CN102906263A - 用于控制蜂中的瓦螨的组合物 - Google Patents
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Abstract
本文公开了一种分离的核酸剂,所述核酸剂包含减量调节狄斯瓦螨基因产物的表达的核酸序列。本文亦公开了包含所述核酸剂的组合物及其用途。
Description
发明领域和背景
本发明涉及用于控制蜂中的瓦螨(Varroa mite)侵染的组合物。
蜜蜂,即意大利蜜蜂(Apis mellifera)为农作物的有效授粉所必需,因此对世界农业而言为关键性的。蜜蜂亦产生经济上重要的产物,包括蜂蜜和蜂蜡。蜜蜂易感染许多寄生虫和病原体,包括外寄生螨、狄斯瓦螨(Varroa destructor)。
蜜蜂的蜂群崩溃失调病(Colony Collapse Disorder,CCD)对摧毁美国和世界农业造成威胁。实际上,2006-2007年冬天在美国最近爆发的CCD中,估计240万蜜蜂蜂巢的25%或更多因为CCD而消失。估计23%的美国养蜂运作在2006-2007年冬天受CCD所累,影响了平均45%的养蜂人运作。在2007-2008年冬天,USDA-ARS的CCD行动小组估计,总计来自商业运作的全部蜂巢的36%被CCD破坏。
CCD通过自一群其成年蜂群体的迅速消失来表征,通常在距蜂群一定距离处发现死亡的成年蜂。在崩溃末期,蜂王仅由少量新形成的成年蜂照料。崩溃的蜂群常常具有大量封盖的幼蜂和食物储备。CCD现象首先在2006年报道;然而,养蜂人早在2004年就注意到与CCD一致的独特的蜂群衰退。已假定多种因素作为原因,所述因素为例如螨和传染剂、天气模式、电磁(蜂窝天线)辐射、杀虫剂、营养不良和应激。迄今为止,CCD的控制已集中在瓦螨控制、环境卫生和移除受影响的蜂巢,针对机会性感染(例如小孢子虫(Nosema))进行处理和改善营养。至今仍未开发有效的预防措施。
瓦螨寄生于蛹和成年蜂中并且在蛹的抚幼室中繁殖。螨使用它们的嘴刺穿外骨骼并且以蜂的血淋巴为食。这些外骨骼中的伤口部位隐匿细菌感染,例如蜂房球菌(Melissococcus pluton),其导致欧洲幼虫腐臭病(European foulbrood)。此外,因为它们的寄生作用,怀疑瓦螨充当许多蜜蜂病原体的载体,所述病原体包括羽翼畸形病毒(DWV)、克什米尔蜜蜂病毒(KBV)、蜜蜂急性麻痹病毒(ABPV)和黑蜂王台病毒(BQCV),并且瓦螨可减弱其宿主的免疫系统,使得它们易受感染的攻击。如果不加以治疗,瓦螨侵染典型地导致群体水平的死亡率。
治疗瓦螨侵染的现行方法被证明无效,因为螨形成对现有杀螨剂的抗性。此外,使用这类杀螨剂可能将有害的化学品引入旨在用于人消费的蜂蜜中。
美国专利申请20090118214教导了dsRNA用于预防和治疗蜜蜂中的病毒感染中的用途。
发明概述
本发明某些实施方案的一个方面提供了一种分离的核酸剂,所述核酸剂包含减量调节狄斯瓦螨基因产物的表达的核酸序列。
本发明某些实施方案的一个方面提供了一种核酸构建体,所述核酸构建体包含编码本发明的分离的核酸剂的核酸序列。
本发明某些实施方案的一个方面提供了一种蜂可摄取的组合物,所述组合物包含至少一种核酸剂,所述核酸剂包含减量调节狄斯瓦螨基因产物的表达的核酸序列。
本发明某些实施方案的一个方面提供了预防或治疗蜂巢的狄斯瓦螨侵染的方法,所述方法包括给蜂施用有效量的至少一种包含减量调节狄斯瓦螨基因产物的表达的核酸序列的核酸剂,从而预防或治疗蜂巢的狄斯瓦螨侵染。
本发明某些实施方案的一个方面提供了预防或治疗蜂巢的狄斯瓦螨侵染的方法,所述方法包括给蜂施用有效量的本发明的核酸构建体,从而预防或治疗蜂巢的狄斯瓦螨侵染。
本发明某些实施方案的一个方面提供了降低蜜蜂对蜂群崩溃失调病(CCD)的易感性的方法,所述方法包括给蜜蜂施用有效量的至少一种双链核糖核酸(dsRNA),所述至少一种dsRNA包含与狄斯瓦螨mRNA的至少21个核苷酸互补且能够诱导狄斯瓦螨特异性mRNA降解的序列。
根据本发明的某些实施方案,所述核酸序列与狄斯瓦螨特异性RNA的至少21个核苷酸互补且能够诱导狄斯瓦螨RNA降解。
根据本发明的某些实施方案,所述核酸剂选自dsRNA、反义RNA和核酶。
根据本发明的某些实施方案,dsRNA选自siRNA、shRNA和miRNA。
根据本发明的某些实施方案,所述基因产物为编码选自以下的多肽的mRNA:ATP酶亚基A、RNA聚合酶I、RNA聚合酶III、凋亡抑制剂(IAP)、FAS凋亡抑制剂和α-微管蛋白。
根据本发明的某些实施方案,所述至少一种核酸剂包含至少五种核酸剂,用于减量调节ATP酶亚基A、RNA聚合酶III、凋亡抑制剂(IAP)、FAS凋亡抑制剂和α-微管蛋白,所述至少五种核酸剂的每一种都靶定不同的基因。
根据本发明的某些实施方案,所述至少一种核酸剂包含至少六种核酸剂,用于减量调节ATP酶亚基A、RNA聚合酶I、RNA聚合酶III、凋亡抑制剂(IAP)、FAS凋亡抑制剂和α-微管蛋白,所述至少六种核酸剂的每一种都用于靶定不同的基因。
根据本发明的某些实施方案,所述核酸剂如SEQ ID No: 1、13、27、30和39所述。
根据本发明的某些实施方案,所述核酸剂如SEQ ID No: 1、4、7、10、13、16、19、22、25、27、30、33、36和39所述。
根据本发明的某些实施方案,所述核酸序列长度大于15个碱基对。
根据本发明的某些实施方案,所述核酸序列长度为19-25个碱基对。
根据本发明的某些实施方案,所述核酸序列长度大于30个碱基对。
根据本发明的某些实施方案,所述组合物呈固体形式。
根据本发明的某些实施方案,所述组合物呈液体形式。
根据本发明的某些实施方案,所述组合物包含蛋白质。
根据本发明的某些实施方案,所述蛋白质呈花粉和/或大豆饼的形式。
根据本发明的某些实施方案,所述液体为蔗糖溶液。
根据本发明的某些实施方案,所述液体为玉米糖浆溶液。
根据本发明的某些实施方案,所述液体进一步包含碳水化合物或糖补充剂。
根据本发明的某些实施方案,所述蜂为蜜蜂。
根据本发明的某些实施方案,所述蜜蜂为采集蜂。
根据本发明的某些实施方案,所述蜜蜂为蜂巢蜂(hive bee)。
根据本发明的某些实施方案,所述蜜蜂为蜂群的蜂,且其中所述施用降低蜂群体对蜂群崩溃失调病的易感性。
根据本发明的某些实施方案,所述施用通过饲喂来实现。
根据本发明的某些实施方案,所述饲喂包括提供液体的蜂可摄取的组合物。
根据本发明的某些实施方案,所述饲喂包括提供固体的蜂可摄取的组合物。
根据本发明的某些实施方案,狄斯瓦螨mRNA编码选自以下的多肽:NADH脱氢酶亚基2、ATP合成酶亚基8、ATP合成酶亚基6、钠通道和细胞色素氧化酶亚基I。
除非另有定义,否则本文所用的所有技术和/或科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的意义。虽然与本文所述方法和材料类似或等同的方法和材料可用于实践或测试本发明的实施方案,但示例性的方法和/或材料描述于下文。在冲突的情况下,以本专利说明书(包括定义)为准。此外,所述材料、方法和实施例仅为说明性的而不意图其为必要限制。
附图简述
仅作为实例参考附图在此描述本发明的某些实施方案。现在详细地具体参考附图,强调的是,所示细节是作为实例并且以阐述性地讨论本发明的实施方案为目的。在这点上,带有附图的描述使得本发明的实施方案可如何实施对本领域技术人员显而易见。
在附图中:
图1为用于dsRNA转入瓦螨的各种实验的时程的示意图。
图2A-E为狭线印迹分析(Slot blot analysis)已摄取的蜂(图2A)、通过成年蜂喂养的幼虫(图2B)、蛹(图2C)和新形成蜂(图2D)中dsRNA-GFP存在情况的结果的照片。dsRNA-GFP和来源于其的siRNA的存在情况通过RNA印迹来分析(图2E)。D=给蜂巢施用dsRNA-GFP之后的天数。
图3为举例说明在顶行所示的天数(时间如图1所示)从瓦螨提取的RNA的RT-PCR分析结果的照片。绿色数字(顶行)表示已将其放置在已摄取dsRNA-GFP的蜂上的瓦螨个体,而黑色数字表示来自放置在对照蜂上的瓦螨的RNA。+ =阳性对照(携带GFP的质粒)。
图4为举例说明使用针对凋亡抑制剂蛋白(IAP;序列27)的引物的瓦螨RNA的RT-PCR的照片。M:大小标记。泳道1-3:来自用序列27的dsRNA处理的蜂巢的瓦螨的模板RNA。泳道4:来自对照蜂巢的瓦螨的模板RNA。泳道5:阳性对照(携带IAP的质粒)。泳道6:阴性对照(无模板)。
图5为举例说明在对照蜂巢中以及在用dsRNA混合物I (最小)和用dsRNA混合物II (最大)处理的蜂巢中每只蜂(成年蜂加上封盖房内的幼虫)的瓦螨计数的条形图。
