MX2014014123A - Uso de n-acetil-5-metoxi-triptamina o analogos de la misma para potenciar el mecanismo de implantacion del embrion, y composiciones y medios de cultivo relacionados. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere al uso de N-acetil-5-metoxi-tript amina (melatonina) y/o un análogo de la misma para su uso en la reproducción asistida, en los campos médico o veterinario, con el fin de promover el mecanismo de implantación del embrión y, en particular, de prevenir el fracaso en la implantación en el útero, mediante la administración tópica de una cantidad eficaz en una hembra de un sujeto mamífero que necesita tal tratamiento, y composiciones, medios de cultivo y dispositivos médicos relacionados.

Description

USO DE N-ACETIL-5-METOXI-TRIPTAMINA O ANÁLOGOS DE LA MISMA PARA POTENCIAR EL MECANISMO DE IMPLANTACIÓN DEL EMBRIÓN. Y COMPOSICIONES Y MEDIOS DE CULTIVO RELACIONADOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al uso de /V-acetil-5-metoxi-triptamina (melatonina) y/o un análogo de la misma para su uso en la reproducción asistida, en el campo médico o veterinario, con el fin de promover el mecanismo de implantación del embrión y, en particular, de prevenir el fracaso en la implantación en el útero, mediante la administración tópica de una cantidad eficaz en una hembra de mamífero que necesita tal tratamiento, y composiciones, medios de cultivo y dispositivos médicos relacionados.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La implantación del embrión humano en el útero es un mecanismo complejo en el que participa tanto el embrión como el epitelio endometrial. Las fases de aposición, adhesión e invasión implican una multiplicidad de moléculas, que desempeñan un papel único en el procedimiento, y el diálogo molecular entre el concebido y el endometrio implica interacciones entre las células, y entre las células y los factores bioquímicos.

Estos mecanismos, si se expresan o inhiben adecuadamente, son de ayuda para determinar el estado de receptividad o de no receptividad del endometrio con respecto al embrión.

El estado de receptividad o de no receptividad endometrial, aunque es un concepto ampliamente extendido, es difícil de definir desde el punto de vista clínico: la normalidad histológica del endometrio no implica necesariamente una normalidad funcional; por otro lado, la expresión en el tiempo y el espacio de determinadas estructuras endometriales, denominadas pinópodos, es un potente indicador del propio estado de receptividad.

La implantación es una secuencia compleja de señales que son cruciales para que se produzca el embarazo. Se supone que, en la interacción entre el embrión y el endometrio, participa un gran número de mediadores moleculares bajo la influencia de las señales del ovario. Estos mediadores comprenden una amplia selección de moleculas tales como hormonas, citoquinas, factores de crecimiento, lípidos, moléculas de adhesión, etc. (1).

El fracaso en la implantación de las teenologías de reproducción asistida (TRA) sigue siendo un problema sin resolver, y se considera uno de los principales motivos de la infertilidad en las mujeres sanas. Considerando entonces que el porcentaje de implantación de las técnicas TRA es de aproximadamente el 25 %, se considera que la receptividad uterina inadecuada es la responsable de aproximadamente dos tercios de todos los fracasos (pues, en un tercio de los mismos, la responsabilidad se atribuye al embrión) (2).

El endometrio es receptor de la invasión del blastocisto durante un intervalo de tiempo limitado y definido como la "ventana de implantación". El "diálogo" para la sincronización entre "las fases de crecimiento embrionario de la primera ovulación y las modificaciones celulares del epitelio endometrial para la implantación" es mantenido por una serie de mensajeros hormonales y bioquímicos.

Durante la "ventana de implantación", el epitelio endometrial expresa, a través del control hormonal y bioquímico, algunas estructuras denominadas pinópodos, capaces de permitir la adhesión y la invasión del blastocisto. La ventana de implantación se caracterizaría, de acuerdo con los estudios de microscopía electrónica (3), por la expresividad máxima de los pinópodos.

La formación de los pinópodos se considera un marcador específico de la receptividad endometrial. Aparecen aproximadamente una semana después de la ovulación, pero su expresión completa cambia de una paciente a otra y parece mantenerse solamente durante un día (4).

La expresión de los pinópodos es directamente proporcional al aumento de los niveles plasmáticos de progesterona (5).

El concepto de receptividad endometrial o "ventana de implantación", en relación con la expresión de los pinópodos, aceptado de manera unánime por la comunidad científica, lleva siendo durante algunas décadas la materia o de aquellos que se enfrentan a los problemas relacionados con la reproducción asistida.

En resumen, la progesterona, la hormona progestacional, es el mediador principal y, en torno a ella, gira una pluralidad de otros mediadores que pueden promover la implantación.

De lo mencionado anteriormente, se desprende cómo el problema de quedarse embarazada a traves de téenicas de reproducción asistida se puede atribuir principalmente al escaso conocimiento del fenómeno de la implantación.

Por lo tanto, parece evidente, también a la vista de las numerosas restricciones legislativas en el ámbito de la reproducción asistida, la necesidad de optimizar la fase de implantación.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Los autores de la presente invención han encontrado ahora que uno de los mediadores capaces de desempeñar un papel clave junto con la progesterona en la expresión de los pinópodos, con muchos efectos positivos para la anidación embrionaria, es la /V-acet¡l-5-metoxi-triptamina (melatonina).

La melatonina es producida por la glándula neuroendocrina pineal, controlada por la luz, pues la oscuridad estimula su síntesis y secreción.

El uso de la melatonina no tiene efectos secundarios ni problemas de sobredosis, y no se ha informado de ninguna contraindicación (6) en la literatura.

Son muchas las ventajas que ya se conocen y se asocian con el uso de la melatonina también en diferentes procedimientos que pueden interferir positivamente en la implantación. A este respecto, existe además una relación inversamente proporcional entre el riesgo de carcinoma del endometrio y los niveles de melatonina en suero con una acción protectora comprobada.

Algunos autores han demostrado (7) que la melatonina inhibe la proliferación de las células endometriales atípicas, denominadas células de Ishikawa, responsables del carcinoma de endometrio. A través de experimentos con radioligandos y antagonistas de la melatonina tales como el luzindol, los resultados del grupo de investigadores han demostrado que el efecto de inhibición es producido por la melatonina a través de los receptores MT2 presentes en las membranas de las células proliferativas de Ishikawa.

Otro aspecto determinante que cabe considerar es el período de la menopausia, durante el cual se reduce la producción de melatonina y, de hecho, durante tal período, el riesgo de carcinoma endometrial es superior.

