MX2011006415A - Metodo, aparato y sistema para diagnostico de estres y enfermedades en plantas mas altas. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un método, un aparato y un sistema para diagnóstico rápido de estrés y enfermedades en plantas más altas. La metodología propuesta se basa en la hipótesis de que cuando una planta está en desequilibrio; existen cambios en su metabolismo que presentan una alteración de la composición química de sus órganos. Esta alteración química lleva a un cambio en las propiedades físicas, tal como la fluorescencia de las hojas. Debido a la complejidad del material de las hojas, el presente método propone que la señal se trate con métodos estadísticos y que se haga la clasificación a través de software con base en aprendizaje de máquina. Como un ejemplo de la aplicación de la invención, los resultados se muestran para la enfermedad de Greening en cítricos. Actualmente, el Greening es la enfermedad cítrica más severa ya que no hay tratamiento disponible para ésta y debido a su alto índice de diseminación y al hecho de que afecta todas las variedades de árboles de naranja, el diagnóstico que se realiza a través de inspección visual, que presenta alta subjetividad, alto porcentaje de error y enfermedad únicamente se diagnostica después de la expresión de los síntomas (-8 meses). Durante la fase asintomática, el árbol infectado es una fuente de diseminación de la enfermedad. La presente invención puede realizar el diagnóstico asintomático de la enfermedad de Greening de la hoja con un porcentaje de diagnóstico correcto superior al 80%.

Description

METODO, APARATO Y SISTEMA PARA DIAGNOSTICO DE ESTRES Y ENFERMEDADES EN PLANTAS MAS ALTAS Campo de la Invención La presente invención se refiere a un método, un aparato y un sistema para el rápido diagnóstico de estrés y enfermedades en plantas más altas. Se presentará como un ejemplo el caso de la enfermedad de Greening en los cítricos en donde el diagnóstico se realiza a partir de la hoja al utilizar el aparato con base en espectrometría de fluorescencia que contiene software para el tratamiento y la clasificación de los datos.

Antecedentes de la Invención Brasil, desde el principio de los años 90, permanece como el mayor productor mundial de naranja, siendo responsable del 80% del comercio internacional de jugo de naranja concentrado y congelado. Con el fin de obtener esta producción, estimada en 900 millones de dólares estadounidenses, se gasta un ingreso de aproximadamente 410 millones de dólares estadounidenses, llevando a aproximadamente 1.5 billones de dólares estadounidenses en transacciones que involucran la comercialización de productos cítricos, tal como jugos y fruta fresca (FNP Consultoria & Comércio, 2008. Disponible en <http: //www. fnp. com.br/agricultura/citros/prod_area_laranj a.php> acceso el 23 septiembre, 2008) . El segundo mayor productor son los Estados Unidos, seguido por México, China y España. España y los Estados Unidos son los principales exportadores de fruta fresca, que corresponde, respectivamente, a 38 y 18% de las exportaciones mundiales (BOTEON, M. VIDAL, A.J. Citricultura no Brasil e na Florida. Citricultura Atual, n. 23, p. 3, 2001.

El estado de Sáo Paulo (Brasil) tiene aproximadamente 34.2 millones de plantas en desarrollo y 163.5 millones de plantas cíclicas en producción, que refleja más de 80% de la producción nacional de frutas cítricas. Actualmente, el responsable del 97% de las exportaciones brasileñas, siendo el gran núcleo dinámico del complejo de cítricos brasileño. Este mercado es responsable de aproximadamente 1.5 billones de dólares estadounidenses de divisa para el país, el estado y las ciudades y emplea 400 mil personas. El parque de cítricos de Sáo Paulo junto con una región en Minas Gerais conocida como "Triángulo Mineiro" presenta 198 millones de árboles. La cosecha de naranjas se realiza todo el año debido a la composición de las variedades tal como "Hamlin", "Lima", "Pera", "Seleta", "Bahía", "Natal", "Valéncia" y "Folha Murcha" . Entre éstas, algunas son apropiadas para la producción de jugo, tal como "Pera", que representa 36% del total de los árboles, seguido por Valéncia", "Natal" y "Hamlin", respectivamente con 17, 25 y 7% (BARROS, M.H.C.; BOTEON, . O Brasil é o único país que produz o ano inteiro. Hortifruti Brasil, v. 3, p. 21, 2002).