发明实施方案描述
本发明在其某些实施方案中,涉及用于降低蜂对于瓦螨侵染的易感性的方法和组合物。
在详细解释本发明的至少一个实施方案之前,要理解的是,本发明不必限于其在以下描述中所述或通过实施例所例示的细节中的应用。本发明能够有其它实施方案或者以多种方式实践或实施。
蜂易感大量的病毒感染。通过减量调节特定的病毒基因产物来治疗这类感染已显示在消除蜂中病毒诱导的感染方面成功(参见美国专利申请20090118214)。
本发明人现提出通过减量调节特定的瓦螨基因产物来治疗蜂中瓦螨侵染。
瓦螨寄生于蛹和成年蜂中并在蛹的抚幼室中繁殖。螨使用它们的嘴刺穿外骨骼并且以蜂的血淋巴为食。本发明人意外地发现,施用给蜂以治疗瓦螨侵染的多核苷酸剂出现在蜂的血淋巴中,从而变为螨可获取的。
本发明人已显示,可成功地将dsRNA转移至瓦螨(图2A-E),所述dsRNA可用来减量调节瓦螨中特定基因的表达(图4)和进一步地,针对减量调节靶定特定基因可引起瓦螨数量上的减少(图5)。
因此,本发明的一个方面提供了预防或治疗蜂的狄斯瓦螨侵染的方法,所述方法包括给蜂施用有效量的包含减量调节狄斯瓦螨基因产物的表达的核酸序列的核酸剂,从而预防或治疗蜂的狄斯瓦螨侵染。
本文所用的术语“蜂”是指成年蜂及其蛹单元二者。根据一个实施方案,所述蜂在蜂巢中。
成年蜂定义为膜翅目中蜜蜂总科的数种有翅、躯体多毛通常有刺的昆虫中的任一种(包括独居种和群居种二者),以及通过用于收集花蜜和花粉的吸吮和咀嚼口器来表征。示例性蜂种包括但不限于:蜜蜂属(Apis)、熊蜂属(Bombus)、无刺蜂属(Trigona)、壁蜂属(Osmia)等。在一个实施方案中,蜂包括但不限于大黄蜂(Bombus terrestris)、蜜蜂(意大利蜜蜂) (包括采集蜂和蜂巢蜂)和中华蜜蜂(Apis cerana)。
根据一个实施方案,所述蜂为蜂群的一部分。
术语“蜂群”是指这样的一群蜂,其包含几十到典型地数万的蜂,所述蜂在筑巢、收集食物和养育幼蜂方面合作。蜂群一般地具有单个蜂王,剩余的蜂为“工蜂”(雌性)或“雄峰”(雄性)。蜂群的社群结构由蜂王和工蜂维持并且依赖于有效的沟通系统。工蜂阶级内的劳动分工主要取决于蜂的年龄,但也随蜂群的需求而改变。繁殖和蜂群蜂数取决于蜂王、食物储备的量和工蜂队伍的大小。还可将蜜蜂细分成“蜂巢蜂”类(通常用于工蜂生命的第一部分,这期间“蜂巢蜂”在蜂巢内执行任务)和“采集蜂”类(所述蜂生命的后半部分,这期间“采集蜂”从蜂巢外定位并收集花粉和花蜜,并将花蜜或花粉带入蜂巢用于消耗和储存)。
根据本发明的此方面,将本发明的试剂用于防止狄斯瓦螨作为蜂或其幼虫上的寄生虫生存。
短语“狄斯瓦螨”是指攻击蜜蜂(中华蜜蜂和意大利蜜蜂)的外寄生螨。所述螨可处于成虫期,以蜂为食;或处于幼虫期,在蜜蜂抚幼室内。
如所提及的,本发明的试剂能够减量调节狄斯瓦螨基因产物的表达。
本文所用的短语“基因产物”是指RNA分子或蛋白质。
根据一个实施方案,所述狄斯瓦螨基因产物为螨生存力所必需的产物。这类基因产物的减量调节将典型地导致瓦螨死亡。根据另一个实施方案,所述狄斯瓦螨基因产物为螨繁殖所必需的产物。这类基因产物的减量调节将典型地导致防止瓦螨的繁殖以及最终根除瓦螨群体。根据又另一个实施方案,所述狄斯瓦螨基因产物为在蜂中产生致病性症状所必需的产物。
根据本发明的此方面可减量调节的示例性基因产物包括但不限于:NADH脱氢酶;亚基2- Genbank检索号NC_004454;ATP合成酶;亚基8-NC_004454;ATP合成酶;亚基6-NC_004454;钠通道基因- Genbank检索号FJ216963;细胞色素氧化酶亚基I- Genbank检索号EF025469。
要理解的是,在本发明的试剂能够减量调节狄斯瓦螨的基因产物表达的同时,优选的是,它们在其它动物(例如蜂)中在较小程度上调节所述基因产物的表达。因此,本发明的试剂必须能够区分螨基因和蜂基因,以比后者更大的程度减量调节前者。根据另一个实施方案,本发明的试剂无论如何都不会减量调节蜂基因。这可通过靶定在螨中差异表达而在蜂中不表达的基因(例如螨钠通道基因-FJ216963)来实现。备选地,可使本发明的试剂靶定在螨和蜂中均表达的基因的螨特异性序列。
根据一个实施方案,本发明的试剂靶定螨基因的以下区段,其至少为100个碱基长且不携带与任何蜂基因组序列或人基因组序列完全同源的长于19个碱基的任何序列。
在下文中提供这类基因区段的实例:
SEQ ID NO: 1:与ATP酶亚基A (区段1)同源的瓦螨基因;SEQ ID NO: 2:与ATP酶亚基A (区段2)同源的瓦螨基因;SEQ ID NO: 3:与ATP酶亚基A (区段3)同源的瓦螨基因;SEQ ID NO: 4:与ATP酶亚基A (区段4)同源的瓦螨基因;SEQ ID NO: 5:与ATP酶亚基A (区段5)同源的瓦螨基因;SEQ ID NO: 6:与ATP酶亚基A (区段6)同源的瓦螨基因;SEQ ID NO: 7:与ATP酶亚基A (区段7)同源的瓦螨基因;SEQ ID NO: 8:与ATP酶亚基A (区段8)同源的瓦螨基因;SEQ ID NO: 9:与ATP酶亚基A (区段9)同源的瓦螨基因;SEQ ID NO: 10:与RNA聚合酶I (区段1)同源的瓦螨基因;SEQ ID NO: 11:与RNA聚合酶I (区段2)同源的瓦螨基因;SEQ ID NO: 12:与RNA聚合酶I (区段3)同源的瓦螨基因;SEQ ID NO: 13:与RNA聚合酶III (区段1)同源的瓦螨基因;SEQ ID NO: 14:与RNA聚合酶III (区段2)同源的瓦螨基因;SEQ ID NO: 15:与RNA聚合酶III (区段3)同源的瓦螨基因;SEQ ID NO: 16:与RNA聚合酶III (区段4)同源的瓦螨基因;SEQ ID NO: 17:与RNA聚合酶III (区段5)同源的瓦螨基因;SEQ ID NO: 18:与RNA聚合酶III (区段6)同源的瓦螨基因;SEQ ID NO: 19:与RNA聚合酶III (区段7)同源的瓦螨基因;SEQ ID NO: 20:与RNA聚合酶III (区段8)同源的瓦螨基因;SEQ ID NO: 21:与RNA聚合酶III (区段9)同源的瓦螨基因;SEQ ID NO: 22:与凋亡抑制剂(IAP;区段1)同源的瓦螨基因;SEQ ID NO: 23:与凋亡抑制剂(IAP;区段2)同源的瓦螨基因;SEQ ID NO: 24:与凋亡抑制剂(IAP;区段3)同源的瓦螨基因;SEQ ID NO: 25:与凋亡抑制剂(IAP;区段4)同源的瓦螨基因;SEQ ID NO: 26:与凋亡抑制剂(IAP;区段5)同源的瓦螨基因;SEQ ID NO: 27:与凋亡抑制剂(IAP;区段6)同源的瓦螨基因;SEQ ID NO: 28:与凋亡抑制剂(IAP;区段7)同源的瓦螨基因;SEQ ID NO: 29:与凋亡抑制剂(IAP;区段8)同源的瓦螨基因;SEQ ID NO: 30:与FAS凋亡抑制剂(区段1)同源的瓦螨基因;SEQ ID NO: 31:与FAS凋亡抑制剂(区段2)同源的瓦螨基因;SEQ ID NO: 32:与FAS凋亡抑制剂(区段3)同源的瓦螨基因;SEQ ID NO: 33:与α-微管蛋白(区段1)同源的瓦螨基因;SEQ ID NO: 34:与α-微管蛋白(区段2)同源的瓦螨基因;SEQ ID NO: 35:与α-微管蛋白(区段3)同源的瓦螨基因;SEQ ID NO: 36:与α-微管蛋白(区段4)同源的瓦螨基因;SEQ ID NO: 37:与α-微管蛋白(区段5)同源的瓦螨基因;SEQ ID NO: 38:与α-微管蛋白(区段6)同源的瓦螨基因;SEQ ID NO: 39:与α-微管蛋白(区段7)同源的瓦螨基因;SEQ ID NO: 40:与α-微管蛋白(区段8)同源的瓦螨基因;SEQ ID NO: 41:与α-微管蛋白(区段9)同源的瓦螨基因;SEQ ID NO: 42:NADH脱氢酶;亚基2 (NC_004454):碱基709-974;SEQ ID NO: 43:ATP合成酶;亚基8 (NC_004454):第3545-3643个碱基;SEQ ID NO: 44:钠通道蛋白(AY259834):碱基3336-3836。
要理解的是,可靶定多于一种基因以使对瓦螨的细胞毒性效应最大化。
因此,根据一个实施方案,靶定下组基因:ATP酶亚基A、RNA聚合酶III、凋亡抑制剂(IAP)、FAS凋亡抑制剂和α-微管蛋白(例如使用具有如1、13、27、30和39所述序列的核酸剂)。
根据另一个实施方案,靶定下组基因:ATP酶亚基A、RNA聚合酶I、RNA聚合酶III、凋亡抑制剂(IAP)、FAS凋亡抑制剂和α-微管蛋白。
