MX2012010364A - Antagonistas de los receptores beta-adrenérgicos y usos de los mismos. - Google Patents

Abstract

Se proporcionan en la presente, métodos para mejorar la función en una célula retinal asociada con una condición diabética y para tratar una condición retinopática diabética en un sujeto. Los métodos comprenden contactar la célula retinal o administrar al sujeto, un combatiente de receptor beta-adrenérgico tal como los que tienen la fórmula estructural química (I): en donde R1 es (CH2)n(CH3)2 o la fórmula (II) en donde n es 1 a 4, R2 es H o H·HX, en donde X es un haluro y R3 es O(CH2)mCH3 en uno o más de C2-C6, en donde m es 0 a 4. También se proporcionan los combatientes BAR que tienen la estructura en donde R1 es el sustituyente (CH2)n-fenil-R2 y la porción hidroxi-benceno es 1,2-benceno diol o 1,3-benceno diol.

Description

AGONISTAS DE LOS RECEPTORES BETA-ADRENÉRGICOS Y USOS DE LOS MISMOS REFERENCIA CRUZADA CON SOLICITUDES RELACIONADAS La presente solicitud internacional reclama el beneficio de prioridad de conformidad con 35 U.S.C. sección 119{e) de la solicitud provisional de los EE.UU. No. de Serie €1/339,679, presentada el 8 de marzo de 2010, ahora abandonada, cuya totalidad se incorpora aquí como referencia.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Campo de la Invención La presente invención se relaciona con los campos de la diabetes y enfermedades de los ojos. Específicamente, la presente invención proporciona compuestos y métodos para tratar la retinopatía diabética preproliferativa.

Descripción de la Técnica Relacionada La retinopatía diabética es la causa principal de ceguera en adultos en edad laboral. Casi todos los diabéticos muestran algunos signos de retinopatía dentro de 20 años de diagnóstico. El costo para los EE.UU. en salud para pacientes diabéticos fue de $174 mil millones tan sólo en 2007. La principal característica de la retinopatía diabética humana, asi como de modelos de animales de la enfermedad; incluyen mayores marcadores inflamatorios gliales y muerte de células neuronales que dan como resultado la pérdida de la visión. Aunque la terapia de insulina puede hacer más lento el avance general de la enfermedad, los mecanismos de regulación de insulina en la retina siguen sin aclararse y no existe un tratamiento dirigido para evitar la pérdida de la visión.

Desde los años 70 se han puesto en uso clínico tratamientos mínimos para la retinopatía diabética, ninguno de ellos diseñado para dirigirse a la retinopatía diabética preproliferativa. El tratamiento actual para la fase proliferativa de la retinopatía diabética es la fotocoagulación con láser, la cual es efectiva en las fases posteriores de la retinopatía diabética proliferativa . Muchos pacientes diabéticos e hipertensos se someten a antagonistas de receptores ß-adrenérgicos y esto es efectivo en la reducción de la presión sanguínea. Sin embargo, no han habido estudios profundos de los efectos de estos agentes en la retina humana.

Un reporte en roedores sugiere que los antagonistas de los receptores ß-adrenérgicos tuvieron poco efecto en la retina (1) . En contraste, otros estudios que utilizan un antagonista de receptor ß-adrenérgico dado sistemáticamente a roedores, mostró que el propranolol, un antagonista de receptor ß-adrenérgico comúnmente utilizado, produjo disminuciones significativas en la actividad eléctrica en la retina ¡ activó los factores de crecimiento que pueden promover la neovascularización (2).

Los mediadores inflamatorios son factores clave en la retinopatia diabética. La señalización del receptor de insulina es activada por la liberación de insulina. Los receptores ß-adrenérgicos modularon los niveles de proteina tanto de mediadores inflamatorios como de señalización de insulina. Particularmente, los niveles de TNFa se reducen por los agonistas de los receptores beta-adrenérgicos, en múltiples tipos de células de la retina.

Estos son enfoques limitados a la fase de tratamiento preproliferativo de la retinopatia diabética, que ocurre antes de desarrollarse el daño vascular. Sin embargo, esta es la fase más adecuada para el tratamiento dado que la visión teóricamente podría debilitarse antes del desarrollo de la ceguera permanente. Se han ofrecido numerosas hipótesis para explicar las patologías retinianas asociadas con la hiperglucemia, sin embargo ninguna se ha llevado al cuidado del paciente para la fase preproliferativa de la enfermedad. Parece razonable identificar los marcadores biológicos que reflejan las etapas tempranas del desarrollo de la enfermedad, de tal manera que el tratamiento pueda iniciarse antes del daño vascular irreversible.

Por lo tanto la técnica anterior carece de métodos efectivos y herramientas para el tratamiento de la retinopatia diabética preproliferativa . La presente invención cumple con esta necesidad y deseo que ha perdurado por largo tiempo en la técnica.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención está dirigida a un método para mejorar la función en una célula retiniana asociada con una condición diabética. El método comprende poner en contacto la célula con un agonista del receptor beta-adrenérgico (BAR, por sus siglas en inglés) , en donde el agonista del BAR aumenta la señalización de insulina y la proteina 3 de unión al factor de crecimiento semejante a la insulina (IGFBP-3, por sus siglas en inglés) y disminuye la apoptosis inducida por TNFa, mejorando asi la función en la célula retiniana. Los agonistas del BAR pueden tener la estructura química general: en donde R1 es (CH2)n(CH3)2 ó n es 1 a 4, R2 es H o ?·??, en donde X es un haluro es un haluro, y R3 es 0(CH2)mCH3 en uno o más de C2-C6, en donde m es 0 a 4.

La presente invención también está dirigida a un método para el tratamiento de una condición retinopática diabética en un sujeto. El método comprende administrar una o más veces una cantidad farmacológicamente efectiva de uno o más agonistas de los receptores ß-adrenérgicos (BAR) , o una composición farmacéutica del mismo al sujeto en donde el agonista mejora la función de células retinianas, tratando de esta manera la retinopatia diabética. La presente invención está dirigida a un método relacionado que comprende además administrar uno o más fármacos diabéticos o retinopáticos al sujeto. Los agonistas del BAR pueden tener la estructura química general descrita en la presente .

La presente invención está dirigida además a un agonista del receptor ß-adrenérgico que tiene la fórmula estructural química o una composición farmacéutica del mismo : en donde n es 1 a 4, R2 es H o ??? es un haluro, y R3 es 0(CH2)m H3 en uno o más de C2-C6, en donde m es 0 a 4.

Aspectos, características y ventajas diferentes y adicionales de la presente invención serán evidentes a partir de la siguientes descripción de las presentes modalidades preferidas de la invención que se ofrecen con el propósito de descripción.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Con la finalidad de que se alcancen y puedan entenderse detalladamente las características, ventajas y objetos antes mencionados de la invención así como otros que se aclararán, en los dibujos adjuntos se ilustran descripciones más particulares y ciertas modalidades de la invención que brevemente se resumieron arriba. Estos dibujos forman parte de la especificación. Sin embargo, se aprecia que los dibujos adjuntos ilustran modalidades preferidas de la invención y por lo tanto no se consideran que limitan su alcance.

La figura 1 ilustra los efectos del Compuesto 2 en la actividad de la PKA y la fosforilación de CREB, y muestra que 1 mM de este compuesto suministrado diariamente a ratas diabéticas aumentó significativamente la actividad de la PKA en la retina en comparación con 10 mM y sin efecto en las ratas de control (Fig. 1, P<0.05, vs. Ctrl y Diab+2, N=5) . Estos datos muestran que la administración tópica del Compuesto 2 llega a la retina e inicia la señalización celular normal.

Las Figuras 2A-2E ilustran formas de onda. La forma de onda representativa de 1 animal en cada uno de los grupos se registró utilizando ERG (Figura 2A) o potencial oscilatorio (OP, por sus siglas en inglés) (Figura 2B) . Las gráficas de líneas con las medias y desviación estándar para todos los animales en cada grupo se muestran a las intensidades de luz crecientes para la onda a (Figura 2C) , la onda b (figura 2D) y potenciales oscilatorios (Figura 2E) registrados usando ERG. Está claro que el Compuesto tópico 2 puede inhibir la pérdida de los tres componentes del ERG en todo el periodo de 8 meses. Las barras de error son SD media. Se midieron mensualmente las amplitudes de onda A y onda B y la amplitud de OCT en cada grupo mediante análisis de electrorretinograma (ERG) . Los datos se presentan para animales con 2, 6 y 8 meses de diabetes. A pesar de que se observó una pequeña diferencia entre las amplitudes de ERG de las ratas de control y de aquellas que recibieron 1 mM del Compuesto 2 a los 2 y 8 meses, únicamente las ratas diabéticas mostraron una reducción significativa en la amplitud de onda a, onda b y amplitudes de potencial oscilatorio (Figuras 2A-2E, P<0.05 vs . Ctrl y Diab+2, N=6) . Los resultados indican que el tratamiento del Compuesto 2 fue capaz de mantener la actividad eléctrica normal en la retina a lo largo del experimento.

Las figuras 3A-3B comparan el espesor retiniano central y periférico y el número de células en la capa de células ganglionares en las ratas de control, las ratas diabéticas y las ratas diabéticas más el compuesto 2 y la imagen de los cuerpos de células fotorreceptoras, las células bipolares y las capas de células ganglionares en donde se administró el compuesto 2 como tratamiento preventivo (Figura 3A) y retardado (Figura 3B) . La imagen para, ratas diabéticas es más corta, dado que se reduce el espesor retiniano interno. Se ha demostrado que la diabetes disminuye el número de células y el espesor retiniano en 2 meses (Jiang y colaboradores, 2010) . Tanto en la retina tanto periférica como central, el espesor de la retina se redujo significativamente en ratas diabéticas que no recibieron tratamiento. El número de células en la capa de células ganglionares (GCL, por sus siglas en inglés) de las retinas periférica y central se redujo significativamente en ratas diabéticas en comparación con los animales de control o diabéticos+2 (P<0.05 vs. Ctrl y Diab+2, N=5) . El tratamiento con el Compuesto 2 mantiene el espesor retiniano y el número de células a pesar de la diabetes en la retina.

