MX2012011751A - Proteinas multimericas recombinantes de la influenza. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a composiciones inmunogénicas que comprenden proteínas recombinantes multiméricas de influenza o partes de las mismas fusionadas a una etiqueta de afinidad de estreptavidina, preferiblemente hemaglutinina recombinante trimérica del virus de influenza y/o neuraminidasa recombinante tetramérica del virus de influenza, o vectores que comprenden secuencias de ácidos nucleicos que codifican tales proteínas de influenza. Las invenciones se refieren además a métodos para la preparación de tales composiciones inmunogénicas y usos de los mismos y métodos para provocar una respuesta inmune en un individuo.

Description

PROTEÍNAS MULTIMÉRICAS RECOMBI ANTES DE LA INFLUENZA Descripción de la Invención La invención se refiere al campo de la virología, más específicamente la invención se relaciona al campo de vacunas del virus de la influenza.

La influenza es una enfermedad infecciosa que es causada por tres tipos de virus de la influenza, tipos A, B y C, que pertenecen a la familia de Orthomyxoviridae. Los virus de la influenza son virus del ARN que consisten de siete segmentos negativos de ARN monocatenario que codifican nueve proteínas (influenza C), u ocho segmentos negativos de ARN monocatenario que codifican once proteínas (influenza A y B) (Chen y Deng, 2009). Las aves son probablemente el anfitrión natural para todos los virus de la influenza A, pero muchos subtipos pueden también infectar mamíferos, incluyendo humanos. Los síntomas de la influenza incluyen fiebre, dolor de cabeza, escalofríos, dolores musculares y garganta irritada, síntomas comparables con el resfriado común. Sin embargo, la influenza puede llevar a complicaciones potencialmente mortales, tal como neumonía y la muerte en grupos de alto riesgo como niños pequeños, ancianos e individuos inmunodeprimidos o crónicamente enfermos inmunes. En el pasado, las pandemias de la influenza, tal como la pandemia de gripe española 1918/1919 (subtipo H1N1) y la gripe de Hong Kong 1968/1969 (subtipo H3N2), han sido responsables de la muerte de millones de personas (Khanna et al., 2008).

La hemaglutinina (HA, por sus siglas en inglés) y la neuraminidasa (NA, por sus siglas en inglés) de proteínas superficiales del virus de la influenza son la base para subtipos de la influenza serológicamente diferentes. Actualmente se han identificado los 16 serotipos HA (H1-H16) y 9 NA (N1-N9), los cuales se utilizan para clasificar virus de la influenza (por ejemplo H3N2). La deriva antigénica, debido a una o más mutaciones que causan sustituciones del aminoácido, puede causar cambios antigénicos menores en HA y NA, dando por resultado la pérdida de inmunidad de un anfitrión. Adicionalmente, un proceso llamado cambio antigénico da como resultado la formación de nuevos subtipos del virus (reordenante) a través de la combinación de HA y NA de diferentes subtipos del virus de la influenza. Estas alteraciones en HA y/o NA pueden en parte ser un resultado de la presión de selección (Chen y Deng, 2009).

La HA está presente en la membrana viral. Debe dividirse mediante proteasas hospedadoras para producir dos polipéptidos, HA1 y HA2, con el fin de ser infecciosos. Después de la división, el N-terminal recientemente expuesto del polipéptido HA2 entonces actúa para mediar la fusión del viral con la membrana de la célula hospedadora, la cual permite que el virus inicie la infección de la célula hospedadora (Skehel y Wiley, 2000). La HA es un homotrímero compuesto por tres regiones estructuralmente distintas, una cabeza globular que consiste de láminas beta antiparalelas que contienen el sitio de unión al receptor y el sitio de división de HA1/HA2, una cepa tricatenaria de doble espiral, alfa helicoidal, y un sedimento globular que consiste en láminas beta antiparalelas. En la figura 1 se muestra una representación esquemática de un virus de la influenza. Cada monómero consiste en un polipéptido HA con las regiones HA1 y HA2 unidas por los enlaces de disulfuro (Skehel y Wiley, 2000; Stevens et al., 2006).

La NA cataliza la hidrólisis de residuos del ácido siálico terminal de glicoproteínas de la célula hospedadora, de tal modo previniendo la unión de HA a estas proteínas. NA facilita así la liberación del virus desde una célula y, por lo tanto, el esparcimiento del virus. La NA es un homotetrámero, anclado a la membrana viral por su N-terminal. En la figura 1 se muestra una representación esquemática de un virus de la influenza. Cada monómero se compone de seis láminas beta topológicamente idénticas arregladas en una formación de hélice, que forma la parte superior de la proteína tetramérica que se une a una región troncal. La actividad enzimática se localiza en cada monómero (Colman 1994).

Las infecciones del virus de la influenza son más frecuentes en invierno y las vacunas contra la influenza estacional se desarrollan cada año. Estas vacunas contienen dos virus de la influenza A (H1N1 y H3N2) y un virus de la influenza B (Khanna et al., 2008). Las nuevas composiciones necesitan desarrollarse cada año para proteger contra las cepas circulantes previstas. Aunque pueden tener alta homología, una vacuna específica puede no proteger contra diferentes cepas del mismo subtipo de la influenza A. Además de las vacunas contra la influenza humana estacional, existen varias vacunas contra la influenza para el tratamiento de animales, como vacunas contra infección de la influenza H5N1 y H9N2 aviar en aves de corral e infección de la influenza H1N1 y H3N2 en cerdos. Las vacunas contra influenza actualmente disponibles son virus de la influenza atenuados o inactivados vivos los cuales son producidos generalmente haciendo crecer el virus en huevos embrionarios de pollo. Varias desventajas de este método de producción existen incluyendo a menudo instalaciones de biocontención de alto nivel requeridas para manejar virus de la influenza, la inhabilidad para obtener altos rendimientos del virus de la influenza en huevos embrionarios de pollo, la alta especificidad para un número muy limitado de subtipos de la influenza A, y la inhabilidad para usar vacunas en individuos (principalmente niños) con alergias al huevo (Lipatov et al., 2004).

Se han hecho un número de intentos para desarrollar vacunas basadas en proteínas recombinantes derivadas de HA o NA. Sin embargo todas estas vacunas tienen limitaciones con respecto a la eficiencia y eficacia del tratamiento. Wei et al. (J Virol. 2008) describe la vacunación de ratones con proteínas de HA recombinantes H5N1. Los plásmidos para la expresión de las proteínas de HA recombinantes H5N1 contienen secuencias del ácido nucleico que codifican un dominio de trimerización y una etiqueta His, las cuales se retiran después de la purificación de las proteínas. Para ser efectivo, los ratones se han inmunizado más de una vez (semanas 0 y 3) con las cantidades relativamente altas (20 g) de proteína. En Song et al. (PLoS One. 2008) y el documento WO 2007/103322, se describe la inmunización de ratones con dos dosis de una composición que comprende la cabeza globular de HA fusionada a la flagelina del ligando TLR5. Adicionalmente, en Song et al. (PLoS One. 2008) los conejos se inmunizaron con dos dosis de 5 o 15 g de HA fusionados a la flagelina. En Saelens et al. (Eur J Biochem. 1999) tres dosis se usaron de una composición que comprende HA recombinante expresado en P. pastoris y el coadyuvante de Ribi, una emulsión de aceite en agua, para inmunizar a los ratones, y el documento WO 95/18861 describe el uso de tres dosis de una composición que comprende la neuraminidasa para inmunizar a los ratones. Kong et al. (Proc Nati Acad Sci USA. 2006) necesitan tres dosis para inmunizar a los ratones con el ADN de plásmido que expresa una hemaglutinina del virus de la influenza, como también se describe en los documentos WO 2007/100584, WO 2008/112017 y WO 2009/092038.

Es un objeto de la presente invención proporcionar composiciones inmunogenéticas mejoradas para producir una inmunorespuesta protectora contra un virus de la influenza. La invención, por lo tanto, proporciona una composición inmunogenética que comprende por lo menos un ectodominio recombinante multimérico de una proteína del virus de la influenza o una parte del mismo fusionado a una etiqueta de afinidad por estreptavidina, y un diluyente farmacéuticamente aceptable.

Una "composición inmunogenética" en la presente se define como una composición que es capaz de producir una inmunorespuesta cuando se administra a un individuo. La inmunorespuesta producida puede ser humoral, celular o una combinación de la misma, e incluye, pero sin limitarse a, la producción de anticuerpos, células B y células T. Una inmunorespuesta, como se utiliza en la presente, se dirige preferiblemente de una manera específica a uno o más inmunógenos de una composición de acuerdo con la invención.

Una composición inmunogenética de la presente invención puede administrarse a un individuo mediante cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, la inyección intramuscular (IM, por sus siglas en inglés), intradérmica (ID, por sus siglas en inglés), subcutánea (SC, por sus siglas en inglés), intracraneal (IC, por sus siglas en inglés), intraperitoneal (IP, por sus siglas en inglés), o intravenosa (IV, por sus siglas en inglés), administración transdérmica, oral, intranasal, o rectal, y combinaciones de las mismas. Además, la administración de una composición inmunogenética de acuerdo con la invención puede realizarse individualmente, tal como a través de la inyección o la administración oral o nasal, o colectivamente, tal como complementando agua potable o rociando sobre animales o en el aire sobre animales, por ejemplo, animales de campo. En una modalidad preferida, una composición inmunogenética, de acuerdo con la invención, se utiliza para producir una inmunorespuesta. Se prefiere que la composición inmunogenética se utilice como una vacuna.

Un "individuo" en la presente se define como un humano o animal, preferiblemente un animal que pueda ser infectado por el virus de la influenza, como las aves, incluyendo, pero sin limitarse a, aves de corral. Los individuos incluyen, pero sin limitarse a, pollos, patos, gansos, pavos, cisnes, emúes, gallina de Guinea y faisanes, humanos, cerdos, hurones, focas, conejos, gatos, perros y caballos. En una modalidad preferida de la invención, un individuo es un mamífero, como un humano, un cerdo o un caballo, o un ave. En una modalidad de la invención el mamífero es un humano.

Un "ectodominio multimérico" en la presente se define como una parte extracelular de una proteína superficial cuya proteína superficial se compone de por lo menos dos subunidades (no unidas covalentemente). Dicha proteína superficial puede ser cualquier proteína superficial de un virus de la influenza. Utilizando un ectodominio multimérico de una proteína superficial del virus de la influenza o parte del mismo, la estructura secundaria, terciaria y cuaternaria correcta de la proteína superficial del virus de la influenza es obtenida y/o preservada. Una "proteína de la influenza" en la presente se define como cualquier proteína codificada por el genoma viral de la influenza.

"Un diluyente farmacéuticamente aceptable" como se utiliza en la presente se define como cualquier solución, sustancia o combinación de las mismas que no tiene actividad biológica o de otra manera indeseada, se entiende que puede administrarse a un individuo junto con otros componentes de una composición inmunológica sin causar una reacción sustancialmente adversa.

A través de la aplicación un ectodominio recombinante multimérico de una proteína de la influenza o parte del misma, fusionada a una etiqueta de afinidad por estreptavidina es también además referido como un ectodominio recombinante multimérico o parte del mismo, de acuerdo con la invención.

Como se utiliza en la presente un "virus de la influenza" comprende virus de la influenza tipo A, virus de la influenza tipo B y virus de la influenza tipo C y todos los subtipos del virus de la influenza. "Influenza tipo", como se utiliza en la presente, se refiere a influenza tipo A, tipo B o tipo C. "Cepa de la influenza", como se utiliza en la presente, se refiere a diferentes virus de la influenza A, por ejemplo, H1N1, H1N2, H1N7, H2N2, H3N2, H3N8, H4N8, H5N1, H5N2, H5N9, H6N2, H6N5, H7N2, H7N3, H7N7, H8N4, H9N2, H10N7, H11N6, H12N5, H13N6. "Hemaglutinina" o "HA", como se utiliza en la presente, se refiere a una proteína de hemagiutinina del virus de la influenza y puede ser de cualquier influenza tipo, A, B o C, y cualquier serotipo, por ejemplo, H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 o H16, incluyendo los subtipos que pertenecen a los mismos serotipos pero con pequeña diferencia como resultado de, por ejemplo, deriva antigénica. La "neuraminidasa" o "NA", como se utiliza en la presente, se refiere a una proteína de neuraminidasa del virus de la influenza y puede ser de cualquier tipo de la influenza, A, B o C, y cualquiera de los serotipos, por ejemplo, NL, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 o N9, incluyendo los subtipos que pertenecen al mismo serotipo pero con pequeña diferencia como resultado, por ejemplo, deriva antigénica. "Parte del mismo", como se utiliza en la presente, se define como cualquier parte de un ectodominio recombinante multimérico de una proteína del virus de la influenza la cual es más pequeña que un ectodominio multimérico entero de una proteína del virus de la influenza, pero tiene una actividad inmunogenética similar.

Por ejemplo, una parte de una HA multimérica recombinante de acuerdo con la invención comprende una HA2, o una parte de una HA2 que comprende un epítopo altamente conservado próximo a la subunidad HA1 de HA (Ekiert et al., 2009), o un ectodominio de HA que carece del dominio principal globular. Preferiblemente, el epítopo de una HA2, parte de un ectodominio de HA2 o HA, carece del dominio principal globular que comprende 1-68 aminoácidos de HA fusionados a 293-524 aminoácidos de HA (numeración del aminoácido de acuerdo con la numeración de HA de la cepa de la influenza X31, Regristro EMBL-EBI No. P03438). Debido a que el epítopo de HA se conserva altamente en diferentes tipos del virus de la influenza, subtipos y cepas, la amplia protección contra diferentes tipos del virus de la influenza, se proporcionan los subtipos o cepas, si dicha parte se utiliza en una composición inmunogenética de acuerdo con la invención.

En una modalidad preferida se proporciona un uso de la composición inmunogenética de acuerdo con la invención para la preparación de un agente profiláctico, para producir una inmunorespuesta contra un virus de la influenza. También se proporciona una composición inmunogenética de acuerdo con la invención para uso como una vacuna.