要理解的是,除了减量调节许多基因之外,本发明进一步预期使用若干试剂来减量调节相同的基因(例如,每个都与相同基因的不同区段杂交的若干dsRNA)。因此,例如当使用下列dsRNA的混合物时,本发明人显示最大的细胞毒性活性:SEQ ID No:1、4、7、10、13、16、19、22、25、27、30、33、36和39,而当使用下列dsRNA的混合物时,显示较小的细胞毒性活性:SEQ ID No: 1、13、27、30和39。
可将能够识别种特异性序列的工具用于此目的——例如BLASTN和其它这类计算机程序。
本文所用的术语“减量调节表达”是指直接或间接地引起所需基因转录的减少、基因的转录产物(例如,RNA)在量、稳定性或可译性方面的减少和/或由所需基因编码的多肽翻译的减少。
减量调节狄斯瓦螨基因产物的表达可如下监测,例如:通过直接检测基因转录物(例如,通过PCR)、通过检测由所述基因或蜂病原体RNA编码的多肽(例如,通过蛋白质印迹或免疫沉淀)、通过检测由所述基因编码的多肽的生物活性(例如,催化活性、配体结合等)或通过监测狄斯瓦螨中的变化(例如,螨的增殖减少、螨的致病力降低、螨的活动力降低等)以及通过测试蜂传染性/致病性。
使用干扰转录和/或翻译的各种试剂(例如RNA沉默剂、核酶、DNA酶和反义物)可在基因组水平和/或转录物水平方面实现狄斯瓦螨基因产物的减量调节。
根据一个实施方案,减量调节狄斯瓦螨基因产物表达的试剂为多核苷酸剂,例如RNA沉默剂。根据此实施方案,所述多核苷酸剂长度大于15个碱基对。
本文所用的短语“RNA沉默”是指由RNA分子介导的一组调节机制[例如,RNA干扰(RNAi)、转录基因沉默(TGS)、转录后基因沉默(PTGS)、压抑、共抑制和翻译阻遏],其导致相应的蛋白质编码基因或蜂病原体RNA序列表达的抑制或“沉默”。已在许多类型的生物体中观察到RNA沉默,所述生物体包括植物、动物和真菌。
本文所用的术语“RNA沉默剂”是指能够抑制或“沉默”靶基因表达的RNA。在某些实施方案中,RNA沉默剂能够通过转录后沉默机制来阻止mRNA分子的完整加工(例如,完全翻译和/或表达)。RNA沉默剂包括非编码RNA分子,例如包含配对链的RNA双链体,以及自其可产生这类小的非编码RNA的前体RNA。示例性RNA沉默剂包括dsRNA,例如siRNA、miRNA和shRNA。在一个实施方案中,RNA沉默剂能够诱导RNA干扰。在另一个实施方案中,RNA沉默剂能够介导翻译阻遏。
RNA干扰是指动物中由短干扰RNA (siRNA)介导的序列特异性转录后基因沉默的过程。相应过程在植物中通常被称为转录后基因沉默或RNA沉默,而在真菌中还被称为压抑。认为转录后基因沉默的过程为进化上保守的细胞防御机制,其用来阻止外源基因的表达,且通常由不同的区系和门共享。经由细胞应答的对外源基因表达的这类防护,可响应于双链RNA (dsRNA)的产生而进化,所述双链RNA来源于病毒感染或来源于转座子元件到宿主基因组中的随机整合,所述细胞应答特异地破坏同源的单链RNA或病毒基因组RNA。
细胞中长dsRNA的存在刺激被称为切酶(dicer)的核糖核酸酶III酶的活性。切酶涉及将dsRNA加工成被称为短干扰RNA (siRNA)的短片段dsRNA。来源于切酶活性的短干扰RNA典型地为约21-约23个核苷酸长并包含约19个碱基对的双链体。RNAi应答也以内切核酸酶复合体(通常被称为RNA诱导的沉默复合体(RISC))为特征,所述复合体介导具有与siRNA双链体的反义链互补的序列的单链RNA的切割。靶RNA的切割发生在与siRNA双链体的反义链互补的区的中部。
根据一个实施方案,所述dsRNA长于30 bp。使用长dsRNA可提供许多优势,因为:细胞可选择最佳沉默序列,这减少测试众多siRNA的需要;长dsRNA允许沉默文库具有与siRNA可能所需的复杂性相比更小的复杂性;和,或许最重要地,当用作治疗剂时,长dsRNA可防止病毒逃逸突变。
多项研究表明,长dsRNA可用来沉默基因表达,而不诱导应激反应或引起显著的脱靶效应——参见例如[Strat等, Nucleic Acids Research, 2006,卷34,期13 3803–3810;Bhargava A等, Brain Res. Protoc. 2004;13:115–125;Diallo M.等, Oligonucleotides. 2003;13:381–392;Paddison P.J.等, Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2002;99:1443–1448;Tran N.等, FEBS Lett. 2004;573:127–134]。
减量调节瓦螨基因产物的另一种方法为通过引入小抑制性RNA (siRNA)。
术语“siRNA”是指诱导RNA干扰(RNAi)途径的小抑制性RNA双链体(一般18-30个碱基对、19-25个碱基对)。虽然近来已描述与21聚体相比,相同位置上长度为25-30个碱基的化学合成RNA双链体效力具有多达100倍增加,但仍典型地将siRNA化学合成为21聚体,其具有中心的19 bp双链体区和末端上对称的2-碱基3’突出端。观察到在触发RNAi中使用较长的RNA获得增加的效力,推测其起因于给切酶提供底物(27聚体)而不是产物(21聚体),这改善了siRNA双链体进入RISC的速率或效率。
已发现3'突出端的位置影响siRNA的效力,以及在反义链上具有3'突出端的不对称双链体一般比在有义链上具有3'突出端的不对称双链体更有效(Rose等, 2005)。这可归因于不对称链加载入RISC中,因为当靶定反义转录物时观察到相反的功效模式。
可连接双链干扰RNA (例如,siRNA)的链,以形成发夹或茎环结构(例如,shRNA)。因此,如所提及的,本发明的RNA沉默剂也可为短发夹RNA (shRNA)。
本文所用的术语“shRNA”是指具有茎环结构的RNA剂,其包含互补序列的第一区和第二区,互补性程度和区的定向足以使区之间形成碱基配对,第一区和第二区通过环区连接,所述环起因于在环区内的核苷酸(或核苷酸类似物)之间缺乏碱基配对。环中核苷酸的数目为在3-23、或5-15、或7-13、或4-9、或9-11之间并包含其端值的数字。环中的某些核苷酸可涉及与环中其它核苷酸的碱基对相互作用。可用来形成环的寡核苷酸序列的实例包括5'-UUCAAGAGA-3' (SEQ ID NO: 4;Brummelkamp, T. R.等, (2002) Science 296: 550)和5'-UUUGUGUAG-3' (SEQ ID NO: 5;Castanotto, D.等, (2002) RNA 8:1454)。本领域技术人员要认识的是,产生的单链寡核苷酸形成茎环或发夹结构,所述结构包含能够与RNAi机构相互作用的双链区。
根据另一个实施方案,所述RNA沉默剂可为miRNA。miRNA为从编码各种大小的初级转录物的基因制备的小RNA。已在动物和植物二者中鉴定它们。初级转录物(称为“初miRNA (pri-miRNA)”)通过多个溶核步骤加工成较短的前体miRNA或“前miRNA”。所述前miRNA以折叠形式存在使得最终的(成熟的) miRNA以双链体存在,两条链被称为miRNA (最后将与靶标碱基配对的链)。前miRNA为自前体移出miRNA双链体的切酶形式的底物,在移出miRNA双链体后,类似于siRNA,可将所述双链体带入RISC复合体。已表明的是,miRNA可转基因表达以及可通过表达前体形式而不是完整的初级形式来起作用(Parizotto等, (2004) Genes & Development 18:2237-2242和Guo等, (2005) Plant Cell 17:1376-1386)。
与siRNA不同的是,miRNA以仅部分互补性与转录序列结合(Zeng等, 2002, Molec. Cell 9:1327-1333)并且阻遏翻译而不影响稳态RNA水平(Lee等, 1993, Cell 75:843-854;Wightman等, 1993, Cell 75:855-862)。miRNA和siRNA二者均通过切酶加工并与RNA诱导的沉默复合体的组分缔合(Hutvagner等, 2001, Science 293:834-838;Grishok等, 2001, Cell 106: 23-34;Ketting等, 2001, Genes Dev. 15:2654-2659;Williams等, 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:6889-6894;Hammond等, 2001, Science 293:1146-1150;Mourlatos等, 2002, Genes Dev. 16:720-728)。近期报道(Hutvagner等, 2002, Sciencexpress 297:2056-2060)假定,经由与siRNA途径相对的miRNA途径的基因调节仅由与靶转录物的互补性程度确定。推测的是,类似于miRNA,与mRNA靶标仅具有部分同一性的siRNA以翻译阻遏中起作用而不是触发RNA降解。