Las figuras 4A-4B muestran el efecto del compuesto 2 en el ojo. La figura 4A muestra el número de capilares degenerados por milímetro cuadrado de retina (P<0.05 vs. Ctrl y Diab+2, N=4). El tratamiento con gotas oftalmológicas redujo significativamente el número de capilares degenerados en ratas diabéticas. En la figura 4B se muestra el número de fantasmas de pericitos por 1,000 capilares (P<0.05 vs. Ctrl y Diab+2, N=4).

Las figuras 5A-5B muestran que el compuesto 2 redujo significativamente los niveles de la actividad de la TNFOÍ in vitro. El mismo compuesto se examinó in vivo como causante de la disminución de los niveles de marcadores inflamatorios en ratas diabéticas. Las figuras 5A-5B muestran la actividad de la TNF en la retina a los 2 meses (Figura 5A) (P<0.05 vs . Ctrl y Diab+2, N=6) y 8 meses (Figura 5B) de diabetes revelado por análisis ELISA (P<0.05 vs. Ctrl y Diab+2, N=€) .

Las figuras 6A-6D muestran un análisis del método de transferencia Western y una gráfica de barras de la relación del receptor beta de la insulina fosforilada con respecto al receptor beta de la insulina total en la retina de rata de 2 meses (Figura 6A, P<0.05 vs . Ctrl y Diab+2, N=5) y 8 meses (Figura 6B, P<0.05 vs . Ctrl y Diab+2, N=5) . La relación global se reduce sustancialmente a los 8 meses de tratamiento o añej amiento de control. Se muestran análisis del método de transferencia Western y una gráfica de barras de la relación de Akt fosforilada a Akt total en la retina de rata de 2 meses (Figure 6C, P<0.05 vs . Ctrl y Diab+2, N=5) y 8 meses (Figura 6D, P<0.05 vs . Ctrl y Diab+2, N=5) . La relación global se reduce sustancialmente a los 8 meses de tratamiento o añej amiento de control.

Las figuras 6E-6H muestran el efecto del compuesto 2 en la relación de fosfo-AKT a AKT total. Las figuras 6E-6F: Fosforilación de Akt en todos los lisatos retiñíanos en 2 meses de diabetes (izquierda) y 8 meses de diabetes (derecha) . Se inició el tratamiento en el momento de la medición de glucosa inicial > 250 mg/dl. Figuras 6G-6H, algunos animales se hicieron diabéticos sin intervención por 6 meses. A los 6 meses, se inició un subconjunto de los animales diabéticos con 1 mM del compuesto tópico 2. A los 8 meses de diabetes (2 meses con Compuesto 2) ó 12 meses de diabetes y 6 meses con Compuesto 2, se midió la fosforilación de Akt en ratas de control, diabéticas, y diabéticas+tratadas con compuesto 2.

Las figuras 7A-7B muestran el análisis ELISA de caspasa escindida a los 2 meses (Figura 7A) y 8 meses (Figura 7B) . Está claro que la apoptosis aumenta en la retina en todos los grupos a los 8 meses. *P<0.05 vs . Ctrl y Diab+49b; N=4 en cada grupo a cada edad.

La figura 8 muestra la estructura química del isoproterenol 1 ( - [ l-hidroxi-2- ( isopropilamino) etil] benceno-1, 2-diol, Compuesto 49b clorhidrato de 4-(l-hidroxi-2- [3,4, 5-trimetoxi-fenil) -etilamino] -etil) -benceno-1, 2-diol y el Compuesto 4 clorhidrato de 5- ( l-hidroxi-2- [2-(3, 4, 5-trimetoxi-fenil) -etilamino] -etil) -benceno-1, 3-diol .

Las figuras 9A-9B muestran el tratamiento de células de üller cultivadas en alto contenido de glucosa con 10, 50 y 100 nM del Compuesto 2. El tratamiento con el Compuesto 2 redujo significativamente los niveles de caspasa 3 escindida (Figura 9A, P<0.05 vs. NT-HG, N=4) y TNFa a 50 nM en comparación con el tratamiento con isoproterenol, que requirió 10 uM para la misma respuesta (Figura 9B, P<0.05 vs. NT-HG, N=4).

Las figuras 10A-10B muestran el tratamiento de células REC con 10, 50 y 100 nM del Compuesto 2. El tratamiento con el Compuesto 2 redujo significativamente los niveles de caspasa 3 escindida (Figura 10A, P<0.05 vs. NT-HG, N=4) y TNFa (Figura 10B, P<0.05 vs . NT-HG, N=4) después de 30 y 60 minutos en comparación con el tratamiento con isoproterenol.

La figura 11 muestra el efecto en ratas diabéticas de tipo I tratadas diariamente con 1 mM del Compuesto 2.

Las figuras 12A-12B muestran que el tratamiento de células de Müller con 50 nM de Compuesto 3 redujo la escisión de la caspasa 3 (Figura 12A) vs. células no tratadas en 1 hora y redujo significativamente la TNFa en 1 hora en comparación con células no tratadas (Figura 12B) .

Las figuras 13A-13B muestran que el tratamiento de células REC con 50 nM del Compuesto 3 redujo la escisión de la caspasa 3 (Figura 13A) y TNFa (Figura 13B) vs . células no tratadas en 1 hora.

Las figuras 14A-14B muestra los efectos del isómero R del compuesto 2 (50 nM) , el isómero S del compuesto 2 (50 nM) y el compuesto racémico 2 en 1 hora ó 24 horas de . tratamiento en la concentración de TNFalfa en células de Müller y endoteliales retinianas.

Las figuras 15A-15B muestra los efectos del isómero R del compuesto 2 (50 nM) , el isómero S del compuesto 2 (50 nM) y el compuesto racémico 2 en 1 hora ó 24 horas de tratamiento en la concentración de caspasa 3 en células de Müller y endoteliales retinianas.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE IA INVENCIÓN Tal como se emplea en la presente, el término "un" o "una", cuando se usa junto con el término "comprende" en las reivindicaciones y/o la especificación, puede referirse a "uno", pero también es consistente con el significado de "uno o más", "por lo menos uno" y "uno o más de uno". Algunas modalidades de la invención pueden consistir o consisten esencialmente de uno o más elementos, etapas de método, y/o métodos de la invención. Se contempla que cualquier método o composición descritos en la presente se pueda implementar con respecto a cualquier otro método o composición descrita en la presente.

Tal como se emplea en la presente, el término "o" en las reivindicaciones se refiere a "y/o" a menos que explícitamente indique que se refiere a sólo alternativas o que las alternativas sean mutuamente exclusivas, aunque la descripción soporte una definición que se refiere a sólo alternativas y "y/o".

Tal como se emplea en la presente, el término "contacto" se refiere a cualquier método adecuado de poner uno o más agonistas de los receptores beta-adrenérgicos (BAR) descritos en la presente u otro agente inhibitorio o estimulatorio que mejore la función y/o estructura de las células retinianas o del tejido vascular retiniano en contacto con células retinianas, o un tejido que comprende las mismas, asociado con una condición diabética, tal como retinopatia diabética o retinopatia preproliferativa . In vitro o ex vivo se logra al exponer las células o te ido retiñíanos a los agonistas de los BAR en un medio adecuado. Para aplicaciones in vivo, es adecuado cualquier método conocido como se describe en la presente.

Tal como se emplea en la presente, los términos "cantidad efectiva" o "cantidad farmacológicamente efectiva" son intercambiables y se refieren a una cantidad que resulta en un retardo o prevención de la aparición de la condición retinopática asociada con la diabetes o resulta en un mejoramiento o remedio de los síntomas de la misma. Aquellos con experiencia en la técnica entienden que la cantidad efectiva puede mejorar la condición del paciente o sujeto, pero puede no ser una cura completa de la condición. Tal como se emplea en la presente, el término "sujeto" se refiere a cualquier objetivo del tratamiento.

En una modalidad de la presente invención se proporciona un método para mejorar la función en una célula retiniana asociada con una condición diabética, que comprende poner en contacto la célula con un agonista del receptor beta-adrenérgico (BAR) , en donde el agonista del BAR aumenta la señalización de insulina y disminuye la apoptosis inducida por TNFa, mejorando asi la función en la célula retiniana.

En esta modalidad el agonista del BAR puede tener la siguiente estructura química: en donde R1 es (CH2)n(C en donde n es 1 a ; R2 es H o ?·??, en donde X es un haluro; y R3 es 0(CH2)mCH3 en uno o más de C2-C6, en donde m es 0 a 4.

En un aspecto de esta modalidad R puede ser (CH2)n(CH3)2 y R2 puede ser H. En este aspecto el agonistas del BAR puede ser el compuesto 2. En otro aspecto R1 puede ser (CH2) 2~fenilo, R2 puede ser H o H'HCl y R3 puede ser 0(CH2)mCH3 en C3, C4 y C5. En este otro aspecto el agonista del BAR puede ser 4- [l-hidroxi-2- [3, 4, 5-trimetoxi-fenil ) -etilamino] -etil) -benceno-1, 2-diol , clorhidrato de 4-(l-hidroxi-2- [3,4, 5-trimetoxi-fenil ) -etilamino] -etil ) -benceno-1, 2-diol, 5- (l-hidroxi-2- [2- (3, 4, 5-trimetoxy-fenil ) -etilamino] -etil) -benceno-1, 3-diol, ó clorhidrato de 5-(l-hidroxi-2- [2- (3,4, 5-trimetoxi-fenil ) -etilamino] -etil) -benceno-1, 3-diol. En todos los aspectos y modalidades la célula retiniana puede ponerse en contacto in vitro o in vivo. También, la condición diabética puede ser retinopatía diabética, retinopatía diabética preproliferativa u otras condiciones hiperglucémicas .

