica. En general, se considera que un gen incluye secuencias reguladoras génicas (por ej., promotores, potenciadores, etc.) y/o secuencias de intrones, además de secuencias codificantes (marcos abiertos de lectura).

Tal como se usan aquí, los términos "polipéptido" y "proteína" se usan indistintamente y se refieren a un polímero de restos de aminoácidos.

Tal como se usa aquí, el término "construcción de ADN" se refiere a una molécula de ácido nucleico artificialmente ensamblada o aislada que comprende un gen de interés o una región codificante de interés. Según algunas realizaciones, la región codificante de interés es ADNc codificante de una variante de Sema3C, tal como, aunque sin limitación, las variantes indicadas en secuencias seleccionadas del grupo consistente en: SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO.

9, SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 35.

Tal como se usa aquí, el término "vector" se refiere a cualquier construcción polinucleotídica recombinante (tal como una construcción de ADN) que se puede usar con el fin de transformación, es decir, la introducción de ADN heterólogo en una célula huésped. Un tipo ejemplar de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle de ADN de doble hélice circular en el que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo ejemplar de vector es un vector vírico, en donde se pueden ligar segmentos de ADN adicionales en el genoma vírico. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula huésped en la que se introducen.

Tal como se usa aquí, un "cebador" define un oligonucleótido que es capaz de emparejarse con (hibridarse con) una secuencia nucleotídica diana, creando así una región de doble hélice que puede servir como punto de iniciación para la síntesis de ADN en condiciones adecuadas.

Tal como se usan aquí, el término "transformación" se refiere a la introducción de ADN extraño en células. Los términos "transformantes" o "células transformadas" incluyen la célula transformada primaria y cultivos derivados de esa célula, independientemente del número de transferencias. Toda la progenie puede no ser precisamente idéntica en el contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. Se incluye la progenie mutante que tiene la misma funcionalidad que la seleccionada en la célula originalmente transformada en la definición de transformantes.

Se puede sintetizar una variante de Semaforina 3C expresando una molécula polinucleotídica codificante de la variante en una célula huésped, por ejemplo, una célula de un microorganismo transformada con la molécula de ácido nucleico.

Se pueden aislar secuencias de ADN codificantes de polipéptidos de tipo salvaje, tales como Semaforina 3C, de cualquier célula que los produzca, usando diversos métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede amplificar un ADN codificante del polipéptido de tipo salvaje a partir de ADN genómico por reacción en cadena de polimerasa (PCR) usando cebadores específicos, construidos en base a la secuencia nucleotídica de la secuencia de tipo salvaje conocida. Se puede extraer el ADN genómico de la célula antes de la amplificación usando diversos métodos conocidos en la técnica.

Se puede clonar el polinucleótido aislado codificante del polipéptido de tipo salvaje en un vector, tal como, aunque sin limitación, los plásmidos pET28a o pGEM-T easy.

Tras aislamiento y clonación del polinucleótido codificante del polipéptido de tipo salvaje, se puede(n) introducir mutación(es) deseada(s), con objeto de llegar a una secuencia polinucleotídica codificante de una variante deseada de Sema3C, por modificación en uno o más pares de bases, usando métodos conocidos en la técnica. Dichos métodos incluyen, por ejemplo, mutagénesis específica de sitio, mutagénesis en cassette, mutagénesis de conjunto recursiva y mutagénesis de saturación de sitios génicos. También se conocen bien métodos para introducir múltiples mutaciones en un polinucleótido. Por ejemplo, se puede realizar la introducción de dos y/o tres mutaciones usando kits comerciales, tales como el kit de mutagénesis dirigida a sitio QuickChange (Stratagene).

Un método alternativo para producir un polinucleótido con una secuencia deseada es el uso de un gen sintético. Se puede preparar un polinucleótido codificante de un polipéptido deseado sintéticamente, por ejemplo usando el método de fosforoamidita. Se puede someter entonces el polinucleótido así producido a otras manipulaciones, incluyendo una o más de purificación, hibridación, ligación, amplificación, digestión por endonucleasas de restricción y clonación en vectores apropiados. Se puede ligar el polinucleótido o bien inicialmente en un vector de clonación, o bien directamente en un vector de expresión que sea apropiado para su expresión en un tipo de célula huésped particular. En el caso de una proteína de fusión, o de una proteína fusionada a un marcador proteico, se pueden ligar diferentes polinucleótidos para formar un polinucleótido. Por ejemplo, se pueden ligar diferentes polinucleótidos en pET21a linealizado.

Se puede incorporar el polinucleótido codificante de la variante de Sema3C en una amplia variedad de vectores de expresión, que se pueden transformar en una amplia variedad de células huésped.

Se puede efectuar la introducción de un polinucleótido en la célula huésped por métodos bien conocidos, tales como transformación química (por ej., tratamiento con cloruro de calcio), electroporación, conjugación, transducción, transfección con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, transvección, microinyección, transfección mediada por lípidos catiónicos, carga por raspado, introducción balística e infección.

Como ejemplos no limitativos representativos de hospedadores apropiados, se incluyen células bacterianas, tales como células de E. coli y Bacillus subtilis. Se pueden codificar las variantes en cualquier vector adecuado para expresión. Se determina el vector apropiado según la célula huésped seleccionada. Como vectores para expresar proteínas en E. coli, por ejemplo, se incluyen, aunque sin limitación, pET, pK233, pT7 y lambda pSKF. Otros sistemas de vectores de expresión se basan en beta-galactosidasa (pEX), proteína de unión a maltosa (pMAL) y glutatión S-transferasa (pGST). Se pueden diseñar los polipéptidos para incluir un marcador proteico, por ejemplo, un Marcador His (seis restos de histidina consecutivos), que se puede aislar y purificar por métodos convencionales.

Se puede llevar a cabo la selección de una célula huésped transformada con el vector deseado usando protocolos de selección estándar que conllevan el crecimiento en un medio de selección que es tóxico para células no transformadas. Por ejemplo, en el caso de E. coli, se puede cultivar en un medio que contenga un agente de selección antibiótico; las células transformadas con el vector de expresión que además proporciona un gen de resistencia a antibióticos, crecerán en el medio de selección.

Tras la transformación de una célula huésped adecuada, y la propagación en condiciones apropiadas para la expresión de proteínas, se puede identificar la variante en extractos celulares de las células transformadas. Se pueden identificar hospedadores transformados que expresan la variante analizando las proteínas expresadas por el hospedador, por ejemplo, usando SDS-PAGE y comparando el gel con un gel de SDS-PAGE obtenido del hospedador que se transformó con el mismo vector pero que no contiene una secuencia de ácido nucleico codificante de la variante deseada.

Se pueden aislar las variantes deseadas que se han identificado en extractos celulares y purificarlas por métodos convencionales, incluyendo precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción con ácido, fraccionación con sal, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de permeación por gel, cromatografía de afinidad y sus combinaciones.

Se pueden analizar las variantes aisladas en cuanto a sus diversas propiedades, por ejemplo, actividad específica, usando métodos conocidos en la técnica. En un ejemplo no limitativo, se pueden analizar las variantes de Semaforina 3C en cuanto a su capacidad para inducir contracción de las células endoteliales derivadas de la vena umbilical humana (HUVEC). Las condiciones para llevar a cabo los procedimientos antes mencionados, así como otros métodos útiles, son fácilmente determinadas por quienes tienen conocimientos ordinarios en la técnica.

Producción sintética

También se pueden producir variantes de Semaforina 3C por medios sintéticos usando técnicas bien conocidas, tales como síntesis en fase sólida. Se pueden producir polipéptidos sintéticos usando diseño y kits de síntesis de péptidos de laboratorio comerciales. Además, se dispone de una serie de sistemas de síntesis de péptidos FMOC. Se puede llevar a cabo el montaje de un polipéptido o fragmento en un soporte sólido usando, por ejemplo, un sintetizador de péptidos automatizado de Applied Biosystems, Inc. Modelo 431A. Se pueden preparar los polipéptidos por síntesis directa o por síntesis de una serie de fragmentos que pueden copularse usando otras técnicas conocidas.

Los experimentos de la Sección de Ejemplos muestran que la semaforina de clase 3 sema3C es la única semaforina de clase 3 además de sema3F que es capaz de inducir el colapso del citoesqueleto de LEC, lo que sugiere que sema3C puede funcionar como un modulador de la linfangiogénesis y de la metástasis tumoral mediada por vasos linfáticos. El producto de escisión de sema3C p65-Sema3C era inactivo cuando se examinó su capacidad para inducir el colapso del citoesqueleto de LEC. Por consiguiente, se usó la variante FR-sema3C con mutación puntual de sema3C que es resistente a la escisión por FPPC en los experimentos.

FR-sema3C inducía de manera efectiva el colapso del citoesqueleto de LEC y HUVEC. Estos efectos estaban mediados en LEC por el receptor de neuropilina-2 y por los receptores de plexina D1 y A1 que forman receptores funcionales de semaforina de clase 3 cuando se asocian con neuropilinas. La silenciación de la plexina-A3 no tuvo efecto sobre la contracción inducida por FR-sema3C/Fc de LEC. Esto es sorprendente, ya que se sabe que sema3F, la otra semaforina que induce contracción de LEC, transduce señales usando neuropilina-2 y plexina-A3. FR-sema3C también inhibía potentemente la proliferación de LEC y menos eficazmente la proliferación de células endoteliales vasculares. Como la sema3C de tipo salvaje, FR-sema3C no tenía efecto sobre la proliferación o sobre la organización citoesquelética de las células de cáncer de mama altamente metastáticas LM2-4, posiblemente porque estas células no expresan el receptor de neuropilina-2. FR-sema3C inhibía la transducción de señal inducida por VEGF-C en LEC, lo que sugiere que puede ciertamente funcionar in vivo como un inhibidor de la linfangiogénesis. Las células LM2-4 que expresan FR-sema3C formaron tumores en los cojinetes grasos mamarios de ratones, pero su crecimiento estaba inhibido en aproximadamente un 50% en comparación con el índice de crecimiento de tumores control. Esto era probablemente el resultado de un efecto antiangiogénico, ya que la concentración de vasos sanguíneos en tumores formados a partir de células que expresan FR-sema3C se redujo en un 50% en comparación con su concentración en tumores que se desarrollaron a partir de células control. La concentración reducida de vasos sanguíneos no puede explicarse únicamente por un efecto directo de FR-sema3C sobre las células endoteliales de los vasos sanguíneos, ya que la FR-sema3C in vitro sólo inhibía la proliferación de células endoteliales vasculares en aproximadamente un 20%. Una reducción en la concentración de macrófagos M2 activados en los tumores que expresan FR-sema3C. Se vio que los macrófagos asociados a tumores M2 aumentaban la angiogénesis y también se observó linfangiogénesis y es posible que la inhibición de su reclutamiento por FR-sema3C contribuya a la inhibición inducida por FR-sema3C de la angiogénesis y la linfangiogénesis.

