MX2013013847A - Suplemento alimenticio, metodo para incrementar la masa bacteriana en el rumen de un rumiente y preparado alimenticio y sus correspondientes. - Google Patents

Abstract

Suplemento alimenticio, método para incrementar la masa bacteriana en el rumen de un rumiante y preparado alimenticio y usos correspondientes. Suplemento alimenticio que comprende proteínas hidrolizadas con un grado de hidrólisis superior al 28% y/o tienen más de 23 mg de nitrógeno a-amino por gramo de proteína y/o tienen más de un 10% de aminoácidos libres. Las proteínas hidrolizadas son proteínas animales, preferentemente hemoglobina. Se suministra oralmente, incluido en un preparado alimenticio, en forma líquida, concentrada o deshidratada. El suplemento es la base para un método para incrementar la masa bacteriana en el rumen de un rumiante en el que se añade en la dieta del rumiante un suplemento con proteínas hidrolizadas de acuerdo con la invención.

Description

SUPLEMENTO ALIMENTICIO, METODO PARA INCREMENTAR LA MASA BACTERIANA EN EL RUMEN DE UN RUMIANTE Y PREPARADO ALIMENTICIO Y USOS CORRESPONDIENTES Campo de la Invención La invención se refiere a un suplemento alimenticio y a un método para incrementar la masa bacteriana en el rumen de un rumiante. La invención también se refiere a un preparado alimenticio y a unos usos del suplemento de acuerdo con la invención.

Antecedentes de la Invención Se considera beneficioso maximizar la síntesis de proteínas microbianas en el rumen porque el perfil de aminoácidos de las proteínas microbianas es muy parecido al perfil de aminoácidos requerido por el animal huésped, comparado con la mayoría de las proteínas usadas como alimento (NRC, 2001) . Los microorganismos del rumen alcanzan sus requerimientos de nitrógeno para la síntesis de proteínas a partir de una mezcla de amoníaco, aminoácidos libres y péptidos. Una gran proporción de la dieta digerible de un rumiante es convertida a los productos finales a través de una fermentación microbiana, básicamente ácidos grasos volátiles (VFA, por sus siglas en inglés) , y la mayoría de la proteína es trasformada en proteína microbiana.

Dado que el perfil de aminoácidos de las bacterias es Ref. 244309 usualmente de mejor calidad que las proteínas usadas como alimento, el objetivo en la nutrición de los rumiantes es maximizar el crecimiento bacteriano para fomentar la síntesis de proteínas microbianas. El crecimiento bacteriano debe ser sostenido con carbohidratos y fuentes de nitrógeno. Se ha demostrado que el crecimiento bacteriano se incrementa con la adición de aminoácidos y/o péptidos, tanto en el caso de bacterias celulolíticas como amilolíticas (Maeng and Baldwin, 1976; Argyle and Baldwin, 1989; Kernick, 1991) . También se ha descrito que la digestión de las fibras se incrementa con la adición de aminoácidos (Griswold et al., 1996; Carro and Miller, 1999) y de proteínas (Cruz Soto et ál . , 1994) a bacterias puramente celulolíticas. Por su parte, Atasoglu et al. (2001) demostraron, con cultivos puros de bacterias celulolíticas, que la incorporación de nitrógeno en forma de amoníaco en nitrógeno de célula microbiana decrece cuando la proporción de aminoácidos se incrementa en el medio, sugiriendo que las bacterias celulolíticas también emplean los aminoácidos, caso de estar disponibles. Resultados similares se han descrito cuando se incrementan las concentraciones de péptidos, si bien Atasoglu et al. (2001) describen que hay una preferencia de las bacterias celulolíticas a incorporar en su nitrógeno celular el nitrógeno procedente de los aminoácidos frente al nitrógeno procedente de péptidos. Sin embargo, en las concentraciones típicas de péptidos y de aminoácidos en el rumen, aproximadamente el 80% del nitrógeno celular se deriva de nitrógeno amoniacal. La adición de aminoácidos de cadena ramificada que fermentarán como ácidos grasos volátiles de cadena ramificada, y de adición de péptidos en el fluido del rumen incrementa la digestión de las fibras, la producción de la proteína microbiana y las eficiencias de crecimiento (Russell and Sniffen, 1984; Thomsen, 1985.

El incremento de las masa microbiana en el rumen mejora el rendimiento de producción de leche (NRC, 2001) . Como ya se ha indicado anteriormente, es una práctica habitual en la industria láctea de suministrar suplementos de aminoácidos, péptidos o levadura para incrementar la producción de leche de las vacas. De entre los diferentes péptidos empleados, la triptona (que es péptido obtenido a partir de la hidrólisis de caseína mediante el enzima tripsina) es considerada como el estándar de referencia para la adición de nitrógeno para bacterias en condiciones de laboratorio.

