MX2013012900A - Cepas de escherichia coli con una alta capacidad para la produccion de plasmidos y su uso en la produccio de vacunas de adn. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a nuevas cepas de Escherichia coli W3110 denominadas WGMC, WGM y WGME que poseen las mutaciones AptsG AmanX AmgIABC, AptsG AmanX, y AptsG AmanX AnagE, respectivamente. Como resultado de estas mutaciones, estas cepas muestran una reducción en la velocidad específica de consumo de glucosa. Esta modificación ocasiona una reducción en la velocidad específica de crecimiento y en la velocidad específica de producción de acetato. Las cepas anteriores y otras cepas control fueron transformadas con el plásmido pHN el cual se emplea como vacuna de ADN. Los resultados de cultivos a nivel de matraz indicaron que las cepas WGMC, WGM y WGME muestran un valor de YP/X 3.2, 2.4 y 2.1 veces mayor que el observado para la cepa W3110 transformada con el mismo plásmido.

Description

CEPAS DE ESCHERICHIA COLI CON UNA ALTA CAPACIDAD PARA LA PRODUCCIÓN DE PLÁSMIDOS Y SU USO EN LA PRODUCCIÓN DE VACUNAS DE ADN CAMPO TECNICO La presente invención se refiere a nuevas cepas de Escheríchia coli derivadas de W3110, denominadas WGMC, WGM y WGME, depositadas en ARS Culture Collection (NRRL), del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos, con los números de acceso B-50856, B-50855 y B-50854, que tienen una alta capacidad para producir un plásmido que se emplea como vacuna de ADN. Estas cepas poseen una tasa reducida de consumo de glucosa lo cual ocasiona una baja o nula producción de acetato y como resultado la capacidad de producción de un plásmido, que se emplea como vacuna de ADN, se encuentra aumentada.

Antecedentes de la invención La bacteria anaerobia facultativa E. coli es uno de los hospederos más utilizados para la expresión de proteínas recombinantes y de metabolitos de interes industrial dado sus características genéticas y fisiológicas (Jana y Deb, 2005). En la industria bioteenológica uno de los mayores costos de producción depende de la materia prima, por lo cual, los medios de cultivo para E. coli suelen contener a la glucosa como fuente principal de carbono y de energía, ya que éste es un azúcar abundante y de bajo costo.

Sin embargo, un problema que se ocasiona al trabajar con altas concentraciones de glucosa en medios minerales y en condiciones aerobias es que se genera una velocidad de crecimiento (m) alta y un sobre-flujo metabólico que no es deseable para los procesos de producción (Lara etal., 2007).

Metabolismo de la glucosa La glucosa es la fuente de carbono y de energía preferido por E. coli (Muñoz-Elías y McKinncy, 2006). La translocación de este azúcar a través de la membrana citoplasmática se puede llevar a cabo por una variedad de sistemas de transporte que dependen de las condiciones ambientales. En E. coli, el sistema de fosfotransferasa (PTS) es un sistema involucrado en el transporte y la fosforilación de varios carbohidratos (Deutscher et al., 2006).

Para que E. coli pueda metabolizar a la glucosa, ésta tiene que fosforilarse. La reacción de fosforilación puede llevarse a cabo por el PTS o por la glucocinasa (Glk). La glucosa-6-fosfato (G6P) se metaboliza a través de la glucólisis que es la ruta inicial catabólica de los azúcares para la generación de energía, tal como la fosforilación de ADP a nivel de sustrato, o indirectamente en la producción de acetil-CoA (Figura 1).

La última reacción de glucólisis en E. coli, puede ser catalizada por diferentes enzimas: la enzima El del PTS, y las piruvato cinasas A y F (PykA/F) (Cunníngham et al., 2009). En el siguiente paso, el piruvato se convierte en acetil-CoA, luego éste, se dirige principalmente al Ciclo de los Ácidos Tricarboxilicos TCA (por sus siglas en inglés), y finalmente a cadena respiratoria, aunque, una parte de acetil-CoA también se puede dirigir a la síntesis de acetato por las enzimas fosfato acetil transferasa (Pta) y acetato cinasa (AckA) (ver Figura 1).

El acetato, un problema en la producción bioteenológica De acuerdo con varios autores, la cantidad de acetato producida en un cultivo de E. coli puede variar principalmente por los siguientes aspectos (Van de Walle y Shiloach, 1998): • La cepa cultivada • La composición del medio de cultivo y • La cantidad de fuente de carbono presente Existen modelos computacionales y experimentales (en un medio mineral con glucosa), que muestran una relación directamente proporcional entre la velocidad específica de consumo de glucosa (qs) y la velocidad específica de formación de acetato (qac) (Kayser et al., 2005).

La concentración de glucosa en el medio de cultivo influye no solo en la formación de acetato sino también en su reutilización (Kleman y Strohl, 1994). Cuando la concentración de glucosa es baja en etapas avanzadas del cultivo, o cuando la glucosa se ha consumido completamente o casi, el acetato puede ser re-metabolizado (Kleman y Strohl, 1994).

Varias estrategias genéticas e ingeníenles se han aplicado para reducir la acumulación de acetato en E. coli. Algunas de las estrategias ingeníenles que se mencionan son las siguientes: I. Disminución de la temperatura en el medio de cultivo, en un rango de 28 a 30 °C. Al bajar la temperatura, la velocidad especifica de crecimiento (m) disminuye, lo que se ha visto asociado a una menor velocidad de síntesis de acetato, sin embargo, este subproducto no se elimina por completo. Además, la disminución de la temperatura en un cultivo tiene efectos pleiotrópicos, ya que un gran número de mecanismos celulares y constantes de equilibrio se afectan por la temperatura. Cuando la temperatura decrece, se puede tener un impacto positivo o negativo en las reacciones encargadas de la producción de proteínas heterólogas (Lee S.Y, 1996).

II. Uso de cultivos lote alimentado para controlar la concentración de glucosa. Con el empleo de cultivos lote alimentado se logra controlar la velocidad de consumo de glucosa, lo cual afecta directamente el flujo glucolítico, evitándose un sobre-flujo de acetil-CoA y la consecuente producción de acetato. Se ha observado, que la restricción en la alimentación de la fuente de carbono tiene un gran impacto positivo sobre la producción de proteína recombinante, por lo cual, el control en la velocidad de alimentación es una estrategia de gran interés (Akesson et al., 2001). Sin embargo, a pesar de su extendido uso, el modo lote alimentado presenta algunos inconvenientes como, un control riguroso del sistema de alimentación, una operación constante del cultivo, contaminación, entre otros.

III. Uso de fuentes de carbono alternativas a la glucosa. La sustitución de la glucosa por otro sustrato como el glicerol, la mañosa o la fructosa genera menor cantidad de acetato en un cultivo (Kleman y Strohl, 1994). Esta estrategia tiene como principal problema, que reduce inespecíficamente a la m, y por lo tanto puede que se reduzca la productividad global del cultivo, aspecto que no es deseable ya que la productividad está relacionada directamente con el costo final de un proceso.

Entre las estrategias genéticas aplicadas para reducer la producción de acetato destacan las siguientes: I. Eliminación de las enzimas de la vía de síntesis del acetato. La inactivación de la enzima fosfato acetil transferasa y de la acetato cinasa. Esta modificación directa en el metabolismo tiene la desventaja de reducir la m e incrementar la velocidad de formación de lactato, otro subproducto hetero-fermentativo de la bacteria E. coli (Yang et al., 1999).

II. Incremento del flujo hacia las reacciones anapleróticas. Por medio de la sobre expresión del gen de la fosfoenol piruvato carboxilasa (Ppc) y la desregulación de la vía del glioxalato. Con el incremento de las reacciones anapleróticas se genera una mayor actividad del TCA y por lo tanto una mayor asimilación de acetil-CoA, el principal precursor de acetato. Sin embargo, esta estrategia genética solo disminuye la excreción de acetato hasta un máximo del 60% y además, dado que el fosfoenolpiruvato y el OAA son intermediarios claves entre el catabolismo y la biosíntesis, la alteración del flujo puede afectar el rendimiento de biomasa y la formación de productos (Aristidou etal., 1995).

III. Reducción de la velocidad de consumo de glucosa. Mediante la inactivación de proteínas específicas de transporte de sustrato se logra disminuir la qs. Como ya se ha mencionado antes, la tasa de consumo de glucosa es un parámetro importante que influye en la reducción de acetato. La reducción de la qs también influye en la productividad específica, en la tasa de solubilidad y en la velocidad de proteólisis de las proteínas (Bácklund etal., 2011). Ésta es una de las estrategias que ha tenido mayor impacto en la reducción de acetato, sin embargo, la mayoría de los trabajos enfocados en la disminución de acetato para mejorar la producción de proteínas heterólogas, solo han trabajado con pocas proteína del PTS capaces de transportar a la glucosa. Para la producción de ADN de plásmido se ha reportado que una cepa con el sistema PTS inactivado produjo 40 mg/L de plásmido y 2 g/L de acetato, en tanto que la cepa parental silvestre produjo 17 mg/L de plásmido y 5.3 g/L de acetato (Soto et al., 2011). Estos resultados indican que la reducción en la velocidad de consumo de glucosa puede ser aplicada al mejoramiento de cepas para la producción de ADN de plásmido.

Información general del PTS y de sus componentes Una característica propia de las bacterias Gram-negativas como E. coli, es la presencia de dos membranas concéntricas en torno al citoplasma, donde el espacio entre ellas, se llama periplasma. La membrana externa constituye la primera barrera a la entrada de carbohidratos. El paso al periplasma, se lleva a cabo por canales especializados de tipo proteico, llamados porinas, donde el motor del transporte, es un gradiente de concentraciones. Una vez que el sustrato se encuentra en la región periplasmática, éste se transloca al citoplasma y se fosforila como resultado de la actividad de un conjunto de proteínas del PTS, las generales y una proteína sustrato-específica. La fuerza impulsora tanto para cruzar la segunda barrera como para la fosforilación del sustrato, es la energía liberada de la hidrólisis del grupo fosfato de una molécula de fosfoenolpiruvato que proviene de la glucólisis (Gosset, 2005).

El sistema de fosfotrasnferasa transporta y fosforila a la glucosa, además de otros azúcares. Es importante mencionar que este sistema está ampliamente distribuido en el dominio de las Bacterias pero ausente en el dominio Arquea y en el Eucarionte (Barabote y Saier, 2005).