Por ejemplo, estudios in vitro e in vivo (6, 8) han demostrado una potente acción antioxidante de la melatonina, siendo dicha acción superior a la del manitol, el glutatión y la vitamina E en la protección del daño oxidativo debido a los radicales hidroxilo tóxicos y a otros productos celulares catabólicos derivados de las variaciones producidas en el metabolismo degenerativo o proliferativo y de/para la oxidación de lípidos.

Además, la melatonina (9-10) tiene importantes propiedades antiestrogenicas y estimula la producción de progesterona, lo que está en antítesis con la acción de los propios estrógenos (los niveles altos de estrógenos se asocian con un peor resultado en las téenicas de reproducción asistida) (11).

En este sentido, cabe señalar que la superovulación a través de gonadotropinas inducida en ciclos de TRA, determina una hiperestrogenización con un aumento de la hiperplasia endometrial, un factor de riesgo significativo para el carcinoma endometrial como se ha mencionado anteriormente.

Algunos autores (12) afirman que existe un sinergismo entre las gonadotropinas coriónicas humanas (hCG) y la melatonina. De hecho, la melatonina aumenta, mediante el aumento, entre otras cosas, de la producción de progesterona (tanto in vivo como in vitro), 6-7 días después del pico ovulatorio de hCG.

A este respecto, cabe destacar cómo el pico postovulatorio de la melatonina coincide perfectamente con la ventana de implantación endometrial y con la formación del blastocisto (la etapa de crecimiento embrionario en la que se produce la anidación en el útero). La correlación positiva entre la melatonina y la progesterona, y la correlación negativa entre la melatonina y el estradiol serían potenciadas por las hCG. De efecto, en ausencia de estas últimas, la melatonina tiene un efecto muy débil sobre la producción de progesterona.

Uno de la presente invención es la A/-acetil-5-metoxi-triptamina o un análogo de la misma para su uso en la reproducción asistida, en el campo médico o veterinario, con el fin de prevenir el fracaso de la implantación en el útero mediante la administración tópica de una cantidad eficaz en una hembra de mamífero que necesita tal tratamiento.

Preferentemente, dicho análogo de /V-acetil-5-metoxi-triptamina se selecciona entre agomelatina, 6-hidroximelatonina, serotonina, 5-hidroxitriptófano o sus derivados.

En una realización preferida de la invención, la hembra de mamífero es una mujer que padece infertilidad o aborto de repetición.

De acuerdo con una realización preferida adicional, la administración tópica de A/-acetil-5-metoxi-triptamina o un análogo de la misma, preferentemente de /V-acetil-5-metoxi-triptamina, tiene lugar a traves de la irrigación endometrial, o del lavado del útero o del endometrio.

De acuerdo con una realización preferida adicional más de la invención, dicha administración tópica se produce en una sola administración en el momento de la extracción de los ovocitos.

Preferentemente, dicho principio activo está presente a una concentración que varía de 4 x 109 g/ml a 25 x 109 g/ml, y todavía más preferentemente superior o igual a 10 x 109 g/ml.

En una realización alternativa, es posible el uso concurrente con una terapia sistémica basada en A/-acetil-5-metoxi-triptamina, hCG o progesterona, o una combinación de las mismas, desde el día de la extracción de los ovocitos.

En realizaciones preferidas alternativas de la presente invención, las téenicas de reproducción asistida se seleccionan del grupo constituido por técnicas básicas o de nivel I, sencillas y poco invasivas, tales como el coito dirigido o la inseminación artificial intrauterina, y técnicas de nivel II o III, que son más complejas e invasivas, seleccionadas entre la fecundación in vitro (IVF), la fecundación in vitro y transferencia de embriones (FIVET), la inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI), inyección intracitoplasmática de espermatozoides morfológicamente seleccionados (IMSI) y las técnicas TESA-TESE (aspiración-extracción de espermatozoides testiculares).

La fecundación artificial se refiere principalmente a la técnica de inseminación intrauterina (IUI), que es una técnica de reproducción asistida en la que el fluido seminal se introduce en el interior de la cavidad uterina. Se puede sugerir en todos los casos de incompatibilidad entre el moco cervical y el líquido seminal, ya que permite llegar más allá de la longitud cervical e introducir los espermatozoides directamente en el útero. Tambien se usa en el caso de esterilidad sin causa aparente, de infertilidad masculina de grado leve o moderado, en los casos de fracasos reiterados en la inducción del embarazo con la estimulación de la ovulación y el coito dirigido, y en los casos de trastornos sexuales que impiden mantener relaciones sexuales completas.

La fecundación in vitro y transferencia de embriones (FIVET) es una téenica TRA en la que se extraen gametos humanos, se colocan én cultivo y, tras la fecundación y producción de uno o más embriones, éstos se transfieren al útero. Esta técnica se sugiere en los casos de: - patología tubárica congénita o adquirida; - infertilidad masculina de grado moderado; - endometriosis de nivel III o IV; - infertilidad sin causas aparentes; - semen liofilizado en relación con la calidad seminal, tras la descongelación; - fracaso del procedimiento terapéutico de técnicas de nivel I.

Tras la estimulación ovárica, se lleva a cabo la extracción de los ovocitos (EXTRACCIÓN) mediante operación transvaginal bajo control ecográfico, con anestesia local y/o sedación profunda, se efectúa la preparación de los espermatozoides y se seleccionan los ovocitos que se van a fecundar. A continuación, se prepara el cultivo extracorpóreo de gametos y, tras verificar que se ha producido la fecundación, se transfiere al útero un número definido de embriones.

La microinyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) usa diversas etapas de la FIVET. También en este caso, la fecundación es extracorpórea, pero se lleva a cabo con la inyección de un solo espermatozoide en el interior del citoplasma del ovocito. A continuación, una vez producida la fecundación, se transfieren los embriones al útero.

Esta técnica se sugiere en los casos de: - infertilidad masculina de grado severo; - azoospermia obstructiva y secretora (espermatozoides testiculares o epididimarios); - fecundación nula o reducida en ciclos previos de fecundación in vitro (IVF); - ovocitos descongelados; - número reducido de ovocitos; - semen liofilizado en relación con la calidad seminal tras la descongelación.

Esta teenica también se puede llevar a cabo en un ciclo espontáneo o mediante la inducción del crecimiento folicular múltiple y tras haberse estimulado el ovario para que produzca más folículos, y así, habiéndose obtenido más ovocitos, se lleva a cabo la extracción de los ovocitos (EXTRACCIÓN) mediante una operación transvaginal. Simultáneamente a la extracción, se lleva a cabo la preparación de los espermatozoides. En caso de azoospermia, las técnicas usadas para la retirada de los espermatozoides son: aspiración percutánea de espermatozoides testiculares (TESA), extracción de espermatozoides testiculares (TESE), aspiración microquirúrgica de espermatozoides epididimarios (MESA), aspiración percutánea de espermatozoides epididimarios (PESA).

