MX2013005374A - Preparaciones de yogur de consistencia espesa que contienen microorganismos probioticos no replicadores. - Google Patents
Preparaciones de yogur de consistencia espesa que contienen microorganismos probioticos no replicadores.Info
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- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
La presente invención se refiere al campo de composiciones de yogur de consistencia espesa. En particular, la presente invención proporciona composiciones de yogur de consistencia espesa que comprenden microorganismos probióticos no replicadores. Estos microorganismos probióticos no replicadores pueden ser, por ejemplo, microorganismos probióticos bioactivos tratados térmicamente. La presente invención también se refiere a los beneficios para la salud proporcionados por estos microorganismos probióticos no replicadores.
Description
PREPARACIONES DE YOGUR DE CONSISTENCIA ESPESA QUE CONTIENEN
MICROORGANISMOS PROBIOTICOS NO REPLICADORES
La presente invención se refiere al campo de las composiciones de yogur de consistencia espesa. En particular, la presente invención proporciona composiciones de yogur de consistencia espesa que comprenden microorganismos probioticos no replicadores. Estos microorganismos probioticos no replicadores pueden ser, por ejemplo, microorganismos probioticos bioactivos tratados térmicamente. La presente invención también se refiere a los beneficios para la salud proporcionados por estos microorganismos probioticos no replicadores.
Los beneficios para la salud de los probioticos son bien aceptados en el arte y se resumieron, por ejemplo, en el documento de Blum et al. en Curr Issues Intest Microbiol. Septiembre 2003; 4(2):53-60. A menudo, los probioticos se administran junto con prebióticos en las formulaciones simbióticas que incluso pueden tener beneficios mejorados para la salud.
Las bacterias probióticas son conocidas por ser capaces de adherirse a las células intestinales humanas y de excluir bacterias patógenas en las células intestinales humanas. Para tener esta actividad, las bacterias probióticas deben permanecer viables en el producto hasta su consumo. Esto constituye un desafío para la industria y hace que la adición de probioticos a productos alimenticios no sea una tarea trivial.
En particular, en el caso de productos que se calientan durante su producción y/o que pueden tener períodos de almacenamiento más extensos antes de ser consumidos, tales como productos no perecederos, se suele considerar difícil garantizar que los probioticos permanezcan viables en el producto hasta el consumo, así como también garantizar que también lleguen en estado viable al tracto intestinal.
Sería deseable disponer de una composición de yogurt con consistencia espesa que sea capaz de impartir beneficios probioticos incluso después de tiempos de almacenamiento más extensos bajo condiciones críticas para los probioticos, siendo simultáneamente fácil de preparar. Sería preferible si esto se lograra mediante el uso de ingredientes naturales que sean seguros para administrar sin efectos secundarios y que sean fáciles de incorporar en composiciones de yogurt con consistencia espesa utilizando técnicas industriales del estado del arte.
También sería deseable proporcionar composiciones que comprendan probioticos con efectos mejorados de estimulación inmunológica.
Asimismo, sería deseable proporcionar composiciones que comprendan probioticos con efectos antiinflamatorios mejorados.
En la presente invención se aborda esta necesidad. Por lo tanto, el objetivo de la misma es mejorar el estado del arte y proporcionar composiciones de yogur de consistencia espesa que satisfagan las necesidades mencionadas anteriormente.
Sorprendentemente, se pudo conseguir este objetivo por medio de la materia de la reivindicación independiente. Las reivindicaciones dependientes desarrollan en mayor detalle el concepto de la presente invención.
En consecuencia, la presente invención proporciona una composición de yogurt de consistencia espesa que comprende microorganismos probióticos no replicadores.
El yogur de consistencia espesa puede ser un yogur firme o batido. Los yogures batidos se encuentran, por ejemplo, en forma de preparaciones sencillas, no endulzadas, endulzadas o con sabor. El yogur de consistencia espesa según la presente invención puede ser bajo en grasas o libre de grasas o cremoso. También puede incluir una preparación de fruta. El yogur firme puede encontrarse en forma de yogur firme con fruta en el fondo.
Una ventaja de añadir microorganismos probioticos no replicadores a un producto es que, aparte de los probioticos viables, no tienen ninguna influencia en la textura de las fibras, si las hubiese en el producto, de modo que la sensación en la boca de la composición se mantiene sin cambios con el tiempo.
Los inventores pudieron demostrar que los probioticos no replicadores pueden ser capaces de impartir los beneficios para la salud de los probioticos, e incluso pueden tener beneficios mejorados.
Por lo tanto, parecen innecesarias las medidas complicadas medidas para mantener los probioticos vivos en el producto final y para garantizar que lleguen vivos al intestino. Adicionalmente, el uso de probioticos no replicadores en la composición de yogur de consistencia espesa también permite que tenga probioticos y prebioticos juntos en una misma preparación sin el riesgo de una destrucción prematura no deseada de las fibras durante la preparación y el almacenamiento del producto.
La cantidad de microorganismos no replicadores en la composición de yogur de consistencia espesa de la presente invención puede corresponder a alrededor de 106 a 1012 ufe por porción.
Obviamente, los microorganismos no replicadores no forman colonias, por lo tanto, este término debe entenderse como la cantidad de microorganismos no replicadores que se obtiene a partir de 104 y 1012 ufe/g de bacterias replicadoras. Esto incluye microorganismos que son inactivados, no viables o que se encuentran muertos o presentes como fragmentos tales como ADN o compuestos de pared celular o citoplasmáticos. En otras palabras, la cantidad de microorganismos que contiene la composición se expresa en términos de la capacidad de formar colonias (ufe) de dicha cantidad de microorganismos como si todos los microorganismos estuvieran vivos,
independientemente de si son no replicadores, como inactivados o muertos, fragmentados o una mezcla de cualquiera de estos estados o de todos.
El yogur de consistencia espesa está hecho a partir de una mezcla estandarizada de leche entera, parcialmente reducida en grasa, leche condensada descremada, crema y leche en polvo sin grasa. De manera alternativa, la leche se puede concentrar parcialmente mediante la eliminación de aproximadamente 15% a aproximadamente 20% de agua en un recipiente al vacío. Se prefiere suplementar la leche en polvo sin grasa con sólidos no grasos lácteos (SNGL). Los niveles de grasa en el yogur varían desde alrededor de menos de 0,5% para el yogur sin grasa hasta un mínimo de 3,2% para el yogur normal. El SNGL es de preferencia de por lo menos 8,25%.
Para modificar ciertas propiedades del yogur, se pueden añadir diversos ingredientes. Para hacer yogur más dulce, se puede añadir sacarosa (azúcar) a un contenido de aproximadamente 7%. Para yogures reducidos en calorías se utilizan edulcorantes artificiales como aspartamo o sacarina. Se puede añadir crema para proporcionar una textura más suave. Tanto la consistencia como la estabilidad en almacenamiento del yogur se pueden mejorar mediante la inclusión de estabilizadores tales como almidón para alimentos, gelatina, goma de algarrobo, goma guar y pectina. La composición de yogur de consistencia espesa puede comprender, por ejemplo, alrededor de 0,3% a 0,5% en peso de pectina.
La composición de yogur de consistencia espesa puede ser almacenada bajo condiciones de refrigeración. Las condiciones de refrigeración típicamente tienen temperaturas en el rango de 2°C a 15°C, de preferencia de 4°C a 8°C.