在本发明的一个实施方案中,适于与本发明一起使用的RNA沉默剂的合成可如下实现。首先,在AUG起始密码子的下游针对AA二核苷酸序列扫描瓦螨靶mRNA。把每个AA和3'相邻的19个核苷酸的出现记录为潜在的siRNA靶位点。由于非翻译区(UTR)在调节蛋白结合位点中更丰富,因此优选地siRNA靶位点选自可读框。UTR结合蛋白和/或翻译起始复合体可能干扰siRNA内切核酸酶复合体的结合[Tuschl ChemBiochem. 2:239-245]。但要理解的是,指向非翻译区的siRNA也可有效,如对GAPDH所表明的,其中指向5'UTR的siRNA介导了在细胞GAPDH mRNA上约90%的减少并完全废止蛋白质水平(wwwdotambiondotcom/techlib/tn/91/912dothtml)。
其次,使用任何序列比对软件将潜在的靶位点与适当的基因组数据库(例如,人、蜂、小鼠、大鼠等)相比较,所述软件为例如可获自NCBI服务器的BLAST软件(wwwdotncbidotnlmdotnihdotgov/BLAST/)。滤除对其它编码序列表现出显著同源性的推定靶位点。
挑选出合格的靶序列作为用于siRNA合成的模板。优选的序列为包含低G/C含量的序列,因为已证明与G/C含量高于55%的序列相比,这些序列在介导基因沉默方面更有效。优选沿着靶基因或序列的长度选择数个靶位点用于评价。为了更好地评价所选siRNA,优选结合使用阴性对照。优选阴性对照siRNA包含与siRNA相同的核苷酸组成,但缺少与基因组的显著同源性。因此,优选使用杂乱的siRNA核苷酸序列,前提是其对任何其它基因或蜂病原体靶序列不显示任何显著同源性。
例如,可用于本发明此方面的siRNA为靶定螨特异性基因的siRNA。在SEQ ID NO: 45-47中提供了示例性siRNA。
SEQ ID NO: 45:attttattcaattaaagtatt
SEQ ID NO: 46:atacctcaaatgtatccttca
SEQ ID NO: 47:ggccaatcccgattccggcga
要理解的是,本发明的RNA沉默剂不需要限于仅含RNA的那些分子,而是进一步包含化学修饰的核苷酸和非核苷酸。
在某些实施方案中,本文提供的RNA沉默剂可与细胞渗透肽功能上相关。本文所用的“细胞渗透肽”为包含以下短(约12-30个残基)氨基酸序列或功能性基序的肽,所述短氨基酸序列或功能性基序赋予与转运透膜复合体穿过细胞的质膜和/或核膜相关的能量独立性(即,非内吞性)易位特性。优选用于本发明的透膜复合体的细胞渗透肽包含至少一个非功能性半胱氨酸残基,其为游离的或被衍生以与已针对这类键合修饰的双链核糖核酸形成二硫键。赋予这类特性的代表性氨基酸基序列举在美国专利第6,348,185号中,其内容通过引用明确地结合于本文中。优选本发明的细胞渗透肽包括但不限于:penetratin、transportan、pIsl、TAT(48-60)、pVEC、MTS和MAP。
能够减量调节瓦螨基因产物的另一种试剂为能够特异性切割蜂病原体多肽的mRNA转录物或DNA序列的DNA酶分子。DNA酶为单链多核苷酸,其能够切割单链和双链靶序列二者(Breaker, R.R.和Joyce, G. Chemistry and Biology 1995;2:655;Santoro, S.W. & Joyce, G.F. Proc. Natl, Acad. Sci. USA 1997;943:4262)。已提出用于DNA酶的一般模型(“10-23”模型)。“10-23”DNA酶具有15个脱氧核糖核苷酸的催化域,由各自7-9个脱氧核糖核苷酸的两个底物识别域的侧接。这种DNA酶类型可有效地在嘌呤:嘧啶连接处切割其底物RNA (Santoro, S.W. & Joyce, G.F. Proc. Natl, Acad. Sci. USA 199;关于DNA酶的综述参见Khachigian, LM [Curr Opin Mol Ther 4:119-21 (2002)]。
减量调节瓦螨基因产物也可通过使用反义多核苷酸来完成,所述反义多核苷酸能够特异性地与编码瓦螨基因产物的mRNA转录物杂交。
在考虑对反义方法重要的两个方面的同时,必须实现可用来有效地减量调节瓦螨基因产物的反义分子的设计。第一方面为递送寡核苷酸进入适当细胞的细胞质,而第二方面为寡核苷酸的设计,所述寡核苷酸以抑制其翻译的方式与细胞内指定的mRNA或RNA靶序列特异性结合。
先前技术教导了许多递送策略,其可用来有效递送寡核苷酸进入多种细胞类型[参见例如Luft J Mol Med 76: 75-6 (1998);Kronenwett等, Blood 91: 852-62 (1998);Rajur等, Bioconjug Chem 8: 935-40 (1997);Lavigne等, Biochem Biophys Res Commun 237: 566-71 (1997)和Aoki等, (1997) Biochem Biophys Res Commun 231: 540-5 (1997)]。
此外,也可得到用于鉴定对其靶mRNA具有最高预测结合亲和力的那些序列的算法,其基于解释在靶mRNA和寡核苷酸二者中结构改变的能量学的热力学循环[参见例如Walton等, Biotechnol Bioeng 65: 1-9 (1999)]。
这类算法已成功地用来在细胞中实施反义方法。例如,由Walton等开发的算法使科学家能够成功地设计用于兔β-球蛋白(RBG)和小鼠肿瘤坏死因子-α (TNF α)转录物的反义寡核苷酸。同一研究小组最近报道,如通过动态PCR技术所评价,合理选择的寡核苷酸在细胞培养中对三种模型靶mRNA (人乳酸脱氢酶A和B以及大鼠gp130)的反义活性,证明在几乎所有情况中有效,所述情况包括在具有磷酸二酯和硫代磷酸寡核苷酸化学物质的两种细胞类型中对三种不同靶标进行的测试。
此外,也发表了用于使用体外系统设计和预测特异性寡核苷酸效力的数种方法(Matveeva等, Nature Biotechnology 16: 1374-1375 (1998)]。
能够减量调节瓦螨基因产物的另一种试剂为能够特异性切割编码瓦螨基因产物的mRNA转录物的核酶分子。
核酶通过切割编码目的蛋白质的mRNA而逐渐地用于序列特异性抑制基因表达[Welch等, Curr Opin Biotechnol. 9:486-96 (1998)]。设计切割任何特异性靶RNA (包括病毒RNA)的核酶的可能性,已使它们成为在基础研究和治疗应用二者中均有价值的工具。
减量调节细胞中瓦螨基因产物的表达的另一种方法为经由三链结构寡核苷酸(TFO)。近期研究已显示,可设计可以序列特异性方式识别和结合到双链螺旋DNA的多嘌呤/多嘧啶区的TFO。这些识别规则由Maher III, L. J.等, Science,1989;245:725-730;Moser, H. E.等, Science,1987;238:645-630;Beal, P. A.等, Science,1992;251:1360-1363;Cooney, M.等, Science,1988;241:456-459;和Hogan, M. E.等, EP Publication 375408概述。寡核苷酸的修饰(例如引入嵌入剂和骨架取代)和结合条件(pH和阳离子浓度)的优化帮助克服对TFO活性的内在阻碍(例如电荷排斥和不稳定性),以及近期已显示,可将合成的寡核苷酸靶定特定序列(关于最新综述参见Seidman和Glazer, J Clin Invest 2003;112:487-94)。
一般而言,三链结构寡核苷酸具有序列对应性:
寡核苷酸 3'--A G G T
双链体 5'--A G C T
双链体 3'--T C G A
然而已显示,A-AT和G-GC三链体具有最大的三股螺旋稳定性(Reither和Jeltsch, BMC Biochem, 2002年9月12日, Epub)。同一作者表明,根据A-AT和G-GC规则设计的TFO不形成非特异性三链体,表明三链体形式的确为序列特异性的。
三链结构寡核苷酸长度优选为至少15、更优选25、再更优选30或更多个核苷酸,最多50或100 bp。
