MX2013009399A - Promotores preferidos para raices y metodos de uso. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona composiciones y métodos para regular la expresión de secuencias de nucleótidos heterólogas en una planta. Las composiciones incluyen una secuencia de nucleótidos novedosa para un promotor del gen que codifica RCc3 de sorgo bicolor. Un método para expresar una secuencia de nucleótidos heteróloga en una planta que usa las secuencias promotoras descritas en la presente descripción. El método comprende transformar una planta o célula vegetal con una secuencia de nucleótidos operativamente unida a uno de los promotores de la presente invención.

Description

PROMOTORES PREFERIDOS PARA RAÍCES Y MÉTODOS DE USO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con el campo de la biología molecular de las plantas, más particularmente, con la regulación de la expresión génica en las plantas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La expresión de las secuencias de ADN heterólogas en un huésped vegetal depende de la presencia de un promotor unido operativamente que es funcional dentro del huésped vegetal. La selección de la secuencia promotora determinará cuándo y dónde dentro del organismo se expresa la secuencia de ADN heteróloga. En donde se desea la expresión en tejidos u órganos específicos, pueden usarse promotores preferidos para tejidos. En donde se desea la expresión génica en respuesta a un estímulo, los promotores inducibles son el elemento regulador de elección. En contraposición, en donde se desea expresión continua en todas las células de una planta, se usan promotores constitutivos. Se pueden incluir secuencias reguladoras adicionales corriente arriba y/o corriente abajo de la secuencia promotora núcleo en los constructos de expresión de los vectores de transformación para producir grados variables de expresión de secuencias de nucleótidos heterólogas en una planta transgénica.

Frecuentemente, es conveniente expresar una secuencia de ADN en tejidos u órganos particulares de una planta. Por ejemplo, podría lograrse un incremento de la resistencia de una planta a la infección provocada por patógenos transmitidos por el suelo y por el aire mediante la manipulación genética del genoma de la planta para que comprenda un promotor preferido para tejidos unido operativamente a un gen heterólogo de resistencia a patógenos para producir proteínas de resistencia a patógenos en el tejido vegetal deseado.

Alternativamente, podría ser conveniente inhibir la expresión de una secuencia nativa de ADN dentro de los tejidos de una planta para lograr un fenotipo deseado. En este caso, la inhibición podría lograrse con la transformación de la planta para que comprenda un promotor preferido para tejidos unido operativamente a una secuencia de nucleótidos no codificante para que la expresión de la secuencia no codificante produzca un transcrito de ARN que interfiera con la traducción del ARNm de la secuencia nativa de ADN.

Hasta ahora, la regulación de la expresión génica en raíces de plantas no ha sido suficientemente estudiada, a pesar de la importancia de la raíz para el desarrollo de la planta. Hasta cierto punto, esto puede atribuirse a que no se dispone fácilmente de funciones bioquímicas específicas para raíces cuyos genes puedan clonarse, estudiarse y manipularse. Alterar genéticamente plantas a través del uso de técnicas de ingeniería genética y producir, de este modo, una planta con rasgos útiles, requiere la disponibilidad de una variedad de promotores. Una colección de promotores permitiría que el investigador diseñe moléculas de ADN recombinante que son capaces de expresarse en los niveles y sitios celulares deseados. Por lo tanto, una colección de promotores preferidos para tejidos permitiría la expresión de un nuevo rasgo en el tejido deseado.

Así, es necesario aislar y caracterizar promotores preferidos para tejidos, particularmente, preferidos para raíces, que puedan servir de regiones reguladoras para la expresión de secuencias de nucleótidos heterólogas de interés de una manera preferida para tejidos, para la manipulación genética de plantas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Se proporcionan composiciones y métodos para regular la expresión de una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés en una planta o célula de una planta. Las composiciones comprenden secuencias de nucleótidos novedosas para promotores que inician la transcripción. Las modalidades de la invención comprenden la secuencia de nucleótidos expuesta en la sec. con núm. de ident.: 1 o un complemento de esta; la secuencia de nucleótidos comprende la secuencia promotora vegetal del plásmido depositado con número de depósito de patente NRRL B-50462 o un complemento de esta, una secuencia de nucleótidos que comprende por lo menos 20 nucleótidos contiguos de la sec. con núm. de ident.: 1 , en donde la secuencia inicia la transcripción en una célula vegetal, y una secuencia de nucleótidos comprende una secuencia que tiene por lo menos 85 % de identidad de secuencia con la secuencia expuesta en la sec. con núm. de ident.: 1 , en donde la secuencia inicia la transcripción en la célula vegetal.

Se proporciona un método para expresar una secuencia de nucleótidos heteróloga en una planta o célula de una planta. El método comprende introducir en una planta o en una célula de una planta un cásete de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés unida operativamente a uno de los promotores de la presente invención. De esta manera, las secuencias promotoras son útiles para controlar la expresión de la secuencia de nucleótidos heteróloga unida operativamente. En métodos específicos, la secuencia de nucleótidos heteróloga de interés se expresa de una manera preferida para la raíz.

Se proporciona, además, un método para expresar una secuencia de nucleótidos de interés de una manera preferida para la raíz en una planta. El método comprende introducir en una célula vegetal un cásete de expresión que comprende un promotor de la invención unido operativamente a una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés.

La expresión de la secuencia de nucleótidos de interés puede proporcionar la modificación del fenotipo de la planta. Esta modificación incluye modular la producción de un producto endógeno, en términos de cantidad, distribución relativa o similares, o la producción de un producto de expresión exógeno para proporcionar una función o producto novedosos en la planta. En composiciones y métodos específicos, la secuencia de nucleótidos heteróloga de interés comprende un producto génico que confiere resistencia a herbicidas, resistencia a patógenos, resistencia a los insectos y/o tolerancia alterada a la sal, el frío o la sequía.

Se proporcionan casetes de expresión que comprenden las secuencias promotoras de la invención unidos operativamente a una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés. Se proporcionan, adicionalmente, células vegetales, tejidos vegetales, semillas y plantas transformados.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a composiciones y métodos establecidos para promotores vegetales y sus métodos de uso. Las composiciones comprenden secuencias de nucleótidos para la región promotora de un gen de sorgo (Sorghum ?'????? con una fuerte similitud con RCc3 en arroz, que se informó se expresa de una manera específica para la raíz (Xu Y, ef al. (1995) Plant Mol. Biol. 27: 237-248. Las composiciones comprenden, además, constructos de ADN que comprenden una secuencia de nucleótidos para la región promotora del gen de sorgo RCc3 unida operativamente a una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés. Por lo tanto, al promotor expuesto en la sec. con núm. de ident.: 1 se le dio el nombre identificativo "pronr|otor Sb-RCc3". Particularmente, la presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico aislado que comprenden la secuencia de nucleótidos expuesta en la sec. con núm. de ident.: 1 , y la secuencia promotora vegetal depositada en los huéspedes bacterianos con número de depósito de patente NRRL B-50462 del 25 de enero de 2011 y los fragmentos, variantes y complementos de esta.

Los plásmidos que contienen las secuencias de nucleótidos promotoras vegetales de la invención se depositaron el 25 de enero de 2011 en el Depósito de patentes de la colección de cultivos del servicio de investigación agrícola del centro nacional para la investigación del uso agrícola (Depository of the Agricultural Research Service Culture Collection of the National Center for Agricultural Utilization Research), en 1815 N. University Street, Peoría, IL, 61604, y tienen asignado el número de depósito de patente NRRL B-50462. Este depósito se mantendrá bajo los términos del tratado de Budapest en el Reconocimiento internacional del depósito de microorganismos para los fines de procedimientos de patentes (International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure). Este depósito se realizó solamente por conveniencia para los expertos en ia técnica y no es una admisión de que se requiere un depósito bajo el título 35 del Código de los Estados Unidos, §112. El depósito estará disponible al público irrevocablemente y sin restricciones o condiciones después de la emisión de una patente. No obstante, debe comprenderse que la disponibilidad de un depósito no constituye una licencia para poner en práctica el tema de la invención en derogación de los derechos de patente otorgados por acción gubernamental.

Las secuencias promotoras Sb-RCc3 de la presente invención incluyen constructos de nucleótidos que permiten el inicio de la transcripción en una planta. En modalidades específicas, la secuencia promotora Sb-RCc3 permite el inicio de la transcripción de una manera preferida para tejidos, más particularmente, de una manera preferida para la raíz. Tales constructos de la invención comprenden regiones reguladas de inicio de transcripción asociadas con la regulación del desarrollo de la planta. Así, las composiciones de la presente invención incluyen constructos de ADN que comprenden una secuencia de nucleótidos de interés unida operativamente a la secuencia promotora Sb-RCc3. La secuencia para la región promotora Sb-RCc3 se encuentra expuesta en la sec. con núm. de ident: 1.

Las composiciones de la invención incluyen las secuencias de nucleótidos para el promotor nativo Sb-RCc3 y los fragmentos y variantes de este. En modalidades específicas, las secuencias promotoras de la invención son útiles para expresar las secuencias de interés de una manera preferida para tejidos, particularmente, preferida para la raíz. Las secuencias de nucleótidos de la invención son de utilidad, además, en la construcción de vectores de expresión para la expresión posterior de una secuencia de nucleótidos heteróloga en una planta de interés o como sondas para aislar otros promotores similares a Sb-RCc3.

La presente invención abarca composiciones de ácido nucleico aisladas o sustancialmente purificadas. Una molécula de ácido nucleico "aislada" o "purificada", o porción biológicamente activa de esta, está prácticamente libre de otro material celular, o medio de cultivo cuando se produce por técnicas recombinantes, o prácticamente libre de precursores químicos u otras sustancias químicas cuando se sintetiza químicamente. Un ácido nucleico "aislado" está libre de secuencias (óptimamente, secuencias que codifican proteínas) que flanquean naturalmente el ácido nucleico (es decir, las secuencias localizadas en los extremos 5* y 3' del ácido nucleico) en el ADN genómico del organisrpó del cual se deriva el ácido nucleico. Por ejemplo, en varias modalidades, la molécula de ácido nucleico aislada puede contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb o 0,1 kb de secuencias de nucleótidos que flanquean naturalmente la molécula de ácido nucleico en el ADN genómico de la célula de la cual se deriva el ácido nucleico. Las secuencias promotoras Sb-RCc3 de la invención pueden aislarse a partir de la región no traducida 5' que flanquea los respectivos sitios de inicio de la transcripción.

La presente invención abarca, además, fragmentos y variantes de las secuencias de nucleótidos promotoras descritas. Particularmente, los fragmentos y variantes de la secuencia promotora Sb-RCc3 de la sec. con núm. de ident.: 1 puede usarse en las construcciones de ADN de la invención. Como se usa en la presente descripción, el término "fragmento" se refiere a una porción de la secuencia de ácido nucleico. Los fragmentos de una secuencia promotora Sb-RCc3 pueden retener la actividad biológica de iniciar la transcripción, más particularmente, conducir la transcripción de una manera preferida para la raíz. Alternativamente, los fragmentos de una secuencia de nucleótidos que son útiles como sondas de hibridación pueden no retener, necesariamente, la actividad biológica. Los fragmentos de una secuencia de nucleótidos para la región promotora del gen Sb-RCc3 pueden variar desde por lo menos aproximadamente 20 nucleótidos, aproximadamente 50 nucleótidos, aproximadamente 100 nucleótidos y hasta la longitud completa de la secuencia de nucleótidos de la invención para la región promotora del gen.