La composición de yogur de consistencia espesa también puede ser almacenada bajo condiciones ambientales. Las condiciones ambientales típicamente tienen temperaturas en el rango de 16°C a 25°C, de preferencia de 18°C a 23°C. Es
particularmente difícil mantener los probioticos viables bajo condiciones ambientales durante períodos prolongados. Por lo tanto, la adición de microorganismos probioticos no replicadores es una manera promisoria de impartir al producto beneficios adicionales para la salud, especialmente para las composiciones de yogur de consistencia espesa a ser almacenadas bajo condiciones ambientales.
La composición de yogur de consistencia espesa también puede comprender prebioticos.
El término "prebiótico" denota sustancias alimenticias que promueven el desarrollo de probioticos en el intestino. No se descomponen en el estómago y/o intestino superior ni son absorbidos en el tracto gastrointestinal de la persona que las ingiere, sino que son fermentados por la microflora gastrointestinal y/o por probioticos. Los prebioticos se definen, por ejemplo, en el documento de Glenn R. Gibson y Marcel B. Roberfroid, Dietary Modulation of the Human Colonic Microbiota: Introducing the Concept of Prebiotics, J. Nutr. 1995 125: 1401 -1412.
Los prebioticos que pueden ser utilizados de acuerdo con la presente invención no se encuentran particularmente limitados e incluyen todas las sustancias alimenticias que promueven el desarrollo de probioticos en el intestino. De preferencia, éstos pueden ser seleccionados a partir del grupo compuesto por oligosacáridos, opcionalmente que contienen fructosa, galactosa, mañosa; fibras dietéticas, en particular fibras solubles, fibras de soya; inulina; o mezclas de los mismos. Los prebioticos preferidos son fructo-oligosacáridos (FOS), galacto-oligosacáridos (IOS), isomalto-oligosacáridos, xilo-oligosacáridos, oligosacáridos de soya, glucosilsacarosa (GS), lactosacarosa (LS), lactulosa (LA), palatinosa-oligosacáridos (PAO), malto-oligosacáridos (MOS), gomas y/o sus hidrolizados, pectinas y/o sus hidrolizados.
Ejemplos típicos de prebioticos son oligofructosa e inulina.
La cantidad de prebióticos en la composición de yogur de consistencia espesa de acuerdo con la invención depende de su capacidad de promover el desarrollo de bacterias de ácido láctico.
La composición de yogur de consistencia espesa puede comprender una cantidad de probióticos que corresponde a una cantidad de por lo menos 103 ufc/g de prebiótico, de preferencia 104 a 107 ufc/g de prebiótico, por ejemplo.
Se descubrió sorprendentemente en la presente invención que, por ejemplo, en términos de un efecto de estimulación inmunológica y/o en términos de un efecto antiinflamatorio, los microorganismos probióticos no replicadores pueden ser incluso más efectivos que los microorganismos probióticos replicadores.
Esto es sorprendente, ya que los probióticos se definen a menudo como "microorganismos vivos que cuando se administran en cantidades adecuadas confieren beneficios para la salud del huésped" (Directrices de FAO/OMS). La gran mayoría de la literatura publicada hace referencia a los probióticos vivos. Además, diversos estudios han investigado los beneficios para la salud entregados por las bacterias no replicantes y en su mayoría indican que la inactivación de los probióticos, por ejemplo, por tratamiento térmico, produce una pérdida del beneficio para la salud deseado (Rachmilewitz, D., et al., 2004, Gastroenterology 126:520-528; Castagliuolo, et al., 2005, FEMS Immunol. Meó. Microbio!. 43:197-204; Gilí, H. S. y K. J. Rutherfurd, 2001 , Br. J. Nutr. 86:285-289; Kaila, M-, et al., 1995, Arch. Dis. Chlld 72:51 -53). Algunos estudios han demostrado que los probióticos muertos pueden retener algunos efectos sobre la salud (Rachmilewitz, D., et al., 2004, Gastroenterology 126:520-528; Gilí, H. S. y K. J. Rutherfurd, 2001 , Br. J. Nutr. 86:285-289), pero evidentemente los probióticos vivos se consideraron en el arte como exhibiendo un mayor rendimiento.
Los microorganismos probióticos "no replicadores" incluyen bacterias
probióticas que han sido tratadas con calor. Esto incluye microorganismos que son inactivados, inviables, se encuentran muertos y/o presentes como fragmentos tales como ADN, metabolitos, compuestos citoplásmicos y/o materiales de la pared celular.
La expresión "no replicadores" significa que no se pueden detectar células viables y/o unidades formadoras de colonias mediante los métodos clásicos en placa.
Dichos métodos clásicos en placa se resumen en el libro de microbiología: James Monroe Jay, Martin J. Loessner, David A. Golden. 2005. Modern food microbiology. 7ma edición, Springer Science, New York, N.Y. p. 790. Típicamente, la ausencia de células viables se puede demostrar de la siguiente manera: no se observa colonia visible alguna en placas de agar o no se produce un aumento de turbidez en el medio de cultivo líquido después de la inoculación con diferentes concentraciones de preparaciones bacterianas (muestras "no replicadoras") e incubación bajo condiciones apropiadas (atmósfera aeróbica y/o anaeróbica durante por lo menos 24 horas).
En el marco de la presente invención, los probióticos se definen como "preparaciones de células microbianas o componentes de células microbianas con un efecto beneficioso sobre la salud o el bienestar del huésped." (Salminen S, Ouwehand A. Benno Y. et al. "Probiotics: how should they be defined' Trends Food Sci. Technol. 1999:10 107-10).
Las composiciones de acuerdo con la presente invención comprenden microorganismos probióticos y/o microorganismos probióticos no replicadores en una cantidad suficiente para generar por lo menos parcialmente un beneficio para la salud. Una cantidad adecuada para lograr esto se define como "una dosis terapéuticamente efectiva". En este contexto, las cantidades efectivas dependerán de una serie de factores conocidos por las personas expertas en la técnica, tales como el peso y el estado general de salud del consumidor, y del efecto de la matriz alimenticia.
En aplicaciones profilácticas, las composiciones de acuerdo con la presente invención se administran a un consumidor susceptible a o bien en riesgo de sufrir un trastorno en una cantidad que sea suficiente para reducir por lo menos parcialmente el riesgo de desarrollar dicho trastorno. Esta cantidad se define como "una dosis profiláctica efectiva". Cabe destacar que las cantidades precisas dependen de una serie de factores, tales como el estado de salud y el peso del consumidor, y del efecto de la matriz alimenticia.
Las personas expertas en la técnica podrán ajustar la dosis terapéuticamente efectiva y/o la dosis profiláctica efectiva de manera apropiada.
En general, la composición de acuerdo con la presente invención contiene microorganismos probióticos no replicadores en una dosis terapéuticamente efectiva y/o en una dosis profiláctica efectiva.
Usualmente, la dosis terapéuticamente efectiva y/o la dosis profiláctica efectiva se encuentra en el rango de aproximadamente 0,005 mg a 1000 mg de microorganismos probióticos no replicadores por dosis diaria.
De preferencia, los microorganismos no replicadores están presentes en una cantidad equivalente a entre 104 y 109 ufc/g de composición seca, de mayor preferencia aun en una cantidad equivalente a entre 105 y 109 ufc/g de composición seca.
Los probióticos pueden convertirse en no replicadores mediante cualquier método conocido en el arte.
Las tecnologías disponibles en la actualidad para convertir cepas probióticas en no replicadoras suelen ser de tratamiento térmico, radiación gamma, luz UV o involucrar el uso de agentes químicos (formalina, paraformaldehído).