Posteriormente, se llevan a cabo la preparación de los ovocitos y la inseminación de los ovocitos mediante la técnica de microinyección intracitoplasmática de un solo espermatozoide. Tras verificarse que se ha producido la fecundación de cada ovocito, se transfieren los embriones al útero.

Es un o adicional de la presente invención una composición adecuada para la administración tópica que comprende A/-acetil-5-metoxi-triptamina o un análogo de la misma, o una combinación de los mismos como principio activo, en una cantidad eficaz en una hembra de mamífero que necesita tal tratamiento, junto con uno o más excipientes o adyuvantes fisiológicamente aceptables, para su uso en la reproducción asistida, en el campo médico o veterinario, con el fin de prevenir el fracaso de la implantación en el útero.

Preferentemente, dicho principio activo está presente en la composición a una concentración que varía de 4 x 109 g/ml a 25 x 109 g/ml, preferentemente superior o igual a 10 x 109 g/ml.

De acuerdo con una realización preferida, el principio activo en la composición mencionada anteriormente se formula como irrigación/lavado endometrial/uterino en un medio de cultivo celular a una concentración final que varía de 4 x 109 g/ml a 25 x 109 g/ml, preferentemente superior o igual a 10 x 109 g/ml.

Tal medio de cultivo para el blastocisto puede comprender preferentemente los siguientes componentes: - fuente de D-glucosa; - antibiótico, preferentemente gentamicina; - albúmina de suero humano; - aminoácidos esenciales y no esenciales, preferentemente L-taurina; - sales tampón seleccionadas preferentemente entre: - sales de calcio: lactato de calcio, pantotenato de calcio; - sales de sodio: cloruro de sodio, bicarbonato de sodio y piruvato de sodio; - sales de potasio: cloruro de potasio, fosfato de potasio; - sales de magnesio: cloruro de magnesio, sulfato de magnesio y sus mezclas; - agua; y tiene un pH de entre 7,5 y 7,8.

De acuerdo con una realización preferida, dicho medio de cultivo puede ser medio de blastocisto Sydncy IVF®.

De acuerdo con una realización alternativa de la presente invención, el principio activo de la composición mencionada anteriormente se formula como irrigación endometrial, o lavado endometrial o uterino en solución fisiológica a una concentración final que varía de 4 x 109 g/ml a 25 x 109 g/ml, preferentemente superior o igual a 10 x 109 g/ml.

En las mujeres, el procedimiento de lavado de la cavidad uterina se ha usado comúnmente con el objetivo principal de establecer un diagnóstico prenatal no invasivo, innovador con respecto a los procedimientos tradicionales invasivos de amniocentesis y muestreo de vellosidades coriónicas [(13) (14)]. En los últimos años, tal teenica se ha aplicado para evaluar las condiciones de la cavidad uterina antes de transferir el embrión en los ciclos de reproducción asistida. La aplicación de este g procedimiento consta de la inserción en el útero de una solución tampón con el fin de recoger secreciones uterinas y la evaluación de sus componentes biológicos orgánicos e inorgánicos. Tiene el fin de identificar los posibles marcadores predictivos del exito de la implantación [(15) (16) (17) (18)].

Más preferentemente, dicha composición adecuada para la administración tópica a través del lavado uterino comprende además aminoácidos esenciales y no esenciales, y sales tampón. Preferentemente, dichas sales tampón son sales de calcio, sodio, potasio y magnesio, y mezclas de las mismas. El uso de sales tampón y aminoácidos se proporciona para producir una formulación con un pH comprendido entre 7 y 8 (preferentemente entre 7,5 y 7,8), con el fin de replicar el microambiente adecuado para el embrión* (y similar al del medio de cultivo en el que crece el embrión antes de la transferencia al útero).

De acuerdo con una realización alternativa, las composiciones de la invención se pueden formular en forma de gel adecuado para la administración uterina, más concretamente para la administración in situ en la cavidad uterina, preferentemente con un dispositivo médico que sea un dispositivo intrauterino "en forma de T". También es posible prever formulaciones de gel de liberación controlada para la administración mucosal.

Teniendo en cuenta que la téenica de lavado uterino descrita anteriormente ha resultado sér una práctica no invasiva y que permite la restauración de las condiciones fisiológicas del útero a través de la retirada mecánica de secreciones, que pueden alterar las condiciones de implantación, la invención tiene como objeto adicional un dispositivo médico para el lavado uterino que comprende un recipiente estéril previamente cargado o para cargarlo con una composición como se ha definido anteriormente.

Más concretamente, el dispositivo de acuerdo con la presente invención se puede cargar en el momento de su uso con una solución estéril adecuada para el lavado uterino o endometrial suplementada con el principio activo melatonina o análogo de la misma de acuerdo con la presente invención ya formado, o se puede cargar con tal solución estéril suplementada justo en el momento de su uso con el principio activo.

De acuerdo con una realización preferida, el recipiente esteril es desechable. Más preferentemente, el recipiente estéril (preferentemente, un recipiente estéril desechable) se carga previamente con solución fisiológica suplementada con melatonina (a una concentración que varía de 4 x 109 g/ml a 25 x 109 g/ml, preferentemente superior o igual a 10 x 109 g/ml), sales tampón y aminoácidos, de modo que se produzca una formulación con pH comprendido entre 7 y 8, preferentemente entre 7,5 y 7,8.

El lavado uterino se realizará con ayuda de un catéter tras la extracción con guía ecográfica. La posterior transferencia o implantación de los embriones tendrá lugar, como media, tres días después del lavado (2-5 días).

Por lo tanto, de acuerdo con realizaciones preferidas de la invención, el dispositivo médico de acuerdo con la invención puede comprender además un catéter flexible estéril, preferentemente con un solo orificio terminal.

La esterilidad de ios componentes de los dispositivos médicos se alcanza preferentemente a través del llenado estéril o la esterilización final, tal como el tratamiento de calentamiento o a través del tratamiento con radiación g.

Además, el dispositivo médico puede venir acompañado de instrucciones para su uso en las diversas téenicas TRA.