Una porción biológicamente activa de un promotor Sb-RCc3 puede prepararse al aislar una porción de la secuencia promotora Sb-RCc3 de la invención y evaluar la actividad promotora de la porción. Las moléculas de ácido nucleico que son fragmentos de una secuencia de nucleótidos promotora Sb-RCc3 comprenden por lo menos aproximadamente 16, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900, 1000, 1 100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1550, 1600, 1650 o 1700 nucleótidos, o hasta la cantidad de nucleótidos presentes en una secuencia promotora Sb-RCc3 de longitud completa descrita en la presente descripción (por ejemplo, 1710 nucleótidos para la sec. con núm. de ident.: 1).

Como se usa en la presente descripción, el término "variantes" se refiere a secuencias prácticamente similares. Para las secuencias de nucleótidos, las variantes de origen natural pueden identificarse con el uso de técnicas de biología molecular reconocidas, tales como, por ejemplo, técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) y de hibridación, como se describe en la presente invención.

Para las secuencias de nucleótidos, una variante comprende una supresión y/o adición de uno o más nucleótidos en uno o más sitios internos dentro del polinucleótido nativo y/o una sustitución de uno o más nucleótidos en uno o más sitios en el polinucleótido nativo. Como se usa en la presente descripción, una secuencia de nucléotidos "nativa" comprende una secuencia de nucleótidos de origen natural. Para las secuencias de nucleótidos, las variantes de origen natural pueden identificarse con el uso de técnicas de biología molecular reconocidas, tales como, por ejemplo, técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y de hibridación, como se describe más adelante. Las variantes de secuencias de nucleótidos incluyen, además, secuencias de nucleótidos derivadas sintéticamente, tales como las generadas, por ejemplo, mediante el uso de mutagénesis dirigida al sitio. Generalmente, las variantes de una secuencia de nucleótidos particular de la invención tienen, por lo menos, aproximadamente 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de identidad de secuencia con esa secuencia de nucleótidos particular, según lo determinado por programas de alineación de secuencias y los parámetros descritos en otras partes de la presente descripción. Una variante biológicamente activa de una secuencia de nucleótidos de la invención puede diferir de esa secuencia en un mínimo de 1-15 residuos de ácido nucleico, un mínimo de 1-10, tal como 6-10, un mínimo de 5, un mínimo de 4, 3, 2, o incluso 1 residuo de ácido nucleico.

Las variantes de secuencias de nucleótidos abarcan, además, secuencias derivadas de un procedimiento mutagénico y recombinogénico, tal como la transposición de secuencias de ADN. Con un procedimiento de este tipo, las secuencias de nucleótidos Sb-RCc3 pueden manipularse para crear un nuevo promotor Sb-RCc3. De esta manera, se generan genotecas de polinucleótidos recombinantes a partir de una población de polinucleótidos de secuencias relacionadas que comprenden regiones de secuencias que tienen una identidad de secuencia importante y que se pueden recombinar homólogamente in vitro o in vivo. Se conocen en la técnica las estrategias para la transposición de secuencias de ADN. Véase, por ejemplo, Stemmer (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 97:10747-10751 ; Stemmer (1994) Nature 370:389-391 ; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 75:436-438; oore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang er a/. (1997) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94:4504^509; Crameri et al. (1998) Nature 397:288-291 ; y las patentes de los Estados Unidos núms. 5.605.793 y 5.837.458.

Las secuencias de nucleótidos de la invención pueden usarse para aislar las secuencias correspondientes de otros organismos, particularmente, otras plantas, más particularmente, otras plantas monocotiledóneas. De esta manera, pueden usarse métodos como PCR, hibridación y similares para identificar esas secuencias en función de su homología de secuencia con las secuencias que se exponen en la presente descripción. La presente invención abarca secuencias aisladas en función de su identidad de secuencia con la secuencia completa de Sb-RCc3 expuesta en la presente descripción o con fragmentos de esta.

En un método de PCR, pueden diseñarse cebadores de oligonucleótidos para usarse en las reacciones de PCR a fin de amplificar las correspondientes secuencias de ADN del ADN genómico extraído de cualquier planta de interés. Los métodos para el diseño de cebadores de PCR y clonación por PCR se conocen generalmente en la técnica y se describen en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2.° ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York), de aquí en adelante Sambrook. Véase, además, Innis et al., eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, New York); Innis y Gelfand, eds. (1995) PCR Stnategies (Academic Press, Nueva York); e Innis y Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, Nueva York). Los métodos de PCR conocidos incluyen, pero no se limitan a, los métodos que usan cebadores emparejados, cebadores anidados, cebadores específicos individuales, cebadores degenerados, cebadores específicos de genes, cebadores específicos de vectores, cebadores parcialmente mal emparejados, y similares.

En las técnicas de hibridación, se usa la totalidad o parte de una secuencia de nucleótidos conocida como sonda que se híbrida selectivamente con otras secuencias de nucleótidos correspondientes presentes en una población de fragmentos de ADN genómico clonado de un organismo seleccionado. Las sondas de hibridación pueden estar marcadas con un grupo detectable, tal como 32P, o cualquier otro marcador detectable. Así, por ejemplo, se pueden preparar sondas para hibridación al marcar los oligonucleótidos sintéticos en función de la secuencia promotora Sb-RCc3 de la invención. Los métodos para la preparación de sondas de hibridación y para la construcción de bibliotecas genómicas se conocen, generalmente, en la técnica y se describen en Sambrook.

Por ejemplo, toda la secuencia promotora Sb-RCc3 descrita en la presente invención, o una o más porciones de esta, pueden usarse como una sonda capaz de hibridarse específicamente con las correspondientes secuencias promotoras Sb-RCc3 y ARN mensajeros. Para lograr una hibridación específica en una variedad de condiciones, estas sondas incluyen secuencias que son únicas entre las secuencias promotoras Sb-RCc3 y tienen por lo menos aproximadamente 10 nucleótidos de longitud, o por lo menos aproximadamente 20 nucleótidos de longitud. Estas sondas pueden usarse para amplificar las correspondientes secuencias promotoras Sb-RCc3 de una planta seleccionada mediante PCR. Esta técnica puede usarse para aislar secuencias codificantes adicionales de un organismo deseado o como ensayo de diagnóstico para determinar la presencia de secuencias codificantes en un organismo. Las técnicas de hibridación incluyen la selección por hibridación de genotecas de ADN cultivadas en placas (ya sea en placas o colonias), véase, por ejemplo, Sambrook.

La hibridación de tales secuencias se puede realizar en condiciones restrictivas. Los términos "condiciones restrictivas" o "condiciones de hibridación restrictivas" se refieren a las condiciones en las cuales una sonda se hibridará con su secuencia objetivo a un grado detectablemente mayor que otras secuencias (por ejemplo, por lo menos 2 veces sobre el valor de fondo). Las condiciones restrictivas dependen de la secuencia y serán diferentes en circunstancias diferentes. Al controlar el rigor de las condiciones de hibridación y/o lavado, es posible identificar las secuencias objetivo que son 100 % complementarias con la sonda (sondeo de homólogos). Alternativamente, pueden regularse las condiciones restrictivas para permitir cierta no coincidencia de las secuencias con el fin de detectar grados más bajos de similitud (sondeo de heterólogos). Generalmente, una sonda tiene menos de aproximadamente 1000 nucleótidos de longitud, óptimamente, menos de 500 nucleótidos de longitud.

Típicamente, serán condiciones restrictivas aquellas en las cuales la concentración de sal sea menor que aproximadamente 1 ,5 M de iones Na, típicamente, de aproximadamente 0,01 a 1 ,0 M de iones Na (u otras sales) a un pH de 7,0 a 8,3, y la temperatura sea de por lo menos aproximadamente 30 °C para las sondas cortas (por ejemplo, de 10 a 50 nucleótidos) y por lo menos aproximadamente 60 °C para las sondas largas (por ejemplo, de más de 50 nucleótidos). Además, pueden lograrse condiciones restrictivas mediante la adición de agentes desestabilizantes, tales como la formamida. Las condiciones restrictivas bajas ilustrativas incluyen la hibridación con una solución tampón de formamida al 30-35 %, NaCI 1 , SDS al 1 % (dodecil sulfato de sodio) a 37 "C, y un lavado en 1X a 2X SSC (20X SSC = NaCI 3.0 M/citrato trisódico 0.3 M) a 50-55 °C. Las condiciones restrictivas moderadas ilustrativas incluyen la hibridación en formamida al 40 a 45 %, NaCI 1 ,0 M, SDS al 1 % a 37 eC, y un lavado en 0.5X a 1X SSC a 55-60 °C. Las condiciones restrictivas altas ilustrativas incluyen la hibridación en formamida al 50 %, NaCI 1 M, SDS al 1 % a 37 °C, y un lavado final en 0,1X SSC a 60-65 °C durante por lo menos 30 minutos. La duración de la hibridación es, generalmente, menor que aproximadamente 24 horas, usualmente, de aproximadamente 4 a aproximadamente 12 horas. La duración del tiempo de lavado será por lo menos el tiempo suficiente para alcanzar el equilibrio.

La especificidad es, típicamente, la función de los lavados posteriores a la hibridación; los factores críticos son la fuerza iónica y la temperatura de la solución de lavado final. Para los híbridos de ADN-ADN, la Tm(temperatura de fusión, por sus siglas en inglés) puede calcularse a partir de la ecuación de Meinkoth y Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284: Tm = 81 ,5 °C + 16,6 (log ) + 0,41 (% GC) - 0,61 (% form) - 500/L; en donde M es la molaridad de cationes monovalentes, "%GC" es el porcentaje de nucleótidos de guanosina y citosina en el ADN, "% form" es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación, y L es la longitud del híbrido en pares de bases. Tm es la temperatura (con la fuerza iónica y el pH definidos) a la cual se híbrida el 50 % a una secuencia objetivo complementaria con una sonda perfectamente apareada. La Tm se reduce en aproximadamente 1 eC por cada 1 % de falta de coincidencia; así, la Tm, las condiciones de hibridación y/o lavado se pueden ajustar para hibridar con las secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si se buscan secuencias con = 90 % de identidad, la Tm puede reducirse 10 °C. Generalmente, las condiciones restrictivas se seleccionan para que sean aproximadamente 5 °C más bajas que la Tm para la secuencia específica y su complemento a una fuerza iónica y un pH definidos. Sin embargo, las condiciones restrictivas altas pueden usar una hibridación y/o lavado a 1 , 2, 3 o 4 °C menos que la Tm; las condiciones restrictivas moderadas pueden usar una hibridación y/o lavado a 6, 7, 8, 9 o 10 °C menos que la Tm; las condiciones restrictivas bajas pueden usar una hibridación y/o lavado a 1 1 , 12, 13, 14, 15 o 20 °C menos que la Tm. Al usar la ecuación, las composiciones de lavado e hibridación, y la Tm deseada, las personas de experiencia ordinaria comprenderán que las variaciones en el rigor de las soluciones de hibridación y/o lavado están inherentemente descritas. Si el grado de falta de coincidencia deseado produce una Tm menor que 45 °C (solución acuosa) o 32 °C (solución de formamida), se prefiere aumentar la concentración de SSC para que pueda usarse una temperatura más alta. Puede encontrarse una guía extensa para la hibridación de ácidos nucleicos en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology— Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2 (Elsevier, Nueva York); y Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocole in Molecular Biology, Capítulo 2 (Greene Publishing and Wiley-lnterscience, Nueva York). Véase, además, Sambrook.

Así, la presente invención abarca las secuencias aisladas que tienen actividad promotora preferida para raíces y que hibridan en condiciones restrictivas con las secuencias promotoras Sb-RCc3 descritas en la presente descripción, o con fragmentos de estas.