En otra modalidad de la presente invención se proporciona un método para tratar una condición retinopática diabética en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una o más veces una cantidad farmacológicamente efectiva de uno o más agonistas del receptor beta-adrenérgico (BAR) , en donde el agonista mejora la función de células retinianas, tratando de esta manera la retinopatía diabética. Además de esta modalidad el método comprende administrar al sujeto uno o más fármacos diabéticos o retinopáticos . En esta modalidad adicional los fármacos pueden administrarse concurrentemente o secuencialmente con el (o los) receptor (es) beta-adrenérgico ( s) .

En ambas modalidades los agonistas de los receptores beta-adrenérgicos pueden ser como se describió anteriormente. También, en ambas modalidades la condición retinopática diabética puede ser retinopatia preproliferativa . Además, los agonistas de los receptores beta-adrenérgicos pueden comprender una composición farmacéutica con un portador farmacéuticamente aceptable, el cual es adecuado para la administración tópica, subconjuntiva o intravenosa.

En otra modalidad de la presente invención se proporciona un agonista del receptor beta adrenérgico que tiene la fórmula estructural química: en donde n es 1 a 4 y R2 es 0(CH2)mCH3 en uno o más de C2-C€, en donde m es 0 a 4. Ejemplos estructurales químicos particulares del agonista del BAR son: En una modalidad relacionada, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende el agonista del receptor ß-adrenérgico como se describe arriba y un portador farmacéuticamente aceptable.

Existe un traslape inesperado entre el receptor de insulina y la señalización del receptor ß-adrenérgico . De manera importante una mayor señalización del receptor ß-adrenérgico puede compensar la pérdida de señalización de insulina en la diabetes, como se demuestra por la disminución en la muerte celular apoptótica en ratas diabéticas después del tratamiento con agonistas de los receptores ß-adrenérgicos . Los mecanismos celulares involucrados pueden incluir un efecto compensatorio directo de señalización del receptor beta-adrenérgico en la muerte celular o alternativamente, una prevención de la inhibición de los receptores de insulina mediante rutas que involucran mediadores inflamatorios tal como TNFa. También puede involucrar un incremento de IGFBP-3 para inhibir la muerte celular endotelial retiniana.

La presente invención proporciona compuestos derivados y análogos del Compuesto 2. Tanto el Compuesto 2 como los compuestos derivados/análogos son agonistas de receptores ß-adrenérgicos . Estos compuesto tienen propiedades catecolaminérgicas y también activan los receptores ß-l y ß-2 adrenérgicos . Estos compuestos se comparan en algunas modalidades con el isoproterenol . Está demostrado que mientras el isoproteronol y los compuestos de la presente invención tienen actividades de receptores ß-adrenérgicos, a pesar de que el isoproterenol es un agonista no selectivo, los agonistas de receptores beta-adrenérgicos de la presente invención tienen efectos más potentes y específicos que el isoproterenol.

Los agonistas de los receptores beta adrenérgicos de la presente invención proporcionados aqui pueden sintetizarse por medio de métodos sintéticos químicos conocidos y estándar. Generalmente, estos agonistas de receptores beta adrenérgicos, incluyendo el isoproterenol conocido, pueden tener la estructura química: El sustituyente R1 puede comprender la porción (CH2) n (CH3) 2f en donde n es 1 a 4, por ejemplo, la porción isopropílica CH2(CH3)2 como en el isoproterenol 1 ó puede comprender una porción de fenilo sustituida: en donde n es 1 a 4. R2 es hidrógeno o una sal farmacológicamente aceptable o una porción de hidrato, tal como ?·??, en donde X es un haluro, por ejemplo, pero no se limita a cloruro. R3 está sustituido en uno o más carbonos fenilo C2-C6 en donde R3 es independientemente -0(CH2)mCH3 y m es 0 a 4.

Generalmente, los agonistas de los receptores beta adrenérgicos proporcionados en la presente incluyen una porción de benceno diol. Por ejemplo, el agonista del receptor ß-adrenérgico puede tener la estructura química: Los agonistas de BAR preferidos con una porción benceno 1,2-diol son clorhidrato de 4- [ l-hidroxi-2- ( 1-etilamino-3-, 4-, 5-trimetoxifenil) etil] benceno-1, 2-diol (Compuesto 2) y tiene la estructura química o 4- [ l-hidroxi-2- ( l-etilamino-3-, 4-, 5-trimetoxifenil) etil] benceno-1, 2-diol (Compuesto 3) con la estructura química: También, el agonista del receptor beta-adrenérgico puede tener la estructura química: Más preferentemente, los agonistas de los receptores beta-adrenérgicos con una porción benceno 1,3-diol son clorhidrato de 5- ( l-hidroxi-2- [2- (3, 4 , 5-trimetoxifenil) -etilamino] -etil) -benceno-1, 3-diol (Compuesto 4) con la estructura química: o 5- ( l-hidroxi-2- [2- (3,4, 5-trimetoxi-fenil) etilamino] -etil) -benceno-1, 3-diol (Compuesto 5) con la estructura química : Está determinado que el mecanismo potencial de acción del Compuesto 2 y otros agonistas de los receptores beta-adrenérgicos descritos en la presente es a través de la reducción de TNF y mayor señalización de insulina para células de Müller y a través de mayores niveles de IGFBP-3 en células endoteliales retinianas. Se contempla que esas acciones pueden presentar biomarcadores para retinopatia diabética humana. La presente invención demuestra que los agonistas de los receptores ß-adrenérgicos previenen el daño ocasionado por la diabetes o condiciones hiperglucémicas que dañan múltiples tipos de células retinianas. Una característica crítica del tratamiento con los agonistas de los receptores beta-adrenérgicos presentados aquí es la especificidad selectiva, es decir, aunque no reducen el daño retiniano, no reducen la presión sanguínea, no alteran la presión intraocular, y son significativamente más eficaces que los actuales agentes enzimáticos que convierten la angiotensina.

Por lo tanto, la presente invención también proporciona métodos de disminución o prevención del daño retiniano asociado con la diabetes a la función y estructura de células retinianas y a capilares del tejido retiniano, tal como mediante la prevención y/o la reversión de la retinopatía diabética mediante la compensación o mantenimiento de la señalización de receptores de insulina. Estos métodos pueden realizarse in vitro o in vivo. Por ejemplo, poniendo en contacto una célula retiniana asociada con una condición diabética con un agonista del receptor adrenérgico mejora la función retiniana de la célula entre otras cosas mediante el incremento en la señalización de insulina y la disminución de la apoptosis inducida por TNFOÍ .

Particularmente, los métodos de tratamiento in vivo proporcionados en la presente están dirigidos a la fase preproliferativa de la retinopatía diabética cuando los síntomas clínicamente observables no son evidentes y antes de que ocurra la muerte celular y la pérdida de visión resultante. El tratamiento se efectúa mediante la administración de uno o más de los agonistas de los receptores ß-adrenérgicos o sales o hidratos farmacológicamente efectivas y aceptables de los mismos descritos en la presente. También pueden administrarse composiciones farmacéuticas que comprenden los agonistas de los receptores ß-adrenérgicos y un portador farmacéuticamente aceptable tal como se conoce y es estándar en la técnica. Se contempla que uno o más de otros fármacos o agentes terapéuticos diabéticos o retinopáticos pueden administrarse concurrentemente o secuencialmente con los agonistas de los receptores ß-adrenérgicos .

Las formulaciones de dosificación de los compuestos de agonistas de receptores ß-adrenérgicos o una sal o hidrato farmacológicamente aceptable de los mismos pueden comprender portadores o vehículos convencionales no tóxicos, fisiológicamente o farmacéuticamente aceptables adecuados para el método de administración. En la técnica se conocen métodos de administración, preferentemente, de suministro subconjuntivo y suministro tópico, pero pueden incluir el suministro intravenoso. Estos compuestos o composiciones farmacéuticas de los mismos pueden administrarse independientemente una o más veces para lograr, mantener o mejorar un efecto farmacológico o terapéutico derivado de estos compuestos u otros fármacos o agentes antidiabéticos. Está dentro de las habilidades del técnico determinar la dosificación o si una dosificación adecuada comprende una sola dosis administrada o múltiples dosis administradas. Una dosificación apropiada depende de la salud del sujeto, del avance o etapa de la diabetes y/o retinopatía, la via de administración y la formulación utilizada .

Los siguientes ejemplos se dan con el propósito de ilustrar varias modalidades de la invención y no significan que limitan de ninguna manera la presente invención.

Preparación de Animales Se utilizaron ratas Lewis macho adquiridas de Charles River. Las ratas diabéticas recibieron una sola inyección de 60 mg/kg de estreptozotocina (Fisher, Pittsburgh, PA) . Las ratas de control recibieron una inyección de solución amortiguadora de citrato. Todas las ratas se pesaron semanalmente y sólo las ratas con niveles de glucosa en la sangre sin ayuno >250 mg/dl se consideraron diabéticas. La designación de diabético se hizo al principio de los experimentos. La glucosa se midió cada dos meses. En ningún momento se administró insulina a las ratas.

