MX2012004378A - Composiciones para controlar ácaros varroa en abejas. - Google Patents

Abstract

Se describe un agente de ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico que reduce la expresión de un producto génico de un ácaro destructor de Varroa; también se describen las composiciones que comprenden el mismo y usos del mismo.

Description

COMPOSICIONES PARA CONTROLAR ÁCAROS VARROA EN ABEJAS CAMPO Y ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a composiciones para controlar infestación de ácaros Varroa en abejas.

Las abejas mielíferas, Apis mellifera, se requieren para la polinización efectiva de cultivos y por lo tanto son críticas para la agricultura a nivel mundial. Las abejas mielíferas también producen productos económicamente importantes, incluyendo miel y cera de abeja. Las abejas mielíferas son susceptibles a un número de parásitos y patógenos, incluyendo el ácaro ectoparásito, Varroa destructor.

El trastorno de colapso de colonia (CCD) de las abejas mielíferas está amenazando con aniquilar la agricultura en los E.U.A. y en el mundo. De hecho, en el brote reciente de CCD en los E.U.A. en invierno de 2006-2007, un estimado de 25% o más de los 2.4 millones de colmenas de abejas mielíferas se perdieron debido a CCD. Un estimado de 23% de operaciones de apicultura en los Estados Unidos padeció CCD en invierno de 2006-2007, afectando un promedio de 45% de las operaciones de apicultura. En invierno de 2007-2008, el grupo de acción de CCD de USDA-ARS estimó que una total de 36% de todas las colmenas de operaciones comerciales fueron destruidas por CCD.

CCD se caracteriza por la pérdida rápida de una colonia de su población de abejas adultas, con abejas adultas muertas usualmente encontradas a una distancia de la colonia. En las etapas finales de colapso, una reina es atendida sólo por algunas abejas adultas recién emergidas. Las colonias colapsadas a menudo tienen progenies bloqueadas y reservas de alimentos considerables. El fenómeno de CCD fue reportado por primera vez en 2006; sin embargo, los apicultores notaron disminuciones de colonia únicas consistentes con CCD tan temprano como en 2004. Varios factores, tales como ácaros y agentes infecciosos, patrones climáticos, radiación electromagnética (antenas de celulares), plaguicidas, nutrición deficiente y estrés han sido postuladas como causas. Hasta la fecha, el control de CCD se ha enfocado en el control de ácaros Varroa, desinfección y remoción de enjambres afectados, tratamiento de infecciones por oportunistas (tales como Nosema) y nutrición mejorada. Hasta la fecha no se han desarrollado medidas preventivas efectivas.

Los ácaros Varroa parasitan a pupas y abejas adultas y se reproducen en las celdas de progenie pupal. Los ácaros usan sus bocas para perforar el exoesqueleto y alimentarse de la hemolinfa de las abejas. Estos sitios de heridas en el exoesqueleto portan infecciones bacterianas, tales como Melissococcus pluton, que causa loque europeo. Además de sus efectos parasitarios, se sospecha que los ácaros Varroa actúan como vectores para un número de patógenos de las abejas mielíferas, incluyendo virus de deformación de las alas (DWV), virus de las abejas de Cachemira (KBV), virus de la parálisis aguda de las abejas (ABPV) y virus de celdas negras de la reina (BQCV), y pueden debilitar los sistemas inmunológicos de sus hospederos, dejándolos vulnerables a infecciones. Si no se tratan, las infestaciones de Varroa generalmente producen mortalidad a nivel de colonias.

Los métodos actuales de tratamiento de infestaciones de Varroa están probando ser inefectivos ya que los ácaros desarrollan resistencia a acaricidas existentes. Además, el uso de dichos acaricidas puede introducir compuestos químicos perjudiciales en la miel que está destinada a consumo humano.

La solicitud de patente de E.U.A. 20090118214 enseña el uso de ARNdc para la prevención y tratamiento de infecciones virales en abejas mielíferas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN De conformidad con un aspecto de algunas modalidades de la presente invención, se provee un agente de ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico que regula descendentemente la expresión de un producto genético de un ácaro Varroa destructor.

De conformidad con un aspecto de algunas modalidades de la presente invención, se provee un constructo de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el agente de ácido nucleico aislado de la presente invención.

De conformidad con un aspecto de algunas modalidades de la presente invención, se provee una composición ingerible por abejas que comprende por lo menos un agente de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que regula descendentemente la expresión de un producto genético de un ácaro Varroa destructor.

De conformidad con un aspecto de algunas modalidades de la presente invención se provee un método de prevención o tratamiento de infestación de un ácaro Varroa destructor de una colmena de abejas, el método que comprende administrar a la abeja una cantidad efectiva de por lo menos un agente de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que regula descendentemente la expresión de un producto genético de un ácaro Varroa destructor, previniendo o tratando así una infestación de ácaro Varroa destructor de una colmena de abejas.

De conformidad con un aspecto de algunas modalidades de la presente invención, se provee a método de prevención o tratamiento de una infestación de ácaro Varroa destructor de una colmena de abejas, el método comprendiendo administrar a la abeja una cantidad efectiva del constructo de ácido nucleico de la presente invención, previniendo o tratando así una infestación de ácaro Varroa destructor de una colmena de abejas.

De conformidad con un aspecto de algunas modalidades de la presente invención, se provee a método de reducción de la susceptibilidad de las abejas mielíferas al trastorno de colapso de colonia (CCD), el método comprendiendo administrar a la abeja mielífera una cantidad efectiva de por lo menos un ácido nucleico de ácido ribonucleico de doble cadena (ARNdc), el por lo menos un ARNdc comprendiendo una secuencia complementaria a por lo menos 21 nucleótldos de ARNm de ácaro Varroa destructor y capaz de inducir degradación del ARNm específico de Varroa destructor.

De conformidad con algunas modalidades de la invención, la secuencia de ácido nucleico es complementaria a por lo menos 21 nucleótidos de ARN específico de ácaro Varroa destructor y capaz de inducir degradación del ARN específico de Varroa destructor.

De conformidad con algunas modalidades de la invención, el agente se selecciona del grupo que consiste de a ARNdc, un ARN antlsentido y una ribozima.

De conformidad con algunas modalidades de la invención, el ARNdc se selecciona del grupo que consiste de ARNic, ARNhc y miARN.

De conformidad con algunas modalidades de la invención, el producto genético es un ARNm que codifica un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de subunidad de ATPasa A, ARN polimerasa I, ARN polimerasa III, inhibidor de apoptosis (IAP), inhibidor apoptótico de FAS y a-Tubulina.

De conformidad con algunas modalidades de la invención, el por lo menos un agente de ácido nucleico comprende por lo menos cinco agentes de ácido nucleico, para subunidad A de ATPasa de regulación descendente, ARN polimerasa III, inhibidor de apoptosis (???), inhibidor apoptótico de FAS y a-Tubulina, cada uno de los por lo menos cinco agentes de ácido nucleico dirigidos a un gen diferente.

De conformidad con algunas modalidades de la invención, el por lo menos un agente de ácido nucleico comprende por lo menos seis agentes de ácido nucleico, para regular descendentemente la subunidad A de ATPasa, ARN polimerasa I, ARN polimerasa III, inhibidor de apoptosis (???), inhibidor apoptótico de FAS y a-Tubulina, cada uno de los por lo menos seis agentes de ácido nucleico para dirigir un gen diferente.

De conformidad con algunas modalidades de la invención, los agentes de ácido nucleico son como se expone en las SEQ ID NOs. 1 , 13, 27, 30 y 39.

De conformidad con algunas modalidades de la invención, los agentes de ácido nucleico son como se expone en las SEQ ID NOs: 1 , 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 27, 30, 33, 36 y 39.

De conformidad con algunas modalidades de la invención, la secuencia de ácido nucleico es mayor que 15 pares de bases de longitud.

De conformidad con algunas modalidades de la invención, la secuencia de ácido nucleico es 19 a 25 pares de bases de longitud.

De conformidad con algunas modalidades de la invención, la secuencia de ácido nucleico es mayor que 30 pares de bases de longitud.

De conformidad con algunas modalidades de la invención, la composición está en forma sólida.

De conformidad con algunas modalidades de la invención, la composición está en forma líquida.

De conformidad con algunas modalidades de la invención, la composición comprende proteína.

De conformidad con algunas modalidades de la invención, la proteína está en forma de discos de polen y/o soya.

De conformidad con algunas modalidades de la invención, el líquido es una solución de sacarosa.

De conformidad con algunas modalidades de la invención, el líquido es una solución de jarabe de maíz.

De conformidad con algunas modalidades de la invención, el líquido además comprende un carbohidrato o complemento de azúcar.

De conformidad con algunas modalidades de la invención, la abeja es una abeja mielífera.

De conformidad con algunas modalidades de la invención, la abeja mielífera es una forrajera.

De conformidad con algunas modalidades de la invención, la abeja mielífera es una abeja de colmena.

De conformidad con algunas modalidades de la invención, la abeja mielífera es una abeja de una colonia, y en donde la administración reduce la susceptibilidad de la colonia de abejas a trastorno de colapso de colonia.

De conformidad con algunas modalidades de la invención, la administración se efectúa por la alimentación.

De conformidad con algunas modalidades de la invención, la alimentación comprende proveer una composición líquida ingerible por la abeja.

De conformidad con algunas modalidades de la invención, la alimentación comprende proveer una composición sólida ingerible pór la abeja., De conformidad con algunas modalidades de la invención, el ARNm del ácaro Varroa destructor codifica un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de subunidad 2 de NADH deshidrogenase, subunidad 8 de ATP sintetasa, subunidad 6 de ATP sintetasa, subunidad I de canal de sodio y citocromo oxidasa.

A menos que se defina de otra manera, todos los técnico términos técnicos y/o científicos usados aquí tienen el mismo significado que es comúnmente entendido por un experto en la técnica al cual compete la invención. Aunque los métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos aquí se pueden usar en la práctica o prueba de modalidades de la invención, métodos y/o materiales ilustrativos se describen más adelante. En caso de conflicto, la especificación de patente, incluyendo definiciones, tendrá control. Además, los materiales, métodos y ejemplos son ilustrativos únicamente y no se pretende que necesariamente sean limitantes.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Algunas modalidades de la invención se describen en la presente, a manera de ejemplo únicamente, con referencia a los dibujos anexos. Con referencia específica ahora a los dibujos con detalle, se resalta el hecho de que los particulares mostrados son a manera de ejemplo y para propósitos de discusión ilustrativa de modalidades de la invención. A este respecto, la descripción tomada junto con los dibujos hace evidente para los expertos en la técnica cuántas modalidades de la invención pueden ponerse en práctica.