Se usan los siguientes términos para describir las relaciones de secuencias entre dos o más ácidos nucleicos o polinucleótidos: (a) "secuencia de referencia", (b) "ventana de comparación", (c) "identidad de secuencias", (d) "porcentaje de identidad de secuencia" y (e) "identidad sustancial". (a) Como se usa en la presente descripción, "secuencia de referencia" es una secuencia definida que se usa como base para ia comparación de secuencias. Una secuencia de referencia puede ser un subconjunto o la totalidad de una secuencia especificada, por ejemplo, tal como un segmento de la totalidad del ADNc o de una secuencia génica, o la totalidad del ADNc o de la secuencia génica. (b) Como se usa en la presente descripción, "ventana de comparación" hace referencia a un segmento contiguo y especificado de una secuencia de polinucleótidos, en donde la secuencia de polinucleótidos de la ventana de comparación puede comprender adiciones, o supresiones (es decir, espacios o interrupciones) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones ni supresiones) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. Generalmente, la ventana de comparación tiene por lo menos 20 nucleótidos contiguos de longitud y, opcionalmente, puede tener 30, 40, 50, 100 o más. Los expertos en la técnica comprenderán que para evitar una alta similitud con una secuencia de referencia debido a la inclusión de espacios en la secuencia de polinucleótidos, se introduce, típicamente, una penalización por abrir espacios (penalización por interrupciones) y se resta de la cantidad de coincidencias.

Los métodos de alineamiento de secuencias para comparación se conocen bien en la técnica. Así, la determinación del porcentaje de identidad de secuencias entre dos secuencias se puede obtener con el uso de un algoritmo matemático. Los ejemplos no limitantes de estos algoritmos matemáticos son el algoritmo de Myers y Miller (1988) CABIOS 4: 11-17; el algoritmo de alineamiento local de Smith et al. (1981 ) Adv. Appl. Math. 2:482; el algoritmo de alineamiento global de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453; el método de búsqueda de alineamientos locales de Pearson y Lipman (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. 85:2444-2448; el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc.

Nati. Acad. Sci. USA 872264, modificado como en Karlin y AltschuI (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:5873-5877.

Las implementaciones informáticas de estos algoritmos matemáticos pueden usarse para comparar secuencias y determinar la identidad de secuencias. Tales implementaciones incluyen,- pero no se limitan a: CLUSTAL en el programa PC/Gene (disponible de Intelligenetics, Mountain View, California); el programa ALIGN (versión 2.0) y GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA del paquete de programas para genética GCG Wisconsin Package, versión 10 (disponible de Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, California, Estados Unidos). Los alineamientos con estos programas se pueden realizar con los parámetros predeterminados. El programa CLUSTAL está bien descrito por Higgins et al. (1988) Gene 73:237-244 (1988); Higgins et al. (1989) CABIOS 5:151-153; Corpet ef al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang ef al. (1992) CABIOS 8:155-65; y Pearson et al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307-331. El programa ALIGN está basado en el algoritmo de yers y Miller (1988) mencionado anteriormente. Con el programa ALIGN, se puede usar una tabla de residuos de peso PAM120, una penalización de longitud de interrupción de 12 y una penalización por interrupción de 4 al comparar secuencias de aminoácidos. Los programas BLAST de AltschuI et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403 están basados en el algoritmo de Karlin y AltschuI (1990) mencionado anteriormente. Con el programa BLASTN, puntaje = 100, longitud de palabra = 12, se puede realizar búsquedas BLAST de nucieótidos para obtener secuencias de nucieótidos homólogas a una secuencia de nucieótidos que codifique una proteína de la invención. Con el programa BLASTX, puntaje = 50, longitud de palabra = 3 se puede realizar búsquedas BLAST de proteínas para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a una proteína o polipéptido de la invención. Para obtener alineamientos de interrupción con fines comparativos, se puede usar Gapped BLAST (en BLAST 2.0), tal como describen AltschuI et al. en. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Altemativamente, se puede usar PSI-BLAST (en BLAST 2.0) para realizar una búsqueda iterativa que detecte las relaciones distantes entre moléculas. Véase Altschul et al. (1997) mencionado anteriormente. Cuando se usan BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST, es posible usar los parámetros predeterminados de los respectivos programas (por ejemplo, BLASTN para secuencias de nucleótidos, BLASTX para proteínas). Véase el sitio web para el Centro nacional de información sobre biotecnología (National Center for Biotechnology Information). El alineamiento también se puede realizar manualmente mediante inspección.

A menos que se indique de otra manera, los valores de identidad/similitud de secuencias que se proporcionan en la presente descripción se refieren al valor obtenido con el uso de la versión 10 de GAP al usar los siguientes parámetros: % de identidad y % de similitud para una secuencia de nucleótidos al usar un peso GAP (GAP Weight) de 50 y un peso de longitud (Length Weight) de 3 y la matriz de puntaje nwsgapdna.cmp; % de identidad y % de similitud para una secuencia de aminoácidos con un peso GAP de 8 y un peso de longitud de 2 y la matriz de puntaje BLOSUM62, o cualquier programa equivalente a este. "Programa equivalente" significa cualquier programa de comparación de secuencias que, para cualquiera de dos secuencias en cuestión, genere un alineamiento con coincidencias idénticas de residuos de aminoácidos o nucléotidos y un porcentaje idéntico de identidad de secuencias en comparación con el alineamiento correspondiente generado por la versión 10 de GAP.

GAP usa el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453, para encontrar el alineamiento de dos secuencias completas que maximiza la cantidad de coincidencias y minimiza la cantidad de interrupciones. GAP toma en consideración todos los alineamientos posibles, así como las posiciones de las interrupciones y crea el alineamiento con la mayor cantidad de bases coincidentes y la menor cantidad de espacios o interrupciones. Esto permite la provisión de una penalización por. creación de interrupciones y una penalización de la extensión de interrupciones en unidades de bases coincidentes. GAP debe beneficiarse de la cantidad de penalizaciones por creación de interrupciones de las coincidencias por cada espacio que inserta. Si se selecciona una penalización de la extensión de interrupciones mayor que cero, GAP debe, adicionalmente, obtener beneficios para cada espacio insertado de la longitud de interrupciones por la penalización de la extensión de interrupciones. Los valores predeterminados de penalización por creación de interrupciones y de penalización de la extensión de interrupciones en la versión 10 del paquete de software GCG Wisconsin Genetics Software Package para secuencias de proteínas son 8 y 2, respectivamente. Para las secuencias de nucleótidos, la penalización predeterminada por creación de interrupciones es 50, mientras que la penalización predeterminada de la extensión de interrupciones es 3. Las penalizaciones por creación y extensión de interrupciones se pueden expresar como un entero seleccionado del grupo de enteros que consiste en 0 a 200. Así, por ejemplo, las penalizaciones por creación y extensión de interrupciones pueden ser 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55. 60, 65 o mayores.

GAP presenta un miembro de la familia de los mejores alineamientos. Puede haber muchos miembros de esta familia, pero ningún otro miembro tiene mejor calidad. GAP muestra cuatro figuras de importancia para los alineamientos: calidad, relación, identidad y semejanza. La calidad es la medida maximizada para alinear las secuencias. La relación es la calidad dividida por la cantidad de bases en el segmento más corto. La identidad porcentual es el porcentaje de los símbolos que realmente coinciden. La similitud porcentual es el porcentaje de los símbolos que son similares. Los símbolos que están en los espacios vacíos se ignoran. Se determina una similitud cuando el valor de la matriz de puntajes para un par de símbolos es mayor o igual que 0,50: el umbral de similitud. La matriz de puntaje que se usa en la versión 10 del paquete de programas GCG Wisconsin Genetics Software Package es BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff (1989) Proc. Nati. Acad. Sc¡. USA 89:10915). (c) Como se usa en la presente descripción, "identidad de secuencia" o "identidad" en el contexto de dos secuencias de ácidos nucleicos o de polipéptidos se refiere a los residuos en las dos secuencias que son iguales cuando están alineadas para la máxima correspondencia en una ventana de comparación especificada. Cuando el porcentaje de identidad de secuencia se usa con referencia a proteínas, se reconoce que las posiciones de los residuos que no son idénticas difieren, frecuentemente, por sustituciones conservadoras de aminoácidos, en donde los residuos de aminoácidos se sustituyen por otros residuos de aminoácidos con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad) y, por lo tanto, no alteran las propiedades funcionales de la molécula. Cuando las secuencias difieren en sustituciones conservadoras, el porcentaje de identidad de secuencia se puede ajustar ascendentemente para corregir la naturaleza conservadora de la sustitución. Se dice que las secuencias que difieren por tales sustituciones conservadoras tienen "similitud de secuencias" o "similitud". Los expertos en la técnica conocen bien los medios para realizar este ajuste. Típicamente, esto requiere el puntaje de una sustitución conservadora como una falta de coincidencia parcial en lugar de completa y se incrementa, de este modo, el porcentaje de identidad de secuencias. Así, por ejemplo, en donde a un aminoácido idéntico se le da un puntaje de 1 y a una sustitución no conservadora se le da un puntaje de 0, a una sustitución conservadora se le da un puntaje entre 0 y 1. Los puntajes de las sustituciones conservadoras se calculan, por ejemplo, como implementados en el programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, California). (d) Como se usa en la presente descripción, "porcentaje de identidad de secuencias" se refiere al valor determinado al comparar dos secuencias óptimamente alineadas en una ventana de comparación, en donde la porción de la secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, espacios vacíos) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones ni supresiones) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. Para calcular el porcentaje se determina la cantidad de posiciones en las cuales se produce la base de ácido nucleico o el residuo de aminoácido idénticos en las dos secuencias para obtener la cantidad de posiciones coincidentes, se divide la cantidad total de posiciones coincidentes por la cantidad total de posiciones en la ventana de comparación y el resultado se multiplica por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencias. (e) El término "identidad sustancial" de secuencias de polinucleótidos significa que un polinucleótido comprende una secuencia que tiene por lo menos 70 % de identidad de secuencia, óptimamente, por lo menos 80 %, más óptimamente, por lo menos 90 % y, muy óptimamente, por lo menos 95 %, en comparación con una secuencia de referencia al usar uno de los programas de alineamiento descritos con los parámetros estándar.

Otra indicación de que las secuencias de nucleótidos son sustancialmente idénticas es cuando dos moléculas se hibridan entre sí en condiciones restrictivas. Generalmente, las condiciones restrictivas se seleccionan para que sean aproximadamente 5 °C menos que la Tm para la secuencia específica a una fuerza iónica y un pH definidos. Sin embargo, las condiciones restrictivas abarcan temperaturas que varían de aproximadamente 1 °C a aproximadamente 20 °C menos que la Tm en función del grado deseado de rigor para las condiciones, como se califica de otro modo en la presente descripción.

Como se usa en la presente descripción, el término planta incluye células vegetales, protoplastos vegetales, cultivos de tejidos de células vegetales a partir de los cuales se pueden regenerar las plantas, callos de plantas, matas de plantas y células vegetales que están intactas en plantas o partes de plantas, tales como embriones, polen, óvulos, semillas, hojas, flores, ramas, frutos, granos, espigas, mazorcas, chalas, tallos, raíces, puntas de raíces, anteras, y similares. El término "grano" se refiere a la semilla madura producida por agricultores comerciales con otros propósitos aparte del cultivo o reproducción de especies. El alcance de la invención incluye, además, ta progenie, variantes y mutantes de las plantas regeneradas, siempre que estas partes comprendan los polinucleótidos introducidos.