Una "etiqueta de afinidad por estreptavidina" o "etiqueta Strep" en la presente se define como una etiqueta que une a la estreptavidina o un derivado de la misma, tal como Tactina Strep, que comprende por lo menos un péptido que consiste de nueve aminoácidos: Ala-Trp-Arg-His-Pro-GIn-Phe-Gly-Gly , o por lo menos un péptido que consiste de ocho aminoácidos (también llamado etiqueta Strep II): Trp-Ser-His-Pro-GIn-Phe-Glu-Lys, donde Trp es triptófano, Ser es serina, His es histidina, Pro es prolina, Gln es glutamina, Phe es fenilalanina, Glu es glutamina, Lys es lisina, Ala es alanina, Arg es arginina y Gly es glicina. En una modalidad preferida una etiqueta de afinidad por estreptavidina comprende dos más de los péptidos, cada uno consiste de ocho o nueve aminoácidos, más preferiblemente tres de los péptidos. En una modalidad una etiqueta de afinidad por estreptavidina comprende más de tres de dichos péptidos. Una etiqueta Strep, por ejemplo, se utiliza para propósitos de aislamiento y/o purificación. La etiqueta une a la estreptavidina o a un derivado de la misma, por ejemplo, inmovilizado en una columna. La elución de una proteína fusionada a una etiqueta Strep de la columna puede realizarse utilizando la biotina o un derivado u homólogo de la misma, tal como la destio-biotina. La etiqueta de afinidad por estreptavidina puede colocarse en la C-terminal o N-terminal de la proteína de interés. Un "derivado", como se utiliza en la presente, se define como cualquier variante de estreptavidina que tiene la capacidad de enlazarse mediante una etiqueta de afinidad por estreptavidina, y puede así utilizarse para aislar o purificar una proteína que contiene una etiqueta de afinidad por estreptavidina. Un derivado preferido de estreptavidina es Strep-tactin.

La elución de las proteínas recombinantes enlazadas puede realizarse bajo condiciones moderadas mediante competición con biotina o un derivado adecuado. Con condiciones moderadas se entiende que la purificación puede realizarse bajo condiciones fisiológicas, como soluciones acuosas, temperatura ambiente, pH neutral o ligeramente básico, y presión normal.

En una modalidad preferida de la invención, un ectodominio recombinante multimérico de una proteína de la influenza o parte del mismo se selecciona del grupo, que consiste de un ectodominio de hemaglutinina trimérica de la influenza recombinante o parte del mismo, y un ectodominio de neuraminidasa tetramérica de la influenza recombinante o parte del mismo.

En algunas modalidades una secuencia de aminoácidos de un ectodominio recombinante multimérico o una parte del mismo, de acuerdo con la invención, es alterada tal como por sustituciones, eliminaciones y/o adiciones del aminoácido que proporcionan las proteínas funcionalmente equivalentes a un ectodominio recombinante multimérico o parte del mismo, de acuerdo con la invención. Las proteínas funcionalmente equivalentes pueden identificarse por cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, por su capacidad para inducir una inmunorespuesta contra el virus de la influenza en un individuo, o en un análisis in vitro donde la unión a anticuerpos es determinada. Se proporciona un ectodominio recombinante multimérico alterado en una composición inmunogenética de acuerdo con la invención, por ejemplo, debido a que puede producirse en un de alto nivel, comparado con un ectodominio multimérico madre no alterado.

Los ectodominios multiméricos recombinantes o partes de los mismos, de acuerdo con la invención, son preferidos sobre los ectodominios monoméricos o partes de los mismos de proteínas del virus de la influenza, debido a que tales ectodominios multiméricos darán lugar a una obtención más efectiva de una inmunorespuesta. Por lo tanto, una baja dosificación y un número reducido de administraciones de una composición inmunogenética que comprende tal ectodominio recombinante multimérico de acuerdo con la invención son necesarios para producir una inmunorespuesta suficiente, comparada con las composiciones inmunogenéticas que comprenden un ectodominio monomérico de una proteína del virus de la influenza.

Una composición inmunogenética, de acuerdo con la invención, puede comprender un ectodominio de hemaglutinina de la influenza recombinante trimérico o parte del mismo, o un ectodominio de neuraminidasa recombinante tetramérico de la influenza o parte del mismo. Tal composición inmunogenética es particularmente adecuada para producir una inmunorespuesta en un individuo contra un subtipo o cepa del virus de la influenza, o más de uno de los subtipos o cepas relacionadas de un virus de la influenza. En algunas modalidades, sin embargo, una composición inmunogenética de acuerdo con la invención comprende una combinación de uno o más ectodominios de hemaglutinina trimérica o partes de los mismos, y/o uno o más ectodominios de neuraminidasa tetramérica o partes de los mismos.

Así, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 ectodominios de hemaglutinina trimérica o partes de los mismos pueden combinarse, como H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 y/o H16, o 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 ectodominios de neuraminidasa tetramérica o partes de los mismos pueden combinarse, como N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 y/o N9. Adicionalmente, una composición inmunogenética, de acuerdo con la invención, puede comprender una combinación de uno o más ectodominios de hemaglutinina trimérica o partes de los mismos y uno o más ectodominios de neuraminidasa tetramérica o partes de los mismos de diferentes subtipos de la influenza. Por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 ectodominios de hemaglutinina trimérica o porciones de los mismos, y 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 ectodominios de neuraminidasa tetramérica o partes de los mismos, pueden combinarse, como H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 y/o N9. Estará claro para un experto que el término "uno o más ectodominios" comprende uno o más ectodominios de uno o más subtipos del virus de la influenza, tal como, por ejemplo, el virus de la influenza A y virus de la influenza B. Así, una composición inmunogenética, de acuerdo con la invención, puede ser una composición multivalente con la cual una protección mejorada contra una infección del virus de la influenza puede lograrse con respecto a una composición inmunogenética que comprende un ectodominio de hemaglutinina de la influenza recombinante trimérica o una porción del mismo, o un ectodominio de neuraminidasa de la influenza recombinante tetramérica o una porción del mismo. Adicional, o alternativamente, con gna composición multivalente puede lograrse una protección más amplia contra más de un tipo del virus de la influenza, o subtipos o cepas del virus de la influenza. Además, una composición inmunogenética, de acuerdo con la invención, puede ser menos sensible a alteraciones antigénicas que las vacunas del virus de la influenza atenuadas tradicionales o atenuadas vivas.

Otras ventajas de composiciones inmunogenéticas, de acuerdo a la presente invención, son, por ejemplo, la posibilidad de producir los ectodominios multiméricos recombinantes o partes de los mismos en grandes cantidades en cultivo celular, y a costos relativamente bajos, puesto que ninguna instalación de biocontención de alto nivel es necesaria para la producción de composiciones inmunogenéticas, de acuerdo con la invención.

En contraste con tentativas anteriores para producir vacunas basadas en proteínas del virus de la influenza recombinante, solamente cantidades muy bajas de un ectodominio recombinante multimérico, o parte del mismo de una proteína del virus de la influenza, o parte de la misma fusionado a una etiqueta de afinidad por estreptavidina, de acuerdo con la invención, son necesarias para producir una inmunorespuesta en un individuo. Como se muestra más detalladamente en los ejemplos, cantidades tan bajas como 3.75 pg de proteína recombinante en hurones, 5 \¿g de proteína recombinante en cerdos y 0.4 pg de proteína recombinante en pollos, son suficientes para producir una inmunorespuesta protectora en estos animales respectivos a partir del desafío con el virus de la influenza.

Las composiciones inmunogenéticas, de acuerdo con la invención, pueden administrarse en una dosis simple o en dosis múltiples. Sin embargo, en comparación con otras vacunas basadas en proteínas recombinantes de la influenza, la protección contra una infección por virus de la influenza se alcanza después de una administración de una composición inmunogenética , de acuerdo con la invención. Así, las composiciones inmunogenéticas, de acuerdo a la presente invención, son más efectivas que otras composiciones inmunogenéticas basadas en proteínas recombinantes de la influenza conocidas en la técnica.

Una etiqueta Strep no es probable para afectar la función de la proteína, estructura, doblado, secreción, y tiene una baja inmunogenicidad. Además, la elución de una etiqueta Strep que contiene la proteína se consigue bajo condiciones moderadas. Sin limitarse por la teoría, se cree que una combinación de por lo menos un ectodominio recombinante multimérico, de acuerdo con la invención, y el uso de una etiqueta de afinidad por estreptavidina, resulta en las ventajas de la presente invención sobre la composición inmunogenética que comprende proteínas de la influenza conocidas en la técnica, posiblemente debido a las condiciones moderadas que pueden emplearse durante las purificaciones de proteínas y, por lo tanto, la buena conservación de la antigenicidad de las proteínas y la obtención más efectiva de una inmunorespuesta.

En algunas modalidades de la invención, un dominio de trimerización se utiliza para proporcionar un ectodominio de hemaglutinina de la influenza recombinante trimérica o para parte del mismo. El término "dominio de trimerización", como se utiliza en la presente, se define como dominio que media la formación de un trímero fuera de tres proteínas monoméricas o partes de las mismas. Los dominios de trimerización adecuados incluyen, pero sin limitarse a, una secuencia de trimerización de fibritina del bacteriófago T4 y un dominio de trimerización artificial (GCN4-pll) basado en la protefna de doble espiral GCN4 de levadura. En una modalidad preferida, la trimerización de un ectodominio de hemaglutinina de la influenza recombinante o parte del mismo, es proporcionada por un dominio de trimerización basado en GNC4. El dominio de trimerización basado en GCN4 comprende preferiblemente la secuencia de aminoácidos MKQIEDKIEEIESKQKKIENEIARIKK.

En algunas modalidades de la invención, un dominio de tetramerización se utiliza para proporcionar un ectodominio recombinante tetramérico de neuraminidasa de la influenza o parte del mismo. El término "dominio de tetramerización", como se utiliza en la presente, se define como un dominio que media la formación de un tetrámero fuera de cuatro proteínas o partes monoméricas del mismo. Los dominios de tetramerización adecuados incluyen, pero no se limitan a, el dominio de tetramerización de la fosfoproteína del virus de Sendai y un dominio de tetramerización (GCN4-pLI), derivado mediante la mutación del dominio de dimerización de levadura GCN4. En una modalidad preferida, la tetramerización de un ectodominio de neuraminidasa recombinante de la influenza o parte del mismo, es proporcionada por un dominio de tetramerización basado en GCN4. Un dominio de tetramerización pasado en GCN4 comprende preferiblemente la secuencia de aminoácidos MKQIEDKLEEILSKLYHIENELARIKKLLGE.

En algunas modalidades, una composición inmunogenética, de acuerdo con la invención, comprende un adyuvante y/o un portador u otro excipiente conocidos en la técnica. "Un adyuvante" se define en la presente como una sustancia agregada a una composición inmunológica para mejorar la inmunorespuesta de un individuo a un antígeno particular, en cualquier célula del nivel humoral. Los adyuvantes adecuados incluyen, pero no se limitan a, sales de aluminio y calcio, como fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio, sulfato de aluminio y potasio (alumbre) y fosfato de calcio; adyuvantes orgánicos tal como el escualeno; adyuvantes basados en aceite, como el adyuvante de Freund completo e incompleto, RIBI Adjuvant System® Stimune (Specol)®, TiterMax®, Montanides, MF-59, AS03, QS21, adyuvante 65, saponina, MDP, y formulación adyuvante Syntex (SAF, por sus siglas en inglés)®, lípido de monofosforilo A, adyuvante de Gerbu® y complejos inmunoestimglantes (ISCOM, por sus siglas en inglés); citocinas tal como Interferón-gamma; secuencias del ácido nucleico inmunoestimulantes como oligonucleótidos de CpG, liposomas y partículas tipo virus; tensioactivos tal como hexadecilamina; y polianiones como piran y sulfato de dextrano. Un adyuvante preferido es Stimune (Specol). Los adyuvantes preferidos adicionales para uso en humanos son fosfato o hidróxido de aluminio, fosfato de calcio, ISCOM, AS03 o MF59.

Un adyuvante preferido son los ISCOM. La tecnología de ISCOM tiene varias ventajas sobre otros adyuvantes. Los ISCOM estimulan inmunorespuestas humorales y mediadas por células. Los ISCOM son un adyuvante altamente eficiente, permitiendo la reducción adicional de las cantidades de un ectodominio recombinante multimérico o parte del mismo, de acuerdo con la invención. Uno de los ISCOM preferidos es Matrix-M de ISCOM. Sin limitarse a la teoría es posible que el uso de ISCOM en un método o composición inmunogenética, de acuerdo a la presente invención, pueda incluso mejorar las ventajas de la presente invención sobre la composición inmunogenética que comprende proteínas de la influenza conocidas en la técnica, como una dosificación más baja y un número reducido de administraciones de una composición inmunogenética de acuerdo con la invención.

Como se utiliza en la presente, "un portador" o "una base" se define como una molécula, tal como un péptido, un polipéptido, una proteína, un complejo de proteína o un compuesto químico que puede asociarse con cualquier componente de composiciones inmunogenéticas, como se define en la presente para el propósito de transporte de dicho componente, presentación al sistema inmunológico, y/o para mejorar la inmunogenicidad de la composición inmunogenética. Los portadores o bases adecuados incluyen, pero no se limitan a, una base biológica tal como un virus, una bacteria, una partícula similar al virus y un remanente bacteriano, tal como una estructura de pared bacteriana, una base química, tal como un arreglo de unidades de estreptavidina unidas químicamente o derivados del mismo, un enlace multivalente bioquímico, una difteria o un toxoide de tétanos, hemocianina de lapa californiana (KLH, por sus siglas en inglés), albúmina de suero (tal como BSA), hemocianina, albúmina, toxina de difteria muíante no tóxica CRM197, complejo de proteína de membrana externa (OMPC, por sus siglas en inglés) a partir de Neisseria meningitidis, la subunidad B de Escherichia Coli inestable al calor, una partícula similar a un virus acoplada desde la proteína de recubrimiento recombinante de bacteriófago Qb y gránulos de celulosa.

La presente invención además proporciona un vector que comprende un módulo de expresión, que comprende una secuencia del ácido nucleico que codifica una secuencia de señal, una secuencia del ácido nucleico que codifica un ectodominio recombinante de una proteína de la influenza o parte del mismo, una secuencia del ácido nucleico que codifica una secuencia de trimerización o tetramerización, y una secuencia del ácido nucleico que codifica una etiqueta de afinidad por estreptavidina.

Un vector, de acuerdo con la invención, es adecuado particularmente para la expresión y producción de un ectodominio recombinante multimérico o parte del mismo, de acuerdo con la invención. Por lo tanto, en una modalidad preferida, se proporciona un uso de un vector de acuerdo con la invención para la preparación de una composición inmunogenética, de acuerdo con la invención para producir una inmunorespuesta contra un virus de la influenza. También se proporciona un vector de acuerdo con la invención para uso como una vacuna.