La concentración de vasos linfáticos en los tumores que se desarrollaron a partir de las células que expresan FR-sema3C también se redujo en aproximadamente un 50% en comparación con su densidad en tumores control, lo que sugiere que FR-sema3C ciertamente sí funciona como un factor antilinfangiogénico. La expresión de FR-sema3C en las células tumorales inhibía potentemente la diseminación de células tumorales a los ganglios linfáticos. Se observaron efectos similares cuando se inhibió la transducción de señal inducida por factores linfangiogénicos, tales como VEGF-C y VEGF-D, lo que sugiere que la inhibición de la metástasis por FR-sema3C es ciertamente debida a su actividad antilinfangiogénica. Tanto el número de ganglios linfáticos que contienen metástasis como el tamaño de las metástasis en los ganglios linfáticos que contienen metástasis se redujeron en ratones que albergaban tumores derivados de células LM2-4 que expresan FR-sema3C. Estos resultados sugieren que se puede usar FR-sema3C para inhibir la diseminación metastática de tumores de cáncer de mama y posiblemente de tipos adicionales de tumores que se diseminan usando el sistema linfático.

También se describe aquí un método para inhibir o suprimir la linfangiogénesis en un sujeto, comprendiendo el método administrar a un sujeto una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de al menos una de las variantes Sema3C de la invención. La presente solicitud también describe un método para inhibir o suprimir la linfangiogénesis en un sujeto, comprendiendo el método administrar a un sujeto una composición farmacéutica que comprende como principio activo una cantidad terapéuticamente efectiva de Semaforina 3C de tipo salvaje como se indica en la SEQ ID NO: 1.

Según algunas realizaciones, la presente invención proporciona el tratamiento de una enfermedad o afección que se asocia a linfangiogénesis excesiva o que puede beneficiarse de la inhibición o supresión de la linfangiogénesis, usando una cantidad terapéuticamente efectiva de al menos una de las variantes de Sema3C. Según algunas realizaciones, la presente invención proporciona el tratamiento de una enfermedad o afección que se asocia a linfangiogénesis excesiva o que puede beneficiarse de la inhibición o supresión de la linfangiogénesis, usando una composición farmacéutica que comprende como principio activo una cantidad terapéuticamente efectiva de Semaforina 3C de tipo salvaje como se indica en la SEQ ID NO: 1. Son ejemplos no limitativos de afecciones que pueden beneficiarse de una linfangiogénesis reducida el edema linfático y la linfangiomatosis.

Tal como se usa aquí, el término "linfangiogénesis" se refiere a formación y/o crecimiento de vasos linfáticos de novo o a partir de vasos linfáticos existentes. Tal como se ejemplifica aquí más adelante, aparte de la Sema3F previamente mostrada como un repelente de células endoteliales linfáticas (LEC), se vio inesperadamente que Sema3C era la única Semaforina de clase 3 que inducía colapso de LEC.

Según algunas realizaciones, la presente solicitud describe un método para inhibir la linfangiogénesis en un sujeto, comprendiendo el método administrar a un sujeto una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de al menos una variante de Semaforina 3C como se indica en la SEQ ID NO: 1, en donde la variante comprende al menos una modificación en el sitio 2 de escisión de proproteína convertasa de tipo furina (FPPC) consistente en los restos de aminoácidos 549-552, y en donde la modificación hace que dicha variante sea resistente a la escisión en dicho sitio de escisión. Según algunas realizaciones, una cantidad terapéuticamente efectiva es una cantidad suficiente para inhibir la linfangiogénesis en un sujeto.

Según algunas realizaciones, la administración de la composición farmacéutica a un sujeto da como resultado la inhibición o supresión de la linfangiogénesis. Según algunas realizaciones, la administración de la composición a un sujeto afectado de cáncer da como resultado la inhibición o supresión de la linfangiogénesis en un tumor. Según algunas realizaciones, la administración de la composición a un sujeto afectado de cáncer da como resultado la inhibición o supresión de la linfangiogénesis de vasos linfáticos asociados a tumores. Según algunas realizaciones, inhibición o supresión de la linfangiogénesis se refiere a inhibición o supresión de al menos un 50%, posiblemente al menos un 70%, de manera alternativa al menos un 90%, de la linfangiogénesis en un sujeto no tratado con la composición o una composición que comprende Sema3C de tipo salvaje como se indica en la SEQ ID NO: 1. Según algunas realizaciones, la inhibición o supresión de la linfangiogénesis es local. Según algunas realizaciones, la administración de la composición a un sujeto afectado de cáncer da como resultado la reducción de la densidad de los vasos linfáticos asociados a tumores. Según algunas realizaciones, la administración de la composición a un sujeto afectado de cáncer da como resultado la supresión del crecimiento de vasos linfáticos asociados a tumores. Según algunas realizaciones, la administración de la composición a un sujeto afectado de cáncer da como resultado la reducción del drenaje linfático de un tumor.

Sin desear inclinarnos por teoría o mecanismo alguno, la capacidad de las variantes de Sema3C para reducir la densidad de los vasos linfáticos asociados a tumores puede contribuir a su capacidad para suprimir el crecimiento tumoral y/o suprimir la diseminación de metástasis a los ganglios linfáticos centinelas.

La variante para uso según la invención es capaz de inhibir la linfangiogénesis. Según algunas realizaciones, la variante es capaz de suprimir la linfangiogénesis. Según algunas realizaciones, la variante es capaz de suprimir o inhibir la diseminación de metástasis. Según algunas realizaciones, la variante es capaz de suprimir o inhibir la diseminación de metástasis a los ganglios linfáticos, preferiblemente ganglios linfáticos centinelas.

La presente invención proporciona la composición para uso en la inhibición de la linfangiogénesis. Según algunas realizaciones, la presente invención proporciona la composición para uso en la supresión de la linfangiogénesis. Según algunas realizaciones, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende como principio activo una cantidad terapéuticamente efectiva de Semaforina 3C de tipo salvaje como se indica en la SEQ ID NO: 1 para inhibir o suprimir la linfangiogénesis.

La presente solicitud también describe un método para tratar el cáncer en un sujeto, comprendiendo el método administrar al sujeto una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de al menos una variante de Semaforina 3C como se indica en la SEQ ID NO: 1, en donde la variante comprende al menos una modificación en el sitio 2 de escisión de proproteína convertasa de tipo furina consistente en los restos de aminoácidos 549-552 de Sema3C como se indica en la SEQ ID NO: 1; en donde la modificación hace que la variante sea resistente a la escisión en el sitio 2 de escisión.

La presente solicitud también describe un método de tratamiento del cáncer que comprende administrar al sujeto una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de al menos una variante de Semaforina 3C como se indica en la SEQ ID NO: 1, en donde la variante comprende al menos una modificación en el sitio 2 de escisión de proproteína convertasa de tipo furina consistente en los restos de aminoácidos 549-552 y al menos una modificación en el sitio 3 de escisión de proproteína convertasa de tipo furina consistente en los restos de aminoácidos 742-745, y en donde las modificaciones hacen que dicha variante sea resistente a la escisión en dichos sitios de escisión.

Tal como se describe aquí, el término "cantidad terapéuticamente efectiva" se relaciona con una cantidad suficiente para inducir al menos uno de los siguientes efectos clínicos cuando se administra a un sujeto: supresión del crecimiento tumoral en el sujeto, reducción de la aparición de metástasis en el sujeto, inhibición de la linfangiogénesis, inhibición de la angiogénesis y una combinación de éstas.

Tal como se describe aquí, según algunas realizaciones, se selecciona el tratamiento del grupo consistente en: supresión del crecimiento de un tumor, reducción de la aparición de metástasis y una combinación de éstas. Según algunas realizaciones, el tratamiento es la supresión del crecimiento de un tumor en un sujeto. Según algunas realizaciones, el tratamiento es la detención del crecimiento de un tumor en un sujeto. Según algunas realizaciones, un tumor en un sujeto tratado con la composición aquí descrita es de menor tamaño y/o peso que un tumor comparable en un sujeto no tratado con la composición.

Tal como se describe aquí, según algunas realizaciones, tratar es reducir la aparición de metástasis en un sujeto. Según algunas realizaciones, tratar es reducir la aparición de metástasis en los ganglios linfáticos de un sujeto. Según algunas realizaciones, tratar es reducir la aparición de metástasis en los ganglios linfáticos centinelas de un sujeto. Tal como se usa aquí, el término "ganglios linfáticos centinelas" se refiere a ganglios linfáticos que drenan un tumor canceroso. Según algunas realizaciones, tratar es reducir el número de metástasis en un sujeto. Según algunas realizaciones, tratar es reducir el tamaño de la metástasis en un sujeto. Según algunas realizaciones, las metástasis son metástasis en los ganglios linfáticos, preferiblemente metástasis en los ganglios linfáticos centinelas. Según algunas realizaciones, tratar es inhibir el crecimiento de las metástasis. Según algunas realizaciones, tratar es inhibir o suprimir la diseminación de metástasis. Según algunas realizaciones, tratar es inhibir o suprimir la diseminación de metástasis a los ganglios linfáticos, preferiblemente a los ganglios linfáticos centinelas. Sin desear inclinarnos por teoría o mecanismo alguno, la capacidad de las variantes de Sema3C para inhibir o suprimir la linfangiogénesis puede contribuir a su capacidad para suprimir o inhibir la diseminación de metástasis a los ganglios linfáticos centinelas de un tumor.