En términos de cantidades numéricas, por ejemplo, microorganismos no replicadores tratados a "alta temperatura por corto tiempo" pueden estar presentes en la composición en una cantidad que corresponde a entre 104 y 1012 ufc/g equivalentes de la composición seca.
Sería preferible utilizar una técnica para convertir probióticos en no replicadores que sea relativamente fácil de aplicar en circunstancias industriales en la industria alimentaria.
Por ejemplo, los probióticos pueden convertirse en no replicadores y pueden añadirse a la composición de yogur de consistencia espesa como probióticos no replicadores.
La mayoría de los productos que se encuentran actualmente en el mercado que contienen probióticos son tratados con calor durante su producción. Por lo tanto, sería conveniente poder tratar con calor probióticos ya sea junto con el producto producido o por lo menos de una manera similar, de modo tal que simultáneamente los probióticos mantienen o mejoran sus propiedades beneficiosas o incluso adquieren una nueva propiedad beneficiosa para el consumidor.
En consecuencia, los probióticos también se pueden añadir a la composición de yogur de consistencia espesa en una forma viable y pueden convertirse en no replicadores durante una etapa de tratamiento térmico en el proceso normal de producción de yogur de consistencia espesa.
Considerando que la inactivación de microorganismos probióticos mediante tratamientos térmicos se asocia en la literatura generalmente con una pérdida por lo menos parcial de actividad probiótica, en la presente invención se ha descubierto sorprendentemente que la conversión de microorganismos probióticos en no replicadores, por ejemplo, mediante tratamiento térmico, no provoca la pérdida de beneficios probióticos para la salud, sino que por el contrario podría mejorar los beneficios para la salud existentes e incluso generar nuevos beneficios para la salud.
Por lo tanto, una realización de la presente invención consiste en una composición de yogur de consistencia espesa en donde los microorganismos probioticos no replicadores se convirtieron en no replicadores mediante un tratamiento térmico.
Dicho tratamiento térmico puede llevarse a cabo a una temperatura de por lo menos 71 ,5°C durante por lo menos 1 segundo.
Se pueden utilizar tratamientos térmicos a largo plazo o tratamientos térmicos a corto plazo.
Actualmente, en la escala industrial se suelen preferir tratamientos térmicos a corto plazo, tales como tratamientos térmicos similares al tratamiento UHT. Este tipo de tratamiento térmico reduce la carga bacteriana, y reduce el tiempo de procesamiento, reduciendo de este modo la descomposición de nutrientes.
En la presente invención se demuestra por primera vez que microorganismos probioticos, sometidos a un tratamiento térmico a altas temperaturas por tiempos cortos, exhiben perfiles inmunológicos antiinflamatorios, independientemente de sus propiedades iniciales. En particular, mediante este tratamiento térmico se desarrolla un nuevo perfil antiinflamatorio o bien se mejora un perfil antiinflamatorio existente.
Por lo tanto, ahora es posible generar microorganismos probioticos no replicadores con perfiles inmunológicos antiinflamatorios mediante el uso de parámetros específicos de tratamiento térmico que corresponden a tratamientos térmicos típicos de aplicación industrial, incluso si los homólogos vivos no son cepas antiinflamatorias.
De esta manera, por ejemplo, el tratamiento térmico puede ser un tratamiento de alta temperatura de alrededor de 71 ,5°C a 150°C durante cerca de 1 a 120 segundos. El tratamiento de alta temperatura puede ser un tratamiento de alta temperatura/tiempo corto (HTST) o un tratamiento a temperatura ultra alta (UHT).
Los microorganismos probioticos pueden ser sometidos a un tratamiento de
alta temperatura a aproximadamente 71 ,5°C a 150°C por un período corto de aproximadamente 1 a 120 segundos.
De mayor preferencia, los microorganismos pueden ser sometidos a un tratamiento de alta temperatura a aproximadamente 90°C a 140°C, por ejemplo 90°C a 120°C, durante un período corto de cerca de 1 a 30 segundos.
Este tratamiento de alta temperatura convierte los microorganismos por lo menos en parte en no replicadores.
El tratamiento de alta temperatura se puede llevar a cabo a una presión atmosférica normal, pero también se puede realizar a una presión elevada. La presión típica varía desde 1 hasta 50 bares, de preferencia desde 1 hasta 10 bares, de mayor preferencia desde 2 hasta 5 bares. Obviamente, se prefiere si los probioticos son tratados térmicamente en un medio que sea líquido o sólido cuando se aplica el calor. Por lo tanto, una presión ideal para ser aplicada dependerá de la naturaleza de la naturaleza de la composición a la cual se proporcionan los microorganismos y de la temperatura utilizada.
El tratamiento de alta temperatura puede llevarse a cabo en un rango de temperaturas de aproximadamente 71 ,5°C a 150°C, de preferencia de aproximadamente 90°C a 120°C, de mayor preferencia de aproximadamente 120°C a 140°C.
El tratamiento de alta temperatura puede realizarse durante un período corto de aproximadamente 1 a 120 segundos, de preferencia de aproximadamente 1 a 30 segundos, de mayor preferencia durante aproximadamente 5 a 15 segundos.
Este marco de tiempo específico se refiere al tiempo durante el cual los microorganismos probioticos se someten a la temperatura especificada. Cabe destacar que dependiendo de la naturaleza y la cantidad de la composición a la que los microorganismos se proporcionan y dependiendo de la arquitectura del equipo calefactor utilizado, puede diferir el tiempo de aplicación de calor.
Sin embargo, típicamente la composición de acuerdo con la presente invención y/o los microorganismos son sometidos a un tratamiento de alta temperatura por corto tiempo (HTST), a pasteurización flash o a un tratamiento de temperatura ultra alta (UHT).
Un tratamiento UHT es un procesamiento de temperatura ultra alta o un tratamiento de ultra calor (ambos casos abreviados UHT) que involucra la esterilización por lo menos parcial de una composición al calentarla durante un corto período, alrededor de 1 a 10 segundos, a una temperatura superior a 135°C (275°F), que es la temperatura necesaria para matar las esporas bacterianas en la leche. Por ejemplo, el procesamiento de la leche de esta manera, usando temperaturas superiores a 135°C, permite una disminución de la carga bacteriana en el tiempo de retención necesario (a 2-5 segundos), lo que permite una operación de flujo continuo.
Existen dos tipos principales de sistemas UHT: los sistemas directo e indirecto. En el sistema directo, los productos son tratados por inyección de vapor o infusión de vapor, mientras que en el sistema indirecto, los productos son tratados con calor usando un intercambiador de calor de placas, un intercambiador de calor tubular o un intercambiador de calor de superficie raspada. Se pueden aplicar combinaciones de sistemas UHT en cualquier etapa o en etapas múltiples durante el proceso de preparación del producto.
Un tratamiento HTST se define de la siguiente manera (alta temperatura/corto tiempo): método de pasteurización diseñado para lograr una reducción de 5-log, matando 99,9999% de los microorganismos viables en la leche. Este método se considera adecuado para la destrucción de casi todas las levaduras, mohos y bacterias comunes de descomposición y también adecuado para garantizar la destrucción de organismos patógenos comunes resistentes al calor. En el proceso HTST la leche se
calienta a 71 ,7°C (161 °F) durante 15 a 20 segundos.