La mayoría de las proteínas animales y vegetales pueden ser hidrolizadas bien por métodos enzimáticos o por métodos ácidos. Los métodos enzimáticos suelen ser los métodos preferidos ya que no quedan residuos ácidos y los aminoácidos mantienen su forma L.

El uso de hemoglobina secada por atomización (spray dried hemoglobin SDH) y de harina de sangre en la industria láctea es bien conocido como una fuente de proteínas que no son hidrolizadas en el rumen y llegan intactas al intestino delgado, donde pueden ser digeridas por la microflora intestinal, para el mantenimiento del tracto intestinal. Sin embargo, no son empleadas como fuente de proteínas para incrementar la masa bacteriana en el rumen.

Sumario de la Invención La invención tiene por objeto un suplemento alimenticio caracterizado porque comprende proteínas hidrolizadas que tienen un alto grado de hidrólisis. Preferentemente las proteínas hidrolizadas tienen un grado de hidrólisis superior al 28% y/o tienen más de 23 mg de nitrógeno a-amino por gramo de proteína y/o tienen más de un 10% de aminoácidos libres.

Efectivamente, como se verá a continuación, en los estudios in vitro, según el procedimiento de Tilley Terry, realizados con contenidos de rumen se ha encontrado que, sorprendentemente, sólo cuando se añadía hemoglobina altamente hidrolizada al medio de rumen había una estimulación especial mayor en el crecimiento de tanto bacterias Grampositivas como Gramnegativas . Usando hemoglobina hidrolizada sólo hasta un grado medio o hemoglobina completa sin hidrolizar o triptona o levadura no se conseguía un efecto similar en el crecimiento bacterial del rumen. La justificación de esta mejora no es claramente conocida. Posiblemente el hecho de suministrar proteína altamente hidrolizada implique suministrar un perfil de aminoácidos, de péptidos y/o de oligopéptidos mucho más variados y más ajustados a las necesidades de la masa bacteriana del rumen que en el caso de suministro de aminoácidos o peptonas específicos (como en el caso del suministro de triptona o de los escasos aminoácidos libres que son sintetizados industrialmente a precios asequibles para estas aplicaciones) .

Preferentemente las proteínas hidrolizadas son proteínas animales, preferentemente proteínas de sangre, y muy preferentemente de hemoglobina.

La invención también tiene por objeto un preparado alimenticio para animales, preferentemente para rumiantes, caracterizado porque comprende un suplemento de acuerdo con la invención.

La invención tiene asimismo por objeto un método para incrementar la masa bacteriana en el rumen o panza de un rumiante caracterizado porque comprende la etapa de añadir proteínas altamente hidrolizadas en la dieta del rumiante. Preferentemente las proteínas hidrolizadas tienen un grado de hidrólisis superior al 28% y/o tienen más de 23 mg de nitrógeno a-amino por gramo de proteína y/o tienen más de un 10% de aminoácidos libres.

Preferentemente las proteínas hidrolizadas son suministradas como suplemento en la dieta de animales, preferentemente de animales rumiantes. Ventajosamente se suministra una cantidad de dicho suplemento equivalente a entre un 0% y un 25% de la ración alimenticia del animal, preferentemente dicha cantidad equivale a entre un 1% y un 10% de la ración alimenticia del animal. El suplemento se puede incluir ventajosamente en el pienso de los animales, es decir, es para consumo oral. Se puede administrar de forma líquida, concentrada o deshidratada. En el caso de que se suministren deshidratadas, la deshidratación es preferentemente por atomización, si bien también se puede hacer ventajosamente por liofilización, mediante secador flash o mediante secador de disco.

Ventajosamente el suplemento es suministrado a un animal del grupo formado por vaca, oveja, cabra, caballo y llama, preferentemente a vacas lecheras.

Las proteínas pueden ser animales o vegetales. Preferentemente son proteínas de sangre, y muy preferentemente de hemoglobina.

Ventajosamente las proteínas hidrolizadas son obtenidas a partir de hemoglobina de un origen del grupo formado por porcino, bovino, ovino, equino y aviar.

Otro objeto de la invención es el uso de un suplemento alimenticio de acuerdo con la invención para incrementar la masa bacteriana en el rumen de un rumiante, en particular para incrementar la masa bacteriana Gram-negativa, y/o para incrementar la producción de leche de un animal del grupo formado por vaca, oveja, cabra, caballo y llama, preferentemente vacas lecheras.

Breve descripción de las Figuras Otras ventajas y características de la invención se aprecian a partir de la siguiente descripción, en la que, sin ningún carácter limitativo, se relatan unos modos preferentes de realización de la invención, haciendo mención de los dibujos que se acompañan. Las figuras muestran: Fig. 1, pH de fluido de rumen influido por la fuente de nitrógeno aportada.

Fig. 2, abundancia relativa de bacterias Grampositivas y Gramnegativas influidas por la fuente de nitrógeno aportada in vitro.