用TFO转染细胞(例如,经由阳离子脂质体)以及与靶DNA形成三股螺旋结构,诱导空间和功能改变,阻断转录起始和延伸,允许在内源性DNA中引入所需的序列改变并引起基因表达的特异性减量调节。
设计、合成和施用有效TFO的详述可在美国专利申请号2003 017068和2003 0096980 (Froehler等)、2002 0128218和2002 0123476 (Emanuele等)以及美国专利号5,721,138 (Lawn)中找到。
本发明的多核苷酸减量调节剂可根据本领域已知的任何多核苷酸合成方法生成,所述方法为例如酶促合成或固相合成。用于进行固相合成的仪器和试剂可从例如Applied Biosystems商购。也可使用任何其它用于这类合成的方法;多核苷酸的实际合成完全在本领域技术人员的能力之内并且可经由已建立的方法利用固相化学(例如氰乙基亚磷酰胺,接着脱保护、脱盐和通过例如自动化的基于三苯甲基的方法(trityl-on method)或HPLC来纯化)来完成,所述方法详述于例如:“分子克隆:实验室手册(Molecular Cloning: A laboratory Manual)”Sambrook等, (1989);“分子生物学中的现行方案(Current Protocols in Molecular Biology)”卷I-III , Ausubel, R. M.编辑(1994);Ausubel等,“分子生物学中的现行方案(Current Protocols in Molecular Biology)”, John Wiley和Sons, Baltimore, Maryland (1989);Perbal,“分子克隆的实践指南(A Practical Guide to Molecular Cloning)”, John Wiley & Sons, New York (1988)以及“寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)”Gait, M. J.编辑(1984)。
本发明的多核苷酸剂可包含由以3'-5'磷酸二酯键结合的嘌呤和嘧啶碱基组成的杂环核苷。
优选使用的多核苷酸剂为在骨架、核苷间键或碱基中修饰的多核苷酸剂,如在下文中所概述。
根据本发明的此方面有用的优选多核苷酸剂的具体实例包括包含经修饰的骨架或非天然核苷间键的多核苷酸剂。具有经修饰的骨架的多核苷酸剂包括在骨架中保留磷原子的多核苷酸剂,如在美国专利第4,469,863;4,476,301;5,023,243;5,177,196;5,188,897;5,264,423;5,276,019;5,278,302;5,286,717;5,321,131;5,399,676;5,405,939;5,453,496;5,455,233;5,466, 677;5,476,925;5,519,126;5,536,821;5,541,306;5,550,111;5,563,253;5,571,799;5,587,361和5,625,050号中所公开。
优选的经修饰的多核苷酸骨架包括例如:硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨烷基磷酸三酯、甲基和其它烷基膦酸酯(包括3'-烯基膦酸酯和手性膦酸酯)、亚膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3'-氨基氨基磷酸酯和氨烷基氨基磷酸酯)、硫羰基氨基磷酸酯、硫羰基烷基膦酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯,以及具有正常3'-5'键合的硼烷磷酸酯(boranophosphates)、这些的2'-5'连接类似物,以及具有反极性的那些,其中核苷单元的相邻对为3'-5'与5'-3'或2'-5'与5'-2'连接的。也可使用多种盐、混合盐和游离酸形式。
或者,其中不包含磷原子的经修饰的多核苷酸骨架具有由短链烷基或环烷基核苷间键、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间键、或者一种或多种短链杂原子或杂环核苷间键形成的骨架。这些包括具有吗啉代键的骨架(部分由核苷的糖部分形成);硅氧烷骨架;硫化物、亚砜和砜骨架;甲乙酰基(formacetyl)和硫代甲乙酰基(thioformacetyl)骨架;亚甲基甲乙酰基和硫代甲乙酰基骨架;含烯骨架;氨基磺酸酯骨架;亚甲基亚氨基和亚甲基肼基骨架;磺酸酯和氨磺酰骨架;酰胺骨架;以及具有混合N、O、S和CH2组分部分的其它骨架,如在美国专利第5,034,506;5,166,315;5,185,444;5,214,134;5,216,141;5,235,033;5,264,562;5,264,564;5,405,938;5,434,257;5,466,677;5,470,967;5,489,677;5,541,307;5,561,225;5,596,086;5,602,240;5,610,289;5,602,240;5,608,046;5,610,289;5,618,704;5,623, 070;5,663,312;5,633,360;5,677,437和5,677,439号中所公开。
根据本发明可使用的其它多核苷酸剂为在糖和核苷间键二者中均修饰的多核苷酸剂,即,用新基团取代核苷酸单元的置换。维持碱基单元用于与适当多核苷酸靶标互补。这类多核苷酸模拟物的实例包括肽核酸(PNA)。PNA多核苷酸是指其中用含酰胺骨架特别是氨乙基甘氨酸骨架置换糖骨架的多核苷酸。将碱基保留并直接或间接地与骨架酰胺部分的氮杂氮原子结合。教导制备PNA化合物的美国专利包括但不限于,美国专利第5,539,082;5,714,331和5,719,262号,其每个通过引用结合于本文中。可用于本发明的其它骨架修饰在美国专利第6,303,374号中公开。
本发明的多核苷酸剂也可包含碱基修饰或取代。本文所用的“未修饰的”或“天然的”碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G),以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。经修饰的碱基包括但不限于其它合成的和天然的碱基,例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶,6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶,5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶,8-卤代、8-氨基、8-巯基、8-硫烷基、8-羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤,5-卤特别是5-溴、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶,7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮杂鸟嘌呤和7-脱氮杂腺嘌呤以及3-脱氮杂鸟嘌呤和3-脱氮杂腺嘌呤。另外的碱基包括在美国专利第3,687,808中公开的那些、在聚合物科学与工程的简明百科全书(The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering), 858-859页, Kroschwitz, J. I.,编辑John Wiley & Sons, 1990中公开的那些、由Englisch等, Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613公开的那些以及由Sanghvi, Y. S., 第15章,反义研究与应用(Antisense Research and Applications), 289-302页, Crooke, S. T.和Lebleu, B. ,编辑, CRC Press, 1993公开的那些。这类碱基对增强本发明寡聚化合物的结合亲和力特别有用。这些包括5-取代嘧啶、6-氮杂嘧啶以及N-2、N-6和O-6取代的嘌呤,包括2-氨丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已显示5-甲基胞嘧啶取代增加核苷酸双链体稳定性0.6-1.2℃[Sanghvi YS等(1993)反义研究和应用(Antisense Research and Applications), CRC Press, Boca Raton 276-278],并且为目前优选的碱基取代,甚至更特别地当与2'-O-甲氧乙基糖修饰组合时。