El sistema PTS en E. coli consiste de dos tipos de componentes: • Dos proteínas generales del PTS; la enzima I (El) y la proteina de histidina (HPr), codificadas por los genes ptsl y ptsH. Estas proteínas participan en la fosforilación de todos los carbohidratos del tipo PTS.

• Complejos azúcar-específicos del PTS, también llamados enzimas II; E. coli cuenta con 21 complejos enzimáticos tipo II codificados ya sea en un gen o en un operón. Estas proteínas son las responsables de la translocación al citoplasma de los diferentes azúcares.

El y HPr son proteínas citoplasmáticas solubles que participan de manera general en la fosforilación de los carbohidratos PTS. Por otra parte, las Ells son proteínas que pueden consistir de una proteína de unión a membrana, que se compone de tres dominios (A, B y C), o más de dos proteínas de las cuales al menos una está unida a la membrana (IIB, IIC o IID) y la otra se encuentra en forma soluble (IIA).

En la actualidad, el modelo de mayor aceptación para el transporte y la fosforilación de azúcares PTS catalizada por las Ells, consiste de los siguientes 3 pasos: 1) El sustrato periplasmático se une con alta afinidad a su proteína específica Eli, si la Eli no está en su forma fosforilada o si no está en complejo con su proteína IIA, el sustrato se transloca pausadamente por difusión facilitada (si este fenómeno llegara a ocurrir, la difusión facilitada ocurre vía un cambio conformacional en la proteína). 2) Alterno o seguido, ocurre la fosforilación del sitio IIB por la proteína IIA, lo que permite una translocación rápida del sustrato al citoplasma. 3) Cuando el sustrato se une al dominio IIB-P ocurre la fosforilación de este, seguido de la disociación del carbohidrato fosforilado dentro del citoplasma.

Las proteínas Ells pueden agruparse en familias basadas en el análisis del alineamiento entre sus secuencias. Cuando los componentes particulares (proteínas transmembranales) del PTS presentan al menos un 25% de identidad entre los aminoácidos, entonces se agrupan en una familia. De acuerdo con esta clasificación existen 5 familias; la familia de la glucosa, la del manitol, la de la lactosa, la de la mañosa y una sin clasificación (Tchieu etal., 2001).

Transporte de glucosa por el PTS El sistema de fosfotransferasa se ha estudiado ampliamente en E. coli y en algunas otras bacterias como Salmonella typhimurium y Bacillus subtilis (Postma et al., 1993; Erni, 2002). En particular se ha estudiado extensamente a la proteína IIBCGIC (PtsG) del PTS en E. coli ya que es la proteína principal encargada del transporte y fosforilación de la glucosa. La subunidad IIBCGIC consiste de dos dominios (Figura 3), el dominio C (41.1 KDa) unido a membrana, el cual se encarga del reconocimiento del sustrato y del transporte, y el dominio B (9.6 KDa) en citoplasma, que fosforila a la glucosa. La proteína PtsG posee una alta afinidad por la glucosa (KM 3-10 mM) y una gran velocidad de transporte (Vmax 126 pmol/min g) (Gosset, 2005) (ver Figura 2).

Se tiene evidencia experimental desde la decada de los 70's del siglo pasado, que el complejo proteico ManXYZ es capaz de transportar y de fosforilar a la glucosa (Curtís y Epstein, 1975). En un trabajo reciente por Picón y colaboradores (2005), donde se inactivó al gen ptsG en la cepa AF1000 (MC4100, relA+ ), observaron un decremento del 33% en la m respecto a la cepa silvestre. Además, en éste mismo trabajo se realizó la doble inactivación (ptsG, manX) con el objetivo de disminuir aun más la velocidad de consumo del sustrato respecto a la muíante AptsG, logrando una m de 0.13 h 1. Bajo esta misma premisa Backlund y colaboradores en el 2008 y en el 2011 realizaron la doble inactivación en ptsG y en manX, obteniendo el mismo resultado respecto a la disminución en la m y en la qs, lo que sugiere entonces, que la proteína ManXYZ contribuye al consumo de glucosa en una muíante AF1000, AptsG.

Algunos otros reportes han sugerido que la proteína BglF (Bramlcy y Komberg, 1987) y MalX (Reidl y Boos, 1991) también deberían tener cierta afinidad por la glucosa (Figura 4), dado que el porcentaje de identidad, entre las secuencias proteicas con respecto a la proteína PtsG es alto >40% (http:bblast.ncbi.nlm.nih.gov/).

Transportadores de glucosa alternativos a la proteína IIBCG|C en E. coli La glucosa también puede ser transportada al citoplasma y fosforilada por las proteínas que están involucrados en la internalización de la galactosa. Se sabe que estos transportadores se inducen en las cepas de E. coli a concentraciones micro-molares de glucosa (Death y Ferencí, 1994). Estos transportadores a diferencia de las proteínas del PTS, solo internalizan a la glucosa, mientras que una cinasa (codificada por el gen glk) fosforila a la glucosa consumiendo una molécula de ATP.

Se ha demostrado, que bajo condiciones de crecimiento donde la concentración de glucosa es inferior a 1 mM (1.8X10-4 g/L), el gen galP que codifica para la proteína transmembrenal GalP se induce. GalP, al ser un transportador de tipo simporte, por cada molécula de glucosa que internaliza, también introduce un protón (H+) al interior de la célula (McDonal et al., 1997).

Los genes del operón mglABC codifican para una proteína dependiente de ATP, un componente periplásmico de unión y una proteína transmembranal (ver Figura 2), respectivamente. Estas proteínas forman el sistema MglABC, el cual transporta glucosa con alta afinidad (Death y Ferenci, 1994). Este sistema se induce cuando la concentración de glucosa está en el rango de 0.3 -1.8 mM.

Uso práctico de mutantes en el PTS En el artículo De Anda y colaboradores (2006) se trabajó con la cepa W3110 a la cual se le inactivaron los genes que codifican para las proteínas generales del PTS. En esta cepa (VH33) además, se sobre-expresó al gen que codifica para la proteína transmembranal GalP con el fin de lograr un consumo de glucosa y una velocidad de crecimiento mayores. La cepa VH33 se cultivó en un termentador en lote para producir a la proteína verde fluorescente (pV21). Con esos experimentos se logro conocer algunos datos importantes: 1. El cultivo en lote de la cepa W3110-pV21 (silvestre) alcanzó una concentración máxima de acetato de 2.83 g/L, mientras que la producción de acetato en la mutante VH32-pV21 (fenotipo PTS GalP+) fue de 0.39 g/L. 2. La qs de la cepa mutante fue 42% menor con respecto a la cepa W3110-pV21. 3. La productividad de la proteína verde fluorescente mejoró en un 239%. 4. El rendimiento de la proteína sobre el sustrato aumentó 3.4 veces.

Por otra parte, el Dr. Larsson trabajó con unas cepas que tienen inactivaciones en genes que codifican para proteínas transmembranales del PTS (Picón et al., 2005), lo que resultó en una reducción de la qs y de la m, respecto a la silvestre. Dos cepas se generaron, una deficiente del gen ptsG, y otra cepa carente de los genes ptsG y manX. La idea fue un menor consumo de glucosa. Los resultados de las m fueron 0.38 y 0.13 h 1 para la mutante AptsG y la mutante AptsG, ManX, respectivamente.

Comparadas con la cepa silvestre AF1000, ésta tuvo un crecimiento de 0.78 h 1 (Bácklund et al., 2011). Esta cepa y sus mutantes mostraron las siguientes características: 1. El cultivo lote de la cepa AF1000 mostró al final del cultivo una concentración de acetato de 1 g/L mientras que la doble muíante disminuyó la producción en 10 veces (0.1 g/L). 2. La concentración de la proteína recombinante aumentó en un 50% (b- galactosidasa) en la doble mutante. 3. La masa celular aumentó en ambas mutantes respecto a la cepa silvestre.

Uso de plásmidos como modelo de producción Los plásmidos se utilizan de manera habitual en los laboratorios de biología molecular desde que se descubrió que pueden ser una buena herramienta de manipulación, transferencia y modificación de la información genética.

En la actualidad, el uso de plásmidos se ha extendido y mas allá de ser una herramienta de biología molecular, se han convertido en vectores terapéuticos. Una de las aplicaciones se basa en el hecho de que los plásmidos que codifican para una proteína viral pueden desencadenar una respuesta inmune y/o celular, sin tener efectos secundarios como las vacunas tradicionales. Por esta razón los plásmidos de este tipo han cobrado gran importancia y han resultado ser prometedores como vectores en terapia génica y vacunación basada en ADN plasmídico (Gurunathan et al., 2000).

En comparación con las vacunas convencionales, las vacunas de ADN plasmídico presentan mayores ventajas. Las más importantes son, que no son infecciosas; dado que el vector únicamente expresa la región del virus o bacteria que se sabe tiene capacidad antigénica, éstas poseen una alta estabilidad tanto genética como ambiental, es posible tener múltiples antígenos en la misma vacuna y especialmente, estas podrían llegar a ser de bajo costo y de fácil producción, características que se buscan en la actualidad (Gurunathan et al., 2000).

Existen en el mercado algunas vacunas de tipo veterinario a base de ADN plasmídico. En este momento, ya se han reportado más de 100 ensayos clínicos de vacunas de ADN (http:bwww.who.int/topics/es/), lo que sugiere que el desarrollo de esta teenología va en aumento y seguramente la demanda en el futuro será grande. Para tales aplicaciones, las dosis empleadas deben de ser del orden de miligramos, lo que implica un reto para la producción de plásmidos (Ulmer et al., 2006).

Los plásmidos con fines terapéuticos están diseñados para expresar en el hospedero el gen de interés, lo que da como resultado, una producción in situ del antígeno (para vacunas) o de una proteína terapéutica (para aplicaciones en terapia génica). El ADN plasmídico usado para estos fines debe contener elementos para su replicación y su selección en hospederos bacterianos y también, todos los elementos que se requieran para la expresión del(de los) antígeno(s) en las células eucariontes (Webster y Robinson, 1997; Gurunathan etal., 2000).