Con el avance de la tecnología en el campo, las plantas comenzaron a multiplicarse mediante injerto, lo que presentó grandes ventajas con respecto a la precocidad y a la uniformidad de los huertos. Sin embargo, al mismo tiempo se reduce la variabilidad, haciendo el cultivo un objetivo constante a varias plagas y enfermedades que, cuando se enfrentan con condiciones favorables para su desarrollo, son capaces de causar daño irreversible. Los costos fitosanitarios , junto con los fertilizantes, son superiores al 60% del costo de producción. La calidad y la cantidad de las frutas cítricas se ven frecuentemente amenazadas debido al daño dejado en las plantas, que, dependiendo de la intensidad del ataque, pueden hacerla improductiva o llevarla a su erradicación.

A mediados del 2004 se reportó una nueva enfermedad en los huertos de Sao Paulo. Una enfermedad devastadora sin cura originada desde Asia y Africa. Huanglongbing (HLB) , también conocido como Greening, es actualmente la enfermedad más temida entre los productores de naranja debido al hecho de que no posee cura o tratamiento, ya que tiene un alto índice de diseminación y afecta todas las variedades comerciales de naranja. La solución más eficiente hasta este momento con el fin de minimizar las pérdidas es la erradicación de las plantas tan pronto como se confirma un diagnóstico positivo de la enfermedad.

La enfermedad de Greening tiene como agente causante una bacteria que vive en el floema de la planta huésped, que se conoce como Candidatus Liberibacter . Existen tres tipos de bacterias relacionados al Greening, Candidatus Liberibacter africanus, Candidatus Liberibacter asiaticus y Candidatus Liberibacter americanus, siendo la última el principal agente causante en el estado de Sao Paulo. Los síntomas de Greening son visualmente los mismos, sin importar en donde ocurre la enfermedad. Inicialmente , los síntomas aparecen en las ramas , que son evidentes debido a la coloración amarilla contrastante con la coloración verde de las hojas de las ramas no afectadas. Las hojas presentan una coloración amarillo pálido, con sectores verdes, presentando puntos irregulares y asimétricos (moteado) . La fruta se deforma y se vuelve asimétrica. La parte blanca de la cascara, en algunos casos, presenta un grosor superior al normal . También puede ocurrir la reducción en el tamaño de la fruta y la caída intensa.

Debido a la falta de una cura, la enfermedad de Greening es, actualmente, la enfermedad más temida en el cultivo de cítricos. Ya fue responsable de la erradicación de más de 2 millones de árboles cítricos y la gran mayoría de ellos estaba en la temporada de productividad más alta.