El fin del dispositivo médico es el de retirar las sustancias oxidantes y los posibles productos secretados en respuesta a la estimulación previa a las técnicas TRA y, por tanto, la restauración de la composición fisiológica del exudado endometrial. El objetivo es el de evitar que tales sustancias oxidantes y productos secretados reduzcan el porcentaje de implantación de las pacientes sometidas a TRA. Como se ha previsto anteriormente, se proporciona el uso de sales tampón y aminoácidos para establecer un pH comprendido entre 7 y 8, preferentemente entre 7,5 y 7,8, con el fin de replicar el microambiente adecuado para el embrión. La adición de melatonina, además de los efectos mostrados en la presente invención, ejerce un efecto antioxidante muy potente y una acción de seguridad frente a las células del endometrio contra el daño oxidativo debido a los radicales tóxicos y a otros productos catabólicos.

Preferentemente, dicho recipiente esteril desechable se selecciona entre jeringa, dispensador, cartucho de autoinyección/lapicero.

De acuerdo con realizaciones particularmente preferidas de la invención, la jeringa es de tipo luer-lock de 3 mi de policarbonato o vidrio de borosilicato. Cuando se usa una jeringa de tipo luer-lock, el catéter intrauterino posiblemente asociado con el dispositivo médico de acuerdo con la invención está provisto de una junta de cierre luer hembra para acoplarla a la jeringa.

Como alternativa, si se usa un sistema de autoinyección o un lapicero (de tipo insulina), se puede usar un cartucho de 3 mi de vidrio de borosilicato.

Más preferentemente, dicho recipiente estéril desechable se carga previamente con un volumen de 1 ,5 mi de solución de lavado que contiene: - 10 x 109 g/ml (10 ng/ml) de melatonina; - aminoácidos esenciales y no esenciales; - sales de calcio; - sales de potasio; - sales de magnesio; a un pH comprendido entre 7,5 y 7,8 y una osmolaridad comprendida entre 280 y 290 mOsm/kg.

La invención también tiene por objeto el dispositivo médico ilustrado anteriormente para su uso en una sola administración en forma de lavado del endometrio en el momento de la extracción de los ovocitos en los protocolos de reproducción asistida.

La invención también se refiere a un medio de cultivo celular in vitro o in vivo que comprende los siguientes componentes: - fuente de D-glucosa; - antibiótico, preferentemente gentamicina; - albúmina de suero humano; - aminoácidos esenciales y no esenciales, preferentemente L-taurina; - sales de calcio: lactato de calcio, pantotenato de calcio; - sales de sodio: cloruro de sodio, bicarbonato de sodio y piruvato de sodio; - sales de potasio: cloruro de potasio, fosfato de potasio; - sales de magnesio: cloruro de magnesio, sulfato de magnesio; - agua; caracterizado porque comprende además A/-acetil-5-metoxi-triptamina o un análogo de la misma, o una combinación de los mismos, en el que dicho principio activo está presente a una concentración que varía de 4 x 109 g/ml a 25 x 109 g/ml, preferentemente superior o igual a 10 x 109 g/ml.

Representa un objeto adicional de la presente invención un medio de cultivo celular para la expansión de pinópodos y la obtención de un modelo de estudio in vitro.

Tal medio de cultivo celular tambien se puede usar para cultivos embrionarios, obteniéndose, por ejemplo, un medio de cultivo que se usa para transferir el embrión al útero, siendo dicho medio insertado de este modo en el útero.

Los aspectos particularmente ventajosos del uso de acuerdo con la presente invención están relacionados con la vía de administración tópica propuesta, que no compromete el ciclo de tratamiento de TRA, siendo tal vía mucho menos invasiva que la biopsia de endometrio, ya aplicada a las mujeres sometidas a un ciclo de TRA (13).

Por último, gracias a las propiedades de inhibición de la síntesis de prostaglandinas (14), que son típicas de la melatonina, este lavado reduce las contracciones uterinas y promueve todavía más la implantación.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS A continuación, se describirá la presente invención de una manera ilustrativa, pero no limitante, de acuerdo con dos realizaciones preferidas, con particular referencia a las figuras adjuntas, en las que; - la Figura 1 ilustra el endometrio antes del tratamiento a través de la composición de acuerdo con la presente invención, por lo tanto, en ausencia de pinópodos; - la Figura 2 ilustra el endometrio 1-2 días después del tratamiento a través de la composición de acuerdo con la presente invención: se comienza a observar la formación de pinópodos; - la Figura 3 ilustra el endometrio 3-4 días despues del tratamiento a través de la composición de acuerdo con la presente invención: crecimiento máximo de los pinópodos; - la Figura 4 ilustra el endometrio 5-6 días después del tratamiento a través de la composición de acuerdo con la presente invención: comienza la escisión de los pinópodos, que parecen ser irregulares (apoptosis de las células); - la Figura 5A muestra los resultados del análisis FACS (medición de la intensidad de la fluorescencia) de la actividad antioxidante de la melatonina, la agomelatina y la 6-hidroximelatonina (170 nM correspondiente a 40 x 109 g/ml) llevado a cabo a una concentración de H2O2 de 20 mM; - la Figura 5B muestra los resultados del análisis FACS (medición de la intensidad de la fluorescencia) de la actividad antioxidante de la melatonina, la agomelatina y la 6-hidroximelatonina (170 nM correspondiente a 40 x 109 g/ml) llevado a cabo a una concentración de H2O2 de 200 mM; - la Figura 6 muestra los resultados del ensayo de apoptosis (% de muerte celular) llevado a cabo a diferentes concentraciones (80 nM, 170 nM, 340 nM; que corresponden respectivamente a 18 x 109 g/ml, 40 x 109 g/ml, 80 x 109 g/ml) de melatonina, agomelatina y 6-hidroximelatonina.

Simplemente a modo de ejemplo, y no como limitantes de la presente invención, de aquí en adelante, se presentan los estudios comparativos llevados a cabo {in vitro e in vivo) por los autores de la presente invención para evaluar el aumento porcentual de la implantación de embriones humanos en las téenicas TRA mediante el uso de melatonina en diferentes soluciones.

EJEMPLO 1: Estudios in vivo MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS Soluciones de melatonina usadas para los lavados de endometrio La melatonina (o /V-acetil-5-metoxi-triptamina; N° CAS 73-31-4) usada se ha obtenido en Farmalabor como producto en forma de polvo con título > 99 %.

