MX2014014290A

MX2014014290A - Anticuerpos anti - ccl2 para el tratamiento de la esclerodermia.

Info

Publication number: MX2014014290A
Application number: MX2014014290A
Authority: MX
Inventors: Paolo G V Martini; Madhusudan Natarajan; Patrick Anthony John Haslett; Albert Barnes Seymour
Original assignee: Shire Human Genetic Therapies
Priority date: 2012-05-22
Filing date: 2013-05-22
Publication date: 2015-05-12
Also published as: CN105854015A; WO2013177264A1; US20150158942A1; BR112014029013A2; AU2013266340A1; US20180179275A1; CN104487091A; HK1208825A1; JP2017193588A; IN2014DN09951A; JP2015520768A; CA2874031A1; EP2852411A1; EP2852411A4; HK1208819A1; EA201491957A1; MX2019006676A; AU2018200834A1; US20160289319A1

Abstract

La presente invención proporciona, entre otras cosas, anticuerpos anti-CCL2 mejorados caracterizados con alta afinidad, potencia, selectividad de tejido y/o especificidad de epítope, y usos de los mismos, en particular, para el tratamiento de esclerodermia y enfermedades, trastornos y afecciones fibróticas y/o inflamatorias relacionadas. En algunas modalidades, la presente invención proporciona métodos y composiciones para el tratamiento de esclerodermia y enfermedades, trastornos y afecciones fibróticas y/o inflamatorias relacionadas basados en un anticuerpo anti-CCL2 que tiene una afinidad de 10-12 M o mayor.

Description

ANTICUERPOS ANTI-CCL2 PARA EL TRATAMIENTO DE LA ESCLERODERMIA REFERENCIA CRUZADA A LAS SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reivindica el beneficio bajo 35 USC § 119(e) de la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos Serie No. 61/650.149, presentada el 22 de mayo de 2012, la aplicación que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad.

LISTADO DE SECUENCIAS La presente especificación hace referencia a un listado de secuencias presentado en forma electrónica como un archivo ASCII.txt llamado "2006685-0330_Sequences_ST25" el 22 de mayo de 2013. El archivo .txt se generó el 14 de mayo de 2013 y es de 2 KB de tamaño.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La esclerosis sistémica (esclerodermia) es un trastorno clínicamente heterogéneo del tejido conectivo, lo que resulta en el endurecimiento y estrechamiento de la piel. Es un tipo autoinmune de la enfermedad caracterizada por la activación inmune, daño vascular y fibrosis. Las principales complicaciones basadas en los órganos que involucran los pulmones, corazón, riñones y tracto gastrointestinal pueden contribuir a la mortalidad y morbilidad. La patogenia es desconocida.

La característica más comúnmente asociada con la esclerodermia es la fibrosis - una acumulación de colágeno en la piel y órganos. La acumulación de colágeno contribuye a los síntomas de la enfermedad, incluyendo la pérdida de cabello, endurecimiento y estrechamiento de la piel, decoloración de la piel, dolor en las articulaciones, rigidez de los dedos y articulaciones, problemas del tracto digestivo y complicaciones para respirar (tos seca, dificultad para respirar, sibilancias). La esclerodermia puede clasificarse en dos grandes subgrupos: esclerodermia cutánea limitada y esclerodermia cutánea difusa. En la esclerodermia cutánea limitada, la fibrosis se limita principalmente a las manos, brazos y cara. La esclerodermia difusa cutánea es un trastorno rápidamente progresivo que afecta a grandes zonas de la piel y compromete uno o más órganos internos. Los pacientes con esclerodermia cutánea limitada tienen un pronóstico a largo plazo relativamente mejor que los pacientes con esclerodermia cutánea difusa. La esclerodermia sistémica generalizada puede dañar el corazón, riñones, pulmones o tracto gastrointestinal, lo que puede causar la muerte. La fibrosis pulmonar es la causa más común de muerte en pacientes con esclerodermia.

Por lo tanto, la esclerodermia es una enfermedad extremadamente debilitante con repercusiones potencialmente fatales. Hay aproximadamente 50,000 pacientes en los EE.UU.. La proporción de pacientes femeninos a pacientes masculinos es aproximadamente 4:1. Los métodos de tratamiento actuales se basan únicamente en el tratamiento sintomático y manejo de las complicaciones que surgen a través de la evolución de la enfermedad (por ejemplo, corticosteroides, NSAID, y medicamentos inmunosupresores como Metotrexato y Cytoxan). No existe un tratamiento que muestre revertir o detener la progresión de la enfermedad. Por lo tanto, existe una alta necesidad médica no satisfecha de un tratamiento eficaz de la esclerodermia.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona métodos mejorados y composiciones para el tratamiento eficaz de la esclerodermia, en particular, con base en anticuerpos o proteínas de unión mejoradas que pueden unirse específicamente a ligando 2 de quimiocina C-C ("CCL2") con alta afinidad, potencia, y/o diversidad de epítope para lograr biodistribución robusta y/o especificidad de tejido. El CCL2 es conocido por ser un objetivo validado para la esclerodermia Varios estudios han demostrado que los fibroblastos de esclerodermia exhiben aumento de la expresión constitutiva de Proteína y ARNm de CCL2. En secciones de piel con esclerodermia, se detectó la expresión de CCL2 en fibroblastos, queratinocitos, y células mononucleares, mientras que fue indetectable en la piel normal (Galindo et al., Arthritis Rheum. 2001 Jun; 44(6):1382-6; Distler et al., Arthritis Rheum. 2001 Nov; 44(11):2665-78; Lioyd et al., Exp Med. 1997 Apr 7;185(7):1371-80; Yamamoto et al., J Dermatol Sci . 2001 Jun; 26(2):133-9; Dentón et al.; Trends Immunol . 2005 Nov; 26(11):596-602. Epub 2005 Sep 15.). Sin embargo, antes de la presente invención, no se ha desarrollado un tratamiento eficaz para la esclerodermia con base en los anticuerpos anti-CCL2. Los presentes inventores observan que los altos niveles de CCL2 en plasmas secuestran los anticuerpos anti-CCL2 inyectados por vía intravenosa, lo que resulta en el direccionamiento ineficaz de CCL2 en tejidos enfermos. Para resolver este problema, los presentes inventores contemplan el uso de anticuerpos anti-CCL2 con alta afinidad administrados en una cantidad suficiente para superar los altos niveles de CCL2 en suero que conducen al direccionamiento eficaz de CCL2 en tejidos enfermos deseados. En particular, los inventores contemplan un anticuerpo monoclonal anti-CCL2 "mejor en su clase" caracterizado con una alta afinidad de unión, selectividad de tejido, especificidad de epítope y/o larga vida media. Tales anticuerpos de la invención, una vez administrados in vivo, dan lugar a la biodistribución y biodisponibilidad deseadas de tal manera que se une y bloquea la señalización de CCL2 en los tejidos objetivo reduciendo la infiltración, inflamación y fibrosis, entre otros síntomas o características de la esclerodermia.

Por lo tanto, en un aspecto, la presente invención proporciona métodos de tratamiento de la esclerodermia que comprenden administrar a un individuo que sufre de o es susceptible a la esclerodermia, una cantidad eficaz de anticuerpo anti-CCL2, o fragmento del mismo, de tal manera que al menos un síntoma o característica de la esclerodermia en un tejido objetivo se reduce en intensidad, severidad o frecuencia, o se ha retrasado su inicio.

En algunas modalidades, al menos un síntoma o característica de la esclerodermia se selecciona del daño de las células endoteliales, proliferación de capas de lámina basal, infiltración de células mononucleares perivasculares, fibrosis, alteración de la arquitectura de órganos viscerales, rarefacción de los vasos sanguíneos, hipoxia, y combinación de los mismos.

En algunas modalidades, el tejido objetivo se selecciona del grupo que consiste de la piel, vasos sanguíneos, pulmón, corazón, riñón, tracto gastrointestinal (incluyendo el hígado), sistema musculoesquelético y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, el tejido objetivo es el pulmón. En algunas modalidades, el tejido objetivo es el corazón.

En algunas modalidades, el individuo está sufriendo de o es susceptible a la esclerodermia cutánea limitada. En algunas modalidades, el individuo está sufriendo o es susceptible a la esclerodermia cutánea difusa.

En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CCL2, o fragmento del mismo, se administra parenteralmente. En algunas modalidades, la administración parenteral se selecciona de la administración intravenosa, intradérmica, inhalación, transdérmica (tópica), subcutánea, y/o transmucosal. En algunas modalidades, la administración parenteral es la administración intravenosa.

En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CCL2, o fragmento del mismo, se administra por vía oral.

En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CCL2, o fragmento del mismo, se administra cada dos meses, mensual, cada tres semanas, quincenal, semanal, diario, o a intervalos variables.

En otro aspecto, la presente invención proporciona el uso de un anticuerpo anti-CCL2, o fragmento del mismo, como se describe en la presente en la manufactura de un medicamento para el tratamiento de la esclerodermia, en donde el tratamiento comprende administrar a un individuo que sufre de o es susceptible a la esclerodermia, una cantidad eficaz del anticuerpo anti-CCL2, o fragmento del mismo, de tal manera que al menos un síntoma o característica de la esclerodermia en un tejido objetivo se reduce en intensidad, severidad o frecuencia, o se ha retrasado su inicio.

En algunas modalidades, la presente invención proporciona el uso de un anticuerpo anti-CCL2, o fragmento del mismo en la manufactura de un medicamento para el tratamiento de la esclerodermia, como se describe en la presente, en donde el anticuerpo anti-CCL2, o fragmento del mismo, se caracteriza por la afinidad de unión de más fuerte y/o mayor que 10~12 M (por ejemplo, mayor que 0.5 X 1012 M, lo13 M, 0.5 X 1CT13 M, 1014 M, 0.5 X 1014 M, o 1CT15 M).

En algunas modalidades, un anticuerpo anti-CCL2, o fragmento del mismo, de acuerdo con la invención se selecciona del grupo que consiste de IgG intacta, F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab, scFv, diacuerpos, triacuerpos y tetracuerpos.

En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CCL2, o fragmento del mismo, es un anticuerpo monoclonal, opcionalmente el anticuerpo anti-CCL2, o fragmento del mismo es un anticuerpo monoclonal humanizado, opcionalmente el anticuerpo anti-CCL2, o fragmento del mismo es un anticuerpo humano.

En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos de tratamiento de la esclerodermia que comprende administrar a un individuo que sufre de o es susceptible a la esclerodermia, un anticuerpo anti-CCL2, o fragmento del mismo, que tiene una afinidad de unión más fuerte y/o mayor que 1012 M (por ejemplo, mayor que 0.5 X 1012 M, 1013 M, 0.5 X ÍCT13 M, 1014 M, 0.5 X 1014 M, o 1015 M).

En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CCL2, o fragmento del mismo, se administra a una dosis terapéuticamente eficaz y un intervalo de administración de tal manera que el anticuerpo anti-CCL2, o fragmento del mismo, se distribuye a uno o más tejidos objetivo seleccionados del grupo que consiste de la piel, vasos sanguíneos, pulmón, corazón, riñón, tracto gastrointestinal (incluyendo el hígado), sistema musculoesquelético y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CCL2, o fragmento del mismo, se administra a una dosis terapéuticamente eficaz y un intervalo de administración de tal manera que el anticuerpo anti-CCL2, o fragmento del mismo, se distribuye a los pulmones y/o el corazón.

En algunas modalidades, el intervalo de administración se selecciona de cada dos meses, mensual, cada tres semanas, quincenal, semanal, diario, o a intervalos variables.

En todavía otro aspecto, la presente invención proporciona métodos de tratamiento de esclerodermia que comprenden administrar a un individuo que sufre de o es susceptible a la esclerodermia, un anticuerpo anti-CCL2, o fragmento del mismo, a una dosis terapéuticamente eficaz y un intervalo de administración de tal manera que el anticuerpo anti-CCL2, o fragmento del mismo, se distribuye al pulmón y/o el corazón. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CCL2, o fragmento del mismo, se distribuye adicionalmente a la piel, riñón, y/o hígado.

En aún otro aspecto, la presente invención proporciona métodos como se describe en diversas modalidades anteriormente, en donde el anticuerpo anti-CCL2, o fragmento del mismo, se selecciona del grupo que consiste de IgG intacta, F(ab')2 F(ab)2, Fab', Fab, scFv, diacuerpos, triacuerpos y tetracuerpos.

En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CCL2, o fragmento del mismo, es un anticuerpo monoclonal. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CCL2, o fragmento del mismo, es un anticuerpo monoclonal humanizado. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CCL2, o fragmento del mismo, es un anticuerpo humano.

Entre otras cosas, la presente invención proporciona anticuerpos anti-CCL2 con alta afinidad. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un anticuerpo anti-CCL2, o fragmento del mismo, que tiene una afinidad de unión más fuerte y/o mayor que 1012 M (por ejemplo, mayor que 0.5 X 1012 M, 1013 M, 0.5 X 1013 M, 1014 M, 0.5 X 1q"14 M, o 1015 M).

En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CCL2, o fragmento del mismo, es un anticuerpo monoclonal.

En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CCL2, o fragmento del mismo, es un anticuerpo monoclonal humanizado.

En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CCL2, o fragmento del mismo, es un anticuerpo humano.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo anti-CCL2, o fragmento del mismo, como se describe en la presente para uso en un método de tratamiento de la esclerodermia que comprende una etapa de administrar el anticuerpo anti-CCL2, o fragmento del mismo, a un sujeto, donde el anticuerpo anti-CCL2, o fragmento del mismo, se caracteriza por una afinidad de unión más fuerte y/o mayor que 10~12 M (por ejemplo, mayor que 0.5 X 10~12M, 1013 M, 0.5 X 1013 M, 1014 M, 0.5 X 1014 M, o 1015 M).

En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CCL2, o fragmento del mismo, es un anticuerpo monoclonal, opcionalmente el anticuerpo anti-CCL2, o fragmento del mismo es un anticuerpo monoclonal humanizado, opcionalmente el anticuerpo anti-CCL2, o fragmento del mismo es un anticuerpo humano .

En todavía otro aspecto, la presente invención proporciona varias composiciones y kits que contienen un anticuerpo anti-CCL2 descrito en la presente.

Otras características, objetos y ventajas de la presente invención son evidentes en la descripción detallada, figuras y reivindicaciones que siguen. Se debe entender, sin embargo, que la descripción detallada, las figuras, y las reivindicaciones, aunque indican modalidades de la presente invención, se dan a modo de ilustración, no de limitación. Varios cambios y modificaciones dentro del alcance de la invención serán evidentes para los expertos en la téenica.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las figuras son sólo para fines ilustrativos, no de limitación.

La Figura 1 ilustra un diagrama ejemplar que representa la puntuación de la piel de Rodnan modificada. Se indican las ubicaciones en el cuerpo, donde se evalúa la fibrosis de la piel.

La Figura 2 representa una gráfica ejemplar que gráfica la concentración en suero y tejido de CCL2 despues del equilibrio.

La Figura 3 ilustra un diagrama ejemplar que representa el direccionamiento de CCL2 en el plasma y en el tejido enfermo.

DEFINICIONES A fin de que la presente invención sea entendida más fácilmente, ciertos términos se definen primero. Las definiciones adicionales para los siguientes términos y otros términos se establecen en toda la especificación.

Afinidad: Como es conocido en la téenica, "afinidad" es una medida de la rigidez con la que un ligando particular se une a (por ejemplo, se asocia no covalentemente con) y/o la velocidad o frecuencia con la que se disocia de, su socio. Como es conocido en la técnica, cualquiera de una variedad de tecnologías puede ser utilizada para determinar la afinidad. En muchas modalidades, la afinidad representa una medida de la unión específica.

Afinidad madurada (o anticuerpo de afinidad madurada) : Como se usa en la presente, se refiere a un anticuerpo con una o más alteraciones en una o más CDR del mismo que dan como resultado una mejora en la afinidad del anticuerpo para el antígeno, en comparación con un anticuerpo parental que no posee las alteraciones. En algunas modalidades, los anticuerpos de afinidad madurada tendrán afinidades nanomolares o incluso picomolares para un antígeno objetivo. Los anticuerpos de afinidad madurada se pueden producir por cualquiera de una variedad de procedimientos conocidos en la téenica. Marks et al. Biotechnology 10: 779-783 (1992) describe la maduración de afinidad por Transposición de dominio VH y VL. La mutagénesis aleatoria de CDR y/o residuos de armazón se describe por: Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol.155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); and Hawkins et al, J. Mol. Biol.226:889-896 (1992).