Los elementos mínimos requeridos para este tipo de plásmidos terapéuticos son: • Origen de replicación bacteriana • Gen de selección bacteriana • Promotor eucarionte • Terminador de la transcripción eucarionte • Gen o genes que codifiquen para una o más proteína(s) antigénica(s) Información sobre el plásmido pHN El plásmido pcDNA3.1(+) de Invitrogen fue la base para la generación del plásmido pHN (6.1 kpb) (Herrera et al., 2007) (ver Figura 4). Éste último plásmido se diseñó como una vacuna potencial contra las paperas (Herrera et al., 2007). En el sitio múltiple de clonación del plásmido pcDNA3.1(+), se insertó el gen de la hemaglutinia-neuraminidasa del virus de las paperas. El gen quedó bajo el control del promotor de citomegalovirus humano (CMV) y por lo tanto se espera que cause una respuesta inmune cuando se expresa en células humanas. El plásmido pHN es un plásmido de tipo ColE1 con un origen de replicación pUC, originalmente derivado del origen de replicación pMB1, sin embargo ColE1 tiene una mutación puntual inmediatamente antes de la secuencia del RNAI. Esta mutación es una inversión de guanina a adenina (G -> A) (Lin-Chao et al., 1992) que aumenta el número de copias del plásmido cuando se incrementa la temperatura del cultivo. En esta temperatura, esta mutación, causa que ei RNAII no se pliegue bien, de modo que el RNAI no puede unirse correctamente, y consecuentemente no se controla eficazmente la replicación del plásmido. Sin embargo, este efecto puede suprimirse mediante la reducción de la temperatura del cultivo a 30°C. Por el contrario, un aumento de la temperatura de 42 a 45°C (en ausencia de la proteína Rom) conduce a un aumento en el número de copias del plásmido (de 400 a 500 copias por célula) (Lin-Chao et al., 1992).

Además, el plásmido pHN no sintetiza el RNA modulador (Rom), cuya transcripción daría lugar a un frenado de la replicación del plásmido. Con la inactivación de este gen, el número de copias es de alrededor de 400 (Miki et al., 1987).

Estrategias empleadas para la producción de ADN plasmídico En la actualidad, se ha dedicado un gran esfuerzo a la búsqueda de estrategias para mejorar la producción de ADN plasmídico. Principalmente, se han evaluado las estrategias de fermentación, incluyendo el medio de cultivo, el modo de alimentación y el comportamiento en cultivos de alta densidad celular (O'Mahoncy et al., 2007). Además, se ha estudiado el impacto de diferentes cepas de E. coli en cultivos lote y lote alimentado, la combinación plásmido-cepa y cepas modificadas en las vías metabólicas que afectan directamente el rendimiento y también la estabilidad del plásmido, entre algunas otras (Lara et al., 2007). Sin embargo, no se cuenta con evidencias suficientes que nos permitan elegir a la mejor cepa productora de ADN plasmídico ni al mejor bioproceso.

Los datos experimentales sugieren que la productividad, la tasa de crecimiento, los rendimientos y la formación de subproductos dependen en gran medida de la combinación de la cepa, el plásmido y las características del proceso. Aunque también es cierto que falta información fisiológica de las condiciones de producción, como flujos metabólicos y expresión genética, que nos permitan condensar mejor la información para poder aplicarla a un proceso de producción (Yau et al., 2008). Esto representa un problema, pues no se consigue hablar del efecto de una variable aislada, sino de la combinación de varias.

Las cepas utilizadas actualmente para la producción de plásmido tienden a ser inestables, es decir tienen una tasa de mutación relativamente elevada que conduce a cambios en el ADN cromosomal. Se ha demostrado, por ejemplo, que la cepa de E. coli DH10B tiene una tasa mayor de mutaciones (13.5 veces) en comparación con la cepa MG1655, esto se atribuye principalmente a una mayor tasa de transposición de secuencias de inserción (Bower y Prather, 2009). Esto significa que la cepa en cuestión, quizás no responderá de la misma manera después de muchas duplicaciones, y que las condiciones de cultivo establecidas, ya no serán las más óptimas para la manufactura de la cepa mutante. Esto podría generar variaciones indeseadas en la producción, provocando incluso, pérdidas monetarias.

Por otra parte, la cepa DH5a es ampliamente utilizada en estudios de producción heteróloga. Actualmente es la cepa más productiva en cultivos a pequeña escala (Yau et al., 2008). Sin embargo, la falta de información detallada sobre la fisiología de esta cepa que está altamente modificada en su genoma, es desfavorable para un modelado preciso y un desarrollo de ingeniería genética. Por ejemplo, se había dicho que el gen deoR que codifica para un represor transcripcional, involucrado en la expresión negativa de genes relacionados al transporte y catabolismo de nucleótidos estaba inactivo, no obstante, recientemente se ha demostrado, que este gen está activo en la DH5a (Xia et al., 2011). Además de este inconveniente, la cepa muestra elevado sobre-flujo metabólico (producción de acetato), lo que representa una seria desventaja para la producción de ADN en altas densidades celulares.

Altos rendimientos de ADN plasmídico se atribuyen principalmente a la inactivación del gen recA. Se considera que este gen influyen en la estabilidad del ADN plasmídico porque reduce la degradación de éste. El gen recA se expresa constitutivamente. RecA es una proteína reguladora que induce una respuesta global al daño del ADN que se produce cuando los daños acumulados son tantos que impiden el avance de la maquinaria de replicación (respuesta SOS). Algunos autores han mostrado que en comparación con la cepa silvestre, la inactivación de este gen conduce a una m mayor y a un rendimiento de ADN del más del doble (Singer et al., 2009). Sin embargo, hay autores que no han observado un efecto benéfico, ya que por ejemplo Capaldo y colaboradores (1974) encontraron aproximadamente el 10% de células sin material genético en cada división celular.

Singer y colaboradores (2009) compararon la producción de plásmido utilizando como fuente de carbono a la glucosa y al glicerol en un cultivo de E. coli DH1. En este estudio se mostró que el glicerol como fuente de carbono aumenta significativamente el rendimiento de plásmido (61%), sin embargo, se observa una disminución en la m de 0.90 a 0.61 h 1. El problema es que no se sabe si realmente fue por el cambio de la fuente de carbono, o si fue porque se disminuyó el crecimiento a raíz de que el glicerol no es la fuente de carbono preferida por E. coli.

La influencia de la m en la formación de ADN plasmídico se ha estudiado activamente. El entendimiento del efecto de la velocidad específica de crecimiento sobre el rendimiento de plásmido es de particular importancia para el diseño de estrategias de cultivo. En general, bajas velocidades de crecimiento conllevan a una mayor síntesis de plásmido. A continuación se detalla más sobre este tema, ya que es un antecedente directo de la presente invención.

Efecto de la velocidad de crecimiento sobre la producción de ADN plasmídico La influencia de la m sobre la formación de plásmido ha cobrado gran importancia, ya que este parámetro ha resultado tener un efecto, por lo que se ha convertido en una de las estrategias utilizadas para aumentar la cantidad de ADN plasmídico. Hasta la fecha, lo que se sabe, es que la m reportada en la cual el rendimiento de plásmido es “máximo” no es la misma en diferentes cepas de E. coli. A continuación se muestran trabajos al respecto.

Tipo de correlación obtenida al evaluar la velocidad de consumo de glucosa • Positiva. En la cepa HB101 en un cultivo en quimiostato y medio complejo (LB), se mostró un aumento de 2 a 3 veces en el número de copias del plásmido al aumentar la velocidad de crecimiento de m=0 a 1 h 1 (Reinikainen y Virkajarvi, 1989). El aumento adicional de la tasa de dilución, redujo drásticamente el número de copias. La tasa de dilución crítica fue 1.4 h 1 cuando las celulas contenían el plásmido pBR322 (4.4 kpb). Sin embargo, este fenómeno es cuestionable ya que se ha reportado que la concentración del plásmido es dependiente de la situación nutrimental (Zabriskie y Arcuri, 1986) y en ese trabajo, el sustrato limitante se desconoce, por lo que podría haber tenido una influencia importante a bajas tasas de dilución.

Negativa. En la cepa RR1 se probó la producción del plásmido pBR329 en tres medios de cultivo distintos (M9, M9+fuente rica de nitrógeno y LB) observando un efecto en la velocidad específica de crecimiento dependiente del medio de cultivo. En ese trabajo, se encontró una correlación negativa entre la velocidad de crecimiento y la producción, independiente del medio de cultivo. La baja velocidad de crecimiento (0.2-0.4 h 1) dada por el medio M9 favoreció la producción del plásmido, mientras que el medio LB (0.9-1.2 h 1) afecto negativamente la producción (Bentlcy etal., 1990).

En la cepa JM103 se probó la producción del plásmido pUC8 en medio mínimo en un cultivo continuo, mostrando igual que en caso anterior, que el decremento en el crecimiento es directamente proporcional a el incremento en la producción del plásmido, encontrando el mayor número de copias de plásmido por celula a una m de 0.23 h 1, aumentando 19 veces la producción de plásmido respecto a una velocidad de crecimiento de 0.4 h 1 (Ryan y Parulekar, 1991).

En la cepa M72 se probó la producción del plásmido pPLc-RP en medio complejo (LB) en un cultivo continuo, en donde la mayor producción de plásmido se dio a una baja velocidad de crecimiento (0.64 h 1) mientras que la menor producción fue a una m de 0.9 h 1, aunque en este caso, la cantidad de ADN solo aumento en un 15% (Kim y Ryu, 1991).

Ninguna con un óptimo. En un cultivo continuo donde se trabajaron diferentes tasas de dilución (de 0.23 a 0.64 h 1) en medio M9 + casamino ácidos, se reportó que la cepa HB101 de E. coli, con el plásmido pDM246 (alto número de copias) mostro el mayor número de copias por célula a una tasa de crecimiento de 0.34 h 1. La misma cepa pero con un plásmido distinto (RSF1050) mostró un incremento de tres veces en el número de copias de ADN plasmídico por célula cuando la velocidad de crecimiento fue de 0.35 h 1 (Seo y Bailey, 1986).

Ninguna. En el trabajo de Yau y colaboradores (2008) se reporto que la modificación de la velocidad específica de crecimiento no tiene efecto sobre el rendimiento del plásmido con la cepa y plásmido empledos, sin embargo, son muy pocos los trabajos que no han encontrado ninguna relación entre la velocidad de crecimiento y la producción de plásmido.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Figura 1. Imagen que muestra el metabolismo central de Escheríchia coli.