En particular, el cultivo de cítricos del estado de Sao Paulo presenta algunas características peculiares que llevan a una alta vulnerabilidad del cultivo a la ocurrencia de epidemias conocidas tal como enfermedad de decaimiento, y de nuevas enfermedades, tal como en la Muerte Súbita de Cítrico (CSD, por sus siglas en inglés) y la enfermedad de Greening, presentando importantes consecuencias a la sostenibilidad del negocio agrario: 1) los huertos de cítricos del estado de Sao Paulo ocupan un área casi continua de aproximadamente 615,300 ha (FNP. Citrus . AGRIANUAL 2003: anuário da agricultura brasileira. FNP consultoria & agroinformativos , Sao Paulo, p.295-314, 2003.), sin grandes variaciones de relieve o barreras físicas y con un alto tráfico de gente entre ellos; 2) las plantas cítricas son perennes y, por lo tanto, están expuestas todo el año y durante varios años al ataque de plagas y enfermedades. Además de eso, puede observarse la emisión de nuevos retoños durante una gran parte del año, que confiere una continuidad de tejido susceptible y de inoculación entre las temporadas de cultivo; 3) los huertos del estado de Sao Paulo presentan una variabilidad genética muy baja. Unicamente cuatro variedades de naranja dulce (Citrus sinensis Osbeck) : *Péra-Rio', 'Natal', Valencia' y 'Hamlin' , propagadas vegetativamente a través de injerto, representan 92% del cultivo de cítricos brasileños. el rizoma utilizado en aproximadamente 85% de los árboles es lima 'Cravo' (C. limonia Obeck) debido a su rusticidad, vigor conferido a la copa y resistencia a la deficiencia hídrica del norte y el noroeste del estado.

Actualmente, existen algunos métodos de diagnóstico para la enfermedad de Greening. El diagnóstico más común se realiza a través de la inspección visual de hojas que presentan los síntomas de la enfermedad. El control de la enfermedad de Greening en el estado de Sao Paulo y en el "Triángulo Mineiro" se ha logrado a través de inspecciones visuales periódicas realizadas por técnicos de Fundecitrus o gente entrenada por ellos. Este método tiene como sus características un alto índice de subjetividad y un alto porcentaje de error, además del hecho de que la enfermedad únicamente se diagnostica después de la expresión de los síntomas, que es, después de un largo período de fase asintomática del árbol (aproximadamente 8 meses) . Durante la fase asintomática de la enfermedad, el árbol infectado es una fuente invisible de diseminación de la enfermedad que lleva a un retraso muy largo en la erradicación del árbol. Sin embargo, después de la visualización de los síntomas, el desarraigo es la única cuestión actual de control de la enfermedad .

El documento JP2006267092 -A describió un kit de detección para enfermedad de Greening en etapas tempranas, con base en la región de la caída en las , concentraciones de manganeso y hierro en los tejidos del árbol infectado. El procedimiento de detección incluye la obtención de un extracto soluble en agua de material de planta que contiene un sistema amortiguador, seguido por el análisis de espectrometría de absorción. La determinación de enfermedad, sin embargo, no es específica, ya que las bajas concentraciones de manganeso y hierro en una planta pueden ser debido a varias causas fisiológicas, incluyendo la deficiencia de estos minerales en la nutrición de la planta. En una forma análoga, el documento JP2004264101-A reclama la detección de la enfermedad de Greening en extractos de planta a través del análisis de la concentración de almidón a través de la reacción de yodo, presentando de esa forma, la misma desventaja en la falta de especificidad fisiológica de la deficiencia .

Un método descrito del documento O2007021485-A2 promete la detección de la bacteria causante de Greening, entre la detección de varios otros patógenos y contaminantes químicos de plantas y animales, utilizando el efecto Raman de dispersión de radiación polarizada aplicada. Sin embargo, la detección se condiciona a muestras acuosas que se envían a un tratamiento complejo que incluye secado sobre superficie metálica coloidal, seguido por contacto con membrana de ultrafiltración.