合成之后,可任选纯化本发明的多核苷酸剂。例如,可通过用溶剂或树脂提取、沉淀、电泳、层析或其组合从混合物中纯化多核苷酸。或者,多核苷酸可在不纯化或经最小程度的纯化的情况下使用,以避免因样品加工的损失。可干燥所述多核苷酸用于储存或将其溶于水溶液中。所述溶液可含有缓冲液或盐以促进双链体链的退火和/或稳定。
要理解的是,可提供本发明的多核苷酸剂本身,或将其提供为包含编码所述多核苷酸剂的核酸序列的核酸构建体。
典型地,如下文所详述,所述核酸构建体包含在宿主细胞中有功能的启动子序列。
在可操作地连接的启动子序列的控制下,本发明的多核苷酸序列可进一步被附加序列侧接,所述附加序列有利地影响其转录和/或所得转录物的稳定性。这类序列一般位于启动子上游和/或表达构建体的3'末端下游。
用于提及调节序列和结构核苷酸序列的术语“可操作地连接的”,意为调节序列引起连接的结构核苷酸序列的调节表达。“调节序列”或“控制元件”是指这样的核苷酸序列,其位于结构核苷酸序列的上游、之内或下游,且影响转录的时机和水平或量、RNA加工或稳定性或者相关结构核苷酸序列的翻译。调节序列可包含启动子、翻译前导序列、内含子、增强子、茎环结构、阻遏物结合序列、终止序列、暂停序列、多聚腺苷酸化识别序列等。
要理解的是,可以许多种方式将所述核酸剂递送给瓦螨。
根据一个实施方案,将所述核酸剂直接递送给螨(例如,通过喷淋受侵染的蜂巢)。所述核酸剂或编码所述核酸剂的构建体可通过扩散进入螨体内。在此实施方案中,核酸构建体的启动子典型地在螨细胞中有效。
要理解的是,由于瓦螨使用它们的嘴刺穿蜂外骨骼并且以蜂的血淋巴为食,因此本发明预期将本发明的多核苷酸剂递送给蜂,籍此其变为存在于蜂的血淋巴中,从而变为螨可获取的。因此,根据另一个实施方案,将所述核酸剂间接递送给螨(例如,通过蜂)。在此实施方案中,核酸构建体的启动子典型地在蜂细胞中有效。
根据一个实施方案,通过喷淋将所述核酸剂递送给蜂。所述核酸剂或编码所述核酸剂的构建体可通过扩散进入蜂体内。
根据另一个实施方案,经由其食物将所述核酸剂递送给蜂。本发明人认为,摄取本发明的核酸剂之后,所述试剂将存在于蜂的血淋巴中,籍此其变为瓦螨可获取的。
因此本发明的多核苷酸可体外合成并添加到食物中。例如可通过向基因区段的末端加入两个相对的启动子(例如T7启动子;SEQ ID NO: 48和49)来合成双链RNA,其中将SEQ ID NO: 48置于紧靠基因的5'而将SEQ ID NO: 49置于紧靠基因区段的3'。然后可用T7 RNA聚合酶体外转录所述dsRNA。
用于合成本发明实施方案的dsRNA的示例性序列在SEQ ID NO: 50-93中提供。
如本文所详述的,蜂饲喂在养蜂人中是通常作法,以提供营养和其它需要(例如,补充的需要)。蜂典型地以蜂蜜和花粉为食,但是已知其也摄取非天然饲料。可喂给蜂多种食料,包括但不限于Wheast (在酪农农干酪上生长的乳品酵母)、大豆粉、酵母(例如酿酒酵母(brewer's yeast)、圆酵母(torula yeast))和单独或组合地饲喂的酵母产物以及作为蜂巢内的干混合物或湿饼或者作为蜂巢外敞开的饲养器中的干混合物饲喂的大豆粉。糖或糖浆也可使用。向喂食给蜂的补充物中添加10-12%的花粉改善适口性。添加25-30%的花粉改善蜂用于生命活动所需的必需营养物的质和量。
蔗糖或甜菜糖、异构化玉米糖浆和50型糖浆为蜜蜂的天然饮食中蜂蜜的良好代用品。后两者可仅作为液体供应给蜂。
可通过例如下列方法中的任一种在蜂巢内将液体饲料供应给蜂:靠摩擦拧紧盖子的桶(friction-top pail)、育卵室内的蜂房、柜式饲养器、boardman饲养器等。可通过在倒置的内罩上放置一或两磅来饲喂干糖。供水必须为蜂一直都可获取的。在一个实施方案中,设想了其中存在漂浮的支持物(例如木片、软木塞或塑料海绵)的盘或托盘。蜂的补充饲料的详述可在例如由Standifer等1977, 标题为“蜜蜂群体的补充喂食(Supplemental Feeding of Honey Bee Colonies)”的USDA出版物(USDA, Agriculture Information Bulletin No. 413)中找到。
要理解的是,瓦螨在蜂的外骨骼中产生伤口部位。这类伤口部位隐匿有细菌感染,例如蜂房球菌,其导致欧洲幼虫腐臭病。此外,因为它们的寄生作用,怀疑瓦螨充当许多蜜蜂病原体(包括羽翼畸形病毒(DWV)、克什米尔蜜蜂病毒(KBV)、蜜蜂急性麻痹病毒(ABPV)和黑蜂王台病毒(BQCV))的载体,并且瓦螨可减弱其宿主的免疫系统,使得它们易受感染的攻击。
因此,通过杀死螨(或防止其繁殖),本发明的试剂可用来预防和/或治疗细菌感染(例如蜂房球菌感染)以及由以上命名的病毒引起的病毒感染。
由于认为瓦螨侵染和病毒感染为蜂群崩溃失调病(CCD)的原因,因此本试剂也可用来防止或减少蜂群体对CCD的易感性。
要理解的是,除了饲喂寡核苷酸和/或多核苷酸用来减少蜂病原体感染和侵染之外,实行适当的环境卫生(例如,制止受侵染蜂巢的再使用)可增加治疗和预防感染的有效性。
预期的是,在自本申请成熟的专利寿命期间,将开发许多用于减量调节基因产物表达的相关方法,意图术语“减量调节狄斯瓦螨基因产物的表达”的范围先验地包含所有这类新技术。
本文所用的术语“约”是指±10%。
术语“包括”、“包括的”、“包含”、“包含的”、“具有”及其变化意为“包括但不限于”。此术语包含术语“由……组成”和“基本由……组成”。
短语“基本由……组成”意为,仅当附加的成分和/或步骤未实质上改变所要求保护的组合物或方法的基本特征和新特征时,所述组合物或方法可包含附加的成分和/或步骤。
除非文段另有明确指示,否则本文所用的单数形式“一”、“一个”和“所述”也包括复数所指。例如,术语“化合物”或“至少一种化合物”可包含多种化合物,包括其混合物。
本文所用的术语“方法”是指完成给定任务的方式、手段、技术和程序,包括但不限于化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业者已知的或从所述从业者已知的方式、手段、技术和程序容易地开发的那些方式、手段、技术和程序。
本文所用的术语“治疗”包括消除、基本上抑制、减缓或逆转病况的行进,基本上改善病况的临床或美学症状或者基本上防止出现病况的临床或美学症状。
要理解的是,在单独的实施方案的文段中因清楚目的而描述的本发明的某些特征,也可在单个实施方案中以组合提供。反之,在单个实施方案的文段中因简明目的而描述的本发明的多个特征,也可单独地或以任何适宜的子组合提供,或者适宜的话提供在本发明的任何其它描述的实施方案中。除非实施方案在不具备那些要素时无法实施,否则不认为在多个实施方案的文段中描述的某些特征为那些实施方案的必不可少的特征。
如上文中所描述和如所附权利要求部分所要求保护的本发明的多个实施方案和方面在下列实施例中找到实验支持。
实施例
现对以下实施例进行引用,其连同下列描述以非限制性方式举例说明本发明的某些实施方案。
一般而言,本文所用的术语和本发明中所使用的实验室程序包括分子技术、生物化学技术、微生物学技术和重组DNA技术。在文献中充分解释了这类技术。参见,例如“分子克隆:实验室手册(Molecular Cloning: A laboratory Manual)”Sambrook等,(1989);“分子生物学中的现行方案(Current Protocols in Molecular Biology)”I-III卷Ausubel, R. M.,编辑(1994);Ausubel等,“分子生物学中的现行方案(Current Protocols in Molecular Biology)”,John Wiley和Sons, Baltimore, Maryland (1989);Perbal,“分子克隆的实践指南(A Practical Guide to Molecular Cloning)”,John Wiley & Sons, New York (1988);Watson等, “重组DNA(Recombinant DNA)”,Scientific American Books, New York; Birren等(编辑)“基因组分析:实验室手册系列(Genome Analysis: A Laboratory Manual Series)”1-4卷,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998);如在美国专利第4,666,828;4,683,202;4,801,531;5,192,659和5,272,057号中所述的方法;“细胞生物学:实验室手册(Cell