En los dibujos: La figura 1 es una representación esquemática del curso de tiempo de varios experimentos para transferencia de ARNdc a ácaros Varroa.

Las figuras 2A-2E son fotografías de los resultados del análisis de transferencia de Slot de la presencia de abejas que han ingerido ARNdc-GFP (figura 2A), en larva alimentadas por abejas adultas (figura 2B), en pupas (figura 2C), y en las abejas recién emergidas (figura 2D). La presencia de ARNdc-GFP y de ARNic derivado del mismo se analizó por Northern blots (figura 2E). D=días después de la administración de ARNdc-GFP a la colmena, La figura 3 es una fotografía que ilustra los resultados del análisis de RT-PCR de ARN extraído de Varroa en los días indicados en la hilera superior (tiempo como se indica en la figura 1). Los números en verde (hilera superior) indican individuos de Varroa que han sido colocados en abejas que han ingerido ARNdc-GFP y los números en negro indican ARN de Varroa colocado en abejas de control. + = control positivo (un plásmido que porta GFP).

La figura 4 es una fotografía que ilustra RT-PCR de ARN de Varroa con iniciadores para proteína inhibidora de apoptosis (IAP; secuencia 27). M: marcadores de tamaño. Lañes 1-3: ARN de plantilla de Varroa de colmenas tratadas con ARNdc de secuencias 27. Franja 4: ARN de plantilla de Varroa de colmenas de control. Franja 5: Control positivo (un plásmido portador de IAP). Franja 6: Control negativo (sin plantilla).

La figura 5 es una gráfica de barras que ilustra el conteo de Varroa por abeja (abejas adultas más larvas dentro de celdas selladas) en colmenas de control y en colmenas tratadas con mezcla I de ARNdc (Mín) y con mezcla II de ARNdc (Máx).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención, en algunas modalidades de la misma, se refiere a métodos y composiciones para reducir la susceptibilidad de las abejas a infestación de ácaros Varroa.

Antes de explicar con detalle por lo menos una modalidad de la invención, cabe entender que la invención no está necesariamente limitada en su aplicación a los detalles expuestos en la siguiente descripción o ejemplificada por los ejemplos. La invención es capaz de otras modalidades o de ponerse en práctica o llevada a cabo de varias maneras.

Las abejas son susceptibles a una miríada de infecciones virales. El tratamiento de dichas infecciones por regulación descendente de un producto genético viral particular ha mostrado ser exitoso en eliminar infecciones viralmente inducidas en la abeja (véase solicitud de patente de E.U.A. 20090118214).

Los inventores de la presente ahora proponen el tratamiento de infestaciones de ácaros Varroa en abejas al regular descendentemente productos genéticos de ácaros Varroa particular.

Los ácaros Varroa parasitan a pupas y abejas adultas y se reproducen en las celdas de progenie pupal. Los ácaros usan sus bocas para perforar el exoesqueleto y alimentarse de la hemolinfa de las abejas. Los inventores de la presente inesperadamente encontraron que los agentes de polinucleótido administrados a las abejas para tratar infestaciones de ácaros Varroa presentadas en la hemolinfa de las abejas estaban disponibles para los ácaros.

Los inventores de la presente han mostrado que el ARNdc puede ser exitosamente transferido a ácaros Varroa (figuras 2A-2E), que el ARNdc puede servir para regular descendentemente la expresión de un gen particular en los ácaros Varroa (figura 4) y además que la dirección de genes particulares para regulación descendente puede causar reducción en el número de ácaros Varroa (figura 5) Por lo tanto, de conformidad con un aspecto de la presente invención, se provee un método de prevención o tratamiento de una infestación de ácaro Varroa destructor de una abeja, el método comprendiendo administrar a la abeja una cantidad efectiva de un agente de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que regula descendentemente la expresión de un producto genético de un ácaro Varroa destructor, previniendo o tratando así una infestación de ácaro Varroa destructor de una abeja.

Como se usa aquí, el término "abeja" se refiere tanto a una abeja adulta como a celdas pupales de la misma. De conformidad con una modalidad, la abeja es una colmena.

Una abeja adulta se define como cualquiera de varios insectos alados, de cuerpo piloso, usualmente picadores de la superfamilia Apoidea en el orden Hymenoptera, incluyendo especies tanto solitarias como sociales y caracterizadas por partes bucales succionadoras y masticadoras para recolectar néctar y polen. Especies de abejas ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, Apis, Bombus, Trígona, Osmia y similares. En una modalidad, las abejas incluyen, pero no se limitan a abejorros (Bombus terrestris), abejas mielíferas (Apis mellifera) (incluyendo abejas forrajeras y de colmena) y Apis cerana.

De conformidad con una modalidad, la abeja es parte de una colonia.

El término "colonia" se refiere a una población de abejas que comprende docenas a generalmente varias decenas de miles de abejas que cooperan en la construcción del nido, recolección de alimentos, y panal de progenie. Una colonia normalmente tiene una sola reina, el resto de las abejas siendo ya sea "obreras" (hembras) o "zánganos" (machos). La estructura social de la colonia es mantenida por la reina y las obreras y depende de un sistema de comunicación efectivo. La división de mano de obra dentro de la casta de obreras principalmente depende de la edad de la abeja pero varía con las necesidades de la colonia. La reproducción y fuerza de la colonia depende de la reina, la cantidad de almacenamiento de alimento, y el tamaño de la fuerza de las obreras. Las abejas mielíferas también se pueden subdividir en las categorías de "abejas de colmena", usualmente para la primera parte del tiempo de vida de las obreras, durante el cual la "abeja de colmena" realiza tareas dentro de la colmena, y "abeja forrajera", durante la última parte del tiempo de vida de la abeja, durante el cual la "forrajera" localiza y recolecta polen y néctar del exterior de la colmena, y lleva el néctar o polen a la colmena para consumo y almacenamiento.

De conformidad con este aspecto de la presente invención, los agentes de la presente invención se usan para evitar que el acaro Varroa destructor vivan como un parásito en la abeja, o larva de la misma.

La frase "ácaro Varroa destructor" se refiere al ácaro parásito externo que ataca las abejas mielíferas Apis cerana y Apis mellifera. El ácaro puede estar en una etapa adulta, alimentándose de la abeja, o en una etapa larvaria, dentro de la celda de progenie de abejas mielíferas.

Como se mencionó, los agentes de la presente invención son capaces de regular descendentemente la expresión de un producto genético de un ácaro Varroa destructor.

Como se usa aquí, la frase "producto genético" se refiere a una molécula de ARN o una proteína.

De conformidad con una modalidad, el producto genético de ácaro Varroa destructor es uno que es esencial para viabilidad de los ácaros. La regulación descendente de dicho producto genético generalmente ocasionaría la muerte de los ácaros Varroa. De conformidad con otra modalidad, el producto genético de ácaro Varroa destructor es uno que es esencial para la reproducción de ácaros. La regulación descendente de dicho producto genético generalmente ocasionaría la prevención de reproducción de los ácaros Varroa y la exterminación final de la población de ácaros. De conformidad con otra modalidad más, el producto genético de ácaro Varroa destructor es uno que es requerido para generar síntomas patogénicos en la abeja.

Los productos genéticos ilustrativos que pueden ser regulados descendentemente de conformidad con este aspecto de la presente invención incluyen, pero no se limitan a NADH deshidrogenase; subunidad 2- acceso a Genbank NCJD04454; ATP sintetasa; subunidad 8 - NC_004454; ATP sintetasa; subunidad 6 - NC_004454¡ gen de canal de sodio - acceso a Genbank No. FJ216963; citocromo oxidasa, subunidad I - acceso a Genbank No. EF025469.

Se apreciará que, aunque los agentes de la presente invención son capaces de regular descendentemente la expresión de un producto genético de un ácaro Varroa destructor, es preferible que regule descendentemente a un grado menor la expresión del producto genético en otros animales, tal como la abeja. Por consiguiente, los agentes de la presente invención deben ser capaces de distinguir entre el gen del ácaro y el gen de la abeja, regulando descendentemente el primero a un mayor grado que el segundo. De conformidad con otra modalidad, los agentes de la presente invención no regulan descendentemente el gen de la abeja cualquiera que sea. Esto se puede efectuar al dirigir un gen que es expresado diferencialmente en el ácaro y no en la abeja, v.gr., el gen de canal de sodio del ácaro - FJ216963. Alternativamente, los agentes de la presente invención pueden ser dirigidos a secuencias específicas de ácaro de un gen que es expresado tanto en el ácaro como en la abeja.

De conformidad con una modalidad, los agentes de la presente invención dirigen segmentos de genes de Varroa que son por lo menos 100 bases de largo y no portan ninguna secuencia más larga que 9 bases que es completamente homologa a cualquier secuencia de genoma de abeja o secuencia de genoma humano.