Anticuerpo: Como se usa en la presente, el término "anticuerpo" se refiere a un polipéptido que consiste de uno o más polipéptidos sustancialmente codificados por genes de inmunoglobulina o fragmentos de genes de inmunoglobulina. Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los genes de región constante kappa, lambda, alfa, gamma, delta, epsilón y mu, así como genes de región variable de inmunoglobulina miríada. Las cadenas ligeras se clasifican típicamente como kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican típicamente como gamma, mu, alfa, delta, o epsilón, que a su vez definen las clases de inmunoglobulina, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Una unidad estructural de inmunoglobulina (anticuerpo) típica se sabe que comprende un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto de dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kD) y una "pesada" (aproximadamente 50-70 kD). El extremo N-terminal de cada cadena define una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsables del reconocimiento del antígeno. Los términos "cadena ligera variable" (VL) y "cadena pesada variable" (VH) se refieren a estas cadenas ligera y pesada respectivamente. Un anticuerpo puede ser específico para un antígeno particular. El anticuerpo o su antígeno pueden ser un analito o una socio de unión. Los anticuerpos existen como inmunoglobulinas intactas o como un número de fragmentos bien caracterizados producidos por digestión con diversas peptidasas. Así, por ejemplo, la pepsina digiere un anticuerpo por debajo de los enlaces de disulfuro en la región bisagra para producir F(ab)'2, un dímero de Fab que en sí mismo es una cadena ligera unida a VH-CHI por un enlace de disulfuro. El F(ab)'2 puede reducirse en condiciones suaves para romper el enlace de disulfuro en la región bisagra convirtiendo de este modo el dímero de (Fab')2 en un monómero de Fab'. El monómero de Fab' es esencialmente un Fab con parte de la región bisagra (véase, Fundamental Immunology, W. E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993), para una descripción más detallada de otros fragmentos de anticuerpos). Mientras que diversos fragmentos de anticuerpo se definen en términos de la digestión de un anticuerpo intacto, un experto ordinario en la téenica apreciará que tales fragmentos de Fab' pueden sintetizarse de novo ya sea químicamente o utilizando la metodología del ADN recombinante. Así, el término "anticuerpo", como se usa en la presente también incluye fragmentos de anticuerpos producidos ya sea por la modificación de anticuerpos enteros o sintetizados de novo usando metodologías de ADN recombinante. En algunas modalidades, los anticuerpos son anticuerpos de cadena única, tales como anticuerpos Fv de cadena única (scFv) en los que una cadena pesada variable y una ligera variable se unen conjuntamente (directamente o a través de un enlazante peptídico) para formar un polipéptido continuo. Un polipéptido Fv de cadena única ("scFv") es un heterodímero de VH::VL enlazado covalentemente que puede ser expresado a partir de un ácido nucleico que incluye secuencias codificantes de VH y VL ya sea unidas directamente o unidas por un enlazante que codifica el péptido. (Véase, por ejemplo, Huston, et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883, el contenido completo de la cual se incorpora en la presente como referencia) Un número de estructuras existen para la conversión de las cadenas de polipéptido ligera y pesada naturalmente agregadas, pero químicamente separadas de una región V del anticuerpo en una molécula de scFv que se pliegan en una estructura tridimensional sustancialmente similar a la estructura de un sitio de unión al antígeno. Véase, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos Nos. 5,091,513 y 5,132,405 y 4,956,778.

Aproximadamente: Como se usa en la presente, el término "aproximadamente" o "alrededor de", como se aplica a uno o más valores de interés, se refiere a un valor que es similar a un valor de referencia establecido. En ciertas modalidades, el término "aproximadamente" o "alrededor de" se refiere a un intervalo de valores que caen dentro de 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12 %, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, o menos en cualquier dirección (mayor que o menor que) del valor de referencia establecido a menos que se indique lo contrario o de otra manera sea evidente por el contexto (excepto cuando tal número excedería 100% de un valor posible).

Agente de unión : Como se usa en la presente, el término "agente de unión" incluye cualquier agente de origen natural, sintético o modificado genéticamente, tal como proteína, que se une a un antígeno o una proteína o péptido objetivo. "Agente de unión" también se refiere como "proteína de unión" . Los agentes de unión pueden derivarse de anticuerpos de origen natural o modificados sintéticamente. Una proteína o agente de unión puede funcionar de manera similar a un anticuerpo mediante la unión a un antígeno específico para formar un complejo y provocar una respuesta biológica (por ejemplo, agonizar o antagonizar una actividad biológica particular). Los agentes o proteínas de unión pueden incluir fragmentos aislados, fragmentos "Fv" que consisten de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo, moléculas de polipéptido de cadena única recombinantes en las que las regiones variables de cadena ligera y pesada están conectadas por un enlazante peptídico ("proteínas de scFv"), y unidades de reconocimiento mínimas que consisten de los residuos de aminoácidos que imitan la región hipervariable. El término agente de unión como se usa en la presente también puede incluir fragmentos de anticuerpo producidos por la modificación de anticuerpos enteros o sintetizados de novo usando metodologías de ADN recombinante. En algunas modalidades, los anticuerpos son anticuerpos de cadena única, tales como anticuerpos Fv de cadena única (scFv) en los que una cadena pesada variable y una cadena ligera variable se unen conjuntamente (directamente o a través de un enlazante peptídico) para formar un polipéptido continuo. Un polipéptido de Fv de cadena única ("scFv") es un heterodímero de VH::VL enlazado covalentemente que puede ser expresado a partir de un ácido nucleico que incluye secuencias codificantes de VH y VL ya sea sea unidas directamente o unidas por un enlazante que codifica el péptido. (Véase, por ejemplo, Huston, et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883, el contenido completo de la cual se incorpora en la presente como referencia). Un número de estructuras existe para la conversión de las cadenas de polipéptido ligera y pesada naturalmente agregadas, pero químicamente separadas de una región V del anticuerpo en una molécula de scFv que se pliega en una estructura tridimensional sustancialmente similar a la estructura de un sitio de unión al antígeno. Véase, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos Nos. 5,091,513 y 5,132,405 y 4,956,778. En algunas modalidades, el término agente de unión como se usa en la presente también puede incluir anticuerpo. Véase la definición de anticuerpo.

CDR: Como se usa en la presente, se refiere a una región determinante de complementariedad dentro de una región variable de anticuerpo. Hay tres CDR en cada una de las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera, que se designan CDR1, CDR2 y CDR3, para cada una de las regiones variables. Un "conjunto de CDR" o "conjunto de CDR" se refiere a un grupo de tres o seis CDR que se presentan ya sea en una región variable única capaz de unirse al antígeno o las CDR de las regiones variables de cadena pesada y ligera afines capaces de unirse al antígeno. Los límites de CDR se han definido de manera diferente dependiendo del sistema, de los cuales varios son conocidos en la téenica (por ejemplo, Kabat, Chothia, etc.).

Compuesto y Agente : Los términos "compuesto" y "agente" se usan en la presente de forma intercambiable. Se refieren a cualquier molécula de origen natural o de origen no natural (es decir, sintética o recombinante), tal como una macromolécula biológica (por ejemplo, ácido nucleico, polipéptido o proteína), molécula orgánica o inorgánica, o un extracto hecho de materiales biológicos tales como células o tejidos de bacterias, plantas, hongos o animales (particularmente mamíferos, incluyendo humanos). El compuesto puede ser una molécula única o una mezcla o complejo de al menos dos moléculas.

Control : Como se usa en la presente, el término "control" tiene su significado entendido en la téenica de ser un estándar contra el cual se comparan los resultados. Típicamente, los controles se utilizan para aumentar la integridad en los experimentos mediante el aislamiento de las variables con el fin de llegar a una conclusión acerca de tales variables. En algunas modalidades, un control es una reacción o ensayo que se realiza simultáneamente con una reacción de prueba o ensayo para proporcionar un comparador. En un experimento, se aplica la "prueba" (es decir, la variable que se prueba). En el segundo experimento, el "control", no se aplica la variable que se prueba. En algunas modalidades, un control es un control histórico (es decir, una prueba o ensayo realizado previamente, o una cantidad o resultado que se conoce previamente). En algunas modalidades, un control es o comprende un registro impreso o guardado de otra manera. Un control puede ser un control positivo o un control negativo.

Regimen de dosificación: Un "régimen de dosificación" (o "régimen terapéutico"), como ese término se usa en la presente, es un conjunto de dosis unitarias (típicamente más de uno) que se administran de forma individual a un sujeto, típicamente separadas por períodos de tiempo. En algunas modalidades, un agente terapéutico dado tiene un régimen de dosificación recomendada, que puede implicar una o más dosis. En algunas modalidades, un régimen de dosificación comprende una pluralidad de dosis cada una de las cuales está separada una de otro por un período de tiempo de la misma longitud; en algunas modalidades, un régimen de dosificación comprende una pluralidad de dosis y al menos dos períodos de tiempo diferentes que separan las dosis individuales.

Diagnóstico: Como se usa en la presente, el término "diagnóstico" se refiere a un proceso destinado a determinar si un individuo está afectado por una enfermedad o dolencia. En el contexto de la presente invención, "diagnóstico de esclerodermia" se refiere a un proceso dirigido a uno o más de: determinar si un individuo está afligido con esclerodermia, identificar un subtipo de esclerodermia (es decir, esclerodermia cutánea difusa o limitada), y determinar la gravedad de la enfermedad.

Cantidad eficaz: Como se usa en la presente, el término "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad de un compuesto o agente que es suficiente para cumplir con su propósito previsto. En el contexto de la presente invención, el propósito puede ser, por ejemplo: modular la causa o los síntomas de la esclerodermia; y/o retrasar o prevenir el comienzo de la esclerodermia; y/o ralentizar o detener la progresión, agravación, o deterioro de los síntomas de la esclerodermia; y/o aliviar uno o más síntomas asociados con esclerodermia; y/o lograr el alivio de los síntomas de la esclerodermia, y/o curar la esclerodermia.

Armazón o Región de armazón: Como se usa en la presente, se refiere a las secuencias de una región variable menos las CDR. Debido a que una secuencia de CDR puede ser determinada por diferentes sistemas, así mismo una secuencia de armazón está sujeta a interpretaciones correspondientemente diferentes. Las seis CDR dividen las regiones de armazón de las cadenas pesadas y ligeras en cuatro sub-regiones (FR1, FR2, FR3 y FR4) en cada cadena, en la que CDR1 se coloca entre FR1 y FR2, CDR2 entre FR2 y FR3, y CDR3 entre FR3 y FR4 . Sin precisar las subregiones particulares como FR1, FR2, FR3 o FR4, una región de armazón, como se refiere por otros, representa las FR combinadas dentro de la región variable de una cadena única de inmunoglobulina de origen natural. Como se usa en la presente, una FR representa una de las cuatro sub-regiones, FR1, por ejemplo, representa la primera región de armazón más cercana al extremo amino terminal de la región variable y 5' con respecto a CDR1, y FR representa dos o más de las sub regiones que constituyen una región de armazón.

Anticuerpo humano: Como se usa en la presente, se pretende que incluya anticuerpos que tienen regiones variables y constantes generadas (o ensambladas) de secuencias de inmunoglobulina humana. En algunas modalidades, los anticuerpos (o componentes de anticuerpo) pueden ser considerados como "humanos" a pesar de que sus secuencias de aminoácidos incluyen residuos o elementos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana (por ejemplo, incluyen variaciones de la secuencia, por ejemplo, que pueden (originalmente) haber sido introducidas mediante mutagénesis aleatoria o específica de sitio in vitro o por mutación somática in vivo), por ejemplo en una o más CDR y en particular CDR3.

Humanizado: Como es conocido en la téenica, el término "humanizado" se usa comúnmente para referirse a anticuerpos (o componentes de anticuerpo) cuya secuencia de aminoácidos incluye secuencias de la región de VH y VL de un anticuerpo de referencia producido en una especie no humana (por ejemplo, un ratón), pero también incluye modificaciones en las secuencias en relación con el anticuerpo de referencia propuesto para volverlos más "similares a humanos", es decir, más similares a las secuencias variables de línea germinal humana. En algunas modalidades, un anticuerpo (o componente de anticuerpo) "humanizado" es uno que se une inmunoespecíficamente a un antígeno de interés y que tiene una región de armazón (FR) que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácidos que la de un anticuerpo humano, y una región determinante de complementariedad (CDR) que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácidos como la de un anticuerpo no humano. Un anticuerpo humanizado comprende sustancialmente la totalidad de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables (Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, Fv) en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana (es decir, inmunoglobulina donante) y todas o sustancialmente todas las regiones de armazón son las de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. En algunas modalidades, un anticuerpo humanizado también comprende al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe), típicamente la de una región constante de inmunoglobulina humana. En algunas modalidades, un anticuerpo humanizado contiene tanto la cadena ligera, así como al menos el dominio variable de una cadena pesada. El anticuerpo también puede incluir una región CHi, bisagra, CH2, CH3, y, opcionalmente, CH4 de una región constante de cadena pesada. En algunas modalidades, un anticuerpo humanizado sólo contiene una región de VL humanizada. En algunas modalidades, un anticuerpo humanizado sólo contiene una región de VH humanizada. En algunas ciertas modalidades, un anticuerpo humanizado contiene regiones de VH y VL humanizadas.

Mejorar, aumentar o reducir: Como se usa en la presente, los términos "mejorar", "aumentar" o "reducir" o equivalentes gramaticales, indican valores que están en relación con una medición de valor basal, tal como una medición en el mismo individuo antes de la iniciación del tratamiento descrito en la presente, o una medición en un individuo de control (o múltiples individuos de control) en la ausencia del tratamiento descrito en la presente. Un "individuo de control" es un individuo afectado con el mismo tipo y aproximadamente la misma severidad de la esclerodermia como el individuo que está siendo tratado, que es aproximadamente de la misma edad que el individuo que está siendo tratado (para asegurarse de que las etapas de la enfermedad en el individuo tratado y los individuos de control son comparables).

Ki t : Como se usa en la presente, el término "kit" se refiere a cualquier sistema de suministro para suministrar materiales. Tales sistemas de suministro pueden incluir sistemas que permitan el almacenamiento, transporte o suministro de diversos reactivos de diagnóstico o terapéuticos (por ejemplo, oligonucleótidos, enzimas, etc. en los recipientes apropiados) y/o materiales de soporte (por ejemplo, amortiguadores, instrucciones por escrito para realizar el ensayo etc.) de una ubicación a otra. Por ejemplo, los kits incluyen uno o más recintos (por ejemplo, cajas) que contienen los reactivos de reacción pertinentes y/o materiales de soporte. Como se usa en la presente, el término "kit fragmentado" se refiere a sistemas de suministro que comprenden dos o más recipientes separados que cada uno contiene una subporción de los componentes totales del kit. Los recipientes pueden ser administrados al receptor propuesto juntos o por separado. Por ejemplo, un primer recipiente puede contener una enzima para uso en un ensayo, mientras que un segundo recipiente contiene oligonucleótidos. El término "kit fragmentada" pretende abarcar los kits que contienen reactivos específicos de analito (ASR) regulados bajo la Sección 520(e) de la Lcy Federal de Alimentos, Fármacos y Cosméticos, pero no se limita a estos. De hecho, cualquier sistema de suministro que comprende dos o más recipientes separados que cada uno contiene un subporción de los componentes totales del kit se incluyen en el término "kit fragmentado." En contraste, un "kit combinado" se refiere a un sistema de suministro que contiene todos los componentes en un recipiente único (por ejemplo, en una caja única que aloja uno de los componentes deseados). El término "kit" incluye tanto los kits fragmentados como combinados.

Normal : Como se usa en la presente, el término "normal", cuando se utiliza para modificar el término "individuo" o "sujeto" se refiere a un individuo o grupo de individuos que no tienen una enfermedad o afección particular, y tampoco es un portador de la enfermedad o afección. El término "normal" también se usa en la presente para calificar a un espécimen o muestra biológica aislada de un individuo o sujeto normal o de tipo salvaje, por ejemplo, una "muestra biológica normal. " Ácido Nucleico : Como se usa en la presente, el término "ácido nucleico" se refiere a un oligonucleótido, nucleótido o polinucleótido, y fragmentos o porciones de los mismos, y a ADN o ARN de origen genómico o sintético que puede ser de hebra única o doble, y representa la hebra sentido o antisentido.

Molécula de Ácido Nucleico: Los términos "molécula de ácido nucleico" y "polinucleótido" se usan en la presente de forma intercambiable. Se refieren a un polímero de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos en forma de hebra única o doble, y a menos que se indique lo contrario, abarcan análogos conocidos de nucleótidos naturales que pueden funcionar de una manera similar a los nucleótidos de origen natural. Los términos abarcan estructuras similares al ácido nucleico con esqueletos sintéticos, así como productos de amplificación.

Proteína : En general, una "proteína" es un polipéptido (es decir, una cadena de al menos dos aminoácidos enlazados entre sí por enlaces peptídicos). Las proteínas pueden incluyen porciones distintas de aminoácidos (por ejemplo, puede ser glicoproteínas) y/o pueden ser procesadas o modificadas de otra manera. Los expertos en la téenica apreciarán que una "proteína" puede ser una cadena de polipéptido completa como la producida por una célula (con o sin una secuencia señal), o puede ser una parte funcional de la misma. Los expertos apreciarán además que una proteína puede a veces incluir más de una cadena de polipéptidos, por ejemplo enlazados por uno o más enlaces de disulfuro o asociados por otros medios.