Se han llevado a cabo dos ensayos clínicos proporcionando la administración de melatonina (concentración de 10 x 109 g/ml) a traves del lavado endometrial en: 1) medio de cultivo de blastocistos Sydncy IVF® (Ensayo clínico 1) suministrado por Cook Ireland Ltd (Número de catálogo G20722 y G20929). Dicho medio de cultivo normalmente se usa para mejorar la escisión, la diferenciación y la expansión in vitro del blastocisto. El medio contiene D- glucosa, los 20 L-aminoácidos esenciales, L-taurina, gentamicina, albúmina de suero humano, lactato de calcio, pantotenato de calcio; cloruro de sodio, bicarbonato de sodio y piruvato de sodio; cloruro de potasio, fosfato de potasio; cloruro de magnesio, sulfato de magnesio; agua purificada. Otras características del medio de cultivo son: - pH: 7, 5-7, 8 (uso de tampón de bicarbonato); - osmolaridad: 280-290 mOsm/kg; - endotoxinas: < 0,4 UE/ml; - MEA: > 80 %. 2) Solución fisiológica (Ensayo clínico 2).

Análisis estadístico: Se ha llevado a cabo un análisis estadístico (IMPRUN.TXT) de regresión lineal con más variables.

Procedimientos estadísticos: Se ha calculado el papel del número de embriones implantados, de su calidad y del procedimiento de lavado con la solución que contiene melatonina en el aumento de la probabilidad de embarazo por regresión logística no condicional, mediante el ajuste de acuerdo con la edad de la madre.

La relación entre la probabilidad de embarazo asociada con cada procedimiento (número de embriones, su calidad y la aplicación del procedimiento de lavado con solución salina o medio para blastocistos que contiene melatonina) y la probabilidad de embarazo con referencia, respectivamente, a la categoría inferior del número de embriones (uno), a la calidad inferior a la óptima de los embriones implantados o a la ausencia del procedimiento de lavado, se ha definido como la oportunidad relativa (OR), y se ha calculado por regresión logística no condicional, mediante el ajuste de acuerdo con la edad de la madre.

En la regresión logística, la OR corresponde al antilogaritmo sobre una base natural del coeficiente de regresión b asociado con cada covariable en el modelo de regresión.

Por lo tanto, el valor así calculado expresa la ventaja obtenida a traves de cada procedimiento, independientemente del resto de condiciones.

Los intervalos de confianza de dos colas al 95 % (IF95 %) de la OR se han calculado mediante la fórmula de Wald (e^ + (Zo/2 * sép)).

Controles de esterilidad (medio de cultivo) Para llevar a cabo los controles de esterilidad del medio de cultivo suplementado con melatonina, se ha usado el dispositivo BACT/ALERT 3D-60 (BIOMERIEUX). Se aplican los frascos de cultivo Bact/ALERT a los sistemas de detección microbiana en procedimientos cualitativos para la recuperación y detección de (bacterias) aeróbicas y anaeróbicas opcionales en la sangre y otros líquidos normalmente estériles como el medio blastocístico usado en la presente experimentación.

El sistema Bact/ALERT de detección microbiana se usa para determinar si hay microorganismos presentes en las muestras de sangre o de otros líquidos normalmente estériles como el medio blastocístico usado en la presente invención, con sospecha de bacteriemia. El sistema Bact/ALERT y los frascos de cultivo ofrecen un sistema de detección microbiana y un medio de cultivo con las condiciones ambientales y nutricionales adecuadas para los microorganismos comúnmente presentes en infecciones de la sangre y otros líquidos normalmente estériles.

Los frascos inoculados (de un mínimo de 5 mi a un máximo de 10 mi de muestra en cuestión) se incuban en el dispositivo, donde son sometidos a un seguimiento continuo con el fin de detectar un posible crecimiento de microorganismos en los frascos de Bact/ALERT.

El sistema Bact/ALERT de detección microbiana usa un sensor colorimétrico y luz reflejada para monitorizar la presencia y la producción de dióxido de carbono (CO2) disuelto en el medio de cultivo.

Los microorganismos posiblemente presentes en la muestra metabolizan los sustratos del medio de cultivo, produciendo dióxido de carbono. La producción de CO2 determinada por el crecimiento de microorganismos induce al sensor azul verdoso permeable a gases presente en la parte inferior de cada frasco de cultivo a adoptar un color amarillo.

El aclaramiento del color indica un aumento de las unidades de reflectancia de monitorización del sistema.

La reflectancia del frasco es monitorizada y rastreada por el dispositivo cada 10 minutos.

Los frascos de cultivo se establecen como positivos o negativos con el software de gestión de los sistemas Bact/ALERT de detección microbiana después de 6 días de incubación.

No es necesario intervenir hasta el momento en el que el dispositivo Bact/ALERT alerta de que un frasco de cultivo es positivo o negativo.

Antes de llevar a cabo cualquier irrigación endometrial, se han realizado ensayos de cultivo para analizar la esterilidad a los 2-4-6 días, y una vez encontrado el cultivo negativo, se usa en el útero.

Criterios de inclusión Se han usado criterios de inclusión restrictivos para seleccionar la población de pacientes que iba a participar en los estudios: 3) edad > 20 y < 44 años; 4) índice de masa corporal (IMC) > 20 y < 28 kg/m2; 5) FSH basal < 19 Ul/I; 6) factores masculinos y femeninos.

Pacientes Las pacientes que participan en los dos estudios clínicos, después de recoger el consentimiento informado, se someten a una fertilización asistida.

En este primer estudio clínico multicéntrico aleatorizado de dos ramas (grupo de control y de estudio) participan aproximadamente 430 pacientes/rama.

Se distribuyen aleatoriamente en tres grupos las pacientes sometidas a reproducción asistida el día de la extracción de los ovocitos: Grupo A: 430 pacientes sometidas a irrigación endometrial con 1,5 mi de solución fisiológica (controles).

Grupo B: 436 pacientes sometidas a irrigación endometrial con una solución de 1 ,5 mi de medio de cultivo suplementada con una concentración final de la melatonina (10 x 109 g/ml).

Grupo C: pacientes no sometidas a irrigación endometrial.

El estudio se ha llevado a cabo con pacientes en varios centros privados especializados en reproducción asistida, tales como el Centro de BRA, el Centro Promea de Torino y Cagliari, el Centro Genera de Perugia y el Centro Público Polielínico de Barí. A estos centros, se ha enviado el medio de cultivo suplementado con melatonina tras someterlo a los ensayos de esterilidad para llevar a cabo el siguiente protocolo de tratamiento.

Tras la inscripción in vivo para la fertilización asistida por irrigación endometrial con concentración conocida (concentración final de 10 x 109 g/ml) de melatonina en el momento de la extracción de los ovocitos, las pacientes se sometieron a la visualización guiada por ecografía relacionada del diámetro del estrato líquido creado en la parte inferior del útero.

