MX2012007124A - Proteinas cry insecticidas cry1ca modificadas. - Google Patents

Abstract

La presente invención incluye proteínas Cry1Ca de B.t. insecticidas, modificadas, que incluyen las proteínas designadas en esta invención como DIG-109 y DIG-152, así como también variantes de DIG-109 y DIG-152, ácidos nucleicos que codifican estas proteínas, métodos para controlar pestes utilizando las proteínas, métodos para producir las proteínas en células huéspedes transgénicas, y plantas transgénicas que producen las proteínas; las proteínas DIG-109 y DIG-152 comprenden péptidos quiméricos compuestos por un segmento de toxina núcleo de Cry1Ca de B.t. y un segmento de protoxina Cry1Ab; también se describen variantes insecticidamente activas de las proteínas DIG-109 y DIG-152.

Description

PROTEÍNAS CRY INSECTICIDAS CRY1CA MODIFICADAS CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a nuevas proteínas Cry insecticidas y a su uso para controlar pestes de insectos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El gusano cogollero (FAW (siglas en inglés correspondientes a "Fall armyworm"; Spodoptera frugiperda) causa daño significativo al maíz y a otros cultivos tales como la soya y el algodón.

Bacillus thuringiensis (B.t.) es una bacteria del suelo que produce proteínas cristalinas pesticidas conocidas como delta endotoxinas o proteínas Cry. Las proteínas Cry son intoxicantes orales que funcionan actuando sobre las células del intestino medio de insectos susceptibles. Una extensa lista de delta endotoxinas es mantenida y regularmente actualizada en la página de Internet: lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Btyintro.html.

Los genes que expresan maíz transgénico que codifican proteínas Cry, más notablemente CryI F, proporcionan niveles comerciales de eficacia contra el gusano cogollero (FAW, por sus siglas en inglés).

A pesar del éxito del maíz transgénico resistente a FAW, la posibilidad del desarrollo de poblaciones de insectos resistentes amenaza a la durabilidad a largo plazo de proteínas Cry en el control de FAW y crea la necesidad de descubrir y desarrollar nuevas proteínas Cry para controlar al gusano cogollero y otras plagas. La resistencia de insectos a proteínas Cry de B.t. puede desarrollarse a través de diversos mecanismos (Heckel et al., 2007, Pigott y Ellar, 2007). Se han identificado múltiples clases de proteínas receptoras para proteínas Cry dentro de los insectos, y existen diversos ejemplos dentro de cada clase de receptor. La resistencia a una proteína Cry en particular puede desarrollarse, por ejemplo, por medio de una mutación dentro de la porción de unión a la toxina de un dominio cadherina de una proteína receptora. Un medio adicional de resistencia puede ser mediado a través de una proteasa de procesamiento de protoxina. Por lo tanto, la resistencia a toxinas Cry en especies de Lepidópteros tiene una base genética completa, con por lo menos cuatro genes de resistencia principales, distintos. Los insectos lepidópteros resistentes a proteínas Cry han sido desarrollados en el campo para Plutella xylostella (Tabashnik, et al., 1994), Tríchoplusia ni (Janmaat y Myers 2003, 2005), y Helicoverpa zeae (Tabashnik er a/., 2008). El desarrollo de nuevas proteínas Cry de elevada potencia proporcionaría herramientas adicionales para el manejo del gusano cogollero (FAW) y otras pestes de insectos. Las proteínas Cry con diferentes modalidades de acción producidas en combinación en maíz transgénico evitarían el desarrollo de resistencia de insectos FAW y protegería la utilidad a largo plazo de la tecnología B.t. para el control de pestes de insectos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención provee proteínas Cry de B.t., incluyendo las proteínas designadas en esta invención DIG-109 y DIG-152, así como también las variantes de DIG-109 y DIG-152, ácidos nucleicos que codifican estas proteínas, métodos para controlar pestes utilizando las proteínas, métodos para producir las proteínas en células hospederas transgénicas, y plantas transgénicas que producen las proteínas.

Según lo descrito en el Ejemplo 1 , las proteínas DIG-109 y DIG-152 comprenden péptidos quiméricos compuestos por un segmento de toxina núcleo de CryI Ca de B.t. y un segmento de protoxina CryIAb. También se describen variantes insecticidamente activas de las proteínas DIG-109 y DIG-152.

Un hallazgo sorprendente reportado en esta invención es que las proteínas DIG-109 y DIG-152 son activas contra poblaciones de larvas de gusano cogollero y larvas del taladrador de la caña de azúcar que son resistentes a CryI F. Por lo tanto, las proteínas DIG-109 y DIG-152 son candidatos ideales para utilizar a fin de controlar pestes de lepidópteros. Las proteínas pueden ser empleadas por sí solas en combinación con otras proteínas Cry, tales como CryI F, CryIAb, y CryIAc, para controlar el desarrollo de poblaciones de insectos resistentes. Para una discusión de ese tipo de pestes, véase, por ej. Tabashnik, PNAS (2008), vol. 105 no. 49, 19029-19030.

Los fragmentos insecticidamente activos de DIG-109 y DIG-152, y nucleótidos que codifican dichos fragmentos, son otro aspecto de la invención.

En una modalidad la invención provee un polipéptido de proteína DIG-109 aislado que comprende un segmento de toxina núcleo seleccionado del grupo formado por: (a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos 28 a 619 de SEQ ID NO:1 ; (b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de los residuos 28 a 619 de SEQ ID NO:1 ; (c) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de los residuos 28 a 619 de SEQ ID NO:1 con hasta 20 sustituciones, deleciones o modificaciones de aminoácidos que no afectan adversamente la expresión o actividad de la proteína codificada por SEQ ID NO: 1.

En otra modalidad, la invención provee un polipéptido de toxina DIG-109 aislado que comprende un segmento de la toxina núcleo de DIG-109 seleccionado del grupo formado por: (a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos 1 a 619 de SEQ ID NO:1 ; (b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de los residuos 1 a 619 de SEQ ID NO:1 ; (c) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de los residuos 1 a 619 de SEQ ID NO:1 con hasta 20 sustituciones, deleciones o modificaciones de aminoácidos que no afectan adversamente la expresión o actividad de la proteína codificada por SEQ ID NO: 1.

En otra modalidad, la invención proporciona una planta que comprende una proteína DIG-109.

En otra modalidad, la invención proporciona un método para controlar una población de una peste que comprende poner en contacto dicha población con una cantidad pesticidamente eficaz de una proteína DIG-109.

En otra modalidad, la invención proporciona un ácido nucleico aislado que codifica una proteína DIG-109.

En otra modalidad, la invención proporciona un constructo de ADN que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una proteína DIG-109 ligada operativamente a un promotor que no es derivado de Bacillus thuringiensis y es capaz de impulsar la expresión en una planta. La invención provee además una planta transgénica que comprende el constructo de ADN incorporado establemente en su genoma y un método para proteger a una planta de una peste que comprende introducir el constructo en dicha planta.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS SEQ ID ??.? segmento de toxina núcleo CryICa; 619 aa SEQ ID NO:2 primer segmento de protoxina Cry1 Ab; 545 aa SEQ ID NO:3 proteína quimérica DIG-152; 1164 aa (versión Pf) SEQ ID NO:4 segundo segmento de protoxina CrylAb; 545 aa SEQ ID NO:5 proteína quimérica DIG-109; 1164 aa (versión de maíz) SEQ ID NO:6 péptido Cry1Ca436; 10 aa SEQ ID NO:7 péptido Cry1Ca591; 10 aa SEQ ID NO:8 DIG-109 que codifica CDS maíz-optimizado; 3492 SEQ ID NO:9 oligonucleótido ZGP3S; 21 nt SEQ ID NO:10 oligonucleótido ZGP3A; 21 nt SEQ ID NO:11 oligonucleótido TQZGP3; 23 nt SEQ ID NO:12 oligonucleótido DSM2S; 17 nt SEQ ID NO: 13 oligonucleótido DSM2A; 19 nt SEQ ID NO:14 oligonucleótido DSM2FQ; 20 nt SEQ ID NO:15 oligonucleótido CRYICaS; 18 nt SEQ ID NO: 16 oligonucleótido CRYICaA; 8 nt SEQ ID NO:17 oligonucleótido CryICa; 23 nt SEQ ID NO. 8 oligonucleótido AAD1S; 20 nt SEQ ID NO: 19 oligonucleótido AAD1A; 22 nt SEQ ID NO:20 oligonucleótido AAD1 ; 24 nt SEQ ID NO:21 oligonucleótido Y1 CAS; 18 nt SEQ ID NO:22 oligonucleótido Y1 CAR; 18 nt SEQ ID NO:23 oligonucleótido F6Y1 CA; 23 nt SEQ ID NO:24 oligonucleótido IVF-Etiqueta; 18 nt SEQ ID NO:25 oligonucleótido IVR-TAQ; 19 nt SEQ ID NO:26 oligonucleótido IV-Sonda; 26 nt SEQ ID NO:27 DIG- 0; 1079 aa SEQ ID NO:28 Región codificante maíz-optimizada para DIG-; 3237 pb SEQ ID NO:29 DIG-111 ; 543 aa SEQ ID NO:30 Región codificante maíz-optimizada para DIG-; 1629 pb SEQ ID NO:31 DIG-112; 1044 aa SEQ ID NO:32 Región codificante maíz-optimizada para DIG-; 3132 pb SEQ ID NO:33 DIG-113; 508 aa SEQ ID NO:34 Región codificante maíz-optimizada para DIG-; 1524 pb SEQ ID NO:35 DIG-1 14; 582 aa SEQ ID NO:36 Región codificante maíz-optimizada para DIG-; 1746 bp BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1. Clasificaciones de daño por alimentación de piezas de hoja de maíz probadas in vitro con larvas neonatas del gusano cogollero (FAW) y gusano cogollero resistente a CryI F (rFAW). Plantas transgénicas TO seleccionadas después de la transformación con pDAS5162 fueron divididas en dos grupos' por selección de inmunotransferencia utilizando el anticuerpo DIG152RPC1 : plantas que no producen DIG-109 (en el lado izquierdo de la figura), y esas que tienen niveles detectables de DIG-109 (en el centro de la figura). Las plantas positivas a DIG-109 son clasificadas por nivel de expresión (de izquierda a derecha; de menor a mayor). El análisis HP para DSM2 fue completado en 36 líneas transformadas de pDAS5162. Un solo evento de integración, definido como 1-2 copias del gen, fue detectado en 95% de las muestras. Los resultados del bioensayo de plantas de Control Positivo y Negativo se muestran en el lado derecho de la figura.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Proteínas DIG-109 y DIG-152, y variantes insecticidamente activas Además de la proteína DIG-109 de longitud completa de SEQ ID NO:5 y la proteína DIG-152 de SEQ ID NO:3, la invención abarca variantes insecticidamente activas. Por el término "variante", los solicitantes pretenden incluir fragmentos, ciertos mutantes de deleción e inserción, y ciertas proteínas de fusión. El segmento de toxina núcleo Cryl Ca de DIG-109 y DIG-152 es una proteína Cry de tres dominios clásica. Como un prólogo para describir variantes de las proteínas DIG-109 y DIG-152 que son incluidas en la invención, será útil revisar brevemente la arquitectura de las proteínas Cry de tres dominios en general y de las toxinas de las proteínas DIG-109 y DIG-152 en particular.

Una mayoría de moléculas de proteínas cristalinas de delta-endotoxina de Bacillus thuringiensis están compuestas por dos segmentos funcionales. La toxina núcleo resistente a proteasa es el primer segmento y corresponde a aproximadamente la primera mitad de la molécula proteica. La molécula de la protoxina de -130 kDa completa es rápidamente procesada al segmento núcleo resistente por proteasas en el intestino de los insectos. El segmento que es delecionado mediante este procesamiento será denominado en esta invención el "segmento de protoxina". El segmento de protoxina se cree que participa en la formación de cristales de toxinas (Arvidson et al., (1989). El segmento de protoxina puede así conferir una especificidad de insecto parcial para la toxina limitando la accesibilidad del núcleo al insecto reduciendo el procesamiento de proteasa de la molécula de toxina (Haider et al., (1986) o reduciendo la solubilidad de la toxina (Aronson et al., (1991 ). Las toxinas B.t. , aun dentro de una cierta clase, varían hasta cierto grado en longitud y en la ubicación precisa de la transición del segmento de toxina núcleo al segmento de protoxina. La transición del segmento de toxina núcleo al segmento de protoxina se producirá típicamente entre aproximadamente 50% y aproximadamente 60% de la toxina de longitud completa. SEQ ID NO:3 describe la secuencia de 1 164 aminoácidos del polipéptido DIG-152 de longitud completa, del cual los 619 aminoácidos N-terminales comprenden la toxina núcleo CryI Ca descrita como SEQ ID NO:1. SEQ ID NO:5 describe la secuencia de 1 164 aminoácidos del polipéptido DIG-109 de longitud completa, del cual los 619 aminoácidos de N-terminal comprenden la toxina núcleo CryI Ca.

Las estructuras cristalinas tridimensionales han sido determinadas para Cry1Aa1 , Cry2Aa1 , Cry3Aa1 , Cry3Bb1 , Cry4Aa, Cry4Ba y Cry8Ea1. Estas estructuras para las toxinas núcleo son notablemente similares y están compuestas por tres dominios distintos con las características descritas más adelante (revisado en de Maagd et al., 2003).

El dominio I es un manojo de siete hélices alfa donde la hélice cinco está rodeada por seis hélices antipáticas. Este dominio ha sido implicado en la formación de poros y comparte homología con otras proteínas formadoras de poros incluyendo hemolisinas y colicinas. El dominio I de la proteína de toxina núcleo CryI Ca comprende los residuos de aminoácidos 36 a 254 de SEQ ID NO:1. [Debe entenderse que las proteínas quiméricas DIG-109 y DIG-152 comprenden el segmento de toxina núcleo CryICa, y por lo tanto las coordenadas asignadas a la secuencia de aminoácidos del segmento de toxina núcleo CryI Ca según lo descrito en SEQ ID NO:1 son aplicables también a la secuencia de aminoácidos de la proteína quimérica DIG-109 descrita en SEQ ID N0:5 y la secuencia de aminoácidos de la proteina quimérica DIG-152 descrita en SEQ ID NO:3.

El dominio II está formado por tres láminas beta antiparalelas empaquetadas entre sí en un prisma beta. Los lazos de este dominio juegan roles importantes en la unión a receptores del intestino medio de los insectos. En proteínas Cry A, los lazos expuestos a la superficie en los ápices de las láminas beta del Dominio II están involucrados en la unión a receptores de cadherina de lepidópteros. Los lazos del dominio II de Cry3Aa se unen a una metaloproteasa asociada a la membrana de Leptinotarsa decemlineata (Say) (escarabajo de la papa del Colorado) en forma similar (Ochoa-Campuzano et al., 2007). El dominio II comparte homología con ciertas proteínas de unión a carbohidratos incluyendo vitelina y jacalina. El dominio II de la proteína de toxina núcleo CryI Ca comprende los residuos de aminoácidos 262 a 458 de SEQ ID NO.1.

El dominio III es un sándwich beta de dos láminas beta antiparalelas. Estructuralmente, este dominio está relacionado con los dominios de unión a carbohidratos de proteínas tales como glucanasas, galactosa oxidasa, sialidasa y otras. El dominio III une ciertas clases de proteínas receptoras y tal vez participa en la inserción de un pre-poro de toxina oligomérico que interactúa con una segunda clase de receptores, cuyos ejemplos son aminopeptidasa y fosfatasa alcalina en el caso de las proteínas CryiA (Pigott y Ellar, 2007). Aun deben identificarse receptores de dominio III de Cry análogos en Coleópteros. Los bloques 2 y 3 de secuencias de B.t. conservadas mapean cerca del término N y del término C del Dominio 2, respectivamente. Por ende, estos bloques 2 y 3 de secuencias conservadas son regiones límites aproximadas entre los tres dominios funcionales. Estas regiones de homología proteica y de ADN conservada han sido investigadas para modificar por técnicas de ingeniería genética toxinas de B.t. recombinantes (Patente Estadounidense No. 6090931 , WO 1991/01087, WO 1995/06730, WO 1998/022595). El Dominio III de la proteína CryICa comprende los residuos de aminoácidos 468 a 617 de SEQ ID NO: 1.

Se ha informado que la a-hélice 1 del Dominio I es eliminada luego de la unión al receptor. Aronson et al. (1999) demostraron que CryIAc unida a VMBC fue protegida de la disociación de la proteinasa K comenzando en el residuo 59, justo después que la a-hélice 1 ; resultados similares fueron citados para CryIAb. Gómez et al., (2002) descubrieron que los oligómeros CryIAb formados luego de la unión al receptor de VMBC carecían de la porción de a-hélice 1 del Dominio I. También, Soberon et al., (2007) han demostrado que mutantes de deleción de terminal N de CryIAb y CryIAc que carecen de aproximadamente 60 aminoácidos que abarcan a-hélice 1 en la estructura de Cry tridimensional son capaces de ensamblar monómeros de peso molecular de aproximadamente 60 kDa en pre-poros en ausencia de unión a cadherina. Estos mutantes de deleción de terminal N fueron reportados como activos en larvas de insectos resistentes a Cry. Por añadidura, Diaz-Mendoza et al., (2007) describieron fragmentos de CryIAb de 43 kDa y 46 kDa que retuvieron la actividad en el taladrador del maíz mediterráneo (Sesamia nonagrioides). Se demostró que estos fragmentos incluyen los residuos de aminoácidos 1 16 a 423; sin embargo, las secuencias de aminoácidos precisas no fueron elucidadas y el mecanismo de actividad de estos fragmentos proteolíticos es desconocido. Los resultados de Gómez et al., (2002), Soberon et al., 2007 y Diaz-Mendoza et al., (2007) contrastan con aquellos de Hofte et al., (1986), quienes informaron que la deleción de 36 aminoácidos del término N de CryIAb dio como resultado la pérdida de actividad insecticida.

Se ha deducido el comienzo y el final de las hélices 1 , 2A, 2B, 3, y 4, y la ubicación de las regiones espaciadoras entre las mismas en el Dominio I de la toxina núcleo CryICa comparando la secuencia de aminoácidos CryI Ca con la secuencia de aminoácidos para Cry8Ea1 , para la cual la estructura es conocida. Estas ubicaciones son descritas en el Cuadro 1 .

CUADRO 1 Coordenadas de aminoácidos de hélices a proyectadas de proteína de toxina núcleo CryICa Variantes de deleción de terminal amino de DIG- 09 v DIG- 52. En uno de sus aspectos, la invención provee variantes de DIG-109 y DIG-152 en las cuales la totalidad o parte de las alfa hélices 1 , 2A, y 2B están delecionadas para mejorar la actividad insecticida y evitar el desarrollo de resistencia por insectos. Estas modificaciones son realizadas para proporcionar vanantes de DIG-109 y DIG-152 con atributos mejorados, tales como un mejor espectro de pestes objetivo, potencia, y mejor manejo de resistencia a insectos. En algunas modalidades de la presente invención, las modificaciones en cuestión pueden afectar la eficacia de la activación de la protoxina y la formación de poros, conduciendo a intoxicación de insectos. Más específicamente, para proporcionar variantes de DIG-109 y DIG-152 con atributos mejorados, se describen deleciones por etapas que remueven parte del gen que codifica el término N. Las deleciones eliminan la totalidad de la a-hélice 1 y la totalidad o parte de la a-hélice 2 en el Dominio I, manteniendo al mismo tiempo la integridad estructural de las a-hélices 3 a 7. Por consiguiente, la presente invención se refiere a mejoras en la eficacia de las proteínas Cry realizadas por modificación genética de los componentes helicoidales a del Dominio 1 para una formación de poros más eficaz. Más específicamente, la presente invención se refiere en parte a proteínas DIG-109 y DIG-152 mejoradas diseñadas para tener deleciones de terminal N en regiones con homología de estructura secundaria putativa a a-hélices 1 y 2 en el Dominio I de proteínas Cry1.

Las deleciones para mejorar las propiedades insecticidas de las toxinas de DIG-109 y DIG-152 pueden iniciarse antes del inicio de a-hélice 2A pronosticado, y pueden terminarse después del extremo de a-hélice 2B, pero preferentemente no se extienden en a-hélice 3.

En el diseño de secuencias codificantes para las variantes de deleción de terminal N, un codón de inicio de ATG, que codifica metionina, es insertado en el extremo 5' de la secuencia nucleotídica diseñada para expresar la variante de deleción. Para secuencias diseñadas para utilizar en plantas transgénicas, puede ser beneficioso adherirse a la "regla de extremo N" ("N-end rule") de Varshavsky (1997). Se enseña que algunos aminoácidos pueden contribuir a la inestabilidad proteica y degradación proteica en células eucarióticas cuando se exhiben como el residuo de terminal N de una proteína. Por ejemplo, los datos recogidos de observaciones en células de levadura y de mamífero, indican que los aminoácidos desestabilizantes de terminal N son F, L, W, Y, R, K, H, I, N, Q, D, E y posiblemente P. Si bien los detalles específicos de los mecanismos de degradación proteica pueden diferir de algún modo entre los organismos, la conservación de identidad de aminoácidos destabilizantes de terminal N vista anteriormente sugiere que mecanismos similares pueden funcionar en células vegetales. Por ejemplo, Worley et al., (1998) descubrieron que en las plantas, la regla de extremo N incluye residuos básicos y aromáticos. Es una posibilidad que la disociación proteolítica por proteasas vegetales cerca del inicio de la a-hélice 3 de las proteínas insecticidas de B.t. en cuestión pueda exponer un aminoácido de terminal N desestabilizante. Dicho procesamiento puede apuntar a las proteínas disociadas para un rápido decaimiento y para limitar la acumulación de las proteínas insecticidas de B.t. hasta niveles insuficientes para un eficaz control de insectos. Por lo tanto, para variantes de deleción de terminal N que comienzan con uno de los aminoácidos desestabilizantes, los solicitantes prefieren agregar un codón que especifique un aminoácido G (glicina) entre la metionina de iniciación de la traducción y el aminoácido desestabilizante.

Los ejemplos 13 y 14 proporcionan ejemplos específicos de variantes de deleción de amino-terminal de DIG-109 y DIG-152 de conformidad con la invención. Pueden identificarse fragmentos útiles adicionales mediante bioensayo de insectos de fragmentos generados por digestión con tripsina o quimiotripsina de la proteína cristalina solubilizada de longitud completa para determinar cuales fragmentos retienen toxicidad, o pueden identificarse determinando la secuencia de un fragmento de proteina tóxica codificado por fragmentos de ADN de la región codificante de proteína Cry. Esta proteína tendrá mayormente una truncación de terminal N corta y una de terminal C larga en comparación con la protoxina. El extremo de terminal N del fragmento tóxico más pequeño es determinado convenientemente por la determinación de secuencias de aminoácidos de terminal N de proteína cristalina soluble tratada con tripsina o quimiotripsina mediante técnicas disponibles en forma rutinaria en la técnica.