Ejemplos de dichos segmentos de gen se proveen a continuación: SEQ ID NO: 1. Gen de Varroa homólogo a subunidad A de ATPasa (segmento 1); SEQ ID NO: 2. Gen de Varroa homólogo a subunidad A de ATPasa (segmento 2); SEQ ID NO: 3. Gen de Varroa homólogo a subunidad A de ATPasa (segmento 3); SEQ ID NO: 4. Gen de Varroa homólogo a subunidad A de ATPasa (segmento 4); SEQ ID NO: 5. Gen de Varroa homólogo a subunidad A de ATPasa (segmento 5); SEQ ID NO: 6. Gen de Varroa homólogo a subunidad A de ATPasa (segmento 6); SEQ ID NO: 7. Gen de Varroa homólogo a subunidad A de ATPasa (segmento 7); SEQ ID NO: 8. Gen de Varroa homólogo a subunidad A de ATPasa (segmento 8); SEQ ID NO: 9. Gen de Varroa homólogo a subunidad A de ATPasa (segmento 9); SEQ ID NO: 10. Gen de Varroa homólogo a ARN polimerasa (segmento 1 ); SEQ ID NO: 11. Gen de Varroa homólogo a ARN polimerasa (segmento 2); SEQ ID NO: 12. Gen de Varroa homólogo a ARN polimerasa (segmento 3); SEQ ID NO: 13. Gen de Varroa homólogo a ARN polimerasa II I (segmento 1); SEQ ID NO: 14. Gen de Varroa homólogo a ARN polimerasa II (segmento 2); SEQ ID NO: 15. Gen de Varroa homólogo a ARN polimerasa II (segmento 3); SEQ ID NO. 16. Gen de Varroa homólogo a ARN polimerasa II (segmento 4); SEQ ID NO: 17. Gen de Varroa homólogo a ARN polimerasa II (segmento 5); SEQ ID NO: 18. Gen de Varroa homólogo a ARN polimerasa II (segmento 6); SEQ ID NO: 19. Gen de Varroa homólogo a ARN polimerasa II I (segmento 7) SEQ ID NO: 20. Gen de Varroa homólogo a ARN polimerasa II (segmento 8); SEQ ID NO: 21. Gen de Varroa homólogo a ARN polimerasa II (segmento 9); SEQ ID NO : 22. Gen de Varroa homólogo a inhibidor de apoptosis (IAP; segmento 1); SEQ ID NO: 23. Gen de Varroa homólogo a inhibidor de apoptosis (IAP; segmento 2); SEQ ID NO: 24. Gen de Varroa homólogo a inhibidor de apoptosis (???; segmento 3); SEQ ID NO: 25. Gen de Varroa homólogo a inhibidor de apoptosis (???; segmento 4); SEQ ID NO: 26. Gen de Varroa homólogo a inhibidor de apoptosis (???; segmento 5); SEQ ID NO: 27. Gen de Varroa homólogo a inhibidor de apoptosis (???; segmento 6); SEQ ID NO: 28. Gen de Varroa homólogo a inhibidor de apoptosis (???; segmento 7); SEQ ID NO: 29. Gen de Varroa homólogo a inhibidor de apoptosis (???; segmento 8); SEQ ID NO: 30. Gen de Varroa homólogo a inhibidor apoptótico de FAS (segmento 1 ); SEQ ID NO: 31. Gen de Varroa homólogo a inhibidor apoptótico de FAS (segmento 2); SEQ ID NO: 32. Gen de Varroa homólogo a inhibidor apoptótico de FAS (segmento 3); SEQ ID NO: 33. Gen de Varroa homólogo a a-Tubulina (segmento 1); SEQ ID NO: 34. Gen de Varroa homólogo a a-Tubulina (segmento 2); SEQ ID NO: 35. Gen de Varroa homólogo a a-Tubulina (segmento 3); SEQ ID NO: 36. Gen de Varroa homólogo a a-Tubulina (segmento 4); SEQ ID NO. 37. Gen de Varroa homólogo a a-Tubulina (segmento 5); SEQ ID NO: 38. Gen de Varroa homólogo a a-Tubulina (segmento 6); SEQ ID NO: 39. Gen de Varroa homólogo a a-Tubulina (segmento 7); SEQ ID NO: 40. Gen de Varroa homólogo a a-Tubulina (segmento 8); SEQ ID NO: 41. Gen de Varroa homólogo a a-Tubulina (segmento 9); SEQ ID NO: 42. NADH deshidrogenasa; subunidad 2 (NC_004454): bases 709 a 974; SEQ ID NO: 43. ATP sintetasa; subunidad 8 (NC_004454): bases 3545 a 3643; SEQ ID NO: 44. Proteína de canal de sodio (AY259834): bases 3336-3836.

Se apreciará que más de un gen puede ser dirigido para aumentar al máximo el efecto citotóxico sobre los ácaros Varroas.

Por lo tanto, de conformidad con una modalidad, el siguiente grupo de genes son dirigidos - subunidad A de ATPasa, ARN polimerasa III, inhibidor de apoptosis (IAP), inhibidor apoptótico de FAS y a-Tubulina (v.gr., usando agentes de ácido nucleico que tienen la secuencia expuesta en 1 , 13, 27, 30 y 39).

De conformidad con otra modalidad, el siguiente grupo de genes son dirigidos - subunidad A de ATPasa, ARN polimerasa I, ARN polimerasa III, inhibidor de apoptosis (IAP), inhibidor apoptótico de FAS y a-Tubulina.

Se apreciará que así como regula descendentemente un número de genes, la presente invención además contempla el uso de un número de agentes para regular descendentemente el mismo gen (v.gr., un número de ARNdc cada uno de los cuales híbrida a un segmento diferente del mismo gen). Por lo tanto, por ejemplo, los inventores de la presente mostraron actividad citotóxica máxima cuando se usó la siguiente mezcla de ARNdcs: SEQ ID NOs:1 , 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 27, 30, 33, 36 y 39 y menos de una actividad citotóxica cuando se usó la siguiente mezcla de ARNdcs: SEQ ID NOs: 1 , 13, 27, 30 y 39.

Herramientas que son capaces de identificar secuencias específicas de especie se pueden usar para este propósito - v.gr., BLASTN y otros programas de computadora de este tipo.

Como se usa aquí, el término "regulación descendente de la expresión" se refiere a causar, directamente o indirectamente, reducción en la transcripción de un gen deseado, reducción en la cantidad, estabilidad o capacidad de traducción de productos de transcripción (v.gr, ARN) del gen, y/o reducción en la traducción del polipéptido(s) codificado por el gen deseado.

La regulación descendente de la expresión de un producto genético de un ácaro Varroa destructor puede ser monitoreada, por ejemplo, por detección directa de los transcritos de gen (por ejemplo, por PCR), por detección de polipéptido(s) codificados por el gen o ARN del patógeno de la abeja (por ejemplo, por Western blot o inmunoprecipitación), por detección de actividad biológica de polipéptidos codificados por el gen (por ejemplo, actividad catalítica, unión a ligando, y similares), o monitoreando cambios en el ácaro Varroa destructor (por ejemplo, proliferación reducida del ácaro, virulencia reducida del ácaro, motilidad reducida del ácaro, etc) y probando la infectividad/patogenicidad de la abeja.

La regulación descendente de un producto genético del ácaro Varroa destructor se puede efectuar sobre el nivel genómico y/o el nivel de transcripción usando una variedad de agentes que interfieren con la transcripción y/o traducción (v.gr., agentes silenciadores de ARN, ribozima, ADNzima y antisentido).

De conformidad con una modalidad, el agente que regula descendentemente la expresión de un producto genético del ácaro Varroa destructor es un agente de polinucleótido, tal como un agente de silenciamiento de ARN. De conformidad con esta modalidad, el agente de polinucleótido es mayor que 15 pares de bases de longitud.

Como se usa aquí, la frase "silenciamiento de ARN" se refiere a un grupo de mecanismos reguladores [v.gr, interferencia de ARN (¡ARN), silenciamiento de gen transcripcional (TGS), silenciamiento de gen post-transcripcional (PTGS), extinción, co-supresión, y represión de la traducción] mediada por moléculas de ARN que dan por resultado la inhibición o "silenciamiento" de la expresión de un gen que codifica proteína correspondiente o secuencia de ARN del patógeno de la abeja. El silenciamiento de ARN se ha observado en muchos tipos de organismos, incluyendo plantas, animales y hongos.

Como se usa aquí, el término "agente de silenciamiento de ARN" se refiere a un ARN que es capaz de inhibir o "silenciar" la expresión de un gen objetivo. En ciertas modalidades, el agente de silenciamiento de ARN es capaz de prevenir el procesamiento completo (v.gr., la traducción y/o expresión completas) de una molécula de ARNm a través de un mecanismo de silenciamiento post-transcripcional. Los agentes de silenciamiento de ARN incluyen moléculas de ARN no codificantes, por ejemplo, duplexes de ARN que comprenden cadenas pareadas, así como ARN precursores de las cuales se pueden generar dichos ARN no codificantes pequeños . Agentes de silenciamiento de ARN ilustrativos incluyen ARNdc tales como ARNic, miARN y ARNhc. En una modalidad, el agente de silenciamiento de ARN es capaz de inducir interferencia de ARN. En otra modalidad, el agente de silenciamiento de ARN es capaz de mediar represión traduccional.

La interferencia de ARN se refiere al proceso de silenciamiento de gen post-transcripcional específico de secuencia en animales mediada por ARN de interferencia corto (RNAic). El proceso correspondiente en plantas comúnmente se refiere como silenciamiento de gen post-transcripcional o silenciamiento de ARN y también se refiere como extinción en hongos. El proceso de silenciamiento de gen post-transcripcional se piensa que es un mecanismo de defensa celular evolutivamente conservado usado para prevenir la expresión de genes extraños y es comúnmente compartido por flora diversa y phyla. Dicha protección de expresión de gen extraño puede haber evolucionado en respuesta a la producción de ARN de doble cadena (ARNdc) derivado de infección viral o de la integración aleatoria de elementos de transposón en el genoma de un hospedero por una respuesta celular que específicamente destruye el ARN de cadena sencilla homólogo o ARN genómico viral.

La presencia de ARNdc largos en las células estimula la actividad de una enzima ribonucleasa III referida como Dicer. Dicer está implicado en el procesamiento del ARNdc en piezas cortas de ARNdc conocidas como ARN de interferencia cortos (ARNic). Los ARN de interferencia corto derivados de la actividad de dicer son generalmente de aproximadamente 21 a aproximadamente 23 nucleótidos de longitud y comprenden duplexes de aproximadamente 19 pares de bases. La respuesta de la ¡ARN también presenta un complejo de endonucleasa, comúnmente referido como un complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC), que media la digestión de ARN de cadena sencilla que tiene secuencia complementaria a la cadena antisentido del dúplex de ARNic. La segmentación del ARN objetivo tiene lugar en la mitad de la región complementaria a la cadena antisentido del dúplex de ARNic.

De conformidad con una modalidad, el ARNdc es mayor que 30 pb. El uso de ARNdc largos puede proveer numerosas ventajas en que la célula puede seleccionar la secuencia de silenciamiento óptima aliviando la necesidad de probar numerosos ARNic; los ARNdc permitirán que las bibliotecas de silenciamiento tengan menos complejidad de la que sería necesaria para ARNic; y quizás de manera más importante, el ARNdc largo podría prevenir mutaciones de escape viral cuando se usan como agentes terapéuticos.