El Apta Citrus, afiliado al Instituto Agronómico de Campiñas (IAC) , es el único centro en el estado de Sao Paulo para proporcionar reportes técnicos para el diagnóstico de enfermedad de Greening. Este reporte se basa en una técnica llamada Reacción de Cadena de Poli erasa (PCR, por sus siglas en inglés) , que consiste en el análisis genético de las hojas en búsqueda del ADN de la bacteria causante de Greening. Sin embargo, la detección del ADN de bacteria es únicamente posible en hojas sintomáticas (moteadas) , e incluso entonces, puede fallar en 10% de los casos. Para el diagnóstico en hojas asintomáticas (sin signos visibles de la enfermedad) , el IAC utiliza una variación más compleja de la técnica llamada PCR en tiempo real, cuya sensibilidad es al menos 1000 veces más alta que la técnica convencional. Sin embargo, en función de su complejidad, la PCR en tiempo real no se ha utilizado en exámenes de rutina, únicamente para trabajo científico. Incluso aunque la técnica PCR es altamente eficiente, es costosa y laboriosa (BOVÉ, J. M. History, etiology, field Identification, transmission, and world distribution of huanglongbing : a destructive> ne ly-emerging, century-old disease of citrus. Huanglongbing Greening International Workshop, v. 1, p. 1, 2006). El costo del análisis por muestra, utilizando la PCR convencional, es aproximadamente 25.00 dólares estadounidenses y un reporte puede tomar aproximadamente 20 días. El uso de PCR en gran escala es económicamente inviable; además del hecho de que produce una cartografía de infestación que está retrasada muy temporalmente. Por otro lado, el documento CN1824802-A reclama la detección de los árboles asintomáticos únicamente 3 horas después del muestreo, pero se restringe a la detección causada por la bacteria Candidatus Liberibacter asiaticum Jagoueix y al cítrico del tipo mandarina.

Es en este momento cuando la fluorescencia se vuelve una disposición relativamente simple y eficiente que puede hacer una diferencia. La fluorescencia es una técnica que permite la detección de alteraciones químicas que ocurren en las hojas de la planta afectada por Greening y por otras enfermedades antes de la percepción de sus manifestaciones visuales.

En el documento BR200201249-A, la auto-fluorescencia de las hojas, frutas y ramas permite la detección de la úlcera cítrica en cítricos asintomáticos, después de la exposición a fuentes de luz con longitud de onda corta. Sin embargo, la técnica está limitada a la detección de esta enfermedad, causada por la bacteria Xanthomonas axonopodis pv. citri.

Esta invención desarrollada en el Embrapa Instrumentagao Agropecuária (Embrapa Instrumentación Agropecuaria) tiene como su objetivo proteger una nueva metodología de diagnóstico y un aparato para diagnosticar estrés y enfermedades en plantas más altas, tal como la ' enfermedad de Greening en los cítricos. Un trabajo previamente realizado en el Laboratorio de Óptica y Lásers de Embrapa Instrumentacáo Agropecuária (LOLEIA por sus siglas en portugués) (documento PI 05059757-7) , demostró la posibilidad de distinción de hojas sanas de enfermas, y también, de distinción de enfermedades (CSD y decaimiento) a través de la relación del máximo del espectro de emisión de fluorescencia al utilizar espectrómetros comerciales. La idea básica de la metodología propuesta fue la siguiente: cuando una planta alcanzó un desequilibrio, que se provoca por el estrés o por enfermedad, ocurren cambios en su metabolismo que llevan a una alteración de la composición química de sus ó ganos. Este cambio químico lleva a un cambio en las propiedades físicas, tal como, por ejemplo, reflectancia y florescencia de las hojas. Con base en esta hipótesis, se desarrolló un estudio de laboratorio al utilizar un aparato comercial, con respecto a la emisión de fluorescencia de las hojas de hojas de cítricos sanas y enfermas. La posibilidad de distinción de árboles sanos, árboles con Decaimiento o CSD se observa través de la relación de picos de emisión de florescencia, método descrito en PI 05059757-7.