Para determinar si la aplicación tópica del Compuesto 2 pudo llegar a la retina y provocar una respuesta, se realizaron estudios de dosis y curso del tiempo. Para esos estudios, los animales se hicieron diabéticos durante 2 meses usando ST . Para ,4 días, las ratas recibieron una variedad de dosis ya del Compuesto 2 (1 mM a 20 mM) o de PBS una vez o dos veces al dia. Después de los 4 días de tratamiento con gotas oftalmológicas en ambos ojos, se sacrificaron los animales diabéticos y de control. Dado que la estimulación de los receptores ß-adrenérgicos aumentaría la producción de adenosina monofosfasa cíclica y activaría la proteína cinasa A, los lisatos retiñíanos se procesaron para un análisis de ELISA para PKA (MesaCup PKA ELISA, Upstate, Temecula, CA) . Después de determinar la dosis óptima y curso del tiempo para el tratamiento con gotas oftalmológicas para el Compuesto 2, se utilizaron tres grupos de ratas para esta parte del estudio (control, diabético (Diabético) , y diabético + gotas oftalmológicas (Diab+2) . Una semana después de la inyección de STZ, 12 ratas se sometieron a terapia con gotas oftalmológicas. Las ratas en la terapia de gotas oftalmológicas recibieron una aplicación diaria de 4 gotas de 1 mM del Compuesto 2 en cada ojo. Para verificar que los niveles de insulina en los animales diabéticos, se realizó un análisis de ELISA (kit de ELISA para Insulina para Rata/Ratón, Lineo, St. Charles, MO) en sangre muestreada de todas las ratas de 2 meses de edad. Las ratas se sacrificaron a los 2 u 8 meses de edad. Con 2 u 8 meses, las retinas se evaluaron para determinar la degeneración inducida por la diabetes del número de células retinianas y el espesor retiniano (2 meses) y capilares degenerados (8 meses) . Se evaluó la actividad de TNF, caspasa 3 escindida y fosforilación del receptor beta de insulina y Akt en ambos puntos de tiempo.

Electrorretinogramas Cada mes del experimento, se realizaron análisis de electrorretinogramas (ERG) en ratas de los tres grupos. Los análisis de electrorretinogramas se hicieron para evaluar los cambios en la actividad eléctrica de la retina y como medida de la efectividad del fármaco. Para los análisis de electrorretinogramas, las ratas de adaptaron a la oscuridad durante toda la noche. A la mañana siguiente, las ratas se anestesiaron usando una inyección intraperitoneal de un cóctel de cetamina (0.6 ml/kg de peso corporal) y xilacina (0.375 ml/kg de peso corporal. La pupila de cada ojo se dilató por completo usando una solución de tropicamide al 1 % (Alcon) . Para proteger el ojo y ayudar a mantener una buena conexión eléctrica, se añadió una gota de solución de metilcelulosa a cada ojo (Celluvisc; Allergan, Irvine, CA) . La temperatura corporal se mantuvo en 37 C con una almohadilla de calentamiento a base de agua. Las respuestas del electrorretinograma se registraron simultáneamente de ambos ojos usando electrodos corneales de alambre de platino, un electrodo de referencia en la frente, y un electrodo a tierra en la cola. Los estímulos del electrorretinograma se suministraron a través del sistema Diagnosys LLC. Todos los animales probados se recuperaron de la anestesia después de las sesiones de registro de los electrorretinogramas . No se utilizó ningún animal con cataratas avanzadas para los análisis de electrorretinogramas.

Las respuestas de los electrorretinogramas se registraron en respuesta a un breve (4 ms) LED blanco y después de la lámpara de arco de Xenón suministrada a intervalos de 2.1 segundos para estímulos tenues e intervalos de 35 segundos para estímulos más brillantes. El intervalo de intensidades de estímulos se extendió de -4.0 a 1.0 log cd*s/m2 para análisis de las amplitudes de ondas b. Se registraron electrorretinogramas con un ancho de banda de 0.3-500 Hz y se muestrearon a 2 kHz por medio de un sistema de adquisición digital (Diagnosys) y se analizaron usando MatLab (The MathWorks, Natick, MA) . Las gráficas de funciones de respuesta de intensidad para la onda a y ondas b se ajustaron a una función hiperbólica (Naka-Rushton) de la forma R(I)/Rmax = Ik/lk+Kn en donde R fue la amplitud de respuesta a la intensidad de destello I, Rmax fue la amplitud de la respuesta máxima que puede lograrse; y K fue la intensidad que evoca una respuesta media máxima.

Para evaluaciones de los potenciales oscilatorios, los estímulos se administraron a 3 log (cd*/m2) . Los análisis de datos para los potenciales oscilatorios se obtuvieron usando el software atLab con un filtro de paso de banda digital ajustado para €0-300 Hz y las ondas pequeñas pico de las 4 ondas pequeñas se midieron desde el valle hasta la cresta (3-4). Se efectuó la estadística sobre las amplitudes de SD media de la onda a y b de cada grupo de tratamiento.. para 2, 6 y 8 meses.

Preparación de vasculatura retiniana digerida en tripsina Para el recuento de capilares acelulares, se utilizaron retinas de un ojo de control, diabético, y diabético+2. Los ojos de enuclearon y se colocaron en formalina amortiguada al 10 % durante 5 días. La retina se disecó en solución de tripsina cruda al 3 % (Difco Bacto Trypsin 250, Detroit, MI) conteniendo 0.2 M de fluoruro de sodio a 37 C durante 2 horas (5) . La retina neural se cepilló suavemente y el árbol vascular retiniano remanente se secó sobre una placa de vidrio.

Cuantificación de capilares acelulares Una vez que el árbol vascular retiniano aislado se secó sobre la placa de vidrio, la placa se tiñó con hematoxilina-ácido peryódico de Schiff. Se contaron los capilares degenerados (acelulares) en la retina media en seis a siete campos espaciados uniformemente alrededor de la retina. Los capilares degenerados se identificaron como tubos de tamaño capilar sin núcleos en ningún lugar a lo largo de su longitud. Los capilares degenerados se contaron sólo si su diámetro promedio fue de por los menos 20 % del hallado en los capilares saludables de los alrededores (6-7) .

La evaluación del adelgazamiento retiniano y la pérdida de células en secciones de parafina fijada a Formalina de la capa de células ganglionares se tiñeron con toluidina azul para análisis de microscopía óptica y morfometría de espesor retiniano (8). Se tomaron imágenes en cuatro lugares en la retina (ambos lados del nervio óptico y la retina media) a 400x. Los núcleos en la capa de células ganglionares (GCL, por sus siglas en inglés) retinianas se contaron en una sección de 100 m de cada imagen, y el espesor de la retina interna (desde la parte superior de la capa nuclear interna hasta la membrana de limitación interna) se evaluaron usando una cámara Retiga acoplada a un microscopio óptico Nikon Biophot con software Qcapture (Qlmaging, Burbay, BC, Canadá) . El espesor retiniano y el número de células en la capa de células ganglionares se midió usando el software Open Lab ( Improvision, Lexington, MA) .

Análisis de Proteínas El otro ojo de cada animal se utilizó para análisis de proteínas para marcadores inflamatorios y señalización de receptores de insulina. Se efectuó un análisis de transferencia Western como se describió (9). Los anticuerpos utilizados fueron receptor beta de insulina (1:500, Cellular Signaling, Danvers, MA) , receptor beta de insulina fosforilado (Tyr 1 150/1151, 1:500, Cellular Signaling, Danvers, MA) , Akt total (1:500, Cellular Signaling, Danvers, MA) , y Akt fosforilado (Ser 473, 1:500, Cellular Signaling, Danvers, MA) . Para análisis de los datos, se obtuvieron valores de densitometría media usando el software Kodak 2.0. La relación de la proteína fosforilada se comparó con niveles de proteína total.

Análisis de ELISA Para determinar la concentración de TNF (Pierce, Rockford IL) y los niveles de caspasa 3 escindida (Cellular Signaling, Danvers, MA) , se realizaron análisis de ELISA de acuerdo con las instrucciones del fabricante, excepto que se cargó igual cantidad de proteínas en ELISA para caspasa 3 escindida de tal manera que pueden usarse los números de densidad óptica.

Células Se compraron células endoteliales retinianas humanas (HREC, por sus siglas en inglés) de Cell Systems (Kirkland, WA) y se cultivaron en medio basal (5 mM de glucosa) o de crecimiento (25 mM de glucosa) . Ambos medios se suplementaron con 10% FBS y antibióticos. El día anterior a los experimentos, las células se privaron del suero por 18-24 horas. Se cultivaron células de Müller de ratas (rMC-1) en medio DMEM con 5 mM de glucosas ó 25 mM de glucosa. Los medios se suplementaron con 10% FBS y antibióticos. Las células se privaron del suero antes de todos los experimentos por 18-24 horas.

Estadística Se realizó la estadística para comparar el control, diabético, diabético+tratamiento ( Diab+compuesto 2) usando un análisis de Kruskal-Wallis, con prueba de Dunn para análisis post hoc. P<0.05 se consideró como significativo .

Efectos in vivo del Compuesto 2 El compuesto 2 no afectó el peso corporal o los niveles de glucosa La administración diaria de 1 mM del Compuesto 2 no afectó el peso corporal o los niveles de glucosa (Tabla 1) . La concentración de plasma del Compuesto 2 disminuyó desde aproximadamente 100 ng/ml hasta aproximadamente 6 ng/ mi en 45 minutos. El peso corporal y los niveles de glucosa en la sangre mostraron una pequeña variación entre los puntos de tiempo de 2 y 8 meses. Tampoco se observaron efectos en la presión sanguínea o en la presión intraocular después del tratamiento con el Compuesto 2 (Tabla 1) . Se midieron los niveles de insulina normales en la retina de control, mientras que los animales diabéticos y diabéticos+Compuesto 2 tuvieron desde poca hasta nada de insulina.

TABLA 1 El Compuesto 2 aumentó la actividad de PKA Para determinar la dosis óptima y el intervalo de tiempo para la administración del fármaco, se utilizaron ratas tratadas con STZ durante 2 meses y se trataron por 4 días con dosis variables de 4 gotas del Compuesto 2 en cada ojo. En el estudio inicial, el intervalo de la dosis óptima investigada fue de entre 1 mM a 20 mM, proporcionada una vez al día., (Fig. 1). Se empleó la medición de PKA como un biomarcador de que el Compuesto 2 llegó a la retina y provocó una respuesta celular normal, dado que los receptores ß-adrenérgicos normalmente activan la PKA.