En el segundo estudio clínico con un solo centro prospectivo, participaron 64 pacientes en el grupo de control y 92 pacientes en el grupo de estudio.

En dicho estudio, se administró melatonina en solución fisiológica esteril a través del lavado endometrial en el interior de la cavidad uterina de las pacientes, tras la extracción de los ovocitos.

Lavado endometrial En resumen, el tratamiento consta de la irrigación del endometrio en el interior de la cavidad uterina sin ninguna célula en cocultivo, usando la solución fisiológica o el medio de cultivo mezclado con melatonina a la concentración final de 10 x 109 g/ml (se habían efectuado estudios previos con un tercio y la mitad de la concentración final, que luego se mantuvo sin dar los mismos resultados - datos no mostrados).

Tras la extracción de los ovocitos, (el tiempo correspondiente a la ovulación despues de la administración de hCG en los protocolos de TRA), una vez controlada la hemostasia vaginal, se articula una jeringa estéril de 2,5 mi a un catéter intrauterino de un solo lumen con abertura apical, y se succiona el medio de cultivo (medio blastocístico) o la solución fisiológica, modificado mediante la adición de melatonina hasta un volumen de 1 ,5 mi.

En el caso de la solución fisiológica, el catéter se puede llenar previamente con solución fisiológica suplementada con melatonina.

Se introduce el catéter en el orificio uterino interno mediante las mismas etapas, a través de las cuales el operador lleva a cabo la transferencia del embrión (TE) convencional.

A continuación, se inyecta lentamente la solución salina suplementada con melatonina o el medio modificado y, una vez finalizada la irrigación, se mide el espesor del estrato de líquido endocavitario por ecografía transabdominal (el lavado y la ecografía deben ser simultáneos, el estrato de líquido alcanza aproximadamente 10 mm y luego desaparece rápidamente).

RESULTADOS Estudio clínico 1 En el estudio in vivo multicéntrico participaron 863 pacientes sometidas a fertilización asistida e irrigación endometrial (mediciones ecográficas del estrato líquido) con melatonina, y 3-4 días después de ello, se sometieron a la transferencia embrionaria. En este último caso, se calculó el IC (intervalo de confianza) del 95 % mediante análisis estadístico (IMPRUN. TXT) de regresión lineal con más variables.

El análisis univariante demuestra que la implantación de 3 embriones implica un aumento significativo, aproximadamente del triple (OR = 2,8, IC del 95 % = 1,7-4, 4), de la probabilidad de embarazo.

En cambio, el número de dos embriones no parece ser suficiente para aumentar la probabilidad de embarazo (OR = 1,0, IC del 95 % =1 ,7-4,4).

Por otro lado, la calidad óptima de los embriones implantados también parece ser un factor importante en el aumento de la probabilidad de embarazo (OR = 2,9; IC del 95 % = 1,8-4, 7). En el análisis univariante, la misma tasa de relevancia parece estar asociada con el uso del procedimiento de irrigación (OR = 2,2; IC del 95 % = 1 ,6-2,9).

El análisis multivariante permite controlar el efecto independiente de cada variable, por lo tanto, de manera totalmente independiente del efecto de los otros procedimientos aplicados y de la edad de la madre. En este caso, el uso del procedimiento de lavado duplica la probabilidad de exito de embarazo (OR = 2,2; IC del 95 % = 1,6-3, 0).

Parece existir una mejora similar asociada con la implantación de tres embriones, en lugar de la implantación de un solo embrión (OR = 2,1; IC del 95 % = 1 ,2-3,7), y con el uso de embriones de calidad óptima (OR = 1,9, IC del 95 % = 1,1-3,3).

Por lo tanto, el uso de los tres procedimientos como se ha informado anteriormente parece ser la mejor opción en los procedimientos de fertilización asistida.

En conclusión, los estudios ¡n vivo han demostrado que la irrigación o el lavado con melatonina de las células endometriales permiten duplicar el número de embarazos con respecto a los otros dos grupos, que no se diferencian significativamente.

Estudio clínico 2 En el estudio monocéntrico, participaron 64 pacientes en el grupo de control y 92 pacientes en el grupo de estudio.

Las pacientes se sometieron a reproducción asistida y lavado endometrial (mediciones ecográficas del estrato líquido) con melatonina en solución salina estéril, y 3-4 días después, se sometieron a la transferencia embrionaria.

El criterio de valoración principal del estudio es la tasa de embarazos clínicos (corazón fetal), debida a la transferencia embrionaria (TE); y el criterio de valoración secundario es la tasa de embarazos en curso y de abortos.

La tasa de embarazos clínicos resultó ser igual al 37 % en el grupo de estudio frente al 17,2 % en el grupo de control, mientras que la tasa de embarazos en curso resultó ser igual al 32,6 % en el grupo de estudio frente al 14,1 % en el grupo de control.

Los resultados se presentan en la siguiente Tabla 1.

TABLA 1 El lavado endometrial llevado a cabo con las diversas soluciones que contienen melatonina permite duplicar la tasa de embarazos clínicos y embarazos en curso frente al grupo de control en la población femenina no fertil.

Los datos parecen confirmar que la extracción de exudado endometrial usando la solución fisiológica con melatonina puede crear un ambiente endometrial fisiológico y mejorar el éxito de la implantación.

Esto permite obtener un medio válido e innovador para aumentar las tasas de implantación de las teenologías de reproducción asistida (TRA).

EJEMPLO 2: Estudio in vitro MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS La melatonina y el medio de cultivo usados son los mismos que ios usados para el estudio in vivo.

Microscopía electrónica (SEM) Se ha usado una emisión de campo en el microscopio electrónico de alta resolución, modelo FE HITACHI S 4000, operando a 15-20 KW.

Preparación de las muestras Poco despues de extraerlos de la paciente, se disponen pequeños fragmentos de tejido endometrial de aproximadamente 1 mm de tamaño en una solución de fijación compuesta de paraformaldehido al 1 % y glutaraldehído al 0,5 % en tampón cacodilato 0,1 M a pH 7,2 durante 3 horas.

Tras esta fijación, se lavan los fragmentos en PBS durante 20 min 3 veces (1 hora en total) y luego se lleva a cabo la fijación posterior en una solución de tetróxido de osmio al 2 % y ferrocianuro de potasio al 2,5 %.

Se mantiene la preparación a oscuras durante 3 horas para luego lavarla bien por rotación en PBS, con 4 reemplazos de 20 min cada uno.