Muestra : Como se usa en la presente, el término "muestra" abarca cualquier muestra obtenida de una fuente biológica. Los términos "muestra biológica" y "muestra" se utilizan indistintamente. Una muestra biológica puede, a modo de ejemplo no limitante, incluir tejido de la piel, tejido hepático, tejido renal, tejido pulmonar, líquido cefalorraquídeo (LCR), sangre, líquido amniótico, suero, orina, heces, muestra epidérmica, muestra de piel, hisopo de mejillas, esperma, líquido amniótico, células cultivadas, muestra de médula ósea y/o de vellosidades coriónicas. Los cultivos celulares de las muestras biológicas también pueden ser utilizados como muestras biológicas. Una muestra biológica también puede ser, por ejemplo, una muestra obtenida de cualquier órgano o tejido (incluyendo un espécimen de biopsia o autopsia), puede comprender células (si son células primarias o células cultivadas), medio acondicionado por cualquier célula, tejido u órgano, cultivo de tejidos. En algunas modalidades, las muestras biológicas adecuadas para la invención son muestras que han sido procesadas para liberar o de otra manera poner a disposición un ácido nucleico para la detección como se describe en la presente. También pueden ser utilizados tejidos fijos o congelados.

Sujeto: Como se usa en la presente, el término "sujeto" se refiere a un humano o cualquier animal no humano (por ejemplo, ratón, rata, conejo, perro, gato, ganado vacuno, cerdos, ovejas, caballos o primates). Un humano incluye formas pre- y post-natal. En muchas modalidades, un sujeto es un ser humano. Un sujeto puede ser un paciente, el cual se refiere a un humano que se presenta a un proveedor médico para el diagnóstico o tratamiento de una enfermedad. El término "sujeto" se utiliza en la presente de manera intercambiable con "individuo" o "paciente". Un sujeto puede estar afligido con o es susceptible a una enfermedad o trastorno, pero puede o no mostrar síntomas de la enfermedad o trastorno.

Que sufre de: Un individuo que está "sufriendo de" una enfermedad, trastorno y/o afección (por ejemplo, esclerodermia) ha sido diagnosticado o muestra uno o más síntomas de la enfermedad, trastorno y/o afección.

Susceptible a : Un individuo que es "susceptible de" una enfermedad, trastorno y/o afección que no ha sido diagnosticado y/o no puede mostrar síntomas de la enfermedad, trastorno y/o afección. En algunas modalidades, un individuo que es susceptible a una enfermedad, trastorno y/o afección (por ejemplo, esclerodermia) puede caracterizarse por uno o más de los siguientes: (1) una mutación genética asociada con el desarrollo de la enfermedad, trastorno, y/o afección; (2) un polimorfismo genético asociado con el desarrollo de la enfermedad, trastorno y/o afección; (3) el aumento y/o disminución de la expresión y/o actividad de una proteína asociada con la enfermedad, trastorno y/o afección; (4) los hábitos y/o estilos de vida asociados con el desarrollo de la enfermedad, trastorno y/o afección; (5) una historia familiar de la enfermedad, trastorno y/o afección; (6) la reacción a ciertas bacterias o virus; (7) la exposición a ciertos productos químicos. En algunas modalidades, un individuo que es susceptible a una enfermedad, trastorno y/o afección desarrollará la enfermedad, trastorno y/o afección. En algunas modalidades, un individuo que es susceptible a una enfermedad, trastorno y/o afección no desarrollará la enfermedad, trastorno y/o afección.

Tratamiento: Como se usa en la presente, el término "tratamiento" (también "tratar" o "tratando") se refiere a cualquier administración de una proteína terapéutica (por ejemplo, la administración de un anticuerpo monoclonal anti-CCL2 o fragmento de unión al antígeno del mismo) que parcial o completamente alivia, atenúa, mitiga, inhibe, retrasa el comienzo de, reduce la gravedad y/o reduce la incidencia de uno o más síntomas o características de una enfermedad, trastorno y/o afección particular (por ejemplo, esclerodermia, fibrosis o inflamación). Tal tratamiento puede ser de un sujeto que no presenta signos de la enfermedad, trastorno y/o afección relevante y/o de un sujeto que exhibe sólo los primeros signos de la enfermedad, trastorno y/o afección. Alternativa o adicionalmente, tal tratamiento puede ser de un sujeto que exhibe uno o más signos establecidos de la enfermedad, trastorno y/o afección relevante.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona, entre otras cosas, anticuerpos anti-CCL2 mejorados caracterizados con alta afinidad, potencia, selectividad de tejido y/o especificidad de epítope, y usos de los mismos, en particular, para el tratamiento de esclerodermia y enfermedades, trastornos y afecciones fibróticas y/o inflamatorias relacionadas. En algunas modalidades, la presente invención proporciona métodos y composiciones para el tratamiento de esclerodermia y enfermedades, trastornos y afecciones fibróticas y/o inflamatorias relacionadas basado en un anticuerpo anti-CCL2 que tiene una afinidad de 1012 M o mayor.

La presente invención, en parte, se basa en los conocimientos únicos observados por los presentes inventores, es decir, anticuerpos anti-CCL2 de alta afinidad, particularmente cuando se administran en altas dosis, permiten la inhibición efectiva de CCL2 en los tejidos afectados a pesar de los niveles elevados de CCL2 en el plasma. Las modalidades de la invención incluyen anticuerpos anti-CCL2 que tienen una afinidad de 1012 o mayor. Los anticuerpos de tal alta afinidad son particularmente ventajosos. Debido a los altos niveles circulantes de CCL2 en el plasma de los pacientes con esclerodermia, una gran fracción de cualquier anticuerpo anti-CCL2 administrado probablemente será secuestrada por CCL2 circulante. Sin desear estar limitado por la teoría, un anticuerpo anti-CCL2 de alta afinidad puede neutralizar efectivamente CCL2 en el tejido afectado, además de neutralizar CCL2 circulante, en parte debido a su capacidad para competir efectivamente con el receptor, CCR2, que tiene una afinidad de unión de 60 pM a CCL2. Por lo tanto, un anticuerpo anti-CCL2 de alta afinidad (por ejemplo, un anticuerpo anti-CCL2 con una afinidad de unión más fuerte que 60 pM) puede secuestrar eficazmente CCL2 en tejido enfermo previniendo la unión entre CCL2 y su receptor CCR2. Como un resultado, puede ser necesario menos cantidad de anticuerpo anti-CCL2 de alta afinidad en el tejido enfermo para lograr los efectos terapéuticos deseados.

Varios aspectos de la invención se describen en detalle en las siguientes secciones. El uso de secciones no tiene la intención de limitar la invención. Cada sección puede aplicarse a cualquier aspecto de la invención. En esta solicitud, el uso de "o" significa "y/o" a menos que se indique lo contrario.

Es el erodermia La esclerodermia o esclerosis sistémica, se considera generalmente una enfermedad autoinmune sistémica crónica que se caracteriza, entre otras cosas, por fibrosis o endurecimiento, alteraciones vasculares, y autoanticuerpos. Sin desear estar limitado por la teoría, se cree que la esclerodermia es causada por una respuesta autoinmune hiperactiva atrapada en un bucle de amplificación de refuerzo. Por ejemplo, la esclerodermia se caracteriza histológicamente por infiltrados inflamatorios de células mononucleares, que a su vez activan y se asocian con un aumento de la síntesis de colágeno en los fibroblastos circundantes. En particular, los macrófagos activados producen TGF-beta y PDGF, que activan los fibroblastos en las zonas afectadas para producir altas cantidades de colágeno.

Las células T también parecen jugar un papel en el proceso de la enfermedad a través de la activación de macrófagos y la liberación directa de citocinas pro-fibrogénicas inflamatorias. Además del colágeno, los fibroblastos activados parecen secretar factores que reclutan células inflamatorias adicionales a las áreas afectadas, que liberan citocinas, que reclutan adicionalmente células inflamatorias liberadoras de citocinas, lo que conduce a la inflamación no regulada y fibrosis tisular.

Por lo general, los monocitos/macrófagos y las células T aumentan en número y activación en la circulación y tejidos de los pacientes con esclerodermia. La acumulación de tejidos es tanto una causa como efecto de la lesión microvascular, que es uno de los primeros eventos en la patogenia de la esclerodermia. La lesión microvascular se caracteriza por el daño de las células endoteliales, la proliferación de las capas de lámina basal, el atrapamiento ocasional de células mononucleares de sangre periférica en la pared de vasos, e infiltrados de células mononucleares perivasculares iniciales. Como la cascada inflamatoria empeora, está dominada por la fibrosis, alteración de la arquitectura del órgano visceral, rarefacción de los vasos sanguíneos, y en consecuencia, hipoxia. Todos estos factores y el reclutamiento continuo de monocitos contribuyen al mantenimiento de la fibrosis En algunas modalidades, la esclerodermia también se considera una enfermedad del tejido conectivo caracterizada generalmente con una acumulación excesiva de proteínas de matriz extracelular en la piel y órganos internos, lesión vascular, y alteraciones inmunológicas.

Muchas de las manifestaciones clínicas de la enfermedad se cree que involucran a una regulación deficiente de la remodelación vascular. Uno de los primeros síntomas de la esclerodermia es una lesión microvascular. Esta lesión microvascular se cree que causa un aumento de la activación de las células endoteliales. Las células endoteliales activadas se cree que expresan moléculas de adhesión resultantes de la permeabilidad capilar alterada permitiendo la migración de las células inflamatorias a través del endotelio y atrapamiento en la pared del vaso. La activación inmunitaria se cree que contribuye a la activación endotelial sostenida, lo que resulta en la descomposición de las células endoteliales. Se cree que este proceso contribuye a la pérdida de elasticidad y estrechamiento de los vasos observados comúnmente en pacientes con esclerodermia. Además, se cree que la lesión microvascular contribuye a infiltrados perivasculares de células mononucleares en la dermis, que se cree que contribuye a la activación de fibroblastos y muchos de los síntomas característicos asociados de la esclerodermia. A medida que aumenta la fibrosis, la permeabilidad disminuye. Como un resultado, se hace más difícil que los anticuerpos penetren los tejidos enfermos. Por lo tanto, la afinidad de anticuerpos anti-CCL2 se vuelve particularmente importante para mantener anticuerpos localizados.

Muchas de las manifestaciones clínicas de la enfermedad se cree generalmente que implican la regulación deficiente de los fibroblastos. La función principal de los fibroblastos es mantener la integridad estructural de los tejidos conectivos secretando de forma continua precursores de la matriz extracelular. Los fibroblastos proporcionan un armazón estructural (estroma) para muchos tejidos, juegan un papel importante en la cicatrización de heridas y son las células más comunes del tejido conectivo en animales. Los fibroblastos son morfológicamente heterogéneos con diversas apariencias dependiendo de su ubicación y actividad.

Hay dos formas principales de esclerodermia: esclerosis/esclerodermia sistémica limitada y esclerosis/esclerodermia sistémica difusa. En la esclerodermia cutánea limitada, la fibrosis de la piel se limita generalmente a la zona proximal al codo. Los pacientes con esclerodermia cutánea limitada generalmente experimentan deterioro vascular. La fibrosis cutánea y de órganos generalmente progresa lentamente en pacientes con esclerodermia limitada. Los pacientes con esclerodermia difusa generalmente experimentan fibrosis de la piel y órganos que progresa más rápidamente que en la esclerodermia limitada y/o inflamación generalizada y/o afectación de órganos internos más grave que se observa en la esclerodermia limitada.

En general se piensa que la enfermedad pulmonar intersticial, que resulta en fibrosis pulmonar, es la causa principal de muertes relacionadas con esclerodermia (Ludwicka-Bradlcy, A., et al. Coagulation and autoimmunity in scleroderma interstitial lung disease. Semin Arthritis Rheum, 41(2), 212-22, 2011). Las complicaciones adicionales que resultan en muertes relacionadas con esclerodermia incluyen, pero no se limitan a cáncer, insuficiencia cardiaca, hipertensión pulmonar, insuficiencia renal, y mala absorción, o cualquier combinación de los mismos.

La esclerodermia es más comúnmente diagnosticada mediante la inspección de los síntomas de la piel. Las pruebas para el diagnóstico incluyen, pero no se limitan a inspección visual y/o manual de la piel, prueba de presión arterial, radiografía de tórax, CT de pulmón, ecocardiograma, análisis de orina, biopsia de piel, y análisis de sangre incluyendo pruebas de anticuerpos antinucleares, pruebas de anticuerpos anti-topoiso erasa, pruebas de anticuerpos anti-centrómero, pruebas de anticuerpos anti-U3, pruebas de anticuerpos anti-ARN, otros tipos de pruebas de anticuerpos, velocidad de sedimentación de eritrocitos, y factor reumatoide.

Anticuerpos Anti-CCL2 La presente invención proporciona métodos y composiciones para el tratamiento de la esclerodermia y enfermedades, trastornos y afecciones fibróticas y/o inflamatorias relacionadas, basados en la administración de anticuerpos anti-CCL2, en particular, anticuerpos anti-CCL2 de alta afinidad.

CCL2 CCL2 es una quimiocina producida por una variedad de tipos de células. También es conocida como proteína-1 quimiotáctica de monocitos (MCP-1). CCL2 es conocido por ser un atrayente potente para muchos tipos de células del sistema inmune, incluyendo pero no limitado a los monocitos, linfocitos T de memoria CD4 y CD8 y células NK (Carulli, M. et al. Can CCL2 serum levels be used in risk stratification or to monitor treatment response in syste ic sclerosis? Ann Rheum Dis, 67, 105-109, 2008, Yamamoto , T. Scleroderma -Pathophysiology. Eur J Dermatol, 19 (1), 14-24). Se ha mostrado que CCL2 promueve la migración de leucocitos a través de monocapas endoteliales, lo que sugiere un papel en la promoción de infiltrados perivasculares de células mononucleares (Id.). También se ha mostrado que CCL2 promueve la activación de fibroblastos y sobrerregula la expresión de ARNm de colágeno tipo I en fibroblastos de rata in vitro. Se ha mostrado los niveles elevados de CCL2 en pacientes con esclerodermia y también en modelos animales de la esclerodermia (Id.). Específicamente, el aumento de los niveles de expresión de CCL2 se ha mostrado en la piel y el aumento del ARN y proteína en CCL2 se ha mostrado en fibroblastos de esclerodermia (Id.).

El CCL2 humano es una proteína de 8.6 kDa que contiene 76 residuos de aminoácidos, la secuencia de aminoácidos de la cual se muestra en la Tabla 1. Se expresa por una variedad de tipos de células, incluyendo monocitos, células endoteliales vasculares, células de músculo liso, ciertas células epiteliales, entre otras y se une a su receptor CCR2. CCL2 pertenece a la familia de las quimiocinas CC que contiene dos residuos de cisteína que son adyacentes (los residuos de cisteína adyacentes subrayados en la Tabla Tabla 1 N CCL2 también se ha purificado, caracterizado, clonado y secuenciado a partir de fuentes no humanas y puede ser producido de manera recombinante o químicamente sintetizado. Como se usa en la presente, el término CCL2 abarca cualquiera de las proteínas de CCL2 de origen natural en otras especies incluyendo, pero no limitado a, ratón, ratas, primates, cerdos, pollos, perros, cabras, ovejas, caballos, camellos, llama, por nombrar sólo algunos, y cualquier CCL2 recombinante o sintético que es sustancialmente homólogo o idéntico a CCL2 humano. En algunas modalidades, una proteína de CCL2 como se usa en la presente tiene una secuencia de al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más homologa a la SEC ID NO: 1. En algunas modalidades, una proteína de CCL2 como se usa en la presente tiene : una secuencia de al menos 50%, 55%, 60 %, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la SEC ID NO: 1. Típicamente, una proteína de CCL2 sustancialmente homologa o idéntica a CCL2 humano también retiene la actividad sustancial de CCL2 humano. "Porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a la secuencia de CCL2 identificada en la presente se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos con los residuos de aminoácidos en la secuencia de CCL2, después de alinear las secuencias e introducir las aberturas, si es necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y sin considerar alguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. La alineación con fines de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos puede lograrse de diversas maneras que están dentro de la experiencia en la téenica, por ejemplo, utilizando software informático disponible públicamente, tal como BLAST, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar parámetros apropiados para medir la alineación, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr el máximo alineamiento sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan. Preferiblemente, el software WU-BLAST-2 se utiliza para determinar la identidad de secuencia de aminoácidos (Altschul et al . , Methods in Enzymology 266, 460-480 (1996); http ://blast.wustl/edu/blast/README.html). WU-BLAST-2 utiliza varios parámetros de búsqueda, la mayoría de los cuales se establecen a los valores predeterminados. Los parámetros ajustables se ajustan con los valores siguientes: duración de superposición = 1, fracción de superposición = 0.125, umbral de mundo (T) = 1.1. La puntuación HSP (S) y parámetros HSP S2 son valores dinámicos y son establecidos por el programa en sí, dependiendo de la composición de la secuencia particular, sin embargo, los valores mínimos pueden ser ajustados y se fijan como se indica anteriormente.