Una dosis tópica de 1 mM proporcionada una vez al día mostró el incremento más alto en la actividad de PKA en comparación con las otras dosis administradas (Fig. 1A P<0.05 vs. Ctrl, N=6) . Se utilizó el tratamiento de concentración de 1 mM para los demás experimentos.

El compuesto 2 inhibió la pérdida de amplitud de la onda B y los potenciales oscilatorios en el electrorretinograma en 8 meses (Figuras 2A-2B) . Los análisis de electrorretinogramas de la función visual se realizaron cada mes en los animales control, diabéticos y diabéticos+tratados con gotas oftalmológicas. Las amplitudes de la onda a (Fig. 2C) , la onda b (Fig. 2D) y los potenciales oscilatorios (Fig. 2E) se redujeron sustancialmente en los animales diabéticos en 2 meses de diabetes, la cual se mantuvo en el periodo de 8 meses. Se observó poca diferencia en las amplitudes de ERG entre las ratas de control y las ratas diabéticas que recibieron el tratamiento del Compuesto 2. Estos resultados sugieren que la gota oftalmológica fue efectiva en mantener la actividad eléctrica de la retina a pesar de la diabetes en las ratas.

El espesor retiniano interno y los números de células en la capa de células ganglionares de la retina central se mantuvieron en ratas diabéticas tratadas con gotas oftalmológicas El espesor retiniano cerca del nervio óptico (retina central) se redujo significativamente en las ratas diabéticas en comparación con las de control (Figuras 3A-3B) . Esta pérdida del espesor retiniano interno se evitó en ratas diabéticas gue recibieron el tratamiento de gotas oftalmológicas. Similarmente, las ratas diabéticas tuvieron menos células en las regiones retinianas centrales (Fig. 3B) , lo cual se evitó en los animales tratados con el Compuesto 2. Es probable gue el número reducido de células en la capa de células ganglionares son tanto células ganglionares retinianas como células amacrinas desplazadas. No se apreciaron cambios en el espesor retiniano o en el número de células en la retina periférica (fuera del nervio óptico) .

La terapia del Compuesto 2 evitó la degeneración de capilares retiñíanos Los números de capilares degenerados son un hallazgo clave de cambios vasculares en la retina de ratas diabéticas (6-7). El tratamiento con 1 mM del Compuesto 2 redujo significativamente los números de capilares degenerados en animales diabéticos a niveles similares a los de los animales de control después de 8 meses de diabetes (Figuras 4A-4B, P<0.05 vs . Ctrl y diab+2) .

Se redujeron signi icativamente los niveles de NFct en los animales tratados con el Compuesto 2 Debido a una reducción significativa en los niveles de TNFOÍ observados in vitro, también se evaluaron los niveles para asegurar que el Compuesto 2 fuera capaz de disminuir los niveles de marcadores inflamatorios en ratas diabéticas. Los datos muestran que después de 2 meses de tratamiento los niveles de proteina del TNFOÍ se elevaron significativamente en ratas solamente diabéticas. Mientras que los mismos niveles en ratas tratadas con el Compuesto 2 fueron similares a los de los niveles de control (Fig. 5A, P<0.05, vs. Ctrl y Diab+2, N=6) . Similarmente, se elevaron significativamente los niveles de TNFOÍ en ratas solamente diabéticas mientras que las ratas tratadas mostraron niveles similares a las ratas de control después de 8 meses de tratamiento con el Compuesto 2 (Fig. 5B, P<0.05 vs. Ctrl, N=6) . Estos resultados sugieren que los agonistas de los receptores ß-adrenérgicos pueden reducir los niveles de marcadores inflamatorios tanto en cultivo como en un modelo fisiológicamente -relevante.

El Compuesto 2 inhibió la pérdida de la fosforilación de tirosina del receptor de insulina en ratas diabéticas Se ha reportado que la estimulación del receptor beta de insulina ocurre principalmente en los residuos de tirosina 1150/1151 (Petrozelli et al, 1984) en las ratas y que la señalización del receptor de insulina ocurre en la retina (Reiter et al, 2006; Jiang y colaboradores, 2010) . El tratamiento con el Compuesto 2 mantuvo la fosforilación de tirosina del receptor beta de insulina en niveles similares a los de los animales de control después de 2 meses de diabetes (Fig. 6A, P<0.05 vs . control) en comparación con sólo ratas diabéticas. La fosforilación de tirosina del receptor beta de insulina también se mantuvo después de 8 meses de diabetes en ratas tratadas con el Componente 2 (Fig. 6B, P<0.05 vs. control). Dado que la fosforilación de Akt es indicativa de la supervivencia celular, se analizaron los niveles de proteina de Akt total y Akt fosforilada en lisatos retiñíanos de ratas de cada grupo de tratamiento. El tratamiento diario con 1 mM del Compuesto 2 mantuvo la relación de Akt fosforilado a niveles similares a los de los valores de control mientras que la diabetes redujo significativamente la fosforilación de Akt (Fig. 6C, P<0.05 vs . control). Los niveles de proteína disminuyeron significativamente en ratas sólo diabéticas cuando se compararon con las ratas de control después de 8 meses (Fig. 6D, P<0.05 vs . control y Diab+2, N=5) . Similarmente, las figuras 6E-6H muestran el efecto del compuesto 2 en la relación de fosfo-AKT a AKT total.

Niveles disminuidos de caspasa 3 escindida en animales tratados con gotas oftalmológicas Dado que hubo una reducción en la pérdida de células inducida por diabetes en los animales tratados en la retina central, probablemente se reduce la apoptosis después del tratamiento. La fosforilación de Akt se mantuvo debido al tratamiento de gotas oftalmológicas a ratas diabéticas, sugiriendo nuevamente que la apoptosis se reduciría. De hecho, la diabetes produjo un aumento significativo en los niveles de caspasa 3 escindida en los lisatos retiñíanos (Figuras 7A-7B, P<0.05 vs. control), que se redujo siguiendo el tratamiento con gotas oftalmológicas del Compuesto 2 (Figuras 7A-7B) . Estos resultados sugieren que la diabetes produce apoptosis en algunas células a través de la ruta de la caspasa 3, que puede inhibirse por los agonistas de los receptores ß-adrenérgicos .

Con base en el trabajo de cultivo celular con el Compuesto 2 descrito arriba, existe fuerte evidencia para examinar un agonista del receptor beta-adrenérgico in vivo para un retinopatia diabética no proliferativa . Por lo tanto, se inició una prueba de gotas oftalmológicas de 50 mM del Compuesto 49b proporcionadas 1 vez al día durante 8 meses. Se encontró que el tratamiento de ratas diabéticas con el Compuesto 2 fue efectivo en prevenir la pérdida del espesor retiniano y la apoptosis de células de la capa de células ganglionares que puede presentarse en roedores diabéticos como una respuesta aguda a la enfermedad.

Uno de los hallazgos clave comunes a la retinopatia ocular es la formación de capilares degenerados, que ocurre en aproximadamente 6 meses de diabetes [23, 24]. El tratamiento con 1 mM de Compuesto 2 fue capaz de reducir significativamente el número de capilares significativos a niveles similares a los controles. Además de reducir la pérdida de células en la retina central después de la diabetes, la terapia de gotas oftalmológicas también fue efectiva en la reducción de la concentración de TNFa a lo largo del régimen de tratamiento, a pesar de que es más efectivo en periodos de tiempo tempranos de la enfermedad.

La diabetes produce una disminución significativa en la fosforilación del receptor de insulina, que se incrementó por las gotas oftalmológicas del compuesto 2 in vivo. Para estos experimentos, se utilizaron los lisatos de la retina de las ratas diabéticas en 2 y 8 meses después de 1 mM de tratamiento con el Compuesto 2. En los estudios de las gotas oftalmológicas del compuesto 2, se mejoró el ERG con el tratamiento de gotas oftalmológicas en todo el periodo de tiempo, aunque la amplitud total de los tres grupos no declinó en el periodo de 8 meses.

Similar a los estudios de prevención de la pérdida del espesor retiniano y del número de células en ratas diabéticas, el Compuesto 2 pudo revertir cambios semejantes a la diabetes en la retina. Como se indica en las figuras 2D-2F, las ratas diabéticas de 6 meses que recibieron la terapia del Compuesto 2 durante 2 meses tuvieron una función retiniana mejorada. Esto se asoció con un incremento de casi 50% en el espesor retiniano en ratas diabéticas solas y sin pérdida de células en la capa de células ganglionares . La presente invención sugiere que los agonistas del BAR pueden revertir el daño de la diabetes tanto funcionalmente como histológicamente.

El isoproterenol puede disminuir los niveles de caspasa 3 escindida en células endoteliales retinianas (REC, por sus siglas en inglés) y células de Müller cultivadas en condiciones hiperglucémicas (Steinle, 2005; Walker y Steinle, 2007) e inducir cambios cardiovasculares. Por lo tanto se desarrolló el Compuesto 2 de agonistas del receptor ß-adrenérgico. La caspasa 3 es una escisión de proteina proapoptótica cuya activación indica muerte celular (Salvesen 2002). El tratamiento con el Compuesto 2 en la concentración de 50 nM disminuyó significativamente los niveles de caspasa 3 en células de Müller en el punto de tiempo de 24 horas <Fig. 12A - 12B, P<0.05 vs . NT-HG) y en REC (Fig. 13A - 13B, P<0.05 vs . Nt-HG) en el punto de tiempo de 30 minutos. Estos resultados muestran que el Compuesto 2 es capaz de disminuir un marcador clave de apoptosis celular in vitro.

Efectos in vitro e in vivo del Compuesto 2 El compuesto 2 previene la apoptosis y la activación de TNFct en REC y células de Müller cultivadas en hiperglucemia Se desarrolló un compuesto con propiedades semejantes al receptor ß-adrenérgico, citado aquí como el Compuesto 2 y su nombre es clorhidrato de 4- [ l-hidroxi-2-(l-etilamino-3-, 4-, 5-trimetoxifenil ) etil] benceno-1, 2-diol y su estructura química se muestra y se compara con el isoproterenol en la figura 8.