Biology: A Laboratory Handbook)”,I-III卷Cellis, J. E.,编辑(1994);“动物细胞培养——基础技术手册(Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique)”,Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994),第三版;“免疫学中的现行方案(Current Protocols in Immunology)”I-III 卷Coligan J. E.,编辑(1994);Stites等(编辑),“基础和临床免疫学(Basic and Clinical Immunology)”(第8版), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994);Mishell和Shiigi (编辑),“细胞免疫学中所选择的方法(Selected Methods in Cellular Immunology)”,W. H. Freeman和Co., New York (1980);在专利和科学文献中广泛描述的可用的免疫测定法,参见例如美国专利第3,791,932;3,839,153;3,850,752;3,850,578;3,853,987;3,867,517;3,879,262;3,901,654;3,935,074;3,984,533;3,996,345;4,034,074;4,098,876;4,879,219;5,011,771和5,281,521号;“寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)”Gait, M. J.,编辑(1984);“核酸杂交(Nucleic Acid Hybridization)”Hames, B. D.,和Higgins S. J.,编辑(1985);“转录和翻译(Transcription and Translation)”Hames, B. D.,和Higgins S. J.,编辑(1984);“动物细胞培养(Animal Cell Culture)”Freshney, R. I.,编辑(1986);“固定化细胞和酶(Immobilized Cells and Enzymes)”IRL Press, (1986);“分子克隆的实践指南(A Practical Guide to Molecular Cloning)”Perbal, B., (1984)和“酶学中的方法(Methods in Enzymology)”1-317卷, Academic Press;“PCR方案:方法和应用的指南(PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications)”,Academic Press, San Diego, CA (1990);Marshak等,“用于蛋白质纯化和表征的策略——实验室课程手册(Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual)”CSHL Press (1996);其全部通过如同完全地在本文中描述的引用而结合。在此文件的各处提供了其它的一般引用。认为其中的程序为本领域众所周知的,为了读者的方便而提供所述程序。其中所包含的全部信息通过引用结合于本文中。
实施例1
饲喂瓦螨特异性dsRNA预防瓦螨侵染
为了确定摄取的dsRNA对瓦螨侵染的有效性,如图1所示,与瓦螨接触前7天和与瓦螨接触后2天,在饲料中给蜜蜂供应瓦螨特异性dsRNA和对照dsRNA。计算每个实验蜂巢死亡瓦螨的数量,并收集活瓦螨和死瓦螨样品用于分子分析。
材料和方法
小型蜂巢群体的建立: 从当地养蜂场的蜂巢中收集幼年(约2个月大)蜂王连同约200只工蜂。将蜂转移到用一个小型蜂房装配的小型蜂巢中,所述小型蜂房预先由规则的蜂巢建立。封盖全部小型蜂巢并置于控温房中(30℃)。
dsRNA制备: 将瓦螨序列克隆到质粒的两个相对的T7启动子之间。增殖质粒DNA之后,切取病毒片段(包括T7启动子)并凝胶纯化。这些充当用于T7指导的体外转录(MEGAscriptTM, Ambion, Austin TX)的模板。将反应产物进行DNA酶消化,之后进行苯酚提取和乙醇沉淀。将最终制品溶解在无核酸酶的水中。
在小型蜂巢中饲喂dsRNA: 在每个蜂房上放置5 g花粉补充饼,且每夜用无菌的培养皿将10 ml 50%蔗糖溶液加入蜂巢中。持续饲喂9天,之后仅将其中蜂王已开始产卵的蜂巢包含在试验中。
建立活跃蜂巢(蜂王产卵)之后,给某些小型蜂巢补充瓦螨特异性(凋亡抑制剂(IAP)基因(SEQ ID NO: 27)或非特异性对照(例如GFP SEQ ID NO: 91) dsRNA,将其加入供应给蜂巢的10 ml 50%蔗糖溶液中,调节至每只蜂每份饲料约1微克dsRNA,假设所有蜂消耗近似相同量的蔗糖溶液。持续dsRNA饲喂6天。
小型蜂巢中的瓦螨侵染: 在活跃蜂巢中饲喂7天后,使某些蜂群与瓦螨群体接触。其后,再持续dsRNA处理2天。在引入瓦螨群体之后,每天从每个小型蜂巢中收集活蜂和死蜂(幼虫和成虫)的样品,连续32天。将每只收集的蜂冷冻在液氮中并且在分子分析前保藏在-70℃。通过打开蜂巢(无烟)、拆下小型蜂房并从两边给小型蜂房拍照来监测蜂群的生活力。每天给蜂巢-蜂房拍照,并监测留下的活蜂的数量。把照片下载到电脑并对每个小型蜂巢计算蜂的总数。
为了测试dsRNA毒性,给另一组蜂巢提供瓦螨特异性dsRNA,但不使其与瓦螨群体接触。两组蜂巢充当附加的对照:未用dsRNA处理并且未接种瓦螨的蜂巢,以及未用dsRNA处理但已接种瓦螨的蜂巢。
RT-PCR分析:
核酸的提取: 使用TRIREAGENT方法(Sigma, St. Louis MO, USA)从保藏的蜂中提取总RNA。简言之,将RNA通过经由离心沉淀和分离来提取,之后重悬在RNA安全溶液(RNAsecure solution)中。
实时RT-PCR: 使用SYBR Green PCR master mix连同Taqman反转录酶(Applied Biosystems, Foster City, CA)将测定量的RNA (100 ng用于病毒表达分析,100 pg用于18S rRNA内参)进行一步RT-PCR。实时RT-PCR在GeneAmp PCR System 5700 (Applied Biosystems)中进行。无反转录酶或无模板下进行的反应不应产生任何产物。
RNA印迹分析: 从处理蜂和对照蜂提取总RNA。向RNA中加入甲醛至1.8%并加热至65℃。在70V 4℃搅拌下,使RNA(每泳道15 μg)在1.2%琼脂糖凝胶上电泳。将先前所述经扩增的瓦螨RNA产物用洋地黄毒苷标记并充当杂交探针。用DIG发光检测试剂盒(Roche Diagnostics GmbH,Mannheim, Germany)进行检测。通过与电泳RNA分子量标记I (Roche)比较来估计RNA大小。在高严格性(0.1× SSC; 65℃)下进行杂交。
蜜蜂中摄入的瓦螨特异性dsRNA的命运: 为了更好地了解dsRNA-瓦螨保护蜂免受瓦螨侵染的作用机制及其结果,从dsRNA-瓦螨处理的蜂和未处理的对照蜂提取总RNA,经由一组核酸酶进行消化,并在PAGE上分离。
结果
通过使用用于GFP的探针的狭线印迹杂交确定了在成年蜂体、蜂幼虫(通过成年蜂喂养)、蜂蛹中dsRNA的存在情况。通过检测小RNA的RNA印迹确定了针对siRNA的dsRNA加工(图2A-E)。
在用dsRNA-GFP饲喂7天的成年蜂和对照(未饲喂)蜂上放置瓦螨个体。在指定时间(图1)从瓦螨提取RNA并用GFP引物进行RT-PCR。结果示于图3中。
给蜂饲喂凋亡抑制剂(IAP)基因的dsRNA区段(SEQ ID NO: 27)。通过RT-PCR对从该蜂巢收集的瓦螨分析IAP基因的表达(图4)。
实施例2
材料和方法
用对应于瓦螨基因区段的dsRNA的两种不同的混合物饲喂蜂巢。所有dsRNA对应于不与蜂或人序列同源(不携带长于19个碱基的同源序列段)的基因区段。混合物I (最小处理)包含SEQ ID NO: 1、13、27、30和39。混合物II (最大处理)包含SEQ ID NO: 1、4、7、10、13、16、19、22、25、27、30、33、36和39。在每个蜂巢中放置三十只瓦螨个体并在两个月后对每个蜂巢中的瓦螨和蜂计数。每组处理重复3次。
结果
在各个蜂巢中未观察到对蜂巢蜂数的可见损害。图5显示了在用瓦螨基因序列的dsRNA处理之后瓦螨群体的减少。
实施例3