Cualquiera de las proteínas de CCL2 descritas anteriormente puede utilizarse para generar e identificar anticuerpos monoespecíficos que se unen específicamente a CCL2. Vea la sección Anticuerpos Anti-CCL2 a continuación.

Anticuerpos Anti-CCL2 Las proteínas CCL2 descritas en la presente, o fragmentos de las mismas, pueden utilizarse para generar anticuerpos por métodos bien conocidos por los expertos en la téenica. Como se usa en la presente, los anticuerpos anti-CCL2 incluyen cualquiera de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que se unen específicamente a cualquiera de los epítopes de CCL2. Como se usa en la presente, el término "anticuerpos" se pretende que incluya inmunoglobulinas y fragmentos de las mismas que son específicamente reactivas a la proteína o péptido designado, o fragmentos de los mismos. Por ejemplo, el término "anticuerpos" incluye anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonales, anticuerpos de dominio único (por ejemplo, anticuerpos de dominio único de tiburón (por ejemplo, IgNAR o fragmentos del mismo)), y fragmentos de anticuerpos siempre y cuando muestren la actividad biológica deseada. Los anticuerpos adecuados también incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos humanos, anticuerpos primatizados, anticuerpos quiméricos, anticuerpos biespecífíeos, anticuerpos humanizados, anticuerpos conjugados (es decir, anticuerpos conjugados o fusionados a otras proteínas, radiomarcas, citotoxinas), InmunoFantiacéuticos Modulares Pequeños ("SMIPs™"), y fragmentos de anticuerpos.

Como se usa en la presente, un "fragmento de anticuerpo" incluye una porción de un anticuerpo intacto, tal como, por ejemplo, la región variable o de unión al antígeno de un anticuerpo. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, y Fv; triacuerpos; tetracuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de cadena única. El término "fragmento de anticuerpo" también incluye cualquier proteína sintética o modificada genéticamente que actúa como un anticuerpo uniéndose a un antígeno específico para formar un complejo. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos aislados, fragmentos "Fv", que consisten de las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras, las moléculas de polipéptido de cadena única recombinantes en las que las regiones variables de cadena ligera y pesada están conectadas por un enlazante peptídico ("proteínas de scFv"), y unidades de reconocimiento mínimas que consisten de los residuos de aminoácidos que imitan la región hipervariable.

Los anticuerpos anti-CCL2 se pueden generar utilizando métodos bien conocidos en la téenica. Por ejemplo, los protocolos para la producción de anticuerpos se describen por Harlow and Lañe, Antibodies : A Laboratory Manual , (1988). Típicamente, los anticuerpos pueden ser generados en ratón, rata, cobayo, hámster, camello, llama, tiburón, u otro huésped adecuado. Alternativamente, los anticuerpos se pueden producir en pollos, produciendo moléculas de IgY (Schade et al., (1996) ALTEX 13(5):80-85). En algunas modalidades, los anticuerpos adecuados para la presente invención son anticuerpos de primate subhumano. Por ejemplo, las técnicas generales para producir anticuerpos terapéuticamente útiles en babuinos pueden encontrarse, por ejemplo, en Goldenberg et al., publicación de patente internacional No. WO 91/11465 (1991), y en Losman et al., Int. J. Cáncer 46: 310 (1990). En algunas modalidades, los anticuerpos monoclonales se pueden preparar utilizando métodos de hibridoma (Milstein and Cuello, (1983) Nature 305 (5934):537-40). En algunas modalidades, los anticuerpos monoclonales también se pueden producir por métodos recombinantes (Patente de Estados Unidos No. 4,166,452, 1979).

Muchas de las dificultades asociadas con la generación de anticuerpos monoclonales por inmortalización de células B pueden ser superadas por la modificación y la expresión de fragmentos de anticuerpos en E. coli, usando la expresión en fagos. Para asegurar la recuperación anticuerpos monoclonales de alta afinidad una biblioteca de inmunoglobulina combinatoria típicamente debe contener un gran tamaño de repertorio. Una estrategia típica utiliza ARNm obtenido de linfocitos o células de bazo de ratones inmunizados para sintetizar ADNc utilizando transcriptasa inversa. Los genes de cadena pesada y ligera se amplifican por separado mediante PCR y se ligan en vectores de clonación de fago. Se producen Dos bibliotecas diferentes, una que contiene los genes de cadena pesada y una que contiene los genes de cadena ligera. El DNA de fago se aísla de cada biblioteca, y las secuencias de cadena pesada y ligera se ligan entre sí y se empaquetan para formar una biblioteca combinatoria. Cada fago contiene un par aleatorio de ADNc de cadena pesada y ligera y después de la infección de E. coli dirige la expresión de las cadenas de anticuerpo en las células infectadas. Para identificar un anticuerpo que reconoce el antígeno de interés, la biblioteca de fagos se coloca en placas, y las moléculas de anticuerpo presentes en las placas se transfieren a filtros. Los filtros se incuban con antígeno marcado radiactivamente y luego se lavan para remover el exceso de ligando no unido. Un punto radiactivo en el autorradiograma identifica una placa que contiene un anticuerpo que se une al antígeno. Los vectores de clonación y expresión que son útiles para producir una biblioteca de fagos de inmunoglobulina humana se pueden obtener, por ejemplo, de STRATAGENE Cloning Systems (La Jolla, California).

Se puede emplear una estrategia similar para obtener scFv de alta afinidad. Véase, por ejemplo, Vaughn et al., Nat. Biotechnol, 14: 309314 (1996). Una biblioteca de scFv con un gran repertorio puede ser construida mediante el aislamiento de genes V de donantes humanos no inmunizados utilizando cebadores de PCR correspondientes a todas las familias de genes de VH, VK y nl conocidos. Después de la amplificación, los grupos VK y se combinan para formar un grupo. Estos fragmentos se ligan en un vector fagémido. El enlazante scFv, (Gly4, Ser)3, se liga luego en el fagémido cadena arriba del fragmento VL. Los fragmentos de VH y enlazante-VL se amplifican y se ensamblan en la región JH. Los fragmentos VH-enlazante-VL resultantes se ligan en un vector fagémido. La biblioteca de fagémido se puede desplazar utilizando filtros, como se describe anteriormente, o utilizando inmunotubos (Nunc; Maxisorp). Resultados similares se pueden lograr construyendo una biblioteca de inmunoglobulina combinatoria a partir de linfocitos o células de bazo de conejos inmunizados y expresando los constructos de scFv en P. pastoris. Véase, por ejemplo, Ridder et al., Biotechnology, 13:255 260 (1995). Además, después del aislamiento de un scFv apropiado, los fragmentos de anticuerpos con mayores afinidades de unión y velocidades de disociación más lentas se pueden obtener a través de procesos de maduración de afinidad tales como mutagénesis de CDR3 y transposición de cadenas. Véase, por ejemplo, Jackson et al., Br. J. Cáncer, 78: 181 188 (1998); Osbourn et al, Immunotechnology, 2: 181196 (1996).

Otra forma de un fragmento de anticuerpo es un péptido que codifica una CDR única. Los péptidos de CDR ("unidades reconocimiento mínimo") pueden obtenerse construyendo genes que codifican la CDR de un anticuerpo de interés. Tales genes se preparan, por ejemplo, mediante el uso de la reacción en cadena de la polimerasa para sintetizar la región variable de ARN de las células que producen anticuerpos. Véase, por ejemplo, Larrick et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2: 106 (1991); Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies, " in MONOCLONAL ANTIBODIES: PRODUCTION, ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION, Ritter et al. (eds.), páginas 166-179 (Cambridge University Press 1995); y Ward et al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies," en MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND APPLICATIONS, Birch et al., (eds.), páginas 137 185 (Wilcy-Liss, Inc.1995).

En algunas modalidades, los anticuerpos adecuados para la invención pueden incluir anticuerpos humanizados o humanos. Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos son cadenas o fragmentos de Ig, Ig quiméricos (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de unión a antígeno de Abs) que contienen una secuencia mínima derivada de Ig no humana. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácidos introducidos a partir de una fuente no humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos se denominan frecuentemente como residuos "importados", que por lo general se toman a partir de un dominio de "importación" variable. La humanización se lleva a cabo por la sustitución de regiones determinantes de la complementariedad (CDR) o secuencias CDR de roedor por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano (Riechmann et al, Nature 332(6162): 323-7, 1988; Verhoeyen et al, Science 239 (4847): 1534-6, 1988.). Tales anticuerpos "humanizados" son Abs quiméricos (por ejemplo, véanse las patentes de Estados Unidos Nos. 4,816,567; 5,693,762; y 5,225,539), en donde sustancialmente menos que un dominio variable humano intacto ha sido sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En algunas modalidades, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los que algunos residuos de CDR y posiblemente algunos residuos de FR se sustituyen por residuos de sitios análogos en Abs de roedor. Los anticuerpos humanizados incluyen Ig humanas (anticuerpo receptor) en las cuales los residuos de una CDR del receptor se sustituyen por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como ratón, rata o conejo, que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos no humanos correspondientes sustituyen los residuos del armazón de Fv de la Ig humana. Los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en las secuencias de armazón o CDR importadas. En general, el anticuerpo humanizado comprende sustancialmente la totalidad de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que la mayoría si no todas las regiones CDR corresponden a aquellas de una Ig no humana, y la mayoría si no todas las regiones FR son aquellas de una secuencia consenso de Ig humana. El anticuerpo humanizado óptimamente también comprende al menos una porción de una región constante de Ig (Fe), típicamente aquella de una Ig humana (Riechmann et al, Nature 332(6162):323-7, 1988; Verhocyen et al, Science.239 (4847):1534-6, 1988).

Los anticuerpos humanos también pueden producirse utilizando diversas téenicas, incluidas las bibliotecas de presentación de fagos (Hoogenboom et al, Mol Immunol (1991) 28(9):1027-37; Marks et al., J Mol Biol. (1991) 222(3):581- 97) y la preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Reisfeld and Sell, 1985, Cáncer Surv. 4(1):271-90). Del mismo modo, la introducción de genes de Ig humana en animales transgénicos en los cuales los genes de Ig endógenos han sido parcial o completamente inactivados puede ser explotados para sintetizar anticuerpos humanos. Tras la provocación, se observa la producción de anticuerpos humanos, que se asemeja mucho a la observada en seres humanos en todos los aspectos, incluyendo la reorganización de genes, ensamblaje y repertorio de anticuerpos (Fishwild et al., High-avidity human IgG kappa monoclonal antibodies from a novel strain of minilocus transgenic mice, Nat Biotechnol. Julio 1996; 14 (7):845-51; Lonberg et al., Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications, Nature, 28 de abril de 1994,-368(6474):856-9; Lonberg and Huszar, Human antibodies from transgenic mice, Int. Rev. Immunol. 1995;13 (1):65-93; Marks et al., By-passing immunization: building high affinity human antibodies by chain shuffling, Biotechnology (NY). Julio 1992; 10(7):779-83). En algunas modalidades, los anticuerpos anti-CCL2 humanos son hechos por la inmunización de animales no humanos por ingeniería genética para producir anticuerpos humanos en respuesta a la provocación del antígeno; por ejemplo, la inmunización con CCL2 humano (por ejemplo, ver Patentes de Estados Unidos Nos.5,569,825; 6,150,584; y 6,596,541).

El uso de anticuerpos anti-CCL2 de alta afinidad es importante para tratar la esclerodermia. Como se describió anteriormente, la afinidad de unión entre CCL2 y el receptor CCR2 es alta (es decir, 60 pM), y hay un alto nivel de circulación de CCL2 en el plasma. Por lo tanto, la mayoría de los anticuerpos anti-CCL2 es probable que sean secuestrados en el plasma una vez administrados y sólo una pequeña fracción puede localizarse en los tejidos objetivo enfermos. Por lo tanto, los anticuerpos anti-CCL2 son poco probable que sean efectivos en competir CCL2 fuera del receptor e inhibe la señalización en el tejido objetivo a menos que también tenga una alta afinidad de unión para CCL2. Además, cuando la esclerodermia avanza, aumenta la fibrosis y la permeabilidad de vasculatura y el acceso al tejido objetivo disminuyen. El uso de anticuerpos anti-CCL2 de alta afinidad asegura que los anticuerpos retenidos en los tejidos objetivo todavía sean capaces de unirse a CCL2 y prevenir la interacción con su receptor.

Por consiguiente, en algunas modalidades, un anticuerpo o fragmento anti-CCL2 de los mismos adecuados para la presente invención tiene una afinidad de unión de o mayor que aproximadamente 500 nM, 100 nM, 10 nM, 1 nM, 500 pM, 100 pM, 50 pM, 10 pM, 1 pM, 500 fM, 400 fM, 300 fM, 200 fM, 100 fM, 50 fM, 10 fM, 1 fM. En algunas modalidades, un anticuerpo o fragmento anti-CCL2 de los mismos adecuados para la presente invención tiene una afinidad de unión que varía entre aproximadamente 500 nM y 1 fM, entre 500 nM y 10 fM, entre 500 nM y 100 fM, entre 500 nM y 1 pM, entre 10 nM y 1 fM, entre 10 nM y 100 fM, entre 10 nM y 1 pM, entre 1 nM y 1 fM, entre 1 nM y 100 fM, entre 1 nM y 500 fM, entre 1 nM y 1 pM, entre 1 nM y 10 pM, entre 1 nM y 50 pM, entre 1 nM y 100 pM, entre 1 nM y 500 pM.

Biodistribución y biodisponibilidad En diversas modalidades, una vez administrado in vivo, un anticuerpo anti-CCL2 de acuerdo con la presente invención, se puede suministrar a varios tejidos objetivo. Los tejidos objetivo deseados, ejemplares, incluyen, pero no se limitan a, piel, vasos sanguíneos, pulmón, corazón, riñón, tracto gastrointestinal (incluyendo el hígado), esófago, sistema musculoesquelético y combinaciones de los mismos.

En diversas modalidades, una vez administrado in vivo, un anticuerpo anti-CCL2 de acuerdo con la presente invención, puede lograr niveles o actividades terapéutica o clínicamente eficaces en diversos tejidos objetivos descritos en la presente. Como se usa en la presente, un nivel o actividad terapéutica o clínicamente eficaz es un nivel o actividad suficiente para conferir un efecto terapéutico en un tejido objetivo. El efecto terapéutico puede ser objetivo (es decir, medible por alguna prueba o marcador) o subjetivo (es decir, el sujeto proporciona una indicación de o siente un efecto). Por ejemplo, un nivel o actividad terapéutica o clínicamente eficaz puede ser un nivel o actividad de proteína que es suficiente para mejorar los síntomas asociados con esclerodermia o enfermedades, trastornos o condiciones relacionadas en el tejido objetivo (por ejemplo, nivel de CCL2). En algunas modalidades, un anticuerpo anti-CCL2 descrito en la presente proporcionada de acuerdo con la presente invención puede reducir los niveles de CCL2 por al menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% en el tejido objetivo en comparación con un control sin tratar o el estado de pre-tratamiento.

En algunas modalidades, un anticuerpo anti-CCL2 descrito en la presente provisto según la presente invención, puede reducir el nivel de suero CCL2 a menos de aproximadamente 1000 mg/ml, 900 pg/ml, 800 pg/ml, 700 pg/ml, 600 pg/ml, 500 pg/ml, 400 pg/ml, 300 pg/ml, 250 pg/ml, 200 pg/ml, 180 pg/ml, 160 pg/ml, 140 pg/ml, 120 pg/ml, 100 pg/ml, o menos.

En general, una vez administrado in vivo, un anticuerpo anti-CCL2 de acuerdo con la presente invención, tienen la mitad de tiempo suficientemente largo en el suero y/o tejidos objetivo (por ejemplo, piel, vasos sanguíneos, pulmón, corazón, riñón, tracto gastrointestinal (incluyendo el hígado), esófago, o sistema músculo-esquelético). En algunas modalidades, un anticuerpo anti-CCL2 de acuerdo con la presente invención, puede tener una vida media de al menos aproximadamente 30 minutos, 45 minutos, 60 minutos, 90 minutos, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 12 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas, 25 horas, 30 horas, 35 horas, 40 horas, hasta 3 días, hasta 7 días, hasta 14 días, hasta 21 días o hasta un mes. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-CCL2 de acuerdo con la presente invención, puede retener el nivel o actividad detectable en el suero y/o tejidos objetivo después de 12 horas, 24 horas, 30 horas, 36 horas, 42 horas, 48 horas, 54 horas, 60 horas, 66 horas, 72 horas, 78 horas, 84 horas, 90 horas, 96 horas, 102 horas, o una semana después de la administración. El nivel o actividad detectable puede determinarse usando diversos métodos conocidos en la téenica.