Según algunas realizaciones, tratar es inhibir la linfangiogénesis. Según algunas realizaciones, tratar es suprimir la linfangiogénesis. Según algunas realizaciones, tratar es inhibir o suprimir la linfangiogénesis en un tumor. Según algunas realizaciones, tratar es inducir la contracción de las células endoteliales linfáticas. Según algunas realizaciones, tratar es reducir la densidad de los ganglios linfáticos en un tumor. Según algunas realizaciones, tratar es suprimir el crecimiento de los ganglios linfáticos en un tumor. Según algunas realizaciones, tratar es reducir la densidad de vasos linfáticos asociados a tumores. Según algunas realizaciones, tratar es suprimir el crecimiento los vasos linfáticos asociados a tumores. Según algunas realizaciones, tratar es reducir el drenaje linfático de un tumor.

Tal como se describe aquí, según algunas realizaciones, "tumor" como se usa aquí se refiere a una masa anormal de tejido resultante de cáncer. Según algunas realizaciones, el cáncer según la presente invención se selecciona del grupo consistente en: linfoma, cáncer de mama, cáncer de cabeza y cuello, carcinomas escamosos de la cabeza y el cuello (HNSCC), cáncer de pulmón, cáncer rectal, cáncer de conductos biliares, cáncer de vejiga, cáncer de huesos, cáncer de colon, cáncer de cerebro, cáncer cervical, melanoma ocular, sarcoma de Kaposi, leucemia, melanoma, mieloma, cáncer ovárico, cáncer vaginal, cáncer de próstata, cáncer testicular, cáncer endometrial, cáncer tiroideo y cáncer de timo. Según algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de mama. Según algunas realizaciones, el cáncer es linfoma. Según algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer que induce tumores que envían metástasis a los ganglios linfáticos. Según algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer que se disemina a través de los ganglios linfáticos. Según algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer que se disemina a través de los ganglios linfáticos, tal como, aunque sin limitación, cáncer de mama, melanoma maligno, linfoma y cáncer de cabeza y cuello. Según algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer que induce tumores que segregan factores que inducen angiogénesis. Según algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer que induce tumores que segregan factores que inducen linfangiogénesis. Según algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer que induce tumores que segregan al menos un tipo de proproteína convertasa de tipo furina (FPPC). Según algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer que induce tumores que segregan al menos un tipo de proproteína convertasa de tipo furina (FPPC) que se sabe que escinde Sema3C en el sitio 2. Según algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer que induce tumores que segregan al menos un tipo de proproteína convertasa de tipo furina (FPPC) que se sabe que escinde Sema3C en el sitio 2 y/o el sitio 3. Sin desear inclinarnos por teoría o mecanismo alguno, las variantes de Sema3C son adecuadas para tratar un tumor que segrega al menos un tipo de FPPC que se sabe que escinde Sema3C, ya que no son susceptibles a los efectos de las FPPC.

La presente invención también describe un método para inhibir o suprimir la angiogénesis en un sujeto, comprendiendo el método administrar a un sujeto una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de al menos una de las variantes de Sema3C. La presente invención también describe un método para inhibir o suprimir la angiogénesis en un sujeto, comprendiendo el método administrar a un sujeto una composición farmacéutica que comprende como principio activo una cantidad terapéuticamente efectiva de Semaforina 3C de tipo salvaje como se indica en la SEQ ID NO: 1.

Tal como se describe aquí, según algunas realizaciones, inhibición o supresión de la angiogénesis se refiere a inhibición o supresión de al menos un 50%, preferiblemente al menos un 70%, lo más preferiblemente al menos un 90%, de la angiogénesis en un sujeto no tratado con la composición de la invención.

Tal como se describe aquí, según algunas realizaciones, la presente invención proporciona un método para inhibir la angiogénesis en un sujeto, comprendiendo el método administrar a un sujeto una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de al menos una variante de Semaforina 3C como se indica en la SEQ ID NO: 1, en donde la variante comprende al menos una modificación en el sitio 2 de escisión de proproteína convertasa de tipo furina (FPPC) consistente en los restos de aminoácidos 549-552, y en donde la modificación hace que dicha variante sea resistente a la escisión en dicho sitio de escisión. Según algunas realizaciones, una cantidad terapéuticamente efectiva es una cantidad suficiente para inhibir la linfangiogénesis en un sujeto.

Tal como se usa aquí, el término "angiogénesis" se refiere a la formación de vasos sanguíneos de novo o a partir de vasos sanguíneos existentes. Según algunas realizaciones, la administración de la composición da como resultado colapso de las células endoteliales de los vasos sanguíneos. Según algunas realizaciones, la administración de la composición a un sujeto afectado de cáncer da como resultado inhibición o supresión de la angiogénesis de células sanguíneas que suministran sangre a un tumor y/o metástasis. Sin desear inclinarnos por teoría o mecanismo alguno, la capacidad de la Sema3C de tipo salvaje y de las variantes de Sema3C para inhibir tanto la angiogénesis como la linfangiogénesis contribuye a su capacidad para suprimir el crecimiento de un tumor y/o reducir la aparición de metástasis, mayormente metástasis en los ganglios linfáticos. Según algunas realizaciones, la variante es capaz de suprimir o inhibir la angiogénesis.

Según algunas realizaciones, tal como se usan aquí, los términos "sujeto" o "un sujeto que lo necesite" se usan indistintamente y se refieren a un sujeto afectado de una patología que se beneficiaría de la inhibición de la linfangiogénesis.

Se puede usar cualquier vía adecuada de administración a un sujeto para la composición para uso según la presente invención, incluyendo, aunque sin limitación, las vías tópica y sistémica. Según algunas realizaciones, administrar es administrar sistemáticamente. Según algunas realizaciones, se formula la composición para administración sistémica.

Según otra realización, la administración sistémica es a través de una vía parenteral. Según algunas realizaciones, las preparaciones de la composición para administración parenteral incluyen soluciones, suspensiones o emulsiones acuosas o no acuosas estériles. Son ejemplos no limitativos de disolventes o vehículos no acuosos propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales, tales como aceite de oliva y aceite de maíz, gelatina y ésteres orgánicos inyectables, tales como el oleato de etilo.

Según algunas realizaciones, administración parenteral es administración intravenosa, intraarterial, intramuscular, intraperitoneal, intradérmica, transdérmica, intravítrea o subcutáneamente. Según otra realización, se realiza la administración parenteral por inyección en bolo. Según otra realización, se realiza la administración parenteral por infusión continua.

Según otra realización, la administración parenteral es administración transmucosal. Según otra realización, la administración transmucosal es administración transnasal. Para la administración transmucosal, se usan penetrantes apropiados para la barrera que se ha de permear en la formulación. Dichos penetrantes son generalmente conocidos en la técnica. El modo preferido de administración dependerá de la indicación particular que se esté tratando y será obvio para un experto en la técnica.

Una linfangiogénesis anormal es un factor complicante en enfermedades adicionales. Una angiogénesis y linfangiogénesis anormal representa una complicación de varias enfermedades oculares inflamatorias en las que nuevos vasos sanguíneos y nuevos vasos linfáticos invaden la córnea normalmente transparente. Se puede inducir esto mediante irritantes, insuficiencia límbica o complicaciones de procedimientos quirúrgicos, tales como injertos de córnea, y causan pérdida de visión. Estas observaciones sugieren que los inhibidores de la linfangiogénesis podrían ser útiles como fármacos para el tratamiento de dichas enfermedades oculares, así como de enfermedades adicionales que conllevan linfangiogénesis inflamatoria, tal como la enfermedad inflamatoria del intestino o diversas complicaciones de la diabetes. Ciertamente, algunos inhibidores que se dirigen al receptor VEGFR-3 que actúa como el receptor para los factores linfangiogénicos VEGF-C y VEGF-D están actualmente en ensayos clínicos. Por consiguiente, se pretende determinar si se puede usar la inyección de FR-sema3C o la aplicación de colirios que contienen FR-sema3C para tratar dichas enfermedades corneales en modelos preclínicos con animales.

Se inducirán inflamación, neolinfangiogénesis y neoangiogénesis en las córneas de los ojos de ratones negros c57 o los ojos de ratas usando quemadura alcalina o colocación de sutura como se ha descrito. Se aplicará FR-sema3C/Fc como gotas o mediante inyección con objeto de determinar si inhibe la neoangiogénesis y la neolinfangiogénesis. Se usará el vehículo solo como control, y se compararán los resultados con los efectos del inhibidor VEGF Avastina. Un resultado positivo será una inhibición significativa de la linfangiogénesis y la angiogénesis hacia la córnea.

En algunas realizaciones de la invención, se proporciona una variante de Semaforina 3C para uso en la reducción de la linfangiogénesis corneal en un sujeto que lo necesite.

En algunas realizaciones de la invención, se proporciona una variante de Semaforina 3C para uso en la prevención o minimización de la linfangiogénesis corneal en un sujeto que tenga riesgo de ello.

La presente solicitud describe un método para reducir la linfangiogénesis corneal en un sujeto que lo necesite, que comprende las etapas de: (a) identificar a un sujeto con linfangiogénesis corneal; y (b) administrar localmente a la córnea de dicho sujeto una composición que comprende una cantidad efectiva de una variante de Semaforina 3C que tiene al menos un 80%, 90%, 95%, 99% o 100% de identidad de secuencia con el aminoácido indicado en la SEQ ID NO: 1, en donde dicha variante comprende al menos una modificación en el sitio 2 de escisión de proproteína convertasa de tipo furina consistente en los restos de aminoácidos 549-552, y en donde dicha modificación hace que dicha variante sea resistente a la escisión en dicho sitio 2 de escisión y/o en donde dicha variante tiene al menos una modificación en el sitio 3 de escisión de proproteína convertasa de tipo furina consistente en los restos de aminoácidos 742-745, y en donde dicha modificación hace que dicha variante sea resistente a la escisión en dicho sitio 3 de escisión, inhibiendo así la capacidad de los vasos linfáticos para expandirse en o invadir el tejido corneal y reducir la linfangiogénesis corneal.