Varios estudios demuestran que los ARNdc largos se pueden usar para silenciar la expresión de gen sin inducir la respuesta al estrés o causando efectos inespecíficos significativos - véase por ejemplo [Strat et al., Nucleic Acids Research, 2006, Vol. 34, No. 13 3803-3810; Bhargava A et al. Brain Res. Protoc. 2004;13:115-125; Diallo M., et al., Oligonucleotides. 2003;13:381-392; Paddison P.J., et al., Proc. Nati Acad. Sci. USA. 2002;99:1443-1448; Tran N., et al., FEBS Lett. 2004;573:127-134].

Otro método de regulación descendente de un producto genético de ácaros Varroa es mediante la introducción de ARN inhibidores pequeños (ARNip).

El término "ARNip" se refiere a duplexes de ARN inhibidor pequeño (generalmente entre 18-30 pares de bases, entre 19 y 25 pares de bases) que inducen la vía de interferencia de ARN (iARN). Típicamente, los ARNip son químicamente sintetizados como 21 unidades monoméricas con una región dúplex central de 19 pp y proyecciones 3' de 2 bases simétricas en los extremos terminales, aunque se ha descrito recientemente que los duplexes de ARN químicamente sintetizados de longitud de 25-30 bases pueden tener tanto como un incremento de 100 veces en potencia comparado con 21 unidades monoméricas en el mismo lugar. La potencia incrementada observada obtenida usando ARN más largos al desencadenar iARN se teoriza que resulta de proveer Dicer con un sustrato (27 unidades monoméricas) en lugar de un producto (21 unidades monoméricas) y que esto mejora la velocidad o eficiencia de entrada del dúplex de ARNip en RISC.

Se ha encontrado que la posición de la proyección 3' influye en la potencia de un ARNip y los duplexes asimétricos que tienen una proyección 3' en la cadena antisentido son generalmente más potentes que aquellos con la proyección 3' en la cadena de sentido (Rose et al., 2005). Esto se puede atribuir a carga de cadena asimétrica en RISC, a medida que los patrones de eficacia opuestos se observan cuando se dirige el transcrito antisentido.

Las cadenas de un ARN de interferencia de doble cadena (v.gr., un ARNic) se pueden conectar para formar una estructura de horquilla o vástago-bucle (v.gr., un ARNhc). Por lo tanto, como se menciona, el agente de silenciamiento de ARN de la presente invención también puede ser un ARN de horquilla corto (ARMhc).

El término "ARNhc", como se usa aquí, se refiere a un agente de ARN que tiene una estructura de vástago-bucle, que comprende una primera y segunda regiones de secuencia complementaria, el grado de complementariedad y la orientación de las regiones siendo suficientes, de tal manera que el apareamiento de bases ocurre entre las regiones, la primera y segunda regiones siendo unidas por una región de bucle, el bucle resulta de una falta de apareamiento de bases entre nucleótidos (o análogos de nucleótido) dentro de la región de bucle. El número de nucleótidos en el bucle es un número entre y que incluye 3 a 23, o 5 a 15, o 7 a 13, o 4 a 9, o 9 a 11. Algunos de los nucleótidos en el bucle pueden estar implicados en interacciones de pares de bases con otros nucleótidos en el bucle. Ejemplos de secuencias de oligonucleótidos que se pueden usar para formar el bucle incluyeb 5'-UUCAAGAGA-3' (SEQ ID NO: 4; Brummelkamp, T. R. et al. (2002) Science 296: 550) y S'-UUUGUGUAG-S' (SEQ ID NO: 5; Castanotto, D. et al. (2002) RNA 8:1454). Un experto en la técnica reconocerá que el oligonucleótido de cadena sencilla resultante forma una estructura de vástago-bucle u horquilla que comprende una región de doble cadena capaz de interactuar con la maquinaria de ¡ARN, De conformidad con otra modalidad, el agente de silenciamiento de ARN puede ser un miARN. Los miARN son ARN pequeños hechos a partir de genes que codifican transcritos primarios de varios tamaños. Han sido identificados tanto en animales como en plantas. El transcrito primario (denominado el "pri-miARN") es procesado a través de varios pasos nucleolíticos a un miARN precursor más corto, o "pre-miARN." El pre-miARN está presente en una forma doblada de modo que el miARN final (maduro) está presente en un dúplex, las dos cadenas siendo referidas como el miARN (la cadena que finalmente formará pares de bases con el objetivo). El pre-miARN es un sustrato para una forma de Dicer que remueve el dúplex de miARN del precursor, después de lo cual, de manera similar a ARNip, el dúplex puede recogerse en el complejo RISC. Se ha demostrado que los miARN pueden ser transgénicamente expresados y ser efectivos a través de la expresión de una forma precursor, y no toda la forma primaria (Parizotto et al. (2004) Genes & Development 18:2237-2242 y Guo et al. (2005) Plant Cell 17:1376-1386), A diferencia de ARNip, los miARN, se unen a secuencias de transcrito sólo con complementariedad parcial (Zeng et al., 2002, Molec. Cell 9:1327-1333) y reprime la traducción sin afectar los niveles de ARN de estado constante (Lee et al., 1993, Cell 75:843-854; Wightman et al., 1993, Cell 75:855-862). Tanto los miARN y ARNip son procesados por Dicer y se asocian con componentes del complejo de silenciamiento inducido por ARN (Hutvagner et al., 2001 , Science 293:834-838; Grishok et al., 2001 , Cell 106: 23-34; Ketting et al., 2001 , Genes Dev. 15:2654-2659; Williams et al., 2002, Proa Nati. Acad. Sci. USA 99:6889-6894; Hammond et al., 2001 , Science 293:1146-1150; Mourlatos et al., 2002, Genes Dev. 16:720-728). Un reporte reciente (Hutvagner et al., 2002, Sciencexpress 297:2056-2060) postula la hipótesis de que la regulación de gen a través de la vía de miARN versus la vía de ARNip es determinado únicamente por el grado de complementariedad al transcrito objetivo. Se especula que los ARNip sólo con identidad parcial al objetivo de ARNm funcionarán en represión de la traducción, similar a un miARN, en vez de desencadenar degradación de ARN.

En una modalidad de la presente invención, la síntesis de agentes de silenciamiento de ARN adecuados para usarse con la presente invención se puede efectuar como sigue. Primero, el ARNm objetivo de ácaros Varroa es escudriñado hacia el extremo 3' del codón de inicio de AUG para secuencias de dinucleótido AA. La ocurrencia de cada AA y los 19 nucleótidos 3" adyacentes se registra como sitios objetivos de ARNip potenciales. Preferiblemente, los sitios objetivos de ARNip se seleccionan del marco de lectura abierto, ya que las regiones no traducidas (UTRs) son más ricas en sitios de unión a proteína reguladores. Las proteínas de unión a UTR y/o complejos de inicio de traducción pueden interferir con la unión del complejo de endonucleasa de ARNip [Tuschl ChemBiochem. 2:239-245], Por lo tanto, se apreciará que los ARNip dirigidos en regiones no traducidas también pueden ser efectivos, como se demuestra para GAPDH, en donde el ARNip dirigido en el 5' UTR medió aproximadamente 90% de disminución en el ARNm de GAPDH celular y anuló por completo el nivel de proteína. (wwwdotambiondotcom/techllb/tn/91/912dothtml).

Segundo, los sitios objetivos potenciales se comparan con una base de datos genómica apropiada (v.gr., humano, abeja, ratón, rata, etc.) usando cualquier software de alineación de secuencia, tal como el software BLAST disponible del servidor NCBI (wwwdotncbidotnlmdotnihdotgov/BLAST ). Sitios objetivos putativos que presentan homología significativa a otras secuencias codificantes se filtran.

Las secuencias objetivos cualificantes se seleccionan como plantilla para síntesis de ARNip. Las secuencias preferidas son aquellas que incluyen contenido bajo de G/C ya que éstas han probado ser más efectivas en mediar silenciamiento de genes en comparación con aquellas con contenido de G/C más alto que 55%. Varios sitios objetivos se seleccionan preferiblemente a lo largo de la longitud del gen objetivo o secuencia objetiva para evaluación. Para una evaluación mejor de los ARNips seleccionados, un control negativo se usa preferiblemente en conjunto. El ARNip de control negativo preferiblemente incluye la misma composición de nucleótido que los ARNip pero carece de homología significativa al genoma. Por lo tanto, una secuencia de nucleótido desorganizada del ARNip preferiblemente se usa, siempre que no despliegue ninguna homología significativa a ningún otro gen o secuencia objetivo de patógeno de la abeja.

Por ejemplo, un ARNip que se puede usar en este aspecto de la presente invención es uno que dirige un gen específico de ácaro. Los ARNip ilustrativos se proveen en SEQ ID NOs: 45-47.

SEQ ID NO: 45: attttattcaattaaagtatt SEQ ID NO: 46: atacctcaaatgtatccttca SEQ ID NO: 47: ggccaatcccgattccggcga Se apreciará que el agente de silenciamiento de ARN de la presente invención no necesita limitarse a aquellas moléculas que contenían sólo ARN, sino que además abarca nucleótidos químicamente modificados y no nucleótidos.