Figura 2. Imagen que muestra a las proteínas involucradas en el transporte de glucosa en Escheríchia coli.

Figura 3. Confirmación por PCR de las mutaciones AptsG, AmanX, AmglABC, AnagE en las cepas WGMC, WGM y WGME. PM: marcador 1 kb DNA ladder; 1 WGM AptsG, AmanX::km; 2 WGME AptsG, AmanX, AnagE::km y 3 WGMC AptsG, AmanX, AmglABC::cm.

Figura 4. Mapa de plásmido pHN.

Figura 5. Imagen que muestra las cineticas de crecimiento de E. coli W3110 y cepas mutantes derivadas. Concentración de glucosa (cuadros), concentración de biomasa (cículos), concentración de acetato (triángulos). A) W3110, B) WG, C) WGX, D) WGB, E) WGE, F) WGM, G) WGMX, H) WGMB, I) WGME, J) WGP, K) WGC, L) WGMP, M) WGMC, N) WHI, O) WHIP y P) WHIC.

Figura 6. Imagen que muestra las cinéticas de crecimiento de E. coli W3110 y cepas mutantes derivadas transformadas con el plásmido pHN. Concentración de glucosa (cuadros), concentración de biomasa (cículos), concentración de acetato (triángulos). A) W3110p, B) WGp, C) WGMCp, D) WGMEp, E) WGM,p y F) WHICp.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION En la presente invención, mediante el uso de téenicas de ingeniería genética se ha logrado generar cepas derivadas de E. coli W3110 con una alta capacidad para la producción de un plasmido usado como vacuna de ADN. E. coli W3110 es una cepa robusta empleada en varios procesos bioteenologicos. El conjunto de cepas generadas a partir de W3110 en esta invención poseen modificaciones en la capacidad de transporte de glucosa. Estas modificaciones ocasionan que las cepas posean una tasa específica y constante de consumo de glucosa, la cual es menor a la observada para la cepa W3110. Como resultado de la menor tasa de consumo de glucosa, las cepas WGMC (W3110 AptsG AmanX AmglABC), WGM (W3110 AptsG AmanX) y WGME (W3110 AptsG AmanX AnagE) muestran ausencia de producción de acetato y cuando son transformadas con el plásmido pHN, una mayor capacidad de producción del plásmido, el cual puede ser empleado como vacuna de ADN. Estas cepas has sido depositadas en ARS Culture Collection (NRRL), del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos, con los números de acceso B-50856 (cepa WGMC), B-50855 (cepa WGM) y B-50854 (cerpa WGME), respectivamente, las cuales se encuentra listas para ser transformadas con un plásmido de interes útil como vacuna de ADN, como por ejemplo el plásmido pHN y ser utilizada en un proceso para la producción industrial de dicho plásmido.

La bacteria E. coli es empleada comúnmente en procesos biotecnologicos para la generación de un gran numero de productos. Estos procesos se basan en el desarrollo de cultivos que emplean a la glucosa como fuente de carbono. La glucosa es empleada por ser uno de los azúcares más baratos y abundantes, que son metabolizados eficientemente por E. coli. A pesar de las ventajas de usar glucosa en cultivos con E. coli, una gran desventaja es que durante su metabolismo se genera el subproducto acetato. Se ha demostrado en múltiples trabajos que la velocidad de formación de acetato, un subproducto indeseable de fermentación aerobia, está relacionada directamente con la velocidad de crecimiento celular y por lo tanto, a la velocidad del flujo de consumo del sustrato (Eiteman y Altman, 2006).

En un cultivo de E. coli, cuando el sustrato es la glucosa, la velocidad de transporte hacia el citoplasma es alta, por lo que no todo el carbono se utiliza de manera óptima para la generación de biomasa, en vez de ello, se genera acetato. La sobre producción de acetato ocurre típicamente en cultivos lote a altas concentraciones de glucosa (Lara et al., 2007). Se ha reportado que hasta el 30% del carbono se puede perder en la formación de acetato y su liberación no permite que todo el potencial energético y generador de biomasa de la glucosa se utilice, lo que resulta en un decremento del rendimiento, entre otros efectos negativos (Bácklund et al., 2011; Picón et al., 2005).

El acetato retarda el crecimiento e inhibe la producción de proteínas recombinantes aun en concentraciones tan bajas como 0.5 g/L (Luli y Strohl, 1990), esto se debe a que los ácidos de cadena corta reducen la velocidad de síntesis del ARN, del ADN, de las proteínas y de los lípidos. Asi mismo, se ha observado que la producción de ADN de plásmido es menor en cultivos con una cepa que produce un alto nivel de acetato, al compararse con una mutante en PTS que produce un nivel bajo del ácido orgánico (Soto et al., 2011). Desafortunadamente, en un cultivo de E. coli las altas concentraciones de acetato, ocasionan una reducción de productividad (Arnold et al., 2001). Este ácido débil incluso afecta directamente la regulación de genes, particularmente los involucrados en la maqumaria de transcripción-traducción, así como, en la respuesta a estrés (Rosenthal et al., 2008). Por lo tanto, el control de la producción de acetato en cultivos de E. coli es importante para lograr altas densidades celulares y buenos rendimientos de proteína recombinante o de ADN de plásmido (Eiteman y Altman, 2006; Soto et al., 2011)) Se ha propuesto que la formación de acetato por la vía Ack-Pta, es el resultado de un desbalance entre la glucólisis y el TCA, una condición en la que la entrada de carbono excede la velocidad de síntesis de acetil-CoA, lo que trae como consecuencia, la generación de acetato que se excreta al medio de cultivo (ver Figura 1) (Shiloach et al., 1996; Van de Walle y Shiloach, 1998; Kirkpatrick et al., 2001). Dicho de otra forma, el acetato se produce cuando la velocidad de consumo de sustrato, es mayor que la de su conversión en biomasa, ATP y CO2 (Kleman y Strohl, 1994).

Debido a la naturaleza lipofílica del ácido acético que se excretó al medio de cultivo, éste puede cruzar la membrana celular y entonces retornar al citoplasma pues su carga es neutra (ácido acético), generando un gradiente de protones al interior de la célula. Debido a que el ácido acético tiene un pKa inferior al pH de la célula, éste se desprotona interfiriendo con el potencial de membrana para la producción de ATP (Luli y Strohl, 1990).

Como se describió arriba, la generación de acetato en cultivos con E. coli constituye un problema importante en el campo de la bioteenología. Los inventores de la presente invención, buscando proponer una solución a este problema, desarrollaron cepas de E. coli con una capacidad reducida de consumo de glucosa, lo cual causó la reducción o eliminación en la producción de acetato. Considerando que diversas cepas de E. coli poseen características diferentes con respecto a su capacidad de crecimiento y de producción de acetato, se decidió realizar un estudio comparativo con varias de ellas. A partir de las cepas W3110, BW25113 y MG1655, se generaron mutantes que carecen de una o varias de las proteínas involucradas en el transporte de glucosa (ver ejemplo 1) (ver Figura 2, ver Tabla 1). Al crecer estas cepas y sus derivadas mutantes en un medio con glucosa como fuente de carbono, se observó una respuesta marcadamente diferente entre ellas (ver Tabla 8). Se observó una reducción del 22% como consecuencia de la inactivación de ptsG en W3110. En contraste, se observó una marcada reducción del 66% en la m en las cepas derivadas AptsG de BW25113 y MG1655, lo cual no es conveniente para una cepa de producción. Debido a lo anterior, se decidió continuar estudiando a la cepa W3110 y sus derivadas. A partir de la cepa W3110 se generó un conjunto adicional de cepas con mutaciones en diversas proteínas involucradas en el transporte de glucosa (ver ejemplo 2) (ver Figura 3) (ver Tabla 1). La caracterización de estas cepas en cultivos en matraz con medio mínimo conteniendo 2.5 g/L de glucosa, permitió establecer que en algunas de estas cepas mutantes la velocidad específica de consumo de glucosa (qs), así como la velocidad específica de producción de acetato (qac) se habían reducido, al compararse con los datos correspondientes de la cepa silvestre W3110 (ver ejemplo 3 y Tabla 9).

A fin de verificar si estas cepas mutantes poseían una ventaja en relación a la cepa parental W3110 en cuanto a la producción de plásmidos, algunas de ellas fueron evaluadas en cuanto a la producción del plásmido pHN, empleado como vacuna de ADN. Las cepas W3110, WG, WGMC, WGM, WGME y WHIC fueron transformadas con el plásmido pHN para generar las nuevas cepas W3110p, WGp, WGMCp, WGMp, WGMEp y WHICp, respectivamente (ver ejemplo 4). Dichas cepas fueron crecidas en cultivos en matraz con medio mínimo conteniendo 2.5 g/L de glucosa. Bajo estas condiciones de cultivo, la cepa W3110p acumuló 0.4 g/L de acetato y mostró un valor de rendimiento del producto, pHN, sobre biomasa (YP/X) de 0.79 mg/g. En contraste, la cepa WGp no acumuló acetato y mostró un valor de (YP/X) de 1.14 mg/g. El incremento en YP/X observado para WGp se puede explicar como consecuencia de la ausencia de producción de acetato, lo cual elimina la pérdida de esqueletos de carbono y el posible efecto tóxico resultante de la acumulación de este ácido orgánico. En el cultivo con la cepa WGMCp tampoco se detectó acetato en el medio y sin embargo se observó un YP/X significativamente mayor, de 2.56 mg/g. Este es un resultado inesperado, ya que tanto la cepa WGp como la cepa WGMCp no muestran acumulación de acetato, sin embargo, la cepa WGMCp mostró un incremento de 2.24 veces en el valor de YP/X con respecto a WGp. Por lo tanto, el incremento en la capacidad de producción del producto pHN no puede atribuirse únicamente a la falta de producción de acetato en el caso de la cepa WGMCp. Así mismo, al compararse con WGp, las cepas WGMp y WGMEp mostraron un incremento en YP/X de 1.68 y 1.48 veces, respectivamente. En conclusión, los resultados obtenidos indicaron que las cepas WGMC, WGM y WGME, al ser transformadas con un plásmido, como se ejemplificó con el plásmido pHN, poseen una mayor capacidad para la producción del plásmido al compararse con las cepa W3110 o WG (ver ejemplo 4 y tabla 10).