Fig. 3, variación de pHs en cada una de las incubaciones del ejemplo 3.

Fig. 4, contaje bacteriano del ejemplo 3.

Fig. 5 muestra la evolución del pH del rumen respecto de la hora de alimentación del ejemplo 4.

Fig. 6 muestra la evolución de la producción de leche (kg/d) en la medida que le afecta el tratamiento y los días de duración del tratamiento del ejemplo 4.

Fig. 7 muestra la evolución de la producción de leche (kg/d) en la medida que le afecta el tratamiento, la paridad y días de duración del tratamiento del ejemplo 4.

Fig. 8 muestra la evolución del nitrógeno amoniacal en el rumen (mg/dl) en la medida que le afecta el tratamiento y los días de duración del tratamiento del ejemplo 4.

Fig. 9 muestra la evolución de las bacterias Grampositivas (Ct) en el rumen en la medida que le afecta el tratamiento y los días de duración del tratamiento del ejemplo 4.

Fig. 10 muestra la evolución de las bacterias Gramnegativas (Ct) en el rumen en la medida que le afecta el tratamiento y los días de duración del tratamiento del ejemplo 4.

Fig. 11 muestra la evolución del recuento de protozoos Ct) en la medida que le afecta el tratamiento, la paridad, y los días de duración del tratamiento del ejemplo 4. Un valor bajo de Ct significa un recuento alto. Cuadrados representan vacas multíparas y círculos representan vacas primíparas.

Descripción Detallada de la Invención EJEMPLO 1: Producción de productos de hemoglobina animal hidrolizada En general, las proteínas hidrolizadas pueden ser obtenidas mediante hidrólisis enzimática, hidrólisis acida o hidrólisis alcalina.

En el caso de hidrólisis enzimática, preferentemente se realiza mediante enzimas del grupo de las proteasas que, ventajosamente, se añaden en una cantidad de enzima inferior al 25% en peso de la proteína a hidrolizar. Preferentemente la hidrólisis enzimática se hace con un pH comprendido entre 2 y 12.

En el caso de hidrólisis ácida, preferentemente la hidrólisis ácida se hace con un ácido del grupo formado por ácido sulfúrico, ácido clorhídrico, ácido nítrico y ácido fosfórico. Ventajosamente se hace a una temperatura superior a los 60°C.

En el caso de hidrólisis alcalina, preferentemente la hidrólisis alcalina se hace con un álcali del grupo formado por hidróxido sódico e hidróxido potásico, y ventajosamente se hace a una temperatura superior a los 60 °C.

Para la realización de este ejemplo 1 se usó hemoglobina como la materia prima para ser hidrolizada y la hidrólisis fue enzimática.

La hidrólisis de hemoglobina animal puede ser obtenida mediante la liberación de la hemoglobina de las células rojas usando una bomba de presión u otros métodos diferentes como diluyendo con agua, agitando a alta velocidad etc. Después, la hemoglobina puede ser hidrolizada enzimáticamente usando un enzima proteolítico, en condiciones de pH y temperatura controlados. Usando la hidrólisis enzimática, un experto en la materia puede conseguir el grado de hidrólisis deseado. Una vez que se ha conseguido un grado de hidrólisis deseado en la hemoglobina, ésta puede ser suministrada directamente como alimento a los rumiantes, puede ser concentrada y almacenada como tal concentrado, o puede ser deshidratada por diversos métodos conocidos .

En el caso concreto del ejemplo 1 el procedimiento seguido fue el siguiente: Fracción de células rojas (hemoglobina) 1 Adición de agua 1 Calentamiento a T > 40 °C i Adición de proteasa bacteriana (> de 0,05% en peso por unidad de volumen) 1 Hidrólisis a T > 40°C 1 Rango de pH : 5 , 0 - 9 , 0 I Inactivación de la enzima a 80°C durante 30 min 1 Secado por atomización 1 Empaquetado El grado de hidrólisis usando este procedimiento puede variar dependiendo de la temperatura, el pH, la dosis o cantidad de enzima aportada y el tiempo de reacción. De esta manera ha sido posible producir los siguientes productos: TABLA 1: Muestras obtenidas de hemoglobina hidrolizada secada por atomización y comparación con triptona EJEMPLO 2: Incubaciones de Tilley Terry Muestras de rumen procedentes de tres animales diferentes fueron incubadas durante 12 horas siguiendo el procedimiento de Tilley Terry (1963) . El fluido de rumen fresco es diluido con una solución tampón y una solución mineral en una proporción de 10:40 (fluido de rumen : solución tampón-mineral ) y se añade la fuente de nitrógeno. Se aplican tres tratamientos diferentes a las muestras de rumen: control negativo (sin adición de la fuente de nitrógeno) , 2% de triptona (como control positivo) , y hemoglobina altamente hidrolizada y secada por atomización (spray dried high hydrolyzed hemoglobin SDHHH, muestra Y010514 obtenida en el ejemplo 1 anterior) suministrada a un porcentaje (2,1%) que aporta la misma cantidad de nitrógeno que un 2% de triptona. El método ha consistido en incubar el fluido de rumen en frascos de 100 mi en una atmósfera de C02 a 39 °C durante 12 horas .