En algunas modalidades, el agente de silenciamiento de ARN provisto aquí puede estar funcionalmente asociado con un péptido penetrante de células. Como se usa aquí, un "péptido penetrante de células" es un péptido comprende una secuencia de aminoácidos corta (aproximadamente 12-30 residuos) o motivo funcional que confiere las propiedades de translocación independientes de energía (es decir, no endocitótica) asociada con el transporte del complejo permeable a membrana a través del plasma y/o membranas nucleares de una célula. El péptido penetrante de células usado en el complejo permeable a membrana de la presente invención preferiblemente comprende por lo menos un residuo de cisteína no funcional, que es ya sea libre o derivado para formar un enlace de disulfuro con un ácido ribonucleico de doble cadena que ha sido modificado para dicho enlace. Motivos de aminoácidos representativos que confieren dichas propiedades se listan en la patente de E.U.A No. 6,348,185, cuyo contenido se incorpora expresamente aquí por referencia. Los péptidos penetrantes de células de la presente invención preferiblemente incluyen, pero no se limitan a, penetratin, transportan, plsl, TAT(48-60), pVEC, MTS, y MAR Otro agente capaz de regular descendentemente un producto genético de ácaros Varroa es una molécula de ADNzima capaz de digerir específicamente un transcrito de ARNm o secuencia de ADN del polipéptido de patógeno de la abeja. Las ADNzimas son polinucleótidos de cadena sencilla que son capaces de digerir secuencias objetivo tanto de cadena sencilla como de doble cadena (Breaker, R.R. y Joyce, G. Chemistry and Biology 1995;2:655; Santoro, S.W. y Joyce, G.F. Proc. Nati, Acad. Sci. USA 1997;943:4262) . Se ha propuesto un modelo general (el modelo "10-23") para la ADNzima. Las ADNzimas "10-23" tienen un dominio catalítico de 15 desoxirribonucleótidos, flanqueados por dos dominios de reconocimiento de sustrato de siete a nueve desoxirribonucleótidos cada uno. Este tipo de ADNzima puede digerir efectivamente su ARN de sustrato en uniones de purina:pirimidina (Santoro, S.W. y Joyce, G.F. Proc. Nati, Acad. Sci. USA 199; para revisión de ADNzimas, véase Khachigian, LM [Curr Opin Mol Ther 4:119-21 (2002)].

La regulación descendente de productos genéticos de ácaro Varrao también se puede efectuar usando un polinucleótido antisentido capaz de hibridar específicamente con un transcrito de ARNm que codifica los productos genéticos de ácaro Varroa.

El diseño de moléculas de antisentido que se pueden usar para regular descendentemente de manera eficiente un producto genético de ácaro Varroa se debe efectuar mientras se consideran dos aspectos importantes al enfoque antisentido. El primer aspecto es el suministro del oligonucleótido al citoplasma de las células apropiadas, mientras que el segundo aspecto es un diseño de un oligonucleótido que de manera específica se une al ARNm diseñado o secuencia objetivo de ARN dentro de las células de una manera que inhibe la traducción del mismo.

La técnica anterior enseña un número de estrategias de suministro que se pueden usar para suministrar de manera eficiente los oligonucleótidos a una amplia variedad de tipos de células [véase, por ejemplo, Luft J Mol Med 76: 75-6 (1998); Kronenwett et al. Blood 91 : 852-62 (1998) ; Rajur et al. Bioconjug Chem 8: 935-40 (1997); Lavigne et al. Biochem Biophys Res Commun 237: 566-71 (1997) and Aoki et al. (1997) Biochem Biophys Res Commun 231 : 540-5 (1997)].

Además, los algoritmos para identificar aquellas secuencias con la afinidad de unión más alta predicha para su ARNm objetivo basada en un ciclo termodinámico que representa los energéticos de alteraciones estructurales tanto en el ARNm objetivo como en el oligonucleótido también están disponibles [véase, por ejemplo, Walton et al. Biotechnol Bioeng 65: 1-9 (1999) ], Dichos algoritmos se han usado exitosamente para implementar un enfoque antisentido en las células. Por ejemplo, el algoritmo desarrollado por Walton et al. permitió a los científicos diseñar exitosamente oligonucleótidos de antisentido para beta-globina de conejo (RBG) y transcritos de factor-alfa de necrosis tumoral (FNT alfa) de ratón. El mismo grupo de investigación más recientemente ha reportado que la actividad antisentido de oligonucleótidos racionalmente seleccionados contra tres ARNm abjetivos modelo (lactate deshidrogenasa A y B humana y gp130 de rata) en cultivo de células como se evaluó por una técnica de PCR cinética probó ser efectiva en casi todos los casos, incluyendo pruebas contra tres diferentes objetivos en dos tipos de células con químicas de oligonucleótido de fosfodiéster y fosforotioato.

Además, varios enfoques para diseñar y predecir la eficiencia de oligonucleótidos específicos usando un sistema in vitro también fueron publicados (Matveeva et al., Nature Bíotechnology 16: 1374 - 1375 (1998)].

Otro agente capaz de regular descendentemente un producto genético de ácaro Varroa es una molécula de ribozima capaz de digerir específicamente un transcrito de ARNm que codifica el producto genético de ácaro Varroa.

Las ribozimas se han usado cada vez más para la inhibición específica de secuencia de expresión de gen por la digestión de ARNms que codifican proteínas de interés [Welch et al., Curr Opin Biotechnol. 9:486-96 (1998)]. La posibilidad de diseñar ribozimas para digerir cualquier ARN objetivo específico, incluyendo ARN viral, los ha vuelto herramientas valiosas tanto en aplicaciones básicas como terapéuticas.

Un método adicional de regulación descendente de la expresión de un producto genético de ácaro Varroa en células es mediante oligonucleótidos formadores de triplex (TFOs). Estudios recientes han mostrado que se pueden diseñar TFO que pueden reconocer y unirse a regiones de polipurina/polipirimidina en ADN helicoidal de doble cadena de una manera específica de secuencia. Estas reglas de reconocimiento son delineadas por Maher III, L. J., et al., Science, 1989;245:725-730; Moser, H. E., et al., Science, 1987;238:645-630; Beal, P. A., et al, Science.1992,251 : 1360-1363; Cooney, M., et al., Science, 1988;241 :456-459; y Hogan, M. E., et al., EP Publicación 375408. La modificación de los oligonucleótidos, tal como la introducción de intercaladores y sustituciones de esqueleto, y la optimización de condiciones de unión (pH y concentración de cationes) han ayudado a superar obstáculos inherentes a la actividad de TFO tales como repulsión de carga e inestabilidad, y recientemente se ha mostrado que los oligonucleótidos sintéticos pueden ser dirigidos a secuencias específicas (para una revisión reciente, véase Seidman y Glazer, J Clin Invest 2003; 112:487-94).

En general, el oligonucleótido formador de triplex tiene la correspondencia de secuencia: oligo 3'-A G G T dúplex 5'-A G C T dúplex 3'-T C G A Sin embargo, se ha mostrado que los tripletes A-AT y G-GC tienen la estabilidad helicoidal triple más grande (Reither y Jeltsch, BMC Biochem, 2002, 12 de Sep. Epub). Los mismos autores han demostrado que los TFO diseñados de conformidad con la regla de A-AT y G-GC no forman triplexes no específicos, lo que indica que la formación de triplex es de hecho específica de secuencia.

Los oligonucleótidos formadores de triplex preferiblemente son por lo menos 15, muy preferiblemente 25, muy preferiblemente aún 30 o más nucleótidos de longitud, hasta 50 ó 100 pb.

La transfección de células (por ejemplo, mediante liposomas catiónicos) con TFO, y la formación de la estructura helicoidal triple con el ADN objetivo induce cambios estéricos y funcionales, bloqueando el inicio de transcripción y alargamiento, permitiendo la introducción de cambios e secuencia deseados en el ADN endógeno y dando por resultado la regulación descendente específica de expresión de gen.

La descripción detallada del diseño, síntesis y administración de TFO efectivos se pueden encontrara en las solicitudes de patente de E.U.A. Nos. 2003 017068 y 2003 0096980 de Froehler et al, y 2002 0128218 y 2002 0123476 de Emanuele et al, y patente de E.U.A. No. 5,721 ,138 de Lawn.

Los agentes de regulación descendente de polinucleotido de la presente invención se pueden generar de conformidad con cualquier método de síntesis de polinucleotido conocido en la técnica tal como síntesis enzimática o síntesis de fase sólida. El equipo y reactivos para ejecutar síntesis de fase sólida están comercialmente disponibles de, por ejemplo, Applied Biosystems. Cualquier otro medio para dicha síntesis también se puede utilizar; la síntesis real de los polinucleótidos está dentro de las capacidades de un experto en la técnica y se puede lograr mediante metodologías establecidas como se detalla, por ejemplo, en "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes l-lll Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988) y "Oligonucleótido Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984), utilizando química de fase sólida, v.gr., cianoetil fosforamidita seguida por desprotección, desalación y purificación por ejemplo, por un método de tritilo automatizado o CLAR.

Los agentes de polinucleótido de la presente invención pueden comprender nucleosidos heterocíclicos que consisten de bases de purinas y pirimidinas, unidas en un enlace de fosfodiéster de 3' a 5'.

Los agentes de polinucleótido preferiblemente usados son aquellos modificados en cualquier esqueleto, enlace de internucleósidos o bases, como se describe ampliamente más adelante.

Ejemplos específicos de agentes de polinucleótido preferidos útiles de conformidad con este aspecto de la presente invención incluyen agentes de polinucleótido que contienen esqueletos modificados o enlaces internucleósido no naturales. Los agentes de polinucleótido que tienen esqueletos modificados incluyen aquellos que retienen un átomo de fósforo en el esqueleto, como se describe en las patentes de E.U.A. Nos: 4,469,863; 4,476,301 ; 5,023,243; 5,177,196; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321 ,131 ; 5,399,676; 5,405,939; 5,453,496; 5,455,233; 5,466, 677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821 ; 5,541 ,306; 5,550,111; 5,563,253; 5,571 ,799; 5,587,361 ; y 5,625,050.

Los esqueletos de polinucleótido modificados preferidos incluyen, por ejemplo, fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos, fosfotriésteres, fosfotriésteres aminoalquílicos, metil- y otros alquil-fosfonatos incluyendo 3'-alquilen-fosfonatos y fosfonatos quiarles, fosfinatos, fosforamidatos incluyendo 3'-amino fosforamidato y aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres, y boranofosfatos que tienen enlaces 3'-5' normales, análogos 2'-5' enlazados de éstos, y aquellos que tienen polaridad invertida en donde los pares adyacentes de unidades de nucleósido están enlazados 3'-5' a 5 -3' o 2'-5' a 5'-2'. También se pueden usar varias sales, sales mixtas y formas de ácido libres.