MATERIALES Y METODOS Los microorganismos empleados en la presenta invención se presentan en la Tabla 1, y los oligos usados para la construcción y verificación se muestran en el anexo de LISTADO DE SECUENCIAS.

Tabla 1. Cepas de E. coli empleadas en este trabajo *Se indica el nombre de la cepa donadora para transducción por P1 o el nombre de los oligos empleados parta inactivación mediante producto de PCR.

Como modelo para la generación de un producto de interes comercial (modelo de vacuna de ADN), en la presente invención se empleó al plásmido pcDNA HN176-MuV, denominado como pHN (ver Figura 4).

Al plásmido pcDNA3.1, se le clonó un gen que codifica para un antígeno que genera respuesta inmune contra la parotiditis (hemaglutinina neuraminidasa HN-). El plásmido pHN lo donó amablemente la Dra. Blanca Barrón de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del Instituto Politéenico Nacional (Herrera et al., 2010).

Técnicas moleculares Extracción de ADN plasmídico por miniprep La extracción de ADN plasmídico en la mayoría de los casos se realizó por miniprep. Esta técnica se fundamenta en la lisis alcalina de las células bacterianas, seguido de la re-naturalización selectiva del ADN plasmídico.

Purificación del plásmido pHN a pequeña escala Para la purificación del plásmido pHN (modelo de vacuna de ADN) se empleó el kit comercial QIAquick de QIAGEN.

El protocolo de purificación de plásmidos de QUIAGEN se basa en una modificación del protocolo de lisis alcalina, seguido por la unión del ADN plasmídico a la resina de intercambio iónico de QIAGEN en condiciones apropiadas de bajo contenido en sales y bajo pH. El RNA, las proteínas y las impurezas de bajo peso molecular se eliminan por medio de un lavado de sales. El ADN plasmídico se eluye en un buffer de alto contenido en sales y después se concentra y se desala mediante precipitación con isopropanol. Cada resina está diseñada para funcionar por gravedad, lo que reduce el tiempo de purificación.

Extracción de ADN cromosomal La extracción del ADN cromosomal se realizó por simple ebullición. Esta téenica se fundamenta en la característica fisiológica de las bacterias Gram-negativas, las cuales poseen membranas celulares de fácil acceso para el rescate del material genético. En este caso, con una simple ebullición del paquete celular en agua, de 10 a 15 min es suficiente para liberar al cromosoma bacteriano (molécula de alto peso molecular).

Transformación por electroporación La electroporación es un método de transformación bacteriana que consiste en la administración de pulsos rápidos de una corriente eléctrica de gran voltaje (2500 Volts) a fin de producir poros transitorios en la membrana de la bacteria y volverla permeable el ingreso de ADN recombinante.

Electroforesis de ADN en gel de agarosa La electroforesis en gel de agarosa se basa, en la carga neta del ADN (carga negativa, dada por el fosfato unido al esqueleto de azúcar) como en el tamaño del fragmento (un tamaño particular para cada región de ADN amplificado). El concentrado de ADN cargado en el gel, se somete a un campo eléctrico, lo cual permite la migración de ADN hacia el ánodo. Dado que el gel es un polímero de agarosa con un tamaño de poro específico la velocidad de migración es inversamente proporcional a su tamaño. Así, mientras más pequeña es una molécula de ADN más fácilmente migrará a través del gel, por lo cual es posible identificar el tamaño del producto en comparación a un marcador de peso molecular conocido (1 kb).

Transducción con el bacteriófago P1vir La transducción es el método de recombinación genética por el cual se introduce ADN exógeno en una célula por medio de un vector viral. Esta téenica, parte de la idea de contar previamente con una cepa que tenga la mutación deseada y de este modo pasarla a otra cepa mediante el fago P1 vir.

El bacteriófago P1 HT int4 (Schmieger, 1972) se utilizó en este trabajo para introducir mutaciones en las cepas por recombinación homologa. Este fago P1 presenta dos mutaciones HT e int, que le confiere respectivamente una elevada frecuencia de transducción, y una deficiencia en la integración del ADN del bacteriófago en el cromosoma de la cepa receptora, evitando así la lisogenia. El bacteriófago P1, se utilizó en este trabajo para la construcción de cepas con mutaciones en los siguientes genes; ptsG (glucosa), manX (mañosa), malX (maltosa), fruA (fructosa), bglF (b-glucosidos), nagE (N-acetil-glucosamina), galP (galactosa), mglA (galactosa).

Comprobación de las inactivaciones cromosomales En el anexo de LISTADO DE SECUENCIAS se muestran los oligonucleótidos (oligos) empleados para la comprobación de las mutantes obtenidas por transducción. Para esto, se verificó que el tamaño del producto fuera el correspondiente a cada gen que se inactivó. El diseño de los primers se realizó con el programa Clone Manager Profesional Suite versión 6 y se aceptaron solo aquellos oligos cuya Tm, según la fórmula termodinámica, estuviera en el rango de 50 a 70 °C y que además, no formaran estructuras secundarias con Tm superior a 37 °C.

Técnicas de mutagénesis sitio dirigida Inactivación de genes cromosomales por productos de PCR Con la metodología descrita por Datsenko y Wanner (2000) es posible remplazar una secuencia cromosómica específica, por un gen de resistencia a antibiótico generado por PCR. Para esta técnica, se utilizan oligos con extensiones homologas correspondientes al gen a inactivar. Estas extensiones, permiten la recombinación del producto de PCR mediante la recombinasa Red del fago l en las regiones que flanquean al gen. Después de la selección de las mutantes, la resistencia al antibiótico se puede eliminar utilizando un plásmido auxiliar que expresa la recombinasa FLP, actuando sobre las secuencias directas repetidas FRTs adyacentes al gen de resistencia.

Estrategia para la eliminación del cassette de resistencia en las cepas mutantes Es posible eliminar el cassette de resistencia de las mutantes siempre y cuando se haya empleado la téenica descrita por Datsenko o alguna modificación de ésta, pues las inactivaciones obtenidas poseen regiones FRT, las cuales son reconocidas por la recombinasa FLP. Esto hace posible que un marcador de selección pueda volver a ser usado, como es el caso del presente trabajo, donde se utilizó por lo general el cassette de kanamicina. Para lograr esto, se transformó con el plásmido pCP20 que codifica para la recombinasa FLP. Las células transformadas se sembraron en medio solido con Ampicilina a 30 °C, y se incubaron durante 16 horas.

Las transformantes obtenidas se sembraron en medio solido no selectivo a 42 °C para favorecer la pérdida del plásmido. Para finalizar, se comprobó por PCR la perdida de la resistencia con los oligonucleótidos específicos de cada inactivación, que en este caso flanquearon el locus del gen.

Sistemas de cultivo de E. coli Medios de cultivo de uso general Se utilizaron varios medios de cultivo durante la caracterización y construcción de las mutantes. En las siguientes tablas se menciona su composición.

Medio LB (Sambrook et al., 1989). Medio de cultivo liquido que se utilizó de forma rutinaria tanto para el crecimiento de las mutantes que serian almacenadas a -70°C (gliceroles), como para los inóculos que fueron utilizados como pre-inoculos (ver Tabla 2).

Tabla 2. Composición del medio LB.

Componente g/L Triptona 10 Extracto de leva 5 NaCI 10 LB agar. Medio de cultivo utilizado para el crecimiento bacteriano en medio sólido. La composición de este medio, es la misma que la usada para la realización del medio LB, con la diferencia, que el medio LB agar, se suplementa con 15 g/L de agar para bacteriología.

LB agar blando. Medio empleado para la obtención y titulación de lisados fágicos. La composición es la misma que la del medio LB, pero este es suplementado de 6-8 g/L de agar para bacteriología.

Medio SOC (Hanahan et al., 1991). Medio utilizado para la recuperación de células después de la electroporación (ver Tabla 3).

Tabla 3. Composición del medio SOC.

Componente g/L Peptona trípsica de caseína 20 Extracto de levadura 5 NaCI 0.58 KCI 0 19 MgCI2 2.03 MgSO4 246 Glucosa 3.6 Medio de cultivo usado para la caracterización del crecimiento La cantidad y composición del medio de cultivo empleado para la caracterización de todas las cepas generadas se describe en la Tabla 4. Se usó el mismo medio de cultivo para los inóculos y para las cinéticas de crecimiento.

Tabla 4. Composición del medio mineral M9 10X.

Componente g/L En la preparación del medio de cultivo M9, primero se disolvieron las cantidades requeridas de sales tales como: Na2HP04, KH2P04, (NH4)CI y NaCI en un volumen adecuado de agua destilada. Se ajusto el pH a 7.2 con NaOH 10 M y posteriormente la solución se esterilizó en una autoclave por 20 min a 121 °C y 15 psi. Por separado, se prepararon soluciones stock de MgSO47H20 (1 M), y de CaCI2 (1 M) las cuales se esterilizaron en las mismas condiciones que la sales. También, se prepararon soluciones stock de tiamina (30 mg/ml) y ampicilina (30 pg/ml), pero estás se esterilizaron por filtración. En segundo lugar, se agregaron estos componentes (MgSO4-7H20, CaCI2 y antibiótico) al medio mineral estéril, en las cantidades descritas. Finalmente, la concentración de glucosa puesta a la solución resultante, fue de 2.5 g/L proveniente de una solución stock de 200 g/L, anteriormente esterilizada.

Medio de cultivo para la producción de pHN La composición del medio de cultivo empleado para el cultivo de las cepas que se eligieron para producir el plásmido pHN se describe en la Tabla 5.

Tabla 5. Composición del medio mineral PD 10X.

Componente g/L Tiamina-HCI 0.01 Ampicilina BBMMI MgS04-7H2O 1.0 Solución de elementos traza 4 mL/L (250X) Para los inóculos y la cinética, el medio consistió de la misma composición y cantidad de nutrientes, con una concentración de glucosa de 2.5 g/L proveniente de una solución stock de 200 g/L, previamente esterilizada. Para la preparación del medio se disolvieron las cantidades requeridas de sales tales como: K2HPO4, KH2PO4, (NH4)2S04, (NH4)CI y citrato de sodio en un volumen adecuado de agua destilada. Además se ajusto el pH a 7.2 con NaOH 10 M, la solución se esterilizó en una autoclave por 20 min a 121 °C y 15 psi.