Se investigó la capacidad del Compuesto 2 de prevenir la escisión de caspasa 3 y la actividad de TNFa en células cultivadas en alta concentración de glucosa. La inhibición de la apoptosis y la activación de mediadores inflamatorios previene significativamente patologías tanto neuronales como vasculares asociadas con la retinopatía diabética (7, 11-13) . En células de Müller, el bloqueo de la apoptosis llevó 24 horas, mientras que la inhibición de la actividad de TNFa ocurrió con mucha más rapidez, en 1 hr cuando las células se trataron -con 10 µ? de; isoproterenol . "Se encontraron cursos de tiempo muy similares para el bloqueo de la apoptosis y la actividad de TNFa en células de Müller tratadas con el Compuesto 2, pero a una dosis significativamente menor (50 n de Compuesto 2 vs . 10 µ? de isoproterenol) . El compuesto 2 redujo los niveles de TNFa en 19% y la caspasa 3 en 55% en comparación -con células no tratadas (Figuras 9A-9B) .

Similar a los resultados en las células de Müller, el Compuesto 2 redujo significativamente la escisión de la caspasa 3 y la actividad de TNFa en células endoteliales retinianas (REC) cultivadas en 25 mM de glucosa. El tratamiento con 50 nM de Compuesto 2 redujo significativamente los niveles de caspasa 3 en 54% y los niveles de TNFa en 23% en comparación con los controles no tratados (Figuras 10A-10B) . El isoproterenol no redujo significativamente el TNFa en células endoteliales retinianas en 10 µ? in vitro.

La figura 11 muestra el efecto en ratas diabéticas de tipo I tratadas diariamente con 1 mM del Compuesto 2. No hubo diferencia en el ventrículo izquierdo en comparación con ratas diabéticas no tratadas. La tinción es para la intensidad del colágeno, la cual se incrementa en la diabetes.

El compuesto 2 redujo los niveles de TNFot y la escisión de caspasa 3 a una dosis menor que 10 uM Las células endoteliales retinianas humanas (HREC) y las células de Müller de ratas (rMC-1) en ambas condiciones de glucosa se trataron con el Compuesto 2 a dosis de 10 nM, 50 nM, 100 nM, 1 µ?, y 10 µ? del Compuesto 2. Se cultivaron células de cada tipo en medio conteniendo L glucosa para controlar cambios en la osmolaridad. 10 µ? También se utilizó 10 µ? de isoproterenol para cada condición como un control positivo. Se trataron células de Müller durante 1 hora y 24 horas, mientras las HREC se trataron durante 30 y 60 minutos.

Después del tratamiento, se recolectaron células en solución de amortiguamiento de lisis conteniendo inhibidores de proteasa y fosfatasa. Se realizaron análisis de ELISA para TNF , caspasa 3 escindida y PKA de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los datos se compararon versus células no tratadas y células en las varias dosis. Se realizó una prueba de Kruskal- allis con una prueba de Dunn para análisis secundarios. El compuesto 2 debe reducir significativamente los niveles de TNFa y la escisión de caspasa 3 a una dosis menor que 10 µ . (requerida para isoproterenol) . La dosis disminuye los niveles de TNFOÍ y de caspasa 3 también aumentan la actividad de PKA.

El compuesto 2 reduce los niveles de NFoc y caspasa 3 mediante la activación de PKA Se cultivaron HREC y células de Müller como se describió en el Ejemplo 1. Después de la privación de suero, las células se trataron con 1 µ de T5720 para inhibir la actividad de PKA por 30 minutos. Las células se trataron después con la dosis óptima del Compuesto 2 por 1 y 24 horas para células de Müller y 30 y 60 minutos para HREC. En el tiempo apropiado después de la estimulación, las células se recolectaron y procesaron para análisis de ELISA para TNFOÍ y caspasa 3 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. También se realizó un análisis de ELISA para PKA para asegurar que la PKA se inhibió apropiadamente. Además de las células tratadas, algunas células se privaron de suero y no recibieron tratamiento como control. Se trataron placas adicionales de cada tipo de célula con KT5720 sólo para asegurar que el inhibidor de PKA solo no tuvo efecto en las células, lo cual confundiria los datos. Los datos se compararon versus células no tratadas y células en las varias dosis. Se realizó una prueba de Kruskal- allis, con una prueba de Dunn para análisis secundarios. P<0.05 se aceptó como significativo .

El compuesto 2 , es efectivo in vivo en el daño retiniano en ratas diabéticas Se hicieron ratas diabéticas con inyección de STZ. Una semana después de la inyección de STZ, se dio una dosis diaria del Compuesto 2 tópico a 1 mM. Se midió ERG después de 6 semanas. El compuesto 2 a 1 mM inhibió la pérdida de amplitud de onda B que tuvo lugar en la diabetes.

Niveles de PKA activada en la retina después de la administración del Compuesto 2 Se esperó que el suministro tópico del Compuesto 2: 1) llegaría a la retina y activaría la PKA a una dosis menor que el suministro subconjuntivo o el suministro sistémico (intravenoso), y 2) produciría menores efectos secundarios negativos, tal como mayor hipertrofia cardiovascular y presión sanguínea fisiológica.

Se caracterizó B/PK después de la administración intravenosa a ratas. Después de la administración del fármaco, se extrajeron muestras de sangre (2-300 pL) del catéter de la vena yugular a intervalos regulares después de la dosificación (5, 15, 30, 45 minutos y 1, 2, 4, 8, 16, y 24 horas) en tubos de muestreo anticoagulados con K3-EDTA. Se obtuvo plasma por centrifugación y se almacenó a -80 °C hasta el análisis. Se recuperaron el corazón, los pulmones y el bazo con el fin de determinar la distribución en los tejidos del Compuesto 2. Se recolectaron muestras urinarias acumulativas en 24 horas después de la dosis y se almacenaron a -80 °C hasta el análisis.

Se caracterizó B/PK después de la administración tópica. Después de la administración del fármaco a ratas, los ojos se enuclearon, se irrigaron con solución salina y se aspiró humor vitreo de la región interna de la cámara vitrea usando una aguja calibre 18. Se obtuvieron muestras de sangre simultáneamente con el fin de determinar el grado de exposición sistémica después de la administración tópica. Se obtuvieron muestras de humor vitreo y de sangre a intervalos regulares después de la dosificación. Se determinaron puntos de tiempo con base en los perfiles de tiempo de concentración obtenidos después de la administración intravenosa del Compuesto 2.

Para el análisis de datos se derivaron parámetros de B/PK de los datos de concentración obtenidos del plasma, del humor vitreo, de la orina y de las heces por medio de análisis no compartimentales estándar. Se determinó la vida media terminal como la relación de In 2 dividida entre ??, el negativo de la pendiente de la regresión lineal de la concentración de log natural vs . el perfil de tiempo durante la fase terminal. Se determinó la exposición sistémica y ocular como plasma o el área ocular bajo la curva (AUC, por sus siglas en inglés) de concentración-tiempo, usando la regla trapezoidal. La determinación de la concentración del Compuesto 2 y el perfil de los metabolitos se realizó usando un ensayo de LC/MS/ S validado con base en la metodología descrita (14-15) . El sistema LC-MS/MS comprende un sistema de HPLC Shimadzu (Kioto, Japón) , un espectrómetro de masas en tándem API-4000 Q Trap (Foster City, CA, EE.UU.) equipado con un turbo rocío iónico y un automuestreador HTC-PAL (Leap Technologies, Carrboro, NC, EE.UU.).

El Compuesto 2 disminuyó la inhibición de la señalización del receptor de insulina Se cultivaron células de Müller de ratas (rMC-1) en medio DMEM desarrollado en condiciones de glucosa normal (baja, 5 mM) , niveles diabéticos de glucosa (media, 15 mM) y alta glucosa (alta, 25 mM) . El medio se suplemento con 10% FBS y antibióticos. Se cultivaron cinco placas de cada tipo de células en baja, media y alta glucosa sola y sirvieron como controles no tratados. Se utilizaron cinco placas en cada nivel de glucosa y cada tratamiento en cada punto de tiempo usando L-glucosa como un control para la osmolaridad. También se trataron cinco placas en cada condición de glucosa con 10 mM de insulina para servir como control positivo. Se evaluaron los siguientes tratamientos en células de r G-1 y medio acondicionado en las 3 condiciones de glucosa.

El Compuesto 2 estimula receptores beta-adrenérgicos . Se determinó si el Compuesto 2 solo pudo aumentar la fosforilación de tirosina del receptor de insulina solo. Se evaluaron cinco placas de cada tipo de célula usando 50 nM del Compuesto 2 (o una dosis óptima si es diferente) a los 30 minutos, 1, 2, 6. y 12 horas. Después de que las células se trataron con el Compuesto 2 durante el tiempo apropiado, las células se trataron con solución amortiguadora de lisis conteniendo inhibidores de fosfatasa y proteasa. Después de un ensayo de proteínas, las muestras se examinaron por análisis de transferencia Western para el receptor de insulina fosforilada (Tyr 1150/1151), ERK/12 fosforilada (Tyr 44/42), Akt (Ser 473), y PI3K fosforilada (p85Tyr458, p55Tyrl") . Los análisis de transferencia Western de los niveles totales de proteína de cada proteína se utilizaron para determinar la relación de proteína fosforilada a proteína total.