El término "vector", como se utiliza en la presente, se define como una molécula del ácido nucleico, tal como un plásmido, un bacteriófago o un virus animal, capaz de introducir una secuencia heteróloga del ácido nucleico en una célula hospedadora. Un vector, de acuerdo con la invención, permite la expresión o la producción de una proteína o parte del mismo, codificada por la secuencia heteróloga del ácido nucleico en una célula hospedadora. Los vectores adecuados en un método de acuerdo con la invención incluyen, pero no se limitan a, pCD5 (Pouyani y Seed, 1995) y pCAGGS (Niwa et al., 1991). Una "célula hospedadora" es una célula que se ha transformado, o es capaz de la transformación, mediante una molécula del ácido nucleico, tal como un vector. El término "transformación" en la presente se define como la introducción de un ácido nucleico extranjero en una célula receptora. La transformación de una célula receptora puede dar lugar a la expresión transitoria de una proteína recombinante mediante la célula, se entiende que la proteína recombinante está expresada solamente por un periodo de tiempo definido. Alternativamente, la transformación de una célula receptora puede dar lugar a la expresión estable, se entiende que el ácido nucleico es introducido en el genoma de la célula y así pasa en las siguientes generaciones de las células. Adicionalmente, puede lograrse la expresión inducible de una proteína recombinante. Un sistema de expresión inducible requiere la presencia o ausencia de una molécula que permita la expresión de una secuencia del ácido nucleico de interés. Los ejemplos de sistemas de expresión inducibles incluyen, pero no se limitan a, sistemas de expresión Tet-On y Tet-Off, sistema de expresión de gen inducible por hormona tal como, por ejemplo, un sistema de expresión de gen inducible por ecdisona, un sistema de expresión de gen inducible por arabinosa y un sistema de expresión inducible por Drosofila, utilizando un vector pMT/BiP (Invitrogen), el cual comprende un promotor de metalotioneína inducible.

Una "secuencia de señal" en la presente se define como un péptido de señal que dirige el transporte de una proteína, o parte de la misma, al retículo endoplásmico de una célula eucariótica -el sitio de entrada de la trayectoria secretora. Una secuencia de señal se puede localizar en la N-terminal o C-terminal de la proteína o parte de ella. Los péptidos de señal pueden dividirse después de la inserción de la proteína en el retículo endoplásmico. Por ejemplo, en una modalidad, un vector pMT/BiP para la expresión de la proteína recombinante en células de Drosofila comprende una secuencia de señal de BiP. En otra modalidad, un vector pCD5 para la expresión de la proteína recombinante en células mamíferas comprende la secuencia de señal MP GSLQPLATLYLLG LVA.

Un módulo de expresión comprende, preferiblemente, un promotor/mejorador que permite la iniciación de la transcripción de las secuencias del ácido nucleico contenidas además dentro del módulo de expresión. Los ejemplos de promotores incluyen, pero no se limitan a, promotores de RAmy3D y CaMV para la expresión en células de plantas, polihedrina, p10, IE-0, PCNA, OplE2, OplE1, y promotores de actinia 5c para la expresión en células de insectos, y un promotor beta-actinia, un promotor de inmunoglobina, un promotor 5S ARN, o promotores derivados de virus, tal como citomegalovirus (CMV, por sus siglas en inglés), virus del sarcoma de Rous (RSV, por sus siglas en inglés), y promotores del virus de Simios 40 (SV40, por sus siglas en inglés) para la expresión en células mamíferas. Un vector preferido es proporcionado por el vector de expresión pCD5 para la expresión de la proteína recombinante en células mamíferas que comprenden a un promotor CMV. Un vector preferido adicional es proporcionado por un vector de expresión pCAGGS para la expresión de la proteína recombinante en células mamíferas que comprenden un promotor mejorador de CMV/beta-actinia de pollo (CAG, por sus siglas en inglés).

Un módulo de expresión, de acuerdo con la invención, que se desea para la expresión de un ectodominio de hemaglutinina trimérica de la influenza o una parte del mismo, preferiblemente comprende de 5' a 3': una secuencia del ácido nucleico que codifica una secuencia de señal; una secuencia del ácido nucleico que codifica un ectodominio recombinante de hemaglutinina de la influenza o parte del mismo; una secuencia del ácido nucleico que codifica una secuencia de trimerización , preferiblemente una secuencia de trimerización basada en GCN4, y una secuencia del ácido nucleico que codifica una etiqueta de afinidad por estreptavidina. Un vector de acuerdo con la invención que se desea para la expresión de un ectodominio de neuraminidasa tetramérica de la influenza o parte del mismo preferiblemente comprende de 5' a 3': una secuencia del ácido nucleico que codifica una secuencia de señal; una secuencia del ácido nucleico que codifica una etiqueta de afinidad por estreptavidina; una secuencia del ácido nucleico que codifica una secuencia de tetramerización , preferiblemente una secuencia de tetramerización basada en GCN4; y una secuencia del ácido nucleico que codifica un ectodominio recombinante de hemaglutinina de la influenza o parte del mismo.

Un ectodominio recombinante multimérico o parte del mismo, de acuerdo con la invención, por ejemplo, se expresa en una célula procariótica o en una célula eucariótica, tal como una célula de planta, una célula de levadura, una célula mamífera o una célula de insecto. Adicionalmente, un ectodominio recombinante multimérico o parte del mismo, de acuerdo con la invención, puede expresarse en plantas. Las células procarióticas y eucarióticas son bien conocidas en la técnica. Una célula procariótica es, por ejemplo, E. coli. Los ejemplos de plantas y/o células de plantas incluyen, pero no se limitan a, maíz (células), arroz (células), lenteja de agua (células), tabaco (células, tal como células BY-2 o NT-1) y papa (células). Los ejemplos de células de levadura son Saccharomyces y Pichia. Los ejemplos de células de insectos incluyen, pero no se limitan a, células de Spodoptera frugiperda, tal como células Tn5, SF-9 y SF-21, y células de Drosofila, tal como células Drosofila de Schneider 2 (S2, por sus siglas en inglés). Los ejemplos de células mamíferas que son adecuadas para expresar un ectodominio recombinante multimérico o parte del mismo de acuerdo con la invención incluye, pero no se limitan a, células del riñón del Mono Verde Africano (Vero, por sus siglas en inglés), células del riñón de hámster bebé (tal como BHK-21), células de retina humana (por ejemplo células PerC6), células del riñón embrionarias humanas (tal como células HEK293), células del riñón Caninas de Madin Darby (MDCK, por sus siglas en inglés), fibroblastos del embrión de Pollo (CEF, por sus siglas en inglés), células del riñón de embrión de Pollo (células CEK), células madre embrionarias derivadas de blastodermo (por ejemplo EB14), fibroblastos embrionarios de ratón (tal como células 3T3), células del ovario de hámster chino (CHO, por sus siglas en inglés), mielomas de ratón (tal como NSO y SP2/0), células musculares de codornices (QM5), y derivados de estos tipos de célula. En una modalidad preferida, las células mamíferas HEK293T o células de insectos S2 se utilizan para la producción de un ectodominio recombinante multimérico o parte de las mismas, de acuerdo con la invención.

Además se proporciona por la invención un método para la preparación de una composición inmunogenética, de acuerdo con la invención, que comprende proporcionar un vector de acuerdo con la invención, transformar una célula hospedadora con dicho vector, cultivar la célula hospedadora en un medio de cultivo, permitiendo de este modo la expresión del ectodominio recombinante multimérico de una proteína de la influenza o parte del mismo, fusionado a una etiqueta de afinidad por estreptavidina, y aislar el ectodominio recombinante multimérico de una proteína de la influenza o parte del mismo, fusionado a una etiqueta de afinidad por estreptavidina.

Cuando se utiliza un método de acuerdo con la invención para la expresión de un ectodominio recombinante multimérico o parte del mismo, de acuerdo con la invención, en una célula hospedadora el ectodominio multimérico o parte de la mismo se secreta preferiblemente en el medio de cultivo y puede aislarse del medio de cultivo. El aislamiento del ectodominio multimérico o parte del mismo, por ejemplo, es realizado centrifugando o filtrando el medio de cultivo para eliminar las células y restos de célula y purificación, utilizando cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, métodos de electroforesis en gel o cromatografía, tal como cromatografía de afinidad o cromatografía líquida de alto rendimiento. En una modalidad preferida, un ectodominio recombinante multimérico o parte del mismo, de acuerdo con la invención, se purifica utilizando la etiqueta de afinidad por estreptavidina fusionada, por ejemplo, utilizando columnas de purificación con estreptavidina o Strep-Tactin sefarosa (IBA Alemania) y un amortiguador de elución para desplazar la proteína de etiqueta Strep de la columna que comprende biotina o un derivado u homólogo del mismo.

En algunas modalidades un vector, de acuerdo con la invención, se deriva de un virus animal tal como, pero sin limitarse al virus de vacuna (incluyendo derivados atenuados tal como el virus de la Vacuna Modificada Ankara, MVA), virus de la Enfermedad de Newcastle (NDV, por sus siglas en inglés), adenovirus o retrovirus. Se prefiere que se atenúe un virus animal que se utilizó como un vector de acuerdo con la invención. Cualquiera de estos vectores es adecuado particularmente para la expresión de un ectodominio recombinante multimérico o parte del mismo, de acuerdo con la invención, en un anfitrión, en el cual se desea una respuesta inmunogenética para producirse. Una ventaja del uso de un virus animal, tal como NDV, es que puede hacerse crecer eficientemente en huevos embrionados de pollo a bajos costos y en cantidades suficientemente altas. En una modalidad preferida, después de la propagación del virus animal en virus aislado de huevos embrionados de pollo, se utilizó posteriormente para infectar células eucarióticas. Las células infectadas entonces se utilizan para la producción de un ectodominio recombinante multimérico o parte del mismo, de acuerdo con la invención. Los ejemplos de las células que son adecuadas para expresar un ectodominio recombinante multimérico o parte del mismo, de acuerdo con la invención, son células mamíferas, como se describe anteriormente. En otra modalidad preferida, después de, por ejemplo, la propagación del virus animal en huevos embrionados de pollo, el virus aislado se utilizó para infectar directamente células de un anfitrión en el cual una respuesta inmunogenética debe producirse. Una ventaja de infectar a un anfitrión, en el cual una respuesta inmunogenética se va a elevar con un vector, de acuerdo con la invención, es que la administración es realizada muy eficientemente, por ejemplo, rociando sobre los animales o en el aire sobre los animales. La invención, por lo tanto, comprende además una composición inmunogenética que comprende el vector de acuerdo con la invención y un diluyente farmacéuticamente aceptable.

Un vector de acuerdo con la invención para el uso en una composición inmunogenética de acuerdo con la invención comprende preferiblemente un módulo de expresión que comprende un promotor que es adecuado para la iniciación de la transcripción en células del anfitrión deseado. Los ejemplos de promotores adecuados para la expresión de por lo menos un ectodominio recombinante multimérico o porción de los mismos, de acuerdo con la invención, en anfitriones aviares, incluyen, pero no se limitan a, un promotor aviar de beta-actinia o un promotor del ARN pol I de pollo. Los ejemplos de promotores adecuados para la expresión de por lo menos un ectodominio recombinante multimérico o una porción de los mismos, de acuerdo con la invención, en anfitriones mamíferos incluyen, pero no se limitan a, un promotor de beta-actinia, un promotor de inmunoglobina, un promotor del 5S ARN o los promotores derivados de virus, tal como citomegalovirus (CMV, por sus siglas en inglés), virus del sarcoma de Rous (RSV, por sus siglas en inglés) y promotores de virus 40 de Simio (SV40, por sus siglas en inglés) para anfitriones mamíferos.

En algunas modalidades, una secuencia del ácido nucleico que codifica un ectodominio recombinante o parte del mismo, de acuerdo con la invención, es alterada tal como mediante sustituciones, eliminaciones y/o adiciones del ácido nucleico que permiten la expresión de las proteínas equivalentes funcionalmente a un ectodominio recombinante multimérico o parte del mismo, de acuerdo con la invención. Las proteínas equivalentes funcionalmente pueden identificarse mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, mediante su capacidad de inducir una inmunorespuesta contra el virus de la influenza en un individuo o en un ensayo in vitro, donde se determina la unión a anticuerpos.

En algunas modalidades, una secuencia del ácido nucleico que codifica un ectodominio de hemaglutinina trimérica de la influenza o parte del mismo, y/o una secuencia del ácido nucleico que codifica una neuraminidasa tetramérica de la influenza o parte de la misma, se inserta en un vector. En otra modalidad el ácido nucleico que codifica más de un ectodominio de hemaglutinina trimérica de la influenza o porción del mismo, y/o neuraminidasa tetramérica de la influenza o parte de la misma o combinaciones de los mismos se insertan en un vector. En aún otra modalidad, una composición inmunogenética, de acuerdo con la invención, comprende vectores separados en los cuales se inserta una secuencia del ácido nucleico que codifica un ectodominio de hemaglutinina trimérica de la influenza o parte del mismo, y/o una neuraminidasa tetramérica de la influenza o parte de la misma.

Así, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 secuencias del ácido nucleico que codifican un ectodominio de hemaglutinina trimérica o parte del mismo, pueden combinarse en un vector, tal como secuencias del ácido nucleico que codifican H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 y/o H16. Alternativamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 secuencias del ácido nucleico que codifican un ectodominio de neuraminidasa tetramérica o parte del mismo, pueden combinarse en un vector, tal como secuencias del ácido nucleico que codifican N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 y/o N9. Adicionalmente, una composición inmunogenética, de acuerdo con la invención, puede comprender una combinación de una o más secuencias del ácido nucleico que codifican un ectodominio de hemaglutinina trimérica o parte del mismo y una o más secuencias del ácido nucleico que codifican un ectodominio de neuraminidasa tetramérica o parte del mismo de diferentes subtipos de influenza. Por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 secuencias del ácido nucleico que codifican ectodominios de hemaglutinina trimérica o partes de los mismos y 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 secuencias del ácido nucleico que codifican ectodominios de neuraminidasa tetramérica o partes de los mismos pueden combinarse, por ejemplo, H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 y/o N9. Será claro para un experto que el término "uno o más ectodominios" comprende uno o más ectodominios de uno o más subtipos del virus de la influenza, tal como, por ejemplo, virus de la influenza A y virus de la influenza B. De esta manera, una composición inmunogenética, de acuerdo con la invención, puede comprender una composición multivalente, con la cual se logra una protección más amplia contra más de un tipo del virus de la influenza, o subtipos o cepas del virus de la influenza. Además, tal composición inmunogenética puede ser menos sensible a alteraciones antigénicas que las vacunas del virus de la influenza atenuadas inactivas o vivas tradicionales.