Por separado, se prepararon y se esterilizaron soluciones stock de MgS047H20 (1M), glucosa (200 g/L) y elementos traza (250X) (ver Tabla 6) a 121 °C y 15 psi por 20 min. De igual modo se prepararon soluciones stock de tiamina (30 mg/ml) y ampicilina (pg/ml) pero estas se esterilizaron por filtración.

Tabla 6. Elementos traza 250X.

Componente g/L Na EDTA 7.05 COCI2-7 H20 1.25 MnCI24H20 7.5 CUCI2-2 H20 0.75 H3BO3 1.5 NaMo04 -2H20 1.05 Zn (CH3COO) 2 16.9 Citrato férrico 50.4 Antibióticos Los diferentes medios de cultivo se suplementaron siempre con el antibiótico correspondiente a cada mutante. Estos antibióticos se añadieron al medio estéril a partir de una solución concentrada conservada a -20°C. Todas las soluciones de antibiótico se esterilizaron por filtración, en una membrana de tamaño de poro de 0.22 mm marca ILLEX® GV. En la Tabla 7 se muestran las concentraciones finales a las que fueron utilizados los antibióticos.

Tabla 7. Antibióticos empleados.

Antibiótico Concentración en el medio (pg/ml) Ampicilina (Amp) 100 Carbenicilina (Cb) 100 Cloranfenicol (Cm) 30 Kanamicina (Km) 30 Ampicilina (sal sódica): se preparó una solución concentrada a 100 mg/ml_ en agua bidestilada.

Carbenicilina: se preparó una solución concentrada a 100 mg/mL en agua bidestilada.

Cloranfenicol: Se preparó una solución concentrada de 30 mg/ml en etanol absoluto. Kanamicina (Sulfato acido): Se preparó una solución concentrada de 30 mg/ml en agua destilada.

Cultivos en matraz agitado Los estudios de crecimiento se realizaron por triplicado en matraces Erlenmcyer bafleados con capacidad de 250 mL, con un volumen de operación de 50 mL de medio de cultivo mínimo (M9 o PD), con 2.5 g/L de glucosa a 37 °C y 300 rpm. Todos los cultivos se crecieron en la incubadora “New Brunswick Scientifíc classic series C24KC Refrigerated Incubator Shaker Edison NJ, USA”. En condiciones de esterilidad, los medios minerales (M9 y PD) se inocularon con una cantidad de biomasa tal que la absorbancia inicial (600nm) del cultivo fuera de 0.10 ± 0.01. Para la inoculación del matraz, se partió de un cultivo semilla crecido bajo las condiciones mencionadas anteriormente y tomado siempre en fase exponencial. Cada cultivo semilla fue crecido por un tiempo dependiente de cada cepa, procurando que el cultivo semilla siempre llegara al final de la fase exponencial, en este caso la ?.Oboo oscilaba entre 2.25 y 2.75 (nota: se procuraba tomar en este intervalo ya que si se tomaba a una D.O de 1 o arriba de 3 el cultivo sufría de fase lag o simplemente se retrasaba su crecimiento). El cultivo semilla provino de un cultivo (pre-inoculo) crecido en LB overnight.

Métodos analíticos para el seguimiento de los cultivos Determinación de la concentración de biomasa Medición de la absorbancia del cultivo La concentración de biomasa se determinó en base a la densidad óptica medida a una longitud de onda de 600 nm (Luz Visible) en un espectrofotómetro de la marca Beckman DU-70 [California, USA] Para esto, se extrajeron muestras del cultivo y se mezclaron en cantidades adecuadas con agua destilada para diluir a la concentración necesaria, esto es, entre 0.1 y 0.5 D.O (diluciones de 1:1 y 1:8 se tuvieron que realizar).

Dado que son cultivos de baja densidad celular, cuantificar la biomasa se vuelve inespecífico por la baja cantidad de biomasa obtenida y el error se hace más grande entre menor sea la cantidad analizada, por lo que, para obtener la cantidad de biomasa en cada punto de la cinetica se utilizó una relación de, 1 D.O = 0.37 g/L (De Anda et al., 2006) Cuantificación de la glucosa y el acetato por cromatografía liquida de alta resolución (HPLC) Para determinar la concentración del acetato y de la glucosa extracelular, se tomaron muestras de 1 mL en tubos eppendorf de los cultivos y después se centrifugaron por 5 min a 13 000 rpm. El sobrenadante se filtró por membranas Millipore Millex-HN de Nylon con tamaño de poro de 0.45 pm. La cuantificación se realizó en un equipo de HPLC equipado con detectores de índice de refracción (IR) y de fotoarreglo de diodos (UV), utilizando una columna de Aminex HPX 87H (Biorad). Como fase móvil, se utilizó una solución de H2SO4 5 mM a un flujo de 0.5 mL/min y a una temperatura de 50 °C.

Se construyeron dos curvas estándar, una para el acetato y otra para la glucosa. Se utilizaron 5 concentraciones para la formación de estas rectas. En el caso de la curva de acetato la máxima concentración fue de 1 g/L y la mínima de 0.05 g/L, por otra parte, la máxima concentración de glucosa que se manejo fue de 3 g/L y la mínima de 0.01 g/L. Los datos se ajustaron a una recta que se hizo pasar por cero con un valor de r2 = 0.99 Cuantificación de ADN por nanodrop Para la cuantificación del ADN tanto lineal como circular (pHN), se utilizó un espectrofotómetro con capacidad micro, el Nanodrop 2000c de Thermo SCIENTIFIC a una longitud de onda de 260nm.

Cálculos cinéticos y estequiométricos Una vez que se ha realizado un experimento, es necesario determinar parámetros que nos indiquen la magnitud del cambio obtenido entre las mutantes y el control, por ello se determinaron los cálculos de la misma forma para cada muíante.

Los parámetros evaluados fueron: la velocidad específica de crecimiento (m): el rendimiento biomasa/sustrato (Yx/S), el rendimiento producto/biomasa (Yp/X), la velocidad especifica de consumo de glucosa como sustrato (qs), la velocidad especifica de producción de acetato (qac), el producto al final del cultivo (Pmáx) así como la productividad especifica (qp), los cuales se determinaron durante la fase de crecimiento exponencial. Las expresiones matemáticas que se emplearon para calcular estos parámetros se detallan a continuación.

Nomenclatura: D interrumpir, inactivar PTS sistema de fosfotransferasa ptsG gen del principal transportador de glucosa del sistema PTS malX gen del transportador de maltosa del sistema PTS bglF gen del transportador de b-glucosidos del sistema PTS nagE gen del transportador de N-acetil-glucosamina del sistema PTS manX gen del transportador de mañosa del sistema PTS galP gen del transportador simporter de galactosa mglABC gen del transportador tipo ABC de galactosa ptsHIcrr genes de los components comunes de PTS m velocidad específica de crecimiento Yx/s rendimiento biomasa/sustrato Yp/x rendimiento producto/biomasa qs velocidad especifica de consumo de sustrato dac velocidad especifica de producción de acetato P máx concentración de producto al final del cultivo dp productividad especifica Cálculo de rendimientos Los rendimientos Yx/S, Yp/S y YP/x, durante la fase de crecimiento exponencial fueron calculados mediante la determinación de la pendiente en la gráfica S (sustrato= glucosa) contra X (biomasa), S contra P (producto) o X contra P, de manera correspondiente.

Cálculo de las velocidades específicas de conversión La velocidad específica de crecimiento se obtuvo durante la fase exponencial de crecimiento, mediante el cálculo por regresión lineal (Inx =pt + InXo), esto es, graficando el logaritmo natural de la concentración de biomasa contra el tiempo. Donde la pendiente representa la velocidad de crecimiento. El metodo de mínimos cuadrados obtenidos en todas la cinéticas mostró correlaciones mayores o iguales a 0.97.

Las velocidades específicas de consumo de sustrato, producción de acetato y productividad específica se calcularon con las siguientes ecuaciones: qs = Uc/s · M dac— Uc/ac ' H dp - Yp/x m EJEMPLOS Ejemplo 1. Generación y caracterización de cepas derivadas de MG1655, BW25113 y W3110 con inactivaciones de genes involucrados en el consumo de glucosa.

Como primera parte de la presente invención, se inactivaron los genes ptsG y manX en las cepas MG1655, BW25113 y W3110. La inactivación se efectuó mediante la teenica de transducción con el bacteriófago P1vir, empleando como cepas donadoras a E. coli JW1087-2 y JW1806-1. Las inactivaciones fueron verificadas mediante PCR usando como controles a las cepas progenitoras y los oligos ptsGF, ptsGR, manXF y manXR, obteniéndose los resultados esperados.

Se estudió el efecto que tiene la deleción de los genes ptsG y manX sobre el consumo de glucosa en varias cepas derivadas de K-12. En las cepas W3110, MG1655 y BW251 13, se inactivó por remoción a los genes ya sea solo ptsG o ptsG y manX. Se caracterizó en la cepa parental y en las mutantes generadas, la cinética de crecimiento y la estequiometria del consumo de la glucosa y la producción de acetato y de biomasa celular. Los datos se presentan en la Tabla 8. Estos resultados se obtuvieron en medio mineral M9 con 2.5 g/L de glucosa como única fuente de carbono y energía.

En la Tabla 8 se presentan los resultados de las cepas W3110, MG1655, BW25113 y de sus mutantes en AptsG y AptsG, AmanX. Se reporta la m, la qs, la velocidad de producción de acetato (qac) y el rendimiento de biomasa sobre sustrato (Uc/s).

Hay varios aspectos importantes a resaltar de la respuesta a las inactivaciones en genes de transporte de sustrato en las cepas K-12 (ver Tabla 8). La m disminuyó o aumentó conforme lo hizo la qs de manera lineal. La qac fue mayor para la cepa parental MG1655 respecto a la cepa W3110 (aun cuando la qs fue mayor en la cepa parental W3110). La cepa BW25113 mostró la mayor velocidad de producción de acetato, pero también fue la que tuvo mayor velocidad de consumo de sustrato. Mientras que el Yx/S para cada cepa y mutantes fue similar.