En ciertas modalidades, un anticuerpo anti-CCL2 descrito en la presente, logra una concentración de al menos 20 mg/ml, al menos 15 pg/ml, al menos 10 pg/ml, al menos 7.5 pg/ml, al menos 5 pg/ml, al menos 2.5 pg/ml, al menos 1.0 pg/ml o al menos 0.5 pg/ml en el suero o tejidos objetivo después de la administración (por ejemplo, intravenosa) a tal sujeto (por ejemplo, una semana, 3 días, 48 horas 36 horas, 24 horas, 18 horas, 12 horas, 8 horas, 6 horas, 4 horas, 3 horas, 2 horas, 1 hora, 30 minutos, o menos después de la administración (por ejemplo, i.v.) al sujeto).

Tratamiento de la Esclerodermia y Enfermedades, Trastornos o Afecciones relacionadas Los anticuerpos an i-CCL2 descritos en la presente pueden usarse para tratar eficazmente a individuos que sufren de o son susceptibles a esclerodermia o enfermedades, trastornos o condiciones inflamatorias, fibróticas, relacionadas. Los términos "tratar" o "tratamiento", como se usan aquí, se refieren a la mejora de uno o más síntomas, prevención o retraso de la aparición de uno o más síntomas, y/o disminución de la gravedad o frecuencia de uno o más síntomas de la enfermedad, trastorno o estado relevante.

Varios anticuerpos de la invención pueden administrarse solos o en combinación con otros anticuerpos o agentes terapéuticos. En algunas modalidades, los anticuerpos descritos en la presente se pueden administrar solos o en combinación con otros agentes terapéuticos, tales como aquellos que son útiles en el tratamiento de enfermedades, trastornos o condiciones inflamatorias o fibróticas. Tales agentes terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, corticosteroides, NSAID, fármacos inmunosupresores (por ejemplo, metotrexato y Cytoxan), inmunomoduladores de moléculas pequeñas, anticuerpos del receptor de interferón, fármacos anti-fibróticos incluyendo D-penicilamina, colchicina, PUVA, relaxina, y tratamientos anti-TGF y ciclosporina, y antagonistas del receptor de endotelina.

En algunas modalidades, los anticuerpos descritos en la presente se pueden administrar usando dosis convencionales y métodos de suministro, tales como aquellos descritos para otros agentes terapéuticos, comparables. Las dosis a ser administradas se pueden determinar por procedimientos convencionales conocidos por aquellos expertos en la téenica. Véase, por ejemplo, The Pharmacological Basis of Therapeutics, Goodman and Gilman, eds., Macmillan Publishing Co., New York. En general, las dosis efectivas son aquellas que son lo suficientemente grandes para producir el efecto deseado, por ejemplo, la neutralización de CCL2 y/o el bloqueo de la unión de CCL2 a su receptor cognado. La dosificación no debe ser tan grande como para causar efectos secundarios adversos, tales como reacciones cruzadas no deseadas, reacciones anafilácticas, y similares. Los factores a considerar incluyen la actividad del anticuerpo/agente específico involucrado, su estabilidad metabólica y duración de acción, modo y tiempo de administración, combinación de fármacos, velocidad de excreción, y la edad, peso corporal, salud general, sexo, dieta, y severidad de los estados de enfermedad particulares del huésped que se somete a la terapia.

Los anticuerpos descritos en la presente se pueden administrar en cualquier régimen de dosificación que es terapéuticamente eficaz. En algunas modalidades, los anticuerpos anti-CCL2 se administran cada dos meses, mensual, cada tres semanas, quincenal, semanal, diario, o a intervalos variables.

Los anticuerpos descritos en la presente se pueden administrar usando cualquier método de administración, que incluye las vías de administración, parenterales y no parenterales. Las vías parenterales incluyen, por ejemplo, intravenosa, intraarterial, intraportal, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, intraespinal, intratecal, intracerebroventricular, intracraneal, intrapleural u otras vías de inyección. Las vías no parenterales incluyen, por ejemplo, oral, nasal, transdérmica, pulmonar, rectal, bucal, vaginal, ocular. La administración también puede ser por infusión continua, administración local, liberación sostenida a partir de implantes (geles, membranas o similares), y/o inyección intravenosa.

Esclerodermia En algunas modalidades, los métodos y composiciones descritos en la presente se pueden usar para tratar a un sujeto quien sufre o es susceptible a todas las formas de esclerodermia, incluyendo, la esclerosis/esclerodermia sistémica limitada, la esclerosis /esclerodermia sistémica difusa, y otras formas de esclerodermia. La esclerosis/esclerodermia sistémica limitada implica típicamente manifestaciones cutáneas que afectan principalmente las manos, los brazos y la cara. También se conoce como síndrome de CREST, en referencia a las siguientes complicaciones: Calcinosis, fenómeno de Raynaud, disfunción esofágica, esclerodactilia y telangiectasias . Además, la hipertensión arterial pulmonar puede ocurrir en hasta un tercio de los pacientes, y es la complicación más grave de esta forma de esclerodermia . La esclerosis/esclerodermia sistémica difusa está progresando rápidamente y afecta a una gran superficie de la piel y uno o más órganos internos, con frecuencia los riñones, el esófago, el corazón y los pulmones. Otras formas de esclerodermia incluyen esclerodermia sistémica sinusoidal, que carece de cambios en la piel, pero tiene manifestaciones sistémicas, y dos formas localizadas que afectan a la piel, pero no a los órganos internos: esclerodermia morfea y lineal.

En algunas modalidades, el tratamiento se refiere a alivio parcial o completo, mejora, disminución, inhibición, retraso de la aparición, reducción de la gravedad y/o incidencia de uno o más síntomas asociados con esclerodermia, incluyendo, pero no limitado a, el daño de las células endoteliales, proliferación de capas de lámina basal, infiltración perivascular de células mononucleares, fibrosis, alteración de la arquitectura de órganos viscerales, rarefacción de los vasos sanguíneos, hipoxia, inflamación de los dedos, dorso, y antebrazos, sensaciones de frialdad en las extremidades, úlceras digitales, elongación de pliegues ungueales, sangrado por picadura de las uñas, cicatrices por picadura en las uñas, hipertensión pulmonar, fibrosis de la piel, caída del cabello, opresión en la piel, dureza de la piel, hiperpigmentación, hipopigmentación, picazón de la piel, síndrome del túnel carpiano, debilidad muscular, dolor en las articulaciones, rigidez en las articulaciones, fibrosis renal, fibrosis esofágica, fibrosis de boca, fibrosis cardiaca y fibrosis pulmonar, fibrosis hepática, fibrosis muscular, tos seca, falta de aliento, dificultad para respirar, alveolitis, neumonía, sibilancias, hinchazón después de las comidas, estreñimiento, diarrea, dificultad para tragar, ectasia vascular antral gástrica, reflujo esofágico, ardor de estómago, incontinencia fecal, manchas blancas planas en la boca, pérdida de mucosa gingival adjunta, recesión gingival, ensanchamiento difuso del ligamento periodontal, disfagia, falta de elasticidad de la boca, resorción de rama posterior de la mandíbula, proceso coronoide, y el cóndilo, cáncer, insuficiencia cardiaca, hipertensión pulmonar, insuficiencia renal, mala absorción, o cualquier combinación de los mismos, en comparación con un control sin tratar o el estado de pre-tratamiento.

En algunas modalidades, el tratamiento se refiere a alivio parcial o completo, mejora, disminución, inhibición, retraso de la aparición, reducción de la severidad y/o incidencia de fibrosis. Tal como se utiliza aquí, el término "fibrosis" se refiere a la formación de un exceso de tejido conectivo fibroso en un órgano o tejido. Sin desear estar vinculado a alguna teoría particular, se cree que la fibrosis puede ser causada por la activación de ciertos fibroblastos. Los diferentes subtipos de fibroblastos son conocidos para llevar a cabo diversas funciones, incluso dentro de un solo tejido. Por ejemplo, los fibroblastos papilares de las capas superiores de la piel producen haces de colágeno delgados y tienen una alta velocidad de proliferación, mientras que los fibroblastos reticulares de la capa dérmica más profunda de la piel producen haces de colágeno gruesos y abundante versicano, y promueve la contracción rápida de celosía. Los fibroblastos pueden estar en un estado de reposo o en diferentes fases de activación. Durante la función celular normal, los fibroblastos llegan a ser activados, por ejemplo, en respuesta a la lesión para facilitar la curación de la herida. Los fibroblastos activados producen un aumento de los componentes de la matriz extracelular, incluyendo el colágeno y enzimas modificadoras de colágeno. En individuos con esclerodermia, generalmente se observa un aumento en la activación de fibroblastos, acompañado por una sobreproducción de la ECM. Esta sobreproducción de la ECM generalmente se cree que causa fibrosis, la formación de exceso de tejido conectivo fibroso en un órgano o tejido, que es una característica de la esclerodermia.

En algunas modalidades, el tratamiento se refiere a alivio parcial o completo, mejora, disminución, inhibición, retraso de la aparición, reducción de la gravedad y/o incidencia de la fibrosis en la piel, riñón, tracto gastrointestinal (incluyendo el hígado), vasos sanguíneos, tracto gastrointestinal, sistema musculoesquelético, pulmón, y/o esófago.

En algunas modalidades, los resultados de tratamiento en alivio parcial o completo, mejora, disminución, inhibición, retraso de la aparición, reducción de la severidad y/o incidencia de fibrosis de la piel. Típicamente, la fibrosis de la piel se asocia con engrosamiento de la piel, endurecimiento, o la formación de cicatrices (por ejemplo, cicatriz queloide o cicatriz de quemadura, etc.). En algunas modalidades, la fibrosis de la piel se evalúa por Puntuación de la Piel Rodnan Modificado. Por ejemplo, como se ilustra en la Figura 1 la piel no involucrada se le da una puntuación de 0; engrosamiento leve se le da una puntuación de 1; engrosamiento moderado se le da una puntuación de 2; y engrosamiento grave se le da una puntuación de 3. En algunas modalidades, los resultados del tratamiento en una reducción de la Puntuación de la Piel Rodnan Modificado en más de 10%, más del 15%, más del 20%, más del 25%, más del 30%, más del 35%, más del 40%, más del 45%, más del 50%, más de 55%, más del 60%, más del 65%, más del 70%, más del 75%, más del 80%, más del 85%, más del 90%, más del 95%, o más, en comparación al estado de pre tratamiento. En algunas modalidades, los resultados del tratamiento en la eliminación sustancial de fibrosis de la piel.

Sin pretender estar vinculado a alguna teoría, se pensaba también que la activación de los fibroblastos en pacientes con esclerodermia puede ser causada por la activación de la respuesta inmune mediante la producción de citocinas. Los ejemplos de citocinas incluyen, pero no se limitan a TGF-b, CCL2, CTGF, ET-1, factor de crecimiento de fibroblastos, IL-1, IL-4, IL-6, IL-12, IL-13, IL-17, MCP -1, MCP-3, y PDGF. Las citocinas pueden ser producidas por las células pro-inflamatorias del sistema inmune, por ejemplo, las células T activadas, monocitos o macrófagos, o, alternativamente, las citocinas pueden ser producidas por células epiteliales. Un factor que contribuye a la activación de los fibroblastos puede ser infiltrados perivasculares de células mononucleares en la dermis asociados con el aumento de la permeabilidad capilar. Los medios alternativos o adicionales de activación de los fibroblastos incluyen la interacción con la matriz extracelular y/o tensión mecánica. Por lo tanto, en algunas modalidades, el tratamiento de pacientes con esclerodermia de acuerdo con la presente invención, resulta en la reducción de la producción de una o más citocinas pro-inflamatorias, tales como aquellas descritas en la presente. En algunas modalidades, los resultados de tratamiento en una reducción de una citocina pro-inflamatoria (por ejemplo, TGF-b, CCL2, CTGF, ET-1, factor de crecimiento de fibroblastos, IL-1, IL-4, IL-6, IL-12, IL-13, IL-17, MCP-1, MCP-3, y/o PDGF) en más de un 10%, más del 15%, más del 20%, más del 25%, más del 30%, más de 35%, más del 40%, más del 45%, más del 50%, más del 55%, más del 60%, más del 65%, más del 70%, más del 75%, más del 80%, más de 85 %, más del 90%, más del 95%, o más, en comparación con el estado de pre-tratamiento. Varios métodos para determinar el nivel de citocinas son conocidos en la téenica y se pueden utilizar para practicar la presente invención.

En algunas modalidades, el tratamiento resulta en los niveles séricos CCL2 reducidos. En algunas modalidades, el tratamiento resulta en una reducción de los niveles séricos CCL2 en más de un 10%, más del 15%, más del 20%, más del 25%, más del 30%, más del 35%, más del 40%, más del 45%, más del 50%, más del 55%, más del 60%, más del 65%, más del 70%, más del 75%, más del 80%, más del 85%, más del 90%, más del 95%, o más, en comparación con el estado de pre tratamiento. En algunas modalidades, el tratamiento resulta en un nivel sérico CCL2 de menos de aproximadamente 800 pg/ml, 700 mg/ml, 600 pg/ml, 500 pg/ml, 400 pg/ml, 350 pg/ml, 300 pg/ml, 250 pg/ml, 200 pg/ml, 150 pg/ml, o 100 pg/ml. En algunas modalidades, el tratamiento resulta en un nivel sérico CCL2 comparables a aquel de un control sano de substancialmente la misma edad o etapa de desarrollo.

Enfermedades, trastornos o afecciones fibróticas Además de la Esclerodermia, los métodos y composiciones de acuerdo con la presente invención se pueden usar para tratar enfermedades, trastornos o condiciones fibróticas en general, incluyendo, pero sin limitarse a, fibroesclerosis multifocal, enfermedad injerto contra huésped esclerodermatosa, fibrosis sistémica nefrogénica, fibrosis específica de órganos, y similares. Los trastornos fibróticos específicos de órganos, ilustrativos, incluyen, pero no se limitan a, fibrosis pulmonar, hipertensión pulmonar, fibrosis quística, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, fibrosis hepática, fibrosis renal, NASH, y similares. Muchas enfermedades, trastornos o condiciones fibróticas tienen deposición desordenada y/o exagerada de la matriz extracelular en los tejidos afectados. La fibrosis puede estar asociada con la inflamación, se produce como un síntoma de la enfermedad subyacente, y/o es causada por un procedimiento quirúrgico o proceso de cicatrización de heridas. La fibrosis sin control puede resultar en la destrucción de la arquitectura del órgano o tejido subyacente, comúnmente referido como cicatrices.

NASH es generalmente una enfermedad silenciosa, con pocos o ningún síntoma. Los pacientes generalmente se sienten bien en las primeras etapas y sólo comienzan a tener síntomas-tales como fatiga, pérdida de peso, y debilidad- una vez que la enfermedad está más avanzada o desarrolla cirrosis. La progresión de NASH puede tomar años, incluso décadas. El proceso se puede detener y, en algunos casos, incluso puede comenzar a reducirse por sí sola sin terapia específica. 0 NASH puede empeorar lentamente, causando cicatrización o fibrosis que aparece y se acumulan en el hígado. Cuando la fibrosis empeora, la cirrosis se desarrolla en la cual el hígado sufre serias cicatrices, se endurece, y no puede funcionar normalmente. No todas las personas con NASH desarrollan cirrosis, pero una vez que la cicatrización grave o cirrosis está presente, algunos tratamientos pueden detener la progresión. Una persona con cirrosis experimenta retención de líquidos, pérdida de masa muscular, sangrado de los intestinos, y la insuficiencia hepática. El trasplante hepático es el único tratamiento para la cirrosis avanzada con insuficiencia hepática y el trasplante se lleva a cabo cada vez más en personas con NASH. NASH se ubica como una de las principales causas de cirrosis en los Estados Unidos, detrás de la hepatitis C y la hepatopatía alcohólica.

La fibrosis de riñón (renal) resulta en la formación excesiva de tejido conectivo fibroso en el riñón. La fibrosis renal causa morbilidad y mortalidad significativas y conduce a la necesidad de diálisis o trasplante de riñón. La fibrosis puede producirse ya sea en el filtrado o componente de reabsorción de la nefrona, la unidad funcional del riñón. Una serie de factores puede contribuir a la cicatrización del riñón, en particular alteraciones de la fisiología involucrada en la autorregulación de la filtración glomerular. Esto a su vez conduce a la sustitución de las estructuras normales con matriz extracelular acumulada. Un espectro de cambios en la fisiología de las células individuales conduce a la producción de numerosos fibrógenos péptidos y no péptidos que estimulan alteraciones en el equilibrio entre la síntesis de matriz extracelular y la degradación para favorecer la cicatrización.