La presente solicitud también describe un método para minimizar o prevenir la linfangiogénesis corneal en un sujeto que lo necesite, que comprende las etapas de: (a) identificar a dicho sujeto en riesgo de desarrollar la instauración de linfangiogénesis; y (b) administrar localmente a la córnea de dicho sujeto una composición que comprende una cantidad efectiva de una variante de Semaforina 3C que tiene al menos un 80%, 90%, 95%, 99% o 100% de identidad de secuencia con el aminoácido indicado en la SEQ ID NO: 1, en donde dicha variante comprende al menos una modificación en el sitio 2 de escisión de proproteína convertasa de tipo furina consistente en los restos de aminoácidos 549-552, y en donde dicha modificación hace que dicha variante sea resistente a la escisión en dicho sitio 2 de escisión y/o en donde dicha variante tiene al menos una modificación en el sitio 3 de escisión de proproteína convertasa de tipo furina consistente en los restos de aminoácidos 742-745, y en donde dicha modificación hace que dicha variante sea resistente a la escisión en dicho sitio 3 de escisión antes de dicho desarrollo, inhibiendo así la capacidad de los vasos linfáticos para formarse o expandirse en, o invadir, el tejido corneal.

La presente solicitud también describe un método para reducir la linfangiogénesis corneal en un sujeto que lo necesite, que comprende las etapas de: (a) identificar a un sujeto con linfangiogénesis corneal; y (b) administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad efectiva de una variante de Semaforina 3C que tiene al menos un 80%, 90%, 95%, 99% o 100% de identidad de secuencia con el aminoácido indicado en la SEQ ID NO: 1, en donde dicha variante comprende al menos una modificación en el sitio 2 de escisión de proproteína convertasa de tipo furina consistente en los restos de aminoácidos 549-552, y en donde dicha modificación hace que dicha variante sea resistente a la escisión en dicho sitio 2 de escisión y/o en donde dicha variante tiene al menos una modificación en el sitio 3 de escisión de proproteína convertasa de tipo furina consistente en los restos de aminoácidos 742-745, y en donde dicha modificación hace que dicha variante sea resistente a la escisión en dicho sitio 3 de escisión, inhibiendo así la capacidad de los vasos linfáticos para expandirse en, o invadir, el tejido corneal y reducir la linfangiogénesis corneal.

La presente solicitud también describe un método para minimizar o prevenir la linfangiogénesis corneal en un sujeto en riesgo de padecerla, que comprende las etapas de: (a) identificar a dicho sujeto en riesgo de desarrollar la aparición de linfangiogénesis; y (b) administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad efectiva de una variante de Semaforina 3C que tiene al menos un 80%, 90%, 95%, 99% o 100% de identidad de secuencia con el aminoácido indicado en la SEQ ID NO: 1, en donde dicha variante comprende al menos una modificación en el sitio 2 de escisión de proproteína convertasa de tipo furina consistente en los restos de aminoácidos 549-552, y en donde dicha modificación hace que dicha variante sea resistente a la escisión en dicho sitio 2 de escisión y/o en donde dicha variante tiene al menos una modificación en el sitio 3 de escisión de proproteína convertasa de tipo furina consistente en los restos de aminoácidos 742-745, y en donde dicha modificación hace que dicha variante sea resistente a la escisión en dicho sitio 3 de escisión antes de dicho desarrollo, inhibiendo así la capacidad de los vasos linfáticos para formarse o expandirse en, o invadir, el tejido corneal.

Según algunas realizaciones, reducción o prevención de la linfangiogénesis corneal se refiere a inhibición o supresión de al menos un 50%, preferiblemente al menos un 70%, lo más preferiblemente al menos un 90%, de la angiogénesis en un sujeto no tratado con la composición de la invención.

También se describe aquí un método para tratar la diabetes o la EII que comprende las etapas de administrar a un sujeto que lo necesite una composición que comprende una cantidad efectiva de una variante de Semaforina 3C que tiene al menos un 80%, 90%, 95%, 99% o 100% de identidad de secuencia con el aminoácido indicado en la SEQ ID NO: 1, en donde dicha variante comprende al menos una modificación en el sitio 2 de escisión de proproteína convertasa de tipo furina consistente en los restos de aminoácidos 549-552, y en donde dicha modificación hace que dicha variante sea resistente a la escisión en dicho sitio 2 de escisión y/o en donde dicha variante tiene al menos una modificación en el sitio 3 de escisión de proproteína convertasa de tipo furina consistente en los restos de aminoácidos 742-745, y en donde dicha modificación hace que dicha variante sea resistente a la escisión en dicho sitio 3 de escisión.

Según otra realización, la administración sistémica de la composición es mediante inyección. Para administración por inyección, se puede formular la composición en una solución acuosa, por ejemplo en un tampón fisiológicamente compatible, incluyendo, aunque sin limitación, solución de Hank, solución de Ringer o tampón salino fisiológico. Las formulaciones para inyección pueden presentarse en formas unitarias de dosificación, por ejemplo, en ampollas, o en recipientes multidosis con, eventualmente, un conservante añadido.

Las suspensiones acuosas para inyección pueden contener sustancias que aumenten la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilcelulosa sodio, sorbitol o dextrano. Eventualmente, la suspensión puede contener también estabilizadores adecuados o agentes que aumenten la solubilidad de los principios activos, para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas.

Según otra realización, las composiciones formuladas para inyección pueden estar en forma de soluciones, suspensiones, dispersiones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación, tales como agentes suspensores, estabilizadores y/o dispersantes. Como ejemplos no limitativos de disolventes o vehículos lipofílicos adecuados, se incluyen aceites grasos, tales como aceite de sésamo, o ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como oleato de etilo o triglicéridos.

Según otra realización, se ha de administrar la composición intravenosamente, y por lo tanto se formula en una forma adecuada para administración intravenosa. Según otra realización, se ha de administrar la composición intraarterialmente, y por lo tanto se formula en una forma adecuada para administración intraarterial. Según otra realización, se ha de administrar la composición intramuscularmente, y por lo tanto se formula en una forma adecuada para administración intramuscular.

Según algunas realizaciones, se ha de administrar la composición por inyección directa en un tumor. Según algunas realizaciones, se ha de administrar la composición por inyección en el ambiente de un tumor. Según algunas realizaciones, se ha de administrar la composición por inyección en un vaso sanguíneo en el ambiente del tumor. Según algunas realizaciones, se ha de administrar la composición por inyección en un vaso sanguíneo que suministra sangre a un tumor.

Según ciertas realizaciones, la administración sistémica es por una vía enteral. Según otra realización, la administración por una vía enteral es administración oral. Según algunas realizaciones, se formula la composición para administración oral.

Según algunas realizaciones, la administración oral es en forma de cápsulas de gelatina duras o blandas, píldoras, cápsulas, tabletas, incluyendo tabletas recubiertas, grageas, elixires, suspensiones, líquidos, geles, lechadas, jarabes o inhalaciones y sus formas de liberación controlada.

Los vehículos adecuados para administración oral son bien conocidos en la técnica. Se pueden preparar composiciones para uso oral usando un excipiente sólido, triturando eventualmente la mezcla resultante y procesando la mezcla de gránulos, después de añadir agentes auxiliares adecuados según se desee, para obtener tabletas o núcleos de grageas. Como ejemplos no limitativos de excipientes adecuados, se incluyen cargas, tales como azúcares, incluyendo lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol, preparaciones de celulosa, tales como almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma de tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa y carbometilcelulosa sodio, y/o polímeros fisiológicamente aceptables, tales como polivinilpirrolidona (PVP).

Si se desea, se pueden añadir agentes desintegrantes, tales como polivinilpirrolidona entrecruzada, agar o ácido algínico o una sal del mismo, tal como alginato de sodio. Se pueden formular cápsulas y cartuchos de, por ejemplo, gelatina para uso en un dispensador que contengan una mezcla de polvo de la composición y una base de polvo adecuada, tal como lactosa o almidón.

Las formas sólidas de dosificación para administración oral incluyen cápsulas, tabletas, píldoras, polvos y gránulos. En dichas formas sólidas de dosificación, se mezcla la composición con al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable inerte, tal como sacarosa, lactosa o almidón. Dichas formas de dosificación pueden también comprender, como es práctica normal, sustancias adicionales aparte de diluyentes inertes, por ej., agentes lubricantes, tales como estearato de magnesio. En el caso de las cápsulas, tabletas y píldoras, las formas de dosificación pueden también comprender agentes tamponantes. Las tabletas y las píldoras pueden adicionalmente ser preparadas con recubrimientos entéricos.

Las formas líquidas de dosificación para administración oral pueden además contener adyuvantes, tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes y suspensores y agentes edulcorantes, saborizantes y perfumantes. Según algunas realizaciones, se usa además el recubrimiento entérico de la composición para administración oral o bucal. El término "recubrimiento entérico", tal como se usa aquí, se refiere a un recubrimiento que controla la localización de la absorción de la composición en el sistema digestivo. Son ejemplos no limitativos para materiales usados para recubrimiento entérico ácidos grasos, ceras, fibras vegetales o plásticos.

Según algunas realizaciones, la administración es administración tópica. Según algunas realizaciones, se formula la composición para administración tópica.

Según algunas realizaciones, la administración de la composición a un sujeto que lo necesite es por una vía seleccionada del grupo consistente en: intravenosa, intraarterial, transdérmica, subcutánea, por inyección directa en un tejido y por inyección directa en un tumor. Según ciertas realizaciones, la administración puede ser oral.

En algunas realizaciones, la invención hace uso de un complejo de Semaforina 3C que tiene al menos un 80%, 90%, 95%, 99% o 100% de identidad de secuencia con el aminoácido indicado en la SEQ ID NO: 1 o una variante de la misma según las realizaciones en donde se une a restos proteicos (por ej., secuencia de aminoácidos heteróloga) o no proteicos (por ej., PEG), siendo cada uno de los cuales capaz de prolongar la semivida de la composición mientras está en circulación.

Dicha molécula es altamente estable (resistente a la actividad proteolítica in vivo, probablemente debido al bloqueo estérico conferido por el resto no proteico) y puede producirse usando síntesis en fase sólida común. Aún se pueden usar otras técnicas recombinantes, mediante las cuales se somete el producto peptídico recombinante a modificación in vitro (por ej., PEGilación, como se describirá más ampliamente aquí a continuación).