Toxinas Quiméricas Se han reportado previamente proteínas quiméricas que utilizan el dominio de la toxina núcleo de una toxina Cry fusionada al segmento de protoxina de otra toxina Cry. Las variantes DIG-109 y DIG- 52 incluyen toxinas que comprenden un segmento núcleo de toxina de terminal N de una toxina CryI Ca (la cual puede ser de longitud completa o puede tener las deleciones de terminal N antes descritas) fusionada a un segmento de protoxina heterologo en algún punto pasando el extremo del segmento de la toxina núcleo. La transición al segmento de protoxina heterologo puede ocurrir en aproximadamente la unión de la toxina núcleo/ protoxina o, alternativamente, una porción de la protoxina nativa (que se extiende pasando el segmento de toxina núcleo) puede ser retenida con la transición a la protoxina heteróloga que ocurre corriente abajo. Como un ejemplo, una toxina quimérica de la presente invención tiene el segmento de toxina núcleo completo de CryI Ca (aminoácidos 1-619) y una protoxina heteróloga (aminoácidos 620 hasta el término C). En modalidades preferidas, el segmento heterologo de la protoxina es derivado de una delta-endotoxina CryIAb, según lo ilustrado en SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:4.

Variantes de sensibilidad a proteasa Las proteasas de intestino de insectos típicamente funcionan para ayudar al insecto a obtener aminoácidos necesarios de la proteína dietaria. Las proteasas digestivas de insecto mejor comprendidas son serina proteasas, las cuales parecen ser el tipo más común (Englemann y Geraerts, 1980), particularmente en especies lepidópteras. Los insectos coleópteros tienen intestinos que son más neutros a ácidos que los intestinos de los lepidópteros. La mayoría de las larvas y adultos de coleópteros, por ejemplo el escarabajo de la papa del Colorado, tiene intestinos medios ligeramente ácidos, y las cisteína proteasas proporcionan la principal actividad proteolítica (Wolfson y Murdock, 1990). Más precisamente, Thie y Houseman (1990) identificaron y caracterizaron a las cisteína proteasas, tipo B de catepsina y tipo H de catepsina, y la aspartil-proteasa, tipo D de catepsina, en el escarabajo de la papa del Colorado. Gillikin eí al., (1992) caracterizaron la actividad proteolítica en los intestinos de larvas del gusano de las raíces del maíz occidental y encontraron principalmente cisteína proteasas. La Patente estadounidense No. 7230167 describió que la serina proteasa, catepsina G, existe en el gusano de las raíces del maíz occidental. La diversidad y diferentes niveles de actividad de las proteasas de intestino de insectos pueden influir sobre la sensibilidad del insecto a una toxina B.t. en particular.

En otra modalidad de la invención, los sitios de disociación de proteasa pueden ser modificados por técnicas de ingeniería genética en sitios deseados para efectuar el procesamiento proteico dentro del intestino medio de larvas susceptibles de ciertas pestes de insectos (Walters eí al., 2008). Estos sitios de disociación de proteasas pueden ser introducidos mediante métodos tales como síntesis química de genes o PCR de superposición de corte y empalme ("splice overlap PCR") (Horton et al., 1989). Las secuencias de reconocimiento de serina proteasas, por ejemplo, pueden ser opcionalmente insertadas en sitios específicos en la estructura de proteína Cry para efectuar el procesamiento proteico en puntos de deleción deseados dentro del intestino medio de larvas susceptibles. Las serina proteasas que pueden ser empleadas de ese modo incluyen serina proteasas de intestino medio de lepidópteros tales como tripsina o enzimas del tipo tripsina, quimiotripsina, elastasa, efe. (Christeller et al., 1992). Adicionalmente, los sitios de deleción identificados empíricamente secuenciando productos de digestión de proteína Cry generados con preparaciones de proteasas de intestino medio de larva no fraccionadas o por unión a vesículas de membrana borde de cepillo pueden ser modificados por técnicas de ingeniería genética para efectuar la activación proteica. Las proteínas Cry modificadas generadas ya sea por deleción de genes o por introducción de sitios de disociación de proteasas tienen actividad mejorada en pestes lepidópteras incluyendo Ostrinia nubilalis, Diatraea grandiosella, Helicoverpa zea, Agrotis Ípsilon, Spodoptera frugiperda, Spodoptera exigua, Diatraea saccharalis, Loxagrotis albicosta, y otras pestes objetivo.

Las serina proteasas de coleópteros tales como tripsina, quimiotripsina y proteasa del tipo catepsina G, cisteína proteasas de coleóptero tales como catepsinas (proteasas tipo B, tipo L, tipo O y tipo K) (Koiwa et al., (2000) y Bown et al., (2004), metaloproteasas coleópteras tales como ADAM10 (Ochoa-Campuzano et al., (2007)), y proteasas de ácido aspártico de coleóptero tales como catepsinas tipo D y tipo E, pepsina, plasmepsina, y quimiosina pueden ser adicionalmente empleadas mediante modificación por técnicas de ingeniería genética de secuencias de reconocimiento apropiadas en sitios de procesamiento deseados para efectuar el procesamiento de proteínas Cry dentro del intestino medio de larvas susceptibles de ciertas pestes de insectos.

Una ubicación preferida para la introducción de dichos sitios de disociación de proteasa puede estar dentro de la región "espadadora" entre la ct-hélice2B y la a-hélice 3, por ejemplo dentro de los aminoácidos 85 a 90 de la proteína de toxina núcleo CryI Ca (SEQ ID NO:1 y CUADRO 1). Las proteínas Cry modificadas generadas ya sea por deleción de genes o por introducción de sitios de disociación de proteasas tienen actividad mejorada en pestes de insectos incluyen, aunque sin limitarse a, gusano cogollero, taladrador de la caña de azúcar y pestes similares.

Existen diversas tecnologías para permitir la determinación de la secuencia de los aminoácidos que comprenden los residuos de terminal N o de terminal C de polipéptidos. Por ejemplo, puede emplearse metodología de degradación Edman automatizada en forma secuencial para determinar la secuencia de aminoácidos de terminal N de hasta 30 residuos de aminoácidos con 98% de precisión por cada residuo. Adicionalmente, la determinación de la secuencia de los aminoácidos que comprenden el extremo carboxi de polipéptidos es también posible (Bailey et al., (1992); Patente estadounidense No. 6046053). Por consiguiente, en algunas modalidades, las proteínas Cry de B.t. las cuales han sido activadas por medio del procesamiento proteolítico, por ejemplo, mediante proteasas preparadas del intestino de un insecto, pueden ser caracterizadas y los aminoácidos de terminal N y de terminal C del fragmento de toxina activada identificados. Las variantes DIG-109 y DIG-152 producidas por introducción o eliminación de sitios de procesamiento de proteasa en posiciones apropiadas en la secuencia codificante para permitir, o eliminar, la disociación proteolítica de una proteína variante más grande por proteasas de insecto, planta o microorganismos están dentro del alcance de la invención. El resultado final de dicha manipulación se entiende que es la generación de moléculas de fragmento de toxina que tienen la misma o mejor actividad que la proteína de toxina intacta (de longitud completa).

Dominios de las toxinas de DIG-109 y DIG-152 Los dominios separados del segmento de toxina núcleo CryI Ca según lo ejemplificado en las toxinas de DIG-109 y DIG-152, (y variantes que son 90%, 95%, o 97% idénticas a dichos dominios) se espera que sean útiles para formar combinaciones con dominios de otras toxinas Cry para proporcionar nuevas toxinas con mayor espectro de toxicidad a las pestes, potencia mejorada o mayor estabilidad proteica. El dominio I de la proteína de toxina núcleo CryI Ca consiste en los residuos de aminoácidos 36 a 254 de SEQ ID NO:1. El dominio II de la proteína de toxina núcleo CryI Ca consiste en los residuos de aminoácidos 262 a 458 de SEQ ID NO:1. El dominio III de la proteína de toxina núcleo CryICa consiste en los residuos de aminoácidos 468 a 617 de SEQ ID NO:1. El intercambio de dominios ("domain swapping") o barajado de dominios ("domain shuffiing") es un mecanismo para generar proteínas de delta-endotoxinas alteradas. Los dominios II y III pueden ser intercambiados entre proteínas de delta-endotoxina, dando como resultado toxinas híbridas o quiméricas con actividad pesticida mejorada o espectro objetivo mejorado. El dominio II está involucrado en la unión al receptor. El dominio III se une a ciertas clases de proteínas receptoras y tal vez participa en la inserción de un pre-poro de toxina oligomérico. Algunas sustituciones de dominio III en otras toxinas han demostrado producir toxicidad superior contra Spodoptera exigua (de Maagd et al., (1996) y existe una guía sobre el diseño de los intercambios de dominios de toxinas Cry (Knight et al., (2004).

Los métodos para generar proteínas recombinantes y analizarlas para actividad pesticida son bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Naimov et al., (2001 ), de Maagd er a/., (1996), Ge er a/., (1991 ), Schnepf et al., (1990), Rang et al., (1999)). El dominio I de las proteínas CrylA y Cry3A ha sido estudiado para determinar la capacidad de insertar y formar poros en membranas. Las hélices alfa 4 y 5 del Dominio I juegan roles claves en la inserción de membrana y formación de poros (Walters et al., 1993, Gazit et al., 1998; Nunez-Valdez et al., 2001 ), si bien son propuestas otras hélices para contactar la superficie de membrana como las varillas de un paraguas (Bravo et al., (2007); Gazit et al., (1998)).

Variantes DIG-109 v DIG-152 creadas realizando una cantidad limitada de deleciones, sustituciones o adiciones de aminoácidos Pueden realizarse fácilmente deleciones, sustituciones y adiciones de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos del segmento de toxina núcleo CryICa de SEQ ID NO:1 en forma secuencial y los efectos de dichas variaciones sobre la actividad insecticida pueden ser analizados por bioensayo. Siempre que el número de cambios sea limitado en cantidad, dicho ensayo no involucra experimentación no razonable. La invención incluye variantes insecticidamente activas de la toxina núcleo (aminoácidos 1-619 de SEQ ID ??.?) en las cuales se han realizado hasta 10, hasta 15, o hasta 20 adiciones, deleciones o sustituciones independientes.

La invención incluye variantes de DIG-109 y DIG-152 que tienen un segmento de toxina núcleo que es 90%, 95% o 97% idéntico a los aminoácidos 1-619 de SEQ ID NO:1. Las vanantes pueden ser realizadas efectuando mutaciones al azar o las variantes pueden ser diseñadas. En el caso de mutantes diseñadas, existe una elevada probabilidad de generar variantes con actividad similar a la toxina nativa cuando se mantiene la identidad de aminoácidos en regiones importantes de la toxina que representan la actividad biológica o que están involucradas en la determinación de la configuración tridimensional la cual es finalmente responsable de la actividad biológica. También se producirá una elevada probabilidad de retener la actividad si las sustituciones son conservadoras. Los aminoácidos pueden ser colocados en las siguientes clases: no polares, polares no cargados, básicos y ácidos. Las sustituciones conservadoras por las cuales un aminoácido de una clase es reemplazado por otro aminoácido del mismo tipo tienen menos probabilidades de alterar materialmente la actividad biológica de la variante. El Cuadro 2 provee un listado de ejemplos de aminoácidos que pertenecen a cada clase.

CUADRO 2 Clase de Aminoácido Ejemplos de Aminoácidos Cadenas laterales no Ala, Val, Leu, lie, Pro, Met, Phe, Trp polares Cadenas Laterales Polares Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln No Cargadas Cadenas Laterales Acidas Asp, Glu Cadenas Laterales Básicas Lys, Arg, His Cadenas Laterales Thr, Val, He ramificadas beta Cadenas Laterales Tyr, Phe, Trp, His Aromáticas En algunos casos, también pueden realizarse sustituciones no conservadoras. Un factor importante es que estas sustituciones no deberían disminuir significativamente la actividad biológica de la toxina. Las variantes incluyen polipéptidos que difieren en secuencia de aminoácidos debido a mutagénesis. Las proteínas variantes abarcadas por la presente invención son biológicamente activas, es decir continúan teniendo la actividad biológica deseada de la proteína nativa, es decir, reteniendo la actividad pesticida.

Pueden diseñarse además proteínas variantes que difieren en el nivel de secuencia pero que retengan la misma o similar estructura tridimensional esencial total, distribución de carga superficial y similares. Ver, por ej. Patente Estadounidense No. 7058515; Larson et al., (2002); Stemmer (1994a, 1994b, 1995); y Crameri et al., (1996a, 1996b, 1997). Ácidos Nucleicos Los ácidos nucleicos aislados que codifican la toxina DIG-109 o que codifican la toxina DIG-152 son un aspecto de la presente invención. Esto incluye ácidos nucleicos que codifican SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:5, y sus complementos, así como también otros ácidos nucleicos que codifican variantes insecticidas de SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:3, y SEQ ID NO:5. Por "aisladas" los solicitantes quieren decir que las moléculas de ácido nucleico han sido retiradas de su medioambiente nativo y han sido colocadas en un medioambiente diferente por la mano del hombre. Debido a la redundancia del código genético, una variedad de secuencias de ADN diferentes puede codificar las secuencias de aminoácidos descritas en esta invención. El experto en la técnica sabe bien crear estas secuencias de ADN alternativas que codifican a las mismas, o esencialmente las mismas, toxinas.

Síntesis de genes Los genes que codifican las proteínas Cry mejoradas descritas en esta invención pueden ser preparados mediante una variedad de métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los segmentos de genes sintéticos y genes sintéticos pueden ser preparados mediante química de triéster de fosfito y fosforamidita (Caruthers et al, 1987), y los proveedores comerciales se encuentran disponibles para realizar síntesis de genes a demanda. Los genes de longitud completa pueden ser ensamblados de diversas maneras incluyendo, por ejemplo, por ligación de fragmentos de restricción o ensamble de reacción en cadena de polimerasa de oligonucleótidos superpuestos (Stewart y Burgin, 2005). Por añadidura, se pueden efectuar deleciones de genes terminales mediante amplificación por PCR utilizando oligonucleótidos terminales específicos del sitio.

Por ejemplo, pueden realizarse ácidos nucleicos que codifican la toxina DIG-109 o toxina DIG-152, por construcción sintética mediante métodos practicados en la actualidad por cualquiera de los diversos proveedores comerciales. (Ver, por ejemplo, Patente estadounidense N° 7482119B2). Estos genes, o porciones o variantes de los mismos, también pueden ser construidos sintéticamente, por ejemplo, mediante el uso de un sintetizador de genes y los métodos de diseño de, por ejemplo, la Patente estadounidense N° 5380831. Alternativamente, pueden construirse fácilmente variaciones de genes sintéticos o de presentación natural utilizando técnicas de biología molecular convencionales para preparar mutaciones de puntos. También pueden realizarse fragmentos de estos genes utilizando exonucleasas o endonucleasas disponibles en el mercado de acuerdo con procedimientos convencionales. Por ejemplo, pueden emplearse enzimas tales como Sa/31 o mutagénesis dirigida al sitio para cortar sistemáticamente nucleótidos de los extremos de estos genes. Además, pueden obtenerse fragmentos de genes los cuales codifican fragmentos de toxina activos utilizando una variedad de enzimas de restricción.

Dada la secuencia de aminoácidos para una toxina DIG-109 o para una toxina DIG-152, puede diseñarse una secuencia codificante mediante traducción inversa de la secuencia proteica utilizando codones preferidos por el huésped pretendido, y luego refinando la secuencia utilizando codones alternativos (redundantes) para retirar secuencias que podrían causar problemas. Por añadidura, pueden construirse por técnicas de ingeniería genética codones de detención periódicos en los marcos de lectura no codificantes para eliminar marcos de lectura abierta largos, inadvertidos.

Cuantificación de Identidad de Secuencias Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o de dos secuencias de ácidos nucleicos, las secuencias son alineadas para propósitos de comparación óptima. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función de la cantidad de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, porcentaje de identidad = cantidad de posiciones idénticas / cantidad total de posiciones (por ej., posiciones superpuestas) x100). En una modalidad, las dos secuencias tienen el mismo largo. El porcentaje de identidad entre dos secuencias puede ser determinado utilizando técnicas similares a aquellas descritas más adelante, con o sin permitir espacios vacíos. En el cálculo del porcentaje de identidad, se cuentan típicamente apareamientos exactos.

La determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias puede lograrse utilizando un algoritmo matemático. Un ejemplo no limitativos de ese tipo de algoritmo es BLAST (AltschuI ef al., 1990, y arlin y AltschuI, 1990), modificado como en Karlin y AltschuI (1993), e incorporado en los programas BLASTN y BLASTX. Las búsquedas de BLAST pueden ser convenientemente empleadas para identificar secuencias homologas (similares) a una secuencia de referencia en bases de datos de ácido nucleico o proteína. Las búsquedas en BLASTN pueden realizarse, (puntuación = 100, longitud de palabra = 12) para identificar secuencias de nucleótidos que tienen homología con las moléculas de ácido nucleico reivindicadas de la invención. Las búsquedas en BLASTX pueden llevarse a cabo (puntuación = 50, longitud de palabra = 3) para identificar secuencias de aminoácidos que tienen homología con moléculas de proteínas insecticidas reivindicadas de la invención.

Gapped BLAST AltschuI ef al., (1997) puede utilizarse para obtener alineaciones con espacios vacíos (gaps) con fines comparativos. Alternativamente, puede emplearse PSI-Blast para realizar una búsqueda iterada que detecta relaciones distantes entre moléculas AltschuI et al., (ibid). Cuando se emplean los programas BLAST, Gapped BLAST, y PSI-Blast, pueden utilizarse los parámetros de error de los respectivos programas. Véase www.ncbi.nlm.nih.gov.

Un ejemplo no limitativo de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo ClustalW (Thompson ef al., 1994). ClustalW compara secuencias y alinea la totalidad de la secuencia de ADN o aminoácidos, y por ende puede proporcionar información acerca de la conservación de secuencia de la totalidad de la secuencia de aminoácidos o secuencia de nucleótidos. El algoritmo ClustalW es empleado en diversos paquetes de software de análisis de ADN/ aminoácidos disponibles en el mercado, tal como el módulo ALIGNX del Vector NTI Program Suite (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA). Al alinear secuencias de aminoácidos con ALIGNX, se puede emplear convenientemente las configuraciones de error con una penalidad abierta de Gap de 10, una penalidad de extensión de Gap de 0.1 y la matriz de comparación blosum63mt2 para evaluar el porcentaje de similitud de aminoácidos (consenso) o identidad entre las dos secuencias. Al alinear secuencias de ADN con ALIGNX, se puede emplear convenientemente las configuraciones de error con una penalidad abierta Gap de 15, una penalidad de extensión Gap de 6.6 y la matriz de comparación swgapdnamt para evaluar el porcentaje de identidad entre las dos secuencias.

Otro ejemplo no limitativo de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es aquel de Myers y Miller (1988). Ese tipo de algoritmo es incorporado en el programa wSTRETCHER, el cual es parte del paquete de software de alineación de secuencias wEMBOSS (disponible en http://emboss.sourceforge.net/). wSTRETCHER calcula una alineación global óptima de dos secuencias utilizando una modificación del algoritmo de programación dinámica clásico el cual utiliza espacio lineal. La matriz de sustitución, penalidad de inserción de espacio vacío (gap) y penalidades de extensión de espacio vacío (gap) empleados para calcular la alineación pueden ser especificados. Al utilizar el programa wSTRETCHER para comparar secuencias de nucleótidos, se puede emplear una penalidad abierta Gap de 16 y una penalidad de extensión Gap de 4 con el archivo de matriz de puntuación EDNAFULL. Al utilizarse para comparar secuencias de aminoácidos, una penalidad abierta Gap de 12 y una penalidad de extensión Gap de 2 pueden emplearse con el archivo de matriz de puntuación EBLOSUM62.

Un ejemplo no limitativo adicional de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es aquel de Needleman y Wunsch (1970), el cual es incorporado en los paquetes de software de alineación de secuencias GAP Versión 10 y wNEEDLE (http://emboss.sourceforge.net/). Puede emplearse GAP Versión 10 para determinar la identidad o similitud de secuencias utilizando los siguientes parámetros: para una secuencia nucleotídica, % de identidad y % de similitud son encontrados utilizando Peso de GAP (GAP Weight) de 50 y Longitud Peso (Length Weight) de 3, y la matriz de puntuación (scoring) nwsgapdna.cmp. Para comparación de secuencias de aminoácidos, se determina el % de identidad o % de similitud utilizando peso GAP de 8 y longitud peso de 2, y el programa de puntuación BLOSUM62. wNEEDLE lee dos secuencias de entrada, encuentra la alineación óptima (incluyendo gaps) a lo largo de su longitud entera, y escribe su alineación de secuencia global óptima al archivo. El algoritmo explora todas las alineaciones posibles y selecciona la mejor, utilizando una matriz de puntuación (scoring) que contiene valores para cada coincidencia de nucleótido o residuo posible. wNEEDLE encuentra la alineación con el máximo puntaje posible, donde el puntaje de una alineación es igual a la suma de los apareamientos tomados de la matriz de puntuación, menos las penalidades que surgen de los gaps de abertura o extensión en las secuencias alineadas. La matriz de sustitución y penalidades de abertura y extensión de gaps son especificadas por el usuario. Cuando se comparan las secuencias de aminoácidos, se emplean una penalidad de abertura de Gap de error de 10, una penalidad de extensión de Gap de 0.5, y la matriz de comparación EBLOSUM62. Cuando las secuencias de ADN son comparadas utilizando wNEEDLE, se emplea una penalidad de abertura de Gap de 10, una penalidad de extensión de Gap de 0.5, y la matriz de comparación EDNAFULL.

También pueden emplearse programas equivalentes. Por "programa equivalente" se quiere decir cualquier programa de comparación de secuencias que, para cualesquiera dos secuencias en cuestión, genera una alineación que tiene apareamientos de residuos de aminoácidos o nucleotídicos idénticos y un porcentaje idéntico de identidad de secuencias cuando se comparan con la alineación correspondiente generada por ALIGNX, wNEEDLE, o wSTRETCHER. El % de identidad es el porcentaje de apareamientos idénticos entre las dos secuencias con respecto a la región alineada reportada (incluyendo cualquier espacio vacio (gap) en la longitud) y el % de similitud es el porcentaje de apareamientos entre las dos secuencias con respecto a la región alineada reportada (incluyendo cualquier espacio vacio en la longitud).

La alineación también puede llevarse a cabo manualmente por inspección.

Huéspedes recombinantes Los genes que codifican toxinas de la presente invención pueden ser introducidos en una amplia variedad de huéspedes microbianos o vegetales. La expresión del gen de toxina da como resultado, directa o indirectamente, en la producción intracelular y mantenimiento de la proteína pesticida. Con huéspedes microbianos adecuados, por ej. Pseudomonas, los microbios pueden ser aplicados al medioambiente de la peste, donde proliferarán y serán ingeridos. El resultado es un control de la peste. Alternativamente, el microbio que alberga al gen de toxina puede ser tratado bajo condiciones que prolongan la actividad de la toxina y estabilizan la célula. La célula tratada, la cual retiene la actividad tóxica, luego puede ser aplicada al medioambiente de la peste objetivo.