La pasteurización flash es un método de pasteurización térmica de bebidas perecederas, tales como zumos de frutas y verduras, cerveza y productos lácteos. Se realiza antes del llenado en contenedores con el fin de matar microorganismos de descomposición, para que los productos sean más seguros y para poder extender su vida útil. El líquido se mueve en flujo continuo controlado mientras se somete a temperaturas de 71 ,5°C (160°F) a 74°C (165°F) durante aproximadamente 15 a 30 segundos.
En el marco de la presente invención, la expresión "tratamiento de alta temperatura por corto tiempo" incluirá tratamientos de alta temperatura por corto tiempo (HTST), tratamientos UHT y pasteurización flash, por ejemplo.
Puesto que un tratamiento térmico de este tipo proporciona probióticos no replicadores con un perfil antiinflamatorio mejorado, la composición de acuerdo con la presente invención puede ser para ser usada en la prevención o el tratamiento de trastornos inflamatorios.
Los trastornos inflamatorios que se pueden tratar o prevenir mediante la composición de la presente invención no se encuentran particularmente limitados. Por ejemplo, pueden ser seleccionados a partir del grupo compuesto por inflamaciones agudas, tales como sepsis; quemaduras; e inflamación crónica, como enfermedades inflamatorias del intestino, por ejemplo, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, pouchitis; enterocolitis necrótica, inflamación de la piel, como inflamación inducida por productos químicos o UV, eczema, piel reactiva; síndrome del intestino irritable; inflamación de los ojos; alergia, asma; y combinaciones de las mismas.
Si se usan tratamientos térmicos a largo plazo para convertir los microorganismos probióticos en no replicadores, dicho tratamiento térmico puede llevarse a cabo en el rango de temperaturas de aproximadamente 70°C a 150°C durante cerca de
3 minutos a 2 horas, de preferencia en el rango de 80°C a 140°C desde 5 minutos a 40 minutos.
Aunque el estado de la técnica generalmente enseña que las bacterias que se convierten en no replicadoras mediante tratamientos térmicos a largo plazo suelen ser menos efectivas que las células vivas en términos de ejercer sus propiedades probióticas, en la presente invención se pudo demostrar que los probióticos sometidos a un tratamiento térmico son superiores en la estimulación del sistema inmunologico en comparación con sus homólogos vivos.
La presente invención se refiere también a una composición que comprende microorganismos probióticos que se convirtieron en no replicadores mediante un tratamiento térmico a por lo menos aproximadamente 70°C durante por lo menos cerca de 3 minutos.
Los efectos de estimulación inmunológica de los probióticos no replicadores se confirmaron mediante elaboración de perfiles inmunológicos in vitro. El modelo in vitro utilizado contempla la elaboración de perfiles de citoquinas a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) y es bien aceptado en la técnica como modelo estándar para pruebas de compuestos inmunomoduladores (Schultz et al., 2003, Journal of Dairy Research 70, 165-173; Taylor et al., 2006, Clinical and Experimental Allergy, 36, 1227-1235; Kekkonen et al., 2008, World Journal of Gastroenterology, 14 , 1192- 1203) .
El ensayo PBMC in vitro ha sido utilizado por diversos autores y equipos de investigación, por ejemplo, para clasificar probióticos en función de su perfil inmunologico, es decir, sus características antiinflamatorias o pro-inflamatorias (Kekkonen et al., 2008, World Journal of Gastroenterology, 14, 1 192-1203).
Por ejemplo, este ensayo se ha mostrado para permitir predecir un efecto
antünflamatorio de candidatos probióticos en modelos de ratón de colitis intestinal (Foligne, B., er a/., 2007, World J. Gastroenterol. 13:236-243). Por otra parte, este ensayo se utiliza regularmente como lectura obligatoria en ensayos clínicos y se demostró que produce resultados coherentes con los resultados clínicos (Schuitz et al., 2003, Journal of Dairy Research 70, 165-173; Taylor et al., 2006, Clinical and Experimental Allergy, 36, 1227-1235).
Las enfermedades alérgicas han aumentado constantemente en las últimas décadas y la OMS las considera en la actualidad como epidemias. Por lo general, se considera que la alergia es el resultado de un desequilibrio entre las respuestas Th1 y Th2 del sistema inmunológico, lo que conduce a una fuerte predisposición para la producción de mediadores Th2. Por lo tanto, la alergia se puede mitigar, disminuir o prevenir mediante la restauración de un equilibrio adecuado entre los brazos Th1 y Th2 del sistema inmunológico. Esto implica la necesidad de reducir las respuestas Th2 o de mejorar, por lo menos transitoriamente, las respuestas Th1. Este último caso sería característico de una respuesta de estimulación inmunológica, a menudo acompañada de, por ejemplo, niveles más altos de IFNy, TNF-a e IL-12. (Kekkonen et al., 2008, World Journal of Gastroenterology, 14, 192-1203; Viljanen M. ef al., 2005, Allergy, 60, 494-500).
La composición de yogur de consistencia espesa de la presente invención permite, por lo tanto, tratar o prevenir trastornos relacionados con una defensa inmunológica en riesgo.
Por consiguiente, los trastornos ligados a una defensa inmunológica en riesgo que pueden tratarse o prevenirse mediante la composición de la presente invención, no se encuentran particularmente limitados.
Por ejemplo, pueden ser seleccionados a partir del grupo compuesto por
infecciones, en particular infecciones bacterianas, virales, fúngicas y/o de parásitos; deficiencias de fagocitos; niveles de inmunodepresión bajos a graves, tales como aquéllos inducidos por estrés o por medicamentos de inmunodepresión, quimioterapia o radioterapia; estados naturales de sistemas inmunológicos menos inmunocompetentes tales como los de los recién nacidos; alergias; y combinaciones de las mismas.
La composición de yogur de consistencia espesa de acuerdo con la presente invención también permite mejorar una respuesta del niño a las vacunas, en particular, a las vacunas orales.
Cualquier cantidad de microorganismos no replicadores será efectiva. No obstante, se suele preferir si los probióticos son no replicadores en por lo menos 90%, de preferencia por lo menos 95%, de mayor preferencia por lo menos 98%, de preferencia incluso mayor por lo menos 99%, idealmente por lo menos 99,9%, y más idealmente todos.
En una realización de la presente invención todos los microorganismos son no replicadores.
En consecuencia, en la composición de acuerdo con la presente invención, por lo menos 90%, de preferencia por lo menos 95%, de mayor preferencia por lo menos 98%, de preferencia incluso mayor por lo menos 99%, idealmente por lo menos 99,9%, y más idealmente todos los probióticos puede ser no replicadores.
Todos los microorganismos probióticos pueden ser utilizados para el propósito de la presente invención.
Por ejemplo, los microorganismos probióticos se pueden seleccionar a partir del grupo compuesto por bifidobacterias, lactobacilos, propionibacterias, o combinaciones de los mismos, por ejemplo, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium inf antis,
Bifidobacterium adolescentis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum, Lactococcus lactis, Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis, Lactococcus diacetylactis, Lactococcus cremoris, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii, Escherichia coli y/o mezclas de los mismos.