Alternativamente, los esqueletos de polinucleótido modificados que no incluyen un átomo de fósforo en los mismos tienen esqueletos que son formados por enlaces de internucleótido de alquilo de cadena corta o cicloalquilo, heteroátomo mixto y enlaces de internucleósido de alquilo o cicloalquilo, o uno o más enlaces de internucleósido heteroaromáticos o heterocíclicos de cadena corta. Estos incluyen aquellos que tienen enlaces morfolino (formado en parte de la porción azúcar de un nucleósido); esqueletos de siloxano; esqueletos de sulfuro, sulfóxido y sulfona; esqueletos de formacetilo y tioformacetilos; esqueletos de metilenformacetilo y tioformacetilo; esqueletos que contienen alqueno;esqueletos de sulfamato; esqueletos de metilenimino y metilenhidrazino; esqueletos de sulfonato y sulfonamida; esqueletos de amida; y otros que tienen partes componentes de N, O, S y CH2 mixtas, como se describe en las patentes de E.U.A. Nos. 5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141 ; 5,235,033; 5,264,562; 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677; 5,541 ,307; 5,561 ,225; 5,596,086; 5,602,240; 5,610,289; 5,602,240; 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704; 5,623, 070; 5,663,312; 5,633,360; 5,677,437; y 5,677,439.

Otros agentes de polinucleótido que se pueden usar de conformidad con la presente invención, son aquellos modificados tanto en el enlace de azúcar como en el internucleósido, es decir, el esqueleto, de las unidades de nucleótido son reemplazadas por grupos novedosos. Las unidades de base se mantienen para complementación con el objetivo de polinucleótido apropiado. Un ejemplo para dicha mimética de polinucleótido, incluye ácido nucleico peptídico (PNA). Un polinucleótido PNA se refiere a un polinucleótido en donde el esqueleto de azúcar es reemplazado por un esqueleto que contiene amida, en particular un esqueleto de aminoetilglicina. Las bases son retenidas y se unen directamente o indirectamente a átomos de nitrógeno de aza de la porción amida del esqueleto. Las patentes de los Estados Unidos que enseñan la preparación de compuestos de PNA incluyen, pero no se limitan a, las patentes de E.U.A. Nos. 5,539,082; 5,714,331 ; y 5,719,262, cada una de las cuales se incorpora aquí por referencia. Otras modificaciones del esqueleto, que se pueden usar en la presente invención se describen en la patente de E.U.A. No.: 6,303,374.

Los agentes de polinucleótido de la presente invención también puede incluir modificaciones o sustituciones de bases. Como se usa aquí, bases "no modificadas" o "naturales" incluyen las bases de purina adenina (A) y guanina (G), y las bases de pirimidina timina (T), citosina (C) y uracilo (U). Las bases modificadas incluyen pero no se limitan a otras bases sintéticas y naturales tales como 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetil citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metil y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, derivados de 2-propilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halogenouracilo y citosina, 5-propinil uracilo y citosina, 6-azo uracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halógeno, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas y guaninas 8-sustituidas, uracilos y citosinas 5-halógeno-sustituidos, particularmente 5-bromo, 5-trifluorometil-sustiituidos y otros uracilos y citosinas 5-sustituidos , 7-metilguanina y 7-metíladenina, 8-azaguanina y 8-azaadenin, 7-deazaguanina y 7-deazaadenina y 3-deazaguanina y 3-deazaadenina. Bases adicionales incluyen aquellas descritas en la patente de E.U.A. No.: 3,687,808, aquellas descritas en The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, páginas 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990, aquellas descritas por Englisch et al., Angewandte Chemie, edición internacional, 1991 , 30, 613, y aquellas descritas por Sanghvi, Y. S., capítulo 15, Antisense Research and Applications, páginas 289-302, Crooke, S. T. y Lebleu, B. , ed., CRC Press, 1993. Dichas bases son particularmente útiles para incrementar la afinidad de unión de los compuestos oligoméricos de la invención. Estas incluyen pirimidinas 5-sustitutidas, 6-azapirimidinas y purinas N-2, N-6 y 0-6 sustituidas, incluyendo 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina. Se ha mostrado que las sustituciones de 5-metilcitosina incrementan la estabilidad de dúplex de ácido nucleico por 0.6-1.2°C. [Sanghvi YS et al. (1993) Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Ratón 276-278] y son sustituciones de bases actualmente preferidas, muy particularmente aún cuando se combinan con modificaciones de azúcar 2'-0-metoxietílico.

Después de la síntesis, los agentes de polinucleótido de la presente invención pueden ser opcionalmente purificados, por ejemplo, los polinucleótidos pueden ser purificados de una mezcla de extracción con un solvente o resina, precipitación, electroforesis, cromatografía, o una combinación de los mismos. Alternativamente, los polinucleótidos pueden ser sin , o un mínimo de, purificación para evitar pérdidas debido a procesamiento de muestreo. Los polinucleótidos se pueden secar para almacenarse o disolverse en una solución acuosa. La solución puede contener reguladores de pH o sales para promover alineación y/o estabilización de las cadenas dúplex.

Se apreciará que un agente de polinucleótido de la presente invención se puede proveer como tal, o como un constructo de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el agente de polinucleótido.

En general, el constructo de ácido nucleico comprende una secuencia promotora que es funcional en la célula hospedera, como se detalla más adelante.

Las secuencias de polinucleótido de la presente invención, bajo el control de una secuencia promotora operablemente enlazada, además puede ser flanqueada por secuencias adicionales que afectan ventajosamente su transcripción y/o la estabilidad de un transcrito resultante. Dichas secuencias generalmente están localizadas hacia el extremo 5' del promotor y/o hacia el extremo 3' del constructo de expresión.

El término "operablemente enlazado", como se usa con referencia a la secuencia reguladora y una secuencia de nucleótido estructural, significa que la secuencia reguladora causa expresión regulada de la secuencia de nucleótido estructural enlazada. "Secuencias reguladoras" o "elementos de control" se refieren a secuencias de nucleótido localizadas hacia el extremo 5', dentro de, o hacia el extremo 3' de una secuencia de nucleótido estructural, y que influyen en el tiempo y nivel o cantidad de transcripción, procesamiento o estabilidad de ARN, o traducción de la secuencia de nucleótido estructural asociada. Las secuencias reguladoras pueden incluir promotores, secuencias líderes de traducción, intrones, incrementadores, estructuras de vástago-bucle, secuencias de unión a represor, secuencias de terminación, secuencias de pausa, secuencias de reconocimiento de poliadenilación, y similares.

Se apreciará que los agentes de ácido nucleico pueden ser suministrados a ácaros Varroa en una gran variedad de formas.

De conformidad con una modalidad, los agentes de ácido nucleico se suministran directamente a los ácaros (v.gr., rociando una colmena infestada). Los agentes de ácido nucleico, o constructos que codifican los mismos pueden entrar a los cuerpos de los ácaros por difusión. En esta modalidad, el promotor del constructo de ácido nucleico es generalmente operacional en células de ácaro.

Se apreciará que dado que los ácaros Varroa usan sus bocas para perforar el exoesqueleto de la abeja y alimentarse de la hemolinfa de la abeja, la presente invención contempla el suministro de agentes de polinucleótido de la presente invención a las abejas, por lo que están presentes en la hemolinfa de la abeja quedando disponible para los ácaros. Por lo tanto, de conformidad con otra modalidad, los agentes de ácido nucleico se suministran indirectamente a los ácaros (v.gr., por medio de la abeja). En esta modalidad, el promotor del constructo de ácido nucleico es generalmente operacional en las células de las abejas.

De conformidad con una modalidad, los agentes de ácido nucleico se suministran a las abejas por aspersión. Los agentes de ácido nucleico, o constructos que codifican los mismos pueden entrar a los cuerpos de las abejas por difusión.

De conformidad con otra modalidad, los agentes de ácido nucleico se suministran a las abejas mediante su alimento. Los inventores de la presente consideran que después de la ingestión de los agentes de ácido nucleico de la presente invención, los agentes estarán presentes en la hemolinfa de la abeja, por lo que se vuelven disponibles para los ácaros Varroa.

Por lo tanto, los polinucleótidos de la presente invención pueden ser sintetizados in vitro y añadidos al alimento. Por ejemplo, el ARN de doble cadena puede ser sintetizado al añadir dos promotores opuestos (v.gr, promotores T7; SEQ ID NOs: 48 y 49) a los extremos de los segmentos de gen, en donde SEQ ID NO: 48 se coloca inmediatamente 5' al gen y SEQ ID NO: 49 se coloca inmediatamente 3' al segmento de gen. El ARNdc entonces puede ser transcrito in vitro con la ARN polimerasa de T7.

Las secuencias ilustrativas para sintetizar ARNdc de conformidad con modalidades de la presente invención se proveen en SEQ ID NOs: 50-93.

Como se detalla aquí, la alimentación de la abeja es práctica común entre los apicultores, para proveer tanto necesidades nutricionales como otras, por ejemplo, complementarias. Las abejas generalmente se alimentan de miel y polen, pero se han sabido que ingieren alimentos no naturales también. Las abejas se pueden alimentar de varios alimentos incluyendo, pero sin limitarse a Wheast (una levadura láctea que crecer en queso cottage), harina de soya, levadura (v.gr, levadura de cerveza, levadura torula) y productos de levadura, se pueden alimentar de productos individualmente o en combinación y alimentarse de harina de soya como una mezcla seca o una torta húmeda dentro de la colmena o como una mezcla seca en alimentadores abiertos fuera de la colmena. También es útil el azúcar, o un jarabe de azúcar. La adición de 10 a 12 por ciento de polen a un alimento complementario para abejas mejora la palatabilidad. La adición de 25 a 30 por ciento de polen mejora la calidad y cantidad de nutrientes esenciales que son requeridos por las abejas para actividad vital.

El azúcar de caña o el azúcar de remolacha, jarabe de maíz isomerizado, y jarabe de azúcar de tipo 50 son sustituyentes satisfactorios para miel en la dieta natural de las abejas mielíferas. Los últimos dos se pueden suministrar sólo como un líquido a las abejas.

El alimento líquido se puede suministrar a las abejas dentro de la colmena, por ejemplo, por cualquiera de los siguientes métodos: cubo superior de fricción, panales dentro de la cámara de reproducción, alimentador con tabla de división, alimentación por frasco invertido, etc. El azúcar seco se puede alimentar colocando 0.454 g o 908 g sobre la cubierta interna invertida. Un suministro de agua debe estar disponible a las abejas todo el tiempo. En una modalidad, se contemplan bandeja o charolas en las cuales están presentes soportes flotantes-tales como viruta de madera, corcho o esponja de plástico-están presentes. Descripciones detalladas de alimentos complementarios para las abejas se pueden encontrar, por ejemplo, en la publicación de la USDA por Standifer, et al 1977, entitled "Suppleméntal Feeding of Honey Bee Colonies" (USDA, Boletín de Información de Agricultura No. 413).