Donde el gen de toxina B.t. es introducido por medio de un vector adecuado en un huésped microbiano, y dicho huésped es aplicado al medioambiente en un estado viviente, es esencial que sean empleados ciertos microbios huéspedes. Los huéspedes de microorganismos son seleccionados los cuales se sabe que ocupan la "fitosfera" (filoplano, filosfera, rizosfera y/o rizoplano) de uno o más cultivos de interés. Estos microorganismos se seleccionan de modo de ser capaces de competir exitosamente en el medioambiente en particular (cultivo y otros hábitats de insectos) con los microorganismos autóctonos del tipo silvestre, proporcionar el mantenimiento estable y expresión del gen que codifica el pesticida polipeptídico, y, deseablemente, proporcionan una protección mejorada del pesticida de la degradación e inactivación por el medioambiente.

Una gran cantidad de microorganismos son conocidos que habitan en el filoplano (la superficie de las hojas de las plantas) y/o la rizosfera (las raíces de las plantas que rodean el suelo) de una amplia variedad de cultivos importantes. Estos microorganismos incluyen bacterias, algas, y hongos. De particular interés son microorganismos, tales como bacterias, por ej. de géneros Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Sinorhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc, y Alcaligenes; hongos, particularmente levadura, por ej., los géneros Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula, y Aureobasidium. De particular interés son especies bacterianas de fitosfera tales como Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium radiobacter, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Sinorhizobium meliloti (anteriormente Rhizobium meliloti), Alcaligenes eutrophus, y Azotobacter vinelandii; y especies de levadura de fitosfera tales como Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae, y Aureobasidium pollulans. De particular interés son los microorganismos pigmentados.

Métodos para controlar pestes de insectos Cuando un insecto entra en contacto con una cantidad eficaz de toxina administrada por medio de la expresión de plantas transgénicas, la o las composiciones proteicas formuladas, composición o composiciones proteicas pulverizables, una matriz sebo u otro sistema de administración, los resultados son típicamente la muerte del insecto o los insectos no se alimentan de la fuente la cual hace a las toxinas disponibles para los insectos.

Las toxinas de proteína de la presente invención pueden ser "aplicadas" o proporcionadas para contactar a los insectos objetivos de diversas maneras. Por ejemplo, pueden emplearse plantas transgénicas (donde la proteína es producida por, y está presente en, la planta) y son bien conocidas en la técnica. La expresión de los genes de toxina también puede ser lograda selectivamente en tejidos específicos de las plantas, tales como las raíces, hojas, etc. Esto puede lograrse por medio del uso de promotores específicos de tejido, por ejemplo. Las aplicaciones de pulverización "spray-on" son otro ejemplo y son también conocidas en la técnica. Las proteínas de la presente invención pueden ser apropiadamente formuladas para el uso final deseado, y luego pulverizadas (o de otro modo aplicadas) sobre la planta y/o alrededor de la planta/ a la proximidad de la planta que se va a proteger, antes de descubrirse una infestación, después de que los insectos objetivo son descubiertos, tanto antes como después, y similares. También pueden emplearse gránulos sebo, por ejemplo, y son conocidos en la técnica.

Plantas transgénicas Las proteínas de la presente invención pueden ser empleadas para proteger de manera práctica cualquier tipo de planta del daño por un insecto lepidóptero. Los ejemplos de ese tipo de plantas incluyen maíz, girasol, soya, algodón, cañóla, arroz, sorgo, tabaco, trigo, cebada, vegetales, plantas decorativas, pimientos (incluyendo ají picante), remolachas, fruta y césped para nombrar solo algunos. Los métodos para transformar plantas son bien conocidos en la técnica, y métodos de transformación ilustrativos son descritos en los Ejemplos.

Una modalidad preferida de la presente invención es la transformación de plantas con genes que codifican la proteína insecticida en cuestión o sus variantes. Las plantas transformadas son resistentes al ataque por una peste objetivo de insectos en virtud de la presencia de cantidad controladoras de la proteína insecticida en cuestión o sus variantes en las células de la planta transformada. Incorporando material genético que codifica las propiedades insecticidas de las toxinas insecticidas de B.t. en el genoma de una planta comida por una peste de insecto en particular, el adulto o las larvas morirían después de consumir la planta alimento. Se han transformado numerosos miembros de las clasificaciones de monocotiledóneas y dicotiledóneas. Los cultivos agronómicos transgénicos así como también las frutas y verduras son de interés comercial. Dichos cultivos incluyen, aunque sin limitarse a, maíz, arroz, soya, cañóla, girasol, alfalfa, sorgo, trigo, algodón, maníes, tomates, papas y similares. Existen diversas técnicas para introducir material genético extraño en células de plantas, y para obtener plantas que mantengan establemente y expresen el gen introducido. Dichas técnicas incluyen aceleración de material genético recubierto sobre micropartículas directamente en células (Patente estadounidense N° 4945050 y Patente estadounidense N° 5141 131). Las plantas pueden ser transformadas utilizando tecnología Agrobacterium, véase la Patente estadounidense N° 5177010, Patente estadounidense N° 5104310, Solicitud de patente europea No. 0131624B1 , Solicitud de patente europea No. 120516, Solicitud de patente europea No. 159418B1 , Solicitud de patente europea No. 176112, Patente estadounidense N° 5149645, Patente estadounidense N° 5469976, Patente estadounidense N° 5464763, Patente estadounidense N° 4940838, Patente estadounidense N° 4693976, Solicitud de patente europea No. 1 16718, Solicitud de patente europea No. 290799, Solicitud de patente europea No. 320500, Solicitud de patente europea No. 604662, Solicitud de patente europea No. 627752, Solicitud de patente europea No. 0267159, Solicitud de patente europea No. 0292435, Patente estadounidense N° 5231019, Patente estadounidense N° 5463174, Patente estadounidense N° 4762785, Patente estadounidense N° 5004863, y Patente estadounidense N° 5159135. Otra tecnología de transformación incluye tecnología WHISKERS™, ver la Patente estadounidense N° 5302523 y la Patente estadounidense N° 5464765. También se ha empleado tecnología de electroporación para transformar plantas, véase WO 1987/06614, Patente estadounidense N° 5472869, Patente estadounidense N° 5384253, WO 1992/09696, y WO 1 993/21335. Todas estas patentes y publicaciones de transformación son incorporadas a la presente como referencia. Además de numerosas tecnologías para transformar plantas, el tipo de tejido que es contactado con los genes extraños puede variar también. Dicho tejido incluiría pero no estaría limitado a tejido embriogénico, tejido de callo tipo I y II, hipocotilo, meristema y tejidos similares. Casi todos los tejidos vegetales pueden ser transformados durante la desdiferenciación utilizando técnicas apropiadas dentro del conocimiento de un experto.

Los genes que codifican toxinas DIG-109 o DIG-152 o sus variantes pueden ser insertados en células de plantas utilizando una variedad de técnicas las cuales son bien conocidas en la técnica según lo descrito anteriormente. Por ejemplo, una gran cantidad de vectores de clonación que comprenden un marcador que permite la selección de las células microbianas transformadas y un sistema de replicación funcional en Escherichia coli están disponibles para la preparación y modificación de genes extraños para inserción en plantas superiores. Dichas manipulaciones pueden incluir, por ejemplo, la inserción de mutaciones, truncaciones, adiciones, o sustituciones según lo deseado para el uso pretendido. Los vectores comprenden, por ejemplo, pBR322, serie pUC, serie M13mp, pACYC184, etc. Por consiguiente, la secuencia que codifica la proteína Cry o variantes puede ser insertada en el vector en un sitio de restricción adecuado. El plásmido resultante es empleado para la transformación de E. coli, cuyas células son cultivadas en un medio nutriente adecuado, luego recolectadas y lisadas de. modo que las cantidades trabajables del plásmido sean recuperadas. El análisis de secuencias, análisis de fragmentos de restricción, electroforesis, y otros métodos de bioquímica-biología molecular son generalmente llevados a cabo como métodos de análisis. Después de cada manipulación, la secuencia de ADN empleada puede ser disociada y unida a la siguiente secuencia de ADN. Cada secuencia de ADN manipulada puede ser clonada en los mismos o en otros plásmidos.

El uso de vectores que contienen T-DNA para la transformación de células vegetales ha sido intensamente investigado y suficientemente descrito en la Solicitud de patente europea No. 120516; Lee y Gelvin (2008), Fraley et al., (1986), y An et al., (1985), y está bien establecido en el campo.

Una vez que el ADN insertado ha sido integrado en el genoma de la planta, es relativamente estable a través de generaciones subsiguientes. El vector utilizado para transformar la célula vegetal normalmente contiene un gen marcador seleccionare que codifica una proteína que confiere sobre las células vegetales transformadas resistencia a un herbicida o a un antibiótico, tal como bialafos, kanamicina, G418, bleomicina, o higromicina, inter alia. El gen marcador seleccionable empleado individualmente debería por consiguiente permitir la selección de células transformadas si bien el crecimiento de células que no contiene el ADN insertado es suprimido por el compuesto selectivo.

Se encuentran disponibles una gran cantidad de técnicas para insertar ADN en una célula de planta huésped. Dichas técnicas incluyen transformación con T-DNA administrado por Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes como el agente de transformación. Por añadidura, la fusión de protoplastos de planta con liposomas que contienen el ADN a ser administrado, inyección directa del ADN, transformación biolística (bombardeo de micropartículas), o electroporación, así como también otros métodos posibles, pueden ser empleados.

En una modalidad preferida de la presente invención, las plantas serán transformadas con genes donde el uso de codones de la región codificante de proteína ha sido optimizado para plantas. Ver, por ejemplo, la Patente estadounidense N° 5380831 , la cual se incorpora a la presente como referencia. Adicionalmente, de manera ventajosa, se emplearán plantas que codifican una toxina truncada. La toxina truncada típicamente codificará aproximadamente 55% a aproximadamente 80% de la toxina de longitud completa. Los métodos para crear genes B.t. sintéticos para utilizar en plantas son conocidos en la técnica (Stewart 2007).

Sin importar la técnica de transformación, el gen es preferentemente incorporado en un vector de transferencia de genes adaptado para expresar los genes de toxina insecticida de B.t. y las variantes en la célula vegetal incluyendo en el vector un promotor vegetal. Además de promotores vegetales, pueden emplearse promotores de una variedad de fuentes en forma eficaz en células vegetales para expresar genes extraños. Por ejemplo, pueden emplearse promotores de origen bacteriano, tales como el promotor de octopina sintasa, el promotor de nopalina sintasa, el promotor de manopina sintasa; promotores de origen viral vegetal, tales como los promotores 35S y 19S del virus mosaico de coliflor y promotores similares. Los promotores vegetales incluyen, aunque sin limitarse a subunidad pequeña de ribulosa-1 ,6-bisfosfato (RUBP) carboxilasa (ssu), promotor de beta-conglicinina, promotor de faseolina, promotor de ADH (alcohol deshidrogenasa), promotores de choque térmico, promotor de ADF (factor de despolimerización de actina), y promotores específicos de tejido. Los promotores también pueden contener ciertos elementos de secuencia potenciadores que pueden mejorar la eficacia de la transcripción. Los potenciadores típicos incluyen aunque sin limitarse a ADH1-intrón 1 y ADH1-intrón 6. Pueden emplearse promotores constitutivos. Los promotores constitutivos dirigen la expresión de genes continua en casi todos los tipos celulares y en casi todos los momentos (por ej. actina, ubiquitina, CaMV 35S). Los promotores específicos de tejido son responsables de la expresión de genes en tipos específicos de células o tejidos, tales como hojas o semillas (por ej., zeína, oleosina, napina, ACP (Proteína Portador de Acilo "Acyl Carrier Protein")), y también pueden emplearse estos promotores. También pueden emplearse promotores que son activos durante una cierta etapa del desarrollo de las plantas así como también activos en tejidos y órganos de plantas específicos. Los ejemplos de ese tipo de promotores incluyen, aunque sin limitarse a, promotores que son específicos de raíces, específicos de polen, específicos de embriones, específicos de seda del maíz, específicos de fibra de algodón, específico del endosperma de la semilla, específico del floema y similares.

Bajo ciertas circunstancias puede ser conveniente utilizar un promotor inducible. Un promotor inducible es responsable de la expresión de genes como respuesta a una señal específica, tal como: estímulo físico (por ej., genes de choque térmico); luz (por ej. RUBP carboxilasa); hormona (por ej. glucocorticoide); antibiótico (por ej. tetraciclina); metabolitos; y estrés (por ej. sequía). Pueden emplearse otros elementos de transcripción y traducción deseables que funcionan en plantas, tales como secuencias líder no traducidas en 5', secuencias de terminación de la transcripción de ARN y secuencias señal de adición poli-adeniladas. En la técnica se conocen numerosos vectores de transferencia de genes específicos para plantas.

Los cultivos transgénicos que contienen características de resistencia a insectos (Rl) son prevalentes en plantas de maíz y algodón por toda América del Norte, y el uso de estas características se está expandiendo globalmente. Se han desarrollado cultivos transgénicos comerciales que combinan características de Rl y de tolerancia a herbicidas (TH) por múltiples compañías de semillas. Estos incluyen combinaciones de características de Rl conferidas por proteínas insecticidas B.t. y características de TH tales como tolerancia a inhibidores de Acetolactato Sintasa (ALS) tales como sulfonilureas, imidazolinonas, triazolopirimidina, sulfonanilidas, y similares, inhibidores de Glutamina Sintetasa (GS) tales como bialafos, glufosinato, y similares, inhibidores de 4-HidroxiFenilPiruvato Dioxigenasa (HPPD) tales como mesotriona, isoxaflutol, y similares, inhibidores de 5-EnolPiruvilShikimato-3-Fosfato Sintasa (EPSPS) tales como glifosato y similares, e inhibidores de Acetil-Coenzima A Carboxilasa (ACCase) tales como haloxifop, quizalofop, diclofop, y similares. Otros ejemplos son conocidos en los cuales las proteínas transgénicamente proporcionadas proporcionan tolerancia por parte de las plantas a clases de químicos herbicidas tales como herbicidas de fenoxiácidos y herbicidas de auxinas piridiloxiacetatos (ver WO 2007/053482 A2), o herbicidas de fenoxiácidos y herbicidas de ariloxifenoxipropionatos (ver WO 2005107437 A2, A3). La capacidad de controlar múltiples problemas de pestes a través de las características de Rl es un concepto de producto comercial valioso, y la conveniencia de este concepto de producto es aumentada si las características de control de insectos y las características de control de malezas se combinan en la misma planta. Por añadidura, puede obtenerse un valor mejorado por medio de combinaciones de planta únicas de características de Rl conferidas por una proteína insecticida de B.t. tal como aquella de la presente invención con una o más características de TH adicionales tales como aquellas antes mencionadas, más una o más características de entrada adicionales (por ej. otra resistencia a insectos conferida por proteínas derivadas de B.t. u otras proteínas insecticidas, resistencia a insectos conferida por mecanismos tales como RNAi y similares, resistencia a nemátodos conferida por proteínas derivadas de B.t. u otras proteínas nematícidas, resistencia a nemátodos conferida por mecanismos tales como RNAi y similares, resistencia a enfermedades, tolerancia al estrés, utilización de nitrógeno mejorada, y similares), o características de salida (por ej. alto contenido de aceites, composición de aceites sanos, mejora nutricional, y similares). Ese tipo de combinaciones pueden ser obtenidas ya sea a través de la mejora genética convencional (apilamiento de mejoras genéticas ("breeding stack")) o en forma conjunta como un evento de transformación novedoso que involucra la introducción simultánea de múltiples genes (apilamiento molecular ("molecular stack")). Los beneficios incluyen la capacidad de manejar pestes de insectos y control mejorado de malezas en una planta de cultivo que proporciona beneficios secundarios al productor y/o al consumidor. Por lo tanto, la presente invención puede ser empleada en combinación con otras características para proporcionar un completo paquete agronómico de calidad mejorada de cultivo con la capacidad de controlar en forma flexible y eficaz en cuanto al costo cualquier cantidad de problemas agronómicos.

Pestes Objetivo La toxina DIG- 09 y la toxina DIG-152 de la invención son particularmente adecuadas para utilizar en el control de insectos lepidópteros.

Los lepidópteros son un grupo importante de pestes agrícolas, hortícolas y del hogar que causan una gran cantidad de daños cada año. Este orden de insectos abarca larvas y adultos que se alimentan de las raíces y del follaje. Las pestes de insectos lepidópteros incluyen, aunque sin limitarse a: Achoroia grisella, Acleris gloverana, Acleris varíana, Adoxophyes orana, Agrotis ípsilon (gusano cortador negro (black cutworm)), Alabama argillacea, Alsophila pometaria, Amyelois transitella, Anagasta kuehniella, Anarsia lineatella, Anisota senatoria, Antheraea pernyi, Anticarsia gemmatalis, Archips sp., Argyrotaenia sp., Athetis mindara, Bombyx morí, Bucculatrix thurberiella, Cadra cautella, Choristoneura sp., Cochylls hospes, Colias eurytheme, Corcyra cephalonica, Cydia latiferreanus, Cydia pomonella, Datana integerríma, Dendrolimus sibericus, Desmia feneralis, Diaphania hyalinata, Diaphania nitidalis, Diatraea grandiosella (taladrador del maíz del suroeste ("southwestern corn borer")), Diatraea saccharalis (taladrador de la caña de azúcar ("sugarcane borer")), Ennomos subsignaria, Eoreuma loftini, Esphestia elutella, Erannis tilaria, Estigmene aerea, Eulia salubricola, Eupocoellia ambiguella, Eupoecilia ambiguella, Euproctis chrysorrhoea, Euxoa messoria, Gallería mellonella, Grapholita molesta, Harrisina americana, Helicoverpa subflexa, Helicoverpa zea (gusano de la mazorca del maíz ("corn earworm")), Heliothis virescens, Hemileuca oliviae, Homoeosoma electellum, Hyphantia cunea, Keiferia lycopersicella, Lambdina fiscellaria fiscellaria, Lambdina fiscellaria lugubrosa, Leucoma salicis, Lobesia botrana, Loxagrotis albicosta (gusano cortador de habas occidental ("western bean cutworm")J, Loxostege sticticalis, Lymantria dispar, Macalla thyrisalis, Malacosoma sp., Mamestra brassícae, Mamestra configurata, Manduca quinquemaculata, Manduca sexta, Maruca testulalis, Melanchra picta, Operophtera brumata, Orgyia sp. , Ostrinia nubilalis (taladrador del maíz europeo ("European corn borer")), Paleacrita vernata, Papiapema nebris (taladrador del tallo común ("common stalk borer")), Papilio cresphontes, Pectinophora gossypiella, Phryganidia californica, Phyllonorycter blancardella, Pieris napi, Pieris. rapae, Plathypena scabra, Platynota flouendana, Platynota stultana, Platyptilia carduidactyla, Plodia interpunctella, Plutella xylostella (polilla torso de diamante ("diamondback moth")), Pontia protodice, Pseudaletia unipuncta (oruga militar ("armyworm")), Pseudoplasia includens, Sabulodes aegrotata, Schizura concinna, Sitotroga cerealella, Spilonta ocellana, Spodoptera frugiperda (gusano cogollero ("fall armyworm")), Spodoptera exigua (oruga militar de la remolacha ("beet armyworm")), Thaurnstopoea pityocampa, Ensola bisselliella, Trichoplusia ni, Udea rubigalis, Xylomyges curíails, y Yponomeuta padella.

También se contempla el uso de la toxina DIG-109 y de la toxina DIG-152, y sus variantes, para controlar pestes Coleópteras de plantas de cultivo. En algunas modalidades, las proteínas Cry pueden ser económicamente empleadas para el control de pestes de insectos que incluyen, aunque sin limitarse a, por ejemplo, gusanos de la raíz tales como Diabrotica undecimpunctata howardi (gusano de la raíz del maíz sureño ("southern corn rootworm")), Diabrotica longicornis barberi (gusano de la raíz del maíz del norte ("northern corn rootworm")), y Diabrotica virgifera (gusano de la raíz del maíz occidental ("western corn rootworm")^, y larvas tales como las larvas de Cyclocephala borealis (escarabajo enmascarado el norte ("northern masked chafer") Cyclocephala immaculate (escarabajo enmascarado del sur ("southem masked chafer")), y Popillia japónica (escarabajo japonés).

Detección de anticuerpos de toxinas DIG-109 y DIG-152 Anticuerpos anti-toxinas Los anticuerpos contra las toxinas B.t. descritos en esta invención, o contra toxinas equivalentes, o fragmentos de estas toxinas, pueden prepararse fácilmente utilizando procedimientos convencionales en esta técnica, según lo enseñado, por ejemplo por Coligan ef al., 2007 y sus actualizaciones. Dichos anticuerpos son útiles para detectar la presencia de la toxina DIG-109, la toxina DIG-152, y sus variantes.

Una vez que la toxina insecticida B.t. ha sido aislada, pueden desarrollarse anticuerpos específicos para la toxina mediante métodos convencionales que son bien conocidos en la técnica. Las inyecciones repetidas en un huésped de elección durante un período de semanas o meses activarán una respuesta inmune y darán como resultado títulos séricos de toxina anti-B.t. significativos. Los huéspedes preferidos son especies de mamíferos y las especies más altamente preferidas son conejos, cabras, ovejas y ratones. La sangre extraída de dichos animales inmunizados puede ser procesada mediante métodos establecidos para obtener antisuero (anticuerpos policlonales) reactivo con la toxina insecticida B.t. Luego, el antisuero puede se purificado por afinidad mediante adsorción a la toxina de acuerdo con técnicas conocidas en el campo. El antisuero purificado por afinidad puede ser purificado adicionalmente aislando la fracción de inmunoglobulina dentro del antisuero utilizando procedimientos conocidos en la técnica. El material resultante será una población heterogénea de inmunoglobulinas reactivas con la toxina insecticida B.t.

Los anticuerpos anti-toxina B.t. también pueden ser generados preparando un inmunógeno semisintético que consiste en un fragmento peptídico sintético de la toxina insecticida B.t. conjugado a un portador inmunógeno. Numerosos esquemas e instrumentos útiles para preparar fragmentos peptídicos son bien conocidos en la técnica. Muchos portadores inmunógenos adecuados tales como seroalbúmina bovina o Hemocianina de Lapa Californiana ("Keyhole Limpet Hemocyanin") son también bien conocidos en la técnica, al igual que las técnicas para acoplar el inmunógeno a proteínas portadoras. Una vez que el inmunógeno semisintético ha sido construido, el procedimiento para preparar anticuerpos específicos para el fragmento de toxina insecticida B.t. es idéntico a aquellos empleados para preparar anticuerpos reactivos con la toxina B.t natural.