En la solicitud de patente PI 05059757-7, la idea de un módulo portátil que realiza medidas espectroscópicas en hojas se protegió para el diagnóstico de muerte súbita de cítrico con estimulación al utilizar una bombilla, un led o un láser en el intervalo de 420 a 480 nm. En el 2006, el LOLEIA desarrolló un sistema al utilizar espectroscopia de fluorescencia inducida por láser (LIFS, por sus siglas en inglés) , similar a la propuesta en el documento PI 05059757-5, con una sonda construida con fibra óptica y un sistema de detección constituido de un grupo de fotodiodos calibrados que permite la obtención del espectro de emisión de la hoja en una forma extremadamente rápida (~ ls) y estimulación con láser a 470 nm. Con este nuevo sistema, se volvió posible analizar un gran volumen de muestras en tiempo reducido. En ese momento, la enfermedad de Greening ya se consideraba la enfermedad más severa del sector cítrico brasileño, y, por lo tanto, LOLEIA inició una investigación con el fin de evaluar la posibilidad de diagnóstico de Greening al utilizar espectroscopia de fluorescencia. Con los resultados preliminares, se puede observar que la mejor distinción para la enfermedad de Greening se observó con otro láser con una estimulación de longitud de onda de 561 nm. Con el módulo portátil reformulado, se realizó un estudio de discernimiento para evaluar la posibilidad del diagnóstico de Greening a través de las hojas. De este estudio, resultó en una nueva metodología de diagnóstico de enfermedad diferente a la de la solicitud de patente PI 05059757-7 (para CSD) .

Incluso aunque la metodología actual utiliza un aparato similar protegido para la CSD, con diferente longitud de onda de estimulación, el sistema como un todo es totalmente diferente y se discutirán a continuación las diferencias principales .

En el sistema actual, no se utilizan las relaciones de picos como en el documento PI 05059757-7. Se desarrolló un software para recolectar los espectros de fluorescencia y para realizar un tratamiento estadístico de ellos (Figuras 1 y 2) con el fin de evaluar en la forma de más discernimiento todo el espectro de emisión para obtener un número más alto de información que permita un diagnóstico más preciso de las enfermedades .

Después de tratarse por el método estadístico de Análisis de Componente Principal (PCA, por sus siglas en inglés) , se definieron claramente aglomeraciones en las gráficas tridimensionales de los primeros componentes principales como se muestra en la Figura 3.

Ya que el sistema se vuelve más sensible, también se distingue la variedad de la copa y del rizoma, razón por la cual se elaboró otra solicitud de patente con este tema, el "Método e Equipamento para Certificagao de Mudas de Citros" (Método y Equipo para Certificación de Semilleros Cítricos) . De esta forma, para cada combinación de copa y rizoma, se realizó un proceso de calibración de sistema. Para cada combinación de copa y rizoma, se utilizó un grupo de muestras que contienen hojas sanas y enfermas con el fin de proporcionar información al sistema de espectros típicos de cada clase de muestras. En general, se evaluaron las siguientes clases: muestras sanas, muestras enfermas que presentan Greening en la fase sintomática, muestras enfermas que presentan Greening en la fase asintomática, con CSD y con decaimiento.

Al utilizar herramientas de aprendizaje de máquina, se desarrolló otro software de tal forma que se utilizó la base de datos de calibración en una forma que el sistema puede ser capaz de medir una hoja totalmente desconocida y clasificar el estado del árbol como sano o enfermo, y, si está enfermo, identificar la enfermedad. En el caso de enfermedad de Greening, fue posible identificar la enfermedad en la fase sintomática así como en la fase asintomática. Este resultado muestra el gran potencial de la técnica para permitir la realización del diagnóstico temprano de la enfermedad.

En la patente de CSD, el análisis de espectroscopia se realizó únicamente después de la obtención de un mapa del huerto a través de imágenes de fluorescencia, que realizó una distinción de árboles sanos de los enfermos. En la patente actual, el diagnóstico se realiza al utilizar únicamente la espectroscopia de fluorescencia.

Por lo tanto, diferente de la patente PI 05059757-7, el aparato ya que estaba protegido per se no es capaz de realizar un diagnóstico automático. El sistema completo necesita el software de adquisición y el tratamiento estadístico de los datos, la base de datos de calibración y el software de clasificación. De esta forma, en esta patente, se solicita la protección del sistema completo compuesto por el aparato para la realización de medidas de espectroscopia de fluorescencia, el software de adquisición y el tratamiento estadístico de los datos, la base de datos y el software de clasificación para la realización del diagnóstico de Greening a través de las hojas de cítrico.