La presente invención se puede usar para transformar cualquier especie de plantas que incluyen, pero no se limitan a, monocotiledóneas y dicotiledóneas. Los ejemplos de especies de plantas incluyen maíz (Zea mays), Brassica sp. (por ejemplo, B. napus, B. rapa, B. júncea), particularmente, las especies de Brassica útiles como fuentes de aceites de semillas, alfalfa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeno (Sécale ceneale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), mijo (por ejemplo, mijo perla (Pennisetum glaucum), mijo común (Panicum miliaceum), mijo cola de zorro (Setaria itálica), mijo africano (Eleusine coracana)), girasol, (Helianthus annuus), cártamo Carthamus tinctorius), trigo (Triticum aestivum), soja (Glicina max), tabaco (Nicotiana tabacum), papa (Solanum tuberosum), maní (Arachis hypogaea), algodón (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), batata (Ipomoea batatus), mandioca (Manihot esculenta), café (Coffea spp ), coco (Cocos nucífera), ananá (Ananas comosus), árboles de cítricos (Citrus spp.), cacao (Theobroma cacao), té (Camellia sinensis), banana (Musa spp.), palta (Persea americana), higo (Ficus casica), guayaba (Psidium guajava), mango (Mangifera indica), olivo (Olea europaea), papaya (Carica papaya), castaña de cayú (Anacardium occidentale, macadamia (Macadamia integrifolia), almendro (Prunus amygdalus), remolacha azucarera (Beta vulgaris), caña de azúcar (Saccharum spp.), avena, cebada, hortalizas, ornamentales y coniferas.

Las hortalizas incluyen tomates (Lycopersicon esculentum), lechuga (por ejemplo, Lactuca sativa), porotos (Phaseolus vulgaris), habas (Phaseolus limensis), arvejillas (Lathyrus spp.), y miembros del género Cucumis, tales como pepino (C. sativus), melón cantalupo (C. cantalupensis) y melón almizclero (C. meló). Las plantas ornamentales incluyen azalea (Rhododendron spp.), hortensia (Macrophylla hydrangea), rosa china (Hibiscus rosasanensis), rosas (Rosa spp.), tulipanes (Tulipa spp.), narcisos (Narcissus spp.), petunias (Petunia hybrida), clavel (Dianthus caryophyllus), estrella federal (Euphorbia pulcherrima) y crisantemo.

Las coniferas que pueden emplearse para practicar la presente invención incluyen, por ejemplo, pinos tales como el pino taeda (Pinus taeda), pino de América Central (Pinus ellioti), pino ponderosa (Pinus ponderosa), pino contorta (Pinus contorta) y pino de Monterrey (Pinus radiata); abeto de Douglas (Pseudotsuga menziesii); Tsuga del Canadá (Tsuga canadensis); pícea blanca (Picea glauca); secuoya roja (Sequoia sempervirens); abetos verdaderos tales como abeto plateado (Abies amabilis) y abeto balsámico (Abies balsames); y cedros tales como la tuya gigante (Thuja plicata) y el cedro amarillo de Alaska (Chamaecyparis nootkatensis). En modalidades específicas, las plantas de la presente invención son plantas de cultivo (por ejemplo, maíz, alfalfa, girasol, Brassica (mostaza), soja, algodón, cártamo, maní, sorgo, trigo, mijo, tabaco, etc.). En otras modalidades, las plantas de maíz y soja son óptimas y, en otras modalidades adicionales, las plantas de maíz son óptimas.

Otras plantas de interés incluyen plantas de grano que proporcionan semillas de interés, plantas de semilla oleaginosa, y plantas leguminosas. Las semillas de interés incluyen semillas de grano, tales como maíz, trigo, cebada, arroz, sorgo, centeno, etc.

Las plantas de semilla oleaginosa incluyen algodón, soja, cártamo, girasol, Brassica, maíz, alfalfa, palma, coco, etc. Las plantas leguminosas incluyen porotos y arvejas. Los porotos incluyen guar, algarroba, fenogreco, poroto de soja, alubias de jardín, caupí, brotes de soja, haba de Lima, habas, lentejas, garbanzo, etc.

Las secuencias codificantes heterólogas expresadas por los promotores Sb-RCc3 de la invención pueden usarse para variar el fenotipo de una planta. Son de interés varios cambios en el fenotipo, que incluyen modificar la expresión de un gen en una raíz de una planta, alterar el mecanismo de defensa de la planta contra patógenos o insectos, incrementar la tolerancia de la planta a los herbicidas, alterar el desarrollo radicular para responder al estrés del ambiente, modular la respuesta de la planta a la sal, temperatura (calor y frío), sequía, y similares. Estos resultados pueden obtenerse por medio de la expresión de una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés que comprende un producto génico adecuado. En modalidades específicas, la secuencia de nucleótidos heteróloga de interés es una secuencia endógena de la planta cuyo nivel de expresión se incrementa en la planta o parte de la planta. Alternativamente, pueden obtenerse resultados al permitir una reducción en la expresión de uno o más productos génicos endógenos, particularmente, enzimas, transportadores o cofactores, o al afectar la captación de nutrientes en la planta. Estos cambios producen un cambio en el fenotipo de la planta transformada.

Las categorías generales de secuencias de nucleótidos de interés para la presente invención incluyen, por ejemplo, los genes involucrados en la información, tales como dedos de zinc, los involucrados en la comunicación, tales como las quinasas, y los involucrados en el mantenimiento, tales como las proteínas de choque térmico. Las categorías más específicas de transgenes incluyen, por ejemplo, genes que codifican rasgos importantes para la agronomía, resistencia a los insectos, resistencia a las enfermedades, resistencia a los herbicidas, y resistencia al estrés ambiental (tolerancia alterada al frío, sal, sequía, etc.). Se reconoce que cualquier gen de interés puede estar unido operativamente al promotor de la invención y expresado en la planta.

Los genes de resistencia a insectos pueden codificar resistencia a las plagas que causan una gran retraso en el rendimiento, tales como el gusano de la raíz, gusano cortador, taladro europeo del maíz y similares. Estos genes incluyen, por ejemplo, los genes de proteínas tóxicas de Bacillus thuríngiensis (patentes de los Estados Unidos núms. 5.366.892; 5.747.450; 5.736.514; 5.723.756; 5.593.881 ; y Geiser et al. (1986) Gene 46:109); y similares.

Los genes que codifican los rasgos de resistencia a las enfermedades incluyen genes desintoxicantes, tales como los que desintoxican la fumonisina (patente de los Estados Unidos núm. 5.792.931); genes para la resistencia (R) a las enfermedades y de avirulencia (avr) (Jones et al. (1994) Science 266:789; Martin et al. (1 993) Science 262:1432; y Mindrinos et al. (1994) Cell 78:1089); y similares.

Los rasgos de resistencia a los herbicidas pueden incluir genes que codifican para la resistencia a los herbicidas que actúan para inhibir la acción de la acetolactato sintasa (ALS), particularmente, los herbicidas tipo sulfonilurea (por ejemplo, el gen de la acetolactato sintasa (ALS) que contiene mutaciones que producen tal resistencia, particularmente, la mutaciones S4 y/o Hra), los genes que codifican para la resistencia a los herbicidas que actúan para inhibir la acción de la glutamina sintasa, tales como fosfinotricina o basta (por ejemplo, el gen bar), glifosato (por ejemplo, el gen EPSPS y el gen GAT; véase, por ejemplo, la publicación de patente de los Estados Unidos núm. 20040082770 y la patente núm. WO 03/092360) u otros genes conocidos en la técnica. El gen bar codifica para la resistencia al herbicida basta, el gen nptll codifica para la resistencia a los antibióticos kanamicina y geneticina y los mutantes del gen ALS codifican para la resistencia al herbicida clorsulfurón.

La resistencia al glifosato la imparte el mutante 5-enolpiruvil-3-fosfiquimato sintasa (EPSP) y los genes aroA. Véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos núm. 4.940.835 otorgada a Shah et al., que describe la secuencia de nucleótidos de una forma de EPSPS que puede conferir resistencia al glifosato. La patente de los Estados Unidos núm. 5.627.061 otorgada a Barry et al. describe, además, genes que codifican enzimas EPSPS. Véase, además, las patentes de los Estados Unidos núms. 6.248.876 B1 ; 6.040.497; 5.804.425; 5.633.435; 5.145.783; 4.971.908; 5.312.910; 5.188.642; 4.940.835; 5.866.775; 6.225.114 B1 ; 6.130.366; 5.310.667; 4.535.060; 4.769.061 ; 5.633.448; 5.510.471 ; Re. 36.449; RE 37.287 E; y 5.491.288; y las publicaciones internacionales núm. WO 97/04103; WO 97/04114; WO 00/66746; WO 01/66704; WO 00/66747 y WO 00/66748, incorporadas en la presente descripción como referencia para este propósito. La resistencia al glifosato se imparte, además, a plantas que expresan un gen que codifica una enzima glifosato oxidorreductasa, tal como se describe detalladamente en las patentes de los Estados Unidos núm. 5.776.760 y 5.463.175, que se incorporan en la presente descripción como referencia para este fin. Adicionalmente, la resistencia al glifosato se puede impartir a las plantas mediante la sobreexpresión de genes que codifican la glifosato N-acetiltransferasa. Véase, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos núms. 7.714.188 y 7.462.481.

Los productos exógenos incluyen enzimas y productos vegetales, asi como de otras fuentes que incluyen procariotas y otros eucariotas. Estos productos incluyen enzimas, cofactores, hormonas, y similares.

Los ejemplos de otros genes aplicables y su fenotipo asociado incluyen el gen que codifica la proteína de recubrimiento viral y/o ARN, u otros genes virales o vegetales que confieren resistencia viral; genes que confieren resistencia fúngica; genes que promueven la mejora del rendimiento; y genes que proporcionan resistencia al estrés, tal como frío, deshidratación a causa de la sequía, calor y salinidad, metales tóxicos o elementos traza, o similares.

La secuencia de nucleótidos heteróloga unida operativamente al promotor Sb-RCc3 descrito en la presente descripción puede ser una secuencia no codificante para un gen seleccionado como objetivo. Así, las secuencias promotoras descritas en la presente descripción pueden estar unidas operativamente a secuencias de ADN no codificantes para reducir o inhibir la expresión de una proteína nativa en la raíz de la planta.

"ARNi" se refiere a una serie de técnicas relacionadas para reducir la expresión de genes (véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos núm. 6.506.559). Actualmente se piensa que técnicas más antiguas conocidas con otros nombres están basadas en el mismo mecanismo, pero en la literatura se las designa con nombres distintos. Estas incluyen la "inhibición de no codificantes", la producción de transcritos de ARN no codificante capaces de suprimir la expresión de la proteína objetivo, y la "cosupresión" o "supresión codificante", que se refieren a la producción de transcritos de ARN codificante capaces de suprimir la expresión de genes foráneos o endógenos idénticos o prácticamente similares (patente de los Estados Unidos núm. 5.231.020, incorporada en la presente descripción como referencia). Tales técnicas se basan en el uso de constructos que producen la acumulación de ARN bicatenario con una cadena complementaria al gen objetivo que se silenciará. El promotor Sb-RCc3 de las modalidades se puede usar para dirigir la expresión deconstructos que producirán los ARN de interferencia, que incluyen los MicroARN y ARNip.