Los anticuerpos monoclonales (Mabs) de la toxina anti-B.t. son fácilmente preparados utilizando toxina insecticida B.t. purificada. Se han puesto en práctica métodos para producir MAbs durante más de 15 años y son bien conocidos por los expertos en la técnica. Las inyecciones intraperitoneales o subcutáneas repetidas de toxina insecticida B.t. purificada en adyuvante activarán una respuesta inmune en la mayoría de los animales. Los linfocitos B hiperinmunizados son extraídos del animal y fusionados con una línea celular socio de fusión adecuada capaz de ser cultivada indefinidamente. Los animales preferidos cuyos linfocitos B pueden ser hiperinmunizados y empleados en la producción de MAbs son mamíferos. Los animales más preferidos son ratas y ratones y la más preferida de todas es la cepa de ratones BALB/c.

Numerosas líneas de células de mamífero son socios de fusión adecuados para la producción de hibridomas. Muchas líneas de ese tipo están disponibles en la Recolección Americana de Cultivos Tipificados ("American Type Culture Collection") (ATCC, Manassas, VA) y proveedores comerciales. Las líneas de células socias de fusión preferidas son derivadas de mielomas de ratón y la línea de 653 células de mieloma HL-1® Friendly (Ventrex, Portland, ME) es la más preferida. Una vez fusionadas, se cultivan los hibridomas resultantes en un medio de crecimiento selectivo durante una a dos semanas. Dos sistemas de selección bien conocidos se encuentran disponibles para eliminar células de mieloma no fusionadas, o fusiones entre las células de mieloma, del cultivo de hibridoma mixto. La elección del sistema de selección depende de la cepa de ratón inmunizado y socio de fusión de mieloma empleada. Pueden emplearse el sistema de selección aaT, descrito por Taggart y Samioff, (1983); sin embargo, el sistema de selección HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina), descrito por Littlefield (1964), es preferido debido a su compatibilidad con la cepa de ratón preferida y el socio de fusión antes mencionado. Luego, el medio de crecimiento gastado es seleccionado para la secreción de MAb inmunoespecífico. Los procedimientos de ensayo de inmunoabsorbencia vinculada con enzima (ELISA, por sus siglas en inglés) son más adecuados para este propósito; aunque, también son aceptables los radioinmunoensayos adaptados para el screening de grandes volúmenes. Pueden realizarse múltiples screens (selecciones) diseñados para consecutivamente reducir al mínimo la cantidad considerable de cultivos irrelevantes o menos deseados. Los cultivos que segregan MAbs reactivos con la toxina insecticida B.t. pueden ser seleccionados para reactividad cruzada con toxinas insecticidas B.t. MAbs que se unen preferentemente a la toxina insecticida B.t. preferida pueden ser isotipeados utilizando ensayos disponibles en el mercado. Los MAbs preferidos son de la clase de IgG, y los MAbs más altamente preferidos son de los subisotipos Igd y lgG2a.

Los cultivos de hibridoma que segregan los MAbs preferidos pueden ser subclonados varias veces para establecer monoclonalidad y estabilidad. Los métodos bien conocidos para subclonar cultivos eucarióticos, de células no adherentes incluyen técnicas de dilución de limitación, agarosa blanda y clasificación celular activada por fluorescencia. Después de cada subclonación, los cultivos resultantes preferentemente son ensayados nuevamente para secreción de anticuerpos e isotipo para asegurar que se haya establecido un cultivo estable de segregación de MAb preferido.

Los anticuerpos anti-toxina B.t. son útiles en diversos métodos para detectar la toxina insecticida B.t. reivindicada de la presente invención, y sus variantes o fragmentos. Es bien conocido que los anticuerpos etiquetados con un grupo informante pueden ser empleados para identificar la presencia de antígenos en una variedad de medios. Los anticuerpos etiquetados con radioisótopos han sido empleados durante décadas en radioinmunoensayos para identificar, con gran precisión y sensibilidad, la presencia de antígenos en una variedad de fluidos biológicos. Más recientemente, se han empleado anticuerpos etiquetados con enzimas como un sustituto para anticuerpos radioetiquetados en el ensayo ELISA. Adicionalmente, los anticuerpos inmunorreactivos a la toxina insecticida B.t. de la presente invención pueden ser unidos a una sustancia inmovilizante tal como un pocilio o partícula de poliestireno y pueden ser empleados en inmunoensayos para determinar si la toxina B.t. está presente en una muestra de ensayo.

Detección utilizando sondas Un método adicional para identificar las toxinas y genes de la presente invención es a través del uso de sondas de oligonucleótidos. Estas sondas son secuencias nucleotídicas detectabies. Estas secuencias pueden tornarse detectabies en virtud de una etiqueta radiactiva apropiada o pueden hacerse inherentemente fluorescentes según lo descrito en la Patente estadounidense N° 6268132. Como es bien conocido en la técnica, si la molécula sonda y la muestra de ácido nucleico se hibridan formando enlaces fuertes de apareamiento de bases entre las dos moléculas, puede presumirse razonablemente que la sonda y muestra tienen homología sustancial de secuencias. Preferentemente, la hibridación se lleva a cabo bajo condiciones severas mediante técnicas bien conocidas en la técnica, según lo descrito, por ejemplo, en Keller y Manak (1993). La detección de la sonda provee un medio para determinar en forma conocida si se ha producido la hibridación. Ese tipo de análisis de sonda provee un método rápido para identificar genes que codifican toxinas de la presente invención. Los segmentos nucleotidicos que se emplean como sondas de acuerdo con la invención pueden ser sintetizados empleando un sintetizador de ADN y procedimientos convencionales. Estas secuencias nuleotídicas también pueden ser empleadas como cebadores de PCR para amplificar genes de la presente invención.

Hibridación Como es bien conocido por los expertos en biología molecular, la similitud de dos ácidos nucleicos puede ser caracterizada por su tendencia a hibridarse. Como se emplean en esta invención, los términos "condiciones severas" o "condiciones severas de hibridación" tienen el propósito de hacer referencia a condiciones bajo las cuales una sonda se hibridará (apareará) a su secuencia objetivo hasta un grado detectablemente superior que otras secuencias (por ej. por lo menos el doble con respecto al fondo ("background")). Las condiciones severas son dependientes de la secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. Mediante el control de la severidad de las condiciones de hibridación y/o lavado, las secuencias objetivo que son 100% complementarias a la sonda pueden ser identificadas (sondeo homólogo). Como alternativa, pueden ajustarse las condiciones de severidad para permitir cierto apareamiento erróneo en secuencias de modo que grados inferiores de similitud sean detectados (sondeo heterólogo). En general, una sonda tiene una longitud de aproximadamente 1000 nucleótidos, preferentemente menos de 500 nucleótidos de largo.

Típicamente, las condiciones de severidad serán aquellas en las cuales la concentración de sales es inferior a aproximadamente 1 .5 M ion de Na, típicamente una concentración de aproximadamente 0.01 a 1 .0 ion de Na (u otras sales) a pH 7.0 hasta pH 8.3 y la temperatura es por lo menos aproximadamente 30°C para sondas cortas (por ej. 10 a 50 nucleótidos) y por lo menos aproximadamente 60°C para sondas largas (por ej. más de 50 nucleótidos). También pueden lograrse condiciones severas con la adición de agentes desestabilizantes tales como formamida. Las condiciones de baja severidad ejemplares incluyen hibridación con una solución tampón de 30% a 35% formamida, NaCI 1 M, 1 % SDS (dodecilsulfato sódico) a 37°C y un lavado en 1X a 2X SSC (20X SSC = NaCI 3.0 M /citrato trisódico 0.3 M) a 50°C hasta 55°C. Las condiciones se severidad moderada ejemplares incluyen hibridación en 40% a 45% de formamida, NaCI 1 .0 M, 1 % SDS a 37°C y una lavado en 0.5X a 1 X SSC a 55°C hasta 60°C. Las condiciones ejemplares de severidad elevada incluyen hibridación en 50% de formamida, NaCI 1 M, 1 % SDS a 37°C y un lavado en 0.1X SSC a 60°C hasta 65°C. Opcionalmente, los buffers de lavado pueden comprender aproximadamente 0.1 % hasta aproximadamente 1% SDS. La duración de hibridación es generalmente inferior a aproximadamente 24 horas, generalmente aproximadamente 4 a aproximadamente 12 horas.

La especificidad es típicamente la función de los lavados poshibridación, siendo los factores más importantes la resistencia iónica y la temperatura de la solución de lavado final. Para ADN/híbridos de ADN, el punto de fusión térmica (Tm) es la temperatura (bajo resistencia iónica y pH definidos) a la cual 50% de una secuencia objetivo complementaria se híbrida a una sonda perfectamente apareada. Tm es reducida en aproximadamente 1 °C para cada 1 % de apareamiento erróneo; por lo tanto, la Tm, las condiciones de hibridación, y/o las condiciones de lavado pueden ser ajustadas para facilitar la hibridación de secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si se buscan secuencias con >90% de identidad, la Tm puede ser reducida 10°C. En general, las condiciones de severidad son seleccionadas para ser aproximadamente 5°C inferiores a la Tm para la secuencia específica y su complemento a una resistencia iónica y pH definidos. Sin embargo, las condiciones altamente severas pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 1 °C, 2°C, 3°C, o 4°C inferiores a la Tm; las condiciones moderadamente severas pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 6°C, 7°C, 8°C, 9°C, o 10°C inferiores a la Tm, y condiciones de baja severidad pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 1 1 °C, 12°C, 13°C, 14°C, 15°C, o 20°C inferiores a la Tm.

Tm (en °C) puede ser experimentalmente determinada o puede ser aproximada por cálculo. Para híbridos de ADN-ADN, la Tm puede ser aproximadamente a partir de la ecuación de Meinkoth y Wahl (1984): Tm(°C) = 81.5T + 16.6(log M) + 0.41 (%GC) - 0.61 (% formamida) - 500/L; donde M es la molaridad de cationes monovalentes, %GC es el porcentaje de nucleotidos de guanosina y citosina en el ADN, % de formamida es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación, y L es la longitud del híbrido en pares de bases.

Alternativamente, la Tm es descrita por la siguiente fórmula (Beltz er a/., 1983).

Tm(°C) = 81.5°C + 16.6(log[Na+]) + 0.41 (%GC) - 0.61 (% de formamida) - 600/L donde [Na+] es la molaridad de iones de sodio, %GC es el porcentaje de nucleotidos de guanosina y citosina en el ADN, % de formamida es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación, y L es la longitud del híbrido en pares de bases Utilizando las ecuaciones, composiciones de hibridación y lavado, y Tm deseada, los expertos en la técnica comprenderán que las variaciones en la severidad de las soluciones de hibridación y/o lavado son descritas inherentemente. Si el grado deseado de apareamiento erróneo da como resultado una Tm inferior a 45°C (solución acuosa) o 32°C (solución de formamida), se prefiere aumentar la concentración de SSC de modo que pueda utilizarse una temperatura más elevada. Una guía extensa a la hibridación de ácidos nucleicos es encontrada en Tijssen (1993) y Ausubel et al., 1995 y sus actualizaciones). También ver Sambrook et al., (1989) y sus actualizaciones.

La hibridación de ADN inmovilizado sobre transferencias Southern con sondas específicas para genes radiactivamente etiquetadas puede realizarse mediante métodos convencionales Sambrook et al., supra.). Los isótopos radiactivos empleados para etiquetar sondas de polinucleótidos pueden incluir 32P, 33P, 14C, o 3H. La incorporación de isótopos radiactivos en moléculas sonda de polinucleótidos puede realizarse mediante cualquiera de los diversos métodos bien conocidos por los expertos en la técnica de la biología molecular. (Ver, por ej. Sambrook et al., supra.) En general, la hibridación y subsiguientes lavados pueden llevarse a cabo bajo condiciones severas que permiten la detección de secuencias objetivo con homología a los genes codificantes de toxina reivindicados. Para sondas de genes de ADN de doble hebra, la hibridación puede realizarse durante la noche a 20-25°C por debajo de la Tm del híbrido de ADN en 6X SSPE, Solución de Denhardt 5X, 0.1 % de SDS, 0.1 mg/mL de ADN desnaturalizado [20X SSPE es NaCI 3M, NaHP04 0.2 M y EDTA 0.02M (sal sódica del ácido etilendiaminatetra- acético); Solución de Denhard 10?? es 20 gm/L de Polivinilpirrolidona, 20 gm/L Ficoll tipo 400 y 20 gm/L de Albúmina Sérica Bovina (fracción V)].

Los lavados pueden realizarse, típicamente, de la siguiente manera: Dos veces a temperatura ambiente durante 15 minutos en 1X SSPE, 0.1% SDS (lavado de severidad más baja).

Una vez a Tm - 20°C durante 15 minutos en 0.2X SSPE, 0.1 % de SDS (lavado a más alta severidad).

Para las sondas de oligonucleótidos, la hibridación puede llevarse a cabo durante la noche a 10-20°C por debajo de la Tm del híbrido en 6X SSPE, 5X solución de Denhardt, 0.1% SDS, 0.1 mg/mL de ADN desnaturalizado. Tm para sondas de oligonucleótidos puede determinarse mediante la siguiente fórmula (Suggs et al., 1981 ).

Tm(°C ) = 2(número de pares de bases T/A) + 4(número de pares de bases G/C) Los lavados pueden típicamente llevarse a cabo de la siguiente manera: Dos veces a temperatura ambiente durante 15 minutos 1X SSPE, 0.1 % de SDS (lavado de severidad inferior).

Una vez a la temperatura de hibridación durante 15 minutos en 1 X SSPE, 0.1 % de SDS (lavado de más alta severidad).

Algunos ejemplos de concentraciones de sales y combinaciones de temperaturas son los siguientes (en orden de severidad en aumento): 2X SSPE o SSC a temperatura ambiente; 1X SSPE o SSC a 42°C; 0.1X SSPE o SSC a 42°C; 0.1 X SSPE o SSC a 65°C.

Las moléculas sondas para hibridación y moléculas híbridas formadas entre moléculas sonda y objetivo pueden tornarse detectable por medios que no son etiquetado radiactivo. Dichos métodos alternativos tienen el propósito de estar dentro del alcance de la esta invención.

Debería entenderse que los ejemplos y modalidades descritos en esta invención son para propósitos ilustrativos solamente y que el experto en la técnica podrá realizar diversas modificaciones o cambios y estos deben ser incluidos dentro del espíritu y alcance de esta solicitud y del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

A menos que se indique o implique específicamente, los términos "un", "una" y "el", "la" significan "por lo menos uno" como se emplea en esta invención.

Siguen ejemplos que ilustran procedimientos para poner en práctica la invención. Estos ejemplos no deberían ser interpretados como limitativos. Todos los porcentajes son en peso y todas las proporciones de mezclas de solventes son en volumen a menos que se indique lo contrario. Todas las temperaturas son en grados Celsius.

EJEMPLO 1 Diseño de toxinas núcleo CrvICa quiméricas y protoxinas CrvIAb Toxinas Quiméricas Las proteínas quiméricas que utilizan el dominio de toxina núcleo de una toxina Cry fusionada al segmento de protoxina de otra toxina Cry han sido previamente reportadas, por ejemplo, en la Patente estadounidense N° 5593881 y la Patente estadounidense N° 5932209. La secuencia de proteína de delta endotoxina Cry Ca3 es depositada como Número de Acceso GenBank AAA22343 bajo una terminología obsoleta de CrylC(b).

Las variantes de proteínas quiméricas CryI Ca de esta invención incluyen toxinas que comprenden un segmento de toxina núcleo N-terminal derivado de una toxina insecticida Cry1Ca3 fusionada a un segmento de protoxina delta endotoxina heteróloga en algún punto pasando el extremo del segmento de la toxina núcleo. La transición de la toxina núcleo al segmento de protoxina heteróloga puede producirse en aproximadamente la unión de la toxina núcleo/ protoxina nativa o, en la alternativa, una porción de la protoxina nativa (que se extiende pasando el segmento de toxina núcleo) puede ser retenida, produciéndose la transición a la protoxina heteróloga corriente abajo. En forma de variante, los segmentos de toxina núcleo y protoxina pueden comprender exactamente la secuencia de aminoácidos de las toxinas nativas de las cuales derivan, o pueden incluir adiciones, delecíones o sustituciones de aminoácidos que no disminuyen, y pueden aumentar, la función biológica de los segmentos cuando se fusionan entre sí.

Por ejemplo, una toxina quimérica de la presente invención comprende un segmento de toxina núcleo derivado de Cry1 Ca3 y una protoxina heteróloga. En una modalidad preferida de la invención, el segmento de toxina núcleo derivado de Cry1 Ca3, y descrito como el segmento de toxina núcleo CryI Ca en SEQ ID NO: 1 (619 aminoácidos), se fusiona a un segmento heterólogo que comprende un segmento de protoxina derivado de una delta-endotoxina CryIAb. SEQ ID NO:2 describe la secuencia de 545 aminoácidos de un segmento de protoxina derivado de CryIAb y útil en variantes CryICa de la invención. Se dirige la atención a los últimos 100 a 150 aminoácidos aproximadamente de este segmento de protoxina de SEQ ID NO:2, el cual es importante incluir en la toxina quimérica de la presente invención. Por lo tanto, una modalidad preferida de la invención comprende una proteína quimérica en la cual el segmento de toxina núcleo CryI Ca descrito como SEQ ID NO:1 está unido al segmento de protoxina derivado de CryIAb según lo descrito en SEQ ID NO:2. La secuencia de 1 164 aminoácidos de la proteína quimérica, en esta invención denominada DIG-152, es descrita como SEQ ID NO:3 (versión pMYC2547). Una segunda modalidad preferida de la invención comprende una proteína quimérica en la cual el segmento de toxina núcleo CryICa descrito como SEQ ID NO:1 está unido a un segundo segmento de protoxina de 545 aminoácidos derivado de CryIAb según lo presentado en SEQ ID NO.4. Se dirige la atención hacia los últimos aproximadamente 100 a 150 aminoácidos de este segmento de protoxina, el cual es importante de incluir en la toxina quimérica de la presente invención. La secuencia de 1 164 aminoácidos de la segunda proteína quimérica, denominada DIG-109, es descrita como SEQ ID NO:5 (versión optimizada para el maíz). Debe entenderse que otras fusiones quiméricas que comprenden variantes de toxina núcleo CryI Ca y protoxinas derivadas de CryIAb están dentro del alcance de esta invención.

Se señala que los segmentos de protoxina derivados de CryIAb como son presentados en SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:4 son equivalentes esencialmente funcionales entre sí, difiriendo en secuencia solamente en una única posición (la primera posición).

EJEMPLO 2 Construcción de plásmidos de expresión que codifican proteínas núcleo CryICa/ de protoxina CryIAb quiméricas y expresión en Pseudomonas Se utilizaron métodos de clonación convencionales [según lo descrito en, por ejemplo, Sambrook et al., (1989) y Ausubel et al., (1995), y sus actualizaciones] en la construcción del constructo de expresión pMYC2547 de Pseudomonas fluorescens (Pf) construido por técnicas de ingeniería genética para producir una proteína quimérica de longitud completa compuesta por un núcleo CryI Ca fusionado a una protoxina CryIAb (DIG-1 52; SEQ ID NO:3). La producción proteica se llevó a cabo en la cepa MB214 de Pseudomonas fluorescens (un derivado de la cepa MB101 ; P. fluorescens biovar I), que tiene una inserción de un operón lac modificado según lo descrito en la Patente estadounidense N° 5169760. La estrategia básica de clonación incluía la subclonación de un fragmento de ADN que codifica DIG-152 en vectores plásmidos, por lo cual se coloca bajo el control de expresión del promotor Ptac y del terminador rrnBT1T2 del plásmido pKK223-3 (PL Pharmacia, Milwaukee, Wl). Un plásmido de ese tipo fue denominado pMYC2547, y el aislado MB214 que alberga este plásmido es denominado Dpf108.

Análisis de Crecimiento y Expresión en Frascos de Agitación La producción de proteína DIG-152 para caracterización y bioensayo de insectos se logró mediante la cepa Dpf108 de P. fluorescens cultivada en frascos de agitación. Se llevó a cabo la producción de proteína DIG-152 impulsada por el promotor Ptac según lo descrito previamente en la Patente estadounidense N° 5527883. La expresión fue inducida por la adición de isopropil-p-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) después de una incubación inicial de 24 horas a 30° con agitación. Los cultivos fueron muestreados en el momento de la inducción y en diversos momentos post-inducción. Se midió la densidad celular por densidad óptica a 600 nm (OD6oo)- Fraccionamiento Celular y Análisis de SDS-PAGE de Muestras en Frascos de Agitación En cada momento del muestreo, la densidad celular de las muestras se ajustó hasta OD6oo = 20 y se centrifugaron alícuotas de 1 m!_ a 14000 x g durante cinco minutos. Las pellas celulares se congelaron a -80°. Las fracciones solubles e insolubles de las muestras de pellas celulares en frascos de agitación congeladas fueron generadas utilizando Solución de Extracción EasyLyse™ Bacterial Protein Extraction Solution (EPICENTRE® Biotechnologies, Madison, Wl). Cada pella celular fue resuspendida en 1 mL de solución EasyLyse™ y diluida 1 :4 en buffer de lisis y se incubó con agitación a temperatura ambiente durante 30 minutos. El lisado fue centrifugado a 14,000 rpm durante 20 minutos a 4o y el sobrenadante fue recuperado como la fracción soluble. La pella (fracción insoluble) se resuspendió a continuación en un volumen igual de solución salina tamponada con fosfato (PBS; Na2HP04 1 1.9 mM, NaCI 137 mM, KCI 2.7 mM, pH 7.4).

Las muestras se mezclaron 1 :1 con buffer de muestra 2X Laemmli que contenía ß-mercaptoetanol (Sambrook et al., supra.) y se hirvieron durante 5 minutos con anterioridad a la carga sobre geles Criterion XT Bis-Tris 12% (Bio-Rad Inc., Hercules, CA). Se llevó a cabo electroforesis en el buffer XT MOPS recomendado. Los geles fueron manchados con Mancha Bio-Safe Coomassie Stain de acuerdo con el protocolo del fabricante (Bio-Rad) y se tomaron imágenes utilizando el sistema de imágenes Alpha Innotech Imaging system (San Leandro, CA).