Sumario de la Invención La presente invención muestra que el estrés y las enfermedades en plantas más altas, tal, como Greening, por ejemplo, el principal problema actual del cultivo de cítricos brasileño, pueden detectarse en una forma rápida, precisa, temprana y económicamente viable por los medios de espectroscopia de fluorescencia realizados directamente en las hojas y otras partes de la planta, junto con la creación de una base de datos y modelos de predicción o discriminación estadística, matemática y/o computacional de aprendizaje de máquina, que contribuyen, de esta forma, al control de enfermedades.

La primera modalidad de la presente invención es un Método para el diagnóstico de enfermedades y estrés en plantas más altas, particularmente Greening, en donde están comprendidos los siguientes pasos: a) calibrar el software de clasificación, recolectando el espectro de emisión de al menos 150 hojas de los árboles enfermos y 150 hojas de los árboles sanos; b) recolectar al menos 03 hojas de cada árbol geo-referenciado del huerto para analizarse; c) detectar y medir el espectro de emisión de fluorescencia de todas las hojas recolectadas en (b) ; d) analizar los espectros generados en (c) ; y e) generar un reporte para cada árbol; f) con base en las coordenadas y en el reporte para cada árbol, la construcción de un mapa de estado de salud del huerto.

Una segunda modalidad de la presente invención es un aparato para el diagnóstico de enfermedades en plantas más altas en donde comprende una fuente de estimulación, un cable óptico de estimulación, un filtro óptico ajustable, un adaptador de fibra óptica, un cable óptico mezclado, una sonda, un cable óptico de emisión, un mini espectrómetro y un software de clasificación de procesamiento de datos.

Una modalidad adicional de la invención es un sistema en donde el método se utiliza para el diagnóstico de enfermedades y estrés en plantas más altas en asociación con un aparato de espectroscopia para el diagnóstico de enfermedades y estrés en plantas más altas, a través de la espectroscopia de emisión de fluorescencia.

Breve Descripción de las Figuras La Figura 1, impresión de pantalla del software de adquisición .

La Figura 2, impresión de pantalla del software para el tratamiento de datos .

La Figura 3, gráfica de los tres primeros componentes principales generados de los espectros de emisión de fluorescencia capturados mediante el sistema portátil desarrollado por LOLEIA para árboles de naranja dulce ("Pera") en rizoma Sunky sano (38), con Greening sintomático (39) y asintomático para Greening (40) .

La Figura 4, impresión de pantalla del software de clasificación que resalta la ventana de clasificación (41) .

La Figura 5, el aparato para el diagnóstico de la enfermedad de Greening.

La Figura 6, espectros de emisión típicos de hojas de naranja Hamlin con rizomas de lima "Cravo" obtenidos en el sistema portátil de LIFS desarrollado y construido en LOLEIA.

La Figura 7, gráficas PCA generadas a través de los espectros de hojas del árbol de naranja Hamlin con rizomas de lima "Cravo" sanos y enfermos con AG, SG, CSD y Decaimiento en la temporada lluviosa. Todos los espectros se obtuvieron en el sistema portátil de LIFS desarrollado y construido en LOLEIA.

Descripción Detallada de la Invención Al principio, con el fin de desarrollar el método propuesto en esta invención, se realizó una caracterización de espectroscopia de las hojas y pigmentos fotosintéticos extraídos de las hojas con el fin de observar las diferencias espectrales entre un material sano y uno enfermo, al utilizar un espectrómetro de fluorescencia convencional.

Después de este estudio, se realizaron alteraciones en un aparato desarrollado para el diagnóstico de CSD (PI 05059757-7) con el fin de hacer posible el diagnóstico de Greening. Sin embargo, no fueron suficientes las modificaciones restringidas a alteraciones ópticas en el aparato.