Después de 12 horas de incubación se obtiene una muestra de líquido para determinar el pH y el crecimiento microbiano. El pH ha sido determinado usando una sonda electrónica .

Determinación del crecimiento microbiano Dado que no se puede realizar medidas de densidad óptica en fluido de rumen, el crecimiento bacteriano fue estimado usando dos métodos diferentes: 1) Centrifugado y determinación de masa de un pellet microbiano después de completar el periodo de incubación de doce horas. 2) La muestra líquida obtenida de los frascos de incubación fue empleada para extraer ADN, y a continuación se realizaron RT-PCRs (reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real) cuantitativos para determinar el total de bacterias Grampositivas y Gramnegativas .

Para la extracción del ADN, las muestras de rumen fueron centrifugadas tras la incubación a 6500g durante 15 minutos a 4°C. El sobrenadante fue descartado. El pellet fue dividido en partes iguales de 0,25 g y congelado (-80°C) hasta el análisis posterior. El ADN microbiano total fue extraído utilizando el método RBB+C que emplea la técnica denominada "bead beating" en presencia de altas concentraciones de dodecilsulfato de sodio (SDS) , sal y EDTA, y realizando la subsiguiente purificación del ADN con columnas QIAamp (QIAGEN) (Yu and Morrisson, 2004) .

Se ha realizado el RT-PCR cuantitativo usando placas de 0,2 mi de 96 pocilios y un IQ™SYBRe Green Supermix con el sistema de detección en tiempo real MylQ™ de BioRad. Para la cuantificación de bacterias se usaron cebadores específicos para regiones del gen 16S rRNA, a una concentración final de 0.5 µ?. Los ciclos de amplificación PCR se muestran en la Tabla 2. La especificidad del amplicón (pieza de ADN formado como producto de amplificación) se determinó a base del análisis de las curvas de fusión de los productos finales del PCR mediante el incremento de la temperatura a una velocidad de 0.5°C/30 seg de 55°C a 95 °C. Las reacciones PCR fueron realizadas por triplicado. Se empleó agua como control negativo y se calculó la expresión como una cuantificación relativa normalizada con el control negativo con 2ACt.

Tabla 2 Cebadores y ciclos de amplificación RT-PCR Gen Cebadores Referencia Ciclo RT-PCR 1 x (95°C 05:00min) 16SrRNA Fw 5' -AYGACGTCAAGTCMTCATGG-3 ' (Klausegger 40 x (95°C Gram- Rv 5' -AGGAGGTGATCCAACCGCA-3 ' et al, 1999) 00:30min, 65°C Negativo 00:30min, 72°C 1 x (95°C 05:00min) 16SrRNA Fw 5' -GAYGACGTCAARTCMTCATGC-3 ' 40 x (95°C (Klausegger Gram- Rv 5' -AGGAGGTGATCCAACCGCA- 3 ' 00:30min, 65°C et al, 1999) Positivo 00:30min, 72°C 00 : lOmin) Medidas de pH En todos los casos el fluido del rumen ha mostrado un ligero incremento en su pH después de finalizada la incubación (ver Figura 1) . El incremento fue significativamente mayor en el caso SDHHH (hemoglobina altamente hidrolizada y secada por atomización) . El incremento de pH indica que los microorganismos fueron capaces de usar las fuentes de nitrógeno aportadas como fuentes de energía, provocando una excreción de amoníaco.

Cuantificación microbiana por RT-PCR La Figura 2 muestra los resultados de los RT-PCR cuantitativos expresados como 2 usando el control negativo como referencia (dado que no es posible realizar una cuantificación absoluta) . Se observa que la estimulación en el crecimiento bacteriano es aún más acusado en las bacterias Gramnegativas que en las bacterias Grampositivas .

Un estudio comparativo ha mostrado que los péptidos son incorporados de una forma más eficaz en la proteína bacteriana. Una hipótesis para explicar porqué el crecimiento de las bacterias Gramnegativas es mayor que el crecimiento de las bacterias Grampositivas podría basarse en la especial composición de oligopéptidos , péptidos y aminoácidos libres presentes en la fuente de nitrógeno.

Por lo tanto, se puede observar que SDHHH es una fuente de nitrógeno para la síntesis de proteínas microbianas fácilmente disponible. Adicionalmente, SDHHH parece estimular preferentemente el crecimiento de las bacterias Gramnegativas, que son, más deseables que las bacterias Grampositivas en el rumen.