Preparación de Cuerpos de Inclusión Se llevaron a cabo preparaciones de cuerpos de inclusión (IB, por sus siglas en inglés) de proteína DIG-152 en células de fermentaciones de P. fluorescens que produjeron proteína insecticida B.t. insoluble, según lo demostrado por SDS-PAGE y MALDI-MS (Desorción por Láser Asistida por Matriz/ Espectrometría de Masas por Ionización ("Matrix Assisted Láser Desorption/lonization Mass Spectrometry"). Se descongelaron pellas de fermentación de P. fluorescens en un baño de agua a 37°. Las células fueron resuspendidas hasta 25% p/v en buffer de lisis [Tris 50 mM, pH 7.5, NaCI 200 mM, sal disódica de EDTA 20 mM (ácido etilendiaminatetraacético), 1 % Tritón X-100, y Ditiotreitol (DTT) 5 mM; 5 mL/L de cóctel de inhibidor de proteasa bacteriano (Catálogo # P8465; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) se agregaron justo antes del uso]. Las células se suspendieron utilizando un homogenizador manual en la configuración más baja (Tissue Tearor, BioSpec Products, Inc., Bartlesville, OK). Se agregó lisozima (25 mg de Sigma L7651 , de la clara de huevo de la gallina) a la suspensión celular mezclando con una espátula de metal, y la suspensión se incubó a temperatura ambiente durante una hora. La suspensión se enfrió en hielo durante 15 minutos, luego se sónico utilizando un sonificador Branson Sonifier 250 (dos sesiones de 1 minuto, en ciclos de tarea de 50%, 30% de salida). Se controló la lisis celular por microscopía. Se agregaron 25 mg adicionales de lisozima en caso necesario, y se repitieron la incubación y la sonicación. Luego de la confirmación de la lisis celular por microscopía, el lisado se centrifugó a 11 ,500 x g durante 25 minutos (4o) para formar la pella de Cl, y el sobrenadante se descartó. La pella de Cl se resuspendió con buffer de lisis de 100 mL, se homogenizó con la mezcladora manual y se centrifugó como se describió anteriormente. La pella de Cl se lavó repetidamente por resuspensión (en 50 mL de buffer de lisis), homogenización, sonicación, y centrifugación hasta que el sobrenadante se tornó incoloro y la pella de Cl tomó un color intenso y blanco mate. Para el lavado final, la pella de Cl se resuspendió en agua, destilada filtrada estéril (0.22 pm) que contenía EDTA 2 mM y se centrifugó, la pella final se resuspendió en agua destilada filtrada estéril que contenía EDTA 2 mM, y se almacenó en alícuotas de 1 mL a -80° El análisis de SDS-PAGE y cuantificación de proteína en las preparaciones de Cl se realizó descongelando una alícuota de 1 mL de pella de Cl y diluyendo 1 :20 con agua destilada filtrada estéril. Luego, la muestra diluida se hirvió con buffer de muestra reductor 4X [Tris 250 mM, pH 6.8, 40% glicerol (v/v), 0.4% Bromofenol Azul (p/v), 8% SDS (p/v) y 8% ß-mercaptoetanol (v/v)] y se cargó sobre un gel de 12+2 pocilios, de 4-20% Tris-Glicina, Novex® (Invitrogen) corrido con buffer 1X Tris/Glicina/SDS (BioRad). El gel se corrió durante 60 min. a 200 voltios y luego se manchó con Azul Coomassie (50% G-250/50% R-250 en 45% metanol, 10% ácido acético), y se desmanchó con 7% ácido acético, 5% metanol en agua destilada. La cuantificación de bandas objetivo se realizó comparando valores densitométricos para las bandas contra muestras estándares de Albúmina Sérica Bovina (BSA, por sus siglas en inglés) corridas sobre el mismo gel para generar una curva estándar.

Solubilización de Cuerpos de Inclusión Se centrifugaron seis ml_ de suspensión de cuerpos de inclusión de DIG-152 a partir del clon de Pf DPÍ108 en la configuración más alta de una microcentrifugadora modelo 5415C de Eppendorf (aproximadamente 14,000 x g) para peletizar las inclusiones. Se eliminó el sobrenadante del buffer de almacenamiento y se reemplazó con 25 ml_ de buffer de carbonato sódico 100 mM, pH 1 1 , en un tubo cónico de 50 ml_. Las inclusiones fueron resuspendidas utilizando una pipeta y sometidas a vórtice para mezclar completamente. El tubo se colocó en una plataforma de agitación suave a 4o durante toda la noche para extraer la proteína objetivo. El extracto se centrifugó a 30,000 x g durante 30 min a 4o, y el sobrenadante resultante se concentró 5 veces utilizando un dispositivo de filtro centrífugo de celulosa regenerado Amicon Ultra-15 (Corte de Peso Molecular 30,000; Millipore). Luego, el buffer de muestra se cambió a CAPS [ácido 3-(ciclohexamino)1-propansulfónico] 10 mM pH 10 utilizando columnas PD-10 descartables (GE Healthcare, Piscataway, NJ).

Solubilización y activación con tripsina de proteína de Cuerpos de Inclusión En algunos casos, la suspensión de cuerpos de inclusión DIG-152 del clon Pf DPf108 se centrifugó en la configuración más alta de una microcentrifugadora modelo 5415C de Eppendorf (aproximadamente 14,000 x g) para peletizar las inclusiones. El sobrenadante del buffer de almacenamiento fue eliminado y reemplazado con CAPS 100 m , pH 11 para proporcionar una concentración proteica de aproximadamente 50 mg/mL. El tubo se sacudió a temperatura ambiente durante tres horas para solubilizar por completo la proteína. Se agregó tripsina en una cantidad igual a 5% hasta 10% (p:p, en base al peso inicial del polvo de Cl) y se consiguió la digestión por incubación mientras se agitaba durante toda la noche a 4o o por balanceo durante 90-120 minutos a temperatura ambiente. El material insoluble fue eliminado por centrifugación a 10,000 x g durante 15 minutos, y el sobrenadante se aplicó a una columna de intercambio aniónico MonoQ (10 mm por 10 cm). La proteína DIG- 52 activada fue eluida (según lo determinado por SDS-PAGE, ver más abajo) mediante un gradiente de NaCI 1 M 0% a 100% sobre 25 volúmenes de columna. Las fracciones que contenían la proteína activada se agruparon y, cuando resultó necesario, se concentraron hasta menos de 10 mL utilizando un dispositivo de filtro centrífugo de celulosa regenerado Amicon Ultra-15 según lo mencionado anteriormente. Luego, el material se hizo pasar a través de una columna Superdex 200 (16 mm por 60 cm) en buffer que contenía NaCI 100 mM. 10% glicerol, 0.5% Tween-20 y EDTA 1 mM. Se determinó por análisis de SDS-PAGE que la proteína activada (enzimáticamente truncada) eluye a 65 hasta 70 ml_. Las fracciones que contenían la proteína activada se agruparon y concentraron utilizando el concentrador centrífugo según lo descrito anteriormente.

Electroforesis en qel Las preparaciones proteicas concentradas se prepararon para electroforesis diluyendo 1 :50 en buffer de muestra NuPAGE® LDS (Invitrogen) que contenía DTT 5 mM como un agente reductor y se calentó a 95° durante 4 minutos. La muestra se cargó en sendas por duplicado de un gel 4-12% NuPAGE® a lo largo de cinco patrones de BSA que oscilaban entre 0.2 pg y 2 g/senda (para generación de curvas estándares). Se aplicó voltaje a 200 V utilizando buffer de corrida MOPS SDS (Invitrogen) hasta que el tinte de rastreo alcanzó el fondo del gel. El gel se manchó con Azul Coomassie G-250 al 0.2% en 45% de metanol, 10% de ácido acético, y se desmanchó, primero brevemente con 45% metanol, 10% ácido acético, y luego con 7% ácido acético, 5% metanol hasta que el fondo se aclaró. Luego del desmanchado, el gel se barrió con un BioRad Fluor-S Multilmager. Se empleó el programa informático Quantity One Software v.4.5.2 del instrumento para obtener volúmenes de fondo sustraído de las bandas proteicas manchadas y para generar la curva estándar de BSA que se empleó para calcular la concentración de proteína DIG-152 quimérica en la solución inicial.

EJEMPLO 3 Actividad insecticida de proteína DIG-152 producida en Pseudomonas fluorescens Se demostró la actividad insecticida de la proteina DIG-152 en especies lepidópteras incluyendo el taladrador del maíz europeo (ECB (siglas en inglés correspondientes a "European corn borer"; Ostrinia nubilalis (Hübner)), ECB resistente a cryl F (rECB), gusano de la mazorca del maíz (CEW, correspondiente a "corn earworm"; Helicoverpa zea (Boddie)), gusano cortador negro (BCW, correspondiente a "black cutworm"; Agrotis ípsilon (Hufnagel)), gusano cogollero (FAW, correspondiente a "fall armyworm", Spodoptera frugiperda (J.E. Smith)), FAW resistente a Cryl F (rFAW), y taladrador del maíz del suroeste (SWCB, correspondiente a "southwestern corn borer", Diatraea grandiosella).

Preparación de muestras y bioensayos Las preparaciones de cuerpos de inclusión (proteína de longitud completa nativa o proteína activada con tripsina) se transfirieron a buffer de CAPS 10 mM pH 10 mediante métodos de intercambio tales como diálisis o columnas de PD-10. Luego, las muestras se diluyeron apropiadamente en CAPS 10 mM pH 10, y todos los bioensayos contenían un tratamiento de control que consistió en este buffer, que sirvió como un control de fondo para inhibición de la mortalidad o del crecimiento.

Las concentraciones proteicas en buffer de bioensayo fueron estimadas por electroforesis en gel utilizando BSA para crear una curva estándar para densitometría en gel, que se midió utilizando un sistema de imágenes BioRad según lo expuesto anteriormente. Las proteínas de la matriz del gel se mancharon con mancha a base de Azul Coomassie y se desmancharon antes de la lectura.

Las proteínas purificadas se analizaron para determinar la actividad insecticida en bioensayos llevados a cabo con larvas de lepidópteros neonatos en dieta para insectos artificial. Las larvas de ECB, CEW, BCW, FAW, y SWCB fueron incubadas de huevos obtenidos de una colonia mantenida por un insectario comercial (Benzon Research Inc., Carlisle, PA). Las larvas de rECB y rFAW fueron incubadas de huevos recolectados de colonias patentadas (Dow AgroSciences, Indianápolis, IN).

Los bioensayos se llevaron a cabo en bandejas de plástico de 128 pocilios diseñadas específicamente para bioensayos de insectos (C-D International, Pitman, NJ). Cada pocilio contenía 1.0 mL de dieta para lepidópteros multi-especies (Southland Products, Lake Village, AR). Se administró una alícuota de 40 pL de muestra de proteína por pipeta sobre la superficie de la dieta de 1.5 cm2 de cada pocilio (es decir 26.7 pL/cm2). Las concentraciones de dieta se calcularon como la cantidad (ng) de proteína DIG-1 52 por centímetro cuadrado de área superficial en el pocilio. Las bandejas tratadas se mantuvieron en una cámara de extracción de vapores hasta que el líquido en la superficie de la dieta se había evaporado o fue absorbido en la dieta.

Dentro de unas pocas horas de eclosión, se recogieron larvas individuales con un cepillo de pelo de camello humedecido y se depositaron sobre la dieta tratada, una larva por pocilio. Luego, los pocilios infestados se sellaron con láminas adhesivas de plástico transparente, ventiladas para permitir el intercambio de gases (C-D International). Las bandejas de bioensayos se mantuvieron bajo condiciones medioambientales controladas [28°, aproximadamente 40% de Humedad Relativa (HR), 16 hr:8 hr (luz: oscuridad)] durante 5 días, y después de ese tiempo, se registraron la cantidad total de insectos expuestos a cada muestra proteica, la cantidad de insectos muertos, y el peso de los insectos sobrevivientes. Se calcularon el porcentaje de mortalidad y el porcentaje de inhibición del crecimiento para cada tratamiento. Se calculó el porcentaje de inhibición del crecimiento (Gl, por sus siglas en inglés) de la siguiente manera: % Gl = [1 - (T IT/TNIT)/(TWIBC/TNIBC)] x 100 donde TWIT es el peso total de insectos en el tratamiento (the Total Weight of Insects in the Treatment), TNIT es el número total de insectos en el tratamiento (the Total Number of [nsects in the Treatment) TWIBC es el peso total de insectos en el control de fondo (control buffer) (the Total Weight of Insects in the Background Check (Buffer control)), y TNIBC es el número total de insectos en el control de fondo (control buffer) (the Total Number of Insects in the Background_Check (Buffer control)).

La GI50 se determinó que era la concentración de proteína DIG-152 quimérica en la dieta a la cual el valor de % de Gl era de 50. La LC50 (50% de Concentración Letal) se registró como la concentración de proteína DIG-152 en la dieta a la cual se mataron el 50% de los insectos del ensayo. Se realizó un análisis estadístico (ANOVA de una vía) utilizando el programa informático JMP (SAS, Cary, NC).

El Cuadro 3 presenta los resultados de bioensayos de ingestión de proteína DIG-152 en siete tipos de larvas de insecto de ensayo.

CUADRO 3 Valores de GUo y LCsn (en nq/cm2) calculados de superficie de dieta de insecto cargada con proteína DIG-152 Una característica de la proteína DIG-152 de la presente invención es que el crecimiento de larvas neonatas de gusano cogollero {Spodoptera frugiperda) y taladrador del maíz del suroeste {Diatraea grandiosella) es inhibido luego de la ingestión de la proteína DIG-152. Por añadidura, las larvas de gusano cogollero que son resistentes a la intoxicación por CryI F son tan susceptibles a la actividad de DIG-152 como lo son las larvas de gusano cogollero del tipo silvestre.

EJEMPLO 4 Actividad insecticida adicional de proteína DIG-152 producida en Pseudomonas fluorescens La actividad insecticida hacia lepidópteros de la proteína DIG-152 (no activada con tripsina) fue adicionalmente demostrada en larvas neonatas de taladrador de la caña de azúcar (SCB, "sugarcane borer"; Diatraea saccharalis) y SCB resistente a CrylAb (rSCB) en experimentos de respuesta a la dosis que utilizan procedimientos de incorporación a la dieta. Los cuerpos de inclusión de DIG-152 fueron solubilizados por balanceo suave a 4o durante 4 horas en 7.5 mL de CAPS 100 mM pH11 , EDTA 1 mM, donde se habían agregado 200 pL de inhibidor de proteasa bacteriana (Sigma P4865; preparado según las instrucciones del proveedor). Luego de centrifugación para peletizar el material insoluble, la concentración de proteína inicial se ajustó hasta 4.0 mg/mL en CAPS 100 mM, pH 1 1. Para el bioensayo de insectos, se prepararon concentraciones de proteína DIG-152 en el intervalo de 0.030 pg a 102 pg/gm de dieta mezclando volúmenes apropiados con una dieta meridica (Bio-Serv, Frenchtown, NJ) justo antes de dispensar aproximadamente 0.7 mL de la dieta en celdas individuales de bandejas de 128 celdas (Bio-Ba-128, C-D International).

La proteína CryIAb activada con tripsina (empleada como un control positivo para actividad insecticida) se analizó en el intervalo de 0.03125 pg a 32 pg/gm de dieta (preparada mezclando polvo liofilizado con cantidades apropiadas de agua destilada antes de la preparación de la dieta).

Las dietas preparadas con agua destilada (Blank Control (Control Testigo), para ensayos CryIAb) o Buffer Solamente (CAPS 100 mM pH1 1 , para ensayos de DIG-152) se emplearon como tratamientos de control. Una larva neonata de D. saccharalis (<24 hr después de la eclosión) fue liberada sobre la superficie de la dieta en cada celda. Después de la inoculación larvaria, las celdas fueron cubiertas con tapas ventiladas (C-D International) y las bandejas de bioensayo se colocaron en una cámara ambiental mantenida a 28°, 50% de HR, y a un fotoperíodo de 16 hr:8 hr (luz: oscuridad). Se registraron la mortalidad larvaria, el peso de las larvas, y la cantidad de larvas sobrevivientes que no demostraron aumentos de peso (< 0.1 mg por cada larva) en el séptimo día después de la inoculación. Cada combinación de cepa de insecto/ concentración de proteína Cry fue replicada cuatro veces, con 16 a 32 larvas en cada réplica.

Los criterios de mortalidad larvaria se midieron como mortalidad "práctica", que consideró tanto las larvas muertas (mórbidas) como las larvas sobrevivientes (Raquíticas, que no se alimentan) que no mostraron un aumento significativo de peso corporal (es decir < 0.1 mg por cada larva). La mortalidad práctica de las larvas en un tratamiento se calculó utilizando la ecuación: Mortalidad Práctica (%) = [TDS TNIT] x 100 donde TDS es la cantidad total de larvas muertas más la cantidad de larvas raquíticas (the Total number of Dead larvae plus the number of Stunted larvae), y TNIT es la cantidad total de insectos en el tratamiento ("the Total Number of Insects in the Treatment") La mortalidad "práctica" (en adelante simplificado como Mortalidad) de cada cepa de D. saccharalis se corrigió para mortalidad larvaria observada en dieta de Control Testigo y agua para analizar los resultados luego del tratamiento con CryIAb, o la dieta tratada con buffer solamente para el tratamiento con DIG- 52.

Los resultados de los experimentos de respuesta a la dosis fueron adicionalmente analizados para establecer un valor de GI50, [es decir, la concentración de proteína B.t. en la dieta a la cual el valor de la inhibición del crecimiento larvario (% Gl) fue 50]. El valor del % de Gl de las larvas con dieta que contiene proteína CryIAb se calculó utilizando la fórmula: %GI = [TWC -TWT] TWC x 100 donde TWC es el peso corporal total de las larvas que se alimentan de dieta control y agua ("Total body Weight of larvae feeding on water Control d'iet"), y TWT es el peso corporal total de las larvas que se alimentan de dieta tratada con CryIAb ("Total body Weight of larvae feeding on CryIAb Treated diet") si bien, para analizar el % de Gl de las larvas como resultado de la ingestión de proteína DIG-152, se calculó utilizando la fórmula: %GI = [TWB -TWT]/TWB x 100 donde TWB es el peso corporal total de larvas que se alimentan con dieta tratada con control de Buffer solamente ("Total body Weight of larvae feeding on Buffer-Only control treated diet"), y TWT es el peso corporal total de larvas que se alimentan de dieta tratada con DIG- 52 ("Total body Weight of larvae feeding on DIG-152 Treated diet") Una inhibición del crecimiento larvario de 100% fue asignada a una replicación si no habían larvas que tenían aumento de peso significativo (<0.1 mg por cada larva). Los datos de la inhibición del crecimiento fueron analizados utilizando un ANOVA de dos vías con cepa de insecto y concentración de proteína Cry como los dos factores principales. Se emplearon ensayos LSMEANS para determinar las diferentes en los tratamientos en el nivel a = 0.05.

Los resultados de los bioensayos de incorporación de la dieta en larvas de Diatraea saccharalis son proporcionados en el Cuadro 4.

CUADRO 4 Mortalidad larvaria en respuesta a la dosis e inhibición del crecimiento (% media ± sem) de Diatraea saccharalis susceptible a Crv1 Ab (SCB) y resistente a CrylAb (rSCB) que se alimenta con dieta que contiene proteína CrylAb o DIG-1523 por una misma letra no son significativamente diferentes (P < 0.05; ensayo LS EANS). sem = error estándar de la media pg de proteína/g de dieta c La medida de la mortalidad larvaria fue según lo definido en el texto. d Estos valores porcentuales fueron calculados utilizando la fórmula descrita en el texto. e Estos valores porcentuales fueron calculados utilizando la fórmula descrita en el texto.

' NE = No Ensayado Análisis de datos Luego los datos de dosis / mortalidad corregidos fueron sometidos a análisis por el método de "probits" para determinar las concentraciones proteicas del tratamiento que causaron un valor de mortalidad del 50% (LC50) y los correspondientes intervalos de confianza del 95% (Cl). Los tratamientos empleados en el análisis por el método de "probits" incluyeron la concentración más alta que produjo mortalidad cero, la concentración más baja que dio como resultado 100% de mortalidad, y todos los resultados entre estos extremos. Se calcularon las relaciones de resistencia dividiendo el valor de LC50 de la cepa rSCB por aquel de los insectos SCB. Se empleó un ensayo de relación de dosis letal para determinar si las relaciones de resistencia eran significativas a un nivel a = 0.05. Se empleó además un ANOVA de dos vías para analizar los datos de mortalidad, seguido por el ensayo LSMEANS en el nivel a = 0.05 para determinar diferentes en los tratamientos. Los resultados de los análisis son presentados en el Cuadro 5.

CUADRO 5 Síntesis de pruebas de bioensavo en larvas de SCB y rSCB utilizando dieta para insectos en donde se incorporó proteína DIG-152 o proteina CrylAb La medida de mortalidad larvaria se definió según lo descrito en el texto. b Las relaciones de resistencia con una letra 'S' son Significativas, mientras que aquellas con las letras 'NS" son No Significativas en el nivel del 5% en base a los ensayos de dosis letales.

Una característica de la proteina DIG-152 de la presente invención es que el crecimiento de larvas de taladrador de caña de azúcar neonatas (Diatraea saccharalis) es inhibido, o las larvas son exterminadas, después de la ingestión de proteina DIG-152 en niveles similares a aquellos de proteína CrylAb activada que proporcionaron la misma respuesta biológica. Una característica adicional de la proteína DIG-152 es que las larvas Diatraea saccharalis que son resistentes a los efectos tóxicos de la proteína CrylAb son no obstante susceptibles a la acción tóxica de la proteína DIG-152.

EJEMPLO 5 Producción de anticuerpos monoclonales de ratón y policlonales de conejo inmunorreactivos contra proteínas CryICa quiméricas Se desarrollaron anticuerpos para la detección y cuantificación de proteínas CryI Ca quiméricas y variantes de proteínas CryI Ca quiméricas, por ejemplo, en extractos preparados a partir de plantas transgénicas que producen las proteínas de la presente invención. Se emplearon métodos de preparación / análisis de inmunotransferencia estándares y métodos de ELISA para caracterizar los anticuerpos y para la detección de proteína B.t. (por ejemplo, según lo enseñado en Coligan et al., 2007 y sus actualizaciones).

Producción de anticuerpos policlonales El antígeno proteico empleado para inmunizaciones policlonales fue la toxina núcleo truncada con tripsina preparada a partir de proteína DIG-152 producida en células de P. fluorescens según lo enseñado en el Ejemplo 2. Por añadidura, dos péptidos específicos para el segmento de toxina núcleo CryICa fueron conjugados a Hemocianina de Lapa Califomiana ("Keyhole Limpet Hemocyanin") y empleados como inmunógenos. Los péptidos en cuestión corresponden a los aminoácidos 436-445 (VQRSGTPFLT; Cry1Ca436; SEQ ID NO:6) y aminoácidos 591-600 (SEQPLFGAGS; Cry1Ca591 ; SEQ ID NO:7) de SEQ ID NO:1. Estas secuencias peptídicas fueron identificadas como siendo únicas para CryI Ca cuando la secuencia proteica de CryICa fue comparada con las secuencias de diversas otras clases de proteínas B.t. Cry . Adicionalmente, los péptidos se espera que sean expuestos en la superficie de la proteína nativa CryI Ca.