Se determino también si el Compuesto 2 activaría la PKA para provocar mayor fosforilación de tirosina del receptor de insulina e intermediarios de fase posterior. Se cultivaron células de r C-1 en las 3 condiciones de glucosa descritas anteriormente. Después de la privación de suero, las células se trataron durante 30 minutos con 1 µ de KT5720, un inhibidor de PKA especifico. Después de 30 minutos de tratamiento con KT5720, se añadieron 50 n del Compuesto 2 por €0 ó 180 minutos adicionales. Algunas células recibieron el tratamiento de KT5720 sólo para asegurar que el tratamiento con este inhibidor no tuvo efecto en la fosforilación del receptor de insulina. También se utilizaron controles de L-glucosa y sin tratamiento. Adicionalmente, se realizó la mutagénesis dirigida al sitio como se describió anteriormente antes del tratamiento. Una ves recolectados, los análisis se realizaron como se describió arriba. Adicionalmente, se realizó un análisis de ELISA para PKA para asegurar que no había una actividad de PKA presente.

El TNFct fue un intermediario clave en la regulación del Compuesto 2 de la fosforilación del receptor de insulina Se utilizaron células de Müller de ratas (rMC-1) para estos experimentos y se cultivaron en las 3 condiciones de glucosa descritas arriba. Para todos los tratamientos, se utilizaron cinco placas de cada tipo de célula a la dosis y punto de tiempo apropiados usando controles de L-glucosa para osmolaridad. Se utilizaron cinco placas para cada experimento como controles no tratados. Después de la privación de suero, se aplicaron varios tratamientos al medio de cultivo.

Comparación de la estimulación de TNFa sola y estimulación de TNFa con Compuesto 2 Se midió la fosforilación de Ser 307 en IRS-1, la fosforilación de tirosina del receptor de insulina, y la fosforilación de Akt en serina 473 para evaluar si TNFa inhibe la transducción de señales de insulina a través de IRS-1 y determinar el papel de las actividades de PKA en TNFa. Se cultivaron células de rMC-1 después del mismo protocolo para condiciones de glucosa como se describieron arriba. Una vez que las células se sometieron a ayuno, se trataron 5 placas con TNFa sólo a 5 ng/ml durante 30 minutos; se trataron 5 placas con TNFa durante 30 minutos, después con 50 nM del Compuesto 2 durante 60 minutos y se trataron 5 placas con TNFa y KT5720 durante 30 minutos, seguido por el Compuesto 2 durante 60 minutos. Después de los tratamientos, las células se procesaron como anteriormente, excepto que para la evaluación del sustrato 1 del receptor de insulina (IRS-1), el foco estuvo en la serina 307, por ser el sitio clave para el bloqueo de TNFa de transducción de señales de insulina (16). Se realizó la mutagénesis dirigida al sitio para convertir Serina 307 a una alanina sobre IRS-1 para determinar si la TNFa regula la capacidad de respuesta del receptor de insulina a través del sitio en células de Müller retinianas.

Se efectuaron análisis de ELISA para medir la actividad de TNFa y de caspasa 3 escindida. Se realizó marcación de TUNEL para localizar células apoptóticas. Se midieron los niveles de insulina en las células y en el medio para medir si la estimulación de TNFa regula la producción o secreción de insulina. Para todos los tratamientos, se obtuvieron valores de densitometria media usando el software Kodak 2.0. La relación de la proteina fosforilada se comparó con niveles de proteina total. Se efectuó un mínimo de 4 experimentos independientes para cada grupo de tratamiento. Se realizó el análisis de ELISA usando la recomendación de fabricante con base en la curva estándar generada en el ensayo. Se realizaron análisis estadísticos usando análisis de Kruskal- allis, seguido por una prueba post-hoc de Dunn para todas las columnas usando el software Prism. Se realizaron análisis para comparar tratamientos con grupos no tratados. P<0.05 se aceptó como significativo.

El compuesto 2 evitó y/o revertió las alteraciones neuronales y vasculares de largo plazo comunes de la retinopatia diabética Se mostró la capacidad del Compuesto 2 de evitar y revertir los cambios retiñíanos que ocurren en la retinopatia diabética pre-proliferativa en roedores. Se utilizaron 30 ratas, de control, 30 ratas diabéticas, y 30 ratas para el Compuesto 2. En el día 0 se inyectaron 60 ratas (30 diabéticas, 30 con Compuesto 2) con 60 mg/kg de estreptozotocina para eliminar la producción de insulina por medio de sus células pancreáticas beta. Dos días después de las inyecciones de estreptozotocina, se obtuvieron mediciones de glucosa en todas las ratas, aceptándose la diabetes como niveles de glucosa superiores a 250 mg/dl. Comenzando en el día de la discriminación inicial, se inició la terapia de gotas oftalmológicas de 1 mM del Compuesto 2 en 30 ratas. Las 30 ratas que no recibieron estreptozotocina sirvieron como ratas de control. Los niveles de glucosa se midieron dos veces por semana .

Se realizaron análisis en las ratas para determinar cambios agudos (8 semanas de diabetes, 45 ratas) y cambios crónicos (8 meses de diabetes, 45 ratas) . Además de todas las mediciones en la retina, se tomaron secciones de tejido del corazón a las 8 semanas y 8 meses para asegurar que no había hipertrofia de los ventrículos debido al fármaco. También se realizó un análisis de transferencia Western para cadena ligera de miosina, un marcador sustituto de hipertrofia cardiovascular. Cada mes, todas S3 las ratas recibieron 2 análisis de la función visual, un electrorretinograma (ERG) e imagen retiniana en vivo usando Topografía de Coherencia Ópti-ca (OCT, por sus siglas en inglés) . Se evaluó el espesor retiniano y la imagenología retiniana en vivo usando OCT de roedor. Esta tecnología permite la visualización no invasiva de cada capa de la retina para múltiples pruebas del mismo animal.

Se utilizó la dosis óptima y el curso de tiempo del Compuesto 2 que se determinó anteriormente. Treinta ratas de control, 30 ratas diabéticas, y 30 ratas para el Compuesto 2. En el día 0 se inyectaron 60 ratas (30 diabéticas, 30 con Compuesto 2) con 60 mg/kg de estreptozotocina para eliminar la producción de insulina por medio de sus células pancreáticas beta. Dos días después de las inyecciones de estreptozotocina, se obtuvieron mediciones de glucosa en todas las ratas, aceptándose la diabetes como niveles de glucosa superiores a 250 mg/dl. Comenzando en el día de la discriminación inicial, se inició la terapia de gotas oftalmológicas de 1 mM del Compuesto 2 en 30 ratas. Las 30 ratas que no recibieron estreptozotocina sirvieron como ratas de control. Los niveles de glucosa se midieron dos veces por semana. Se realizaron análisis en las ratas para determinar cambios agudos (8 semanas de diabetes, 45 ratas) y cambios crónicos (8 meses de diabetes, 45 ratas) . Además de todas las mediciones en la retina, se tomaron secciones de tejido del corazón a las 8 semanas y 8 meses para asegurar que no había hipertrofia de los ventrículos debido al fármaco. Se examinaron cadenas ligeras de miosina como marcadores sustitutos de hipertrofia -cardiovascular usando análisis de transferencia Western. Cada mes, todas las ratas se probaron para determinar la función visual, un electrorretinograma (ERG) e imagenología retiniana en vivo usando Topografía de Coherencia Óptica (OCT) . Para los análisis de ERG se realizaron experimentos de acuerdo con los métodos descritos (2) . Mientras los animales estuvieron despiertos para los análisis de ERG, se monitoreó la presión sanguínea y el pulso para detectar eventos cardiovasculares negativos. A la dosis tópica de 50 mM estos eventos no habían sido observados, de tal manera que era improbable que sucedieran al utilizar el Compuesto 2.

Se evaluó el espesor retiniano y la imagenología retiniana en vivo usando OCT de roedor. Cada capa de la retina se examinó múltiples veces en el mismo animal en una forma no invasiva para determinar cambios en regiones específicas en el curso del experimento. Estos datos se combinaron con mediciones histológicas de espesor retiniano. Se utilizó microscopía óptica para el examen histológico de cambios neuronales, que ocurrió con frecuencia en las fases agudas. Se tiñeron secciones de parafina fijada a formalina con toluidina azul para microscopía óptica y morfometría del espesor retiniano. Se tomaron imágenes en cuatro lugares en la retina (.ambos lados del nervio óptico y la retina media) a 400x. Los núcleos en la capa de células ganglionares (GCL) retinianas se contaron en una sección de 100 µp? de cada imagen. Se evaluó el espesor de la retina interna desde la parte superior de la capa nuclear interna hasta la membrana de limitación interna usando una cámara Retiga acoplada a un microscopio óptico Nikon Biophot con software Qcapture (Qlmaging, Burbay, BC, Canadá) . El espesor retiniano y el número de células en la capa de células ganglionares se midió usando el software OpenLab ( Improvision, Lexington, MA) . Se utilizaron pruebas T impares para comparar datos de animales de control, diabéticos, y diabéticos + tratados con gotas oftálmicas, aceptándose P<0.05 como significativo .

Los análisis de la vasculatura retiniana se basaron en métodos publicados (6-7). Para los análisis inflamatorios, se recolectaron lisatos retiñíanos en solución amortiguadora de lisis conteniendo inhibidores de proteasa y fosfatasa. Se realizó un ensayo de proteina BCA para determinar el contenido de proteína de los lisatos. Se realizaron análisis de citocina Luminex ulti-plex para evaluar si el Compuesto 2 podía disminuir significativamente . las actividades de proteínas de mediadores inflamatorios clave in vivo. Para analizar las rutas de señalización . del receptor de insulina; se recolectaron y evaluaron animales de control, diabéticos, y diabéticos + Compuesto 2.