Ejemplo 3 Se han realizado 4 réplicas de incubaciones de Tilley Terry, cada una de ellas empleando tres muestras diferentes de líquidos de rumen de tres vacas diferentes para determinar la fermentación de rumen y los cambios microbianos, comparados con un control al que no se le ha añadido ninguna fuente de nitrógeno. Las fuentes de nitrógeno aportadas fueron : - plasma - hemoglobina con una hidrólisis media y secada por atomización (spray dried médium hydrolyzed hemoglobine, SDMHH) (muestra 11XIP007-2 del ejemplo 1) - hemoglobina con una alta hidrolización y secado por atomización (SDHHH) (muestra 11XIP007-4 del ejemplo 1) - urea al 98% - nutriente de soja (SB ) - levadura - glóbulos rojos secados por atomización (RBC) Los líquidos de rumen han sido diluidos en una proporción 10:40 y se les ha añadido (incluyendo el control) un 1% de harina de maíz. Todas las fuentes de proteína fueron aportadas en una cantidad tal que aportaban un 2% de nitrógeno.

Las incubaciones han sido de 16 horas, bajo agitación continua (150 rpm) 5% de C02 y 39 °C.

El pH se ha medido al inicio y al final de las incubaciones, se ha determinado la concentración de bacterias Gramnegativas y Grampositivas .

En la figura 3 se observa la variación de pHs en cada una de las incubaciones.

En la figura 4 se observa el contaje bacteriano.

Se observa que tanto SDHHH como SDMHH producen un efecto positivo en el incremento del pH del rumen, como también ocurre con la levadura, el SBM y el plasma. Sin embargo, sorprendentemente, el SDHHH muestra un efecto superior en el crecimiento de bacterias de rumen tanto Grampositivas como Gramnegativas . Este efecto no es observable ni en SDMHH ni en la hemoglobina sin hidrolizar.

EJEMPLO 4 El objetivo fue de valorar los efectos de un hidrolizado de proteína sobre la fermentación en el rumen, la producción de leche, la composición de la leche, y las concentraciones en sangre de urea, glucosa e insulina.

El experimento fue un experimento aleatorio completo paralelo replicado con dos tratamientos, 16 vacas, durante 30 días. La unidad experimental era la vaca (los tratamientos se aplicaron sobre una base individual) .

Animales y tratamientos Dieciséis vacas fueron alimentadas con una ración total mezclada (en inglés: total mixed ration TMR) que fue muestreada y analizada en cuanto a materia seca (MS) , proteína cruda (PC) , fibra detergente neutra (FDN) , carbohidratos no fibrosos (CNF) , almidón, y extracto de éter (EE) sobre una base semanal) . Los tratamientos fueron dos (8 vacas por tratamiento) : un grupo de control que recibió 100 g de urea/d, y un grupo (grupo SDHHH o grupo APC) que recibió 319 g de SDHHH/d (muestra Y206024 obtenida en el ejemplo 1, el SDHHH es denominado internamente peptein-4 por APC) . Estos dos compuestos se han mezclado con agua y a continuación se han mezclado con la TMR.

Los datos del SDHHH empleado son: Humedad 3.1% Proteína 87.1% Cenizas 12.9% Aminoácidos libres 21.58% Nitrógeno alfa-amino libre 34.62 mg/g proteína Las vacas se han alimentado dos veces al día. Los dos tratamientos suministraron la misma cantidad de N suplementario (44,8 g/d) . 8 vacas llevaban cánula en el rumen, 4 en cada tratamiento que han servido para obtener muestras del rumen.

Mediciones La ingesta individual y el comportamiento alimentario se han monitorizado de forma automática, empleando un sistema de monitorización de ingesta alimentaria (Bach et al. 2004) . Se ha recogido la producción de leche durante todo el estudio. Adicionalmente , los días 0, 14 y 28, se han tomado muestras de todas las vacas para determinar los componentes de la leche (grasa, proteína, lactosa, urea y contajes de células somáticas) tanto en el ordeño de la mañana como en el de la tarde.

También, se han empleado animales canulados para recoger muestras del rumen los días 0, 14 y 28 a las 0, 2, 4 y 6 horas después del suministro matutino de alimentos para determinar la concentración de ácidos grasos volátiles, pH y amoniaco. Adicionalmente, se han procesado todas las muestras del rumen y se han almacenado a -80°C para la extracción posterior del ADN y la cuantificación de las bacterias Grampositivas y Gramnegativas , y protozoarios . Para la extracción del ADN, se han centrifugado las muestras del rumen después de incubadas a 6500 x g durante 15 min a 4°C. Se ha descartado el sobrenadante y se ha distribuido el pellet homogeneizado en partes alícuotas de 0,25 g que se han congelado a -80 °C hasta su uso. Se ha extraído el ADN microbiano total empleando el método de RBB+C que utiliza la ruptura celular ("bead beating") en presencia de elevadas concentraciones de dodecilsulfato sódico (SDS) , sal y EDTA, y la purificación posterior del ADN con columnas QIAmp (QIAGEN) (Yu y Morrison, 2004) .