Las inmunizaciones y recolecciones séricas se llevaron a cabo por procedimientos estándares por proveedores contratados. Los anticuerpos policlonales fueron obtenidos a través de Covance (Princeton, NJ). Se emplearon conejos blancos de Nueva Zelanda para producir anticuerpos policlonales contra la proteína DIG-152 activada con tripsina. Se empleó un tiempo de ciclos de 14 días entre las inmunizaciones y recolecciones de suero. La dosificación fue iniciada con adyuvante completo de Freund que contenía 0.5 mg de proteína o péptido conjugado. Se prepararon inyecciones subsiguientes con adyuvante de Freund incompleto.

Los sueros de los dos conejos fueron combinados para producir un solo lote de anticuerpo purificado con proteína A (denominado DIG152RPC1 ) reactivo con la proteína de toxina núcleo CryI Ca. Como es bien sabido por un experto en la técnica de la caracterización de anticuerpos, los anticuerpos policlonales generados contra una proteína intacta no son en general extremadamente específicos y a menudo detectarán muchos epítopos en la proteína inmunizante así como también otras proteínas relacionadas. Por consiguiente, el análisis de inmunotransferencias reveló que DIG152RPC1 detecta otras toxinas Bt de clase Cry1 , específicamente, CryIAb, CryI Da, y CryI Fa activadas con tripsina, y CryI Be y CryI Ea activadas con quimiotripsina. Se observa que en entornos comerciales, las plantas de cultivo pueden producir otras proteínas de clase Cry1 , y por ende DIG152RPC1 representa un reactivo útil para detectar estas proteínas, incluyendo truncaciones y otras formas de las proteínas.

Dos lotes específicos para péptidos conjugados de anticuerpo policlonal de conejo fueron desarrollados para CryI Ca. Se emplearon dos conejos Blancos de Nueva Zelanda para cada péptido y los sueros se agruparon para cada péptido; dando como resultado un lote de anticuerpo peptídico para cada uno de los dos péptidos. Las inmunizaciones y recolecciones de sueros se llevaron a cabo por procedimientos estándares, con tiempo de ciclos de 14 días entre las inmunizaciones y las recolecciones de sueros. El lote final de suero fue purificado por afinidad con el correspondiente péptido. La evaluación de ELISA directo de ambos anticuerpos específicos de péptido reveló que el anticuerpo contra el péptido Cry1 Ca591 parece específicamente detectar CryI Ca cuando se compara con la reacción con otras proteínas de la clase Cry1 , si bien el anticuerpo contra péptido Cry1 Ca436 no es tan específico (Cuadro 6).

CUADRO 6 Lecturas de Densidad Óptica por ELISA directo obtenidas con dos anticuerpos específicos contra péptido CryICa después de reacción con diversos antíqenos de proteína Bt Cry1 cuando se presentan a 1 ug/mL Producción de anticuerpos monoclonales Se prepararon anticuerpos monoclonales por Open BioSystems/Thermo Fisher Scientific (Huntsville, AL). El desarrollo de anticuerpos monoclonales anti-Cry1 Ca de ratón empleó la toxina núcleo truncada con tripsina preparada de proteína DIG-152 producida en células de P. fluorescens según lo descrito en el Ejemplo 2. La inmunización y el desarrollo de las líneas celulares se llevaron a cabo por métodos de desarrollo de anticuerpos convencionales en cultivo celular y no por métodos de producción de ascitis. Las líneas celulares monoclonales se desarrollaron según procedimientos convencionales fusionando las células de bazo de ratón inmunizadas con una línea de células de mieloma de ratón ND4 compatible.

El screening por ELISA de unión directo identificó sueros de ratón M4 como teniendo especificidad significativa hacia la proteína CryICa (Cuadro 7).

CUADRO 7 Títulos de criterios de valoración de reacción de ELISA de unión directa de sueros de ratón M4 (inmunizados con CryI Ca activado con tripsina) a diversas proteínas de clase Cry1 Todas las líneas monoclonales derivadas de M4 fueron analizadas por ELISA de unión directa para la unión a CryI Ca, CryI Da, CryIAc, CryI Fa, CryI Be, y CryIAb. Las líneas M4-34 y M4-23, las cuales demostraron la capacidad de detectar CryI Ca [es decir, proporcionaron una lectura de densidad óptica (DO) elevada], y no detectaron las otras proteínas de clase Cry1 [es decir, dieron cero lecturas DO o lecturas DO muy bajas], son de particular interés (Cuadro 8). Los anticuerpos monoclonales de la Línea preferida M4-34 son denominados anticuerpo DIG152MabM4-34.

CUADRO 8 Lecturas de Densidad Óptica por ELISA de unión directa de lineas de células monoclonales derivadas de M4 reaccionadas con la proteína CrylCa activada con tripsina objetivo y proteínas de clase Cry1 no objetivo Por lo tanto, un objetivo de la presente invención es el de proporcionar anticuerpos monoclonales que reconozcan específicamente la proteína B.t. CrylCa truncada.

EJEMPLO 6 Diseño de una secuencia codón- optimizada de maíz que codifica la proteína DIG-109 Un experto en la técnica de la biología molecular en plantas comprenderá que pueden diseñarse múltiples secuencias de ADN para codificar una sola secuencia de aminoácidos. Un medio común para aumentar la expresión de una región codificante para una proteína de interés consiste en diseñar la región codificante de modo que su composición codónica se asemeje a la composición codónica general del huésped en el cual el gen está destinado a ser expresado. Una guía con respecto al diseño y producción de genes sintéticos puede ser encontrada en, por ejemplo, WO 1997/13402 y en la Patente Estadounidense No. 5380831.

Una secuencia de ADN que tiene una preferencia codónica de maíz fue diseñada y sintetizada para producir la proteína insecticida quimérica DIG-109 en plantas monocotiledóneas transgénicas. Se calculó un cuadro de uso de codones para maíz (Zea mays L) de 706 secuencias codificantes de proteína obtenidas de secuencias depositadas en GenBank (www: ncbi.nlm.nih.gov). Se calculó un conjunto codónico de maíz promedio ponderado después de omitir cualquier codón redundante empleado menos de aproximadamente 10% de los usos de codones totales para ese aminoácido. La representación del Promedio Ponderado para cada codón se calculó utilizando la fórmula: % Promedio Ponderado de C1 = 1/(%C1 + %C2 + %C3 + etc.) x %C1 x 100 donde C1 es el codón en cuestión y %C2, %C3, etc. representan los valores de uso % promedios de los codones sinónimos remanentes.

Para derivar una secuencia de ADN codón- optimizada del maíz que codifica la proteína DIG-109 de 1 164 aminoácidos de SEQ ID NO:5, se realizaron sustituciones codónicas a la secuencia de ADN cryICa nativa que codifica el segmento de toxina núcleo CryI Ca de modo que la secuencia de ADN resultante tuviera la composición codónica general del Cuadro de preferencias codónicas optimizados para maíz. De manera similar, se realizaron las sustituciones codónicas a la secuencia de ADN cryIAb nativa que codifica el segmento de protoxina CryIAb de SEQ ID NO: 4 de modo que la secuencia de ADN resultante tuviera la composición codónica general del Cuadro de preferencias de codones optimizados para maíz. Se realizaron refinamientos adicionales a las secuencias para eliminar sitios de reconocimiento de enzimas de restricción no deseables, sitios de corte y empalme de intrones vegetales potenciales, corridas largas de residuos A/T o C/G, y otros motivos que podrían interferir con la estabilidad de ARN, transcripción o traducción de la región codificante en células vegetales. Se realizaron otros cambios para introducir sitios de reconocimiento de enzimas de restricción deseados y para eliminar Marcos de Lectura Abierta internos largos (marcos diferentes a +1 ). Estos cambios fueron todos realizados dentro de las restricciones de retener aproximadamente la composición de codones con preferencia hacia el maíz. Una secuencia codón- optimizada de maíz completa que codifica la proteína DIG-109 es descrita como SEQ ID NO:8. La síntesis de un fragmento de ADN correspondiente a SEQ ID NO:8 fue realizada por un proveedor comercial (DNA2.0, Menlo Park, CA).

EJEMPLO 7 Construcción de vectores de transformación de plantas que contienen genes expresables en plantas que codifican proteínas DIG-109 El sistema superbinario de Agrobacterium (Japan Tobacco, Tokio, JP) es empleado convenientemente para la transformación de huéspedes de plantas monocotiledóneas. El sistema superbinario emplea el plásmido vector lanzadera pSB1 1 el cual contiene las secuencias para la repetición de borde de T-DNA derecho (RB) y la repetición de borde de T-DNA Izquierdo (LB) separados por múltiples sitios de clonación. Un derivado de pSB1 1 (denominado pDAB7691) fue preparado mediante métodos de clonación de ADN convencionales. El plásmido pDAB7691 contiene la secuencia codificante de DIG-109 maíz- optimizada (CDS; es decir, SEQ ID NO:8) bajo el control transcripcional del promotor de ubiquitinal del maíz con intrón 1 asociado (Patente Estadounidense N° 5510474) y la Región No Traducida en 3' Per5 de maíz (3' UTR) (Patente Estadounidense N° 7179902). Adicionalmente, pDAB7691 contiene un gen marcador seleccionare vegetal que comprende el DSM2 CDS de Dow AgroSciences (WO 2008/070845 A2) bajo el control transcripcional del promotor actinal de arroz con intrón 1 asociado (Patente Estadounidense N° 5641876) y UTR 3' de Lipasa del maíz (Patente Estadounidense N° 7179902). La disposición física de los componentes de la región T de pDAB7691 es ilustrada convenientemente como: RB>promotor Ub¡1 de maíz:DIG-109 CDS: Per5 3'UTR de maíz>promotor Act1 del arroz:DSM2 CDS: Lip 3'UTR del maíz>LB Un segundo derivado de pSB1 1 (denominado pDAB100276) fue preparado mediante métodos de clonación de ADN convencionales. El plásmido pDAB100276 contiene la secuencia codificante de DIG-109 maíz-optimizada (CDS; es decir, SEQ ID NO:8) bajo el control transcripcional del promotor ubiquitina 1 del maíz con intrón 1 asociado y la Per5 3' UTR del maíz. Por añadidura, pDAEM 00276 contiene un gen marcador seleccionable vegetal que comprende la CDS AAD1 de Dow AgroSciences (Solicitud de Patente Estadounidense No. 20090093366), bajo el control transcripcional del promotor de ubiquitina 1 del maíz con intrón 1 asociado y la UTR 3' de Lipasa del maíz. La disposición física de los componentes de la región T de pDAB100276 es ilustrada convenientemente como: RB>promotor Ub¡1 del maíz:DIG-109 CDS: Per5 3' UTR del maíz> promotor Ubi1 del maíz:AAD-1 CDS: Lip 3' UTR del maíz >LB Para preparar para la transformación de Agrobacterium, se cultivaron células de la cepa de clonación de Escherichia coli DH5a que albergan el plásmido pDAB7691 o el plásmido pDAB100276 a 37° durante toda la noche en medio de agar LB (g/L: Bacto Triptona, 10; Bacto Extracto de Levadura, 5; NaCI, 10; agar, 15) que contenía Espectinomicina (100 pg/mL). Se cultivaron células de la cepa DH5a que contenían el plásmido movilizante conjugal pRK2013 en agar LB que contenía Kanamicina (50 pg/mL). Luego de la incubación, las placas se colocaron a 4o a la espera de la disponibilidad de la cepa de Agrobacterium tumefaciens LBA4404 que contenía el plásmido pSBl EJEMPLO 8 Transformación de Aqrobacterium para generación de vectores superbinarios El sistema superbinario de Agrobacterium, el cual emplea la cepa de Agrobacterium tumefaciens LBA4404 que contiene el plásmido pSB1 , es empleado convenientemente para la transformación de huéspedes de plantas monocotiledóneas. Las metodologías para construir y validar vectores superbinarios son bien establecidas según lo proporcionado en el Manual Operativo para pSB1 (Japan Tobacco). Se emplearon métodos de microbiología y biología molecular convencionales para generar y validar el plásmido superbinario pDAS5162, el cual es un plásmido cointegrador que comprende a los plásmidos pSB1 y pDAB7691 , y el plásmido superbinario pDAS5848, el cual es un plásmido cointegrador que comprende a los plásmidos pSB1 y pDAB100276.

EJEMPLO 9 Producción de proteína DIG-109 en plantas de maíz Transformación Mediada por Agrobacterium de Maíz Se plantaron semillas de una cruza F1 Hi-ll (Armstrong et al., 1991 ) en macetas de 18.9270589 litros (5 galones) que contenían una mezcla de medio de cultivo sin tierra 95% Metro-Mix 360 (Sun Gro Horticulture, Bellevue, WA) y 5% de arcilla/arcilla del suelo. Las plantas se cultivaron en un invernadero utilizando una combinación de sodio a presión elevada y lámparas de haluro de metal con un fotoperiodo de 16 horas de luz: 8 horas de oscuridad. Se realizaron polinizaciones de hermanos controladas para obtener embriones F2 inmaduros para transformación. Se recolectaron mazorcas de maíz a aproximadamente 8-10 dias pos-polinización cuando los embriones inmaduros tenían un tamaño entre 1.0 mm y 2.0 mm.

Infección y cocultivo Las mazorcas de maíz fueron descascaradas y la superficie fue esterilizada por frotación con jabón líquido, sumergiendo en blanqueador comercial 20% (que contenía hipoclorito sódico al 5%) durante aproximadamente 20 minutos, luego enjuagando tres veces con agua estéril. Una suspensión de células de Agrobacterium tumefaciens que contenían pDAS5162, un vector superbinario que alberga a un gen que codifica la proteína DIG- 09 y que contenía el gen marcador seleccionable de planta DSM2, se preparó transfiriendo 1 o 2 lazos de bacterias [cultivadas durante 2-3 días a 28° en medio sólido YEP (g/L: Bacto Extracto de Levadura, 10; Bacto Peptona, 10; NaCI, 5; agar, 15) que contenía 100 mg/L de Espectinomicina, 10 mg/L de Tetraciclina, y 250 mg/L de Estreptomicina] en 5 mL de medio líquido de infección [Medio Basal LS (Linsmaier y Skoog, 1965), vitaminas N6 (Chu et al., 1975), 1.5 mg/L de ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), 68.5 g/L de sacarosa, 36.0 g/L de glucosa, L-prolina 6 mM, pH 5.2] que contenía 100 µ? de acetosiringona.

Alternativamente, una suspensión de células de Agrobacterium tumefaciens que contenían pDAS5848, un vector superbinario que alberga un gen que codifica la proteína DIG-109 y que contiene el gen marcador seleccionare de planta AAD-1 , se preparó transfiriendo 1 o 2 lazos de bacterias cultivadas según lo descrito anteriormente en 5 mL de medio líquido de infección que contenía 100 a 200 µ? de acetosiringona.

En ambos casos, la solución se sometió a vórtice hasta que se logró una suspensión uniforme, y la concentración se ajustó hasta una densidad final de 200 unidades Klett utilizando un colorímetro Klett-Summerson con un filtro púrpura (para transformaciones de pDAS5162), o hasta una densidad óptica de 1.2 a 550 nm (para transformaciones de pDAS5848). Los embriones inmaduros fueron aislados directamente en un tubo de microcentrífuga que contenía 2 mL del medio de infección. El medio se extrajo y se reemplazó con 1 mL de la solución de Agrobacterium y la solución de Aorobacterí/m/embriones se incubó durante 5 a 10 minutos a temperatura ambiente. Luego, los embriones fueron transferidos a medio de cocultivo [Medio Basal LS, vitaminas N6, 1.5 mg/L de 2,4-D, 30.0 g/L de sacarosa, L-prolina 6 mM, 0.85 mg/L de AgN03, 2.8 g/L de goma Gelan (PhytoTechnology Laboratories, Lenexa, KS), pH 5.8] que contenía 100 µ? de acetosiringona (para transformantes de pDAS5162) o que contenía 100 a 200 µ? de acetosiringona (para transformantes pDAS5848), y cocultivados durante 3-4 días a 20° en la oscuridad.

Luego del cocultivo, los embriones fueron transferidos a medio de reposo que contenía sales de MS y vitaminas, L-prolina 6 mM, 100 mg/L de mio-inositol, 500 mg/L de MES, 30 g/L de sacarosa, 1.5 mg/L de 2,4-D, 0.85 mg/L de AgN03, 250 mg/L de Cefotaxime, 2.8 g/L de goma gelan, pH 5.8. Aproximadamente 7 días después, los embriones fueron transferidos al mismo medio suplementado con 3 mg/L de Bialaphos (para transformantes pDAS5162) o suplementados con 100 nM de haloxifop (para transformantes pDAS5848) (medio de selección). Los aislados transformados fueron identificados después de aproximadamente 8 semanas y se aumentaron de tamaño transfiriéndolos a medio de selección frasco en intervalos de 2 semanas para regeneración y análisis.

Regeneración y producción de semillas Para la regeneración, los cultivos fueron transferidos a medio de inducción "28" (sales MS y vitaminas, 30 g/L de sacarosa, 5 mg/L de Bencilaminopurina, 0.25 mg/L 2, 4-D, 250 mg/L de Cefotaxime, 2.5 g/L de goma gelan, pH 5.7) suplementado con 3 mg/L de Bialaphos (para transformantes pDAS5162) o suplementado con 100 nM de haloxifop (para transformantes pDAS5848). La incubación fue durante 1 semana bajo condiciones de luz baja (14 Em"2s'1), luego 1 semana bajo condiciones de luz alta (aproximadamente 89 pEm"2s"1). Los tejidos fueron posteriormente transferidos a medio de regeneración "36" (igual que el medio de inducción excepto que carece de los reguladores del crecimiento de plantas). Cuando las plántulas tuvieron un largo de 3-5 cm, se transfirieron a tubos de vidrio para cultivo que contenían medio SHGA [(Schenk y Hildebrandt (1972) sales y vitaminas; PhytoTechnologies Labr.), 1.0 g/L de mio-inositol, 10 g/L de sacarosa y 2.0 g/L de goma gelan, pH 5.8] para permitir el crecimiento adicional y desarrollo del brote y las raíces. Las plantas fueron trasplantadas a la misma mezcla de suelo según lo descrito anteriormente y cultivadas hasta floración en el invernadero. Se llevaron a cabo polinizaciones controladas para la producción de semillas.

Los expertos en la técnica de la transformación del maíz comprenderán que otros métodos están disponibles para la transformación del maíz y para la selección de plantas transformadas cuando se emplean otros genes marcadores seleccionares expresables en plantas (por ej. genes de tolerancia a herbicida).

EJEMPLO 10 Análisis bioquímico y bioensavos de insectos de plantas de maíz productoras de proteina DIG-109 La producción de proteína DIG-109 en plantas de maíz transgénicas se examinó en proteínas extraídas de hojas de plantas jóvenes (generación T0). Dos discos de hojas de maíz de 6 mm de diámetro se colocaron en un tubo de muestra de una caja de tubos agrupados de 96 pocilios de profundidad (Costar Cat# 3957) y se congelaron a -80° hasta el día del análisis. En ese momento, se agregaron dos BB's Daisy™ recubíertos con zinc de 4.5 mm a cada tubo (congelado), junto con 200 µ?_ de buffer de extracción compuesto por PBS (Solución Salina Tamponada con Fosfato; Fisher Cat# BP665-1) más 0.05% de Tween 20. Cada tubo se tapó y la caja se colocó en un molino de perlas (Pulverizador 4-96 de Kleco™; García Manufacturing, Visalia, CA) a la configuración máxima durante tres minutos. Las muestras pulverizadas se centrifugaron durante 5 minutos a 2,500 x g y el sobrenadante que contenía proteínas solubles se empleó en los ¡nmunoensayos.

Los análisis de inmunotransferencia de proteínas de hojas de maíz extraídas revelaron que el anticuerpo policlonal DIG152RPC1 no reacciona en forma cruzada con proteínas extraídas de hojas de plantas no transgénicas. En extractos de plantas transformadas con pDAS5162, se detectaron diversas especies proteicas por el anticuerpo DIG152PRC1. Al menos cuatro bandas inmunorreactivas principales fueron generalmente detectadas. En muchos casos, se observó una especie proteica abundante que migra con una movilidad correspondiente a una proteína de aproximadamente 70 kDa. La otra especie proteica principal tenía tamaños moleculares estimados como de 65 kDa, los mismos que el del péptido límite con tripsina de DIG-152 preparado a partir de Dpf108 en el Ejemplo 2), 60 kDa, y 55 kDa. Cuando los extractos de hojas de maíz transgénico pDAS5162 fueron examinados por ¡nmunotransferencia utilizando un anticuerpo policlonal DIG-152, en algunas plantas las especie de 60 kDa y 55 kDa eran las más abundantes. Con cualquiera de los dos anticuerpos, solo se encontraron unas pocas plantas con la proteína de longitud completa DIG-109 (130 kDa), y, cuando se encontraron, estaba presente como una especie menor.

Es evidente que, si bien el transgén introducido en el maíz por medio de transformación con pDAS5162 codifica la proteína DIG-109 de longitud completa, la actividad proteolítica dentro de las células de maíz procesa la proteína naciente hasta una abundancia de especies de peso molecular más pequeño estables.

La toxicidad de insectos de las hojas recolectadas de plantas de maíz transgénico independientemente aisladas transformadas con el constructo pDAS5162 se analizó in vitro utilizando larvas neonatas de gusano cogollero (FAW, Spodoptera frugiperda (J.E. Smith)) y larvas de gusano cogollero (FAW) resistente a CryI F (rFAW). Se obtuvieron huevos de gusano cogollero (FAW) de un insectario comercial (Benzon), y los huevos rFAW provenían de una población patentada (Dow AgroSciences). Se tomaron muestras de segmentos de hojas para bioensayos de insectos de plantas T0 cultivadas en invernadero aproximadamente 2 semanas después de que las plantas fueran trasplantadas desde el laboratorio en el invernadero. Se colocaron dos trozos de hojas de cada planta (cada una de aproximadamente 0.000645 mz (1 pulgada cuadrada)) en pocilios separados de una bandeja de 32 pocilios (CD International) encima de aproximadamente 3 ml_ de agar al 2% solidificado. Los huevos se incubaron sobre dieta de lepidópteros de múltiples especies (Southland Products) y las larvas neonatas se seleccionaron cuando tenían menos de 24 horas de edad. Se colocaron cuidadosamente aproximadamente 10 larvas por segmento de hoja en cada pocilio utilizando un pincel para pintar de pelo de camello. Las bandejas infestadas se sellaron con las tapas perforadas suministradas con las bandejas, luego se mantuvieron a 28°, 40% HR, 16 horas luz:8 horas de oscuridad durante tres días. El porcentaje de daño (% DA (por sus siglas en inglés) para cada trozo de hoja se registró a la conclusión del ensayo. Se promediaron las puntuaciones del daño y se emplearon para determinar cuales plantas tenían el menor daño de cada tipo de insecto analizado. Los ensayos fueron replicados varias veces para todos los insectos.