Se apreciará que los ácaros Varro causan sitios de heridas en el exoesqueleto de las abejas. Dichos sitios de herida portan infecciones bacterianas, tales como Melissococcus pluton, que causa el loque europeo. Además de sus efectos parasitarios, se sospecha que los ácaros Varroa actúan como vectores para un número de patógenos de las abejas mielíferas, incluyendo virus de deformación de las alas (DWV), virus de las abejas de Cachemira (KBV), virus de la parálisis aguda de las abejas (ABPV) y virus de celdas negras de la reina (BQCV), y pueden debilitar los sistemas inmunológicos de sus hospederos, dejándolos vulnerables a infecciones.

Por lo tanto, al matar a los ácaros (o al evitar la reproducción de los mismos), los agentes de la presente invención se pueden usar para prevenir y/o tratar infecciones bacterianas tales como Melissococcus pluton e infecciones virales causadas por los virus anteriormente nombrados.

Puesto que se piensa que la infestación de ácaros Varroa e infecciones virales son responsables de trastorno de colapso de colonia (CCD), los agentes de la presente también se pueden usar para prevenir o reducir la susceptibilidad de una colonia de abejas a CCD.

Se apreciará que, además de la alimentación de oligonucleótidos y/o polinucleótidos para la reducción de la infección e infestación de patógenos de las abejas, la aplicación de desinfección apropiada (por ejemplo, abstenerse de reutilizar colmenas infestadas) puede incrementar la efectividad del tratamiento y prevención de infecciones.

Se espera que durante la vida de una patente que madura a partir de esta solicitud, muchos métodos para regular descendentemente la expresión de productos genéticos se desarrollen y se pretende que el alcance del término "regulación descendente de la expresión de un producto genético de un ácaro Varroa destructor" incluya todas esas nuevas tecnologías a priori.

Como se usa aquí el término "aproximadamente" se refiere a + 10%.

Los términos "comprende", "que comprende", "incluye", "que incluye", "que tiene" y sus conjugados significan "que incluye pero no se limita a". Este término abarca los términos "que consiste de" y "que consiste esencialmente de".

La frase "que consiste esencialmente de" significa que la composición o método puede incluir ingredientes y/o pasos adicionales, pero sólo si los ingredientes y/o pasos adicionales no alteran materialmente las características básicas y novedosas de la composición o método reivindicado.

Como se usa aquí, la forma singular "un", "una", "el" y "la" incluyen referencias plurales a menos que el contexto determine claramente otra cosa. Por ejemplo, el término "un compuesto" o "por lo menos un compuesto"puede incluir una pluralidad de compuestos, incluyendo mezclas de los mismos.

Como se usa aquí, el término "método" se refiere a maneras, medios, técnicas y procedimientos para lograr una tarea dada incluyendo, pero sin limitarse a, aquellas maneras, medios, técnicas y procedimientos ya sea conocidos por, o fácilmente desarrollados a partir de manera, medios, técnicas y procedimientos conocidos por quienes trabajan en las técnicas química, farmacología, biológica, bioquímica y médica.

Como se usa aquí, el término "tratamiento" incluye anular, sustancialmente inhibir, desacelerar o revertir la progresión de una condición, sustancialmente mitigar los síntomas clínicos o estéticos de una condición o sustancialmente prevenir la aparición de síntomas clínicos o estéticos de una condición.

Se aprecia que ciertas características de la invención, que, para fines de claridad, se describen en el contexto de modalidades separadas, también se pueden proveer en combinación en una sola modalidad. Por el contrario, varias características de la invención, que, para fines de brevedad, se describen en el contexto de una sola modalidad, también se pueden proveer por separado o en cualquier sub-combinación adecuada o según sea adecuado en cualquier otra modalidad descrita de la invención. Ciertas características descritas en el contexto de varias modalidades no han de ser consideradas características esenciales de estas modalidades, a menos que la modalidad sea inoperante sin esos elementos.

Varias modalidades y aspectos de la presente invención, como se delineó anteriormente y como se reivindica en la sección de reivindicaciones más adelante encuentran soporte experimental en los siguientes ejemplos.

EJEMPLOS Ahora se hará referencia a los siguientes ejemplos, que junto con las descripciones anteriores ilustran algunas modalidades de la invención de una manera no limitante.

Generalmente, la nomenclatura usada aquí y los procedimientos de laboratorio utilizados en la presente invención incluyen técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas y de ADN recombinante. Dichas técnicas se explican uniformemente en la literatura. Véase, por ejemplo, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volúmenes l-lll Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); metodologías como se expone en las patentes de E.U.A. Nos. 4,666,828; 4,683,202; 4,801 ,531 ; 5,192,659 and 5,272,057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volúmenes l-lll Cellis, J. E., ed. (1994); "Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique" de Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), tercera edición; "Current Protocols in Immunology" Volúmenes l-lll Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8a edición), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980); los inmunoensayos disponibles se describen de manera extensa en la literatura de patentes y científica, véase, por ejemplo, patentes de E.U.A. Nos. 3,791 ,932; 3,839, 153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901 ,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011 ,771 and 5,281 ,521 ; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., y Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., y Higgins S. J., eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) y "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996); todas las cuales se incorporan por referencia como si se expusieran en su totalidad. Otras referencias generales se proveen a lo largo de este documento. Se cree que los procedimientos en las mismas son bien conocidos en la técnica y se proveen para conveniencia del lector. Toda la información contenida en los mismos se incorpora aquí por referencia.

EJEMPLO 1 La alimentación de ARNdc específico de Varroa impide la infestación de ácaros Varroa A fin de determinar la efectividad de ARNdc ingerido en la infestación de ácaros Varroa, las abejas mielíferas se proveen de ARNdc específico de Varroa y de control en el alimento durante 7 días antes, y 2 días después del contacto con los ácaros Varroa, como se ilustra en la figura 1. Los números de Varroa muertos por colmena experimental se cuentan, y los Varroa vivos y muertos de la muestra son recolectados por análisis molecular.

Materiales y métodos Establecimiento de colonias de mini-colmena: Abejas reinas jóvenes de aproximadamente 2 meses de edad, junto con aproximadamente 200 abejas obreras se recolectan de las colmenas en un colmenar local. Las abejas son transferidas en mini-colmenas equipadas con un mini-panal que fue previamente construido por una colmena regular. Todas las mini-colmenas se cierran y se colocan en un cuarto con temperatura controlada (30°C).

Preparación de ARNdc: Secuencias de ácaros Varroa se clonan en un plásmido entre dos promotores T7 opuestos. Después de la propagación de ADN del plásmido, los fragmentos virales, incluyendo los promotores T7, son cortados y purificados en gel. Éstos sirven como plantillas para transcripción in vitro dirigida por T7 (MEGAscriptTM, Ambion, Austin TX). El producto de reacción es sometido a digestión por ADNasa seguido por fenol extracción y precipitación con etanol. La preparación final se disuelve en agua libre de nucleasa.

La alimentación de ARNdc en mini-colmenas: Discos de complemento de polen de 5 gr se colocan en la parte superior de cada panal y 10 mi de 50% de solución de sacarosa se introduce en la colmena en una caja de Petri estéril en la noche. La alimentación se continúa durante 9 días y subsiguientemente sólo las colmenas en las cuales las reinas habían empezado a poner huevos son incluidas en el ensayo.

Después del establecimiento de colmenas activas (reinas que ponen huevos), algunas de las mini-colmenas son complementadas con gen específico de ácaros Varroa (inhibidor de apoptosis (IAP) (SEQ ID NO: 27) o control no específico (v.gr., GFP SEQ ID NO: 91) ARNdc, que se añade a los 1 0 mi de solución de azúcar al 50% dada a las colmenas, se ajusta a aproximadamente 1 microgramo de ARNdc por alimento por abeja, suponiendo que todas las abejas consumen aproximadamente la misma cantidad de solución de sacarosa. La alimentación de ARNdc se continúa durante seis días.

Infestación de ácaros Varroa en mini-colmenas: 7 días después de la alimentación en colmenas activas, algunas de las colonias se colocan en contacto con una población de ácaros Varroa. Por lo tanto, el tratamiento con ARNdc se continúa por 2 días más. Muestras de abejas vivas y muertas (larvas y adultos) son recolectadas diariamente de cada mini-colmena después de la introducción de la población de ácaros Varroa durante 32 días consecutivos. Cada abeja recolectada es congelada en nitrógeno líquido y conservada a -70 °C con análisis molecular pendiente. La vitalidad de las colonias es monitoreada al abrir las colmenas (sin humo), abriendo el mini-panal y fotografiando el mini-panal de ambos lados. Los panales de colmena son fotografiados diariamente, y los números de abejas vivas restantes son monitoreados. Las fotografías son descargadas en una computadora y el número total de abejas se cuenta para cada mini-colmena.

Para probar toxicidad de ARNdc, otro grupo de colmenas se proveen de ARNdc específicos de ácaros Varroa, pero no se pone en contacto con la población de ácaros Varroa. Dos conjuntos de colmenas sirven como controles adicionales: colmenas que no son tratadas con ARNdc y no son inoculadas con ácaros Varroa, y colmenas que no fueron tratadas con ARNdc, pero fueron inoculadas con ácaros Varroa.

Análisis de RT-PCR: Extracción de ácidos nucleicos: El ARN total es extraído de las abejas conservadas usando el método TRIREAGENT (Sigma, St. Louis MO, E.U.A.). En resumen, el ARN es extraído por precipitación y separación por centrifugación, después resuspendido en solución RNAsecure.

RT-PCR en tiempo real: Cantidades medidas de ARN (100 ng para análisis de expresión viral y 100 pg para 18S de controles internos de ARNr) son sometidos a RT-PCR de un paso usando la mezcla maestra SYBR Green PCR con transcriptasa inversa Taqman (Applied Biosystems, Foster City, CA). La RT-PCR en tiempo real es conducida en GeneAmp PCR System 5700 (Applied Biosystems). Las reacciones realizadas sin transcriptasa inversa o sin plantilla no deben producir ningún producto.