Se ha realizado el RT-PCR cuantitativo usando placas de 0,2 mi de 96 pocilios y un IQ™SYBR® Green Supermix con el sistema de detección en tiempo real MylQ™ de BioRad. Para la cuantificación de bacterias se usaron cebadores específicos para regiones del gen 16S rRNA, a una concentración final de 0,5 µ?. La especificidad del amplicón se determinó a base de análisis de las curvas de fusión de los productos finales del PCR mediante el incremento de la temperatura a una velocidad de 0.5°C/30 seg de 55°C a 95°C. Las reacciones PCR fueron realizadas por triplicado. Se empleó agua como control negativo y se calculó la expresión como una cuantificación relativa normalizada con el control negativo con 2ACt .

Proceso de datos y análisis estadístico La unidad experimental ha sido la vaca. Se han analizado los datos con un modelo de efectos aleatorios de 2 niveles. Las partes fijas de los modelos tuvieron en cuenta el tratamiento, el tiempo y su interacción bidireccional . El término de error para todos los modelos fue la vaca dentro del tratamiento.

Resultados El pH medio del rumen ha sido de 5,93 y de 5,81+0,10 para las vacas del control y de SDHHH , respectivamente, no siendo la diferencia significativa (P < 0,47) , y como se esperaba, el pH del rumen variaba según el momento de toma de las muestras (Figura 5) .

En su conjunto, la producción de leche no se ha visto afectado por el tratamiento (Tabla 3) ; no obstante hubo una interacción entre el tratamiento y los días de tratamiento (Figura 6) y una interacción triple entre la paridad, el tratamiento y los días de tratamiento (Figura 7) . Básicamente, transcurridos unos 7-10 días de tratamiento, las vacas SDHHH empezaron a producir más leche que las vacas control. Como nota de interés, . las vacas multíparas respondieron mucho mejor que las vacas primíparas a la suplementación SDHHH (Figura 7) . En general, la producción de leche de las vacas primíparas de control fue de 32.5 kg/d, y la producción de las de SDHHH fue 31.7 kg/d; mientras que las vacas multíparas de control produjeron 27.9 kg/d y las de SDHHH produjeron 33.6 kg/d. Las concentraciones de amoniaco en rumen no fueron diferentes entre los tratamientos y fue de 10,42±1,26 mg/dl en el grupo de control y de 10,63±1,09 mg/dl en las vacas SDHHH. No obstante, la evolución de las concentraciones de amoniaco en rumen después de la alimentación matutina fue diferente (P < 0,02) entre los tratamientos (Figura 8) . Básicamente las vacas SDHHH tenían concentraciones menores de NH3 en el momento de la ingesta, y después aumentaban y se mantenían por encima de las concentraciones correspondientes a las vacas del control hasta 4 horas después de alimentadas . Estos resultados sugerirían una disponibilidad mejorada de N en el rumen de las vacas SDHHH en comparación con las del control . La ingesta de materia seca no se ha visto afectada por el tratamiento, si bien disminuía con el tiempo en el caso de las vacas SDHHH. Se debió probablemente a la baja tasa de consumo (P < 0,05) en las vacas SDHHH en comparación con las vacas del control. La eficiencia de la alimentación tendía a aumentar con SDHHH, y aumenta a medida que aumentaban los días del tratamiento (Tabla 3).

Tabla 3. Como el tratamiento y días de tratamiento afectaron la ingesta de material seca (IMS) , comportamiento alimentario y producción de leche.