La composición de acuerdo con la presente invención puede, por ejemplo, comprender microorganismos probióticos seleccionados a partir del grupo compuesto por Bifidobacterium longum NCC 3001 , Bifidobacterium longum NCC 2705, Bifidobacterium breve NCC 2950, Bifidobacterium lactis NCC 2818, Lactobacillus johnsonii La1 ,
Lactobacillus paracasei NCC 2461 , Lactobacillus rhamnosus NCC 4007, Lactobacillus reuteri DS 17938, Lactobacillus reuteri ATCC55730, Streptococcus thermophilus NCC 2019, Streptococcus thermophilus NCC 2059, Lactobacillus casei NCC 4006, Lactobacillus acidophilus NCC 3009, Lactobacillus casei ACA-DC 6002 (NCC 1825), Escherichia coli Nissle, Lactobacillus bulgaricus NCC 15, Lactococcus lactis NCC 2287, o combinaciones de los mismos.
Todas estas cepas fueron depositadas bajo el Tratado de Budapest y/o se encuentran disponibles comercialmente.
Las cepas se han depositado bajo el Trátado de Budapest de la siguiente manera:
Bifidobacterium longum NCC 3001: ATCC BAA-999
Bifidobacterium longum NCC 2705: CNC 1-2618
Bifidobacterium breve NCC 2950: CNCM I-3865
Bifidobacterium lactis NCC 2818: CNCM I-3446
Lactobacillus paracasei NCC 2461: CNCM 1-21 16
Lacíobacillus rhamnosus NCC 4007: CGMCC 1 .3724
Streptococcus themophilus NCC 2019: CNCM 1-1422
Streptococcus themophilus NCC 2059: CNCM 1-4153
Lactococcus lactis NCC 2287: CNCM 1-4154
Lactobacillus casei NCC 4006: CNCM 1-1518
Lactobacillus casei NCC 1825: ACA-DC 6002
Lactobacillus acidophilus NCC 3009: ATCC 700396
Lactobacillus bulgaricus NCC 15: CNCM 1-1 198
Lactobacillus johnsonii La 1 CNCM 1-1225
Lactobacillus reuteri DSM 17938 DSM 17938
Lactobacillus reuteriATCC55730 ATCC55730
Escherichia col¡ Nissle 1917: DSM 6601
Las cepas denominadas ATCC se depositaron con el Depósito de Patente
ATCC, 10801 University Blvd.., Manassas, VA 201 10, EE.UU.
Las cepas denominadas CNCM se depositaron con la COLLECTION NATIONALE DE CULTURES DE MICROORGANISMES (CNCM), 25 me du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, Francia.
Las cepas denominadas CGMCC se depositaron con el Centro General de Recolección de Cultivos Microbiológicos de China, Instituto de Microbiología, Academia de Ciencias de China, Zhongguancun, Código Postal 2714, Beijing 100080, China.
Las cepas denominadas ACA-DC se depositaron con las Colecciones Coordinadas de Microorganismos de Grecia, Laboratorio de Lácteos, Departamento de Tecnología y Ciencia de los Alimentos, Universidad Agrícola de Atenas, 75, lera Odos, Botanikos, Atenas 1 18 55, Grecia.
Las cepas denominadas DSM se depositaron con la DSMZ-Deutsche
Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7 B, 38124 Braunschweig, Alemania.
Las personas expertas en la técnica entenderán que pueden combinar libremente todas las características de la presente invención descritas en la presente memoria, sin apartarse del alcance de la invención divulgada.
Otras ventajas y características de la presente invención son evidentes a partir de los siguientes Ejemplos y Figuras.
Las Figuras 1 A y 1 B muestran la mejora de los perfiles inmunológicos antiinflamatorios de los probióticos tratados con "altas temperaturas por corto tiempo".
La Figura 2 muestra cepas probióticas no antiinflamatorias que se convierten en antiinflamatorias, es decir, que exhiben marcados perfiles inmunológicos antiinflamatorios in vitro después de ser tratadas con " altas temperaturas por corto tiempo".
Las Figuras 3A y 3B muestran cepas probióticas en uso en productos disponibles comercialmente que exhiben perfiles inmunológicos antiinflamatorios mejorados o nuevos in vitro después de ser tratadas con "altas temperaturas por corto tiempo".
Las Figuras 4A y 4B muestran cepas iniciadoras lácteas (es decir, cepas iniciadoras Lc1 ) que exhiben perfiles inmunológicos antiinflamatorios mejorados o nuevos in vitro después del tratamiento térmico a altas temperaturas.
La Figura 5 muestra una cepa probiótica no antiinflamatoria que exhibe perfiles inmunológicos antünflamatorios in vitro después de ser sometida a tratamientos HTST.
Figura 6: Análisis de Componentes Principales sobre datos PB C (IL-12p40, IFN-?, TNF-oc, IL-10) generado con cepas iniciadoras lácticas y probióticas en sus formas vivas y tratadas térmicamente (140°C durante 15 segundos). Cada punto representa una cepa viva o bien tratada térmicamente identificada por su número NCC o nombre.
La Figura 7 muestra las proporciones IL-12p40 / IL-10 de cepas vivas y tratadas térmicamente (85°C, 20min.). En general, el tratamiento térmico a 85°C durante 20 minutos provoca un aumento de las proporciones IL-12p40 / IL-10 a diferencia de los tratamientos a "altas temperaturas por corto tiempo" de la presente invención (Figuras 1A, 1 B, 2, 3A, 3B, 4A, 4B 5).
La Figura 8 muestra la mejora de la secreción de citoquinas in vitro a partir de PBMCs humanas estimuladas con bacterias tratadas térmicamente.
La Figura 9 muestra el porcentaje de intensidad de diarrea observada en ratones sensibilizados con OVA y provocados con solución salina (control negativo), ratones sensibilizados con OVA provocados con OVA (control positivo) y ratones sensibilizados con OVA provocados con OVA y tratados con Bifidobacterium breve NCC2950 tratada térmicamente o viva. Los resultados se muestran como el porcentaje de la intensidad de diarrea (media ± SEM calculado a partir de 4 experimentos independientes) con 100% de intensidad de diarrea correspondiente a los síntomas desarrollados en el grupo de control positivo (sensibilizado y provocado por el alérgeno).
Ejemplo 1 :
Metodología
Preparaciones bacterianas:
Los beneficios para la salud impartidos por probióticos vivos en el sistema inmunológico del huésped se consideran generalmente como específicos de una cepa. Se ha demostrado que los probióticos que inducen altos niveles de IL-10 y/o bajos niveles de citoquinas pro-inflamatorias in vitro (ensayo de PBMC) son potentes cepas antiinflamatorias in vivo (Foligné, B., et al., 2007, World J. Gastroenterol. 13:236-243).
Se utilizaron diversas cepas de probióticos para investigar las propiedades antünflamatorias de los probióticos sometidos a tratamiento térmico. Éstas fueron Bifidobacterium longum NCC 3001 , Bifidobacteríum longum NCC 2705, Bifidobacterium breve NCC 2950, Bifidobacterium lactis NCC 2818, Lactobacillus paracasei NCC 2461 , Lactobacillus rhamnosus NCC 4007, Lactobacillus casei NCC 4006, Lactobacillus acidophilus NCC 3009, Lactobacillus casei ACA-DC 6002 (NCC 1825) y Escherichia coli Nissle. También se evaluaron diversas cepas de cultivos iniciadores, incluyendo algunas cepas utilizadas comercialmente para producir productos fermentados Lc1 de Nestlé: Streptococcus thermophilus NCC 2019, Streptococcus thermophilus NCC 2059, Lactobacillus bulgaricus NCC 15 y Lactococcus lactis NCC 2287.