Como se usa en la presente descripción, los términos "promotor" y "región de inicio de transcripción" se refieren a una región reguladora del ADN que comprende, usualmente, una caja TATA capaz de dirigir la ARN polimerasa II para iniciar la síntesis de ARN en el sitio de inicio de transcripción apropiado para una secuencia codificante particular. Un promotor puede comprender, adicionalmente, otras secuencias de reconocimiento situadas, generalmente, corriente arriba o en 5' con respecto a la caja TATA, denominadas elementos promotores corriente arriba, que influyen en la velocidad de inicio de la transcripción. Se reconoce que al haber identificado las secuencias de nucleótidos de las regiones promotoras descritas en la presente descripción, es una práctica estándar de la técnica aislar e identificar elementos reguladores adicionales en la región 5' no traducida corriente arriba a partir de las regiones promotoras particulares identificadas en la presente descripción. Además, se puede proporcionar promotores quiméricos. Tales quimeras incluyen porciones de la secuencia promotora fusionada con fragmentos y/o variantes de regiones reguladoras transcripcionales heterólogas. Por lo tanto, las regiones promotoras descritas en la presente descripción pueden comprender elementos reguladores corriente arriba, tales como los responsables de la expresión temporal y en tejidos de la secuencia codificante, los potenciadores, y similares. De la misma manera, los elementos promotores que permiten la expresión en el tejido deseado, tal como la raíz, pueden identificarse, aislarse y usarse con otros promotores núcleo para conferir expresión preferida para la raíz. En este aspecto de la invención, "promotor núcleo" significa un promotor sin elementos promotores.

En el contexto de esta descripción, el término "elemento regulador" se refiere, además, a una secuencia de ADN, usualmente, pero no siempre, corriente arriba (5') de la secuencia codificante de un gen estructural, que incluye secuencias que controlan la expresión de la región codificante al proporcionar el reconocimiento de la ARN polimerasa y/u otros factores requeridos para que la transcripción se inicie en un sitio particular. Un ejemplo de un elemento regulador que proporciona el reconocimiento de la ARN polimerasa u otros factores transcripcionales para asegurar el inicio en un sitio particular es un elemento promotor. Un elemento promotor comprende un elemento promotor núcleo, responsable del inicio de la transcripción, así como otros elementos reguladores (tal como se describe en otras partes de esta solicitud) que modifican la expresión de genes. Debe comprenderse que las secuencias de nucleótidos, localizadas dentro de intrones, o en 3' de la secuencia de la región codificante, pueden contribuir, además, a la regulación de la expresión de una región codificante de interés. Los ejemplos de intrones adecuados incluyen, pero no se limitan a, el intrón IVS6 del maíz o el intrón de la actina del maíz. Un elemento regulador puede incluir, además, aquellos elementos localizados comente abajo (3') con respecto al sitio de inicio de la transcripción, o en regiones transcritas, o en ambos. En el contexto de la presente invención, un elemento regulador postranscripcional puede incluir elementos que están activos después del inicio de la transcripción, por ejemplo, potenciadores de la traducción y de la transcripción, represores de la traducción y la transcripción y determinantes de la estabilidad del ARNm.

Los elementos reguladores, o variantes o fragmentos de estos, de la presente invención pueden estar asociados operativamente con elementos reguladores heterólogos o promotores a fin de modular la actividad del elemento regulador heterólogo. Esta modulación incluye intensificar o reprimir la actividad transcripcional del elemento regulador heterólogo, modular los eventos postranscripcionales, o intensificar o reprimir la actividad transcripcional del elemento regulador heterólogo y modular los eventos postranscripcionales. Por ejemplo, uno o más elementos reguladores, o fragmentos de estos, de la presente invención pueden estar asociados operativamente con promotores constitutivos, inducibles o específicos para tejidos, o fragmentos de estos, para modular la actividad de estos promotores dentro de los tejidos deseados en células vegetales.

Las secuencias reguladoras de la presente invención, o variantes o fragmentos de estas, cuando están unidas operativamente a una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés, pueden dirigir la expresión preferida para la raíz de la secuencia de nucleótidos heteróloga en la raíz (o parte de la raíz) de la planta que expresa este constructo. El término "preferido para la raíz" significa que la expresión de la secuencia de nucleótidos heteróloga es muy abundante en la raíz, o una parte de la raíz, que incluye, por ejemplo, la caliptra, el meristemo apical, el protodermo, el meristemo fundamental, el procambium, la endodermis, la corteza, el cilindro vascular, la epidermis, y similares. Si bien puede producirse algún nivel de expresión de la secuencia de nucleótidos heteróloga en otros tipos de tejidos vegetales, la expresión se produce muy abundantemente en la raíz o parte de la raíz, que incluye las raíces primarías, laterales y adventicias.

Una "secuencia de nucleótidos heteróloga" es una secuencia que no ocurre naturalmente con la secuencia promotora de la invención. Si bien esta secuencia de nucleótidos es heteróloga para la secuencia promotora, puede ser homóloga, o nativa, o heteróloga, o foránea para el huésped vegetal.

Las secuencias promotoras aisladas de la presente invención se pueden modificar para proporcionar una variedad de niveles de expresión de la secuencia de nucleótidos heteróloga. Por lo tanto, se puede usar menos de la totalidad de la región promotora y se puede retener la capacidad de dirigir la expresión de la secuencia de nucleótidos de interés. Se sabe que los niveles de expresión del ARNm se pueden alterar de diferentes maneras con supresiones de porciones de las secuencias promotoras. Los niveles de expresión del ARNm se pueden disminuir o, alternativamente, se puede aumentar la expresión como resultado de la supresión de promotores si, por ejemplo, existe un elemento regulador negativo (para un represor) que se elimina durante el proceso de truncamiento. Generalmente, por lo menos aproximadamente 20 nucleótidos de una secuencia promotora aislada se usarán para dirigir la expresión de una secuencia de nucleótidos.

Se sabe que para aumentar los niveles de transcripción pueden usarse potenciadores en combinación con las regiones promotoras de la invención. Los potenciadores son secuencias de nucleótidos que aumentan la expresión de una región promotora. Los potenciadores son conocidos en la técnica e incluyen la región potenciadora SV40, el elemento potenciador 35S, y similares. Se sabe que algunos potenciadores alteran los patrones normales de expresión de los promotores, por ejemplo, al hacer que un promotor se exprese constitutivamente cuando, sin el potenciador, el mismo promotor se expresa únicamente en un tejido específico o en unos pocos tejidos específicos.

Las modificaciones de las secuencias promotoras aisladas de la presente invención pueden proporcionar una variedad en la expresión de la secuencia de nucleótidos heteróloga. Así, se pueden modificar para ser promotores débiles o fuertes. Generalmente, un "promotor débil" se refiere a un promotor que dirige la expresión de una secuencia codificante a un nivel bajo. Un "nivel bajo" de expresión significa una expresión a niveles de aproximadamente 1/10.000 transcritos a aproximadamente 1 /100.000 transcritos hasta aproximadamente 1/500.000 transcritos. Por otra parte, un promotor fuerte conduce la expresión de una secuencia codificante a un nivel alto o de aproximadamente 1/10 transcritos a aproximadamente 1/100 transcritos hasta aproximadamente 1 /1000 transcritos.

Se reconoce que los promotores de la invención pueden usarse con sus secuencias codificantes de Sb-RCc3 nativas para incrementar o disminuir la expresión y producir, de este modo, un cambio en el fenotipo de la planta transformada. Este cambio fenotípico podría afectar, además, el aumento o disminución en los niveles de iones metálicos en los tejidos de la planta transformada.

Las secuencias de nucleótidos descritas en la presente invención, así como las variantes y fragmentos de estas, son útiles en la manipulación genética de cualquier planta. La secuencia promotora Sb-RCc3 es útil en este aspecto cuando está unida operativamente con una secuencia de nucleótidos heteróloga cuya expresión debe controlarse para lograr la respuesta fenotípica deseada. El término "unido(a) operativamente" significa que la transcripción o traducción de la secuencia de nucleótidos heteróloga está bajo la influencia de la secuencia promotora. De esta manera, las secuencias de nucleótidos para los promotores de la invención pueden proporcionarse en casetes de expresión junto con las secuencias de nucleótidos heterólogas de interés para la expresión en la planta de interés, más particularmente, para la expresión en la raíz de la planta.

Estos casetes de expresión comprenderán una región de inicio de transcripción que comprende una de las secuencias de nucleótidos promotoras de la presente invención, o variantes o fragmentos de estas, unida operativamente a la secuencia de nucleótidos heteróloga. Este cásete de expresión puede proporcionarse con una pluralidad de sitios de restricción para que la inserción de la secuencia de nucleótidos esté bajo la regulación transcripcional de las regiones reguladoras. El cásete de expresión puede contener, adicionalmente, genes marcadores seleccionables, así como regiones de terminación 3'.

El cásete de expresión puede incluir, en la dirección 5 -3' de la transcripción, una región de inicio de transcripción (es decir, un promotor, o variante o fragmento de este, de la invención), una región de inicio de traducción, una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés, una región de terminación de la traducción y, opcionalmente, una región de terminación de la transcripción funcionales en el organismo huésped. Las regiones reguladoras (es decir, promotores, regiones reguladoras de la transcripción y regiones de terminación de la traducción) y/o el polinucleótido de las modalidades pueden ser nativos/análogos a la célula huésped o entre sí. Alternativamente, las regiones reguladoras y/o el polinucleótido de las modalidades pueden ser heterólogos para la célula huésped o entre sí. Como se usa en la presente descripción, "heterólogo(a)", con referencia a una secuencia, es una secuencia que se origina a partir de una especie extraña o, si es de la misma especie, una secuencia sustancialmente modificada de su forma natural en la composición y/o locus genómico mediante intervención humana intencional. Por ejemplo, un promotor unido operativamente a un polinucleótido heterólogo es de una especie diferente a la especie de la cual se derivó el polinucleótido o, si es de la misma especie/análogo, uno o ambos están sustancialmente modificados de su forma original y/o locus genómico, o el promotor no es el promotor nativo para el polinucleótido unido operativamente.

Si bien puede preferirse expresar una secuencia de nucleótidos heteróloga al usar los promotores de la invención, pueden expresarse las secuencias nativas. Tales constructos cambiarían los niveles de expresión de la proteína Sb-RCc3 en la planta o célula vegetal. Por lo tanto, se altera el fenotipo de la planta o célula vegetal.

La región de terminación puede ser nativa con la región de inicio de la transcripción, puede ser nativa con la secuencia de ADN de interés unida operativamente, puede ser nativa con el huésped vegetal o puede derivarse de otra fuente (es decir, foránea o heteróloga al promotor, la secuencia de ADN que se expresa, el huésped vegetal o cualquier combinación de estos). Las regiones de terminación adecuadas están disponibles a partir del plásmido Ti de A. tumefaciens, tales como las regiones de terminación de la octopina sintasa y nopalina sintasa. Véase, además, Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991 ) Ce// 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; ogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151- 158; Bailas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; and Joshi et al. (1987) Nuclelc Acid Res. 15:9627-9639.

El cásete de expresión que comprende las secuencias de la presente invención puede contener, además, por lo menos una secuencia de nucleótidos adicional para cotransformar un gen en el organismo. Alternativamente, la(s) secuencia(s) adicional(es) se puede(n) proporcionar en otro cásete de expresión.

Cuando corresponda, las secuencias de nucleótidos cuya expresión va a estar bajo el control de la secuencia promotora preferida para la raíz de la presente invención, y cualquiera de una o más secuencias de nucleótidos adicionales, pueden optimizarse para incrementar la expresión en la planta transformada. Es decir, estas secuencias de nucleótidos pueden sintetizarse al usar los codones vegetales preferidos para una expresión mejorada. Véase, por ejemplo, Campbell y Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11 para un análisis del uso de codones preferido por los huéspedes. En la técnica hay métodos disponibles para sintetizar los genes específicos de las plantas. Véase, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos núms. 5.380.831 , 5.436.391 y Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, incorporadas en la presente descripción como referencia.