Tratamiento Valor P Item Contro SDHHH SE Tratam. Día TratxDía TratxDía 1 xParidad Rend. leche. ,29.6 30.3 1.03 0, .39 <0.001 0.005 0.001 kg/d IMS, kg/d 21.6 20.3 0.72 0, .23 <0.001 0.002 0.39 Tiempo consumo, ,170 174 3.27 0, .39 0.02 0.02 0.77 min/d Tasa de consumo, ,128.8 118.3 3.2 0, .04 0.001 0.15 0.88 g/min Grasa, % 3.42 3.68 0.22 0 .47 0.39 0.65 0.95 Proteína, % 3.32 3.30 0.10 0, .25 0.44 0.41 0.56 Lactosa, % 4.92 4.96 0.03 0 .36 0.68 0.31 0.54 Urea, mg/L 255.8 241.6 15.020 .52 0.03 0.27 0.32 SSCC, 103cel/ml 179.7 135.8 31.18 0 .34 0.31 0.15 0.45 Eficiencia 1.37 1.49 1.56 0 .13 <0.001 <0.001 0.54 leche . , kg/kg La grasa de la leche no se vio afectada por el tratamiento (Tabla 3). No obstante, hubo una interacción significativa entre el tratamiento y la paridad (P < 0,01) . Las vacas primíparas con el tratamiento de control dieron un 2,75% de grasa, mientras que las vacas primíparas con tratamiento SDHHH dieron un 3,96% de grasa. Este aumento de la grasa de leche podría ser la razón porque las vacas primíparas no produjeron más leche con SDHHH como sí ocurrió en el caso de las vacas multíparas. Por otra parte, las vacas multíparas con el tratamiento de control dieron un 4-10% de grasa de manteca, y las vacas multíparas con SDHHH dieron un 3,38% de grasa láctea. Nuevamente, estos resultados podrían explicar, en parte, el aumento del rendimiento de leche observado en las vacas multíparas con SDHHH en comparación con las vacas del control . El contenido en proteína de la leche no se vio afectado por el tratamiento ni por interacción alguna. La lactosa no se vio afectada por el tratamiento tampoco, si bien las vacas primíparas tuvieron valores mayores (P < 0,01) que las vacas multíparas (5,02 frente a 4,86±0,03%, respectivamente) . El contenido en urea de la lecha no fue afectado por el tratamiento, también aumentó progresivamente a medida que aumentaban los días de duración del tratamiento (P < 0,05) en ambos tratamientos.

Los contajes de células somáticas en leche no se vieron afectados por el tratamiento tampoco (Tabla 3) .

La concentración en el rumen de las bacterias Grampositivas tendía (P = 0,07) a disminuir en SDHHH en comparación con las vacas de control a medida que aumentaron los días de tratamiento (Figura 9, cuanto mayor el Ct, menor la concentración de bacterias en el rumen). Es deseable reducir la proporción de bacterias Grampositivas .

Como cuestión de mayor interés, las bacterias Gramnegativas en el rumen aumentaron (P < 0,05) a medida que aumentaron los días de tratamiento SDHHH, mientras que en las vacas de control disminuyeron (Figura 10) . No obstante, no se detectaron diferencias entre tratamientos a lo largo del día de muestreo (a las 0, 2, 4 y 6 horas después de comer), ni en el caso de las bacterias Grampositivas , ni en el de las Gramnegativas .

Finalmente, el recuento de protozoos tendió a ser menor (P = 0.08) en vacas multíparas que recibieron SDHHH que en las vacas multíparas del tratamiento control (Ct = 22.07 vs 21.04+0.27, respectivamente; se debe recordar que un mayor Ct significa un recuento menor) . Además, la evolución del recuento de protozoos fue diferente (P < 0.05) en multíparas que en primíparas en función del tratamiento (Figura 11) . Básicamente, en las vacas multíparas con SDHHH, a medida que se incrementan los días de tratamiento, el número de protozoos decrece, mientras que en vacas primíparas con SDHHH el número de protozoos se incrementó a lo largo del tiempo. De hecho, ignorando los datos del día cero, en general, las vacas primíparas de control tenían 20.82 Ct, y las de SDHHH tenían 19.79 Ct (más protozoos), y las vacas multíparas de control tenían 21.62 Ct, y las de SDHHH tenían 23.2 Ct (menos protozoos) , y esta interacción era significativa con P < 0.01.

Conclusiones Estos resultados muestran que dar un suplemento de SDHHH a las vacas multíparas aumenta la producción de leche después de unos 7-10 días de tratamiento. Este aumento de rendimiento de leche va acompañado por una disminución del contenido en grasa de la leche. En las vacas primíparas no hubo aumento de rendimiento de leche, pero el contenido en grasa de la leche sí aumentó al darles un suplemento de SDHHH a las vacas. El suplementar con SDHHH reduce la concentración de NH3 a la hora de comer, pero la aumenta por encima de las concentraciones correspondientes a las vacas control hasta 4 horas después de comer. Estos resultados sugerirían una disponibilidad mejorada de N en el rumen de las vacas SDHHH en comparación con las vacas control durante por lo menos las 4 primeras horas después de comer.

La concentración en el rumen de las bacterias Grampositivas tiende a disminuir en SDHHH en comparación con las vacas de control a medida que aumentan los días de tratamiento. Como cuestión de mayor interés, las bacterias Gramnegativas en el rumen aumentan a medida que aumentan los días de tratamiento SDHHH. No obstante, no se detectaron diferencias entre tratamientos a lo largo del día de muestreo (a las 0, 2, 4 y 6 horas después de comer) , ni en el caso de las bacterias Grampositivas, ni en el de las Gramnegativas.

Estos resultados confirman los hallazgos de los estudios in vitro que sugieren que el SDHHH promueve el crecimiento de bacterias Gramnegativas en el rumen. Adicionalmente , parece que el SDHHH hacía decrecer la cantidad de protozoos en las vacas multíparas (lo que debería mejorar el uso de las proteínas) , pero no en las vacas primíparas .