Las células bacterianas se cultivaron en condiciones optimizadas para cada cepa en biorreactores 5-15L. Se pueden emplear todos los medios de cultivo bacterianos típicos. Dichos medios son conocidos por las personas expertas en la técnica. Después de ajustar el pH a 5,5, se añadió continuamente 30% de solución base (NaOH o Ca (OH)2). Cuando se consideró adecuado, se mantuvieron condiciones anaeróbicas mediante gaseado de una cámara frontal con C02. Se cultivó E. coli bajo condiciones aeróbicas normalizadas.
Las células bacterianas se recolectaron por centrifugación (5.000 x g, 4°C) y se volvieron a suspender en solución salina de tampón fosfato (PBS) en volúmenes adecuados con el fin de lograr una concentración final de alrededor de 109 a 1010 ufc/ml. Parte de la preparación se congeló a -80°C con 15% de glicerol. Otra parte de las células fue sometida a un tratamiento térmico a:
Temperatura Ultra Alta: 140°C durante 15 segundos mediante
inyección de vapor indirecto.
Alta temperatura por corto tiempo (HTST): 74°C, 90°C y 120°C durante 15 segundos mediante inyección de vapor indirecto.
Baja temperatura por largo tiempo (85°C, 20 min.) en baño María. Después del tratamiento térmico, las muestras se mantuvieron congeladas a -80°C hasta su uso.
Elaboración de perfiles inmunológicos in vitro de preparaciones bacterianas:
Se evaluaron los perfiles inmunológicos de preparaciones bacterianas vivas y tratadas térmicamente (es decir, la capacidad para inducir secreción de citoquinas específicas de glóbulos humanos in vitro). Se aislaron células mononucleares de sangre periférica humana (PBMCs) a partir de filtros sanguíneos. Después de la separación por gradiente de densidad celular, se recolectaron células mononucleares y se lavaron dos veces con una solución salina equilibrada de Hank. A continuación, se volvieron a suspender las células en un Medio de Dulbecco Modificado de Iscove (IMDM, Sigma) suplementado con 10% de suero de ternero fetal (Bioconcept, París, Francia), 1 % de L-glutamina (Sigma), 1 % de penicilina estreptomicina (Sigma) y 0,1 % gentamicina (Sigma). Luego se incubaron PBMCs (7x105 células/pocilio) con bacterias vivas y tratadas térmicamente (7x106 cfu/pocillo equivalente) en placas de 48 pocilios durante 36 horas. Los efectos de las bacterias vivas y tratadas térmicamente fueron probados en PBMCs de 8 donantes individuales divididos en dos experimentos separados. Después de 36 horas de incubación, se congelaron las placas de cultivo y se mantuvieron a -20°C hasta la medición de citoquinas. La elaboración de perfiles de citoquinas se realizó en paralelo (es decir, en el mismo experimento en el mismo lote de PBMCs) para bacterias vivas y sus homólogos tratados térmicamente.
Se determinaron los niveles de citoquinas (IFN-?, IL-12p40, TNF-a e IL-10) en sobrenadantes de cultivo celular después de 36 horas de incubación mediante ELISA (R&D DuoSet Human IL-10, BD OptEIA Human IL12p40, BD OptEIA Human TNFcc, BD OptEIA Human IFN-?) siguiendo las instrucciones del fabricante. IFN-?, IL-12p40 y TNF-a son citoquinas pro-inflamatorias, mientras que IL-10 es un mediador antiinflamatorio potente. Los resultados se expresan como medias (pg/ml) +/- SEM de 4 donantes individuales y son representativos de dos experimentos individuales realizados con 4 donantes cada uno. La proporción de IL-12p40 / IL-10 se calcula para cada cepa como un valor predictivo de un efecto antiinflamatorio in vivo (Foligné, B., et al., 2007, World J.Gastroenterol. 13:236-243).
Los valores numéricos de citoquinas (pg/ml) determinados mediante ELISA (véase párrafo anterior) para cada cepa fueron transferidos al software BioNumerics v5.10 (Applied Maths, Sint-Martens-Latem, Bélgica). Se realizó en este conjunto de datos un Análisis de Componentes Principales (PCA, técnica de dimensionamiento). En este análisis se incluyó la resta de los promedios en los caracteres y la división por las variaciones en los caracteres.
Resultados
Perfiles antiinflamatorios generados por tratamientos del tipo Temperatura Ultra Alta (UHT) o Alta Temperatura por Corto Tiempo (HTST)
Las cepas probióticas bajo investigación se sometieron a una serie de tratamientos térmicos (Temperatura Ultra Alta (UHT), Alta Temperatura por Corto Tiempo (HTST) y 85°C durante 20 min.) y sus perfiles inmunológicos se compararon con las de células vivas in vitro. Los microorganismos vivos (probióticos y/o cultivos iniciadores lácteos) indujeron diferentes niveles de producción de citoquinas cuando se incubaron con PBMC humanas (Figuras 1 A, 1 B, 2, 3A, 3B, 4A, 4B y 5). El tratamiento térmico de estos microorganismos modificó los niveles de citoquinas producidas por PBMC de una manera dependiente de la temperatura. Tratamientos de "alta temperatura por corto tiempo" (120°C o 140°C durante 15") generaron bacterias no replicadoras con perfiles inmunológicos antiinflamatorios (Figuras 1 A, 1 B, 2, 3A, 3B, 4A y 4B). De hecho, las cepas sometidas a un tratamiento de tipo UHT (140°C, 15 segundos) indujeron menos citoquinas pro-inflamatorias (TNF-a, IFN-?, IL-12p40), manteniendo o induciendo simultáneamente la producción de IL-10 adicional (en comparación con sus homólogos vivos). Las proporciones IL-12p40 / IL-10 resultantes fueron inferiores para cualquier cepa sometida a tratamiento de tipo UHT en comparación con células vivas (Figuras 1 A, 1 B, 2, 3A, 3B, 4A y 4B). Esta observación también es válida para las bacterias sometidas a tratamientos de tipo HTST, es decir, a 120°C durante 5 segundos (Figuras 1A, 1 B, 2, 3A, 3B, 4A y 4B), O 74°C y 90°C durante 15 segundos (Figura 5). Los tratamientos térmicos (tratamientos de tipo UHT o HTST) tuvieron un efecto similar en perfiles inmunológicos in vitro de cepas probióticas (Figuras 1A, 1 B, 2, 3A, 3B y 5) y cultivos iniciadores lácteos (Figuras 4A y 4B). Un Análisis de Componentes Principales sobre los datos generados con cepas iniciadoras lácteas y probióticas vivas y tratadas térmicamente (140°C, 15") reveló que las cepas vivas se extienden por todo lo largo del eje x, lo que implica que las cepas exhiben perfiles inmunológicos in vitro muy diferentes, desde inductores bajos (lado izquierdo) hasta inductores altos (lado derecho) de citoquinas pro-inflamatorias. Las cepas sometidas a tratamiento térmico se agrupan en el lado izquierdo del gráfico, mostrando que las citoquinas pro-inflamatorias son mucho menos inducidas por cepas sometidas a tratamiento térmico (Figura 6). Por el contrario, las bacterias sometidas a tratamiento térmico a 85°C durante 20 min. indujeron más citoquinas pro-inflamatorias y menos IL-10 que las células vivas, generando proporciones más elevadas de IL-12p40 / IL-10 (Figura
7)·
Los perfiles antiinflamatorios se mejoran o generan mediante tratamientos de tipo UHT y HTST.