Se proporciona por la invención, además, un método para producir una inmunorespuesta contra un virus de la influenza en un individuo que comprende administrar al individuo una composición inmunogenética, de acuerdo con la invención.

La invención se explica adicionalmente en los siguientes ejemplos. Estos ejemplos no limitan el alcance de la invención, sino que simplemente sirven para aclarar la invención.

Leyendas de las Figuras Figura 1. Representación esquemática de un virus de la influenza.

Figura 2. Expresión, purificación y actividad biológica de proteínas H5 triméricas recojmbinantes, solubles. (A) Representación esquemática de los módulos de expresión H5 usados. La secuencia de codificación de ectodominio H5 (H5) se clonó en la estructura con secuencias de ADN codificadas para un péptido de señal (SP, por sus siglas en inglés), el motivo de trimerización de cremallera de isoleucina <3CN4 (GCN4, por sus siglas en inglés) ADN y la etiqueta Strep II (ST, por sus siglas en inglés) bajo el control de un promotor CMV. (B) La expresión de H5 y secreción en el medio de cultivo se analizaron mediante SDS-PAGE, seguido mediante western blotting. Se detectó la proteína recombinante utilizando un anticuerpo anti-Etiqueta Strep de ratón. (C) Análisis de las proteínas H5 recombinantes purificadas mediante filtración en gel. Se muestran los perfiles de elución de la proteína H5 al usar una columna Superdex200GL 10-300. Se indica la elución de un control de catalasa 232kDa mediante la línea de puntos. (D) Los trímeros H5 recombinantes solubles formaron complejos con un HRP-conjugado, anticuerpo de ratón dirigidos contra la Etiqueta Strep antes de su aplicación en un ensayo de unión de fetuina. La unión de HA también se determinó después del tratamiento de la fetuina con neuraminidasa derivara de Vibrio Cholera (fetuina + VCNA).

Figura 3. Vacunación de hemaglutinina soluble (sHA, por sus siglas en inglés) en pollos. Se inmunizó un grupo de 10 pollos SPF dos veces con 10 ug de sHA (dO y d21). Como un control de desafío, un grupo de pollos se trató con un control (PBS, por sus siglas en inglés). Tres semanas después de la 2a vacunación, todas las aves se desafiaron con 105 TCID50 de H5N1 A/Vietnam/1203/04 y se monitorearon diariamente para determinar los signos clínicos hasta el día 14 p.i. A) La curva de supervivencia Kaplan-Meier, indica el porcentaje de mortalidad cada día para cada grupo. B) Las muestras de sangre se recolectaron 3 semanas después de la primera inmunización (d21), 3 semanas después de la segunda vacunación (d42) y 2 semanas después del desafío (d56). Se trazaron los diagramas de los títulos del anticuerpo H1 en suero para cada ave. Las barras representan medios geométricos para cada grupo. La línea punteada indica el nivel más bajo de anticuerpo correlacionado con la protección en este experimento.

Figura 4. Vacunación de sHA en pollos. Siete grupos de 10 pollos WLH se inmunizaron i.m. con 10, 2 o 0.4 g de sHA ya sea una vez o dos veces con un intervalo de 3 semanas. Como un control de desafío, un grupo se trató con un control (PBS, por sus siglas en inglés). Cuatro semanas después de la vacunación, todos los pollos se desafiaron con 105 TCID50 de A/Vietnam/1203/04 y después se monitorearon diario para signos clínicos durante 14 días. Curva de supervivencia de Kaplan-Meier que indica los de porcentaje de mortalidad en cada día para cada grupo que fue una vez vacunado (A) o dos veces (B).

Figura 5. Expresión y análisis de proteínas HA (sHA) y NA (sNA) solubles, multiméricas purificadas del virus de la influenza 2009 A (H1N1). A) Representación esquemática de las subunidades de sHA y sNA expresadas recombinantemente. sHA: el ectodominio HA (a. a. 17-522) se expresa con una secuencia de señal de N-terminal CD5 y un dominio GCN4 trimérico C-terminal (GCN4-pll) y Etiqueta Strep (ST, por sus siglas en inglés), respectivamente. sNA: el dominio principal NA (a. a. 75-469) se expresa con una secuencia de señal CD5 N-terminal, un OneSTrEP y (GCN4-pLI) un dominio tetramérico GCN4 (GCN4-pLI, por sus siglas en inglés). B) SDS-PAGE de reducción con tinción de azul Coomassie de proteínas sHA y sNA purificadas por afinidad. (C) Cromatografía de filtración en gel de proteínas sHA y sNA purificadas en columna Superdex 200 16/600 y Superdex 200 10/300, respectivamente. Las líneas discontinuas indican la migración de los estándares de calibración (ferritina, kDa 440; catalasa, kDa 232). La masa molecular evidente de los picos principales es 288 kDa para sHA y 291 kDa para sNA, que se correlaciona con un estado oligomérico trimérico y tetramérico de sHA y sNA, respectivamente.

Figura 6. Inducción de anticuerpos al virus de la influenza A 2009 (H1N1) después de la vacunación en hurones. (A) títulos de la inhibición de hemoaglutinación (H1), (B) títulos de inhibición de neuraminidasa (NI) y (C) títulos de neutralización de virus (VN) de sueros de hurones que recibieron una inmunización el día 0 y día 21 con: 3.75 pg de HA + 3.75 + 3.75 pg de NA con el adyuvante (Iscom Matrix Ms; [IMM]), 3.75 pg de NA+IMM, 3.75 pg de HA+3.75 pg de NA + IMM, PBS o IMM, como se indicó. Se exhiben los títulos del medio geométrico; las barras de error indican SD. Se indican las diferencias significativas estadísticas: *, P < 0.05.

Figura 7. Peso del animal y patología del pulmón de hurones inoculados con el virus de la influenza A 2009 (H1N1). Seis grupos de seis hurones cada uno se inmunizaron dos veces con: 3.75 pg de HA + 3.75 pg de NA, 3.75 pg de HA con adyuvante (Iscom Matrix Ms; [IMM]), 3.75 pg de NA + IMM, 3.75 pg de HA + 3.75 pg de NA + IMM, PBS o IMM como se indica. Se inocularon los animales intranasalmente el día 56 con 106 TCID50 del virus. (A) La pérdida de peso de animales inoculados se indica como un porcentaje del peso corporal antes de la infección (100%). (B) El peso del pulmón como porcentaje del peso corporal, como un indicador para la consolidación del pulmón. (C) Se observaron los pulmones macroscópicamente y anotaron para el porcentaje del área del pulmón que exhibe lesiones necróticas. Se exhiben los títulos del medio geométrico; las barras de error indican SD. Se indican las diferencias significativas estadísticas: *, P < 0.05; **, P < 0.01.

Figura 8. Propagación del virus de la influenza de A 2009 (H1N1) en los pulmones, nariz y garganta de hurones inoculados. (A) Títulos del virus del pulmón en el día 4 después de la infección con el virus de la influenza A 2009 (H1N1) en hurones inmunizados con 3.75 pg de HA+3.75 pg de NA, 3.75 pg de HA con adyuvante (Iscom Matrix Ms; [IMM]), 3.75 pg de NA + IMM, 3.75 pg de HA + 3.75 pg de NA + IMM PBS o IMM como se indica. Los virus (B y C) se propagan desde la nariz y la garganta de los animales inoculados. Los hisopos se recolectaron en el día 4 después de la inoculación. Los títulos del virus se determinaron por medio de titulación de punto final en células MDCK. Se dan los títulos del medio geométrico; las barras de error indican la desviación estándar. Se indican las diferencias significativas estadísticas: ***, P < 0.001.

Figura 9. Inducción de anticuerpos de neutralización cruzada después de la vacunación con sHA y sNA del virus de la influenza A 2009 (H1N1) en hurones. (A) Sueros de hurones que recibieron una inmunización doble de sHA o sHA+sNA con adyuvante (Iscom Matrix Ms; [IMM]) se probaron en un ensayo de inhibición de hemaglutinina para anticuerpos Hl hacia diferentes aislantes del virus de la influenza incluyendo virus H1N1 de la influenza A/Swine/shope/1 /56, A/ltaly/1443/76, A/NL/386/86, A/lowa/15/30, A/NL/25/80, A/NewYersey/8/76, A/PR/8/34 e IVR/148. Se exhiben títulos del medio geométrico; las barras de error indican SD. (B) Los sueros de hurones que recibieron una inmunización simple o doble de sNA o sHA + sNA con adyuvante se agruparon y probaron en un ensayo de inhibición de neuraminidasa (NI, por sus siglas en inglés) para anticuerpos NI contra NA del virus de la influenza A/Kentucky/U R06-0258/2007(H1 N1) y A/turkey/Turkey/l/2005(H5NI). El NA de A/California/04/2009(H 1 N 1 ) se tomó a lo largo como un control positivo. El suero de control positivo específico para el virus de la influenza A/NL/602/09(H1 N1 ) o A/turkey/Turkey/l/2005(H5N 1 ) se obtuvo de un hurón infectado con estos virus. Se exhiben los títulos promedio de dos réplicas; las barras de error indican SD.

Figura 10. A. Ectodominio de hemaglutinina (HA, por sus siglas en inglés) (a. a. 17-522) del virus de la influenza A/California/04/2009 (H1N1). B. Dominio principal de la neuraminidasa (NA, por sus siglas en inglés) (a. a. 75-469) del virus de la influenza A/California/04/2009 (H1N1).

Figura 11. Generación del virus del vector rNDV-HA y expresión de HA y sH53. A) Representación esquemática del constructo pFL-HertsAPBC que codifica la proteína HA de la influenza. Los sitios de restricción Xbal y Pmel se introdujeron mediante el sitio de mutagénesis restringida para permitir la inserción de un enlace que contiene señales de transcripción de inicio-fin de NDV. Los genes que codifican el gen H5 HA no modificado o la proteína soluble sH53, el último que consiste del ectodominio H5 HA fusionado a la secuencia de trimerización GCN4, cada uno se insertó corriente abajo de la secuencia de enlace. B) Expresión de HA en monocapas de células QM5. Las células se infectaron con un control o se infectaron con wt NDV Herts (indicado como wt NDV), rN DV-H5 HA o rNDV-sH53 (indicado como NDV-H5 y NDV-SH53, respectivamente) y teñidas para la proteína HA y F utilizando anticuerpos específicos. C) Producción y secreción de sH53 por células infectadas con rNDV-sH53. Las células QM5 se infectaron con rNDV-sH53 en ausencia de tripsina en un MOI de 3 y el sobrenadante se cosechó a 2 días p.i. Se purificó la proteína sH53 a partir del sobrenadante utilizando gránulos de sefarosa de tactina Strep. Se sometió el producto de purificación a electroforesis de SDS-PAGE y tiñeron las proteínas con reactivo de tinción azul. La proteína sH53 expresada en células HEK 293S y una serie de diluciones de BSA se activaron en paralelo. D) El análisis PAGE nativo azul del producto de expresión sH53 se recuperó de células QM5de infectadas con rNDV-sH53. Se indica la posición en el gel de la forma trimérica y monomérica a partir de la proteína HA observada después del calentamiento de la muestra antes de la electroforesis.

Figura 12. Protección después de la vacunación con NDV-H53 de pollos. A. Las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier indicando la supervivencia (%) de los pollos vacunados intramuscularmente (i.m., por sus siglas en inglés). B. índice clínico calculado sobre la base de las signos clínicos (como se describe en materiales y métodos) observados después del desafío.

Figura 13. Respuesta serológica después de la vacunación con NDV-H53 de pollos. Los títulos del anticuerpo de inhibición de hemoaglutinación (Hl, por sus siglas en inglés) contra la influenza (A) y NDV Herts (B) se midieron en las muestras de suero recolectadas en el día 21 después de la vacunación mediante la ruta i.m. Los títulos se expresan como el recíproco de la dilución más alta del suero que muestra Hl. La línea de puntos indica el límite más bajo de detección. Los títulos debajo del límite de detección se asignaron un valor de 2 o 4. Cada círculo representa una medida de Hl por ave para la detección de anticuerpos Hl contra la influenza aviar (Al, por sus siglas en inglés) y dos medidas por ave en el caso de la detección del anticuerpo NDV Hl. Las líneas horizontales indican títulos promedio geométricos por grupo.

Ejemplos Ejemplo 1 Materiales y Métodos Genes y vectores de expresión Basado en la enumeración H3, un clon de cADN que codifica residuos del aminoácido que corresponden a los residuos 18 al 523 del HA de A/Vietnam/1203/2004 (H5N1) (Genbank acceso No. ABW9Q137.1 ) se sintetizaron utilizando codones humanos preferidos por GenScript USA Inc. El ectodominio HA que codifica el cADN se clonó en el vector de expresión pCD5 para la expresión eficiente en células mamtferas (Zeng et al., 2008). El vector pCD5 se ha modificado tal que el cADN que codifica al Ha se clonó en estructura con secuencias de ADN que codifican para una secuencia señal, un motivo de trimerización de cremallera de isoleucina GCN4 (EUKMKQIEDKIEEIESKQKKIENEIARIKKIKLVPRGSLE; (Pancera et al., 2005) y al Etiquetan Strep (WSHPQFEK; IBA, Alemania).

Expresión y purificación de la proteína. El vector de expresión pCD5 que contiene la secuencia de codificación del ectodominio HA se transfectó en células HEK293S GnTI(-) (Reeves et al., 1999) utilizando la polietilenimina (PEI, por sus siglas en inglés) en una relación 1:5 (yg de PEI: µt de ADN). A 6 h después de la transfección, la mezcla de transfección se sustituyó por el medio de expresión 293 SFM II (Invitrogen), complementado con bicarbonato de sodio (3.7 g/litro), glucosa (2.0 g/litro), Primatona RL-UF (3.0 g/litro, Kerry Bio-Science, Zwijndrecht, Países Bajos), penicilina (100 unidades/ml), estreptomicina (100 g/ml), glutaMAX (Gibco), y 1.5% de DMSO. Los sobrenadantes de cultivo de tejido se cosecharon 5-6 días después de la transfección. La expresión y secreción de la proteína HA se confirmaron mediante electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio (PAGE, por sus siglas en inglés)-poliacrilamida seguida por western blotting utilizando un anticuerpo anti-Etiqueta Strep de ratón (IBA, Alemania). Se purificaron las proteínas secretadas de HA utilizando gránulos de sefarosa de Strep-tactin de acuerdo con las instrucciones del fabricante (IBA, Alemania). La concentración de la proteína purificada se determinó utilizando un espectrofotómetro Nanodrop 1000 (Isogen Life Sciences) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Caracterización biológica del HA recombinante. El estado de oligomerización de la proteína de HA se determinó analizando el perfil de elución utilizando una columna Superdex200GL 10-300 (U-Protein Express). La funcionalidad del trímero soluble de HA (sHA3, por sus siglas en inglés) se determinó utilizando ensayos de una fase sólida de fetuina (Lambre et al., 1991). Se utilizó 1 Mg/ml por pozo de fetuina para cubrir placas nunc maxisorp de 96 pozos. Cuando se indicó en la figura la fetuina bajo receta se trató con neuraminidasa derivada de Vibrio Cholera (VCNA, por sus siglas en inglés) seguida por etapas de lavado extensas. sHA3 se formó en complejo previamente con el anticuerpo anti-Etiqueta Strep unido a peroxidasa de rábano picante (HRP, por sus siglas en inglés) (relación molar 2:1) durante 30 minutos a 0°C antes de la incubación de diluciones limitantes en las placas recubiertas con fetuina (60 minutos, a temperatura ambiente [RT, por sus siglas en inglés]). La unión de Ha posteriormente se detectó utilizando el sustrato de tetrametilbencidina (BioFX) en un lector de ELISA (EL-808 [BioTEK]), leyendo el OD a 450 nm.