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Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (23)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un suplemento alimenticio caracterizado porque comprende proteínas hidrolizadas , donde las proteínas hidrolizadas son proteínas de hemoglobina y tienen un grado de hidrólisis superior al 28% y/o tienen más de 23 mg de nitrógeno a-amino por gramo de proteína y/o tienen, más de 10% de aminoácidos libres.

2. Un preparado alimenticio para rumiantes, caracterizado porque comprende un suplemento alimenticio de proteínas hidrolizadas donde las proteínas hidrolizadas tienen un grado de hidrólisis superior al 28% y/o tienen más de 23 mg de nitrógeno -amino por gramo de proteína y/o tienen más de 10% de aminoácidos libres.

3. Un método para incrementar la masa microbiana en el rumen de un rumiante, caracterizado porque comprende la etapa de añadir en la dieta del rumiante proteínas hidrolizadas, donde las proteínas hidrolizadas tienen un grado de hidrólisis superior al 28% y/o tienen más de 23 mg de nitrógeno a-amino por gramo de proteína y/o tienen más de 10% de aminoácidos libres.

4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque las proteínas hidrolizadas son suministradas como suplemento en la dieta de animales, preferentemente de animales rumiantes.

5. El método de conformidad con una de las reivindicaciones 3 ó 4, caracterizado porque se suministra una cantidad del suplemento equivalente a entre 0% y un 25% de la ración alimenticia del animal, preferentemente la cantidad equivale a entre 1% y 10% de la porción alimenticia del animal .

6. El método de conformidad con una de las reivindicaciones 3 a 5, caracterizado porque el suplemento es suministrado a un animal del grupo formado por vacas, ovejas, cabras, caballos y llamas, preferentemente a vacas lecheras.

7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, caracterizado porque las proteínas hidrolizadas son proteínas animales, preferentemente proteínas de sangre, y muy preferentemente de proteínas de hemoglobina .

8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, caracterizado porque las proteínas hidrolizadas son proteínas vegetales.

9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8, caracterizado porque las proteínas hidrolizadas son obtenidas mediante hidrólisis enzimática.

10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la hidrólisis enzimática se realiza mediante enzimas del grupo de las proteasas .

11. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 u 10, caracterizado porque la hidrólisis enzimática se realiza con un pH comprendido entre 2 y 12.

12. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, caracterizado porque en la hidrólisis enzimática se añade una cantidad de enzima inferior al 25% en peso de la proteína a hidrolizar.

13. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8, caracterizado porque las proteínas hidrolizadas son obtenidas mediante hidrólisis ácida.

14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la hidrólisis ácida se realiza con un ácido del grupo formado por ácido sulfúrico, ácido clorhídrico, ácido nítrico y ácido fosfórico.

15. El método de conformidad con una de las reivindicaciones 13 ó 14, caracterizado porque la hidrólisis ácida se realiza a una temperatura superior a los 60 °C.

16. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8, caracterizado porque las proteínas hidrolizadas son obtenidas mediante hidrólisis alcalina.

17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la hidrólisis alcalina se realiza con un álcali del grupo formado por hidróxido sódico e hidróxido potásico .

18. El método de conformidad con una de las reivindicaciones 16 ó 17, caracterizado porque la hidrólisis alcalina se realiza a üna temperatura superior a los 60°C.

19. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 18, caracterizado porque las proteínas hidrolizadas se añaden al pienso de dichos animales.

20. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 19, caracterizado porque las proteínas hidrolizadas son obtenidas a partir de hemoglobina de un origen del grupo formado por porcino, bovino, ovino, equino y aviar .

21. El uso de un suplemento alimenticio que comprende proteínas hidrolizadas donde las proteínas hidrolizadas tienen un grado de hidrólisis superior a 28% y/o tienen más de 23 mg de nitrógeno a-amino por gramo de proteína y/o tienen más de 10% de aminoácidos libres, para incrementar la masa bacteriana en el rumen de un rumiante.

22. El uso de un suplemento alimenticio que comprende proteínas hidrolizadas donde las proteínas hidrolizadas tienen un grado de hidrólisis superior a 28% y/o tienen más de 23 mg de nitrógeno a-amino por gramo de proteína y/o tienen más de 10% de aminoácidos libres, para incrementar la producción de leche de un animal del grupo formado por vacas, ovejas, cabras, caballos y llamas, preferentemente vacas lecheras .

23. El uso de un suplemento alimenticio que comprende proteínas hidrolizadas donde las proteínas hidrolizadas tienen un grado de hidrólisis superior a 28% y/o tienen más de 23 mg de nitrógeno a-amino por gramo de proteína y/o tienen más de 10% de aminoácidos libres, para incrementar la masa bacteriana Gram-negativa en el rumen de un rumiante.