Enfermedades, trastornos o afecciones inflamatorias En algunas modalidades, los métodos y composiciones de acuerdo con la presente invención se usan para tratar enfermedades, trastornos o afecciones inflamatorias, incluyendo, pero no limitado a: Respuesta Inflamatoria Sistémica (SIRS); Enfermedad de Alzheimer (y afecciones y síntomas asociados, incluyendo: neuroinflamación crónica, activación glial; aumento de microglia; formación de placas neuríticas, y respuesta a la terapia); Esclerosis Lateral Amiotrófica (ALS), artritis (y afecciones y síntomas asociados, incluyendo, pero no limitado a: inflamación articular aguda, artritis inducida por antígenos, artritis asociada con tiroiditis linfocítica crónica, artritis inducida por colágeno, artritis juvenil; artritis reumatoide, osteoartritis, artritis inducida por estreptococos y pronóstico, espondiloartropatías, artritis gotosa), asma (y afecciones y síntomas asociados, incluyendo: asma bronquial, enfermedad obstructiva crónica de las vías respiratorias, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, asma juvenil y asma ocupacional); enfermedades cardiovasculares (y afecciones y síntomas asociados, incluyendo aterosclerosis, miocarditis autoinmune, hipoxia cardíaca crónica, insuficiencia cardíaca congestiva, enfermedad de la arteria coronaria, miocardiopatía y disfunción de las células cardíacas, incluyendo: activación de las células de músculo liso de aorta; apoptosis de las células cardíacas, e inmunomodulación de la función de las células cardíacas; diabetes y afecciones y síntomas asociados, incluyendo diabetes autoinmune, diabetes (tipo 1) insulino-dependiente, periodontitis diabética, retinopatía diabética y nefropatía diabética); inflamaciones gastrointestinales (y afecciones y síntomas asociados, incluyendo enfermedad celíaca, osteopenia asociada, colitis crónica, enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria intestinal y colitis ulcerosa) ; úlceras gástricas; inflamaciones hepáticas tales como virales y otros tipos de hepatitis, cálculos biliares de colesterol y fibrosis hepática, infección por V1H (y afecciones y síntomas asociados, incluyendo respuestas degenerativas, respuestas neurodegenerativas, y enfermedad de Hodgkin asociada con el V1H), síndrome de Kawasaki (y enfermedades y afecciones asociadas, incluyendo síndrome de ganglios linfáticos mucocutáneos, linfadenopatía cervical, lesiones de la arteria coronaria, edema, fiebre, aumento de leucocitos, anemia leve, descamación, erupciones en la piel, enrojecimiento conjuntival, trombocitosis, esclerosis múltiple, nefropatías (y enfermedades y afecciones asociadas, incluyendo nefropatía diabética, enfermedad renal terminal, glomerulonefritis aguda y crónica, nefritis intersticial aguda y crónica, nefritis por lupus, síndrome de Goodpasture, supervivencia por hemodiálisis y lesión por reperfusión isquémica renal), enfermedades neurodegenerativas (y enfermedades y afecciones asociadas, incluyendo neurodegeneración aguda, inducción de IL-1 en el envejecimiento y enfermedad neurodegenerativa, plasticidad inducida por IL-1 de las neuronas del hipotálamo e hiperreactividad por estrés crónico), oftlialmopatías (y enfermedades y afecciones asociadas, incluyendo retinopatía diabética, oftalmopatía de Graves, y uveítis, osteoporosis (y enfermedades y afecciones asociadas, incluyendo incidencia de fracturas o pérdida ósea alveolar, femoral, radial, vertebral o de la muñeca, pérdida ósea después de la menopausia, masa, incidencia de fracturas o tasa de pérdida de ósea), otitis media (adulta o pediátrica), pancreatitis o acinitis de páncreas, enfermedad periodontal (y enfermedades y afecciones asociadas, incluyendo en adultos, de inicio temprano y en diabéticos); enfermedades pulmonares, incluyendo enfermedad pulmonar crónica, sinusitis crónica, enfermedad de la membrana hialina, hipoxia y enfermedad pulmonar en SIDS; reestenosis de injertos coronarios u otros vasculares; reumatismo incluyendo artritis reumatoide, cuerpos reumáticos de Aschoff, enfermedades reumáticas y miocarditis reumática; tiroiditis incluyendo tiroiditis linfocítica crónica; infecciones del tracto urinario, incluyendo la prostatitis crónica, síndrome de dolor pélvico crónico y urolitiasis; trastornos inmunológicos, incluyendo enfermedades autoinmunes, tales como aerata alopecia, miocarditis autoinmune, enfermedad de Graves, oftalmopatía de Graves, esclerosis del liquen, esclerosis múltiple, psoriasis, lupus eritematoso sistémico, esclerosis sistémica, enfermedades de la tiroides (por ejemplo, bocio y estruma linfomatosa (tiroiditis de Hashimoto, bocio linfadenoide); trastornos del sueño y síndrome de fatiga crónica y obesidad (no diabética o asociada con la diabetes); resistencia a enfermedades infecciosas, tales como la leishmaniasis, lepra, enfermedad de Lyme, carditis de Lyme, malaria, malaria cerebral, meningitis, nefritis tubulointersticial asociada con la malaria), que son causadas por bacterias, virus (por ejemplo, citomegalovirus, encefalitis, virus de Epstein-Barr, virus de inmunodeficiencia humana, virus de influenza) o protozoos (por ejemplo, Plasmodium falciparum, tripanosomas); respuesta a un trauma, incluyendo trauma cerebral (incluyendo apoplejías e isquemias, encefalitis, encefalopatías, epilepsia, lesión cerebral perinatal, convulsiones febriles prolongadas, SIDS y hemorragia subaraenoide), bajo peso al nacer (por ejemplo, parálisis cerebral), lesión pulmonar (lesión pulmonar hemorrágica aguda, síndrome de Goodpasture, reperfusión isquémica aguda), disfunción miocárdica, causada por contaminantes ocupacionales y ambientales (por ejemplo, susceptibilidad al síndrome de aceite tóxico, silicosis), trauma por radiación, y eficiencia de las respuestas de cicatrización de heridas (por ejemplo, quemaduras o heridas térmicas, heridas crónicas, heridas quirúrgicas y lesiones de la médula espinal); regulación hormonal incluyendo fertilidad/fecundidad, probabilidad de un embarazo, incidencia de parto prematuro, complicaciones prenatales y neonatales, incluyendo prematuros de bajo peso al nacer, parálisis cerebral, septicemia, hipotiroidismo, dependencia de oxígeno, anomalía craneal, menopausia de aparición temprana; respuesta de un sujeto al trasplante (rechazo o aceptación), respuesta de fase aguda (por ejemplo respuesta febril), respuesta inflamatoria general, respuesta de aflicción respiratoria aguda, respuesta inflamatoria sistémica aguda, cicatrización de heridas, adhesión, respuesta inmunoinflamatoria, respuesta neuroendocrina, desarrollo de la fiebre y resistencia, respuesta en fase aguda, respuesta al estrés, susceptibilidad a la enfermedad, estrés por movimientos repetitivos, codo de tenista, y manejo del dolor y respuesta.

Biomarcadores o Indicadores para la Estratificación del Paciente, Monitoreo y/u Optimización del Tratamiento En algunas modalidades, los métodos y composiciones basados en anticuerpos anti-CCL2 descritos en la presente se pueden utilizar con biomarcadores para la estratificación del paciente, monitoreo y/u optimización del tratamiento. En algunas modalidades, los biomarcadores adecuados son biomarcadores expresados diferencialmente. Como se usa en la presente, el término "biomarcador expresado diferencialmente" se refiere a un biomarcador cuyo nivel de expresión es diferente en un sujeto (o una población de sujetos) afligido con esclerodermia en relación a su nivel de expresión en un sujeto sano o normal (o una población de sujetos sanos o normales). El término también abarca un biomarcador cuyo nivel de expresión es diferente para un subtipo de enfermedad diferente (es decir, esclerodermia cutánea limitada o cutánea difusa). El término abarca además un biomarcador cuyo nivel de expresión es diferente en diferentes etapas de la enfermedad (por ejemplo, esclerodermia leve o temprana, esclerodermia severa o tardía). La expresión diferencial incluye diferencias cuantitativas, así como cualitativas, en el patrón de expresión temporal o celular del biomarcador. Como se describe en mayor detalle a continuación, un biomarcador expresado diferencialmente, solo o en combinación con otros biomarcadores expresados diferencialmente, es útil en una variedad de diferentes aplicaciones en el diagnóstico, estadificación, terapéutica, desarrollo de fármaco y áreas relacionadas. Los patrones de expresión de los biomarcadores expresados diferencialmente descritos en la presente pueden ser descritos como una huella digital o una firma de la esclerodermia, subtipo de esclerodermia, etapa de esclerodermia y gravedad y/o progresión de la enfermedad esclerodermia. Se pueden utilizar como punto de referencia para comparar y caracterizar muestras desconocidas y muestras para las que se solicita información adicional. El término "nivel de expresión disminuido", como se usa en la presente, se refiere a una disminución en la expresión de al menos 10% o más, por ejemplo, 20%, 30%, 40%, o 50%, 60%, 70%, 80 %, 90% o más, o una disminución en la expresión mayor que 1 vez, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 50 veces, 100 veces o más medida por uno o más métodos descritos en la presente. El término "nivel de expresión aumentado", como se usa en la presente, se refiere a un aumento en la expresión de al menos 10% o más, por ejemplo, 20%, 30%, 40%, o 50%, 60%, 70%, 80 %, 90% o más o un aumento en la expresión mayor que 1 vez, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 50 veces, 100 veces o más, medida por uno o más métodos, tal como el método descrito en la presente.

Análisis de la expresión génica de la piel Varios métodos para la identificación de biomarcadores expresados diferencialmente en los pacientes con esclerodermia son conocidos en la téenica y se pueden utilizar para practicar la presente invención. Por ejemplo, el análisis de la expresión génica de la piel puede ser una herramienta poderosa para subconjuntar pacientes, identificar biomarcadores e indicadores de los subconjuntos de pacientes respondedores. En algunas modalidades, los genes que son regulados diferencialmente en pacientes con esclerodermia pueden ser identificados mediante la comparación de perfiles de transcripción de muestras de piel de individuos sanos con los que tienen esclerodermia. Además, los transcriptos de genes que se asocian con la gravedad de la enfermedad pueden ser identificados incluyendo pacientes con esclerodermia en diversas etapas de la progresión de grado. Los perfiles de transcripción pueden ser analizados por análisis de micromatriz, como se ha descrito, por ejemplo, por Milano et al. en "Molecular Subsets in the Gene Expression Signatures of Scleroderma Skin" (PLOS One, 3:7, 1-18, 2008), la totalidad de la cual se incorpora en la presente como referencia. Por ejemplo, el análisis de micromatrices se puede realizar en muestras de piel (por ejemplo, muestras de antebrazo y espalda) de pacientes con esclerodermia difusa, esclerodermia limitada, morfea (una enfermedad similar a la esclerodermia sin afectación de órganos internos) y controles sanos. Para identificar los genes más altamente asociados con esclerodermia, se seleccionan los genes que son más consistentes internamente entre las réplicas y los sitios de la muestra, siendo la más variable entre los individuos, para análisis adicional. El análisis de agrupamiento basado en la expresión génica diferencial correlacionada con la severidad de la esclerodermia puede ser utilizado para seleccionar los genes afectados por la esclerodermia.

Se ha informado de que los genes expresados diferencialmente ejemplares en la esclerodermia pueden ser agrupados en 6 grupos. El primer grupo incluye genes de inmunoglobulina expresados altamente en un subconjunto de pacientes con esclerodermia difusa y en pacientes con morfea, incluyendo pero no limitado a CCR2, CCL4, e IGLL1. El segundo grupo incluye firma de proliferación, incluyendo los genes que se expresan sólo cuando la célula se está dividiendo. Los genes que muestran una mayor expresión en este grupo incluyen los genes regulados del ciclo celular, como CKS1B, CDKS2, CDC2, MCM8 y E2F7. La existencia de una firma de proliferación es coherente con los informes de las biopsias de piel que demuestran que las células de tejido de esclerodermia difusa sometidas aumentaron la proliferación. El tercer grupo incluye colágeno y componentes de matriz extracelular, incluyendo, pero no limitado a COL5A2, COL8A1, COL10A1, COL12A1. El cuarto grupo incluye genes típicamente asociados con la presencia de linfocitos T y macrófagos, que se expresan de manera similar al tercer grupo e incluyen PTPRC, que se requiere para la activación de células T, así como CD2 y CDW52, que se expresan en la superficie de los linfocitos T. El quinto grupo incluye genes que muestran una baja expresión en la esclerodermia difusa. Estos genes muestran mayores niveles de expresión en otras biopsias e incluyen WIF1, tetranectina, IGFBP6, e IGFBP5, entre otros. El último grupo es un grupo de expresión génica heterogénea que es alta en la esclerodermia limitada y un subconjunto de esclerodermia difusa, incluyendo, pero no limitado a, UTS2R, GALR3, PARD6G, PSEN1, PH0X2A, CENTG3, HCN4, KLF16, y GPR15G. Los genes expresados diferencialmente ejemplares adicionales se describen en Milano et al. en "Molecular Subsets in the Gene Expression Signatures of Scleroderma Skin" (PLOS One, 3:7, 1-18, 2008), la totalidad de la cual se incorpora en la presente como referencia.

Firma de múltiples genes como marcadores sustitutos Las combinaciones de genes pueden ser utilizadas como biomarcadores. Los métodos ejemplares para la identificación de biomarcadores se proporciona en, por ejemplo, Fariña et al, en "A Four-Gene Biomarker Predicts Skin Disease in Patients with Diffuse Cutaneous Systemic Sclerosis" (Arthritis Rheum. 62(2), 580-588, 2010), la totalidad de la cual se incorpora en la presente como referencia. Partiendo con objetivos tales como interferón y TGF se sabe que están regulados en la esclerodermia, Fariña identificó un biomarcador de cuatro genes, incluyendo los genes CTGF, THS1, COL4, y Pall. Se encontró que la transcripción de estos cuatro genes en combinación está altamente correlacionada con la Puntuación de Piel de Rodnan Modificada (mRSS) y altamente predictiva de esclerodermia difusa.

La mRSS se utiliza como un marcador clínico de la esclerodermia. Típicamente, la mRSS se asigna como se muestra en la Figura 1: la piel no involucrada se le asigna una puntuación de 0; al engrosamiento leve se le da una puntuación de 1; al engrosamiento moderado se le da una puntuación de 2; y al engrosamiento severo se le da una puntuación de 3. Por lo general, una puntuación de mRSS total que varía desde 0-51 se puede determinar con base en una clasificación de 0-3 en 17 áreas de la piel de un paciente. La mRSS se puede utilizar como indicadores para el diagnóstico y el monitoreo del tratamiento solo o en combinación con otros biomarcadores ..

La estrategia similar se puede utilizar para identificar y validar biomarcadores potenciales de la firma para la esclerodermia. Específicamente, los transcriptos de genes identificados como positiva o negativamente regulados en la esclerodermia se analizan solos o en combinación para identificar biomarcadores comprendidos de transcriptos de genes o combinaciones de transcriptos de genes que están más altamente correlacionados con los marcadores clínicos de la esclerodermia. Además de mRSS, otros marcadores clínicos se pueden utilizar, como el Cuestionario de Evaluación de Salud (HAQ - DI), capacidad de difusión del pulmón para el monóxido de carbono (DLCO), o capacidad vital forzada (FVC).

Niveles de CCL2 Los niveles de CCL2, por ejemplo, niveles en suero de CCL2, se pueden utilizar como biomarcador o indicadores para determinar la gravedad de la enfermedad, afectación de órganos, selección de tratamiento adecuado, monitoreo de la progresión de la enfermedad y respuesta del paciente. Para determinar los niveles de CCL2 como biomarcadores o indicadores, los niveles de CCL2 en el suero de los pacientes en una variedad de etapas de la esclerodermia e individuos no afectados son determinados. Esto se puede hacer mediante el ensayo de los niveles de proteína de CCL2 en suero, por ejemplo, por ELISA, y se correlacionó con la piel y otros órganos involucrados (por ejemplo, pulmón, hígado, riñón, esófago). Los métodos ejemplares se describen en Carulli et al. Ann Rheum Dis.67: 105-109, 2008.

Los niveles de CCL2 presentes en la piel, tales como de una biopsia, y/o suero también pueden ser correlacionados con mRSS u otros marcadores clínicos, tales como HAQ - DI, DLCO, o FVC.