En la Figura 5, se muestra una representación esquemática del nuevo sistema desarrollado, objeto de la presente invención. 42-hojas de cítrico para analizarse; 43-sonda; 44-cable óptico; 45-adaptador de fibra óptica; 46-filtro regulable; 47-fibras ópticas de estimulación; 48 -láser de diodo; 49-fibra óptica de emisión; 50-mini espectrómetro; 51-computadora portátil; 52-tratamiento de señal/datos; 53 -base de datos; 54 -software de clasificación; 55 -reporte; en la inserción se muestra el perfil lateral de la sonda (56), que contiene las siguientes partes: 57-fibras ópticas de estimulación; y 58 -fibra óptica de emisión.

Se desarrolló una nueva metodología para el diagnóstico de Greening que también es el objeto de la presente invención. La metodología está compuesta de tres pasos: 1 - Construcción de una base de datos - inicialmente, el sistema requiere una base de datos con información de espectros de emisión de florescencia posibles de una hoja de una combinación dada de copa y rizoma. Con el fin de lograr eso, se recolectaron al menos 150 hojas de árboles sanos, 150 hojas de árboles enfermos sintomáticos y 150 hojas de árboles enfermos asintomáticos . Los espectros de estas 450 hojas se capturaron mediante el aparato de la presente solicitud, cuya patente se está solicitando, y se tratan mediante los métodos estadísticos a través de un software también desarrollado especialmente para este aparato.

El programa desarrollado para la recolección de los datos permite el ajuste de varios parámetros de adquisición (Figura 1) , entre los cuales está el tiempo de integración (en ms) , que es el intervalo de tiempo en el cual el mini espectrómetro recolecta luz antes de enviar al programa la información sobre el espectro (1) . También permite modificar el número de recolecciones que realiza el programa con el fin de componer, a través de cálculo promedio, un espectro individual (2) ; que es un procedimiento útil en la reducción de ruido. Aún existe el ajuste de vagón (3) , que controla la intensidad del alisamiento del espectro aplicado mediante el programa .

Otra clase de elementos ajustables en la pantalla principal es considerando la visualización de los espectros recolectados. Es posible determinar los límites de longitud de onda inferiores y superiores exhibidos en la pantalla', en nm (4), así como los límites de intensidad (5), en unidades arbitrarias. Incluso es posible visualizar uno o más espectros recolectados, así como removerlos de la pantalla posterior (6) . En este caso, los espectros se exhiben en diferentes colores, y el usuario tiene la opción de aceptar o deshabilitar un subtítulo (7) generado automáticamente.

En el caso de la presencia de la presencia de más de un espectro en la pantalla, es necesario que el usuario especifique cuál de ellos debe guardarse en la base de datos (8) . Con el fin de guardar un espectro, sin embargo, es necesario proporcionar la descripción de éste, tal como la naturaleza de estimulación que genera (9) y de la muestra analizada. Los datos obligatorios sobre la muestra son: las variedades de rizoma (10) y las variedades de copa (11) , la enfermedad que está infectando la planta (12) y el área de origen de ésta (13) . El conjunto de opciones para cada uno de los casos puede evitarse al dar clic en el botón derecho de los campos respectivos.

Todavía hay datos sobre la muestra que deben llenarse por el mismo usuario: el número de la parcela (14), de la calle (15) , del número (16) , que identifican la planta y la fecha de la recolección de la muestra (18) . El número de la hoja (17) se atribuye automáticamente por el programa, con el fin de evitar confusión en el caso de existencia de más de una muestra procedente de la misma planta. La fecha de adquisición de . espectro (19) también se registra automáticamente. El programa incluso permite el registro de observaciones adicionales que el usuario puede necesitar hacer sobre la muestra en cuestión (20) .