Análisis de Northern-Blot: El ARN total se extrae de abejas tratadas y de control. El formaldehído se añade al ARN a 1.8% y se calienta a 65 °C. El ARN, 15 pg por franja se somete a electroforesis en un gel de agarosa al 1 .2% a 70 V, 4 °C con agitación. El producto de ARN de ácaros Varroa amplificado previamente descrito es marcado con digoxigenina y sirve como una sonda para hibridación. La detección se realiza con el kit de detección luminiscente DIG (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania). Los tamaños del ARN se estiman comparando con los marcadores de peso molecular I del ARN sometido a electroforesis (Roche). La hibridación se lleva a cabo a alta astringencia (0.1x SSC; 65°C).

El destino del ARNdc específico de ácaros Varroa ingerido en abejas mielíferas: Para entender mejor el mecanismo(s) de acción por el cual los ácaros Varroa con ARNdc protegen a las abejas contra infestación de ácaros Varroa y sus consecuencias, el ARN total se extrae de abejas tratadas con ácaros Varroa y no tratadas, sometidas a digestión por un panel de nucleasas, y separadas en PAGE.

Resultados La presencia de ARNdc en el cuerpo de abejas adultas, en las larvas de abejas (alimentadas por abejas adultas), en las pupas de abejas se determinó por hibridación de transferencia por ranura con una sonda para GFP. El procesamiento del ARNdc a ARNip se determinó por Northern blots que detectan ARN pequeños (figuras 2A-2E).

Los individuos de Varroa se colocan en abejas adultas que han sido alimentadas por 7 días con ARNdc-GFP y en abejas de control (no alimentadas). El ARN se extrajo de Varroa en los tiempos indicados (figura 1) y se sometió a RT-PCR con iniciadores de GFP. Los resultados se ilustran en la figura 3.

Las abejas fueron alimentadas con un segmento de ARNdc para gen de inhibidor de apoptosis (IAP) (SEQ ID NO: 27). Varroa recolectado de esa colmena fueron analizados por RT-PCR para la expresión del gen IAP (figura 4).

EJEMPLO 2 Materiales y métodos Las colmenas fueron alimentadas por dos mezclas diferentes de ARNdcs correspondientes a segmentos de gen de Varroa. Todos los ARNdc fueron correspondientes a segmentos de gen que no son homólogos a secuencias de abejas o humanas (no portan tramos de secuencias homologa más largos de 19 bases). La mezcla I (tratamiento mínimo) contenía SEQ ID NOs: 1 , 13, 27, 30 y 39. La mezcla II (tratamiento máximo) contenía SEQ ID NOs: 1 , 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 27, 30, 33, 36 y 39. Treinta individuos de Varroa ase colocaron en cada colmena y dos meses más tarde Varroa y las abejas se contaron en cada colmena. Cada tratamiento se repitió 3 veces.

Resultados No se observó daño visible a la resistencia de la colmena entre las diversas colmenas. La figura 5 demuestra la reducción de la población de Varroa después del tratamiento con ARNdc de secuencias de gen de Varroa.

EJEMPLO 3 Ensayos de campo a gran escala de ARNdc específico de Varroa para la prevención de enfermedad asociada con ácaros Varroa de abejas mielíferas Para determinar la efectividad de ARNdc de ácaros Varroa ingerido sobre la infestación de ácaros Varroa bajo condiciones de campo reales, y para evaluar los efectos sobre parámetros importantes de la salud de la colonia, las abejas en colmenas de tamaño completo de la muestra se proveen de ARNdc específico de ácaros Varroa en el alimento durante 5 días antes, y 4 días después de la infestación con ácaros Varroa.

Materiales y métodos Material de insectos: Acervos de cinco abejas de los siguientes tratamientos; control remoto, ARNdc de ácaros Varroa únicamente, ácaros Varroa únicamente y ARNdc específico de ácaros Varroa + ácaros Varroa en cada punto de tiempo, día 0-(día de la aplicación del virus), día 7 y punto final (día 42). La prueba se repitió varias veces.

Extracción de ARN: El ARN se extrajo usando Tri-Reagent (Sigma, E.U.A.) de conformidad con el protocolo provisto por el fabricante. Todas las muestras se trataron con ADNasa I y se resuspendieron con regulador de pH de carga (90% de Formamida, 0.05 de azul de Bromofenol, 0.05% de Xileno cianol) antes de cargar en el gel.

Electroforesis en gel y transferencia: 10 ug de ARN recién preparado se mide usando el espectrofotómetro de nanogota y cargando en gel de acrilamida al 12% (relación de 1 :19 de acrilamida:Bis acrilamida) en ambiente de desnaturalización (el gel contiene 7M de Urea). Después de la electroforesis, las muestras son transferidas a membrana de nylon positivamente cargada (Roch, E.U.A.) usando el método de electrotransferencia.

Hibridación y detección de señal: La membrana es hibridada con sonda de ADN recién preparada de segmento de ácaros Varroa, tomada de una región que no corresponde al ARNdc del ARNdc específico de ácaros Varroa. Esto se hizo usando el kit de preparación de sonda de PCR DIG (Roch, E.U.A.) a 42°C en solución de DIG easyhyb (Roch, E.U.A.) de conformidad con el protocolo del fabricante. La membrana se lava dos veces con 2 X SSC/0.1 % SDS, después se lava para astringencia con 0.1 X SSC/0.1 % SDS en 65 °C. Las membranas después se lavan usando kit de lavado y bloque DIG (Roch, E.U.A.) de conformidad con el protocolo del fabricante. La detección se realiza usando sustrato CSPD-star (Roch, E.U.A.). El control positivo es 21 nt cebadores de ADN correspondientes a la secuencia hibridada.

La señal es detectada usando exposición de membrana durante 2-12 horas en quimioluminador fabricado por Kodak.

Los parámetros básicos de la salud de las colonias de abejas (números de progenie cubierta, números de abejas en la colmena, forrajeras que regresan y producción de miel) se evalúan en colmenas alimentadas con ARNdc de ácaros Varroa alimentados y colmenas de control, en ausencia de infestación de ácaros Varroa.

Aunque la invención se ha escrito junto con modalidades específicas de la misma, es evidente que muchas alternativas, modificaciones y variaciones serán evidentes para los expertos en la técnica. Por consiguiente, se pretende abarcar todas esas alternativas, modificaciones y variaciones que caen dentro de la esencia y amplio alcance de las reivindicaciones anexas.

Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente mencionadas en esta especificación son incorporadas aquí en su totalidad por referencia en la especificación, al mismo grado como si cada publicación, patente o solicitud de patente individual fuera específicamente e individualmente indicada para ser incorporada aquí por referencia. Además, la cita o identificación de cualquier referencia en esta solicitud no debe considerarse como una admisión de que dicha referencia está disponible como técnica anterior a la presente invención. En la medida que se usen los encabezados de sección, no deben considerarse necesariamente como limitantes.

Claims (20)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1 - Un agente de ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico que regula descendentemente la expresión de un ARNm de un ácaro Varroa destructor, en donde dicho ARNm codifica un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de subunidad A de ATPasa, ARN polimerasa I, ARN polimerasa III, inhibidor de apoptosis (IAP), inhibidor apoptótico de FAS y a-Tubulina.

2. - El agente de ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicha secuencia de ácido nucleico es complementaria a por lo menos 21 nucleótidos de ARNm específico de ácaro Varroa destructor capaz de inducir degradación de dicho ARNm de ácaro Varroa destructor.

3. - El agente de ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el agente se selecciona del grupo que consiste de un ARNdc, un ARN antisentido y una ribozima.

4. - Un constructo de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el agente de ácido nucleico aislado de cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

5. - Una composición ingerible por abejas que comprende el agente de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 -3.

6. - La composición ingerible por abejas de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque comprende por lo menos un agente de ácido nucleico que tiene una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 1 , 4, 6, 7, 10, 13, 16, 18, 19, 22, 23, 25, 27, 30, 31 , 33, 38, 39, 41 , 51 y 76.

7. - La composición ingerible por abejas de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque comprende por lo menos cada uno de los agentes de ácido nucleico que tienen una secuencia de ácido nucleico como se expone en las SEQ ID NOs: 1 , 13, 27, 30 y 39.

8. - La composición ingerible por abejas de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque por lo menos seis agentes de ácido nucleico seleccionados del grupo de secuencias de ácido nucleico que tienen una secuencia de nucleótidos que consiste de las SEQ ID NOs: 1 , 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 27, 30, 33, 36 y 39.

9. - La composición ingerible por abejas de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque dicha composición está en forma sólida o forma líquida.

10.- La composición ingerible por abejas de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque dicha composición comprende proteína.

11. - La composición ingerible por abejas de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque dicha proteína está en forma de polen y/o discos de soya.

12. - La composición ingerible por abejas de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque dicha composición está en forma líquida y además comprende un complemento de carbohidrato o azúcar.

13. - Un agente de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que regula descendentemente la expresión de un producto de gen de un ácaro Varroa destructor para usarse en la prevención o tratamiento de una infestación de ácaro Varroa destructor de una colmena de abejas.

14. - El agente de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque la prevención o tratamiento de dicha infestación de Varroa comprende reducir la susceptibilidad de las abejas mielíferas de dicha colmena de abejas al trastorno de colapso de la colonia.

15. - El agente de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 13 ó 14, caracterizado además porque dicho agente de ácido nucleico es el agente de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 -3.

16. - El agente de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13-15, caracterizado además porque es formulado en una composición ingerible por abejas.

17.- El agente de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque dicha composición ingerible por abejas es la composición ingerible por abejas de cualquiera de las reivindicaciones 5-12.

18 - El uso de un agente de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que regula descendentemente la expresión de un producto de gen de un ácaro Varroa destructor, para preparar una composición ingerible por abejas de cualquiera de las reivindicaciones 5-12 para prevenir o evitar una infestación de un ácaro Varroa destructor de una colmena de abejas.

19.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 18, en donde prevenir o tratar dicha infestación de Varroa comprende reducir la susceptibilidad de las abejas mielíferas de dicha colmena de abejas al trastorno de colapso de la colonia.

20.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 18 o 19, en donde dicho agente de ácido nucleico es el agente de ácido nucleico para cualquiera de las reivindicaciones 1-3.