La frase "resto no proteico", tal como se usa aquí, se refiere a una molécula que no incluye aminoácidos unidos en péptido que se une a la Semaforina 3C antes descrita que tiene al menos un 80%, 90%, 95%, 99% o 100% de identidad de secuencia con el aminoácido indicado en la SEQ ID NO: 1 o una variante de la misma. Según algunas realizaciones, el resto no proteico puede ser un polímero o un copolímero (sintético o natural). Como ejemplos no limitativos del resto no proteico, se incluyen polietilenglicol (PEG) o un derivado del mismo, polivinilpirrolidona (PVP), copolímero de éter divinílico y anhídrido maleico (DIVEMA); ácido polisiálico (PSA) y/o poli(estireno co-anhídrido maleico) (SMA). Adicionalmente, se pueden usar complejos que pueden proteger a la Semaforina 3C que tiene al menos un 80%, 90%, 95%, 99% o 100% de identidad de secuencia con el aminoácido indicado en la SEQ ID NO: 1 o una variante de la misma del ambiente y, por lo tanto, mantienen su estabilidad, incluyendo, por ejemplo, liposomas o micelas. Según algunas realizaciones, la Semaforina 3C que tiene al menos un 80%, 90%, 95%, 99% o 100% de identidad de secuencia con el aminoácido indicado en la SEQ ID NO: 1 o una variante de la misma se unen a un resto no proteico, que puede actuar como un agente potenciador de la liberación mantenida. Como agentes ejemplares potenciadores de la liberación mantenida, se incluyen, aunque sin limitación, ácido hialurónico (HA), ácido algínico (AA), metacrilato de polihidroxietilo (Poli-HEMA), glyme y poliisopropilacrilamida.

La unión del componente de la secuencia de aminoácidos Semaforina 3C que tiene al menos un 80%, 90%, 95%, 99% o 100% de identidad de secuencia con el aminoácido indicado en la SEQ ID NO: 1 o una variante de la misma a otros agentes no aminoácidos puede ser por unión covalente o por acomplejación no covalente, por ejemplo, por acomplejación con un polímero hidrofóbico, que puede degradarse o escindirse para producir un compuesto capaz de tener liberación mantenida; atrapando la parte de aminoácido de la Semaforina 3C que tiene al menos un 80%, 90%, 95%, 99% o 100% de identidad de secuencia con el aminoácido indicado en la SEQ ID NO: 1 o una variante de la misma que la comprende en liposomas o micelas para producir un complejo que comprende Semaforina 3C que tiene al menos un 80%, 90%, 95%, 99% o 100% de identidad de secuencia con el aminoácido indicado en la SEQ ID NO: 1 o una variante de la misma. La asociación puede ser por el atrapamiento de la secuencia de aminoácidos en el otro componente (liposoma, micela) o la impregnación de la secuencia de aminoácidos en un polímero para producir el péptido final de la invención.

En algunas realizaciones, el derivado de PEG es ésteres de N-hidroxisuccinimida (NHS) de PEG ácidos carboxílicos, éster succinimidílico de PEG carboximetilado (SCM-PEG), derivados benzotriazolcarbonato de PEG, éteres glicidílicos de PEG, PEG carbonatos de p-nitrofenilo (PEG-Np C, tales como metoxi PEG-NPC), PEG aldehídos, PEG-ortopiridildisulfuro, PEG activados con carbonildiimidazol, PEG-tiol, PEG-maleimida. También se pueden usar PEG-maleimida, PEG-vinilsulfona (VS), PEG-acrilato (AC) o PEG-disulfuro de ortopiridilo.

La seroalbúmina puede también estar implicada en la prolongación de la semivida a través de módulos con la capacidad de interaccionar no covalentemente con albúmina. En estos enfoques, un resto de unión a albúmina se conjuga o se fusiona genéticamente con la proteína terapéutica con actividad de unión a albúmina son conocidos de ciertas bacterias. Por ejemplo, la proteína estreptocócica G contiene varios pequeños dominios de unión a albúmina (ABD) compuestos por aproximadamente 50 restos de aminoácidos (6 kDa). La fusión de un ABD a una proteína da como resultado una semivida fuertemente prolongada (véase Roland E Kontermann, strategies for extended serum half-life of protein therapeutics, Current Opinion in Biotechnology 2011,22: 868-876).

En algunas realizaciones, la variante e IgG y/o cualquier otra proteína que se pueda usar para prolongar la semivida de la variante en el suero se unen por un conector. En algunas realizaciones, el conector es una secuencia de entre 2 y 20 aminoácidos.

La descripción que antecede de las realizaciones específicas revelará así por completo la naturaleza general de la invención.

Hay que entender que la fraseología o terminología aquí empleada tiene fines de descripción y no de limitación. Los medios, materiales y etapas para llevar a cabo diversas funciones descritas pueden adoptar una variedad de formas alternativas sin desviarse de la invención.

Ejemplos

Ejemplo 1: Generación de variantes de Sema3C resistentes a la escisión

Se generó una construcción de polinucleótido codificante de una variante no escindible de Sema 3C en dos etapas:

1. Se realizó una mutagénesis dirigida a sitio sobre una construcción de polinucleótido que comprende el ADNc de Sema 3C como se indica en la SEQ ID NO: 15 con objeto de generar una construcción que comprende ADNc codificante de una variante de Sema 3C mutada en el sitio 2 de escisión FPPC.

2. Se truncó el 3' del ADNc codificante de la variante resultante desde el nucleótido 2215, de tal modo que la construcción de polinucleótido resultante comprendía un ADNc codificante de una variante de Sema 3C que está mutada en el sitio 2 y que tiene una deleción del sitio 3 y el sitio ADAMTS1.

Mutagénesis dirigida a sitio:

Se realizó una mutagénesis dirigida a sitio usando la ADN polimerasa PfuUltraII (Stratagene), según el manual del fabricante. Con objeto de realizar la mutagénesis dirigida a sitio, cada tubo de PCR contenía: 10 ng de plantilla de ADN (ADNc de Sema3C-wt humana, como se indica en la SEQ ID NO: 15, en un plásmido pGEM-T easy), 1,25 ng de cada cebador como se describe más adelante, 5 |il de tampón de reacción de ADN polimerasa PfuUltraII 10X, 2,5 mM de dNTP, 1 |il de ADN polimerasa PfuUltraII y H²O hasta un volumen final de 50 |il. El programa de PCR usado era: 95°C, 5 minutos, 95°C, 30 segundos, 48°C, 1,5 minutos, 72°C, 10 minutos-de nuevo a la etapa 2, x25, 72°C, 5 minutos.

Con objeto de digerir el ADN plantilla metilado, se añadió 1 |il de la enzima de restricción DpnI a cada tubo después de la reacción de PCR. Tras la digestión de restricción, se transformó el ADN resultante en células competentes XL-1 Blue. Con objeto de generar una construcción de ADN que comprende ADNc codificante de una variante de Semaforina 3C que tiene el sitio 2 mutado desde RSRR (como se indica en la SEQ ID NO: 3) hasta KSKK (como se indica en la SEQ ID NO: 13), se realizaron tres tandas aditivas de mutagénesis como sigue:

1. Etapa 1 - mutar el sitio FPPC 2 que tiene la secuencia de aminoácidos RSRR (como se indica en la SEQ ID NO:

3) a un sitio que tiene la secuencia de aminoácidos RSKR (como se indica en la SEQ ID NO: 11), usando los siguientes cebadores y ADNc de Sema3C-wt humana como plantilla:

5'-cebador GGGAAACGGAGGAGCAAAAGACAAGATGTGAGACATGG (SEQ ID NO: 24)

3'-cebador CCATGTCTCACATCTTGTCTTTTGCTCCTCCGTTTCCC (SEQ ID NO: 25)

2. Etapa 2 - mutar el sitio que tiene la secuencia de aminoácidos RSKR (como se indica en la SEQ ID NO: 11) a un sitio que tiene la secuencia de aminoácidos KSKR (como se indica en la SEQ ID NO: 12), usando los siguientes cebadores y la construcción generada en la etapa 1 como plantilla:

5'-cebador

TACCCAACTGGGAAACGGAAGAGCAAAAGACAAGATGTGAGACA TGG (SEQ ID NO: 26)

3'-cebador

CCATGTCTCACATCTTGTCTTTTGCTCTTCCGTTTCCCAGTTGGGTA (SEQ ID NO: 27)

3. Etapa 3 - mutar el sitio que tiene la secuencia de aminoácidos KSKR (como se indica en la SEQ ID NO: 12) a un sitio que tiene la secuencia de aminoácidos KSKK (como se indica en la SEQ ID NO: 13), usando los siguientes cebadores y la construcción generada en la etapa 2 como plantilla:

5'-cebador

GGGAAACGGAAGAGCAAAAAACAAGATGTGAGACATGGAAACCC (SEQ ID NO: 28)

3'-cebador GGGTTTCCATGTCTCACATCTTGTTTTTTGCTCTTCCGTTTCCC (SEQ ID NO: 29)

La construcción de ADN resultante comprendía ADNc codificante de una variante de Sema 3C mutada en el sitio 2, como se indica en la SEQ ID NO: 10.

Truncación del extremo 3' del ADNc de Sema3C (como se indica en la SEQ ID NO: 32) desde la base 2215:

Se sometió además la construcción de ADN generada en la etapa 3 anterior a una reacción de PCR usando los siguientes cebadores:

1. 5'-cebador CGGGATCCACCATGGCATCGGACAATTTG (SEQ ID NO: 30). El sitio de restricción BamHI está subrayado.

2. 3'-cebador CGCTCGAGACTATTGATGAGGGCCTTTAACTT (SEQ ID NO: 31). El sitio de restricción XhoI está subrayado.