Varios biomarcadores se pueden usar solos o en combinación, o alternativamente, junto con marcadores de diagnóstico clínico, tal como mRSS, para estratificar pacientes con base en la gravedad de la esclerodermia, selección de la terapia apropiada o régimen de dosificación, evaluación de la eficacia de una terapia, monitoreo de la capacidad de respuesta a la terapia, pronóstico para el curso de la enfermedad, y medición de la progresión de la enfermedad en un sujeto. Típicamente, en tales métodos, los niveles de biomarcadores adecuados (por ejemplo, tales como los seleccionados entre diversos genes expresados diferencialmente descritos en la presente y otros marcadores conocidos, tales como niveles de CCL2) determinados para una muestra biológica obtenida del sujeto a partir de uno o más puntos de tiempo se comparan con los niveles del sujeto a partir de uno o más de otros puntos de tiempo. Por ejemplo, los niveles de biomarcadores pueden medirse antes o al comienzo de un curso de tratamiento. Los niveles de biomarcadores se pueden medir en uno o más puntos de tiempo durante todo el curso del tratamiento y se compararon con el nivel antes del tratamiento o de un punto de tiempo anterior de un curso de tratamiento. La identificación o selección del tratamiento adecuado, la determinación si un paciente tiene respuesta positiva a un tratamiento y/o la optimización del tratamiento puede ser determinada con base en la evaluación de biomarcadores.

Composiciones Farmaceuticas La presente invención también proporciona composiciones que comprenden uno o más anticuerpos proporcionados. En algunas modalidades, la presente invención proporciona al menos un anticuerpo y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable. Tales composiciones farmacéuticas pueden comprender opcionalmente y/o pueden administrarse en combinación con una o más sustancias adicionales terapéuticamente activas. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas proporcionadas son útiles en la medicina. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas proporcionadas son útiles como agentes profilácticos (es decir, vacunas) en el tratamiento o prevención de la esclerodermia o ramificaciones negativas asociadas o correlacionadas con la esclerodermia. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas proporcionadas son útiles en aplicaciones terapéuticas, por ejemplo en individuos que sufren de o son susceptibles a la esclerodermia. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas se formulan para la administración a seres humanos.

Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas proporcionadas aquí pueden proporcionarse en una forma inyectable estéril (por ejemplo, una forma que es adecuada para la inyección subcutánea o infusión intravenosa). Por ejemplo, en algunas modalidades, se proporcionan composiciones farmacéuticas en una forma de dosificación líquida que es adecuada para la inyección. En algunas modalidades, se proporcionan composiciones farmacéuticas como polvos (por ejemplo, liofilizados y/o esterilizados), opcionalmente bajo vacío, que se reconstituyen con un diluyente acuoso (por ejemplo, agua, amortiguador, solución salina, etc.) antes de la inyección. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas se diluyen y/o reconstituyen en agua, solución de cloruro de sodio, solución de acetato de sodio, solución de alcohol bencílico, solución salina amortiguada con fosfato, etc. En algunas modalidades, el polvo se debe mezclar suavemente con el diluyente acuoso (por ejemplo, no sacudido).

En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas proporcionadas son comprenden uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables (por ejemplo, conservador, diluyente inerte, agente dispersante, agente tensioactivo y/o emulsionante, agente amortiguador, etc.). En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas comprenden uno o más conservadores. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas no comprenden conservador.

En algunas modalidades, se proporcionan composiciones farmacéuticas en una forma que se puede refrigerar y/o congelar. En algunas modalidades, se proporcionan composiciones farmacéuticas en una forma que no se puede refrigerar y/o congelar. En algunas modalidades, las soluciones reconstituidas y/o formas de dosificación líquidas pueden ser almacenadas durante un cierto período de tiempo después de la reconstitución (por ejemplo, 2 horas, 12 horas, 24 horas, 2 días, 5 días, 7 días, 10 días, 2 semanas, un mes, dos meses o más). En algunas modalidades, el almacenamiento de las composiciones de anticuerpos por más tiempo que el tiempo especificado resulta en la degradación del anticuerpo.

Las formas farmacéuticas líquidas y/o soluciones reconstituidas pueden comprender materia particulada y/o decoloración antes de la administración. En algunas modalidades, una solución no debe utilizarse si está decolorada o turbia y/o si la materia particulada permanece después de la filtración.

Las composiciones de las composiciones farmacéuticas descritas en la presente se pueden preparar por cualquier método conocido o desarrollado después en la téenica de la farmacología. En algunas modalidades, tales métodos de preparación incluyen la etapa de poner el ingrediente activo en asociación con uno o más excipientes y/o uno o más de otros ingredientes auxiliares, y luego, si es necesario y/o deseable, conformar y/o envasar el producto en una unidad de dosis única o múltiple deseada.

Una composición farmacéutica de acuerdo con la invención pueden prepararse, envasarse y/o venderse a granel, como una dosis unitaria única, y/o como una pluralidad de dosis unitarias únicas. Como se usa en la presente, una "dosis unitaria" es cantidad discreta de la composición farmacéutica que comprende una cantidad predeterminada del ingrediente activo. La cantidad del ingrediente activo es generalmente igual a una dosis que se administra a un sujeto y/o una fracción conveniente de tal dosis tal como, por ejemplo, una mitad o un tercio de tal dosis.

Las cantidades relativas de ingrediente activo, excipiente farmacéuticamente aceptable, y/o cualquiera de los ingredientes adicionales en una composición farmacéutica de acuerdo con la invención puede variar, dependiendo de la identidad, tamaño, y/o condición del sujeto tratado y/o dependiendo de la vía por la cual la composición se va a administrar. A modo de ejemplo, la composición puede comprender entre 0.1% y el 100% (p/p) de ingrediente activo.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden comprender adicionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable, que como se usa en la presente, puede ser o comprender solventes, medios de dispersión, diluyentes, u otros vehículos líquidos, auxiliares de dispersión o suspensión, agentes tensioactivos, agentes isotónicos, espesantes o emulsionantes, conservadores, aglutinantes sólidos, lubricantes y similares, como se adapte a la forma de dosificación particular deseada. Remington's The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro, (Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006) describe diversos excipientes utilizados en la formulación de composiciones farmacéuticas y téenicas conocidas para la preparación de los mismos. Excepto en la medida en que cualquier medio excipiente convencional sea incompatible con una sustancia o de sus derivados, tal como mediante la producción de cualquier efecto biológico indeseable o interactuar de otro modo de una manera perjudicial con cualquier otro componente de la composición farmacéutica, su uso está contemplado dentro del alcance de esta invención.

EJEMPLOS Ejemplo 1. Preparación de anticuerpos anti-CCL2 de alta afinidad Este ejemplo ilustra la preparación de anticuerpos anti-CCL2 de alta afinidad. Como se describió anteriormente, varios métodos están disponibles para generar y seleccionar anticuerpos con especificidades y afinidades de unión deseadas.

En este ejemplo particular, el anticuerpo anti-CCL2 se compone de un anticuerpo humano completo que comprende dos brazos de unión al antígeno de longitud completa. Los ratones transgénicos que expresan genes de anticuerpos humanos son inmunizados inicialmente con CCL2 recombinante humano purificado en adyuvante completo de Freund mediante inyección subcutánea. Después de la inmunización inicial, cada uno de los ratones recibe una inyección subcutánea adicional una vez a la semana durante tres semanas. Los esplenocitos se recolectaron de los ratones con altos títulos de anticuerpos, como se determina por ELISA, y se fusionan a una línea celular de mieloma de ratón como sigue. Las suspensiones de células individuales de esplenocitos de ratones inmunizados se fusionan a una cuarta parte del número de células de mieloma no secretadas de ratón con 50% de PEG. Las células se colocaron en placa a aproximadamente 1 x 105/cavidad en placas de microtitulación de fondo plano, seguido de una incubación de una semana. Los cavidades individuales luego se seleccionaron por ELISA para anticuerpos IgG monoclonales anti-CCL2 humanos. Una vez que ocurre el crecimiento extensivo de hibridoma, los hibridomas que secretan anticuerpos se volvieron a colocar en placas, se examinaron de nuevo y, si siguen siendo positivos para IgG humana, los anticuerpos monoclonales anti-CCL2 se subclonan al menos dos veces por dilución limitante.

Alternativamente, los anticuerpos se pueden aislar directamente del ADN que codifica los dominios VH y VL de células B positivas antígeno único de ratones transgénicos inmunizados (como se describió anteriormente) empleando citometría de flujo. Brevemente, los ratones transgénicos inmunizados con CCL2 humano se terminaron y los esplenocitos se recolectaron. Los glóbulos rojos se removieron por lisis seguido de la granulación de los esplenocitos recolectados. Los esplenocitos resuspendidos se incubaron primero con un cóctel de IgG humana, FITC-anti-mFc , y CCL2 humano biotinilado durante 1 hora. Las células teñidas se lavaron dos veces con PBS, luego se tiñeron con un cóctel de IgG humana y de rata, APC-anti-mlgM, y SA-PE durante una hora.

Las células teñidas se lavaron una vez con PBS y después se analizaron por citometría de flujo en un M0F10™ XDP (Beckman Coulter, Inc.). Cada célula B positiva a IgG, negativa a IgM, y positiva a antígeno se clasificó y se colocó en placas en un cavidad separada en una placa de 96 cavidades. RT-PCR de genes de anticuerpos de estas células B se realizó de acuerdo con un método descrito por Wang et al. (2000, J. Immunol Methods 244:217-225). Los productos de PCR de cadena pesada y cadena ligera se clonaron en vectores que contienen una región constante de cadena pesada humana (por ejemplo, IgGj.) y una región constante de cadena ligera humana (por ejemplo, CK), respectivamente. Los plásmidos recombinantes purificados que tienen una secuencia de región variable de cadena pesada y plásmidos que tienen una secuencia de región variable de cadena ligera de la misma célula B luego se combinaron y se transíectaron en una línea de célula huésped (por ejemplo, una línea celular CHO).

Además de inmunización clásica de ratón, se pueden utilizar también otros métodos de selección de anticuerpos basados en camélidos o expresión en fagos. Los anticuerpos de alta afinidad se seleccionan utilizando ensayos estándar de unión al receptor. Los anticuerpos con afinidad mayor que 10~ 12 M se purifican.

Ejemplo 2. Pruebas de intervalo de dosis Este ejemplo ilustra un estudio de respuesta a la dosis diseñado para evaluar los intervalos de dosis eficaces de anticuerpo anti-CCL2 para el tratamiento de la esclerodermia.

Un modelo de ratón con esclerodermia inducida por bleomicina se utilizó en este ejemplo. Típicamente, la fibrosis se indujo en ratones mediante inyección subcutánea repetida de bleomicina, ácido poliinosínico-policitidílico y/o LPS en la piel dorsal. Específicamente, bombas osmóticas (7 días) que contienen ya sea bleomicina a una concentración de 10-110 mg y hasta 200 pg de LPS a una concentración de 300 pg, ácido policitidílico a una concentración de 100 pg o PBS solo, se implantaron por vía subcutánea en grupos de 10 ratones B6. En este modelo de ratón, los cambios histopatológicos en la piel se asemejan estrechamente a la observada en la esclerodermia. La acumulación de células mononucleares temprana y TGF-b sobrerregulado y la expresión de quimiocinas es seguida por fibrosis dérmica caracterizada por haces de colágeno gruesos y la acumulación de fibroblastos activados. Los ratones también manifiestan evidencia de fibrosis pulmonar y renal.

Las dosis de un anticuerpo anti-CCL2 o un anticuerpo de control de concentraciones crecientes se administraron a llooss rraattoonneess mmeeddiiaannttee inyección intraperitoneal.

Ejemplo 3. Eficacia in vivo del anticuerpo anti- CCL2 Este ejemplo ilustra un estudio diseñado para evaluar el efecto del tratamiento con anticuerpos anti-CCL2 en la inflamación y fibrosis en el modelo de ratón con bleomicina para la esclerodermia Bombas osmóticas de 7 o 28 días que contienen ya sea PBS solo o 10-110 mg y hasta 200 pg de bleomicina en PBS se implantaron subcutáneamente en ratones B6. Cada dos días, los ratones se trataron mediante inyección intraperitoneal con anticuerpo anti-CCL2 a concentraciones adecuadas, como se determina en el ejemplo 2, o con un anticuerpo de control.

Después de 7 días, en el caso de una bomba osmótica de 7 días, o 28 días, en el caso de una bomba osmótica de 28 días, la piel y el tejido pulmonar se recolectaron para el análisis transcripcional e histológico. Los niveles de proteína de CCL2 en muestras de tejido se midió por ELISA. Para el análisis transcripcional, el ARN se extrajo de tejido de la piel y el ARN aislado está sujeto a y PCR de transcriptasa inversa semicuantitativa o cuantitativa usando téenicas comúnmente conocidas en la técnica. Los niveles de expresión de gen de TGF y los niveles de expresión de gen de genes pro-inflamatorios, incluyendo pero no limitado a PAI1, COMP, COLlal, F4/80, IL-6 y TNFOÍ se midieron utilizando cebadores disponibles comercialmente (TaqMan®) (TaqMan). Para el análisis histológico, la fibrosis de la piel se analizó mediante examen microscópico de secciones de tejido teñidas con hematoxilina y eosina (H&E). El uso de la tinción de H&E para visualizar la morfología del tejido es bien conocido en la téenica. La inmunohistoquímica se utilizó para cuantificar la infiltración de monocitos mediante el examen microscópico de secciones de tejido sondeadas con el anticuerpo anti-F4/80 específico de monocito usando técnicas bien conocidas en la técnica. prevé que el tratamiento con anticuerpo anti-CCL2 reducirá la infiltración de monocitos y macrófagos, reducirá la expresión génica inflamatoria (ej., IL-6, TNFa), y disminuirá la expresión del gen marcador inducida por TGF . Esto se espera que resulte en una disminución general en la fibrosis.

Ejemplo 4. Modelado terapéutico Este ejemplo ilustra un modelo de producción de CCL2 y renovación en diversos tejidos y plasma para predecir los niveles objetivo de tejidos.

Típicamente, el CCL2 se produce en los tejidos de la enfermedad y se secreta en el plasma. En individuos sanos, la síntesis de CCL2 en la piel es baja o indetectable. La síntesis de CCL2 aumenta con la afectación de piel total, tanto de piel no afectada y afectada, lo que lleva a un aumento de niveles de CCL2 en suero. Los niveles de CCL2 en suero aumentan adicionalmente con el involucramiento de órganos. Típicamente, los individuos sanos tienen un nivel de CCL2 en suero promedio de menos de aproximadamente 100 mg/ml. Los individuos que tienen fenómeno de Raynaud así llamado tienen niveles de CCL2 en suero promedio ligeramente aumentados. Los pacientes que sufren de esclerosis típicamente tienen un nivel de CCL2 en suero promedio de aproximadamente 250 pg/ml. Los pacientes que sufren de esclerosis sistémica cutánea limitada típicamente tienen un nivel de CCL2 en suero promedio de aproximadamente 250 pg/ml. Los pacientes que sufren de esclerosis sistémica cutánea difusa típicamente tienen un nivel de CCL2 en suero promedio de aproximadamente 380 pg/ml. Los pacientes que sufren de esclerosis sistémica cutánea limitada típicamente tienen un nivel de CCL2 en suero promedio de aproximadamente 250 pg/ml.

El peso molecular de CCL2 es de aproximadamente 8.6 kDa, que es mucho menor que el umbral de filtración glomerular de aproximadamente 50 kDa, lo que resulta en la depuración renal rápida. El CCL2 es internalizado por la internalización mediada por receptor activo. La Kd típica para CCL2 para unirse a su receptor CCR2 es aproximadamete 60 pM-2 nM. El CCR2 está presente principalmente en las células de origen linfoide y endotelio linfático. Se contempla que las causas de esclerodermia aumentan la permeabilidad vascular temprana en la progresión de la enfermedad, lo que permite el equilibrio sustancial de CCL2 y cualquier anticuerpo terapéutico entre el intersticio y suero. Por lo tanto, la vida media en suero de CCL2 es aproximadamente 10 minutos con base en los datos de ratones y conejos. Se espera que la vida media en suero de CCL2 en los seres humanos sea similar. El tejido relativamente permeable permite que el CCL2 alcance el equilibrio de tejido a suero (mitad máxima) de forma rápida, por ejemplo en aproximadamente 2 horas. En algunos casos, el nivel de CCL2 en suero puede alcanzar 1000 pg/ml (~ 75 pM) con la participación de toda la piel, pero sin la participación de órganos. Un perfil de objetivo que muestra equilibrio de CCL2 en suero y tejido se muestra en la Figura 2, que predice la cantidad deseada de anticuerpos necesarios para neutralizar 3 nM de CCL2 en tejido y compite con su receptor. El modelo ilustrado representa una presentación extrema de altos niveles de CCL2.