Las cepas sometidas a tratamientos UHT y HTST exhiben perfiles antiinflamatorios independientemente de sus respectivos perfiles inmunológicos iniciales (células vivas). Se demostró que las cepas probióticas conocidas por ser antiinflamatorias in vivo y que exhiben perfiles antiinflamatorios in vitro [B. longum NCC 3001 , B. longum NCC 2705, B. breve NCC 2950, B. lactis NCC 2818), presentan perfiles antiinflamatorios in vitro mejorados después de tratamientos " a alta temperatura por corto tiempo". Como se muestra en la Figura 1 , las proporciones IL-12p40 / IL-10 de cepas de Bifidobacterium sometidas a tratamiento de tipo UHT fueron inferiores a aquéllas de los homólogos vivos, mostrando por lo tanto perfiles antiinflamatorios mejorados de muestras sometidas a tratamiento de tipo UHT. Más sorprendentemente, también se comprobó la generación de perfiles antiinflamatorios mediante tratamientos de tipo UHT y HTST para cepas vivas no antiinflamatorias. Tanto L. rhamnosus NCC 4007 como L. paracasei NCC 2461 vivas exhiben proporciones elevadas IL-12p40 / IL-10 in vitro (Figuras 2 y 5). Las dos cepas vivas mostraron ser no protectoras contra la colitis inducida por TNBS en ratones. Las proporciones IL-12p40 / IL-10 inducidas por L. rhamnosus NCC 4007 y L. paracasei NCC 2461 se redujeron drásticamente después de tratamientos de "alta temperatura por corto tiempo" (UHT o HTST), alcanzando niveles tan bajos como los obtenidos con las cepas de Bifidobacterium. Estas proporciones bajas de IL-12p40 / IL-10 se deben a los bajos niveles de producción de IL-12p40 en combinación con la ausencia de cambio (L. rhamnosus NCC 4007) o una inducción drástica de secreción de IL-10 (L paracasei NCC 2461 ) (Figura 2).
En consecuencia:
Se pueden mejorar perfiles antiinflamatorios de microorganismos vivos mediante tratamientos térmicos de tipo UHT y HTST (por ejemplo B. longum NCC 2705, B. longum NCC 3001 , B. breve NCC 2950, B. lactis NCC 2818)
Se pueden generar perfiles antiinflamatorios a partir de microorganismos vivos no antiinflamatorios (por ejemplo L. rhamnosus NCC 4007, L. paracasei NCC 2461 , iniciadores lácteos S. thermophilus NCC 2019) mediante tratamientos térmicos de tipo UHT y HTST.
También se demostraron perfiles antiinflamatorios para cepas aisladas a partir de productos disponibles comercialmente (Figuras 3A y 3B), incluyendo una cepa de E. coli probiótica.
El impacto de los tratamientos de tipo UHT y HTST fue similar para todos los probióticos evaluados e iniciadores lácteos, por ejemplo, lactobacilos, bifidobacterias y estreptococos.
Se aplicaron tratamientos de tipo UHT/HTST a varios lactobacilos, bifidobacterias y estreptococos con diferentes perfiles inmunológicos in vitro. Todas las cepas indujeron menos citoquinas pro-inflamatorias después de los tratamientos de tipo UHT/HTST que sus homólogos vivos (Figuras 1A, 1 B, 2, 3A, 3B, 4A, 4B, 5 y 6), lo que demuestra que el efecto de los tratamientos de tipo UHT/HTST en las propiedades inmunológicas de las bacterias no replicadoras resultantes puede generalizarse a todos los probióticos, en particular, a los lactobacilos y las bifidobacterias y cepas específicas de E. coli y para todos los cultivos iniciadores lácteos, en particular, a los estreptococos, lactococos y los lactobacilos.
Ejemplo 2:
Metodología
Preparaciones bacterianas:
Se utilizaron cinco cepas de probióticos para investigar las propiedades de estimulación inmunológica de los probióticos no replicadores: 3 bifidobacterias (B. longum NCC3001 , B. lactis NCC2818, B. breve NCC2950) y 2 lactobacilos (L paracasei NCC2461 , L rhamnosus NCC4007).
Las células bacterianas se cultivaron en MRS en fermentación discontinua a 37°C durante 16 a 18 horas, sin control de pH. Las células bacterianas se centrifugaron (5.000 x g, 4°C) y se volvieron a suspender en solución salina de tampón fosfato antes de ser diluidas en agua salina con el fin de llegar a una concentración final de alrededor de 10E10 ufc/ml. Se sometieron a tratamiento térmico B. longum NCC3001 , B. lactis NCC2818, L. paracasei NCC2461 y L. rhamnosus NCC4007 a 85°C durante 20 minutos a baño María. Se sometió a tratamiento térmico B. breve NCC2950 a 90°C durante 30 minutos a baño María. Las suspensiones bacterianas tratadas térmicamente se dividieron en alícuotas y se mantuvieron congeladas a -80°C hasta su uso. Las bacterias vivas se almacenaron a -80°C en PBS-glicerol al 15% hasta su uso.
Elaboración de perfiles inmunológicos in vitro de preparaciones bacterianas:
Se evaluaron los perfiles inmunológicos de preparaciones bacterianas vivas y tratadas térmicamente (es decir, la capacidad para inducir secreción de citoquinas específicas de glóbulos humanos in vitro). Se aislaron células mononucleares de sangre periférica humana (PBMCs) a partir de filtros sanguíneos. Después de la separación por gradiente de densidad celular, se recolectaron células mononucleares y se lavaron dos veces con una solución salina equilibrada de Hank. A continuación, se volvieron a
suspender las células en un Medio de Dulbecco Modificado de Iscove (IMDM, Sigma) suplementado con 10% de suero de ternero fetal (Bioconcept, París, Francia), 1% de L-glutamina (Sigma), 1 % de penicilina/estreptomicina (Sigma) y 0,1 % gentamicina (Sigma). Luego se incubaron PBMCs (7x105 células/pocilio) con bacterias vivas y tratadas térmicamente (7x106 cfu/pocillo equivalente) en placas de 48 pocilios durante 36 horas. Los efectos de las bacterias vivas y tratadas térmicamente fueron probados en PBMCs de 8 donantes individuales divididos en dos experimentos separados. Después de 36 horas de incubación, se congelaron las placas de cultivo y se mantuvieron a -20°C hasta la medición de citoquinas. La elaboración de perfiles de citoquinas se realizó en paralelo (es decir, en el mismo experimento en el mismo lote de PBMCs) para bacterias vivas y sus homólogos tratados térmicamente.
Se determinaron los niveles de citoquinas (IFN-?, IL-12p40, TNF- e IL-10) en sobrenadantes de cultivo celular después de 36 horas de incubación mediante ELISA (R&D DuoSet Human IL-10, BD OptEIA Human IL12p40, BD OptEIA Human TNFoc, BD OptEIA Human IFN-?) siguiendo las instrucciones del fabricante. IFN-?, IL-12p40 y TNF-a son citoquinas pro-inflamatorias, mientras que IL-10 es un mediador antiinflamatorio potente. Los resultados se expresan como medias (pg/ml) +/- SEM de 4 donantes individuales y son representativos de dos experimentos individuales realizados con 4 donantes cada uno.