Se purificó el producto de PCR resultante en gel de agarosa y se ligó en un plásmido pGEM-T easy. Se cortó el producto del plásmido pGEM-T easy usando las enzimas de restricción BamHI y XhoI y se ligó en un plásmido NSPImyc-6His o un plásmido NSPI-Fc. Los plásmidos resultantes codificaban, respectivamente:

1. UNCL-Sema3C/myc-6His - una variante de Sema 3C no escindible en el sitio 2, que tenía una deleción C-terminal que comprendía el sitio 3 y el sitio ADAMTS1 y que tenía un marcador myc-6His C-terminal. La secuencia de la variante resultante es como se indica en la SEQ ID NO: 9. El ADNc codificante de la variante resultante es como se indica en la SEQ ID NO: 23.

2. UNCL-Sema3C/FC - una variante de Sema 3C no escindible en el sitio 2, que tenía una deleción C-terminal que comprendía el sitio 3 y el sitio ADAMTS1 y que tenía un marcador FC C-terminal. La secuencia de la variante resultante es como se indica en la SEQ ID NO: 8. El ADNc codificante de la variante resultante es como se indica en la SEQ ID NO: 22.

La Fig. 1A representa Sema3C de tipo salvaje (indicada como "Sema3C"), que tiene los tres sitios de escisión FPPC y el dominio básico (DB) intactos. La Fig. 1A además representa UNCL-Sema3C/FC preparada como se ha descrito aquí anteriormente, que tiene el sitio 2 mutado desde RSRr hasta KSKK, que tiene un sitio 3 de deleción de truncación C-terminal y el sitio ADAMTS1 y que tiene un marcador FC C-terminal. Como puede verse en la Fig. 1A, el sitio 1 en UNCL-Sema3C/FC está intacto. La Fig. 1B muestra una tinción de western blot de medios condicionados de células HEK293 transfectadas con un vector de expresión vacío (NC), una construcción codificante de Sema3C de tipo salvaje (Sema3C wt) marcada con FC o una construcción codificante de UNCL-Sema3C/FC (UNCL-Sema3C). Como puede verse en la Fig. 1B, un western blot usando anticuerpos anti-FC mostró que la Sema3C de tipo salvaje se escinde en una forma de 55 kDa, mientras que UNCL-Sema3C/ FC no lo hace.

Ejemplo 2: Comparación del efecto de la Sema3C truncada frente a la de tipo salvaje sobre la formación de vasos in vitro por las células endoteliales vasculares

Con objeto de examinar el efecto de la Semaforina 3C no escindible sobre la angiogénesis, se sembraron células endoteliales derivadas de la vena umbilical humana (HUVEC) en un gel de laminina líquida/colágeno (Matrigel). Se sabe que las HUVEC sembradas en un Matrigel imitan la angiogénesis humana y que desarrollan vasos en el Matrigel. Se dejaron las células sin tratar, tratadas con la parte N-terminal de una variante de Sema3C escindida en el sitio 2 y marcada con FC (denominada Sema3C-p65-FC, como se indica en la SEQ ID NO: 7) o tratadas con Sema3C de tipo salvaje (denominada Sema 3C-WT). Como puede verse en la Fig. 2, las células no tratadas y las células tratadas con Sema3C-p65-FC formaron una red de tubos tras la incubación (Fig. 2 B,C,E,F). Por el contrario, como puede verse en las Fig. 2H-I, las células tratadas con Sema3C de tipo salvaje se contrajeron y no consiguieron formar tubos.

Ejemplo 3: La Semaforina 3C induce contracción de las células endoteliales linfáticas

Con objeto de examinar el efecto de las Semaforinas de la clase 3 sobre la linfangiogénesis, se empleó el ensayo de colapso de LEC (Células Endoteliales Linfáticas), monitorizando la capacidad de las semaforinas para inducir colapso de LEC. Se plaquearon LEC sobre cubreobjetos revestidos de gelatina (diámetro 13 mm, grosor 1 mm) un día antes del experimento, de tal forma que tuvieran una confluencia del 50-70% el día del experimento.

Se inició el experimento mediante una incubación de 25 min de LEC a 37°C con sema3E purificada (1 |ig/ml) o medio condicionado de células HEK293 transfectadas con un vector vacío o una construcción codificante de formas de tipo salvaje de sema3A, sema3B, sema3C, sema3D, sema3F, sema3G o sema6A. Se recogieron los medios condicionados de 6x10® células HEK29348 horas después de la siembra. Para verificar que las semaforinas usadas son activas, se estudiaron usando un ensayo de colapso en células HUVEC (Células Endoteliales de Vena Humana) o células de glioblastoma primario humano (U87, ATCC).

Tras incubación, se lavaron las LEC una vez en PBS y se permeabilizaron en Triton-X-100 al 0,5% diluido en PFA al 4% durante 2 minutos a temperatura ambiente. Se fijaron entonces las células por incubación en PFA al 4% a temperatura ambiente durante 25 minutos y se lavaron después 5 veces en PBS. Se marcaron luego las células con anticuerpo antivinculina y se diluyeron en PBS (1:100) a temperatura ambiente durante 1 hora (20 |il de anticuerpo diluido por cada cubreobjetos). Se lavaron entonces las células 3 veces en PBS durante 5 minutos y se marcaron con la mezcla de Cy3 antirratón (anticuerpo secundario para tinción de vinculina) (1:300) y Faloidina Alexa Flour 488 (1:100, 2 unidades/ml) (para visualizar filamentos de actina), se diluyeron en PBS durante 45 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad (para sema3B, sema3D, sema3G, sema3E, sema6A). O con Cy2 (1:300) y Faloidina 570 (1:100, 2 unidades/ml), para sema3C, sema3F, sema3A y el control de vector vacío. Se montaron luego las células usando medio de montaje Mowiol (Calbiochem) sobre portaobjetos de vidrio y se fotografiaron 24 horas después de montarlas usando un microscopio fluorescente invertido (LSM 700) a un aumento 40X.

Como puede verse en la Fig. 3, aparte de Sema 3F (Fig. 3C), que previamente se había sugerido que inhibía la linfangiogénesis, sólo el medio condicionado con Sema 3C inducía colapso del citoesqueleto de Células Endoteliales Linfáticas incubadas con (Fig. 3B) contrariamente a todas las demás Semaforinas de clase 3 estudiadas o el medio condicionado por células HEK293 transfectadas por un vector de expresión vacío (Fig. 3A). Los resultados sugieren que Sema3C es capaz de inhibir la linfangiogénesis.

Ejemplo 4: Comparación del efecto de Sema3C truncada frente a la de tipo salvaje sobre la contracción de Células Endoteliales Linfáticas (LEC)

Se plaquearon LEC sobre cubreobjetos revestidos de gelatina (diámetro 13 mm, grosor 1 mm) en placas de 6 pocillos, un día antes del experimento, de tal forma que tuvieran una confluencia del 50-70% el día del experimento.

Se incubaron LEC durante 25 min a 37°C con medio condicionado de células HEK293 transfectadas con un vector vacío o una construcción codificante de sema3C de tipo salvaje marcada con FC (denominada Sema3C-WT) o la variante Sema3C-p65 marcada con FC (Sema3C truncada en el sitio 2, denominada Sema3C-p65). Se fotografiaron las células en el momento de añadir los diversos medios condicionados (tiempo cero) y después de 1 hora de incubación (1 hora). Como puede verse en la Fig. 4F, la incubación con Sema3C-p65 no indujo contracción de LEC, de forma similar a la muestra de control (Fig. 4B). La Sema3C de tipo salvaje, sin embargo, era capaz de inducir contracción de LEC (Fig. 4D).

Ejemplo 5: La Semaforina 3C no escindible previene la formación de metástasis en ganglios linfáticos centinelas de tumores inducidos en ratones desnudos

Con objeto de seguir a las células cancerosas en ratones, se infectaron células LM2-4 (derivadas de células de cáncer de mama MDA-MB-231 altamente metastáticas) con lentivirus que dirigían la expresión de la proteína fluorescente rojo tomate. Se infectaron entonces las células con lentivirus vacíos (células de control) o con lentivirus que dirigían la expresión de UNCL-sema3C/Myc, como se describe en el Ejemplo 1 (células UNCL-Sema3C).

Se disociaron las células de control y las células UNCL-Sema3C de cultivos exponenciales con tripsina/EDTA, se lavaron con PBS y se llevaron a una concentración de 4x107 células/ml. Se inoculó cada suspensión celular (2x10®/0,05 ml) en el cojinete graso mamario derecho de ratones NOD hembras de 5 semanas de edad (n=7). Después de 31 días, se sacrificó a los ratones y se resecaron xenoinjertos, se pesaron y se fijaron en formalina. Se extrajeron los ganglios linfáticos centinelas (mesentéricos) y los ganglios linfáticos axiales y se fotografiaron usando un estereomicroscopio fluorescente Olympus SZX9 para detectar células que expresaban rojo tomate que metastatizaban al ganglio linfático. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidados Animales del Technion, Haifa, Israel.

Los tumores que se desarrollaron a partir de células que expresan UNCL-Sema3C/Myc eran aproximadamente un 40% más pequeños que los tumores que se desarrollaron a partir de las células de control. Como puede verse en la Fig. 5M, el peso de un tumor inducido por células UNCL-Sema3C (marcadas como "Sema3C") era significativamente inferior (* = p<0,05) al de un tumor inducido por las células de control (marcadas como "control").

Como puede verse en las imágenes del microscopio fluorescente representadas en la Fig. 5, los ganglios linfáticos centinelas recogidos de un animal que tenía tumores que expresan UNCL-Sema3C/Myc no contenían células que expresaran proteína fluorescente rojo tomate, contrariamente a los ganglios linfáticos centinelas recogidos de los animales de control (Fig. 5K-L y Fig. 5E-H, respectivamente). Las Fig. 5A-D y 5I-J representan imágenes de contraste de fase de los ganglios linfáticos centinelas representados en las Fig. 5E-H y 5K-L, respectivamente.