Experimentos de desafío por vacunación en pollos Se utilizaron pollos SPF White Leghorn (Lohmann) de 6 semanas de edad. Las aves se alojaron en un cuarto climatizado bajo condiciones Bsl-3. En el primer experimento, un grupo de 10 pollos se inmunizó dos veces (el día 0 y 21) mediante inyección i.m. (0.5 mi) de 10 pg de sHA3 complementado con Stimune (ID -Lelystad, Lelystad, Países Bajos). Como un control de desafío, un grupo de 10 pollos recibió un volumen igual de PBS en Stimune (vacunados con un control). Tres semanas después de la vacunación, las aves se desafiaron mediante infección con 105 TCID50 del virus A/Vietnam/1194/04 (0.1 mi intranasalmente, i.n. y 0.1 mi intratraquealmente, i.t., UniProt Taxonomy ID: 284217) y monitorearon durante un período de 14 días para los signos de enfermedad. Las muestras de sangre se recolectaron en 3 semanas después de cada inmunización (en el d21 y d42) y el día 14 después de la infección (p.i.). Las muestras de tráquea y cloaca se tomaron de cada pollo en día 2, 4 y 7 p.i.

En el siguiente experimento, se usó un total de 70 gallinas ponedoras de un día de edad (White Leghorn), adquiridas de un criador local. Se vacunaron los pollos contra NDV (virus de la Enfermedad de Newcastle) e IBV (virus de la Bronquitis Infecciosa) en la edad de un día de acuerdo con la rutina de la granja. En la edad de 6 semanas, las aves se transportaron a la instalación de nivel de seguridad Biológica (Bsl-)3 y asignaron a 7 grupos experimentales de 10 aves cada uno. Se inmunizaron seis grupos mediante una sola inyección intramuscular de 10, 2 o 0.4 g de antígenos sHA3 el día 21 o dos veces (el día 0 y 21) con las mismas dosis. Como un control de desafío, un grupo de 10 aves de vacunó con control (el día 0 y 21) con PBS en Stimune. Cuatro semanas después de la vacunación (día 49), los pollos se desafiaron como antes y se observaron diariamente para comprobar los signos clínicos durante 14 días. Se tomaron muestras de sangre antes de la vacunación, después de la primera (día 21) y segunda (día 49) vacunación y el día 14 p.i. Se tomaron muestras de tráquea e hisopos de cloaca los mismos días, como se describe anteriormente.

Análisis de detección del virus Se almacenaron la tráquea e hisopos de cloaca en medio de caldo de triptosa frío. Se clarificó el medio con centrifugación de baja velocidad y se cosechó el sobrenadante, se dividió en alícuotas y almacenó a -70°C. Después de la congelación- descongelación, se agruparon la tráquea e hisopos de cloaca muestreados de la misma ave en el mismo día, se extrajo el ARN y ensayó la presencia de ARN viral utilizando el análisis cuantitativo de RT-PCR (Taq Man PCR) dirigido contra el gen M1, que codifica una proteína de matriz del virus de la influenza. Primero, se sintetizó el cADN utilizando el cebador 5'-CACTGGGCACGGTGAGC-3', después se amplificó parte del gen M1 activando 45 ciclos de Light Cycler PCR, utilizando el cebador 5'-CTTCTAACCGAGGTCGAAACGTA-3 como el cebador inverso en presencia de la prueba fluorescente TaqMan 5'-6FAM-TCAGGCCCCCTCAAAGCCGA-X-ph. Las muestras de control negativas y positivas se probaron paralelamente. El límite inferior de detección se determinó como aproximadamente 500 TCID50. Algunas muestras dieron resultados inciertos, se entiende que dieron solamente una señal muy débil (fluorescencia < 0.07) después de >31 ciclos.

Ensayo de inhibición de hemoaqlutinación El suero inmune inactivado por calor de muestras de sangre de pollo se probaron para actividad de Hl con 1% de glóbulos rojos de pollo y 4 HAU (unidades hemaglutinantes) de A/Vietnam/1194/04, de acuerdo con métodos estándar. La formación del botón rojo se anotó como evidencia de la hemoaglutinación. Se expresaron los títulos del anticuerpo como el recíproco de la dilución más alta de suero que muestra Hl.

Resultados Expresión, purificación y caracterización de los trímeros H5.

Para expresar un ectodominio HA soluble trimérico (sHA3, por sus siglas en inglés) en células mamíferas, la secuencia codificante del ectodominio H5 primero se clonó en el vector de expresión apropiado. En el vector pCD5 usado, la secuencia Ha se precedió por una secuencia codificante del péptido señal, para permitir la secreción eficiente de la proteína recombinante, y seguida por la codificación de secuencias para el motivo de trimerización de la cremallera de isoleucina GCN4 (Pancera et al., 2005) y la etiqueta Strep II (Fig. 2A). La expresión del ectodominio HA se logró mediante la transfección transitoria del plásmido de expresión en las células HEK. La expresión y secreción de la proteína HA se verificaron sometiendo los sobrenadantes de cultivo celular a la electroforesis en gel seguida por western blotting utilizando un anticuerpo dirigido contra la etiqueta Strep II (Fig. 2B). Los resultados muestran que la proteína HA recombinante podrá detectarse fácilmente en el sobrenadante del cultivo celular después de la transfección de las células con el plásmido de expresión, pero no después de la transfección control. Se purificó la proteína HA secretada en un protocolo de una sola etapa utilizando granulos de sefarosa de Strep-tactin. Las producciones de proteína varían entre 0.4-1 mg de proteína recombinante por 100 mi de medio de cultivo celular. Después de la purificación de la proteína H5 de los sobrenadantes del cultivo celular, el estado oligomérico de la proteína H5 se analizó mediante cromatografía en columna de filtración en gel Superdex200 (Fig. 2C). La cantidad de la proteína HA se eluyó con la velocidad de un oligómero, probablemente un trímero, mientras solamente una fracción menor se encontró en forma de agregados en el volumen vacío. La naturaleza trimérica del oliómero H5 se confirmó utilizando electroforesis nativa azul en gel. Se estudió la actividad biológica de la proteína H5 purificada utilizando un ensayo de unión de fase sólida con la fetuina de glicoproteína de sangre sialisada. La unión de HA se midió por medio del HRP conjugado al anticuerpo anti-etiqueta Strep II como se detalló en la sección de Material y Métodos. La preparación de H5 demostró una unión dependiente de la concentración a fetuina. Esta unión fue dependiente de ácido siálico, puesto que no se observó la unión cuando la fetuina se había tratado con VCNA (Fig. 2D). En conclusión, el H5 trimérico soluble, activo biológicamente, se produjo eficientemente en células mamíferas y purificó fácilmente.

Eficacia de la vacuna sHA3 contra una infección con H5N1 letal en pollos Para determinar la eficacia protectora de sHA3 en pollos, diez pollos se vacunaron dos veces intramuscularmente (el día 0 y 21) (i.m.) con 10 pg de sHA3, complementado con Stimune y desafiados 3 semanas más adelante mediante inoculación intranasal (i.n.)/intratraqueal (i.t.) de una dosis letal del virus H5N1 A/V¡etnam/1194/04. Además, 10 aves se vacunaron con control para servir como controles de desafío. Como se muestra en la figura 3, la vacunación con 10 ug de sHA3 podrá generar protección completa. Ninguno de los pollos vacunados murieron o mostraron síntomas indicativos de la enfermedad relacionada a la influenza, mientras todos los pollos vacunados con control sucumbieron en el plazo de 2 días. El análisis serológico de muestras de sangre mostró que todos los pollos vacunados con control tuvieron un título debajo del límite de detección. Los títulos del anticuerpo Hl aumentaron a un máximo de 1024 después de un refuerzo con sHA3. El título de Hl más bajo observado después del refuerzo fue 64, el cual fue suficiente, aparentemente, para proteger al animal contra el desafío mortal. Curiosamente, el 50% de las aves habían desarrollaron títulos del anticuerpo Hl iguales a 64 o superiores tres semanas después de la primera vacunación. Estos resultados motivaron a calcular la dosis de sHA3 mínima requerida para conferir la protección y examinar si una dosis sencilla con sHA3 podrá también ser protectora .

En el segundo experimento de vacunación-desafío, se vacunaron pollos con 10, 2 o 0.4 ug de sHA3 dos veces o mediante una sola inyección, y desafiados cuatro semanas después mediante infección de una dosis letal de A Vietnam/1194/04, como se describe anteriormente. Una vacunación de refuerzo con una dosis de 0.4 ug de sHA3 fue suficiente para proteger el 90% de los pollos contra mortalidad, mientras todos los pollos sobrevivieron cuando se administró una vacunación de refuerzo de 2 o 10 g (Fig. 4B). Además, los resultados muestran que una sola vacunación con sHA3 es suficiente para proteger los pollos contra una infección mortal; solamente un pollo murió cuando una dosis de 2 pg se administró, mientras una dosis de 10 g fue protectora para todas las aves. Incluso una sola dosis de 0.4 pg podría ser capaz de proteger el 60% de los pollos contra la muerte. Todos los pollos que recibieron la vacuna de control (PBS, por sus siglas en inglés) murieron en el plazo de 2 días.

También analizamos si la vacunación con sHA3 disminuyó o evitó la diseminación del virus. Con este fin, los hisopos de tráquea y cloaca se tomaron de los pollos vacunados y desafiados del experimento mostrado en la figura 4 los días 2, 4 y 7 p.i. Los hisopos de tráquea y cloaca muestreados del mismo pollo se reunieron en el mismo día, y la presencia de ARN viral en los hisopos reunidos se analizó utilizando gn ensayo de PCR PT cuantitativo que detecta el gen M1. Los resultados se muestran en la figura 1. De los pollos que recibieron una vacunación de refuerzo con el antígeno HA, solamente 2 aves, las cuales han recibido la cantidad más baja de antígeno, fueron positivos probados. La diseminación del virus no pudo observarse en cualquiera de las otras aves, aunque 3 hisopos dieron resultados no concluyentes. También cuando los pollos recibieron solamente una vacunación, se apareció que la mayoría de las aves no diseminaron ningún virus. Ninguna de las aves diseminó el virus en el día 4 y 7 después de la infección después de la vacunación con 10 pg de sHA3. Los resultados muestran la ausencia de virus diseminado correlacionado con las aves que se protegieron contra un desafío letal con HPAI H5N1.

Tabla 1. Detección de virus en muestras recolectadas de hisopos de tráquea y cloaca agrupados de pollos vacunados ·+ = positivo; ± = no concluyente; - = negativo Ejemplo 2 Materiales y métodos Virus de la influenza A El virus de la influenza A/Netherlands/602/2009 se aisló del primer caso de una infección 2009-A/H1N1 confirmada en el laboratorio en los Países Bajos mediante inoculación de huevos de pollo embrionados de 11 días de edad (Munster et al., 2009). Las cepas virales del virus de la influenza A/Netherlands/602/2009 (H1N1, por sus siglas en inglés) se prepararon infectando confluentes de células de riñón de perro Madin-Darby (MDCK, por sus siglas en inglés). Después de que se completaron los cambios citopatológicos, los sobrenadantes de cultivo se limpiaron mediante centrifugación a baja velocidad y almacenaron a 70°C. Los títulos de virus infeccioso se determinaron en células de MDCK como se describió previamente (Rimmelzwaan et al., 1998). Todos los experimentos con estos virus se realizaron bajo condiciones de Bio Safety Level (BSL)-3.

Preparación de antígenos HA y NA Los genes optimizados por codón humano que codifican el ectodominio de hemaglutinina (HA, por sus siglas en inglés) (a. a. 17-522, figura 10A) y el dominio principal de neuraminidasa (NA, por sus siglas en inglés) (a. a. 75-469, Fig. 10B) del virus de la influenza A/California/04/2009 (H1N1, UniProt Taxonomy ID: 641501) se sintetizaron (GenScript) y clonaron en un derivado del plásmido de expresión S 1 - 1 g (Li et al., 2003) para la expresión en células HEK293T. El gen HA se flanqueó mediante una secuencia de señal CD5 N-terminal, una secuencia de trimerización GCN4 artificial C-terminal (GCN4-pll, por sus siglas en inglés) (Harbury et al., 1993) seguido por una Etiqueta Strep para la purificación de afinidad (IBA GmbH). El dominio principal de NA se flanqueó mediante una secuencia de señal CD5 N-terminal, una secuencia Etiqueta Strep doble (Una-STrEP) (IBA GmbH) y un dominio de tetramerización GCN4 artificial (GCN4-pLI) (Harbury et al., 1993), respectivamente.

Expresión y purificación de proteína Se transfectaron células HEK293T con los vectores de expresión pCD5 que contenían las secuencias de codificación de HA y NA utilizando el polietileneimina (PEI, por sus siglas en inglés) en una relación 1:5: (µ? de DNA: \¡g de PEI). A las 6 horas después de la transfección, el medio de transfección se sustituyó por el medio de expresión 293 SFM II (Invitrogen), complementado con el bicarbonato de sodio (3.7 g/litro), glucosa (2.0 g/litro), Primatone RL-UF (3.0 g/litro, Kerry Bio-Science, Zwijndrecht, Países Bajos), penicilina (100 unidades/ml), estreptomicina (100 g/ml), glutaMAX (Gibco) y 1.5% de DMSO. Los sobrenadantes de cultivo de tejido se cosecharon 5-6 días después de la transfección y purificaron los ectodominios de HA y NA a partir del medio de cultivo utilizando la cromatografía de afinidad por Sirep-Tactina (IBA GmbH). La expresión y purificación de la proteína de HA y NA se confirmó mediante western blotting, utilizando un conjugado de S rep-Tactina-HRP (IBA GmbH) (datos no mostrados) y análisis de SDS-PAGE.