Efecto in vivo de Bifidobacterium breve NCC2950 viva y tratada térmicamente en la prevención de diarrea alérgica:
Se utilizó un modelo de ratón de diarrea alérgica para evaluar el efecto promotor de Th1 de B. breve NCC2950 (Brandt E.B et al. JCI 2003; 1 12(1 1 ): 1666-1667). Después de la sensibilización (2 inyecciones intraperitoneales de ovoalbúmina (OVA) y sulfato de aluminio y potasio en un intervalo de 14 días; días 0 y 14), ratones Balb/c machos fueron provocados oralmente con OVA 6 veces (días 27, 29, 32, 34, 36, 39), lo que resultó en síntomas clínicos transitorios (diarrea) y cambios en los parámetros inmunológicos (concentración plasmática de IgE total, IgE específica de OVA, proteasa 1 de mastocitos de ratón, es decir, MMCP-1 ). Bifidobacterium breve NCC2950 viva o tratada térmicamente a 90°C durante 30 minutos se administró por sonda 4 días antes de la sensibilización con OVA (días -3, -2, -1 , 0 y días 1 1 , 12, 13 y 14) y durante el período de provocación (días 23 a 39). Se utilizó una dosis diaria de bacterias de alrededor de 109 de unidades formadoras de colonias (ufe) o ufe/ratón equivalente.
Resultados
Inducción de la secreción de citoquinas 'pro-inflamatorias' después del tratamiento térmico
Se evaluó in vitro la capacidad de las cepas bacterianas tratadas térmicamente para estimular la secreción de citoquinas por células mononucleares de sangre periférica humana (PBMCs). Los perfiles inmunológicos basados en cuatro citoquinas tras la estimulación de PBMCs por bacterias tratadas térmicamente se compararon a aquéllos inducidos por células bacterianas vivas en el mismo ensayo in vitro.
Las preparaciones tratadas térmicamente se cultivaron y se evaluaron por ausencia de recuentos viables. Las preparaciones bacterianas tratadas térmicamente no produjeron colonias después del cultivo en placas.
Los probióticos vivos indujeron diferentes niveles de producción de citoquinas dependientes de la cepa cuando se incubaron con PBMCs humanas (Figura 8). El tratamiento térmico de los probióticos modificó los niveles de citoquinas producidas por PBMCs en comparación con sus homólogos vivos. Las bacterias tratadas térmicamente
indujeron más citoquinas pro-inflamatorias (TNF-oc, IFN-?, IL-12p40) que sus homólogos vivos. Por el contrario, las bacterias tratadas térmicamente indujeron cantidades similares o inferiores de IL-10 en comparación con las células vivas (Figura 8). Estos datos muestran que las bacterias tratadas térmicamente son más capaces de estimular el sistema inmunológico que sus homólogos vivos y, por lo tanto, son más capaces de estimular defensas inmunológicas debilitadas. En otras palabras, los datos in vitro muestran un efecto de estimulación ¡nmunológica mejorada de cepas bacterianas después del tratamiento térmico.
Con el fin de ilustrar el efecto mejorado de la B. breve NCC2950 tratada térmicamente (en comparación con las células vivas) sobre el sistema inmunológico, se evaluaron bacterias B. breve NCC2950 (cepa A) tanto vivas como tratadas térmicamente en un modelo animal de diarrea alérgica.
En comparación con el grupo de control positivo, la intensidad de la diarrea fue significativa y disminuyó consistentemente después del tratamiento con B. breve NCC2950 tratada térmicamente (41 ,1 % ± 4,8), mientras que la intensidad de la diarrea se redujo en sólo 20 ± 28,3% después del tratamiento con B. breve NCC2950 vivas. Estos resultados demuestran que una B. breve NCC2950 tratada térmicamente exhibe un efecto mejorado de protección contra la diarrea alérgica que su contraparte viva (Figura 9).
En consecuencia, se demostró que la capacidad de los probióticos para mejorar las defensas inmunológicas se mejoró después del tratamiento térmico.
Ejemplos adicionales:
Se puede preparar la siguiente composición de yogur de consistencia espesa para ser almacenada a temperaturas de refrigeración (4°C a 8°C) usando técnicas estándar:
Claims (13)
1. Composición de yogur de consistencia espesa, caracterizada porque comprende microorganismos probióticos no replicadores.
2. Composición de yogur de consistencia espesa de acuerdo con la reivindicación 1 , caracterizada porque comprende microorganismos probióticos no replicadores en una cantidad correspondiente a 106 a 1012 ufe por porción.
3. Composición de yogur de consistencia espesa de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la composición se almacenará a temperatura ambiente o de refrigeración.
4. Composición de yogur de consistencia espesa de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque también comprende prebióticos, por ejemplo, oligofructosa e inulina.
5. Composición de yogur de consistencia espesa de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque los microorganismos probióticos se convirtieron en no replicadores mediante un tratamiento térmico, de preferencia mediante un tratamiento de alta temperatura a por lo menos 71 ,5°C durante por lo menos 1 segundo.
6. Composición de yogur de consistencia espesa de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizada porque el tratamiento térmico es un tratamiento de alta temperatura de 71 ,5-150°C durante cerca de 1-120 segundos, y de preferencia es un tratamiento de alta temperatura/corto tiempo (HTST) o un tratamiento de temperatura ultra alta (UHT).
7. Composición de yogur de consistencia espesa de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizada porque se usa en la prevención o el tratamiento de trastornos inflamatorios.
8. Composición de yogur de consistencia espesa de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizada porque el tratamiento térmico se lleva a cabo en el rango de temperatura de 70-150°C durante cerca de 3 minutos a 2 horas, de preferencia en el rango de 80-140°C entre 5 minutos y 40 minutos.
9. Composición de yogur de consistencia espesa de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizada porque se usa en la prevención o el tratamiento de trastornos relacionados con una defensa inmunológica en riesgo.
10. Composición de yogur de consistencia espesa de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque por lo menos 90%, de preferencia por lo menos 95%, de mayor preferencia por lo menos 98%, de preferencia incluso mayor por lo menos 99%, idealmente por lo menos 99,9%, y más idealmente todos los probióticos son no replicadores.
1 1. Composición de yogur de consistencia espesa de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque los microorganismos probióticos se seleccionan a partir del grupo compuesto por bifidobacterias, lactobacilos, propionibacterias, o combinaciones de los mismos, por ejemplo Bifidobacteríum longum, Bifidobacterium lactis, Bifidobacteríum animalis, Bifidobacteríum breve, Bifidobacteríum infantis, Bifidobacteríum adolescentis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum, Lactococcus lactis, Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis, Lactococcus diacetylactis, Lactococcus cremoris, Lactobacillus bulgarícus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii, Escherichia coliy/o mezclas de los mismos.
12. Composición de yogur de consistencia espesa de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque los microorganismos probióticos se seleccionan a partir del grupo compuesto por Bifidobacterium longum NCC 3001 , Bifidobacterium longum NCC 2705, Bifidobacterium breve NCC 2950, Bifidobacterium lactis NCC 2818, Lactobacillus johnsonii La1 , Lactobacillus paracasei NCC 2461 , Lactobacillus rhamnosus NCC 4007, Lactobacillus reuteri DSM 17983, Lactobacillus reuteri ATCC55730, Streptococcus thermophilus NCC 2019, Streptococcus thermophilus NCC 2059, Lactobacillus casei NCC 4006, Lactobacillus acidophilus NCC 3009, Lactobacillus casei ACA-DC 6002 (NCC 1825), Escherichia co// Nissle, Lactobacillus bulgaricus NCC 15, Lactococcus lactis NCC 2287, o combinaciones de los mismos.
13. Composición de yogur de consistencia espesa de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque contiene alrededor de 0,005 mg a 000 mg de microorganismos no replicadores por dosis diaria.
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