La cepa W3110 mostró un rendimiento de acetato sobre sustrato Yac/s =0.14 gac/gs, la cepa MG1655 tuvo un Yac/S =0.20 gac/gs, y la cepa BW25113 mostró un Y ac/s =0.28 gac/gs· Lo que nos indica, que la cepa W3110 produce la menor cantidad de acetato (0.14 g a partir de un gramo de glucosa) respecto a las otras dos cepas evaluadas. Por otra parte, si calculamos el rendimiento de acetato sobre biomasa (Yac/x) las relaciones cambian. La cepa W3110 mostró un Yac/X0.44 gac/gx, la cepa MG1655 tuvo un Yac/x 0.44 gac/gx, y la cepa BW25113 mostró un Yac/X 0.72 gac/gx· Esto sugiere, que la cepa W3110 y la cepa MG1655 tienen un sobre-flujo metabólico similar, ya que 1 gramo de biomasa produce la misma cantidad de acetato. Por otro lado, este dato nos indica que la cepa BW25113 produce casi el doble de acetato con la misma cantidad de biomasa. Finalmente, con respecto al Yx/Sse puede observar que prácticamente las tres cepas dirigen la misma cantidad de glucosa a biomasa durante todo el cultivo.

Del análisis anterior, podemos predecir que la qs en la cual ya no se detectará acetato es similar en las cepas MG1655 y W3110, dado que observamos que el sobre-flujo metabólico es igual para estas cepas. Por otra parte, la qs en la cual ya no se detectará acetato en las cepas derivadas de BW25113, es más baja respecto a las otras dos cepas evaluadas.

En las cepas BW25113 y MG1655, al eliminar el gen ptsG, la velocidad de crecimiento disminuye alrededor de un 71%. Por otra parte, al inactivar el gen manX (además del gen ptsG) en ambas cepas, se observó un aumento en la velocidad de crecimiento con respecto a la muíante sencilla, AptsG. El aumento en la m de la muíante doble respecto a la sencilla en el fondo genético MG1655 fue de 35%, mientras que en el fondo BW25113, el aumento en la m fue de un poco más que el triple.

Por otra parte, únicamente la cepa W3110 con las inactivaciones en ptsG y ptsG, manX mostró que al inactivar secuencialmente los genes relacionados al transporte de glucosa, la velocidad de crecimiento disminuyó de manera sostenida.

Tabla 8. Parámetros cinéticos y estequiométricos de las mutantes AptsG y AptsG, AmanX.

Cepa Características m (??') qs (g/g h) qac(g/g ) Yx/s MG1655 0.60 - 1.37 ± 0.28 ± - 6.02 0.14 0.02 _ MG 6.20 ± 0.49 i MG1655 AptsG.: Km 002 008 N D 043 ± 004 BW251 13 0.65 + 1.74 + O.48 + F-, A(araD-araB)567 0.03 0.16 0.03 0.38 + 0.02 BG BG AmanX:: Km 0.02 0.19 O.05 0.35 ± 0.05 W3110 WG W3110 AptsG::K o.oi 0.15 0.08 + 0.06 0.46 + 0.13 WGM 0.36 + 0.79 0.03 0.06 0.46 ± 0.06 Los resultados anteriores muestran que las inactivaciones de los genes ptsG y manX tienen efectos diferentes en las tres cepas estudiadas. A diferencia de lo obseivado con MG1655 y BW25113, en el caso de la cepa W3110 y derivadas, se observó un decremento gradual de la capacidad de consumo de glucosa al eliminar ptsG o ptsG y manX. Esta respuesta es congruente con ei papel relativo de los transportadores de glucosa inactivados. Considerando lo anterior, se decidió continuar este trabajo únicamente con la cepa W3110.

Ejemplo 2. Inactivación de genes involucrados en el consumo de glucosa en la cepa W3110 y cepas derivadas.

En E. coli existen otras proteínas involucradas en el consumo de glucosa, además de aquellas codificadas por ptsG y manX (ver Figura 2). Por lo tanto, se decidió generar mutantes adicionales en proteínas con función conocida o probable en el transporte de glucosa. Se decidió inactivar genes codificantes para proteínas de los sistemas de transporte de beta-glucósidos ( bglF ), maltosa ( malX ), N-acetilglucosamina (nagE), así como dos transportadores de galactosa ( galP y mglABC). La diferentes inactivaciones se efectuaron ya sea mediante la téenica de transducción con el bacteriófago P1 vir, empleando las cepas donadoras indicadas en la Tabla 1, o bien, mediante la técnica de interrupción cromosomal, empleando los oligonucleótidos SEQ. ID NO: 21 y SEQ. ID NO: 22. Las inactivaciones fueron verificadas mediante PCR usando como controles a las cepas progenitoras y los oligonucleótidos SEQ. ID NO: 1, SEQ. ID NO:2, SEQ. ID NO:3, SEQ. ID NO:4, , SEQ. ID NO:5, SEQ. ID NO:6, SEQ. ID NO:7, SEQ. ID NO:8, SEQ. ID NO:9, SEQ. ID NO:10, SEQ. ID NO: 11, SEQ. ID NO:12, SEQ. ID NO:13, SEQ. ID NO:14, SEQ. ID NO:15, SEQ. ID NO:16, SEQ. ID NO: 17 y SEQ. ID NO: 18) obteniéndose los resultados esperados. Como ejemplo, se comprueban los resultados obtenidos con las cepas WGM, WGME y WGMC. En la Figura 3 se muestran geles en donde se confirma por PCR la presencia de las mutaciones AptsG AmanX AmglABC, AptsG AmanX, y AptsG AmanX AnagE, en las cepas WGMC, WGM y WGME respectivamente.

Ejemplo 3. Caracterización de la cepa W3110 y cepas derivadas en medio mineral con glucosa como fuente de carbono.

Los efectos de la inactivación de genes que codifican para diversas proteínas con un papel conocido o posible sobre el transporte de glucosa, con las mutantes generadas en el ejemplo anterior se muestran en la Tabla 9 y la Figura 5.

Tabla 9. Parámetros cinéticos y estequimétricos de W3110 y mutantes derivadas que carecen de proteínas transportadoras de glucose.

Características Cepa* (h 1) qs(g/g h) qac(g/g h) Yx/s relevantes 0.08 ± WG AptsG:: Km 0.51 ± 0.01 1.27 ± 0.15 0.46 ± 0.13 0.06 WGM AptsG, AmanX::Km 0.36 ± 0.03 0.79 ± 0.06 N.D. 0.46 ± 0.06 WGMF WGM, MruA:: Km 0.37 ± 0.03 0.86 ± 0.11 N.D. 0.43 ± 0.06 WGMX WGM, AmalX:: Km 0.32 ± 0.01 0.70 ± 0.07 N.D. 0.45 ± 0.05 WGMB WGM, AbgIF.Km 0.29 ± 0.00 0.81 ± 0.09 N.D. 0.33 ± 0.01 WGME WGM, AnagE.:Km 0.28 ± 0.02 0.68 ± 0.00 N.D. 0.39 ± 0.03 WGM WG, AmanX:: Km 0.36 ± 0.03 0.79 ± 0.06 N.D. 0.46 ± 0.06 WGX WG, AmalX:: Km 0.23 ± 0.03 0.61 ± 0.00 N.D. 0.33 ± 0.00 O.08 ± WGB WG, AbglF:: Km 0.43 ± 0.04 1.29 ± 0.03 0.35 ± 0.03 O.02 WGE WG, AnagE::Km 0.41 ± 0.02 0.83 ± 0.07 N.D. 0.50 ± 0.06 O.11 ± WGA WG, AfruA Km 0.53 ± 0.02 1.40 ± 0.43 0.39 ± 0.10 0.01 WGP AptsG, galP::Km 0.49 ± 0.08 1.45 ± 0.00 0.07 ± 0.00 0.36 ± 0.01 WGC AptsG, 0.48 ± 0.01 1.24 ± 0.00 0.10 ± 0.00 0.39 ± 0.05 AmglABC:;Km AptsG, AmanX, WGMP 0.29 ± 0.01 0.68 ± 0.01 N.D. 0.43 ± 0.01 AgalP:: Km AptsG, AmanX, WGMC 0.31 ± 0.01 AmglABC:: Cm 0.82 ± 0.00 N.D. 0.38 ± 0.00 AptsHIcrr.·. Cm, WHIP 0.18 ± 0.02 0.39 ± 0.02 N.D.

AgalP.Km 0.42 ± 0.04 AptsHIcrr, WHIC 0.20 ± 0.01 0.39 ± 0.02 N.D. 0.32 ± 0.05 AmglABC:: Cm WHI AptsHlcrr::Cm 0.25 ± 0.01 0.60 ± 0.04 N.D. 0.42 ± 0.02 WHIPC 0.20 ± 0.01 0.40 ± 0.04 N.D. 0.41 ± 0.01 AmglABC::Cm 0.35 ± WHIK WHI, Aglk::Km 0.17 ± 0.00 0.48 ± 0.01 N.D. 0.01 * Todas las cepas mutantes fueron generadas a partir de la cepa W3110 La respuesta cinética y estequiométrica de las cepas mutante WGM, WGMF, WGMB y WGME se presenta en la Tabla 9. Respecto al YX/S, no hubo ninguna diferencia para las cuatro cepas. Por otra parte, no se detectó por cromatografía de líquidos la producción de acetato.

Para el caso de las cepas WGMF y WGMX, estas mutantes no mostraron algún efecto en los parámetros evaluados. Por otra parte, la WGME mostró una velocidad de crecimiento y un consumo de glucosa similar al de la mutante WHI, lo que sugiere que en esa condición genética ( AptsG , AmanX) la proteína más importante para el transporte de glucosa es NagE. Finalmente, para el caso de la mutante WGMB la velocidad de crecimiento disminuyó respecto a la mutante doble, sin embargo, el efecto en la qs no fue significativo como en el caso de la inactivación del gen nagE. Respecto a la qs, no se observó un cambio significativo entre la mutante WGM y la mutante WGMF. Esto sugiere que el gen bglF en la mutante doble no está relacionado con el transporte de glucosa.

Para determinar la importancia en el transporte de glucosa de las proteínas GalP y MglABC dependientes de la glucocinasa, se evaluó la inactivación de los genes que codifican para estas proteínas en las mutantes WG, WGM y WHI (Tabla 9), es decir, en dos fondos genéticos distintos, en uno que nosotros llamamos PTS+ y en otro PTS . En el PTS+, solo se han inactivado uno o unos de los complejos transmembranales del sistema de fosfotransferasa ( AptsG y AptsG, AmanX) y PTS , cuando se han inactivado los componentes generales del sistema de fosfotransferasa, con lo cual, ninguna proteína sustrato-específica del PTS es capaz de transportar y activar a la glucosa, pues no es posible la fosforilación de los componentes IIBC, porque las proteína generales (El y HPr) que translocan el grupo fosfato del fosfoenolpiruvato han sido inactivadas ( AptsHIcrr ).