Se conoce que las modificaciones de secuencias adicionales intensifican la expresión génica en un huésped celular. Estas incluyen la eliminación de secuencias que codifican señales de poliadenilación falsas, señales del sitio de empalme exón-intrón. repeticiones similares a transposones y otras secuencias muy caracterizadas que pueden ser perjudiciales para la expresión del gen. El contenido G-C de la secuencia de nucleótidos heteróloga se puede ajustar a un promedio de concentraciones para un huésped celular específico, según lo calculado como referencia para los genes conocidos expresados en la célula huésped. Cuando es posible, la secuencia se modifica para evitar estructuras secundarias en horquilla del ARNm.

Los casetes de expresión pueden contener, adicionalmente, secuencias líder 5". Estas secuencias líder pueden actuar para potenciar la traducción. Estas secuencias líderes de traducción se conocen en la técnica e incluyen líderes del picornavirus, por ejemplo, líder del EMCV (región 5' no codificante de encefalomiocarditis) (Elroy-Stein et al. (1989) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:6126-6130); líderes del potyvirus, por ejemplo, líder del TEV (virus del grabado del tabaco) (Allison et al. (1986) Virology 154:9-20); líder del MD V (virus del mosaico enanizante del maíz); proteína de unión a ¡nmunoglobulina humana de cadena pesada (BiP) (Macejak et al. (1991) Nature 353:90-94); el líder no traducido de la proteína de cubierta de ARNm del virus del mosaico de la alfalfa (AMV ARN. 4) (Jobling et al. (1987) Nature 325:622-625); líder del virus del mosaico del tabaco (TMV) (Gallie et al. (1989) Molecular Biology of RNA, páginas 237-256); y el líder del virus del moteado clorótico del maíz (MCMV) (Lommel et al. (1991) Virology 67 :382-385). Véase, además, Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiology 84:965-968. Además, pueden usarse los métodos conocidos que mejoran la estabilidad del ARNm, por ejemplo, intrones, tales como el intrón de ubiquitina del maíz (Christensen y Quail (1996) Transgenic Res. 5:213-218; Christensen ef al. (1992) Plant Molecular Biology 18:675-689) o el intrón del maíz Adhl (Kyozuka er al. (1991) Mol. Gen. Genet. 228:40-48; Kyozuka et al. (1990) Maydica 35:353-357), y similares.

En la preparación del cásete de expresión pueden manipularse los diversos fragmentos de ADN con el fin de proporcionar las secuencias de ADN en la orientación adecuada y, según corresponda, en el marco de lectura adecuado. Para este fin, pueden usarse adaptadores o conectores para unir los fragmentos de ADN, o pueden involucrarse otras manipulaciones para proporcionar sitios de restricción adecuados, eliminar ADN superfluo, eliminar sitios de restricción, o similares. Para este propósito pueden usarse mutagénesis in vitro, reparación de cebadores, restricción, hibridación, resustituciones, por ejemplo, transiciones y transversiones.

Es posible incluir, además, genes reporteros o genes marcadores seleccionares en los casetes de expresión. Los ejemplos de genes reporteros conocidos en la técnica pueden encontrarse, por ejemplo, en Jefferson et al. (1991) en Plant Molecular Biology Manual, ed.

Gelvin et al. (Kluwer Academic Publishers), págs. 1-33; DeWet et al. (1987) Mol. Cell. Biol. 7:725-737; Goff et al. (1990) EMBO J. 9:2517-2522; Kain et al. (1995) BioTechniques 79:650-655; y Chiu et al. (1996) Current Biology 6:325-330.

Los genes marcadores seleccionares para la selección de células o tejidos transformados pueden incluir genes que confieren resistencia a antibióticos o resistencia a herbicidas. Los ejemplos de genes marcadores seleccionables adecuados incluyen, pero no se limitan a, genes que codifican para la resistencia al cloranfenicol (Herrera Estrella et al. (1983) EMBO J. 2:987-992); metotrexato (Herrera Estrella et al. (1983) Nature 303:209-213; Meijer et al. (1991) Plant Mol. Biol. 16:807-820); higromicina (Waldron et al. (1985) Plant Mol.

Biol. 5:103-108; y Zhijian et al. (1995) Plant Science 108: 219-227); estreptomicina (Jones et al. (1987) Mol. Gen. Genet. 270:86-91); espectinomicina (Bretagne-Sagnard et al. (1996) Tnansgenic Res. 5:131-137); bleomicina (Hille er al. (1990) Plant Mol. Biol. 7:171-176); sulfonamida (Guerineau et al. (1990) Plant Mol. Biol. 75:127-136); bromoxinil (Stalker et al. (1988) Science 242:419-423); glifosato (Shaw et al. (1986) Science 233:478-481 ; y las solicitudes de los Estados Unidos con los núms. de serie 10/004,357; y 10/427,692); fosfinotricina (DeBlock era/. (1987) EMBO J. 6:2513-2518).

Otros genes que podrían ser de utilidad en la recuperación de eventos transgénicos, pero podrían no requerirse en el producto final incluyen, pero no se limitan a, ejemplos tales como GUS (beta glucuronidasa; Jefferson (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5:387), GFP (proteína verde fluorescente; Chalfie et al. (1994) Science 263:802), luciferasa (Riggs et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15(19):W b y Luehrsen et al. (1992) Methods Enzymol. 216:397-414) y los genes del maíz que codifican para la producción de antocianina (Ludwig er a/. (1990) Science 247:449).

Se puede usar el cásete de expresión que comprende el promotor Sb-RCc3 de la presente invención unido operativamente a una secuencia de nucleótidos de interés para transformar cualquier planta. De esta manera, se pueden obtener plantas, células vegetales, tejidos de plantas, semillas, raíces, y similares, modificados genéticamente.

Los métodos de la invención involucran introducir un polipéptido o polinucleótido en una planta. "Introducir" significa presentar a la planta el polinucleótido o polipéptido de tal manera que la secuencia gane acceso al interior de una célula de la planta. Los métodos de la invención no dependen de un método particular para introducir una secuencia en una planta, únicamente que el polinucleótido o polipéptido gane acceso al interior de por lo menos una célula de la planta. Los métodos para introducir polinucleótidos o polipéptidos en las plantas se conocen en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, métodos de transformación estable, métodos de transformación transitoria y métodos mediados por virus.

"Transformación estable" significa que la construcción de nucleótidos introducido en una planta se integra al genoma de la planta y es capaz de ser heredado por la progenie de este. "Transformación transitoria" significa que un polinucleótido se introduce en la planta y no se integra al genoma de la planta o se introduce un polipéptido en una planta.

Los protocolos de transformación, así como los protocolos para introducir secuencias de nucleótidos en plantas, pueden variar según el tipo de planta o célula vegetal, es decir, monocotiledónea o dicotiledónea, a las que se dirige la transformación. Los métodos adecuados para la introducción de secuencias de nucleótidos en células vegetales y la inserción posterior en el genoma de la planta incluyen microinyección (Crossway et al. (1986) Biotechniques 4:320-334), electroporación (Riggs et al. (1986) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 83:5602-5606), transformación mediada por Agrobacteríum (Townsend et al., patentes de los Estados Unidos núms. 5.563.055 y Zhao et al., 5.981.840), transformación directa de genes (Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3:2717-2722), y aceleración de partículas con técnicas de biobalística (véase, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos núms. 4.945.050; 5.879.918; 5.886.244; 5.932.782; Tomes et al. (1995) en Plant Cell, 77ssí/e, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg and Phillips (Springer-Verlag, Berlín); McCabe eí al. (1988) Biotechnology 6:923-926); y transformación de Lec1 (patante núm. WO 00/28058). Véase, además, Weissinger et al. (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477; Sanford eí al. (1987) Particulate Science and Technology 5:27-37 (cebolla); Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87:671-674 (frijol de soja); McCabe eí al. (1988) Bio/Technology 6:923-926 (frijol de soja); Finer y Mc ullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P: 175-182 (frijol de soja); Singh eí al. (1998) Theor. Appl. Genet. 96.319-324 (frijol de soja); Datta eí al. (1990) Biotechnology 8:736-740 (arroz); Klein eí al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:4305-4309 (maíz); Klein eí al. (1988) Biotechnology 6:559-563 (maíz); patentes de los Estados Unidos núms. 5.240.855; 5.322.783 y 5.324.646; Klein eí al. (1988) Plant Physiol. 91 :440-444 (maíz); Fromm eí al. (1990) Biotechnology 8:833-839 (maíz); Hooykaas-Van Slogteren eí al. (1984) Natura (Londres) 31 1 :763-764; patente de los Estados Unidos núm. 5.736.369 (cereales); Bytebier eí al. (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:5345-5349 (Liliaceae); De Wet eí al. (1985) en The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman eí al. (Longman, Nueva York), págs. 197-209 (polen); Kaeppler eí al. (1990) Plant Cell Reports 9:415-418 y Kaeppler eí al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566 (transformación mediada por monocristales filamentarios); D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (electroporación); Li eí al. (1993) Plant Cell Reports 12:250-255 y Christou y Ford (1995) Annals of Botany 75:407-413 (rice); Osjoda et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750 (maíz por vía de Agnobacterium tumefaciens) todas ellas incorporadas en la presente descripción como referencia.

En modalidades específicas, los constructos de ADN que comprenden las secuencias promotoras de la invención se pueden proporcionar a una planta mediante el uso de una variedad de métodos de transformación transitoria. Tales métodos de transformación transitoria incluyen, pero no se limitan a, sistemas virales de vectores y la precipitación del polinucleótido de forma que impida la liberación posterior del ADN. Por lo tanto, la transcripción a partir del ADN unido a partículas puede ocurrir, pero la frecuencia con la cual se libera para integrarse en el genoma se reduce considerablemente. Estos métodos incluyen el uso de partículas recubiertas con polietilimina (PEI; Sigma núm. P3143).

En otras modalidades, el polinucleótido de la invención se puede introducir en plantas al poner en contacto las plantas con un virus o ácidos nucleicos virales. Generalmente, esos métodos implican incorporar un constructo de nucleótidos de la invención dentro de una molécula de ADN o ARN viral. En la técnica se conocen métodos para introducir polinucleótidos en plantas y expresar una proteína codificada en estas, que involucran moléculas de ADN o ARN virales. Véase, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos núms. 5.889.191 , 5.889.190, 5.866.785, 5.589.367, 5.316.931 , y Porta et al. (1996) Molecular Biotechnology 5:209-221 ; incorporadas en la presente descripción como referencia.

En la técnica se conocen métodos para la inserción dirigida de un polinucleótido en un sitio específico en el genoma de la planta. En una modalidad la inserción del polinucleótido en un sitio genómico deseado se logra con el uso de un sistema de recombinación específica de sitio. Véase, por ejemplo, las patentes núm. W099/25821 , W099/25854, WO99/25840, W099/25855 y W099/25853, que se incorporan en la presente descripción como referencia. En resumen, el polinucleótido de la invención puede estar contenido en el cásete de transferencia flanqueado por dos sitios de recombinación no idénticos. El cásete de transferencia se introduce en una planta que tiene incorporado de manera estable en su genoma un sitio objetivo flanqueado por dos sitios de recombinación no idénticos que corresponden a los sitios del cásete de transferencia. Se proporciona una recombinasa adecuada, y el cásete de transferencia se integra en el sitio objetivo. Así, el polinucleótido de interés se integra en una posición cromosómica específica en el genoma de la planta.

Las células que se han transformado se pueden cultivar en plantas, de conformidad con los modos convencionales. Véase, por ejemplo, cCormick et al. (1986) célula vegetal Reports 5:81-84. Después, estas plantas se pueden cultivar, y polinizar, ya sea con la misma cepa transformada o con cepas distintas, y el híbrido resultante tiene una expresión constitutiva de la característica fenotípica identificada deseada. Se pueden cultivar dos o más generaciones para asegurarse de que la expresión de la característica fenotípica deseada se mantiene y se hereda de manera estable y, después, cosechar las semillas para asegurarse de que se ha logrado la expresión de la característica fenotípica deseada. De esta manera, la presente invención proporciona semillas transformadas (a las que se hace referencia, además, como "semillas transgénicas") que tienen un constructo de nucleótidos de la invención, por ejemplo, un cásete de expresión de la invención, incorporado de manera estable en su genoma.