La oligomerización de las proteínas se determinó mediante cromatografía de filtración en gel y mediante análisis nativo azul de PAGE.

Hurones Los hurones hembras adultos jóvenes no consanguíneos sanos (Mustela putorius fur; entre 6 y 12 meses) se suministraron por Schimmel, Uddel, Países Bajos. Los hurones se seleccionaron para la presencia de anticuerpos contra el virus de la influenza circulante A/H1N1 y A/H3N2 y el virus de la influenza 2009 A (H1N1) de origen de cerdo [virus de la influenza A 2009 (H1N1)] mediante análisis de inhibición de hemoaglutinación. Los hurones que probaron ser negativos para estos virus se utilizaron en este experimento. Un comité de ética animal independiente aprobó el protocolo experimental antes de iniciar los experimentos.

Inmunizacjones e infecciones Treinta y seis hurones seronegativos se dividieron en seis grupos de 6 hurones y se vacunaron dos veces con las siguientes formulaciones: 3.75 pg de HA trimérico + 3.75 pg NA tetramérico en PBS (grupo 1); 3.75 pg de HA trimérico en Matrix-M de Iscom (Isconova, Uppsala, Suecia; grupo 2); 3.75 pg de NA tetramérico en Matrix-M de Iscom (grupo 3); 3.75 pg de HA trimérico + 3.75 pg de NA tetramérico en Matrix-M de Iscom (grupo 4); PBS (grupo 5); Matrix-M de Iscom (grupo 6). Se realizaron las vacunaciones con un intervalo de 20 días bajo anestesia con ketamina en los músculos cuádriceps de la pata trasera en un volumen total de 1 mi. Los hurones se alojaron en grupos y recibieron alimento y agua ad-libitum. A 32 días después de la última vacunación, se anestesiaron los animales con ketamina/medetomidina (invertida con atipamezol), pesaron y desafiaron posteriormente con 1x106 de TCIDso de influenza A/NL/602/09 (H1N1) en un volumen de 3 mi de Solución Salina Amortiguada con Fosfato (PBS, por sus siglas en inglés). Después de la infección, se monitorearon los hurones tres veces diariamente para el desarrollo de signos clínicos. Antes de la infección y dos y cuatro días después de la infección, los hisopos de nariz y garganta de cada hurón se recolectaron mientras se anestesiaron hurones con ketamina. Cuatro días después de la infección, se pesaron los animales y sacrificaron posteriormente mediante desangramiento bajo anestesia con ketamina y medetomidina. Se realizaron las autopsias de acuerdo con los procedimientos estándar.

Serología Se recolectaron muestras de suero antes de la vacunación, en el día de la segunda vacunación (día 20) y en el día del desafío (día 52). Se almacenaron los sueros a -20°C hasta el uso. Se probaron los sueros para la presencia de anticuerpos anti-HA utilizando un ensayo de inhibición de hemoaglutinación (Hl-ensayo) con 1% de eritrocitos de pavo y para la presencia de anticuerpos de neutralización de virus utilizando un microensayo de neutralización de virus (VN-ensayo) como se describió previamente (Frank et al., 1980 y Palmer et al., 1975). Se probaron los sueros para la presencia de anticuerpos reactivos con la influenza A/NL/602/09 (nH1N1). Con este fin se produjeron virus genéticos inversos. Los títulos obtenidos con estos virus fueron comparables con aquellos contra las cepas tipo silvestre (datos no mostrados). El suero de control positivo específico para la influenza A/NL/602/09 (H1N1) se obtuvo de un hurón infectado con este virus (Munster et al., 2009). También se probaron sueros para la presencia de anticuerpos inhibidores de neuraminidasa (NI, por sus siglas en inglés) utilizando un ensayo basado en fetuina (Lambre et al., 1991). En resumen, placas de Nunc axiSorp de 96 pozos se cubrieron durante la noche a 4CC con 100 µ? de 5 g/ml de fetuina. Se incubaron volúmenes de 60 µ? de muestras de suero diluidas en serie con un volumen igual de sobrenadante de cultivo celular S2 que contiene NA (diluido 40x en PBS-Ca/Mg [0.901 mM/0.493 mM], incubaron durante 30 minutos a 37°C y después 100 µ? de la mezcla se agregaron a las placas cubiertas con fetuina. Después de una hora de incubación a 37°C, se lavaron las placas y midieron posteriormente la actividad de neuraminidasa utilizando una aglutinina del cacahuete etiquetada con peroxidasa (Sigma, Zwijndrecht, Países Bajos) (2.5 g/ml). Se incubaron las placas durante una hora a temperatura ambiente, lavaron después de lo cual se agregaron 100 µ? de sustrato de peroxidasa (TMB, por sus siglas en inglés) a cada pozo. Después de 5 minutos, se detuvo la reacción mediante la adición de 100 µ? de ácido fosfórico 0.3 M y midieron los valores de OD a 450 nm, utilizando un lector de ELISA (EL-808 [BioTEK]).

Títulos de virus en pulmones y en hisopos de garganta v nariz Se recolectaron muestras de todos los lóbulos del pulmón derecho y del lóbulo accesorio de hurones infectados y congelaron instantáneamente sobre hielo seco con etanol y almacenaron a 70°C hasta procesamiento adicional. Se pesaron las muestras de pulmón y homogeneizaron posteriormente con un FastPrep-24 (P.M. Biomedicals, Eindhoven, Países Bajos) en la solución salina balanceada de Hank que contiene 0.5% de lactoalbúmina , 10% de glicerol, 200 U/ml de penicilina, 200 pg/ml de estreptomicina, 100 U/ml de sulfato de polimixina B, 250 g/ml de gentamicina y 50 U/ml de nistatina (ICN Pharmaceuticals, Zoetermeer, Países Bajos) y centrifugaron brevemente. Después de la recolección de hisopos de nariz y garganta, se almacenaron los hisopos a -70°C en el mismo medio como se utilizó para homogeneizar muestras de pulmón. Se utilizaron diluciones cuadruplicadas seriadas diez veces de muestras de garganta, nariz y pulmón para infectar células MDCK como se describió previamente (Rimmelzwaan et al., 1998). La actividad de HA de los sobrenadantes de cultivo recolectada 5 días después de la inoculación se utilizó como indicador de infección. Se calcularon los títulos de acuerdo con el método de Spearman-Karber y expresaron, como el registro TCID50, por gramo para el tejido pulmonar o por mi para los hisopos (Karber, 1931).

Análisis Estadístico El significado entre los grupos animales se analizó mediante la prueba de ANOVA y Tukey subsecuente a ANOVA. Las diferencias se consideraron significativas a P<0.05.

Resultados Respuestas del anticuerpo inducidas mediante inmunización con HA y NA solubles Las versiones multiméricas, solubles del ectodominio de HA (sHA; a. a. 17-522) y el dominio principal de neuraminidasa (sNA; a. a. 75-469) del virus de la influenza pandémico 2009 A (H1N1), expresado en células mamíferas HEK293T y purificado a partir del sobrenadante de célula (Fig. 5), se probó para la capacidad de inducir la protección contra el desafío del virus homotípico. Se inmunizaron hurones en los días 0 y 20 con sHA y sNA (sHA + sNA), sHA se complementó con Iscom Matrix M (IMM; SHA-I M), sNA-IMM o sHA + sNA-l M M , y anticuerpos inducidos contra las proteínas de HA y NA mediante las inmunizaciones se midieron en los sueros recolectados en el día del desafío (día 52). Los animales vacunados con sHA-IMM tuvieron altos títulos de medio geométrico (GMT, por sus siglas en inglés) de inhibición de hemoaglutinación (Hl, por sus siglas en inglés) contra el virus homólogo (Fig. 6A). Los títulos Hl fueron mayores perceptiblemente en animales inmunizados con sHA+sNA-I M. Sin adyuvante (sHA+sNA) y en los dos grupos de control (IMM o PBS) ningún título Hl fue medible. También la titulación de la inhibición de neuraminidasa (NI, por sus siglas en inglés) reveló la inducción dependiente a ayudante de anticuerpos NA (Fig. 6B). Sin embargo, en este caso no se observó ninguna mejora significante de estos títulos debido a la coadministración de HA. Consistente con los títulos de Hl observados, títulos de neutralización de virus (VN, por sus siglas en inglés) se encontraron tanto en los animales vacunados con sHA-IMM y sHA+sNA-IMM (Fig. 6C). También aquí la coadministración del antígeno sNA en los animales vacunados con sHA + sNA-IMM dio lugar a un aumento en el título de VN, yendo de 1:202 a 1:468 en los grupos sHA-IMM y sHA + sNA-IMM, respectivamente. Los títulos NI bajos se detectaron en el suero después de la primera inmunización (día 20; datos no mostrados).

Protección contra signos clínicos después de la infección con virus de la influenza 2009 A (H1N1) Los hurones vacunados se desafiaron intratraquealmente con el virus 10e TCIDso 2009 A (H1N1) 5 semanas después del refuerzo. No se observó ningún signo claro de enfermedad durante el período de inmunización o después de la inoculación de desafío con el virus de la influenza 2009 A (H1N1). Sin embargo, la pérdida de peso corporal llegó a ser obvia después de la inoculación en los grupos control de PBS e IMM así como en el grupo de vacuna sHA+sNA no complementado (Fig. 7A). Interesantemente, también los animales inmunizados con el antígeno sHA-IMM mostraron pérdidas de peso similares mientras estos efectos estuvieron ausentes después de la vacunación con las formulaciones que contienen sNA (grupos sNA-IMM y sHA+sNA-IMM). Los pesos del pulmón de los hurones determinados post mortem mostraron una tendencia correspondiente de animales vacunados con sNA complementado que tienen menos incremento relacionado a enfermedad debido a la consolidación del pulmón (Fig. 7B).

Los cambios histopatológicos se localizaron en lesiones multifocales a coalescentes con más del 50% de los pulmones afectados en los hurones control desprotegidos inoculados con PBS o adyuvante solamente (IMM) (Fig. 7C). Las lesiones se caracterizaron con infiltrados linfocíticos peribronquiolares inflamatorios marcados y fluido ocasionalmente proteínico. No hubo necrosis en el epitelio bronquiolar resultante en debri celular en el lumen. Todos estos cambios histopatológicos se localizaron en lesiones multifocales a coalescentes con más del 50% del pulmón afectado. La reducción clara en cambios histopatológicos se observó en animales vacunados con sNA complementado (grupo sNA-IMM o sH A + sNA-l M M) . Los hurones que se inmunizaron con sHA-IMM se protegieron parcialmente de desarrollar la patología que muestra ~20% del área del pulmón que fue afectada.

Protección de vacuna contra réplica de vjrus Para medir el efecto de la vacunación con bajas dosis de 3.75 pg de HA trimérico y/o NA tetramérico en la severidad de la infección inducida mediante la inoculación de desafío con el virus de la influenza 2009 A (H1N1), los títulos del virus se determinaron en pulmones, garganta y nariz en el día 4 después de la inoculación. El virus replicado eficientemente en los pulmones de los hurones control (Fig. 8A; Grupos de PBS e IMM) y en los animales inmunizados con la combinación no complementada de sHA y sNA (grupo sHA + sNA-l MM), con títulos virales promedio de aproximadamente 107- 108. Estas cargas virales se redujeron significativamente (~5 unidades logio) en los animales inmunizados con la proteína de sHA con adyuvante (grupo sHA-IMM) y en animales inmunizados con proteína sHA y sNA con adyuvante (grupo sHA+sNA-IMM). tas cargas virales promedio se redujeron por aproximadamente 2 log10 en animales inmunizados con el antígeno sNA complementado.

Altas cargas virales en la nariz se observaron en los animales control (grupos PBS e IMM) después de la inoculación con el virus de la influenza 2009 A (H1N1). Las cargas virales en la nariz se redujeron considerablemente en los animales inmunizados con ya sea con sHA o sNA complementado o la combinación sHA+sNA no complementado. Los anímales inmunizados con la combinación complementada de antígenos sHA y sNA tienen la reducción mayor y significante de los títulos virales de la nariz (Fig. 8B). Las diferencias en las cargas virales de la garganta de los grupos vacunados comparadas con los grupos control no fueron significantes a excepción de los animales vacunados con la combinación complementada de sHA y sNA. Estos hurones no tienen títulos virales detectables en la garganta.

Respuestas del anticuerpo de neutralización cruzada inducidas mediante inmunización con HA y NA solubles Los sueros de hurones recolectados antes del desafío de virus se probaron para anticuerpos de neutralización cruzada, utilizando ensayos de Hl y NI contra otras diferente cepas de la influenza H1N1. Los anticuerpos de neutralización cruzada que inhibían la hemoaglutinación contra virus de la influenza A/NL/386/86, A/NL/25/80 y A/NewYersey/8/76 H1N1 están presentes en el suero de animales inmunizados con sHA-IMM y sHA+sNA-IMM (Fig. 9A). La inclusión de sNA en la vacuna que contiene sHA dio lugar a un aumento constante en la actividad de inhibición de hemoaglutinación hacia cepas heterotípicas, similar como se ve para la cepa homologa. El nivel relativo de anticuerpos de MI cruzado por animal correspondió con el de anticuerpos de Hl contra HA homólogo. No se detectó ninguna actividad neutralizante cruzada de suero para virus H1N1 de la influenza A Swine/shope/1/56, A/ltaly/1443/76, A/lowa/15/30, A PR/8/34 e IVR/148. La actividad de inhibición de neuraminidasa contra la sNA del virus de la influenza A Kentucky/U R06- 0258/2007(H1 N1) humano y A turkey/Turkey/l/2005(H5N 1 ) aviar se encontró en los sueros reunidos de animales inmunizados con sNA-IMM y sHA+sNA-IMM (Fig. 9B).