En la cepa WG donde la velocidad de crecimiento aun es alta (m= 0.51 h 1) y donde se puede decir que hay suficiente carbono y energía, se observó que la inactivación del gen galP (WGP) y el operón mglABC (WGC) no tienen algún efecto negativo en la qs ni en la m. Por otra parte, en la mutante WGM se observó que el gen galP es importante para el metabolismo dado que su inactivación disminuyó la m y la qs. En cambio, la inactivación del operón mglABC en la doble mutante no tiene efecto sobre los parámetros de interés.

Ejemplo 4. Caracterización de la cepa W3110 y cepas derivadas transformadas con el plásmido pHN en la producción de plásmidos útiles en la producción de vacunas de ADN.

Con el propósito de establecer si algunas de las cepas generadas (Tabla 9) mostraban una capacidad mayor que la cepa progenitora W3110 para la producción de una vacuna de ADN, las cepas W3110, WG, WGMC, WGM, WGME y WHIC fueron transformadas con el plásmido pHN generando asi a las cepas W3110p, WGp, WGMCp, WGMp, WGMEp y WHICp, respectivamente. Para caracterizar la producción del plásmido en las mutantes seleccionadas, se realizaron los cultivos en matraz agitado, con 2.5 g/L de glucosa en medio mineral PD y elementos traza. Este medio de cultivo, se eligió porque está formulado para la producción de plásmidos.

La cepa silvestre produjo 025 + 0.02 g/L de acetato, en tanto que este ácido no se detectó en ninguna otra mutante de las cinco evaluadas (ver Tabla 10 y Figura 6). Se sabe que la formación de acetato provoca una desviación de carbono y un efecto negativo en las células (en nuestro trabajo no se observa un efecto negativo en la generación de biomasa dado que la concentración no es inhibitoria), en este caso, podemos observar que la diferencia entre el rendimiento de plásmido sobre biomasa (Yp/x) en la cepa WGp es 40% mayor con respecto a la cepa silvestre W3110p, mientras que la producción de acetato en la cepa silvestre es apenas de cerca del 10% de la entrada de glucosa. Este carbono, en conjunto con la disminución en la qs mejora el rendimiento de la mutante WGp.

A partir de la muíante WGMCp y de las mutantes subsecuentes, el aumento en el Yp/x no se puede deber a la no producción de acetato, ya que, ninguna muíante lo produce (ver Tabla 10).

El rendimiento de biomasa sobre sustrato (YX/s) indica la cantidad de biomasa que se 5 produce por unidad de sustrato consumido (usualmente la fuente de carbono y energía) y varía en función de las condiciones del cultivo, de la fisiología de la cepa y de su metabolismo. Para las mutantes de esta sección, no se encontró una dependencia del Uc/s con respecto al cambio en la qs o en el Ur/c. Lo que podemos observar únicamente, es que dos mutantes con diferentes qs disminuyeron su Yx/S 0 respecto a la cepa silvestre, máximo hasta un 20% (ver Tabla 10).

El Yp/c es uno de los parámetros más importantes que se consideran para evaluar a una cepa productora. En la Tabla 10 se puede observar que existe un punto máximo en el valor de YP/X de 2.56 ± 0.37 en la cepa WGMCp ( AptsG , AmanX, AmglABC), que corresponde a una qs= 0.85±0.11 g/g h y a una m= 0.33 ± 0.06 h 1. 5 Tabla 10.

Cepa Características relevantes Xmáx (g/L) qac(g/g h) Conc. de Hac P (mg/L) W3110p 0.94 ± 0.13 0.25 ± 0.02 0.4 0.18 WGp W3110, AptsG::Km 1.17 ± 0.02 0.00 ± 0.00 N.D. 1.06 ± 0.19 WGMCp AptsG AmanX, AmglABC::Cm 0.68 ± 0.25 0.00 ± 0.00 N.D. 1.63 ± 0.45 WGMp AptsG AmanX:: Km 0.89 ± 0.04 0.00 ± 000 N.D. 1.09 ± 0.34 WGMEp AptsG, AmanX, AnagE::Km 0.92 ± 0.05 0.00 ± 0.00 N.D. 1.19 ± 0.41 WHICp AptsHIcrr AmglABC Cm 0.00 ± 0.00 N.D. 1.47 ± 0.30 Cepa m (h 1) qs(g/g h) Qp (mg/g h) Yp/X (mg/g) W3110p 0.63 ± 0.04 1.45 ± 008 0.61 ± 0.11 0.44 ± 003 0.79 ± 0.05 WGp 0.49 ± 0.00 1.08 ± 0.09 0.52 ± 0.02 0.46 ± 0.04 1.14 ± 0.17 WGMCp 0.33 ± 0.06 0.85 ± 0.11 0.65 ± 0.11 0.41 ± 0.02 2.56 ± 0.37 WGMp o 33 + n n? 0 72 ± 004 0.65 ± 0.06 046 ± 004 1.91 ± 0.17 WGMEp 0.37 ± 0.01 0.69 ± 0.04 0.62 ± 0.02 0.53 ± 0.04 1.69 ± 0.11 WHICp 0 14 + 0.02 0 38 ± 008 0 13 ± 301 0.36 ± 0.02 1.31 ± 0.16 La ventaja de producir al plásmido pHN en la cepa hospedera WGMCp (W3110 AptsG, AmanX, AmglABC/pHN) de E. coli, radica en que, es la muíante con el máximo 5 Yp i respecto a todas las cepas evaluadas, tiene una velocidad de crecimiento alta (0.33 h 1), y es la cepa con la más alta productividad.

A continuación se describe un poco más de información sobre la mutante WGMCp, con el rendimiento más alto de plásmido,. Las tres mutaciones en la cepa: AptsG, AmanX, AmglABC, representan una ventaja para la producción de plásmido, pHN en 10 este caso, el cual es últil como vacuna de ADN. Este resultado fue inesperado, dado que en condiciones sin producción de plásmido, los parámetros cinéticos y estequiométricos de la mutante WGMC (AptsG, AmanX, AmglABC ) no mostraron alguna diferencia significativa con respecto a su cepa predecesora WGM (AptsG, AmanX). De alguna manera esto, indicó que la inactivación del operón mglABC 15 provocó un beneficio para la producción de plásmido.

Un parámetro importante en los procesos bioteenológicos es la productividad específica (qp), debido a que representa la velocidad de producción. El factor tiempo, tiene un papel importante en los procesos biotecnológicos, pues entre más tiempo se tarde un cultivo produciendo, su costo de mantenimiento aumenta y por ende el costo 20 del producto de interés. En general, la qp fue similar en todas las cepas (0.60 mg/g h) a excepción de la mutante con la menor velocidad de crecimiento WHICp (AptsHIcrr, AmglABC). Esto se debe posiblemente, a que el flujo de entrada de glucosa (qs= 0.38 ± 0.08 g/g h) es bajo, esté puede no ser suficiente para mantener la síntesis del plásmido y a las reacciones metabólicas propias de la célula, por lo que la síntesis del plásmido se ve disminuida considerablemente.

En la colección de mutantes, seguramente la energía y precursores generados por la lisis de la glucosa entrante, están jugando un papel importante, lo cual se demuestra al verse disminuido el YP/S y el YP/X cuando la qs es menor a 0.85 g/g h. Aunque ya se explicó que la disminución de la qs en una mutante beneficia la producción de plásmido, en este caso, la energía generada con la poca glucosa entrante < 0.85 g/g h, limita la producción. Observamos un decremento en los rendimientos de plásmido de las cepas WGMp {AptsG, AmanX) (qs= 0.72 ± 0.04 g/g h), WGMEp (AptsG, AmanX, AnagE) (qs=0.69 ± 0.04 g/g h) y WHICp ( AptsHIcrr ; AmglABC) (qs=0.38 ± 0.08 g/g h), respecto a la mutante WGMCp ( AptsG AmanX, AmglABC), aunque hay que hacer notar, que el rendimiento del plásmido de las tres cepas (WGMp, WGMEp y WHICp) fue mayor con respecto a las mutantes cuya qs fue >0.85 g/g h.

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Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Una cepa de Escherichia coli W3110, caracterizada por que comprende las siguientes modificaciones, para inhibir la producción de acetato y causar una alta capacidad para la producción de plásmidos. a) la inactivación o interrupción del gene codificante de la permeasa principal del sistema de fosfotransferasa PTS, AptsG; y b) la inactivación o interrupción de un gene codificante del transportador de mañosa del sistema PTS, AmanX

2. La cepa E. coli de la reivindicación 1, caracterizada porque fue depositada en el ARS Patent Culture Collection (NRRL) con el número de acceso NRRL B-50855.

3. La cepa de E. coli de la reivindicación 1, caracterizada por que adicionalmente tiene inactivados o interrumpidos los genes que codifican para el transportador tipo ABC de galactosa, mglABC , para favorecer la producción de plásmidos.

4. La cepa E. coli de la reivindicación 3, caracterizada porque fue depositada en el ARS Patent Culture Collection (NRRL) con el número de acceso NRRL B-50856.

5. La cepa de E. coli de la reivindicación 1, caracterizada por que adicionalmente tiene inactivados o interrumpidos los genes que codifican para transportador de N-acetil-glucosamina del sistema PTS, AnagE, para favorecer la producción de plásmidos.

6. La cepa E. coli de la reivindicación 5, caracterizada porque fue depositada en el ARS Patent Culture Collection (NRRL) con el número de acceso NRRL B-50854.

7. Un proceso para producir plásmidos que pueden ser empleados como vacunas de ADN, caracterizado por que comprende los siguientes pasos: a) Cultivar una cepa de E. coli seleccionada del grupo que consiste de las cepas de la reivindicación 1 a 6, transformada con el plásmido de interes, en un medio adecuado que contiene glucosa como fuente de carbono; b) Opcionalmente, la recuperación del plásmido de interés por operaciones unitarias adecuadas; c) Opcionalmente, la subsecuente purificación del plásmido de interés por operaciones unitarias adecuadas.

8. El proceso de la reivindicación 7, caracterizado por que el plásmido de interés con el que es transformada la cepa de E. coli , es el plásmido pHN.