Los artículos "un" y "una" se usan en la presente descripción para referirse a uno o más de uno (es decir, a por lo menos uno) de los objetivos gramaticales del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" se refiere a uno o más elementos.

En toda la especificación, se entenderá que la expresión "que comprende", o sus variantes, tales como "comprende" o "comprenden", implican la inclusión de un elemento, número entero, etapa, o grupo de elementos, números enteros o etapas mencionados, pero no excluye cualquier otro elemento, número entero o etapa, o grupo de elementos, números enteros o etapas.

Los siguientes ejemplos se ofrecen de manera ilustrativa y no de manera limitante.

Experimentación Ejemplo 1. Identificación del gen Sb-RCc3 El gen Sb-RCc3 se identificó a través de una búsqueda de datos de perfiles de expresión génica obtenidos de la línea élite endogámica BTX623. Se tomaron muestras de tejidos de plantas cultivadas en invernadero de cada uno de los órganos principales en un estadio vegetativo V6 y en un estadio de florescencia tardía (justo antes de la diseminación del polen). Además, se recolectaron tejidos de los órganos reproductores. Se hacen tres réplicas de cada muestra, y cada réplica consiste en nueve plantas. Se aisla el ARN de cada una de las réplicas, se realiza la transcriptasa inversa y se secuencia con la tecnología Solexa para secuenciación de ADN (lllumina). Las "etiquetas" de secuencias se alinearon con secuencias genómicas disponibles al público para identificar el gen. Una comparación de la expresión en cada de las muestras identificó genes con expresión preferida para la raíz.

Ejemplo 2. Aislamiento de PCR del promotor de Sb-RCc3 Una vez identificado un gen, la secuencia flanqueante 5' se obtiene por búsqueda de datos genómicos disponibles públicamente para la secuencia 5' de la región codificante. Para Sb-RCc3 se identificaron aproximadamente 1710 pb de la secuencia comente arriba. Se agrega un sitio de reconocimiento para la endonucleasa de restricción Notl al extremó 5' de la secuencia y se agrega un sitio de reconocimiento para BamH1 al extremo 3' de la secuencia para facilitar el ligamiento del ADN en un vector de expresión una vez sintetizado químicamente. El análisis de la secuencia para determinar motivos reveló una caja TATA putativa a aproximadamente 108 pb del extremo 3' de la secuencia y un sitio de inicio de transcripción putativo a aproximadamente 83 pb del extremo 3'.

Ejemplo 3. Análisis de expresión en plantas de maíz transgénicas Se crearon plantas transformadas estables al usar protocolos de Agmbacterium (detallados en el Ejemplo 4) para permitir la caracterización de la actividad del promotor, que incluye el patrón de expresión y nivel de expresión dirigidos por el promotor. El promotor de Sb-RCc3 (sec. con núm. de ident.: 1) está conectado operativamente al gen de la B-glucuronidasa (GUS) (abreviado como Sb-RCc3:GUS) o un gen insecticida (abreviado Sb-RCc3:IG1). El promotor está unido operativamente al intrón Adh1 (intrón. 1 ) y al gen IG1 (abreviado como Sb-RCc3(Ad intron1):IG1) con el fin de aumentar potencialmente la expresión, puesto que se ha demostrado que en células de plantas cerealeras, la expresión de transgenes se intensifica con la presencia de algunos intrones proximales 5' (véase Callis et al. (1987) Genes and Development 1: 1 183-1200; Kyozuka et al. (1990) Maydica 35:353-357). El uso del gen GUS permite que el patrón de expresión dirigido por el promotor se visualice mediante la tinción histoquímica de los tejidos para determinar la actividad enzimática de GUS.

Se regeneran veintiséis eventos de GUS y se cultivan en condiciones de invernadero hasta que alcanzan un estadio de crecimiento que varía de V4 a V6. Los estadios de crecimiento vegetativo se determinan por la cantidad de hojas "con cuello" en la planta. Por lo tanto, una planta en el estadio V6 tiene 6 hojas completamente desarrolladas. Se toman muestras del tejido foliar y radicular de cada planta en este estadio. Se permite que las plantas se desarrollen hasta un estadio temprano R1 , un punto justo antes de la diseminación del polen, en donde se recolecta el tejido de la panoja, el tallo y los estigmas. Por último, se recolecta el polen cuando las plantas comienzan a desprenderlo.

Los resultados de Sb-RCc3:GUS demuestran que el promotor Sb-RCc3 dirigió la expresión en las raíces de maíz. La expresión se detectó en las regiones maduras de la raíz, principalmente en la corteza. En la punta de la raíz, la expresión se detectó en la región de elongación, pero no en el meristema ni en la caliptra. No se detectó expresión en los tejidos de la hoja, panoja o estigmas. Tampoco se detectó en el polen. Los tallos no exhibieron expresión; sin embargo, en aproximadamente el 50 % de los eventos se detectó expresión en el sistema vascular de la vaina. La expresión no fue fuerte en relación con el nivel de expresión en raíces.

Tabla 1. Resultados de la expresión del maíz1 para Sb-RCc3:GUS 1 Los datos de la tinción histoquímica se representan en una escala de 0 a 3, y el promotor Ubi-1 de maíz, que está muy caracterizado, sirve de punto de referencia. El promotor Ubi-1 es un promotor constitutivo fuerte en casi todos los tejidos de maíz.

Se evalúan en el invernadero veinticuatro plantas de maíz transgénicas que expresan Sb-RCc3:IG1 y 15 plantas que expresan Sb-RCc3:ADH intron:IG1. Los análisis cuantitativos por ELISA practicados en la raíz, que incluye la punta radicular y el tejido maduro en conjunto, y el material de hojas mostraron que la expresión se produjo solamente en raíces con ambos vectores. Esto apoyó la observación realizada al usar GUS. El intrón de ADH se incluyó con el propósito de aumentar la expresión. Sin embargo, la expresión que usa Sb-RCc3 fue mejor sin el intrón de ADH en aproximadamente 2,7 veces. La expresión de Sb-RCc3:IG1 en relación con el promotor muy conocido de la ubiquitina del maíz fue de aproximadamente dos veces menor.

Tabla 2. Resultados de la expresión del maíz1 para Sb-RCc3 y IG1 1 Los datos de la tinción histoquímica se representan en una escala de 0 a 3, y el promotor Ubi-1 de maíz, que está muy caracterizado, sirve como punto de referencia. El promotor Ubi-1 es un promotor constitutivo fuerte en casi todos los tejidos de maíz.

Ejemplo 4. Transformación y regeneración de plantas transgénicas al usar la transformación mediada por Agrobacterium Para la transformación de maíz mediada por Agrobacterium con una secuencia promotora Sb-RCc3 de las modalidades, se empleó el método de Zhao (patente de los Estados Unidos núm. 5.981 .840 (de aquí en adelante, patente '840), y la publicación de patente del PCT núm. W098/32326; el contenido de las cuales se incorpora en la presente descripción como referencia).

Se hace un cultivo de Agrobacterium en una placa maestra con medio 800 a 28 °C en la oscuridad durante 3 días y, después, se almacena a 4 °C por un período de hasta un mes. Las placas de trabajo de Agrobacteríum se cultivaron en placas con medio 810 y se incubaron en la oscuridad a 28 °C durante un período de uno a dos días.

Brevemente, se disecan embriones de espigas de maíz frescas y esterilizadas y se mantienen en medio 561 Q hasta que se recolectan todos los embriones requeridos. Después, los embriones se ponen en contacto con la suspensión de Agrobacteríum preparada en la placa de trabajo, en la que el Agrobacteríum contiene un plásmido que comprende la secuencia promotora de las modalidades. Los embriones se cultivan conjuntamente con el Agrobacteríum en placas con 562P, con los embriones colocados con el eje hacia abajo sobre las placas, de acuerdo con el protocolo de la patente '840.

Después de una semana en medio 562P, los embriones se transfieren al medio 5630. Los embriones se subcultivan en medio 5630 fresco a intervalos de dos semanas y se continúa con la incubación en las mismas condiciones. Comienzan a aparecer los callos después de 6 a 8 semanas en la selección.

Cuando alcanzan el tamaño apropiado, los callos se cultivan en medio de regeneración (288W) y se mantienen en la oscuridad durante 2-3 semanas para iniciar la regeneración de la planta. Después de la maduración de los embriones somáticos, los embriones somáticos bien desarrollados se transfieren á un medio para germinación (272V) y, después, a un recinto de cultivo iluminado. Aproximadamente 7-10 días después, las plántulas en desarrollo se transfieren a un medio 272V libre de hormonas en tubos durante 7-10 días hasta que las plántulas estén bien establecidas. Después, las plantas se transfieren a insertos en recipientes planos (equivalentes a macetas de 6.4 cm (2.5")) que contienen tierra de abono y se cultivan durante 1 semana en una cámara de crecimiento y, posteriormente, se cultivan por 1-2 semanas más en el invernadero y, después, se transfieren a 600 macetas clásicas (6.1 L (1.6 galones)) y se cultivan hasta la madurez.

Medios usados en la transformación mediada por Agrobacterium y regeneración de plantas de maíz transgénicas: El medio 561 Q comprende 4.0 g/l N6 de sales básales (SIGMA C-1416), 1.0 ml/l de mezcla vitamínica de Eriksson (1000x SIGMA-151 1), 0.5 mg/l de tiamina HCI, 68.5 g/l de sacarosa, 36.0 g/l de glucosa, 1.5 mg/l 2,4-D, y 0.69 g/l de L-prolina (que se lleva a volumen con H20 desionizada, después de ajustar el pH a 5.2 con KOH); 2.0 g/l de Gelrite™ (que se agregó después de llevar a volumen con H20 desionizada); y 8.5 mg/l de nitrato de plata (que se agregó después de esterilizar el medio y enfriar a temperatura ambiente).

El medio 800 comprende 50,0 ml/l de solución madre A y 850 mi de H20 desionizada, y se lleva a volumen menos 100 ml/l con H20 desionizada, después de lo cual se adiciona 9,0 g de Phytagar. Después de esterilizar y enfriar, se agrega 50,0 ml/l de la solución B de solución madre BA junto con 5,0 g de glucosa y 2,0 mi de una solución madre de 50 mg/ml de espectinomicina. La solución madre A comprende 60,0 g de K2HP04 dibásico y 20,0 g de fosfato de sodio monobásico, disueltos en 950 mi de agua, ajustada a un pH de 7,0 con KOH, y se lleva a un volumen de 1 ,0 L con H20 desionizada. La solución madre B comprende 20,0 g de NH4CI, 6,0 g de MgS04»7H20, 3,0 g de cloruro de potasio, 0,2 g de CaCI2 y 0,05 g de FeS04»7H20, todos llevados a volumen con H20 desionizada; se esteriliza y se enfría.

El medio 810 comprende 5,0 g de extracto de levadura (Difco), 10,0 g de peptona (Difco), 5,0 g de NaCI, disueltos en H20 desionizada, y se lleva a volumen después de ajustar el pH a 6,8. Después, se agrega 5,0 g de Bacto agar, se esteriliza y se enfría la solución y se agrega 1 ,0 mi de una solución madre de 50 mg/ml de espectinomicina.