El compuesto 2 revertió el daño retiniano debido a diabetes inducida sin tratamientos de 6 meses de antigüedad Se utilizaron noventa ratas (30 con gotas oftalmológicas sin diabetes, 30 sólo con diabetes, 30 con Compuesto tópico 2 seguido por 6 meses de diabetes sin tratar) . Se utilizó estreptozotocina en la dosis de 60 mg/kg en el día 0 y 60 para inducir la diabetes en las ratas. El criterio para el desarrollo de la diabetes experimental fue el nivel de glucosa en la sangre de más de 250 mg/dl dos días después del tratamiento con estreptozotocina. El último grupo de animales se sometió a terapia tópica de gotas oftalmológicas usando el Compuesto 2 a 1 mM. Las 30 ratas restantes sirvieron como controles diabéticos puros. Cambios agudos (8 semanas después de iniciar con gotas oftalmológicas, 45 ratas) y crónicos (8 meses después de iniciar la terapia de gotas oftalmológicas, 45 ratas) usando las mismas mediciones como se describen.

El compuesto 4 previno la apoptosis y la activación de T Fcc en REC y en células de Múller cultivadas en hiperglucemia La figura 8 ilustra la estructura química del Compuesto 4, clorhidrato de 5- ( l-hidroxi-2- [2- (3 , 4 , 5-trimetoxi-fenil) -etilamino] -etil) -benceno-1, 3-diol . Se cultivaron células de Müller y las células endoteliales retinianas (REC) y se trataron con 50 nM del Compuesto 4 de acuerdo con el protocolo para el Compuesto 2 en el Ejemplo 3. Los datos de ELISA muestran que el compuesto 4 tuvo más actividad del receptor beta 2 adrenérgico en células de Müller y en células REC, lo que significa menos probabilidad de efectos cardiacos, y trabaja a 50 nM in vitro para reducir los niveles de TNFa y la escisión de caspasa 3. El Compuesto 4 es más efectivo y trabaja más rápido que el Compuesto 2 en células de Müller, probablemente porque el receptor beta adrenérgico dominante en las células de Müller es el subtipo de receptor beta 2 adrenérgico. En células endoteliales, al Compuesto 4 no le toma mucho tiempo en activar la respuesta de células endoteliales retinianas, probablemente debido a una menor actividad del receptor beta 1 adrenérgico, el cual es el receptor dominante en las células endoteliales retinianas.

Isómeros del Compuesto 2 Las figuras 14A-14B muestran los efectos del isómero R del compuesto 2, el isómero S del compuesto 2 y el compuesto racémico 2 en 1 hora ó 24 horas de tratamiento en la concentración de TNFalfa en células de Müller y endoteliales retinianas. Las figuras 15A-15B muestran los efectos del isómero R del compuesto 2, el isómero S del compuesto 2 y el compuesto racémico 2 en 1 hora ó 24 horas de tratamiento en la caspasa 3 escindida. Estos datos muestran claramente que el isómero R del compuesto 2 es superior al isómero S del compuesto 2 y el compuesto racémico 2.

Se citan en la presente las siguientes referencias . 1. Phipps y colaboradores, Invest Ophthalmol Vis Sci, 2007, 48 (2) :927-34. 2. Jiang, Y. y J.J. Steinle, Invest Ophthalmol Vis Sci, 2009. 3. Forte y colaboradores. J Neurosci Methods, 2007; 169: 191-200. 4. Weymouth, A.E. y Vingrys, A.J., Prog Retin Eye Res, 2008, 27:1-44. 5. Kern, T.S. y Engerman, R.L., Curr Eye Res, 1994, 13:863-867. 6. Kowluru y colaboradores. Diabetes, 2001, 56:373-379. 7. izutani y colaboradores. J Clin Invest, 1996, 97:2883-2890. 8. Steinle y colaboradores. Exp Eye Res, 2009, 88:1014-1019. 9. Steinle y colaboradores. Exp Eye Res, 2008, 87:30-34. 10. Reiter y colaboradores. Diabetes, 2006, 55: 1148-1156. 11. Walker y colaboradores. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2007, 48 (11) .5276-81. 12. Joussen y colaboradores. Faseb J, 2004, 8(12): 1450-1452. 13. Williams, K.P. y Steinle, J.J., Exp Eye Res, 2009, 89(4) :448-455. 14. Trester-Zedlitz y colaboradores. Biochemistry, 2005, 44 (16) : 6133-4613. 15. Gu y colaboradores. Anal Chim Acta, 2008, 609(2): 192-200. 16. Boura-Halfon y colaboradores. Am J Physiol Endocrinol Metab, 2009, 296 ( ) : E581-91.

Cualquier patente o publicación mencionada en esta especificación es indicativo del nivel de aquellos con experiencia en la técnica. Además, estas patentes y publicaciones se incorporan como referencia en la presente con el mismo alcance como si cada publicación estuviera específicamente e incorporada como referencia. Una persona con experiencia en la técnica apreciará que la presente invención está bien adaptada para llevar a cabo los objetos y obtener los fines mencionados, asi como aquellos objetos y ventajas inherentes en la misma. Aquellos con experiencia en la técnica pensarán en cambios en la misma y otros usos que están incluidos dentro del alcance de la invención como lo define el alcance de las reivindicaciones.

Claims (23)

REIVINDICACIONES :

1. Un método para mejorar la función en una -célula retiniana asociada con una condición diabética, que comprende : poner en contacto la célula con un agonista del receptor beta-adrenérgico, dicho agonista del receptor beta-adrenérgico aumenta la señalización de insulina y disminuye la apoptosis inducida por TNFa, mejorando asi la función en la célula retiniana.

2. El método según la reivindicación 1, en donde el agonista del receptor beta-adrenérgico tiene la fórmula estructural química: en donde n es 1 a 4; R2 es H o H-HX, en donde X es haluro; y R3 es 0(CH2)mCH3 en uno o más de C2-C6, en donde m es 0 a .

3. El método según la reivindicación 2, en donde R1 es (CH2)n(CH3)2 y R2 es H.

4. El método según la reivindicación 3, en donde el agonista del receptor beta-adrenérgico es isoproterenol .

5. El método según la reivindicación 2, en donde R1 es (CH2) 2-fenilo, R2 es H o H-HC1 y R3 es 0{CH2)mCH3 en C3, C4 y C5.

6. El método según la reivindicación 5, en donde el agonista del receptor beta-adrenérgico es 4-[l-hidroxi-2- [3, 4,5-trimetoxi-fenil) -etilamino] -etil) -benceno-1,2-diol, clorhidrato de 4- [ l-hidroxi-2- [3, , 5-trimetoxi-fenil) -etilamino] -etil) -benceno-1, 2-diol, 5- ( l-hidroxi-2-[2- (3,4, 5-trimetoxi-fenil ) -etilamino] -etil) -benceno-1, 3-diol, clorhidrato de 5- (l-hidroxi-2- [2- (3, , 5-trimetoxi-fenil) -etilamino] -etil) -benceno-1, 3-diol o un isómero R del mismo.

7. El método según la reivindicación 1, en donde la célula retiniana se pone en contacto in vitro o in vivo.

8. El método según la reivindicación 1, en donde la condición diabética es retinopatía diabética, retinopatía diabética preproliferativa u otras condiciones hiperglucémicas .

9. Un método para tratar una condición de retinopatía diabética en un sujeto, que comprende: administrar una o más veces una cantidad farmacológicamente efectiva de uno o más agonistas de los receptores beta-adrenérgicos al sujeto, en donde dicho agonista mejora la función de células retinianas, tratando de esta manera la retinopatia diabética.

10. El método según la reivindicación 9, en donde el agonista del receptor beta-adrenérgico tiene la fórmula estructural : en donde R1 en donde n es 1 a 4; R2 es H o H-HX, en donde X es haluro; y R3 es 0(CH2)mCH3 en uno o más de C2-C6, en donde m es 0 a 4.

11. El método según la reivindicación 10, en donde R1 es (CH2)n(CH3)2 y R2 es H.

12. El método según la reivindicación 11, en donde el agonista del receptor beta-adrenérgico es isoproterenol .

13. El método según la reivindicación 10, en donde R1 es (CH2) 2-fenilo, R2 es H o H-HC1 y R3 es 0(CH2)mCH3 en C3, C4 y C5.

14. El método según la reivindicación 13, en donde el agonista del receptor beta-adrenérgico es 4-[l-hidroxi-2- [3, 4 , 5-trimetoxi-fenil) -etilamino] -etil) -benceno-1,2-diol, clorhidrato de 4- [l-hidroxi-2- [3, 4, 5-trimetoxi-fenil) -etilamino] -etil) -benceno-1, 2-diol, 5- ( l-hidroxi-2- [2- (3,4, 5-trimetoxi-fenil) -etilamino] -etil) -benceno-1, 3-diol, o clorhidrato de 5- (l-hidroxi-2- [2- (3, 4, 5-trimetoxi-fenil) -etilamino] -etil) -benceno-1, 3-diol o un isómeto R del mismo .

15. El método según la reivindicación 9, en donde adicionalmente comprende: administrar uno o más fármacos diabéticos o retinopáticos al sujeto.

16. El método según la reivindicación 15, en donde los otros fármacos son . administrados concurrentemente o secuencialmente con los agonistas de los receptores beta-adrenérgicos .

17. El método según la reivindicación 9, en donde el agonista del receptor beta-adrenérgico comprende una composición farmacéutica con un portador farmacéuticamente aceptable.

18. El método según la reivindicación 17, en donde la composición farmacéutica es adecuada para administración tópica, subconjuntiva o intravenosa.

19. El método según la reivindicación 9, en donde la condición retinopática diabética es retinopatia preproliferativa .

20. Un agonista del receptor beta-adrenérgico que tiene la estructura química en donde n es 1 a 4; R2 es H o H-HX, en donde X es haluro; y R3 es 0(CH2)mCH3 en uno o más de C2-C6, en donde m es 0 a 4.

21. Un agonista del receptor beta-adrenérgico según la reivindicación 20, que tiene la fórmula estructural química:

22. El agonista según la reivindicación 20, en donde dicha estructura es una forma isómera R.

23. Una composición farmacéutica que comprende el agonista del receptor beta-adrenérgico según la reivindicación 21 y un portador farmacéuticamente aceptable .