用于预防瓦螨相关的蜜蜂疾病的瓦螨特异性dsRNA的大规模现场试验
为了确定在实际现场条件下摄入的瓦螨dsRNA对瓦螨侵染的有效性,以及评价对蜂群健康的重要参数的影响,在用瓦螨侵染前5天和在侵染后4天,在饲料中给全尺寸蜂巢样品中的蜂提供瓦螨特异性dsRNA。
材料和方法
昆虫材料:
来自以下处理的五个蜂群:远程对照、仅瓦螨dsRNA、仅瓦螨以及在每个时间点:第0天(病毒施用日)、第7天和终点(第42天)的瓦螨特异性dsRNA +瓦螨。重复测试数次。
RNA提取:
使用Tri-Reagent (Sigma,USA)根据制造商提供的方案提取RNA。在上样至凝胶之前,用DNA酶I处理所有样品并用上样缓冲液(90%甲酰胺、0.05溴酚蓝、0.05%二甲苯蓝)重悬。
凝胶电泳和印迹:
使用nanodrop分光光度计测定10 ug新鲜制备的RNA并在变性环境(凝胶含有7M尿素)中上样至12%丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺:双丙烯酰胺比率为1:19)。电泳之后使用电印迹方法将样品转移至带正电荷的尼龙膜(Roch,USA)。
杂交和信号检测:
将膜与新鲜制备的瓦螨区段的DNA探针杂交,所述区段取自不对应于瓦螨特异性dsRNA本身的dsRNA的区。使用DIG PCR探针制备试剂盒(Roch,USA)根据制造商方案在42℃在DIG easyhyb溶液(Roch, USA)中进行。用2 × SSC/0.1 % SDS洗涤膜两次,然后针对严格性在65 ℃用0.1 × SSC/0.1 % SDS洗涤。使用DIG洗涤和封闭试剂盒(Wash andBlock Kit) (Roch, USA)根据制造商方案进一步洗涤膜。使用CSPD-star底物(Roch, USA)进行检测。阳性对照为对应于已杂交序列的21 nt DNA引物。
利用在Kodak制造的化学发光器(chemiluminator)中暴露膜2-12个小时来检测信号。
在不存在瓦螨侵染时,在饲喂瓦螨-dsRNA的蜂巢和对照蜂巢中评价蜂群体健康的基本参数(封盖幼蜂的数量、蜂巢中蜂的数量、返回的采集蜂以及蜂蜜产量)。
虽然已结合其具体实施方案描述本发明,但明显的是,许多备选、修饰和变化对本领域技术人员而言显而易见。因此,意图包括落入所附权利要求的精神和宽广范围之内的所有这类备选、修饰和变化。
在本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均在本文中通过引用以其整体结合到本说明书中,引用程度如同具体和单独地指出各个单独的出版物、专利或专利申请通过引用结合于本文中一样。此外,不应将本申请中任何参考文献的加入、引用或确认解释为承认这类参考可作为本发明的先有技术。就使用节标题而言,不应将其解释为必要限制。
Claims (40)
1. 一种分离的核酸剂,所述核酸剂包含减量调节狄斯瓦螨基因产物的表达的核酸序列。
2. 权利要求1的分离的核酸剂,其中所述核酸序列与狄斯瓦螨特异性RNA的至少21个核苷酸互补并且能够诱导所述狄斯瓦螨RNA的降解。
3. 权利要求1的分离的核酸剂,其中所述核酸剂选自dsRNA、反义RNA和核酶。
4. 权利要求3的分离的核酸剂,其中所述dsRNA选自siRNA、shRNA和miRNA。
5. 权利要求1的分离的核酸剂,其中所述基因产物为编码选自以下的多肽的mRNA:ATP酶亚基A、RNA聚合酶I、RNA聚合酶III、凋亡抑制剂(IAP)、FAS凋亡抑制剂和α-微管蛋白。
6. 一种核酸构建体,所述核酸构建体包含编码权利要求1的分离的核酸剂的核酸序列。
7. 权利要求1的分离的核酸剂,其中所述核酸序列长度大于15个碱基对。
8. 权利要求7的分离的核酸剂,其中所述核酸序列长度为19-25个碱基对。
9. 权利要求7的分离的核酸剂,其中所述核酸序列长度大于30个碱基对。
10. 一种蜂可摄取的组合物,所述组合物包含至少一种核酸剂,所述核酸剂包含减量调节狄斯瓦螨基因产物的表达的核酸序列。
11. 权利要求10的蜂可摄取的组合物,其中所述至少一种核酸剂包含至少五种核酸剂,用于减量调节ATP酶亚基A、RNA聚合酶III、凋亡抑制剂(IAP)、FAS凋亡抑制剂和α-微管蛋白,所述至少五种核酸剂中的每一种都靶定不同的基因。
12. 权利要求10的蜂可摄取的组合物,其中所述至少一种核酸剂包含至少六种核酸剂,用于减量调节ATP酶亚基A、RNA聚合酶I、RNA聚合酶III、凋亡抑制剂(IAP)、FAS凋亡抑制剂和α-微管蛋白,所述至少六种核酸剂中的每一种都用于靶定不同的基因。
13. 权利要求11的蜂可摄取的组合物,其中所述核酸剂如SEQ ID No: 1、13、27、30和39所述。
14. 权利要求12的蜂可摄取的组合物,其中所述核酸剂如SEQ ID No: 1、4、7、10、13、16、19、22、25、27、30、33、36和39所述。
15. 权利要求10的蜂可摄取的组合物,其中所述组合物呈固体形式。
16. 权利要求10的蜂可摄取的组合物,其中所述组合物呈液体形式。
17. 权利要求10的蜂可摄取的组合物,其中所述组合物包含蛋白质。
18. 权利要求17的蜂可摄取的组合物,其中所述蛋白质呈花粉和/或大豆饼的形式。
19. 权利要求16的蜂可摄取的组合物,其中所述液体为蔗糖溶液。
20. 权利要求16的蜂可摄取的组合物,其中所述液体为玉米糖浆溶液。
21. 权利要求16的蜂可摄取的组合物,其中所述液体进一步包含碳水化合物或糖补充剂。
22. 一种预防或治疗蜂巢的狄斯瓦螨侵染的方法,所述方法包括给蜂施用有效量的至少一种包含减量调节狄斯瓦螨基因产物的表达的核酸序列的核酸剂,从而预防或治疗蜂巢的狄斯瓦螨侵染。
23. 权利要求22的方法,其中所述蜂为蜜蜂。
24. 权利要求23的方法,其中所述蜜蜂为采集蜂。
25. 权利要求23的方法,其中所述蜜蜂为蜂巢蜂。
26. 权利要求23的方法,其中所述蜜蜂为蜂群的蜂,且其中所述施用降低所述蜂群体对蜂群崩溃失调病的易感性。
27. 权利要求22的方法,其中所述施用通过饲喂来实现。
28. 权利要求27的方法,其中所述饲喂包括提供液体的蜂可摄取的组合物。
29. 权利要求27的方法,其中所述饲喂包括提供固体的蜂可摄取的组合物。
30. 权利要求23的方法,其中所述至少一种核酸剂包含至少五种核酸剂,用于减量调节ATP酶亚基A、RNA聚合酶III、凋亡抑制剂(IAP)、FAS凋亡抑制剂和α-微管蛋白,所述至少五种核酸剂中的每一种都靶定不同的基因。
31. 权利要求23的方法,其中所述至少一种核酸剂包含至少六种核酸剂,用于减量调节ATP酶亚基A、RNA聚合酶I、RNA聚合酶III、凋亡抑制剂(IAP)、FAS凋亡抑制剂和α-微管蛋白,所述至少六种核酸剂中的每一种都用于靶定不同的基因。
32. 权利要求30的方法,其中所述核酸剂如SEQ ID No: 1、13、27、30和39所述。
33. 权利要求31的方法,其中所述核酸剂如SEQ ID No: 1、4、7、10、13、16、19、22、25、27、30、33、36和39所述。
34. 一种预防或治疗蜂巢的狄斯瓦螨侵染的方法,所述方法包括给蜂施用有效量的权利要求6的核酸构建体,从而预防或治疗蜂巢的狄斯瓦螨侵染。
35. 一种降低蜜蜂对蜂群崩溃失调病(CCD)的易感性的方法,所述方法包括给蜜蜂施用有效量的至少一种双链核糖核酸(dsRNA),所述至少一种dsRNA包含与狄斯瓦螨mRNA的至少21个核苷酸互补且能够诱导所述狄斯瓦螨特异性mRNA降解的序列。
36. 权利要求35的方法,其中所述狄斯瓦螨mRNA编码选自以下的多肽:ATP酶亚基A、RNA聚合酶I、RNA聚合酶III、凋亡抑制剂(IAP)、FAS凋亡抑制剂和α-微管蛋白。
37. 权利要求35的方法,其中所述至少一种核酸剂包含至少五种核酸剂,用于减量调节ATP酶亚基A、RNA聚合酶III、凋亡抑制剂(IAP)、FAS凋亡抑制剂和α-微管蛋白,所述至少五种核酸剂中的每一种都靶定不同的基因。
38. 权利要求35的方法,其中所述至少一种核酸剂包含至少六种核酸剂,用于减量调节ATP酶亚基A、RNA聚合酶I、RNA聚合酶III、凋亡抑制剂(IAP)、FAS凋亡抑制剂和α-微管蛋白,所述至少六种核酸剂中的每一种都用于靶定不同的基因。
39. 权利要求37的方法,其中所述核酸剂如SEQ ID No: 1、13、27、30和39所述。
40. 权利要求38的方法,其中所述核酸剂如SEQ ID No: 1、4、7、10、13、16、19、22、25、27、30、33、36和39所述。
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