Los datos fueron analizados utilizando el programa informático estadístico JMP (SAS, Cary, NC), promediando las puntuaciones de % de DAM para cada planta, para cada tipo de insecto. El modelo "Fit Y por X" fue empleado para análisis ANOVA de una vía. Se empleó separación de medios Tukey-Kramer según lo necesario para analizar diferencias significativas entre las puntuaciones de % de daño (DAM) medias para cada tratamiento. Se realizaron comparaciones a las puntuaciones de % de DAM obtenidas de plantas control de edad similar. Las plantas controles positivas fueron cultivadas de semillas del híbrido comercial Herculex I™, que produce la toxina B.t. CryI Fa. Los controles negativos (es decir, plantas no transformadas) fueron representados por las líneas H¡ II y B104, y una isolínea Herculex I™ (un progenitor que no contiene Cry del híbrido Herculex I™).

La Figura 1 sintetiza los resultados obtenidos en dichas pruebas de bioensayos de insectos. Es un hallazgo sorprendente el hecho de que existe una correlación positiva entre la producción de DIG-109 en las hojas transgénicas y la puntuación de %DAM. Para FAW, F = 35.3; d.f. = 1 , 33; P < 0.0001 ; r2 = 0.52, y para rFAW, F = 25.3; d.f. = 1 , 33; P < 0,0001 ; r2 = 0.43. Un hallazgo adicional sorprendente y novedoso es que las larvas de gusano cogollero que son resistentes a intoxicación por la toxina B.t. CryI Fa son aun inhibidas de alimentarse por la toxina B.t. DIG-109.

Se entiende que otras pestes de insectos de maíz pueden ser analizadas en forma similar. Estas pestes incluyen, aunque sin limitarse a: Agromyza parvicornis (minador de las hojas del maíz (corn blot leafmíner)), Agrotis ípsilon (gusano cortador negro (black cutworm)), Anticarsia gemmatalis (oruga del frijol terciopelo (velvetbean caterpillar)), Diatraea grandiosella (taladrador del maíz del suroeste (southwestem corn borer)), Diatraea saccharalis (taladrador de la caña de azúcar (sugarcane borer)), Elasmopalpus lignosellus (taladrador del tallo del trigo (lesser cornstalk borer)), Helicoverpa zea (gusano de la mazorca del maíz (corn earworm)), Heliothis virescens, (gusano del tabaco (tobáceo budworm)), Ostrinia nubilalis (taladrador europeo del maíz (European corn borer)), O. nubilalis, Plutella xylostella resistente a CryI F (polilla torso de diamante (diamondback moth)), P. xylostella Cry1 -resistente, Spodoptera exigua (gusano militar de la remolacha (beet armyworm)), y Trichoplusia ni (gusano medidor de la col (cabbage looper)).

Las plantas de maíz transgénicas transformadas con pDAS5848 (generación TO) también fueron examinadas mediante bioensayos de insectos y mediante inmunoanálisis. La cantidad de proteína DIG-109 en extractos de hojas se cuantificó utilizando un kit de detección de ELISA CryI C disponible en el mercado (Envirologix™, Portland, MA; Cat# AP007), y el nivel de proteína DIG-109 detectada se expresó como partes por millón (ppm; 1 ppm representa 1 ng de proteína DIG-109 por cada mg de proteina soluble total en el extracto). El daño por alimentación por el gusano cogollero (FAW) y gusano cogollero resistente a CryI F (rFAW) se codificó de la siguiente manera: 0 = ningún daño o unas pocas marcas por alimentación de hueco de aguja (pinhole), 1 = 25% a 50% de hoja comida, y 2 = la mayor parte de la hoja consumida o ya no queda nada de la hoja. Una planta protegida es aquella cuya puntuación del daño es 0.67 o inferior.

Los datos del Cuadro 9 muestran que existe una correlación positiva entre la presencia de especie de proteína DIG-109 detectada por ELISA en las plantas TO y el control del daño por alimentación realizado por larvas de gusano cogollero en bioensayos in vitro. La planta con el nivel más alto detectado de proteína DIG-109 (planta 5848-005.4) tenía la puntuación más baja de daño por alimentación de hoja. Las hojas de plantas con niveles inferiores de proteína DIG-109 detectable en el intervalo de 190 a 230 ppm también sufrieron menos daño por alimentación de lo visto con hojas de las plantas controles negativas (es decir, controles no transformados B104 y H¡ II), que tenían puntuaciones promedio de daño de 1.7 y 1.8. En todas las hojas pDAS5848 examinadas, la especie de proteína DIG-109 predominante detectada comprendería un doblete de péptidos de tamaño aproximado 60kDa y 55kDa.

CUADRO 9 Niveles de proteína DIG-109 en extractos de hojas de maíz transgénicas transformadas con pDAS5848 y reducción del daño por alimentación del gusano cogollero a NA = No Aplicable; b SD = Desviación Estándar (Standard Deviation) de la media Por lo tanto, una característica de la presente invención es que la proteína DIG-109, cuando es producida en plantas de maíz, torna a las plantas resistentes al daño por alimentación por larvas de gusano cogollero y larvas de gusano cogollero resistente a CryI F.

EJEMPLO 11 Análisis molecular de plantas de maíz que producen proteína DIG-109 Extracción de tejido Se aisló ADN genómico de hojas de plantas de maíz transgénicas TO transformadas con pDAS5162 y pDAS5848. Las muestras de tejido fueron recolectadas en placas de recolección de 96 pocilios (Qiagen, Cat. #19560) y liofilizadas durante 2 días. Se realizó la disrupción de tejido con un pulverizador de tejido Klecko™ y perlas de tungsteno esencialmente según lo descrito en el Ejemplo 10. Para ensayos de la Sonda de Hidrólisis (HP, por sus siglas en inglés), se aisló ADN genómico en formato de alto rendimiento utilizando el kit DNeasy™ 96 Plant (Qiagen) de acuerdo con el protocolo sugerido por el fabricante. Para el análisis de transferencia Southern, se aisló ADN genómico en formato de alto rendimiento utilizando las modificaciones del protocolo de extracción de ADN CTAB de Murray y Thompson (1980). Murray, M. G., Thompson, W. F. (1980) Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucí. Acids Res. 8:4321-4325.

El ADN extraído de cualquiera de los dos protocolos se cuantificó con el kit de ensayos de ADN Quant-IT Pico Green DNA assay kit (Molecular Probes, Invitrogen Catálogo # P7589). En este procedimiento, se ensayaron 88 muestras de desconocidos en un formato de 96 pocilios conteniendo la primera columna patrones dobles diluidos en forma seriada que oscilaban entre 20 ng/pL y 1.25 ng/pL, más un testigo de buffer, un testigo de agua y un pocilio vacío. Luego, las muestras de ADN del ensayo, 5 pL de diluciones 1 :5 a 1 :40 (dependiendo de la concentración inicial esperada), se mezclaron con el tinte intercalador tamponado, diluido apropiadamente, y se incubaron en una reacción de 105 pL durante diez minutos en la oscuridad. Luego de incubación, se registró la fluorescencia utilizando un lector de placas Synergy2 (BioTek, Winooski, VT). Se estimó la concentración de ADN genómico a partir de la curva estándar calculada después de las correcciones de fluorescencia de fondo.

Preparación de Transferencia Southern Diez pg de ADN genómico de diez líneas de maíz transformadas con pDAS5848 se digirieron con la enzima de restricción Bsm I durante toda la noche a 37°. Los fragmentos de las muestras de ADN digeridas se separaron por medio de electroforesis en gel a través de un gel de agarosa al 1 % (SAS, Cary, NC) y se transfirieron a membrana de nylon (INYC000I0 IMMOBILON-NY+, Millipore). La transferencia Southern se híbrido con una sonda PCR-amplificada etiquetada con digoxigenina (DIG PCR Probé Synthesis Kit; Roche Applied Science, Indianápolís, IN) correspondiente a las bases 251 a 630 de SEQ ID NO:8. La hibridación y la detección se llevaron a cabo de acuerdo con los protocolos del proveedor. ADN de las líneas transformadas con pDAS5848 que se confirmó por análisis de transferencia Southern que albergan una única copia del gen que codifica DIG-109 se emplearon como controles de referencia para ensayos de número de copias PCR cuantitativa.

Ensayos de Sonda de Hidrólisis Se realizaron determinaciones de número de copias de transgenes por ensayos de Sonda de Hidrólisis (HP, por sus siglas en inglés) por PCR en tiempo real utilizado el sistema LightCycler®480 (Roche Applied Science). Se empleó el programa informático LightCycler® Probé Design Software v 2.0 para diseñar ensayos para detectar los genes marcadores seleccionabas DSM2 y AAD-1 , los genes de referencia GLP1 (proteína 1 del tipo germinas de maíz; GenBank Acceso AY394010) y INV (invertasa de maíz; GenBank Acceso U16123), y el gen que codifican DIG-109. Para amplificación, se preparó una mezcla maestra LightCycler®480 Probes Master Mix a una concentración final 1x en una reacción multiplex de volumen 10 pique contenía 0.4 µ? de cada cebador y 0.2 µ? de cada sonda (las secuencias de los oligonucleótidos y etiquetas fluorescentes están enlistadas en el Cuadro 10). Se llevó a cabo una reacción de amplificación de dos pasos con una extensión en 56° durante 40 segundos con adquisición de fluorescencia. Todas las muestras se corrieron por triplicado y se emplearon valores de Ct promediados para la categorización de cada muestra.

CUADRO 10 Oligonucleótidos empleados en ensayos de PCR con Sondas de Hidrólisis (HP) aLa sonda AAD1 es una sonda TaqMan® MGB suministrada por ABI (Invitrogen) El análisis de las sondas de hidrólisis (HP) para DSM2 se completó en 36 líneas transformadas con pDAS5162. Un evento de integración simple, definido como 1-2 copias del gen, se detectó en 95% (34 eventos) de las muestras.

El análisis de HP para AAD-1 y DIG-109 se completó en 13 líneas transformadas con pDAS5848. Se detectó un evento de integración simple en 93% (12 líneas) de las muestras para AAD-1 y 54% (7 líneas) para DIG-109. 54% de las líneas (7 líneas) contenía eventos de integración simples para ambos genes.

EJEMPLO 12 Caracterización bioquímica de especies de truncación de DIG-109 de maíz Se realizó un análisis más detallado sobre proteínas extraídas de hojas de una planta de maíz T0 transformada con pDAS5162. Una inmunotransferencia del extracto de proteína sondeado con el anticuerpo policlonal DIG152RPC1 reveló la presencia de cinco especies de proteína DIG-109. En base a las movilidades relativas de estos péptidos, se asignaron las siguientes identidades: La especie 1 corresponde a la proteína DIG-109 de longitud completa (130 kDa) según lo designado en SEQ ID NO:5; La especie 2 corresponde a un producto DIG-109 de 70 kDa. Un péptido de la misma movilidad es encontrado en extractos de células bacterianas que expresan un gen que codifica la proteína DIG-152 de longitud completa. La generación de estos fragmentos de aproximadamente 70 kDa indica la presencia de sitios de disociación predominantes en la proteína de longitud completa que son expuestos a proteasas encontradas en maíz y en bacterias. La especie 3 corresponde en tamaño a un péptido de limite con tripsina de DIG-152, según lo preparado en el Ejemplo 2, con tamaño de aproximadamente 65 kDa; La especie 4 corresponde a un producto DIG-109 truncado de aproximadamente 60 kDa; La especie 5 corresponde a un producto de DIG-109 truncado de aproximadamente 55 kDa. Los péptidos de aproximadamente 70 kDa, 60 kDa y 55 kDa son adicionalmente caracterizados en el Ejemplo 14.

EJEMPLO 13 Diseño de genes que codifican variantes de DIG-109 y deleción de a- hélices de Dominio I Para mejorar las propiedades insecticidas de la proteína DIG-109, se realizan deleciones seriadas, por etapas, cada una de las cuales elimina parte del término N de la proteína DIG-109 según lo descrito en SEQ ID NO:5. Las deleciones eliminan parte o la totalidad de a-hélice 1 y parte o la totalidad de a-hélice 2 en el Dominio I, manteniendo al mismo tiempo la integridad estructural de a-hélice 3 a a-hélice 7. Hemos deducido los comienzos y extremos de a-hélice 1 , a- hélice 2A, a- hélice 2B, a- hélice 3, y a- hélice 4, y las ubicaciones de las regiones especiadoras entre los mismos en el Dominio I de la toxina núcleo CryICa comparando la secuencia amino de la toxina núcleo CryI Ca con la secuencia de aminoácidos de la proteína CryIAa (GenBank Acceso No. AAA22353), para la cual la estructura es conocida [RCBS Protein Structure Datábase Number: CRYIA(A); Grochuiski et al. , (1995)]. Estas ubicaciones son descritas en el Cuadro 1.

En el diseño de secuencias codificantes para las variantes de deleción de terminal N, un codón de inicio de ATG, que codifica metionina, es insertado en el extremo 5' de la secuencia nucleotidica diseñada para expresar la variante de deleción. Para secuencias diseñadas para utilizar en plantas transgénicas, puede ser beneficioso adherirse a la "regla de extremo N" ("N-end rule") de Varshavsky (1997). Se enseña que algunos aminoácidos pueden contribuir con la inestabilidad proteica y degradación proteica en células eucarióticas cuando se exhiben como el residuo de terminal N de una proteína. Por ejemplo, los datos recogidos de observaciones en células de levadura y de mamífero indican que los aminoácidos desestabilizantes de terminal N son F, L, W, Y, R, K, H, I, N, Q, D, E y posiblemente P. Si bien los detalles específicos de los mecanismos de degradación de proteínas pueden diferir de algún modo entre los organismos, la conservación de identidad de aminoácidos desestabilizantes de terminal N vista anteriormente sugiere que mecanismos similares pueden funcionar en células de plantas. Por ejemplo, Worley et al., (1998) descubrieron que en las plantas, la regla de extremo N incluye residuos básicos y aromáticos. Es una posibilidad que la disociación proteolítica por proteasas vegetales cerca del inicio de a-hélice 3 de las proteínas insecticidas de B.t. en cuestión pueda exponer un aminoácido N-terminal desestabilizante. Dicho procesamiento puede dirigirse hacia las proteínas disociadas para una rápida disminución y límite de la acumulación de las proteínas insecticidas de B.t. hasta niveles insuficientes para un eficaz control de insectos. Por consiguiente, para variantes de deleción de terminal N que comienzan con uno de los aminoácidos desestabilizantes, los solicitantes prefieren agregar un codón que especifica un aminoácido G (glicina) entre la metionina de iniciación de la traducción y el aminoácido desestabilizante.

Las deleciones son diseñadas de la siguiente manera. Este ejemplo utiliza la secuencia de ADN de 3492 pb de longitud completa optimizada para codones del maíz (es decir, SEQ ID NO:8) que codifica la proteína DIG-109 quimérica de 1 164 aminoácidos de longitud completa (es decir SEQ ID NO:5) para ilustrar los principios de diseño con 65 variantes específicas. Un experto en la técnica se dará cuanta de que otras secuencias de ADN que codifican la totalidad o una porción N-terminal del segmento de la toxina núcleo CryI Ca pueden ser similarmente manipuladas para lograr el resultado deseado. Para contemplar la primera secuencia codificante variante delecionada, todas las bases que codifican a-hélice 1 incluyendo el codón para el residuo valina cerca del comienzo de a-hélice 2A (es decir V51 de la proteína DIG-109 de longitud completa de SEQ ID NO:5), son eliminadas. Por lo tanto, la eliminación de las bases 1 a 153 de SEQ ID NO:8 elimina la secuencia codificante para los aminoácidos 1 a 51 de SEQ ID NO:5. La reintroducción de un codón de ATG (metionina) de inicio de la traducción en el comienzo (es decir, en frente del codón correspondiente al aminoácido 52 de la proteína de longitud completa) proporciona la secuencia codificante variante delecionada que comprende un marco abierto de lectura de 3342 bases que codifica una proteina DIG-109 variante delecionada que comprende 1 1 14 aminoácidos (es decir, metionina más aminoácidos 52 a 1 164 de la proteína DIG-109 de longitud completa). Las deleciones seriadas, por etapas, que eliminan codones adicionales para un único aminoácido correspondiente a los residuos 52 a 91 de la proteína DIG-109 de longitud completa de SEQ ID NO:5 proporcionan variantes que carecen de parte o la totalidad de a-hélice 2A y a-hélice 2B. Por lo tanto, una segunda secuencia codificante variante delecionada diseñada requiere la eliminación de bases 1 a 156 de SEQ ID NO:8, eliminando de ese modo la secuencia codificante para los aminoácidos 1 a 52. La restauración de un marco abierto de lectura funcional es nuevamente lograda por reintroducción de un codón de metionina de inicio de la traducción en el comienzo de la secuencia codificante remanente, proporcionando así una segunda secuencia codificante variante delecionada que tiene un marco abierto de lectura de 3339 bases que codifica una proteína DIG-109 variante delecionada que comprende 1 1 13 aminoácidos (es decir metionina más aminoácidos 53 a 1164 de la proteína DIG-109 de longitud completa). La secuencia codificante variante delecionada última diseñada requiere la remoción de las bases 1 a 273 de SEQ ID NO:8, eliminando de ese modo la secuencia codificante para los aminoácidos 1 a 91 , y, después de la reintroducción de un codón de metionina de inicio de la traducción, proporcionando una secuencia codificante variante de deleción que tiene un marco abierto de lectura de 3222 bases el cual codifica una proteína DIG-109 variante de deleción de 1074 aminoácidos (es decir metionina más aminoácidos 92 a 1 164 de la proteína DIG-109 de longitud completa). Según lo ejemplificado, después de la eliminación de la secuencia de deleción, se agrega un codón de metionina iniciador al comienzo de la secuencia codificante remanente para restaurar un marco abierto de lectura funcional. También según lo descrito, debe agregarse un codón de glicina adicional entre el codón de metionina y el codón para el aminoácido determinante de inestabilidad en el caso de que la remoción de la secuencia delecionada deje expuesto al término N de la porción remanente de la proteína de longitud completa uno de los aminoácidos determinantes de inestabilidad según lo proporcionado anteriormente.

El Cuadro 1 1 describe variantes específicas diseñadas de conformidad con la estrategia descrita con anterioridad.

CUADRO 11 Secuencias de proteínas variantes de deleción de la proteína DIG-109 de longitud completa de SEQ ID NQ.5 Los ácidos nucleicos adicionales que codifican las variantes de proteína DIG-109 descritos en el Cuadro 11 son diseñados de conformidad con los principios generales para genes sintéticos destinados para la expresión en plantas, según lo enseñado en el Ejemplo 6.

EJEMPLO 14 Diseño de variantes de proteína DIG-109 Según lo descrito en el Ejemplo 12, el producto de traducción inicial que comprende la proteína DIG-109 de longitud completa es procesado hasta diversos grados en plantas, y uno de los productos corresponde en tamaño al péptido de toxina núcleo truncado con tripsina de 65 kDa. Esta toxina núcleo se considera que es la forma activada de la toxina que se une a los receptores en el intestino medio del insecto y da como resultado toxicidad. Las tripsinas son endopeptidasas que disocian proteínas en el lado C-terminal de los residuos arginina (R) o lisina (K). Por lo tanto, el péptido de DIG-109 de 65 kDa visto en el maíz puede corresponder al fragmento de 65 kDa generado por disociación después de los residuos R28 y R628 de SEQ ID NO:5 por una proteasa del tipo tripsina del maíz. Se señala que este péptido de toxina núcleo de 65 kDa puede comprender los aminoácidos 28 a 619 del segmento de toxina núcleo CryI Ca de SEQ ID NO: 1 y los aminoácidos 1 a 9 del segmento de protoxina CryIAb de SEQ ID NO:4. Sin embargo, debe entenderse que el término C preciso del producto de truncación de 65 kDa, o de otros productos de truncación observados en el maíz transgénico y descritos más adelante, no ha sido experimentalmente determinado. Por consiguiente, los diseños de las proteínas variantes DIG-109 descritos en esta invención tienen el propósito de ser ilustrativos y otras proteínas variantes truncadas DIG-109 que retienen actividad insecticida están dentro del alcance de esta invención.

La concentración de productos de péptido DIG-109 presente en la mayoría de las plantas de maíz transgénicas se determinó que es de aproximadamente 200 ppm. Por lo tanto, material insuficiente está disponible para purificación de los tejidos vegetales a mano para determinar las secuencias de aminoácidos de los péptidos DIG-109. Los péptidos sustitutos que son similares en tamaño a los productos truncados detectados en maíz fueron generados utilizando diferentes proteasas para disociar proteína DIG-1 52 de longitud completa.

Identidad del péptido de 70 kDa El perfil de SDS-PAGE de DIG-152 de longitud completa producido como cuerpos de inclusión en Pseudomonas fluorescens (? reveló una cantidad significativa de una proteína que tiene un tamaño molecular aparente de 70 kDa y que era relativamente estable al tratamiento con tripsina. Luego de la purificación a partir de cuerpos de inclusión de DIG-152 de longitud completa solubilizados mediante una combinación de cromatografía de intercambio aniónico y de exclusión por tamaño, este péptido tenía movilidad idéntica en SDS-PAGE a la del péptido DIG-109 de aproximadamente 70 kDa detectado en extractos de plantas de maíz transgénicas. Ambos péptidos fueron reconocidos por un anticuerpo policlonal dirigido contra DIG-152, y análisis de secuencias de aminoácidos del péptido P -producido identificado MDNNP como la secuencia de terminal N (residuos 1 a 5 de DIG-109, SEQ ID NO:5). Por lo tanto, el péptido de 70 kDa contiene el término N nativo de la proteína DIG-109 de longitud completa. La disociación de tripsina en el sitio de disociación de terminal C de toxina núcleo putativo (R628), dejando al mismo tiempo intactos los primeros 28 residuos que son característicamente eliminados de la proteína DIG-109 por disociación de tripsina en R28 para generar la toxina núcleo, genera un péptido (compuesto por DIG-109 residuos 1-628) con un tamaño calculado de 70,5 kDa, casi idéntico al peso molecular aparente de los péptidos DIG-152 aislados de cuerpos de inclusión de Pf y detectados en plantas de maíz transgénicas. Por consiguiente, se propone que la identidad de la proteína de 70 kDa corresponde a un péptido DIG-109 truncado compuesto por aminoácidos 1 -628.

Identidades de los péptidos de 60 kDa y 55 kDa Se descubrió que las plantas de maíz transformadas con pDAS5162 y pDAS5848 también producen proteínas derivadas de DIG-109 de movilidades correspondientes a 60 kDa y 55 kDa. Los péptidos de estos tamaños fueron producidos experimentalmente disociando, en primer lugar, proteína DIG-152 de longitud completa con tripsina y posteriormente tratando los productos disociados con tripsina con quimiotripsina. [El tratamiento de proteina DIG-152 de longitud completa con quimiotripsina sola dio como resultado múltiples productos truncados de algún modo más grandes que 60 kDa ] Los productos disociados con tripsina / quimiotripsina fueron preparados a granel y luego purificados por cromatografía de intercambio aniónico seguido por cromatografía de exclusión por tamaño Superóse 200. Se observaron tres picos principales en el paso de cromatografía de exclusión por tamaño, eluyendo a volúmenes recogidos de 12.5 mL, 18.3 mL, y 20 mL. El primer pico principal (12.5 mL) contenía agregados de peso molecular elevado (700 kDa a 1000 kDa) de proteínas DIG-152, y el tercer pico principal (20 mL) contenía quimiotripsina en exceso. La fracción de 12.5 mL también contenía bandas que tenían movilidades que correspondían a los productos de 65 kDa y 60 kDa de DIG-152; por ende, parece ser que la oligomerización o agregación de péptidos derivados de DIG-152 es reversible.