Los anticuerpos monoclonales actualmente disponibles inyectados por vía intravenosa típicamente no son eficaces porque se unen a CCL2 en el plasma y forman un complejo antes de que alcancen los tejidos enfermos. Veáse la Figura 3. Al proporcionar anti-CCL2 que es de alta afinidad, podemos proporcionar suficiente anticuerpo anti-CCL2 para unir CCL2 en el tejido y competir con la afinidad de 60 pM para CCR2.

Ejemplo 5. Diseño clínico Con base en el éxito de los tratamientos de animales, la dosis de Fase I-III variada y estudios de dosis única de anticuerpo anti-CCL2 detalladas en las Tablas 2-6 se diseñan en individuos sanos e individuos con diferentes etapas de la esclerodermia para evaluar la seguridad, tolerabilidad, eficacia y farmacocinética de la terapia anti-CCL2 .

Un objetivo primario del ensayo clínico en humanos 1 incluye determinar la seguridad de los 4 niveles de dosis de anticuerpo anti-CCL2 administrados en individuos sanos.

Los objetivos secundarios incluyen evaluar la farmacocinética de 4 niveles de dosis diferentes de anticuerpo anti-CCL2 administrados en individuos sanos. Una sinopsis de protocolo detallada de este ensayo clínico se muestra en la Tabla 2.

Tabla 2: Ensayo Clínico en Humanos 1 Un objetivo primario del ensayo clínico en humanos 2 incluye determinar la seguridad de los 4 niveles de dosis de anticuerpo anti-CCL2 administrados en individuos con síntomas tempranos de la esclerodermia. Los objetivos secundarios incluyen (1) determinar la farmacocinética de 4 niveles de dosis diferentes de anticuerpo anti-CCL2 administrados en individuos con síntomas tempranos de la esclerodermia (2) determinar la respuesta farmacodinámica (PD) de los individuos con síntomas tempranos de la esclerodermia a 4 niveles de dosis diferentes de anticuerpo anti-CCL2 mediante el ensayo de la expresión génica en biopsias secuenciales de la piel y (3) determinar la respuesta clínica de los individuos con síntomas tempranos de la esclerodermia a 4 niveles de dosis diferentes de anticuerpo anti-CCL2, como se mide por la Puntuación de Piel de Rodnan Modificada (mRSS). Una sinopsis de protocolo detallada de este ensayo clínico se muestra en la Tabla 3.

Tabla 3: Ensayo Clínico en Humanos 2 Un objetivo primario del ensayo clínico en humanos 3 incluye determinar la eficacia de un nivel de dosis única de anticuerpo anti-CCL2 administrado en individuos con síntomas tempranos de la esclerodermia como se mide por la Puntuación de Piel Rodnan Modificada (mRSS). Los objetivos secundarios incluyen (1) determinar la eficacia de un nivel de dosis única de anticuerpo anti-CCL2 administrado en individuos con síntomas tempranos de la esclerodermia como se mide por el Cuestionario de Evaluación de Salud - índice de Discapacidad (HAQ - DI) y (2) determinar la eficacia de un nivel de dosis única de anticuerpo anti-CCL2 administrado en individuos con síntomas tempranos de la esclerodermia como se mide por las evaluaciones específicas de órganos. Una sinopsis de protocolo detallada de este ensayo clínico se muestra en la Tabla 4.

Tabla 4: Ensayo Clínico en Humanos 3 Un objetivo primario de ensayo clínico en humanos 4 incluye determinar la eficacia relativa a la ciclofosfamida oral de un nivel de dosis única de anticuerpo anti-CCL2 administrado en individuos con esclerodermia limitada o difusa con enfermedad pulmonar como se mide por la capacidad vital forzada (FVC). Los objetivos secundarios incluyen (1) determinar la eficacia relativa a la ciclofosfamida oral de un nivel de dosis única de anticuerpo anti-CCL2 administrado en individuos con esclerodermia limitada o difusa con enfermedad pulmonar medida por el HAQ - DI, (2) determinar la eficacia relativa a ciclofosfamida oral de un nivel de dosis única de anticuerpo anti-CCL2 administrado en individuos con esclerodermia limitada o difusa con enfermedad pulmonar como se mide por el mRSS, y (3) determinar la eficacia relativa a la ciclofosfamida oral de un nivel de dosis única de anticuerpo anti-CCL2 administrado en individuos con esclerodermia limitada o difusa con enfermedad pulmonar como se mide por la capacidad de difusión del pulmón para el monóxido de carbono (DLCO). Una sinopsis de protocolo detallada de este ensayo clínico se muestra en la Tabla 5.

Tabla 5: Ensayo Clínico en Humanos 4 El objetivo de ensayo clínico en humanos 5 incluye (1) determinar la eficacia relativa a la ciclofosfamida oral de un nivel de dosis única de anticuerpo anti-CCL2 administrado en individuos con síntomas tempranos de la esclerodermia y/o esclerodermia limitada o difusa con enfermedad pulmonar como se mide por la capacidad vital forzada (FVC), (2) determinar la eficacia relativa a la ciclofosfamida oral de un nivel de dosis única de anticuerpo anti-CCL2 administrado en individuos con síntomas tempranos de la esclerodermia y/o esclerodermia limitada o difusa con enfermedad pulmonar medida por HAQ - DI, (3) determinar la eficacia relativa a la ciclofosfamida oral de un nivel de dosis única de anticuerpo anti-CCL2 administrado en individuos con síntomas tempranos de la esclerodermia y/o esclerodermia limitada o difusa con enfermedad pulmonar medida por mRSS, y (4) determinar la eficacia relativa a la ciclofosfamida oral de un nivel de dosis única de anticuerpo anti-CCL2 administrado en individuos con síntomas tempranos de la esclerodermia y/o esclerodermia limitada o difusa con enfermedad pulmonar medida por DLCO. Una sinopsis de protocolo detallada de este ensayo clínico se muestra en la Tabla 6.

Tabla 6: Ensayo Clínico en Humanos 5 Se espera que los pacientes que exhiben síntomas tempranos de la esclerodermia tratados con anticuerpo anti-CCL2 demuestren una mejora significativa de los síntomas como se mide por el mRSS y HAQ - DI. Se espera que los pacientes con esclerodermia limitada o difusa con enfermedad pulmonar tratados con anticuerpo anti-CCL2 demuestren una mejora significativa de los síntomas como se mide por el mRSS, HAQ -DI, y FVC. Se espera que el anticuerpo anti-CCL2 sea más eficaz que la ciclofosfamida en el tratamiento de los pacientes, ya sea con síntomas tempranos de la esclerodermia o con esclerodermia limitada o difusa con enfermedad pulmonar como se mide por mRSS, HAQ - DI, y/o FVC.

Equivalencias y Alcance Los expertos en la téenica reconocerán, o serán capaces de determinar usando no más que experimentación rutinaria, muchos equivalentes a las modalidades específicas de la invención descritas en la presente. El alcance de la presente invención no pretende ser limitado a la descripción anterior, sino más bien es como se describe en las reivindicaciones adjuntas.

En las reivindicaciones los artículos tales como "un", "una" y "el" pueden significar uno o más de uno, a menos que se indique lo contrario o de otra manera sea evidente por el contexto. Así, por ejemplo, la referencia a "un anticuerpo" incluye una pluralidad de tales anticuerpos, y la referencia a "la célula" incluye la referencia a una o más células conocidas por aquellos expertos en la técnica, y así sucesivamente. Las reivindicaciones o descripciones que incluyen "o" entre uno o más miembros de un grupo se consideran satisfechos si uno, más de uno, o todos los miembros del grupo están presentes en, empleado en, o de otra manera relevante a un producto o proceso dado a menos que se indique lo contrario o de otro modo sea evidente por el contexto. La invención incluye modalidades en las cuales exactamente un miembro del grupo está presente en, empleados en, o de otro modo relevantes para un producto o proceso proporcionado. La invención incluye modalidades en las cuales más de uno, o todos los miembros del grupo están presentando, empleado en, o de otra manera relevante para un producto o proceso proporcionado. Además, se debe entender que la invención abarca todas las variaciones, combinaciones y permutaciones en las cuales una o más limitaciones, elementos, cláusulas, términos descriptivos, etc., de una o más de las reivindicaciones enumeradas se introducen en otra reivindicación. Por ejemplo, cualquier reivindicación que sea dependiente de otra reivindicación puede ser modificada para incluir una o más limitaciones encontradas en cualquier otra reivindicación que sea dependiente de la misma reivindicación de base. Además, donde las reivindicaciones enumeran una composición, es de entenderse que se incluyen los métodos de uso de la composición para cualquiera de los propósitos descritos en la presente, y se incluyen los métodos de producción de la composición de acuerdo con cualquiera de los métodos de producción descritos en la presente u otros métodos conocidos en la téenica, a menos que se indique lo contrario o a menos que sea evidente para un experto normal en la técnica lo que derivaría en una contradicción o inconsistencia.

Cuando los elementos se presentan como listas, por ejemplo, en formato de grupo Markush, es de entenderse que cada subgrupo de los elementos también se da a conocer, y cualquier elemento(s) puede ser eliminado del grupo. Se debe entender que, en general, en la invención, o aspectos de la invención, es/son referidos como que comprende elementos, características, etc., particulares, ciertas modalidades de la invención o aspectos de la invención consisten de, o consisten esencialmente de, tales elementos, características, etc. Para propósitos de simplicidad aquellas modalidades no se han establecido específicamente en el verba haec en la presente. Se hace notar que el término "que comprende" pretende estar abierto y permite la inclusión de elementos o etapas adicionales.

Cuando se dan los intervalos, se incluyen criterios de valoración. Además, se debe entender que a menos que se indique lo contrario o de otro modo sea evidente a partir del contexto y sea comprendido por un experto ordinario en la téenica, los valores que se expresan como intervalos pueden asumir cualquier valor específico o sub-intervalo dentro de los intervalos establecidos en diferentes modalidades de la invención, a la décima parte de la unidad del límite inferior del intervalo, a menos que el contexto dicte claramente lo contrario.

Además, se debe entender que cualquier modalidad particular de la presente invención que cae dentro de la técnica anterior, puede ser excluida explícitamente de una o más de las reivindicaciones. Puesto que tales modalidades se considera que son conocidas para un experto normal en la técnica, pueden ser excluidos incluso si la exclusión no se establece explícitamente en la presente. Cualquier modalidad particular de las composiciones de la invención (por ejemplo, cualquier genotipo/subtipo de HCV, cualquier anticuerpo HCV, cualquier epítope, cualquier composición farmacéutica, cualquier método de administración, cualquier aplicación terapéutica, etc.) puede ser excluida de una o más reivindicaciones, por cualquier razón, esté o no relacionado con la existencia de la téenica anterior.

Las publicaciones descritas anteriormente y en todo el texto se proporcionan únicamente para su descripción antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada en la presente debe interpretarse como una admisión de que los inventores no tienen derecho a antedatar dicha divulgación en virtud de la descripción anterior.

Obras modalidades Los expertos en la técnica apreciarán fácilmente que lo anterior representa solamente ciertas modalidades preferidas de la invención. Varios cambios y modificaciones en los procedimientos y composiciones descritas anteriormente se pueden hacer sin apartarse del espíritu o alcance de la presente invención, como se expone en las siguientes reivindicaciones.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método de tratamiento de la esclerodermia, caracterizado porque comprende administrar a un individuo que sufre de o es susceptible a la esclerodermia, una cantidad eficaz de anticuerpo anti-CCL2, o fragmento del mismo, de tal manera que al menos un síntoma o característica de la esclerodermia en un tejido objetivo se reduce en intensidad, severidad o frecuencia, o se ha retrasado su inicio.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque al menos un síntoma o característica de la esclerodermia se selecciona del daño de las células endoteliales, proliferación de capas de lámina basal, infiltración de células mononucleares perivasculares, fibrosis, alteración de la arquitectura de órganos viscerales, rarefacción de los vasos sanguíneos, hipoxia, y combinación de los mismos.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el tejido objetivo se selecciona del grupo que consiste de la piel, vasos sanguíneos, pulmón, corazón, riñón, tracto gastrointestinal (incluyendo el hígado), sistema musculoesquelético y combinaciones de los mismos.

4. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el tejido objetivo es el pulmón.

5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque el tejido objetivo es el corazón.

6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el individuo está sufriendo de o es susceptible a la esclerodermia cutánea limitada.

7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el individuo está sufriendo o es susceptible a la esclerodermia cutánea difusa.

8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el anticuerpo anti-CCL2, o fragmento del mismo, se administra parenteralmente.

9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la administración parenteral se selecciona de la administración intravenosa, intradérmica, inhalación, transdérmica (tópica), subcutánea, y/o transmucosal.

10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la administración parenteral es la administración intravenosa.

11. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizado porque el anticuerpo anti-CCL2, o fragmento del mismo, se administra por vía oral.

12. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el anticuerpo anti-CCL2, o fragmento del mismo, se administra cada dos meses, mensual, cada tres semanas, quincenal, semanal, diario, o a intervalos variables.

13. Un método de tratamiento de la esclerodermia caracterizado porque comprende administrar a un individuo que sufre de o es susceptible a la esclerodermia, un anticuerpo anti-CCL2, o fragmento del mismo, que tiene una afinidad de unión mayor que 1012 M

14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el anticuerpo anti-CCL2, o fragmento del mismo, se administra a una dosis terapéuticamente eficaz y un intervalo de administración de tal manera que el anticuerpo anti-CCL2, o fragmento del mismo, se distribuye a uno o más tejidos objetivo seleccionados del grupo que consiste de la piel, vasos sanguíneos, pulmón, corazón, riñón, tracto gastrointestinal (incluyendo el hígado), sistema musculoesquelético y combinaciones de los mismos.

15. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el anticuerpo anti-CCL2, o fragmento del mismo, se administra a una dosis terapéuticamente eficaz y un intervalo de administración de tal manera que el anticuerpo anti-CCL2, o fragmento del mismo, se distribuye a los pulmones y/o el corazón.

16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el intervalo de administración se selecciona de cada dos meses, mensual, cada tres semanas, quincenal, semanal, diario, o a intervalos variables.

17. Un método de tratamiento de esclerodermia caracterizado porque comprende administrar a un individuo que sufre de o es susceptible a la esclerodermia, un anticuerpo anti-CCL2, o fragmento del mismo, a una dosis terapéuticamente eficaz y un intervalo de administración de tal manera que el anticuerpo anti-CCL2, o fragmento del mismo, se distribuye al pulmón y/o el corazón.

18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el anticuerpo anti-CCL2, o fragmento del mismo, se distribuye adicionalmente a la piel, riñón, y/o hígado.

19. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el anticuerpo anti-CCL2, o fragmento del mismo, se selecciona del grupo que consiste de IgG intacta, F(ab' ) 2, F(ab)2, Fab', Fab, scFv, diacuerpos, triacuerpos y tetracuerpos.

20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el anticuerpo anti-CCL2, o fragmento del mismo, es un anticuerpo monoclonal.

21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el anticuerpo anti-CCL2, o fragmento del mismo, es un anticuerpo monoclonal humanizado.

22. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el anticuerpo anti-CCL2, o fragmento del mismo, es un anticuerpo humano.

23. Un anticuerpo anti-CCL2, o fragmento del mismo, caracterizado porque tiene una afinidad de unión mayor que 1012 M.

24. El anticuerpo anti-CCL2 de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el anticuerpo anti-CCL2, o fragmento del mismo, tiene una afinidad de unión mayor que 1013M.

25. El anticuerpo anti-CCL2 de conformidad con la reivindicación 23 o 24, caracterizado porque el anticuerpo anti-CCL2, o fragmento del mismo, se selecciona del grupo que consiste de IgG intacta, F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab, scFv, diacuerpos, triacuerpos y tetracuerpos.

26. El anticuerpo anti-CCL2 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23-25, caracterizado porque el anticuerpo anti-CCL2, o fragmento del mismo, es un anticuerpo monoclonal.

27. El anticuerpo anti-CCL2 de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el anticuerpo anti-CCL2, o fragmento del mismo, es un anticuerpo monoclonal humanizado.

28. El anticuerpo anti-CCL2 de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el anticuerpo anti-CCL2, o fragmento del mismo, es un anticuerpo humano.

29. Un kit caracterizado porque comprende un anticuerpo anti-CCL2, o fragmento del mismo, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23-28. RESUMEN DE LA INVENCION La presente invención proporciona, entre otras cosas, anticuerpos anti-CCL2 mejorados caracterizados con alta afinidad, potencia, selectividad de tejido y/o especificidad de epítope, y usos de los mismos, en particular, para el tratamiento de esclerodermia y enfermedades, trastornos y afecciones fibróticas y/o inflamatorias relacionadas. En algunas modalidades, la presente invención proporciona métodos y composiciones para el tratamiento de esclerodermia y enfermedades, trastornos y afecciones fibróticas y/o inflamatorias relacionadas basados en un anticuerpo anti-CCL2 que tiene una afinidad de 1012M o mayor.