El medio 562 comprende 4,0 g/l de sales básales N6 (SIGMA C-1416), 1 ,0 ml/l de mezcla vitamínica de Eriksson (1000x SIGMA-151 1), 0,5 mg/l de tiamina HCI, 30,0 g/l de sacarosa, y 2.0 mg/l 2,4-D (que se lleva a volumen con H20 desionizada después de ajustar el pH a 5,8 con KOH); 3.0 g/l Gelrite™ (que se agrega después de llevar a volumen con H20 desionizada); y 0.85 mg/l nitrato de plata y 1 .0 mi de una materia prima de 1 00 mM de acetosyringone (ambas agregadas después de esterilizar el medio y enfriar a temperatura ambiente).

El medio 5630 comprende 4,0 g/l de sales básales N6 (SIGMA C-1416), 1 ,0 ml/l de mezcla vitamínica de Eriksson (1000x SIGMA-1511 ), 0,5 mg/l de tiamina HCI, 30,0 g/l de sacarosa, 1 ,5 mg/l de 2,4-D, 0,69 g de L-prolina y 0,5 g de solución tampón MES (que se lleva a volumen con H20 desionizada después de ajustar el pH a 5,8 con KOH). Después, se agrega 6,0 g/l de agar-agar Ultrapure™ (EM Science), y se esteriliza y se enfría el medio. Posteriormente, se agrega 0,85 mg/l de nitrato de plata, 3,0 mi de una solución madre de 1 mg/ml de bialafos, y 2,0 mi de una solución madre de 50 mg/ml de carbenicilina.

El medio 288 W comprende 4,3 g/l de sales MS (GIBCO 11 117-074), 5,0 ml l de solución madre de vitaminas MS (0,100 g de ácido nicotínico, 0,02 g/l de tiamina HCI, 0,10 g/l de piridoxina HCI y 0,40 g/l de glicina que se lleva a volumen con H20 desionizada purificada) (Murashige y Skoog (1962) Physiol. Plant. 75:473), 100 mg/l de mio-inositol, 0.5 mg/l de zeatin, y 60 g/l de sacarosa, que después de trae a volumen con H20 desionizada purificada después de ajustar a un pH de 5.6. Después, se agrega 6,0 g/l de agar-agar Ultrapure™ (EM Science) y se esteriliza y se enfría el medio. Posteriormente, se agregan 1.0 ml/l de 0.1 mM de ácido abscísico; .0 mg/l de ácido indoieacético y 3.0 mg/l de Bialafos, junto con 2.0 mi de un materia prima de 50 mg/ml de carbenicillina.

El medio libre de hormonas (272V) comprende 4,3 g/l de sales MS (GIBCO 11 117-074), 5,0 ml/l de solución madre de vitaminas MS (0,100 g/l de ácido nicotínico, 0,02 g/l de tiamina HCI, 0, 10 g/l de piridoxina HCL y 0,40 g/l de glicina que se lleva a volumen con H20 desionizada purificada), 0, 1 g/l de mioinositoi y 40,0 g/l de sacarosa (que se lleva a volumen con H20 desionizada purificada después de ajusfar el pH a 5,6); y 6 g/l de Bacto agar (que se agregó después de llevar a volumen con H20 desionizada purificada); se esteriliza y enfría el medio a 60 °C.

Ejemplo 5. Análisis de deleción del promotor de RCc3 El promotor de 1710bp RCc3 puede dividirse en 5 regiones de 300-400bp con el uso de sitios de escisión de endonucleasa de restricción que ocurren de forma natural en el promotor en las siguientes posiciones (lectura 3' a 5'): BAM \ (0), BglH (232), BspM\ (545), Stu\ (941 ), Nhe\ (1354), y Not\ (1710). Esto dio la oportunidad de generar cuatro 5' truncamientos del promotor. Comprobar estos truncamientos en las plantas puede proporcionar un entendimiento de las regiones del promotor que juegan un papel importante en la expresión y la preferencia de la raíz de este promotor.

La digestión del promotor de RCc3 con endonucleasas de restricción Notl-Nhel resulto en la producción de un fragmento del promotor de 1354bp, denominado TR1. La digestión con Notl y Stul resultó en un fragmento del promotor de 941 bp y la digestión con Notl y SspMI resultó en un fragmento de 545bp, denominados respectivamente TR2 y TR3. Cortar el promotor con Notl y Bglll resultó en un fragmento del promotor de 232bp, denominado TR4. Cada uno de estos fragmentos se purificó y ligó en un cásete de expresión que resultó en cada fragmento del promotor operablemente conectado al gen B-glucuronidasa (GUS).

Veinticinco eventos de maíz transgénico se regeneraron para cada truncamiento y se cultivaron bajo condiciones de invernadero. Las plantas crecieron a la etapa V6 7 cuando se tomaron muestras del material de las hojas y la raíz para análisis de tinción histoquímica GUS. Las plantas se cultivaron hasta la etapa R1 -R2 y se tomaron muestras para tallo, panoja y polen. Los resultados mostraron que ninguno de los truncamientos afectó la expresión en las hojas, tallos y polen. No se detectó ninguna expresión de GUS en ninguno de los tejidos (Tabla 3). El tejido de recubrimiento que rodea al tallo también se ensayó para encontrar la expresión y no se detectó ninguna (datos no mostrados). La expresión borlas tampoco fue detectable, excepto por una planta transformada con el fragmento del promotor de 232bp.

El patrón general de expresión se retuvo en general, pero el nivel de expresión en la punta de la raíz que incluye la región meristemática y parte de la región de elongamiento disminuyó al trucarse el promotor. Generalmente, el patrón general de expresión se retuvo, pero el nivel de expresión en la punta de la raíz que incluye la región meristemática y parte de la región de elongamiento disminuyó al truncarse el promotor. El fragmento del promotor de 232bp, que contenía una caja TATA putativa, no exhibió ninguna expresión de la raíz.

Pueden identificarse unos cuantos motivos en el promotor de RCc3, tales como ROOTMOTIFTAPOX1 (ATATT) (datos no mostrados). Sin embargo, el truncamiento del promotor sugiere que el promotor de RCc3 promotor tiene secuencias que proporcionan redundancia funcional o que las secuencias críticas para las expresión y preferencia de la raíz residen en el fragmento H1 BspM\-Bam. La expresión preferida por la raíz se mantiene en el sitio de la escisión del Bspt H, pero cuando el promotor se trunca en el sitio de escisión II de Bgl, el promotor se vuelve no funcional Tabla 3. Resultados del análisis de deleción Los datos de la tinción histoquímica se representan en una escala de 0 a 3, y el promotor Ubi-1 de maíz, que está muy caracterizado, sirve como punto de referencia. El promotor Ubi-1 es un promotor constitutivo fuerte en casi todos los tejidos de maíz.

Los artículos "un" y "una" se usan en la presente descripción para referirse a uno o más de uno (es decir, a por lo menos uno) de los objetivos gramaticales del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" se refiere a uno o más elementos.

Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patentes mencionadas en la especificación son indicativas del nivel de aquellos con experiencia en la técnica a quienes se dirige la presente invención. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patentes se incorporan en la presente descripción como referencia con el mismo alcance, como si cada publicación, cada patente o cada solicitud de patente se indicara específica e individualmente para incorporarla como referencia.

Aunque la invención mencionada anteriormente se ha descrito con cierto detalle a modo de ilustración y ejemplo para lograr claridad de comprensión, será evidente que pueden practicarse ciertos cambios y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES: 1. - Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: a) una secuencia de nucleótidos que comprende las secuencia expuesta en la sec. con núm. de ident.: 1 o un complemento de esta; b) una secuencia de nucleótidos que comprende las secuencias promotoras vegetales de los plásmidos depositados con número de depósito de patente NRRL B-50462, o un complemento de estas; y c) una secuencia de nucleótidos que comprende por lo menos 20 nucleótidos contiguos de la secuencia expuesta en la sec. con núm. de ident.: 1 , en donde la secuencia inicia la transcripción en una célula vegetal. 2. - Un cásete de expresión que contiene una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la reivindicación 1 , unido operativamente a una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés. 3. - Un vector que comprende el cásete de expresión de acuerdo con la reivindicación 2. 4. - Una célula vegetal que comprende el cásete de expresión de acuerdo con la reivindicación 2. 5. - La célula vegetal de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el cásete de expresión se integra de manera estable en el genoma de la célula vegetal. 6. - La célula vegetal de acuerdo con la reivindicación 4, en donde, la célula vegetal proviene de una monocotiledónea. 7:- La célula vegetal de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la monocotiledónea es maíz. 8.- La célula vegetal de acuerdo con la reivindicación 4, en donde la célula vegetal proviene de una dicotiledónea. 9.- Una planta que comprende el cásete de expresión de acuerdo con la reivindicación 2. 10 - La planta de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la planta es una monocotiledónea. 1 1.- La planta de acuerdo con la reivindicación 10, en donde la planta monocotiledónea es maíz. 12 - La planta de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la planta es una dicotiledónea. 13 - La planta de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el cásete de expresión se incorpora de manera estable en el genoma de la planta. 14.- Una semilla transgénica de la planta de acuerdo con la reivindicación 13, en donde la semilla comprende el cásete de expresión. 15.- La planta de acuerdo la reivindicación 9, en donde la secuencia de nucleótidos heteróloga de interés comprende un producto génico que confiere resistencia a herbicidas, sales, frío, sequía, patógenos o a insectos. 16.- Un método para expresar una secuencia de nucleótidos en una planta o en una célula vegetal; el método comprende introducir en la planta o en la célula vegetal un cásete de expresión que comprende un promotor unido operativamente a una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés, en donde el promotor comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: a) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia expuesta en la sec. con núm. de ident.: 1 ; b) una secuencia de nucleótidos que comprende las secuencias promotoras vegetales de los plásmidos designados con número de depósito de patente NRRL B-50462; y, c) una secuencia de nucleótidos que comprende por lo menos 20 nucleótidos contiguos de la secuencia expuesta en la sec. con núm. de ident.: 1 , en donde la secuencia de nucleótidos inicia la transcripción en la planta. 17. - El método de acuerdo con la reivindicación 16, en donde la secuencia de nucleótidos heteróloga de interés comprende un producto génico que confiere resistencia a herbicidas, sales, frío, sequía, patógenos o insectos. 18. - El método de acuerdo con la reivindicación 16, en donde la secuencia de nucleótidos heteróloga de interés se expresa de una manera preferida para la raíz. 19. - Un método para expresar una secuencia de nucleótidos de una manera preferida para la raíz en una planta; el método comprende introducir en una célula vegetal un cásete de expresión y regenerar una planta a partir de esa célula vegetal; la planta tiene incorporado en su genoma de manera estable el cásete de expresión; el cásete de expresión comprende un promotor unido operativamente a una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés, en donde el promotor comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: a) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia expuesta en la sec. con núm. de ident: 1 ; b) una secuencia de nucleótidos que comprende las secuencias promotoras vegetales de los plásmidos depositados con número de depósito de patente NRRL B-50462; y c) una secuencia de nucletidos que comprende por lo menos 20 nucleótidos contiguos de la secuencia expuesta en la sec. con núm. de iden : 1 , en donde la secuencia inicia la transcripción en una célula de la raíz de una planta. 20.- El método de acuerdo con la reivindicación 19, en donde la expresión de la secuencia de nucleótidos heteróloga de interés altera el fenotipo de la planta. RESUMEN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona composiciones y métodos para regular la expresión de secuencias de nucleótidos heterólogas en una planta. Las composiciones incluyen una secuencia de nucleótidos novedosa para un promotor del gen que codifica RCc3 de sorgo bicolor. Un método para expresar una secuencia de nucleótidos heteróloga en una planta que usa las secuencias promotoras descritas en la presente descripción. El método comprende transformar una planta o célula vegetal con una secuencia de nucleótidos operativamente unida a uno de los promotores de la presente invención.