Las proteínas en el pico de 18.3 mL, junto con proteína DIG-152 disociada con tripsina solamente, se analizaron por SDS-PAGE bajo condiciones reductoras y desnaturalizantes. Estas proteínas comprendían dos especies principales con movilidades correspondientes a 60 kDa y 55 kDa. También se observaron proteínas más pequeñas de 14 kDa y 9 kDa y fueron identificadas como quimiotripsina que estaba aparentemente unida a los péptidos DIG-152 durante la purificación. Por añadidura, se observó una banda de elevado peso molecular con movilidad correspondiente a 240 kDa.

Las proteínas en esta banda fueron reconocidas por el anticuerpo DIG152RPC1 , demostrando que lo más probable es que era un oligómero (tetrámero) de los productos de disociación de DIG-152.

Las proteínas en los extractos de plantas que producen DIG-109 se separaron por SDS-PAGE y luego se sometieron a electrotransferencia sobre nitrocelulosa, junto con muestras de DIG-152 disociada con tripsina, purificada y proteína DIG-152 disociada con tripsina luego quimiotripsina. Las bandas correspondientes a péptidos DIG-109 o DIG-152 fueron visualizadas utilizado quimioluminiscencia aumentada activada por una combinación de un anticuerpo de conejo DIG152RPC1 primario y un anticuerpo etiquetado con peroxidasa de rábano picante antí-conejo secundario. La muestra de DIG-152 tratada con tripsina exhibió una banda única a aproximadamente 65 kDa de movilidad. El extracto de plantas que producen péptidos DIG-109 exhibió cuatro bandas: una con movilidad correspondiente a 130 kDa, (que representa la proteína DIG-109 de longitud completa), bandas de movilidades correspondientes a 60 kDa y 55 kDa, y una banda de movilidad correspondiente a aproximadamente 20 kDa. El producto de disociación de 20 kDa de DIG-109 no fue adicionalmente caracterizado. La proteína DIG-152 que fue tratada con tripsina y luego con quimiotripsina exhibió dos bandas que tenían movilidades correspondientes a aproximadamente 60 kDa y 55 kDa, y que co-migraban con las bandas de 60 kDa y 55 kDa vistas en los extractos de plantas. También había una banda de elevado peso molecular con movilidad correspondiente a aproximadamente 240 kDa en la muestra de proteína DIG- 52 que fue tratada con tripsina y luego con quimiotripsina.

Por lo tanto, los productos de disociación principales de DIG-109 que son producidos en maíz corresponden en tamaño a los dos productos que son obtenidos cuando la proteína DIG-152 de longitud completa es primero disociada con tripsina, luego disociada adicionalmente con quimiotripsina. Los primeros cinco residuos de terminal N de los péptidos de 60 kDa y 55 kDa producidos enzimáticamente fueron ambos determinados como DAFLV (correspondiente a residuos 74 a 78 de la proteína DIG-109, SEQ ID NO:5). Se señala que dicha disociación después de W73 de la proteína DIG-109 de longitud completa da como resultado la remoción de a-hélice1 , a-hélice2A y parte de a-hélice2B (Cuadro 1 ).

Se señala adicionalmente que, puesto que tanto los péptidos de 60 kDa como 55 kDa tienen la misma secuencia N-terminal, el segmento de 5 kDa es eliminado en la producción del péptido más pequeño (55 kDa) debe representar el procesamiento adicional desde el extremo C-terminal del péptido de 60 kDa.

Las supuestas coordenadas de aminoácidos de los cinco péptidos DIG-109 principales producidos en plantas de maíz transformadas con pDAS5162 y pDAS5848 son sintetizadas en el Cuadro 12. Los términos C precisos de estas Especies no fueron determinados. Se observa que la disociación con tripsina de la Especie 4 de 60 kDa después de R568 generaría un péptido de 56 kDa, (es decir, cerca de aquel de la Especie 5).

CUADRO 12 Identidades propuestas de péptidos procesados derivados de proteínas DIG-109 y DIG-152. Las posiciones de términos C aproximadas fueron deducidas de PM aproximado en geles. Los números de aminoácidos son inclusivos Según lo expuesto en el Cuadro 1 , a-hélice1 a a-hélice4 de la toxina núcleo DIG-109 residen dentro de los primeros 145 aminoácidos de la proteína DIG-109. La disociación en el primer sitio potencial en el extremo N-terminal de la toxina núcleo DIG-109 (R87 de DIG-109; R59 de la toxina núcleo) eliminaría 59 aminoácidos del núcleo DIG-109, y produciría una proteína que tiene un peso molecular de 61.02 kDa, con una a-hélice 1 , a-hélice2A, y a-hélice2B eliminadas. La remoción de -hélice1 de CrylAb ha sido implicada en permitir que la proteína eluda una unión inicial hacia el receptor cadherina, dando como resultado la formación de una estructura pre-poro oligomérica anterior a la inserción en las membranas celulares del intestino medio del insecto, y finalmente dando como resultado la formación de poros. Por analogía a esos estudios, se pronostica que la remoción de la porción N-terminal del núcleo DIG-109 truncada con tripsina, dando como resultado la pérdida de a-hélice1 , es un paso necesario para permitir la formación de oligómeros y para la unión a un receptor de aminopeptidasa N secundario que conduce a la formación de un poro funcional. Por lo tanto, la disociación de la proteína DIG-109 en plantas de ese modo podría dar como resultado un péptido de toxina DIG-109 que luego de la ingestión por insectos elude el requerimiento de unión a un receptor cadherina. Se ha demostrado que ese tipo de efecto da como resultado la superación de la resistencia a la intoxicación por proteína B.t. en insectos que tienen proteínas de receptor cadherina mutantes.

Los péptidos más pequeños (60 kDa y 55 kDa) encontrados en las plantas de maíz transgénicas pDAS5162 y pDAS5848 pueden representar los productos de disociación adicional por una proteasa del tipo tripsina. Puesto que estos péptidos son solo 5 kDa a 10 kDa más pequeños que el péptido núcleo de 65 kDa, dicha disociación adicional eliminaría menos de un total de aproximadamente 80 residuos de cualquiera de los dos extremos de la toxina núcleo. Dentro de los primeros 130 residuos del término N de la proteina DIG-109, los sitios de disociación con tripsina potenciales están ubicados en R28 (R-1 de la toxina núcleo), R87 (R59 de la toxina núcleo), R93 (R65 de la toxina núcleo), K1 15 (K87 de la toxina núcleo), K122 (K94 de la toxina núcleo), R127 (R99 de la toxina núcleo), y R129 (R101 de la toxina núcleo). Dentro de los 100 aminoácidos finales del término C de la toxina núcleo, los potenciales sitios de disociación con tripsina están situados en R530 (R502 de la toxina núcleo), R533 (R505 de la toxina núcleo), K557 (K529 de la toxina núcleo), R568 (R540 de la toxina núcleo), R571 (R543 de la toxina núcleo), R582 (R554 de la toxina núcleo), y K610 (K582 de la toxina núcleo).

Utilizando las ubicaciones de los sitios de disociación de proteasa potenciales identificados anteriormente como una guía, las secuencias de ADN derivadas de la secuencia codificante de DIG-109 optimizada para el maíz descrita en SEQ ID NO:8 fueron diseñadas para codificar variantes de proteína DIG-109 genéticamente truncadas. Las pautas para la adición de codones de metionina y glicina de terminal 5' para iniciar las regiones codificantes truncadas según lo descrito en el Ejemplo 13 fueron también empleadas para estos constructos. La primera modalidad de ese tipo, DIG-1 10, descrita como SEQ ID NO:27, comprende los aminoácidos 88 a 1 164 de la proteína DIG-109, con una adición de terminal N de metionina y glicina. Una secuencia de ADN optimizada para el maíz que codifica DIG-1 10 es descrita como SEQ ID NO:28. Una segunda modalidad, DIG-1 11 , descrita como SEQ ID NO:29, comprende los aminoácidos 88 a 628 de la proteína DIG-109, con una adición en terminal N de metionina y glicina. Una secuencia de ADN optimizada para el maíz que codifica DIG- 1 1 es descrita como SEQ ID NO:30. Una tercera modalidad, DIG-1 12, descrita como SEQ ID NO:31 , comprende los aminoácidos 123 a 1164 de la proteína DIG-109, con una adición en terminal N de metionina y glicina. Una secuencia de ADN optimizada para el maíz que codifica DIG-1 12 es descrita como SEQ ID NO:32. Una cuarta modalidad, DIG-1 13, descrita como SEQ ID NO:33, comprende los aminoácidos 123 a 628 de la proteína DIG-109, con una adición en terminal N de metionina y glicina. Una secuencia de ADN optimizada para el maíz que codifica DIG- 13 es descrita como SEQ ID NO:34. Una quinta modalidad, DIG-1 14, descrita como SEQ ID NO:35, comprende los aminoácidos 1 a 582 de la proteína DIG-109. Una secuencia de ADN optimizada para el maíz que codifica DIG-1 14 es descrita como SEQ ID NO:36.

Cabe señalar que las proteínas DIG-1 10 y DIG- 12 incluyen el segmento de protoxina CryIAb descrito en SEQ ID NO:4. Se cree que este segmento de protoxina de terminal C podría funcionar en algunos casos para estabilizar la proteína en la planta o tornarla más soluble. La disociación en el sitio de tripsina en R543 de DIG-1 10, eliminando así la mayor parte del segmento de protoxina, generaría un péptido de tamaño calculado de 61.2 kDa, un tamaño que es muy cercano a aquel del péptido truncado DIG-109 de 60 kDa observado en las plantas de maíz transformadas con pDAS5162 y pDAS5848. La proteína DIG- 11 (la cual carece de la totalidad del segmento de protoxina CryIAb excepto por los primeros 9 aminoácidos) comprende el segmento de DIG-110 que sería el resultado de dicha disociación (es decir, los aminoácidos 1 a 543 de DIG-1 10; tamaño calculado de 61.2 kDa).

Similarmente, la disociación en el sitio R508 análogo de DIG-1 12 generaría un péptido de tamaño calculado 57.2 kDa, un tamaño que es muy cercano a aquel del péptido DIG-109 de 55 kDa observado en las plantas de maíz transformadas con pDAS5162 y pDAS5848. La proteína DIG-1 13 (la cual carece de la totalidad del segmento de protoxina Cry Ab excepto por los primeros 9 aminoácidos) comprende el segmento de DIG-112 que sería el resultado de ese tipo de disociación (es decir, aminoácidos 1 a 508 de DIG-1 12; tamaño calculado de 57.2 kDa).

La proteína DIG-1 4 retiene los aminoácidos 1 a 28 de la proteína DIG-109 (estos residuos pueden ser enzimáticamente eliminados en células de plantas o en el intestino medio de insecto) y termina en el sitio de disociación con tripsina potencial en R582 de la proteína DIG-109. Por lo tanto, esta variante de DIG-109 puede existir como una proteína de 65.7 kDa, o como un péptido 62.6, dependiendo de si los 28 aminoácidos de terminal N son eliminados o no in vivo.

Pueden diseñarse secuencias codificantes optimizadas para maíz adicionales para codificar variantes de proteína DIG-109 adicionales mediante los principios descritos en esta invención.

EJEMPLO 15 Construcción de plásmidos de expresión que codifican DIG-109 y proteínas variantes de DIG-109 y expresión en Pseudomonas Se emplearon métodos de clonación convencionales [según lo descrito en, por ejemplo, Sambrook et al., (1989) y Ausubel et al., (1995), y las actualizaciones del mismo] en la construcción de constructos de expresión de Pseudomonas fluorescens (Pf) construidos por técnicas de ingeniería genética para producir la proteína DIG-109 o una proteína DIG-1 0, DIG-1 1 , DIG- 2, DIG-1 13, o DIG-1 4 (colectivamente denominadas proteínas variantes DIG-109). La producción proteica se realizó en la cepa MB214 de Pseudomonas fluorescens (un derivado de la cepa ??10? ; P. fluorescens biovar I), que tiene una inserción de un operón lac modificado según lo descrito en la Patente Estadounidense No. 5169760. La estrategia básica de clonación abarcó la subclonación de un fragmento de ADN que codifica DIG- 09 o una proteína variante DIG-109 en el plásmido pDOW1 69, por lo cual se coloca bajo el control de expresión del promotor Ptac y del terminador rrnBT1T2 del plásmido pKK223-3 (PL Pharmacia, Milwaukee, Wl). pDOW1 169 es un plásmido de copia media con el origen de replicación RSF1010, un gen pyrF, y un sitio de unión al ribosoma que precede los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción en donde los fragmentos de ADN que contienen regiones codificantes proteicas pueden ser introducidos (Solicitud de Patente Estadounidense No. 20080193974). El plásmido de expresión fue transformado por electroporación en DC454 (una cepa de P. fluorescens de tipo silvestre cercana que tiene mutaciones pyrF y lsc::laclQI), o sus derivados, recuperado en medio de hidrolizado de soya SOC y se plaqueó en medio selectivo (agar de glucosa M9 que carece de uracilo, Sambrook et al., supra). Los detalles de las manipulaciones microbiologicas están disponibles en Squires et al., (2004), Solicitud de Patente Estadounidense No. 20060008877, Solicitud de Patente Estadounidense No. 20080193974, y Solicitud de Patente Estadounidense No. 20080058262, incorporadas a la presente como referencia. Las colonias fueron en primer lugar seleccionadas por PCR y luego los clones positivos fueron analizados por digestión de restricción de ADN plásmido miniprep. El ADN plásmido de clones seleccionados que contienen insertos se secuenció por contrato con un proveedor de secuenciamiento comercial tal como MWG Biotech (Huntsville, AL). Los datos de secuencias fueron ensamblados y analizados utilizando el programa informático Sequencher™ (Gene Codes Corp., Ann Arbor, MI).

Análisis del Crecimiento y Expresión en Frascos de Agitación La producción de proteína DIG-109 o proteínas variantes DIG-109 para caracterización y bioensayo de insectos se logró mediante cepas de P. fluorescens cultivadas en frascos de agitación que contienen plásmidos de expresión apropiados. La producción de proteína DIG-109 o proteínas variantes DIG-109 fue impulsada por el promotor Ptac y se llevó a cabo según lo descrito previamente en la Patente estadounidense N° 5527883. La expresión fue inducida por la adición de isopropil-P-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) después de una incubación inicial de 24 horas a 30° con agitación. Los cultivos fueron muestreados en el momento de la inducción y en diversos momentos pos-inducción. La densidad celular se midió por densidad óptica a 600 nm (??ß??)- En cada momento de muestreo, la densidad celular de las muestras se ajustó hasta ??e?? = 20 y alícuotas de 1 mL se centrifugaron a g durante cinco minutos. Los pellas celulares fueron congeladas EJEMPLO 16 Fraccionamiento Celular y Análisis de SDS-PAGE de Muestras en frascos de Agitación de producción de Pseudomonas de proteínas DIG- 109 y proteínas variantes DIG-109 Las fracciones solubles e insolubles de muestras de pellas celulares en frascos de agitación congeladas fueron generadas utilizando Solución de Extracción de Proteína Bacteriana EasyLyse™ Bacterial Protein Extraction Solution (EPICENTRE® Biotechnologies, Madison, Wl). Se emplean los métodos y pautas según lo descrito en el Ejemplo 2.

EJEMPLO 17 Actividad insecticida de proteínas variantes DIG-109 producidas en Pseudomonas fluorescens La actividad insecticida de las proteínas variantes DIG-109 se demuestra en especie lepidópteras que incluyen al taladrador del maíz europeo ("European corn borer", ECB; Ostrinia nubilalis (Hübner)), ECB resistente a cryI F (rECB), gusano de la mazorca del maíz (CEW, "corn earworm"; Helicoverpa zea (Boddie)), gusano cortador negro (BCW, "black cutworm"; Agrotis ípsilon (Hufnagel)), gusano cogollero (FAW, "fall armyworm", Spodoptera frugiperda (J.E. Smith)), FAW resistente a Cryl F (rFAW), taladrador del maíz del suroeste (SWCB, "southwestern corn borer", Diatraea grandiosella), taladrador de la caña de azúcar (SCB, "sugarcane borer"; Diatraea saccharalis) y SCB resistente a CryIAb (rSCB).

Se siguen los métodos, pautas y análisis de datos descritos en el Ejemplo 3 y 4.

EJEMPLO 18 Construcción de vectores de transformación de plantas que contienen genes expresables en plantas que codifican proteínas variantes DIG-109 El sistema superbinario Agrobacterium (Japan Tobacco, Tokio, JP) es convenientemente empleado para la transformación de huéspedes de plantas monocotiledóneas. La construcción de vectores de expresión en plantas, y la generación de plásmidos superbinarios y su validación se llevan a cabo mediante métodos según lo descnto en el Ejemplo 7 y en el Ejemplo 8. Las disposiciones físicas de los componentes de T-DNA de los plásmidos derivados de pSB1 1 son convenientemente ilustradas como: RB>promotor Ubi1 del maíz:CDS variante DIG-109: Per5 3'UTR del maíz>promotor Act1 del arroz:DSM2 CDS: Lip 3'UTR del maíz>LB, o RB>promotor Ubi1 del maíz:CDS variante de DIG-109: Per5 3' UTR de maíz >promotor Ub¡1 del maíz:AAD-1 CDS: Lip 3' UTR del maíz>LB EJEMPLO 19 Producción de variantes de proteina DIG-109 en plantas de maíz Transformación Mediada por Aprobacterium de Maíz Plantas de maíz transgénicas que producen proteínas variantes DIG109 son generadas mediante los métodos descritos en el Ejemplo 9.

Los expertos en la técnica de la transformación del maíz comprenderán que otros métodos se encuentran disponibles para la transformación del maíz y para la selección de plantas transformadas cuando se emplean otros genes marcadores seleccionabas expresables en plantas (por ej. genes de tolerancia a herbicidas).

EJEMPLO 20 Análisis bioquímico y molecular y bioensayo de insectos de plantas de maíz transgénicas que expresan genes que codifican proteínas variantes DIG-109 La caracterización bioquímica de las proteínas variantes DIG-109 producidas por plantas de maíz transgénicas que albergan y expresan genes que codifican las proteínas variantes DIG-109 se lleva a cabo mediante los métodos y reactivos del Ejemplo 10 y Ejemplo 12. El análisis de transgenes de los genes que codifican proteínas variantes se realiza de acuerdo con los métodos y reactivos descritos en el Ejemplo 1 1. El bioensayo de insectos de trozos de hojas derivados de plantas de maíz transgénicas que albergan y expresan genes que codifican proteínas variantes DIG-109 es conducido por los métodos descritos en el Ejemplo 10.

Claims (23)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una proteína variante CryICa que tiene actividad insecticida, en la cual todo o parte de las alfa hélices N-terminal 1 , 2A, y/o 2B de una correspondiente CryICa de tipo silvestre son delecionados.

2. - La proteína variante de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque las deleciones remueven toda la a-hélice 1 y todo o parte de la a-hélice 2 en el Dominio 1 , dicha proteína comprende las a-hélices 3 a 7.

3. - La proteína variante de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dichas deleciones mejoran la actividad insecticida de la proteína DIG-109 insecticida, en donde dichas deleciones inician antes del comienzo de a-hélice 2A y terminan después del fin de la a-hélice 2B pero no se extienden en la a-hélice 3.

4. - La proteína variante de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dichas deleciones mejoran la actividad insecticida de la proteína DIG-152 insecticida, en donde dichas deleciones inician antes del comienzo de a-hélice 2A y terminan después del fin de la a-hélice 2B pero no se extienden en la a-hélice 3.

5. - La proteína variante de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque las deleciones de la N-terminal comienzan con al menos un aminoácido desestbilizante, y dicha proteína comprende un codón añadido que especifica un aminoácido de glicina entre una metionina de inicio de traslación y el aminoácido desestabilizante.

6. - La proteína variante de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha proteína carece de la secuencia de protoxina de C-terminal.

7. - Una proteína CryI Ca modificada que comprende un sitio introducido de disociación de proteasa dentro de una región espadadora entre la a-hélice 2B y la a-hélice 3.

8. - La proteína modificada de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque dicho sitio de disociación de proteasa es introducido dentro de los aminoácidos 85 a 90 de la proteína de toxina de núcleo CryI Ca de la SEQ ID NO:1.

9. - La proteína de conformidad con la reivindicación 1 o 7, caracterizada además porque dicha proteína tiene actividad mejorada contra un insecto.

10. - La proteína de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque dicho insecto se selecciona del grupo que consiste del gusano cogollero y el taladrador de la caña de azúcar.

1 1 .- Una proteína CryI Ca modificada que comprende un dominio de intercambio o lanzadera seleccionado del grupo que consiste del Dominio II y del Dominio III.

12 - La proteína de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque comprende un segmento de toxina de núcleo que comprende los aminoácidos 1-619 de SEQ ID NO: 1 , en la que hasta 10, hasta 15, o hasta 20 adiciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos han sido realizadas.

13. - Una proteína insecticida fusionada que comprende un segmento de toxina de núcleo N-terminal derivada de una proteína insecticida CryICa fusionada a un segmento de protoxina de endotoxina delta heteróloga a un punto pasando el segmento de toxina de núcleo.

14. - La proteína de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque dicha proteína comprende una secuencia de aminoácidos de residuos 28 a 619 de SEQ ID NO: 1 con hasta 20 sustituciones, deleciones o modificaciones de aminoácidos.

15. - La proteína de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque dicha proteína comprende los residuos 1 a 619 de SEQ ID NO:1 con hasta 20 sustituciones, deleciones o modificaciones de aminoácidos.

16. - Una proteína aislada que es al menos 90% idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO:3, SEQ ID N0:5, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID N0:31 , SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, y SEQ ID N0.1.

17. - La proteína de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque dicha proteína comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31 , SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, y SEQ ID NO:1.

18. - Un polinucleótido aislado que codifica una proteína de la reivindicación 16.

19. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada además porque dicho polinucleótido es al menos 90% idéntico a una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, y SEQ ID NO:2.

20. - Un método para controlar un insecto lepidóptero, dicho método comprende poner en contacto dicho insecto con una proteina de la reivindicación 16.

21. - Una célula de planta que produce una proteína de la reivindicación 16.

22. - Una célula microbiana que comprende un polinucleótido de la reivindicación 18.

23. - Una planta que comprende una pluralidad de células de la reivindicación 21.