Ejemplo 3 Materiales y métodos Céjulas y virus Se cultivaron células musculares de codorniz (QM5, por sus siglas en inglés) (Antin & OrdahI, 1991) en el medio completo de QT35 (Life Technology) y cultivaron células VERO (ATCC CCL-81) en medio de Eagle modificado de Dulbecco (Invitrogen). Se complementaron los medios con 5% de suero bobino fetal y antibióticos. El virus fowlpox recombinante fpEFLT7 (Britton et al., 1996; en la presente designado FPV-T7), proporciona la expresión estable de la polimerasa del bacteriófago ARN T7 tanto en células aviares y mamíferas, se propagó en células de hígado de embrión de pollo primarias. El virus de la influenza A/Vietnam/1194/04 H5N1 (amablemente proporcionado por el Dr. Alan Hay del WHO Influenza Centre en el National Institute for Medical Research, Londres) se propagó en huevos embrionados de pollo libres de patógenos específicos (SPF, por sus siglas en inglés) de 9 días para producir una cepa de virus.

Construcción de cADNs del virus de la enfermedad de Newcastle de longitud completa (NDV. por sus siglas en inglés) El cADN de longitud completa de NDV Herts, pFL-Herts (de Leeuw et al. 2005), con los sitios de restricción únicos Asc\ y sel que flanquean el gen F, se utilizaron como la estructura central para la inserción del gen H5 HA entre los genes P y . Con este fin, los sitios de restricción únicos Xba\ y Pmel se crearon en la región intergénica P.M. mediante mutagénesis dirigida al sitio. Posteriormente, un enlace sintético (GCTCTAGATAAGAAAAAATACGGGTAGAAGTTTAAACGGCGCGC CGG) que codifica la secuencia de una caja fin-inicio de NDV (en negritas) se insertó entre el sitio Xba\ y Pmel (subrayado) del constructo de longitud completa.

Para modificar el sitio de división polibásico de la proteína FO en el motivo monobásico (GRQGR|L; creando FAPBC), el gen F de Herts se amplificó de pFL-HertsAF utilizando los pares del cebador pAscl(Herts) (5'TTGGCGCGCCCCAGGTGCAAGATGGGC 3') junto con N043 (5' TTTACTAGTTTACGAAAAGTATTGGATTTGTGCCCC 3'), y N044 (5' GGAGGGAGACAGGGACGCCTTATAGGTGCCATTATCG 3') junto con pFsel(Herts) (5' CCCGATTGAGGGCCGGCCTCCCC 3'). Para fusionar ambos fragmentos de PCR, una segunda PCR se realizó utilizando los cebadores pAscl(Herts) y pFsel(Herts). El producto de PCR resultante se restringió con Ascl y Fsel e insertado entre el sitio Ascl y Fsel de pFL-Herts creando pFL-HertsAPBC.

El ARN viral se extrajo del virus H5N1 AVietnam/1194/2004 (NIBRG14) utilizando un kit High Puré Viral RNA (Roche). A partir del ARN viral extraído, el cADN se generó utilizando Superscript II (Invitrogen) y el cebador CAI085 (5' AGCAAAAGCAGG 3'), que iguala la región de no codificación de cada segmento. Posteriormente, el gen de HA fue amplificado por PCR utilizando el cebador pMT036 (AGCTTTGTTTAAACAATGGAGAAAATAGTGCTTCTTTTTGC : Sitio Pmel subrayado) y pMT038 (CCGGCGCGCCGTTTAAACTTAAATGCAAATTCTGCATTGTAAC: Sitio Pmel subrayado). Se subclonó cADN de HA en el plásmido pGEM-Teasy (Promega). Se digirió este vector con Pmel y clonó el gen HA en pFL-HertsAPBC generando pFL-HertsAPBC-H5.

Para crear pFL-HertsAPBC-H53, se utilizó el vector de expresión pCD5-sH53 (Cornelissen et al. 2010). En este vector, la secuencia H5 se precedió con una secuencia de codificación de péptido de señal y seguido por las secuencias que codifican para el motivo de trimerización de cremallera de isoleucina GCN4 (Harbury et al. 1993) y la etiqueta Strep II. Se digirió el vector con Pmel y el inserto liberado se unió con el pFL-HertsAPBC digerido con Pmel. El vector pCD5 se había generado tal que un sitio de restricción Pmel esté presente corriente arriba desde la secuencia del péptido señal y corriente abajo de la etiqueta Strep, y el tamaño del genoma se conformó con "la regla de seis" (de Leeuw et al. 1999) después de la inserción de la digestión con Pmel.

Se generaron todos los plásmidos de acuerdo con los procedimientos estándar (Sambrook et al., 1989). Se realizó el análisis de secuencia de regiones modificadas en todos los constructos generados mediante PCR para verificar que no se hubieran introducido ninguno de los cambios inadvertidos.

Recuperación de NDV recombinante Se generó el NDV recombinante mediante genética inversa tilizando el sistema de ARN polimerasa FPV-T7 como se describió (Peeters et al., 1999). Brevemente, se infectaron células VERO crecidas a subconfluencia en placas de 6 pozos con FPV-T7 y transfectaron con el constructo de longitud completa y los plásmidos auxiliares que expresan NP, P y L. Se cosechó el sobrenadante después de 6 días de incubación a 37°C, se clarificó mediante centrifugación de baja velocidad y se filtró a través de un filtro de 0.2 µ?. Se utilizó el filtrado para infectar cultivos celulares de VERO recientes. Después de la incubación durante 3 días en el medio que contiene 5% de fluido alantóico, se recolectó el sobrenadante e inoculó (0.2 mi) en la cavidad alantóica de huevos embrionados de pollo SPF de 9 a 11 días para amplificar el virus. Después de 3 días, se cosechó el fluido alantóicou se clarificó y se dividió en alícuotas. El virus recuperado de pFt-HertsAPBO-He3 se designó rN DV-H53 y el virus recuperado de pFL-HertsAPBO-H5 se designó como rNDV-HA. Se determinaron los títulos del virus (TCID5o mi 1) de las cosechas en células QM5 mediante el método de dilución de punto final y calcgló de acuerdo a Reed y Miinch (Reed y Munch, 1938. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am J Hyg 27: 493-497).

Tinción inmunológica intracelular La expresión de la proteína de HA mediante NDV recombinante en células QM5 se analizó mediante tinción inmunológica intracelular como se describió (Wensvoort et al., 1986). Para esto, las células se permeabilizaron, se fijaron con 3% de paraformaldehído e incubaron con anticuerpo monoclonal (mAb, por sus siglas en inglés) 15A6 anti-H5 (1:1000; Santa Cruz). Se utilizó mAb Anti-F 8E12A8C3 (1:5000; CVI, Lelystad) para la detección de la proteína NDV F. Se utilizó un conjugado de conejo-anti-ratón-HRPO (1:2000; IBA Alemania) como el anticuerpo secundario. Las monocapas de células infectadas con control sirvieron como controles negativos.

Producción y purificación de sH53 Se infectaron células QM5 crecidas a 90% de confluencia en matraces T75 con rNDV-sH53 en un MOI de 3. Después de 72 h de incubación a 37°C, se recolectó el sobrenadante (10 mi) y limpió mediante centrifugación de baja velocidad (10 minutos a 2500 rpm). Se ajustó el pH de la cosecha a 7.8 y se agregó avidina hasta una concentración final de 3 g/ml. Después de 4 h, se purificó la proteína recombinante sH53 utilizando gránulos de sefarosa Strep-tactina como se describió por el fabricante (IBA, Alemania). Se sometió el producto de purificación (15 µ?) a electroforesis de SDS-PAG (12% de Bis-Tris) utilizando amortiguador de activación de MOPS (Invitrogen) y proteínas se tiñó con el reactivo de tinción azul (Thermo Scientific). Se determinó la concentración de proteína sH53 con un espectrofotómetro de nanogota y también se calculó en gel utilizando una serie de albúmina de suero bobino (BSA, por sus siglas en inglés) de cantidades conocidas como referencia. índice de patogenicidad intracerebral La prueba de patogenicidad de pollo de estandardizada de Oficina Internacional de Epizootias (OIE, por sus siglas en inglés) se condujo bajo condiciones BSL3 y después de la aprobación por el Comité de Ética Animal. Diez pollos SPF de un día de edad se inocularon intracerebralmente con 0.1 mi de una dilución 1/10 del virus crecido en huevos NDV-HertsAPBC y observaron para los signos clínicos diarios durante un período de 10 días. Las aves recibieron una puntuación de 0 si mostraron ser normales, 1 si estaban enfermos, 2 en caso de enfermedad severa y 3 si morían. El índice de patogenicidad intracerebral (ICPI, por sus siglas en inglés) se calculó como la puntuación promedio por ave por observación, como se describió en la Directiva del Consejo de la Comunidad Europea 92/66/EEC (1992). Un índice de 3.0 se entiende como que todas las aves murieron en el plazo de 24 horas.

Vacunación de pollos v desafío del virus homólogo Se condujo el estudio animal bajo condiciones de BSL3 y después de la aprobación por el Comité de Ética Animal. Los pollos de SPF White Leghorn (Charles River Laboratories, Alemania), de 6 semanas de edad, se utilizaron en este estudio.

Se vacunaron diez pollos por grupo mediante la ruta intramuscular (i.m.¡ de 0.5 mi) con 107 de TCID50 del virus de vacuna. Además, un grupo de 10 pollos se vacunó i.m. con 5 g de proteína recombinante sH53(NDV) complementado con Stimune (Prionics, Lelystad). Otro grupo de 10 pollos recibió un volumen igual de PBS en Stimune (i.m.) para servir como un control vacunado con control. Tres semanas después de la vacunación, todas las aves se desafiaron mediante inoculación intranasal (0.1 mi) e intratraqueal (0.1 mi) en total 105 de TCID50 de virus H5N1 A/Vietnam/1194/04. Se monitorearon los pollos durante los próximos 10 días para las señales de enfermedad y mortalidad. Recibieron una puntuación de 0 si mostraron ser normales, 1 si estuvieron enfermos, 2 en caso de que estuvieron severamente enfermos y 3 si se sacrificaron o murieron, y se inspeccionaron dos veces al día, siempre y cuando se observó una enfermedad severa. Las aves que fueron renuentes a moverse en respuesta a la manipulación o fueron incapaces de alcanzar la alimentación y agua se sacrificaron. Se calculó el índice clínico como se describió anteriormente para el ICPI. Se recolectaron las muestras de sangre 3 semanas después de la inmunización.

Detección del anticuerpo Hl El suero inmune preparado inactivado por calor de muestras de sangre de pollo se diluyó en serie en medio de cultivo celular en etapas dobles. Se probaron las muestras para actividad de inhibición de hemoaglutinación (Hl, por sus siglas en inglés) utilizando 1% de glóbulos rojos de pollo y 4 unidades hemaglutinantes (HAU, por sus siglas en inglés) de H5N1 A/Vietnam/1194/04. Para la determinación de anticuerpos de Hl de NDV-específico se utilizaron 8 HAU del virus Herts/33. Se contabilizó la formación del botón rojo como evidencia de la hemoaglutinación. Se expresaron los títulos del anticuerpo como el recíproco de la dilución mayor de suero que mostró el Hl.

Resultados Virulencia del virus HertsAPBC El sitio de división de la proteína FO es el determinante principal de la virulencia de NDV (de Leeuw et al., 2005). En cepas velogénicas de NDV, tal como Herts/33, el sitio de división tiene comúnmente un motivo del aminoácido polibásico que puede dividirse mediante proteasas intracelulares, que permiten que el virus crezca en órganos múltiples. Para generar virus atenuados, el sitio polibásico de división (PBC, por sus siglas en inglés) del gen FO de pFL-Herts se modificó en un motivo monobásico de división. Para confirmar la naturaleza atenuada del virus recuperado de este constructo, se probó su patogenicidad in vivo. Con este fin, diez pollos recibieron 0.1 mi de virus mediante inyección intracerebral. El cálculo de las puntuaciones clínicas después de 10 días de observación reveló un I C P I de 0.04, demostrando que la modificación del PBC de hecho había convertido el virus en un patotipo lentogénico.

Propagación de rNDV-sH53 y expresión de la proteína sH53 El virus rNDV-sH53 podrá recuperarse fácilmente en la transfección de pFL-HertsAPBC-H53 en células VERO y hacerse crecer hasta altos títulos en huevos embrionados de pollo y en la línea de células Q 5. El fluido alantóico de huevos infectados produjo un título de 8.5 y el sobrenadante de células QM5 un título 7.5 log de TCID50 mi-1. El virus de vacuna de rNDV HAS cultivado en huevo tiene un título de 7.5 de registro de TCID50 mi 1 Para confirmar la expresión de HA, células Q 5 crecidas en placas de 6 pozos se infectaron con el virus de vacuna rNDV-sH53 cultivado en huevo o infectadas con control. Como controles para la expresión de proteína, las células se infectaron con wt NDV (Herts) o rNDV-HA. A 2 días p.i. (después de infección), las monocapas se sometieron a tinción inmunológica utilizando mAbs específicos para F y Ha. Como se muestra en la figura 11B, la monocapa se tiñó positiva a la proteína F después de la infección con wt NDV o con el virus recombinante quimérico de NDV, pero no después de la infección con el control (Fig. 11B). Las monocapas de célula infectadas con NDV-H5 y NDV-sH53, pero no wt NDV, se tiñeron positivas a HA. Estos resultados demuestran que la proteína HA se expresó mediante NDV-SH53. La infección con NDV-sH53 dio un patrón de tinción claro pero menos intenso y más difuso comparado al observado en células infectadas con NPV-HA, probablemente debido a que la proteína sH53 no se acumula en las células, pero se secreta.

Producción y purificación de la proteína sH53 expresada por NDV Se purificó la proteína sH53 a partir del sobrenadante de células QM5 infectadas con NDV-sH53, utilizando gránulos de Strep-tactina. Se analizó el producto de purificación mediante SDS-PAGE, seguido por tinción Azul. Como muestra la figura 11C, el sH53(NDV) apareció como una banda de ~70 kDa, emigrando algo más lento que la proteína sH53 producida por HEK 293S. De acuerdo con una serie de cantidades conocidas de BSA que se activaron en el mismo gel, el rendimiento de la proteína sH53 purificada se calculó como 0.6-0.7 mg por 100 mi. Se confirmó la naturaleza trimérica del oligómero H5 utilizando electroforesis en gel de Azul-nativo (Fig. 11D).

Vacunación de pollos con proteína NDV-SH53 o sH53 Para examinar la inmunogenicidad de sH53 (NDV, por sus siglas en inglés) y el potencial de NDV-sH53 como una vacuna viva, se vacunaron diez pollos intramuscularmente (i.m.). Para examinar la eficacia protectora de la proteína sH53 producida en células QM5 infectadas con NDV-sH53, un grupo de diez pollos se vacunó i.m. con la proteína complementada con Stimune. Otras 10 aves se vacunaron con control para servir como controles de desafío. Tres semanas después de la vacunación, todos los pollos se desafiaron con una dosis letal del virus homólogo H5N1. Como se esperó sobre la base del ICPI, ningunos de los pollos mostró signos clínicos tras la vacunación.