A esto, le sigue la deshidratación de las muestras de tejido con acetona en sucesión ascendente con 3 sustituciones en 1 hora para cada gradación de 50 %-70 %-80 %-90 %-95 % y 2 reemplazos por acetona pura.

En esta etapa, a continuación, se realiza el secado hasta el punto crítico con CO2 líquido en el dispositivo de alta presión apropiado, que sustituye la acetona al 10 % por CO2 líquido, entonces se lleva lentamente hasta la temperatura del punto crítico y se evapora el CO2. En este momento, las muestras de tejido están perfectamente anhidras, y se pueden disponer en bandejas del microscopio electrónico.

Se fijan las muestras mediante un adhesivo de doble cara conductor de la electricidad especial y, para su colocación, se usan dos agujas muy finas, dejando la preparación lista para su observación con el microscopio electrónico de barrido (SEM).

Muestras biológicas Tras previo consentimiento informado, se disponen en cultivo fragmentos de endometrio extraídos de las pacientes sometidas a histeroscopia diagnóstica.

Para cada paciente, se crean dos partes: una parte del tejido se dispone en cultivo a través de un medio blastocístico convencional exento de melatonina, y la otra parte, a través de un medio blastocístico convencional suplementado con melatonina.

Cultivo establecido Cultivo in vitro de endometrio (extraído a través de histeroscopia de pacientes sometidas a controles previos de fertilización asistida) con melatonina durante 3-6 días y visualización correlacionada de pinópodos a través de microscopía electrónica de barrido (SEM).

RESULTADOS Los estudios in vitro han demostrado que el cocultivo de 3 a 5 días de tejido endometrial en tubo de ensayo con la adición permanente de melatonina, implica un aumento indiscutible de los pinópodos (bajo microscopía electrónica (SEM)), independientemente de la edad de la paciente y de la fase del ciclo menstrual en ciclos espontáneos o manipulados a través de la estimulación farmacológica de superovulación, con respecto al cultivo de control. Tales pinópodos son estructuras que se definen como el marcador de implantación más importante que, para todas las mujeres (con una variabilidad de 5 días, es decir, una mujer puede menstruar después de 26 días con un ciclo corto o menstruar después de 33 días) es de 48 horas. De hecho, dos tercios del éxito de quedarse embarazada dependen del momento correcto de la implantación, el otro tercero depende de la calidad del embrión.

El examen bajo el microscopio electrónico SEM ha demostrado que la adición de melatonina conduce a una expresión morfológica completa de los pinópodos, como se ilustra en las Figuras 1-4.

Esto destaca la importancia de los pinópodos durante la ventana de implantación y el aumento de su expresión inducido en cultivo a través de medios suplementados con melatonina.

EJEMPLO 3: Estudio de los efectos de la melatonina y análogos sobre la oxidación y la apoptosis de la línea celular endometrial HEC-1-A Compuestos de ensayo Los análogos de melatonina que se han usado para la comparación con la melatonina (M5250), son la agomelatina (A1362) y la 6-hidroxi-melatonina (H0627), todos adquiridos en Sigma Aldrich.

Se usaron a diferentes concentraciones (es decir, 40 nM, 80 nM, 170 nM y 340 nM, correspondientes respectivamente a 9,4 x 109 g/ml, 18 x 109 g/ml, 40 x 109 g/ml y 80 x 109 g/ml).

Línea celular Se obtuvieron células HEC-1-A de la ATCC, y se cultivaron siguiendo las instrucciones del proveedor.

HEC-1-A es una línea celular estabilizada epitelial aislada por H. Kuramoto de una paciente con adenocarcinoma (21), que proporciona un valioso modelo para estudiar in vitro la célula epitelial del endometrio (22).

Ensayo de la actividad antioxldante Se cultivó la línea celular HEC-1-A con 170 nM (40 ng/ml) de melatonina, 6-hidroxi-melatonina y agomelatina, y dos concentraciones diferentes de H2O2 (20 y 200 pg/ml).

Se midieron las sustancias oxidantes reactivas (SOR) mediante FACS como han descrito anteriormente Italiano y col. (23) en dos repeticiones independientes. Resultados La melatonina y los dos análogos certificaron el mismo efecto antioxidante, en el modelo de línea celular in vitro, a la concentración de H2O2de 20 pg/ml.

Cuando se aumentó la concentración de H2O2 hasta 200 pg/ml, la mélatonina y la agomelatina siguieron protegiendo la línea celular de la oxidación, mientras que la 6-hidroxi-melatonina no lo hizo. Sin embargo, aumentando la dosis de 6-hidroxi-melatonina hasta 340 nM, se alcanzó el efecto antioxidante de este análogo (datos no mostrados).

Los resultados se ilustran en el gráfico de la Figura 5. Estos resultados están en línea con los datos publicados por Duan y col. (24) sobre el efecto antioxidante de la melatonina en un modelo celular diferente, y demuestran que la melatonina y sus análogos ensayados tienen un efecto similar al menos cuando se usan 20 mg/ml de H2O2 en la línea celular de endometrio.

Ensayo de apoptosis La apoptosis (% de muerte celular) de las celulas endometriales es un fenómeno fisiológico observado generalmente a la tasa del 10-20 % durante el cultivo celular.

Para determinar si la melatonina y sus análogos inducen la muerte celular en el presente contexto experimental específico, se ha tratado la línea celular HEC-1-A con 340 nM (80 ng/ml), 170 nM (40 ng/ml) y 80 nM (18,8 ng/ml) de melatonina, 6-hidroxi-melatonina y agomelatina, respectivamente, durante 24 horas.

Los niveles de apoptosis se analizaron mediante tinción de yoduro de propidio y análisis FACS. Se muestra el porcentaje de eventos sub-G1 para uno de los dos experimentos realizados.

Resultados A todas las concentraciones ensayadas, la melatonina ejerce un efecto protector sobre la apoptosis. La agomelatina tiene un efecto protector a 170 y 340 nM, mientras que no se muestra ningún efecto sobre la apoptosis por la 6-hidroxi-melatonina hasta una concentración de 170 nM. Los resultados se muestran en la Figura 6.

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Claims (26)

REIVINDICACIONES

1. /V-acetil-5-metoxi-triptamina o un análogo de la misma, para su uso en la reproducción asistida, en los campos medico o veterinario, con el fin de prevenir el fracaso en la implantación en el útero mediante la administración tópica de una cantidad eficaz en una hembra de un sujeto mamífero que necesita tai tratamiento.

2. /V-acetil-5-metoxi-triptamina o un análogo de la misma, de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque dicho análogo se selecciona entre agomelatina, 6-hidroximelatonina, serotonina, 5-hidroxitriptófano y sus derivados.