Ejemplo 6: La Semaforina 3C no escindible reduce la densidad de vasos linfáticos asociados a tumores

Se formaron tumores formados usando células LM2-4 que expresan UNCL-sema3C/Myc o una construcción de control en ratones, como se describe en el Ejemplo 5 (seis ratones en cada grupo). Se extrajeron los tumores como se describe en el Ejemplo 5 y se embebieron en parafina. Con objeto de visualizar los ganglios linfáticos en los tumores, se tiñeron secciones de 5 micras de grosor que cubrían la totalidad de la sección transversal de los tumores para el marcador linfático Receptor Endotelial de Vasos Linfáticos 1 (LYVE-1) usando un anticuerpo policlonal anti-LYVE-1 (Abcam Inc, Cambridge, MA) y el kit EnVision™ basado en peroxidasa (Daco). Se determinó el área teñida en campos microscópicos de igual área que cubría la totalidad de las secciones transversales usando el programa morfométrico ImagePro. Como puede verse en la Fig. 6, el área de los ganglios linfáticos en secciones tomadas de tumores inducidos por células que expresan UNCL-Sema3C/ Myc (marcadas como "UNCL-Sema3C") era significativamente menor (** = p<0,01) que el área en la sección tomada de tumores inducidos por las células de control (marcadas como "Control").

Ejemplo 7: La Semaforina 3C no escindible reduce el peso del tumor formado por células de cáncer de mama MDA-MB-231 que expresan VEGF-C

Se infectaron células de cáncer de mama MDA-MB-231 con lentivirus que expresaban la proteína VEGF-C (Factor de Crecimiento Endotelial Vascular C) humana. Tras la selección, se infectó un clon que expresaba elevados niveles de VEGF-C con lentivirus que llevaban o bien construcciones de control o bien de UNCL-sema3C/myc, como se describe en el Ejemplo 5. Se disociaron las células que expresaban VEGF-C y o bien una construcción de control o bien UNCL-sema3C/myc usando tripsina/EDTA, se lavaron con PBS y se llevaron a una concentración de 1x107 células/ml. Se inoculó cada suspensión celular (1x106/0,1 ml) subcutáneamente en el flanco derecho de un ratón desnudo atímico hembra de 5 semanas de edad (n=6). Después de 41 días, se sacrificó a los ratones y se resecaron los xenoinjertos, se pesaron y se fijaron en formalina. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidados Animales del Technion, Haifa, Israel. Como puede verse en la Fig. 7, el peso de los tumores resultantes de células MDA-MB-231 que expresan VEGF-C y UNCL-Sema3C/Myc (marcadas como "VEGF-C Sema3C") era significativamente inferior (* = p<0,05) al peso de los tumores resultantes de células que expresan VEGF-C y la construcción de control (marcadas como "VEGF-C Control").

Ejemplo 8: Expresión de los receptores de Semaforina de Clase 3 en Células Endoteliales Linfáticas (LEC) cultivadas y Células Endoteliales derivadas de la Vena Umbilical Humana (HUVEC) cultivadas

Con objeto de estudiar la expresión de los receptores de Semaforina de Clase 3, se realizó un análisis de PCR en tiempo real. Primeramente, se analizaron ADNc de LEC y HUVEC mediante un sistema de PCR en Tiempo Real AB StepOne (Applied Biosystems) usando una Mezcla de Ensayo de Expresión Génica TaqMan (Applied Biosystems) específica para PlexinaA1, PlexinaA2, PlexinaA3, PlexinaA4, Plexina D1, NP1 y NP2 (hPlexinaA1 HS00413698, hPlexinaA2 HS00300697, hPlexinaA3 HS00250178, hPlexinaA4 HS00297356, hPlexinaD1 HS00892410, hNP1 HS00826128, hNP2 HS00187290).

Se llevaron a cabo las reacciones de PCR con TaqMan para cada gen diana por duplicado sobre muestras de ADNc. Por cada 10 |il de reacción TaqMan, se mezclaron 2,5 |il (25 ng) de ADNc con 2 |il de agua de grado PCR, 5 |il de Mezcla Maestra de PCR 2xTaqMan Universal (Applied Biosystems) y 0,5 |il de mezcla de cebador. Los parámetros de PCR usados fueron: 50°C durante 2 min, 95°C durante 10 min, 40 ciclos de 95°C durante 15 s y 60°C durante 1 min. Se multiplexó el gen de referencia humano RPLPO (hRPLPO HS99999902), un control endógeno estándar de ensayos de expresión génica Taqman de ABI, con el gen diana para cada plantilla de ADNc como una medida de control de calidad. Se analizaron los datos resultantes mediante el Programa RQ Manager para obtener una cuantificación relativa basada en la ecuación aritmética 2-ACt, en donde ACt es el nivel de señal normalizado en una muestra en relación a la señal RPLPO.

Como puede verse en la Fig. 8, las LEC expresan NP2 pero no NP1 o Plexina-A4. La Fig. 8 muestra además que las LEC expresan muy altos niveles de Plexina-A2 en comparación con HUVEC (marcadas como "HUE" en la Fig. 8).

Ejemplo 9: UNCL-Sema3C-Fc induce colapso del citoesqueleto de células endoteliales linfáticas (LEC)

Con objeto de examinar si la capacidad de la Sema 3C de tipo salvaje para inducir contracción de las LEC se mantiene en la forma resistente a la escisión de Sema3C, se plaquearon LEC sobre cubreobjetos en placas de 12 pocillos. Después de 24 horas de incubación, se incubaron las células durante 40 minutos a 37°C con UNCL-Sema3C-FC purificada (SEQ ID NO: 8), Sema3C-p65-FC purificada (SEQ ID NO: 7), Semaforina 3E purificada o tampón de elución. Se lavaron entonces las células, se fijaron y se tiñeron con Faloidina y un anticuerpo anti-Vinculina, como se ha descrito en el Ejemplo 3. Se visualizaron las células usando un microscopio fluorescente invertido (LSM 700) a un aumento 400X.

Como puede verse en la Fig. 9, UNCL-Sema3C-FC era capaz de inducir colapso del citoesqueleto en LEC (B), mientras que las células incubadas con tampón de elución (A), Semaforina 3E-FC (B) o Sema3C-p65-FC (D) no eran capaces de inducir colapso del citoesqueleto. Este resultado sugiere que la capacidad de la Semaforina 3C de tipo salvaje para inducir colapso de las LEC deriva de la actividad de la forma no escindida de Sema 3C.

Ejemplo 10: FR-sema3C/Fc (también denominada aquí UNCL-Sema3C/Fc-) inhibe fuertemente la proliferación de la transducción de señal inducida por LEC y VEGF-C:

Para caracterizar mejor FR-sema3C, se valoró el efecto de FR-sema3C/Fc purificada sobre la proliferación de HUVEC y LEC. Se sembraron HUVEC (2x104 células/pocillo) o LEC (4x104 células/pocillo) en medio LEC en presencia o ausencia de semaforinas (2 |ig/ml). Se fotografiaron las células después de 72 h. FR-sema3C/Fc inhibía fuertemente la proliferación de LEC y las células eventualmente murieron. Por el contrario, aunque FR-sema3C/Fc inhibía la proliferación de HUVEC, la inhibición no dio lugar a muerte celular y era mucho menos potente que la inhibición de la proliferación de LEC (Fig.10A). Estos resultados se confirmaron por medio de un kit de proliferación WST-1. Se sembraron LEC y HUVEC en placas de 96 pocillos revestidas de fibronectina y se midió el efecto de FR-sema3C/Fc (2 |ig/ml) sobre su proliferación según las instrucciones del vendedor. Se muestra la media de N experimentos independientes (Fig 10B).

VEGF-C promueve la proliferación de LEC y es un potente factor linfangiogénico. Por consiguiente, se valoró el efecto de FR-sema3C/Fc sobre la señalización inducida por VEGF-C en LEC. Se cultivaron LEC hasta una confluencia del 90% en medio de crecimiento y se cambiaron luego a medio LEC carente de factores de crecimiento y que contenía un 0,5% de FCS durante 16 h. Se incubaron entonces las células con vehículo o FR-sema3C/Fc (1 ^g/ml) durante 15 minutos, seguido de una estimulación durante 10 min. con VEGF-C (200 ng/ml). Se determinaron los niveles de fosforilación de VEGFR-3, ERK1/2 y AKT esencialmente como se ha descrito previamente para la fosforilación de ERK1/2. La estimulación mediante FR-sema3C/Fc inhibía la fosforilación inducida por VEGF-C del receptor VEGFR-3 de LEC (Tyr-1230/1231), y también inhibía la fosforilación inducida por VEGF-C de ERK1/2 y Akt (Fig. 10C). Estos resultados sugieren que FR-sema3C puede inhibir la proliferación de LEC por inhibición de la señalización de VEGF-C y que FR-sema3C puede competir con VEGF-C por la unión al correceptor de VEGF-C neuropilina-2 para inhibir la fosforilación de VEGFR-3.

Para determinar la contribución relativa de las diferentes neuropilinas y plexinas de LEC a la transducción de señal de FR-sema3C, se silenció la expresión de estos receptores en LEC (Fig. 10D) y se cuantificaron los efectos sobre la contracción celular inducida por FR-sema3C/Fc usando la máquina de doble placa xCELLigence (RTCA) como se muestra en la Fig. 10E. Se realizó la inhibición de la expresión de plexinas con lentivirus que expresan ARNph por plásmidos de ARNph MISSION que dirigen la expresión de diversos ARNph que se compraron a Sigma Aldrich. Se realizó la producción de los lentivirus en células HEK293FT como se ha descrito previamente (Varshavsky et al., 2008). Se sembraron LEC en placas de 35 mm, se infectaron con los diferentes lentivirus silenciadores durante 16 horas. A las 72 horas de la infección, se usaron las células para experimentos de contracción y se detectó la silenciación de ARN mediante qRT-PCR. Los plásmidos comprados fueron: PlexinaA1 - TRCN0000078734, PlexinaA2 -TRCN0000061499, PlexinaA3 - TRCN0000047678, PlexinaA4 - TRCN0000078683, PlexinaD1 - TRCN0000061548, NP1 - TRCN0000063526, NP2 - TRCN0000063312 (Sigma Aldrich).

La contracción inducida por FR-sema3C/Fc del citoesqueleto de actina de las LEC se inhibía fuerte y significativamente en LEC silenciadas en cuanto a la expresión de neuropilina-2 (P<0,001) o de plexina-D1 (P<0,001). La contracción inducida por FR-sema3C/Fc también se inhibía mediante silenciación de plexina-A1, aunque algo menos potentemente (P<0,001), mientras que la silenciación de neuropilina-1 y de las otras plexinas no tuvo efecto (Fig. 10F).