El porcentaje de pollos que sobreviven a la infección y puntuaciones clínicas por grupo observado después del desafío se muestran en la figura 12A. La inmunización intramuscular con la proteína NDV-sH53 o sH53 confirió protección completa. Todos los pollos vacunados sobrevivieron y ninguno mostró síntomas indicativos de enfermedad relacionada a la influenza, mientras que todos los pollos vacunados con control sucumbieron en 2 días.

Las muestras de sangre se recolectaron 3 semanas después de la inmunización y ensayaron para la presencia de anticuerpos de Hl dirigidos contra NDV y virus de la influenza. El ensayo de Hl reveló que la vacunación i.m. podría generar una inmunorespuesta. Los títulos del anticuerpo Hl detectados después de la vacunación i.m. con la proteína NDV-sH53 o sH53 alcanzaron niveles entre 12 y 256 (Fig. 13A), comparables a los detectados en pollos vacunados con NDV-HA, que fueron aparentemente suficientes para proteger todos los animales contra la infección letal. Ninguno de los anticuerpos Hl fueron detectables en pollos vacunados con control.

Todos los pollos que se vacunaron con rNDV-H53 mostraron una inmunorespuesta a NDV, mientras que los pollos que recibieron una inyección i.m. de sH53 desarrollaron solamente títulos del anticuerpo de la influenza Hl, como se esperó. Los títulos del anticuerpo NDV Hl de los grupos vacunados con NDV-sH53 alcanzaron el mismo nivel que los títulos de los grupos vacunados con NDV-HA (Fig. 13B). Esto sugiere que NDV-HA y NDV-sH53 replicaron igualmente bien en los pollos. La protección conferida contra NDV no se ha determinado, pero los títulos de NDV Hl son suficientemente altos para asumir que la vacunación también proporciona protección contra NDV.

Referencias Antin, P. B. & Ordahl, C. P. (1991). Isolation and characterization of an avian myogenic cell line. Dev Biol 143, 111-121.

Britton, P., Green, P., Kottier, S., Mawditt, K. L., Penzes, Z., Cavanagh, D. & Skinner, M. A. (1996). Expression of bacteriophage T7 RNA polymerase in avian and mammalian cells by a recombinant fowlpox virus. J Gen Virol 77, 963-970.

Bukreyev, A., Skiadopoulos, M. H., Murphy, B. R. & Collins, P. L. (2006). Nonsegmented negative-strand viruses as vaccine vectors. J Virol 80, 10293-10306.

Chen J, Deng YM. Influenza virus antigenic variation, host antibody production and new approach to control epidemics. Virol J. 13 de marzo de 2009; 6:30.

Colman PM. Influenza virus neuraminidase: structure, antibodies, and inhibitors. Protein Sci. 1994; 3(10):1687-96.

Cornelissen, L. A. H. M., de Vries, R. P., de Boer-Luijtze, E. A., Rigter, A., Rottier, P. J. M. & de Haan, C. A. M. (2010). A Single Immunization with Soluble Recombinant Trimérico Hemagglutinin Protects Chickens against Highly Pathogenic Avian Influenza Virus H5N1. PLoS ONE 5, el0645. doi: 10.1371.

De Leeuw 0, Peeters B. (1999) Complete nucleotide sequence of Newcastle disease virus: evidence for the existence of a new genus within the subfamily Paramyxovirinae. J Gen Virol. 80 (Pt 1): 131-6.

De Leeuw, 0. S., Koch, G., Hartog, L., Ravenshorst, N. & Peeters, B. P. H. (2005). Virulence of Newcastle disease virus is determined by the cleavage site of the fusión protein and by both the stem región and globular head of the hemagglutinin-neuraminidase protein. J Gen Virol 86, 1759-1769.

DiNapoli, J. ., Kotelkin, A., Yang, L, Elankumaran, S., Murphy, B. R., Samal, S. K., Collins, P. L. & Bukreyev, A. (2007). Newcastle disease virus, a host range-restricted virus, as a vaccine vector for intranasal ¡mmunization against emerging pathogens. Proc Nati Acad Sci USA 104, 9788-9793.

Ducatez MF, Webster RG, Webby RJ. Animal influenza epidemiology. Vaccine. 2008 Sep 12;26 Suppl 4:D67-9.

Ekiert DC, Bhabha G, Elsliger MA, Friesen RH, Jongeneelen M, Throsby M, Goudsmit J, Wilson IA. Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope. Science. 2009; 324(5924):246-51.

Frank, A. L., J. Puck, B. J. Hughes, and T. R. Cate. 1980. Microneutralization test for influenza A and B and parainfluenza 1 and 2 viruses that uses continuous cell lines and fresh serum enhancement. J Clin Microbiol 12:426-32.

Gocnik M, Fislova T, Mucha V, Sladkova T, Russ G, Kostolansky F, Vareckova E. Antibodies induced by the HA2 glycopolypeptide of influenza virus haemagglutinin improve recovery from influenza A virus infection. J Gen Virol. 2008 Apr; 89(Pt 4):958-67.

Harbury, P. B. , T. Zhang, P. S. Kim, and T. Alber. 1993. A switch between two-, three-, and four- stranded coiled coils in GCN4 leucine zipper mutants. Science 262:1401-7.

Karber, G. 1931. Beitrag zur kollektiven behandlung pharmakologischer reihenversuche Exp. Pathol. Pharmakol. 162:480-483.

Khanna M, Kumar P, Choudhary K, Kumar B, Vijayan VK. Emerging influenza virus: a global threat. J Biosci. Noviembre 2008; 33(4):475-82.

Kong WP, Hood C, Yang ZY, Wei CJ, Xu L, García- Sastre A, Tumpey TM, Nabel GJ. Protective immunity to lethal challenge of the 1918 pandemic influenza virus by vaccination. Proc Nati Acad Sci U S A. 24 de octubre de 2006; 103(43): 15987-91.

Lambre, C. R., H. Terzidis, A. Greffard, and R. G. Webster. 1991. An enzyme-linked lectin assay for sialidase. Clin Chim Acta 198:183-93.

Li, W., M. J. Moore, N. Vasilieva, J. Sui, S. K. Wong, M. A. Berne, M. Somasundaran , J. L. Sullivan, K. Luzuriaga, T. C. Greenough, H. Choe, and M. Farzan. 2003. Angiotensin-converting enzyme 2 is a functional receptor for the SARS coronavirus. Nature 426:450-4.

Lipatov AS, Govorkova EA, Webby RJ, Ozaki H, Peiris M , Guan Y, Poon L, Webster RG. Influenza: emergence and control. J Virol. Septiembre de 2004; 78(17):8951 -9.

Munster, V. J., E. de Wit, J. M. van den Brand, S. Herfst, E. J. Schrauwen, T. M. Bestebroer, D. van de Vijver, C. A. Boucher, M. oopmans, G. F. Rimmelzwaan, T. Kuiken, A. D. Osterhaus, and R. A. Fouchier. 2009. Pathogenesis and transmission of swine-origin 2009 A(H1N1) influenza virus in ferrets. Science 325:481-3.

Niwa H, Yamamura K, Miyazaki J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 1991; 108(2): 193-9.

Palmer D, D. W., Coleman M, Schild G. 1975. Haemagglutination inhibition test., Atlanta: US Department of Health, Education and Welfare.

Pancera M, Lebowitz J, Schon A, Zhu P, Freiré E, Kwong PD, Roux KH, Sodroski J, Wyatt R. Soluble mimetics of human immunodeficiency virus type 1 viral spikes produced by replacement of the native trimerization domain with a heterologous trimerization motif: characterization and ligand binding analysis. J Virol. Agosto de 2005; 79(15):9954-69.

Peeters, B. P. H., de Leeuw, O. S., Koch, G. & Gielkens, A. L. (1999). Rescue of Newcastle disease virus from cloned cDNA: evidence that cleavability of the fusión protein is a major determinan, for virulence. J Virol 73, 5001-5009.

Pouyani T, Seed B. PSGL-1 recognition of P-selectin is controlled by a tyrosine sulfation consensus at the PSGL-1 amino terminus. Cell. 1995; 83(2):333-43.

Reeves PJ, Hwa J, Khorana HG. Structure and function in rhodopsin: kinetic studies of retinal binding to purified opsin mutants in defined phospholipid-detergent mixtures serve as probes of the retinal binding pocket. Proc Nati Acad Sci U S A. Marzo de 19992; 96(5): 1927-31.

Rimmelzwaan, G. F., M. Baars, E. C. Claas, and A. D. Osterhaus. 1998. Comparison of RNA hybridization , hemagglutination assay, titration of infectious virus and immunofluorescence as methods for monitoring influenza virus replication in vitro. J Virol Methods 74:57-66.

Saelens X, Vanlandschoot P, Martinet W, Maras M, Neirynck S, Contreras R, Fiers W, Jou WM. Protection of mice against a lethal influenza virus challenge after immunization with yeast-derived secreted influenza virus hemagglutinin. Eur J Biochem. Febrero de 1999; 260(1): 166-75.

Sambrook, J., Fritsch, E. F. & Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2a edición. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory.

Skehel JJ, Wiley DC. Receptor binding and membrane fusión in virus entry: the influenza hemagglutinin. Annu Rev Biochem. 2000; 69:531-69.

Song L, Nakaar V, Kavita U, Price A, Huleatt J, Tang J, Jacobs A, Liu G, Huang Y, Desai P, Maksymiuk G, Takahashi V, Umlauf S, Reiserova L, Bell R, Li H, Zhang Y, McDonald WF, Powell TJ, Tussey L. Efficacious recombinant influenza vaccines produced by high yield bacterial expression: a solution to global pandemic and seasonal needs. PLoS One. Mayo de 2008 21; 3(5):e2257.

Song L, Zhang Y, Yun NE, Poussard AL, Smith JN, Smith JK, Borisevich V, Linde JJ, Zacks MA, Li H, Kavita U, Reiserova L, Liu X, Dumuren K, Balasubramanian B, Weaver B, Parent J, Umlauf S, Liu G, Huleatt J, Tussey L, Paessler S. Superior efficacy of a recombinant flagellin: H5NI HA globular head vaccine is determined by the placement of the globular head within flagellin. Vaccine. Septiembre de 200925; 27(42):5875-84.

Stevens J, Blixt O, Tumpey TM, Taubenberger JK, Paulson JC, Wilson IA. Structure and receptor specificity of the hemagglutinin from an H5N1 influenza virus. Science. 2006; 312(5772):404-10.

Wei CJ, Xu L, Kong WP, Shi W, Canis K, Stevens J, Yang ZY, Dell A, Haslam SM, Wilson IA, Nabel GJ. Comparative efficacy of neutralizing antibodies elicited by recombinant hemagglutinin proteins from avian H5N1 influenza virus. J Virol. Julio de 2008; 82(13):6200-8.

Wensvoort, G., Terpstra, C, Boonstra, J., Bloemraad, M. & Van Zaane, D. (1986). Production of monoclonal antibodies against swine fever virus and their use in laboratory diagnosis. Vet Microbiol 12, 101-108.

Zeng Q, Langereis MA, van Vliet AL, Huizinga EG, de Groot RJ. Structure of coronavirus hemagglutinin- esterase offers insight into corona and influenza virus evolution. Proc Nati Acad Sci U S A. 1 de julio de 2008; 105(26):9065-9.

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Una composición inmunogenética que comprende por lo menos un ectodominio recombinante multimérico de una proteína del virus de la influenza o parte del mismo fusionada a una etiqueta de afinidad por estreptavidina, y un diluyente farmacéuticamente aceptable.

2. La composición inmunogenética de acuerdo con la reivindicación 1, donde el ectodominio recombinante multimérico de una proteína del virus de la influenza o parte del mismo se selecciona del grupo que consiste de un ectodominio recombinante trimérico de hemaglutinina de la influenza o parte del mismo y un ectodominio recombinante tetramérico de neuraminidasa de la influenza o parte del mismo.

3. La composición inmunogenética de acuerdo con la reivindicación 2, en la que la trimerización del ectodominio recombinante de hemaglutinina de la influenza o parte del mismo es proporcionada por un dominio de trimerización basado en GCN4.

4. La composición inmunogenética de acuerdo con la reivindicación 2, en la que la tetramerización del ectodominio recombinante de neuraminidasa de la influenza o parte del mismo es proporcionada mediante un dominio de tetramerización basado en GCN4.

5. a composición inmunogenética de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que comprende además un portador y/o un adyuvante.

6. Un vector que comprende un módulo de expresión, que comprende: a) una secuencia del ácido nucleico que codifica una secuencia de señal; b) una secuencia del ácido nucleico que codifica un ectodominio recombinante de una proteína del virus de la influenza o parte de la misma; c) una secuencia del ácido nucleico que codifica una secuencia de trimerización o tetramerización, y; d) una secuencia del ácido nucleico que codifica una etiqueta de afinidad por estreptavidina.

7. Una composición inmunogenética que comprende el vector de acuerdo con la reivindicación 6, y un diluyente farmacéuticamente aceptable.

8. La composición inmunogenética de acuerdo con la reivindicación 7, donde el vector es un vector viral, tal como el vector derivado del virus de la enfermedad de Newcastle.

9. La composición inmunogenética de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, 7 y 8, para uso como una vacuna.

10. Uso del vector de acuerdo con la reivindicación 6, para la preparación de una composición inmunogenética para producir una inmunorespuesta contra un virus de la influenza.

11. Un método para la preparación de una composición inmunogenética de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que comprende: a) proporcionar el vector de acuerdo con la reivindicación 6; b) transformar una célula hospedadora con el vector de expresión; c) cultivar la célula hospedadora en un medio de cultivo, permitiendo de tal modo la expresión del ectodominio recombinante multimérico de una proteína del virus de la influenza o parte del mismo, fusionado a una etiqueta de afinidad por estreptavidina ; d) aislar el ectodominio recombinante multimérico de una proteína del virus de la influenza o parte del mismo fusionada a una etiqueta de afinidad por estreptavidina, preparando así una composición inmunogenética.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 11, donde ectodominio recombinante multimérico de una proteína del virus de la influenza o parte del mismo, fusionado a una etiqueta de afinidad por estreptavidina, se aisla utilizando la etiqueta de la afinidad por estreptavidina.

13. Un método para producir una inmunorespuesta contra un virus de la influenza en un individuo que comprende administrar al individuo una composición inmunogenética de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

14. El método de acuerdo con la reivindicación 13, donde el individuo es un mamífero o un ave.