3. A/-acetil-5-metoxi-triptamina o un análogo de la misma, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizada porque dicha hembra de un sujeto mamífero es una mujer que padece infertilidad o abortos repetidos.

4. A/-acetil-5-metoxi-triptamina o un análogo de la misma, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque dicha administración tópica es por vía de irrigación endometrial, o lavado uterino o endometrial.

5. A/-acetil-5-metoxi-triptamina o un análogo de la misma, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque dicha administración tópica se lleva a cabo en una sola administración en el momento de la extracción de los ovocitos.

6. /\/-acetil-5-metoxi-triptamina o un análogo de la misma, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque dicha N- acetil-5-metoxi-triptamina o análogo de la misma está presente a una concentración que varía de 4 x 109 g/ml a 25 x 109 g/ml, preferentemente superior o igual a 10 x 109 g/ml.

7. /V-acetil-5-metoxi-triptamina o un análogo de la misma, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para su uso con una administración sistemica simultánea de A/-acetil-5-metoxi-triptamina, HCG o progesterona, o una combinación de las mismas, a partir del día de la extracción de los ovocitos.

8. /V-acetil-5-metoxi-triptamina o un análogo de la misma, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque las téenicas de reproducción asistida se seleccionan del grupo constituido por coito dirigido, inseminación intrauterina (IUI), inseminación in vitro y transferencia de embriones (FIVET), fecundación in vitro (IVF); técnicas de inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) y de inyección intracitoplasmática de espermatozoides morfológicamente seleccionados (IMSI), y TESA-TESE (aspiración-extracción de espermatozoides testicu lares)

9. Una composición adecuada para la administración tópica, caracterizada porque comprende /N/-acetil-5-metoxi-triptamina o un análogo de la misma, o una combinación de los mismos como principio activo, preferentemente A/-acetil-5-metoxi-triptamina, en una cantidad eficaz en una hembra de un sujeto mamífero que necesita tal tratamiento, junto con uno o más excipientes o adyuvantes fisiológicamente aceptables, para su uso en la reproducción asistida, en los campos médico o veterinario, con el fin de prevenir el fracaso de la implantación en el útero.

10. La composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque dicho principio activo está presente a una concentración que varía de 4 x 109 g/ml a 25 x 109 g/ml, preferentemente superior o igual a 10 x 109 g/ml.

11. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 y 10, caracterizada porque dicho principio activo se formula como una irrigación endometrial, o un lavado uterino o endometrial en un medio para cultivo celular hasta una concentración final que varía de 4 x 109 g/ml a 25 x 109 g/ml, preferentemente superior o igual a 10 x 109 g/ml

12. La composición de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque dicho medio de cultivo blastocístico comprende los siguientes componentes: - fuente de D-glucosa; - antibiótico, preferentemente gentamicina; - albúmina de suero humano; - aminoácidos esenciales y no esenciales, preferentemente L-taurina; - sales tampón seleccionadas preferentemente entre: - sales de calcio: lactato de calcio, pantotenato de calcio; - sales de sodio: cloruro de sodio, bicarbonato de sodio y piruvato de sodio; - sales de potasio: cloruro de potasio, fosfato de potasio; - sales de magnesio: cloruro de magnesio, sulfato de magnesio; - agua; y tiene un pH de entre 7,5 y 7,8.

13. La composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque dicho medio de cultivo es el medio blastocístico Sydncy IVF®.

14. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 y 10, caracterizada porque dicho principio activo de la composición anteriormente mencionada es formulado como irrigación endometrial, o lavado uterino o endometrial en solución fisiológica.

15. La composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque comprende además aminoácidos esenciales y no esenciales, y sales tampón para mantener el pH entre 7 y 8, preferentemente de 7,5 a 7,8.

16. Un dispositivo medico para el lavado uterino, caracterizado porque comprende un recipiente estéril cargado previamente o para cargarlo con una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 15.

17. El dispositivo medico de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque el recipiente estéril es desechable.

18. El dispositivo médico de conformidad con las reivindicaciones 16 o 17, caracterizado porque el recipiente estéril es una jeringa, un dispensador o un cartucho para dispositivos de autoinyección.

19. El dispositivo médico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende además un catéter intrauterino estéril.

20. El dispositivo médico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, caracterizado porque comprende un recipiente estéril desechable cargado previamente con una formulación a base de una solución fisiológica suplementada con melatonina, aminoácidos y sales tampón para mantener el pH entre 7 y 8, preferentemente de 7.5 a 7.8.

21. El dispositivo médico de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque dicha formulación comprende aminoácidos esenciales y no esenciales, y sales tampón seleccionadas preferentemente entre sales de calcio, de potasio y de magnesio, y mezclas de las mismas.

22. El dispositivo médico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 21, caracterizado porque la melatonina tiene una concentración comprendida entre 4 x 109 g/ml a 25 x 109 g/ml, preferentemente superior o igual a 10 x 109 g/ml.

23. El dispositivo médico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 22, caracterizado porque dicho recipiente estéril desechable es cargado previamente con un volumen de 1,5 mi de solución fisiológica que comprende: - 10 x 109 g/ml de melatonina; - aminoácidos esenciales y no esenciales; - sales de calcio; - sales de potasio; - sales de magnesio.

24. El dispositivo medico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 23, para su uso en la reproducción asistida, en los campos médico o veterinario, para prevenir el fracaso de la implantación en el útero.

25. Un medio de cultivo celular in vitro o in vivo, que comprende: - fuente de D-glucosa; - antibiótico, preferentemente gentamicina; - albúmina de suero humano; - aminoácidos esenciales y no esenciales, preferentemente L-taurina; - sales tampón seleccionadas preferentemente entre: - sales de calcio: lactato de calcio, pantotenato de calcio; - sales de sodio: cloruro de sodio, bicarbonato de sodio y piruvato de sodio; - sales de potasio: cloruro de potasio, fosfato de potasio; - sales de magnesio: cloruro de magnesio, sulfato de magnesio; y sus mezclas; - agua; caracterizado porque comprende además A/-acetil-5-metoxi-triptamina o un análogo de la misma, o una combinación de los mismos, en donde dicho principio activo está presente a una concentración que varía de 4 x 109 g/ml a 25 x 109 g/ml, preferentemente superior o igual a 10 x 109 g/ml.

26. El uso del medio de cultivo celular como el que se reclama en la reivindicación 25, para el crecimiento de pinópodos y la obtención de un modelo de estudio in vitro.