Ejemplo 11: FR-sema3C (también denominada aquí UNCL-Sema3C) no afecta a la proliferación o migración de células de cáncer de mama LM2-4, pero inhibe fuertemente la progresión de tumores derivados de estas células:

Se derivaron células de cáncer de mama LM2-4 de células de cáncer de mama MDA-MB-231 triple negativas por aislamiento repetido de células metastatizadas desde los pulmones. Se expresó en ellas RFP rojo tomate recombinante y además vector de expresión vacío (control) o FR-sema3C/myc. El medio condicionado de células LM2-4 que expresan FR-sema3C/myc contenía casi exclusivamente FR-sema3C/myc de longitud total (Fig. 11A). FR-sema3C/myc era biológicamente activa e inducía la contracción de HUVEC (Fig. 11B). Sin embargo, FR-sema3C/myc no consiguió inducir contracción de células LM2-4 (Fig. 11B) ni la expresión de FR-sema3C/myc en las células inhibió su proliferación o migración (Fig. 11C y 11D). Las células LM2-4 expresan neuropilina-1 y plexina-D1, pero expresan muy poca neuropilina-2, lo que quizá pueda explicar por qué no responden a FR-sema3C/Fc (Fig. 11E). Se observa que FR-sema3C/myc es idéntica a FR-sema3C/myc6His.

No obstante, incluso aunque la expresión de FR-sema3C/myc en células LM2-4 no cambiara su comportamiento in vitro, la expresión de FR-sema3C/myc inhibía significativamente (P=0,009) el desarrollo de tumores a partir de estas células tras su implantación en los cojinetes grasos mamarios de ratones scid/nod (Fig. 12A). Se lavaron las células LM2-4 que expresaban RFP rojo tomate infectadas con vector lentivírico vacío (control) o con lentivirus que dirigen la expresión de FR-sema3C/myc, se suspendieron en 50 |il de PBS y se inyectaron en los cojinetes grasos mamarios de ratones scid/nod hembras de 6-7 semanas de edad (2x106 células/ratón). Se monitorizó el tamaño de los tumores una vez por semana. A los 30 días, se extirparon los tumores y los ganglios linfáticos y se pesaron. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el comité ético del Technion.

La densidad de vasos linfáticos en los tumores primarios que se desarrollaron a partir de células que expresan FR-sema3C/myc era significativamente menor (aproximadamente -50% menor, P=0,05) en comparación con la densidad de vasos linfáticos en tumores que se desarrollaron a partir de las células de control (Fig. 12B y 12C), lo que indica que FR-sema3C/myc inhibe la linfangiogénesis tumoral. Además, los tumores derivados de células LM2-4 que expresan FR-sema3C/myc también contenían aproximadamente la mitad de la densidad de vasos sanguíneos (P=0,05), como se reveló por la tinción de secciones tumorales con anticuerpos dirigidos contra CD31 (Fig. 12D y 12E) y por análisis FACS (P=0,0018) (Fig. 12F), lo que sugiere que FR-sema3C también funciona como un inhibidor de la angiogénesis tumoral, lo que puede explicar por qué estos tumores eran más pequeños. Notablemente, la densidad de vasos sanguíneos en los tumores de control era aproximadamente 10 veces mayor que la densidad de vasos linfáticos. Los vasos linfáticos en los tumores de control y en los tumores que se desarrollaron a partir de células que expresan FR-sema3C/myc no estaban presentes en regiones necróticas, pero estaban presentes en todas las demás áreas de los tumores. También se determinó la concentración de macrófagos M1 y M2 asociados a tumores usando análisis FACS de suspensiones de una sola célula preparadas a partir de tumores extirpados. Estos experimentos indican que la concentración de la subpoblación de macrófagos M2 positiva a F4-80+/CD206+ se reduce significativamente en aproximadamente un 50% en los tumores que expresan FR-sema3C/myc (P=0,048), mientras que la concentración de la subpoblación M1 F4-80+/CD11-C+ no estaba alterada (Fig. 12G).

Se extirparon los ganglios linfáticos axilar, aórtico lumbar y subilíaco apropiados de ratones que albergaban tumores derivados de células LM2-4 de control y que expresaban FR-sema3C/myc. Se detectaron metástasis en los ganglios linfáticos extirpados usando el sistema de imagen IVIS-200 (Fig. 13A). También se verificó la presencia de metástasis en los ganglios linfáticos tiñendo secciones de ganglios linfáticos con anticuerpos dirigidos contra e1HLA de clase 1 humano (Fig. 13B). Mientras que todos los ratones que albergaban tumores derivados de células de control desarrollaron metástasis en sus ganglios linfáticos, sólo un 26% de los ratones que albergaban tumores derivados de células que expresan FR-sema3C/myc tenían ganglios linfáticos que contenían metástasis detectables (Fig. 13C). Sólo un 19% de los ganglios linfáticos extirpados de ratones que albergaban tumores que expresan FR-sema3C/myc contenían metástasis detectables, mientras que un 70% de los ganglios linfáticos extirpados de ratones que albergaban tumores de control contenían metástasis. Además, el tamaño medio de las metástasis encontradas en los ganglios linfáticos de ratones que albergaban tumores que expresan FR-sema3C/myc era sólo un 15% del tamaño medio de las metástasis encontradas en los ganglios linfáticos derivados de ratones que albergaban tumores de control (P<0,001) (Fig. 13D). Se obtuvieron estos resultados de tres experimentos independientes. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que FR-sema3C inhibe la metástasis a los ganglios linfáticos.

Ejemplo 12: Uso de FR-sema3C (también denominada aquí UNCL-Sema3C) en enfermedades oculares

Una linfangiogénesis anormal es un factor de complicación en enfermedades adicionales. Una angiogénesis y una linfangiogénesis anormales representan una complicación de varias enfermedades oculares inflamatorias en las que nuevos vasos sanguíneos y nuevos vasos linfáticos invaden la córnea normalmente transparente. Se puede inducir esto por irritantes, insuficiencia límbica o complicaciones de procedimientos quirúrgicos, tales como injerto de córnea, y causan pérdida de visión. Estas observaciones sugieren que los inhibidores de la linfangiogénesis podrían ser útiles como fármacos para el tratamiento de dichas enfermedades oculares. Ciertamente, algunos inhibidores que se dirigen al receptor VEGFR-3 que actúa como el receptor para los factores linfangiogénicos VEGF-C y VEGF-D se encuentran actualmente en ensayos clínicos. Por consiguiente, se pretende determinar si se puede usar la inyección de FR-sema3C o la aplicación de colirios que contienen FR-sema3C para tratar dichas enfermedades corneales en modelos preclínicos con animales.

Se inducirán inflamación, neolinfangiogénesis y neoangiogénesis en las córneas de los ojos de ratones negros c57 o los ojos de ratas usando quemadura alcalina o colocación de sutura como se ha descrito. Se aplicará FR-sema3C/Fc como gotas o por inyección con objeto de determinar si inhibe la neoangiogénesis y la neolinfangiogénesis. Se usará vehículo solo como control, y se compararán los resultados con los efectos del inhibidor de VEGF Avastina. Un resultado positivo será una inhibición significativa de la linfangiogénesis y la angiogénesis hacia la córnea.

Tabla de secuencias

La descripción que antecede de las realizaciones específicas revelará por completo la naturaleza general de la invención. Hay que entender que la fraseología o terminología aquí empleada tiene fines de descripción y no de limitación. Los medios, materiales y etapas para llevar a cabo diversas funciones descritas pueden adoptar una variedad de formas alternativas sin desviarse de la invención. Hay que entender que se están realizando más pruebas para establecer los efectos clínicos.

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Una variante de Semaforina 3C para uso en la inhibición de la linfangiogénesis en un sujeto, en donde dicha variante tiene al menos un 80%, 90%, 95%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID NO: 1, en donde dicha variante comprende al menos una modificación en el sitio 2 de escisión de proproteína convertasa de tipo furina consistente en los restos de aminoácidos 549-552, y en donde dicha modificación hace que dicha variante sea resistente a la escisión en dicho sitio 2 de escisión.

2. La variante de Semaforina 3C para uso según la reivindicación 1, en donde dicha modificación es una modificación de al menos un resto de Arginina en dicho sitio 2 de escisión de proproteína convertasa de tipo furina.

3. La variante de Semaforina 3C para uso según la reivindicación 1, en donde dicha variante además comprende al menos una modificación en un dominio básico de dicha variante, teniendo el dominio básico una secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID NO: 5.

4. La variante de Semaforina 3C para uso según la reivindicación 1, en donde dicha al menos una modificación en el sitio 2 de escisión es una modificación como se indica en la SEQ ID NO: 13.

5. La variante de Semaforina 3C para uso según la reivindicación 3, en donde dicha al menos una modificación es una truncación de al menos parte del extremo C de dicha variante como se indica en la SEQ ID NO: 34.

6. La variante de Semaforina 3C para uso según la reivindicación 4, en donde dicha variante además comprende una modificación que es una truncación de al menos parte del extremo C de dicha variante como se indica en la SEQ ID NO: 34.

7. La variante de Semaforina 3C para uso según la reivindicación 1, en donde dicha modificación hace que dicha variante sea resistente a la escisión en dicho sitio de escisión por miembros de las proproteína convertasas de tipo furina.

8. Un complejo que comprende una variante de Semaforina 3C como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-7, y un resto no proteico o proteico, para uso en la inhibición de la linfangiogénesis en un sujeto.

9. El complejo para uso según la reivindicación 8, en donde el resto proteico es un péptido, un polipéptido o una inmunoglobulina o una parte de la misma.

10. El complejo para uso según la reivindicación 9, en donde la inmunoglobulina es una región Fc.

11. Una composición farmacéutica, comprendiendo la composición como principio activo una cantidad terapéuticamente efectiva de Semaforina 3C de tipo salvaje como se indica en la SEQ ID NO: 1 o que tiene al menos un 80%, 90%, 95% o 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID NO: 1 para uso en la inhibición de la linfangiogénesis en un sujeto.