A través de la pantalla de adquisición el usuario también puede iniciar o interrumpir la visualización instantánea de los datos en la pantalla (21) , acceder a la configuración del mini espectrómetro (22) y, finalmente, guardar en la base de datos el espectro actualmente seleccionado, junto con la información insertada en los campos respectivos (23) .

El análisis de los datos almacenados (Figura 2) debe identificarse por un nombre elegido por el usuario (24) . Este también debe seleccionar el intervalo de espectros que se van a utilizar en el análisis (25) y especificar el número de separadores decimales para tomarse en consideración (26) . Aún existe la opción de elegir el valor límite de la desviación estándar asociada con cada longitud de onda, se hace caso omiso de variables con la desviación estándar que es inferior a su límite, con el fin de evitar la ocurrencia de división por cero (27) . Se evita otro problema a través del establecimiento de una diferencia mínima entre dos longitudes de onda como requisito para la consideración por el programa como variables distintas (28) . Esto previene que cualquier diferencia mínima ocasional de redondeo del valor de longitud de onda realizado por el programa resulte en error en el análisis. También existe un campo disponible (29) para que el usuario registre las observaciones sobre el análisis en cuestión.

Es posible seleccionar los espectros que se visualizan en la pantalla (31) , para elegir distinguirlos o no, a través del empleo de diferentes colores (33) , para excluir del análisis los espectros seleccionados (32) o exportarlos en un formato que es compatible con otros programas (37) .

Los procedimientos de análisis disponibles son el cálculo del cociente entre las intensidades de los puntos máximos y mínimos y el PCA. En el primer caso, el usuario puede elegir los límites de los dos intervalos, en donde se calculará el punto máximo (o mínimo) que se utilizará para la determinación de índice (30) , y también puede visualizar gráficamente el resultado (35) . En el segundo caso, el usuario debe elegir tres componentes principales (34) con el fin de visualizar la gráfica tridimensional que los contiene (37) .

De esta forma, se obtiene una gráfica tridimensional (Figura 3) con aglomeraciones que separan las diferentes clases de árboles (sano (38) , sintomático (40) y asintomático (39)) y una base de datos con información característica de cada clase de muestra. 2 - Software de clasificación - al utilizar herramientas de aprendizaje de máquina, estadísticas y/o matemáticas y la base de datos, se desarrolla un modelo de clasificación.

En la Figura 4, se indica (41) la ventana en donde se muestra el diagnóstico de hoja. La clasificación es prácticamente instantánea para el espectro que se acaba de guardar y el diagnóstico proporcionado de conformidad con los criterios de un clasificador previamente generados. Junto con el resultado, la pantalla exhibe un estimativo del grado de confianza del diagnóstico realizado (41) . El usuario tiene la opción de cambiar, en cualquier momento, el clasificador en uso por otro que esté disponible en la base de datos del programa. 3 - Evaluación de huerto - se recolectan al menos tres hojas de cada árbol del huerto. Se geo-referencian los árboles con el fin de presentar la construcción del mapa de infestación. Se mide el espectro de emisión de las hojas y se obtiene el reporte para cada árbol mediante la prevalencia del diagnóstico resultante de las hojas recolectadas. De esta forma, cada árbol geo-referenciado tiene un reporte y es posible construir un mapa de infestación.

En experimentos realizados con el nuevo aparato y la metodología en una parcela de 1000 árboles de naranja "Pera" en rizomas de lima "Cravo" se obtuvo un índice de resultados correctos superior a 80%, incluso en árboles asintomáticos .

Ejemplo En la gráfica de la Figura 6, se presentan espectros típicos obtenidos en el sistema portátil con láser en 561 nm para Hamlin en rizomas de lima "Cravo" . Este conjunto de muestras presenta plantas sanas (59) , con Decaimiento (60), con Muerte Súbita de Cítrico (61), con Greening asintomático (62) y Greening sintomático (63) .

Los análisis PCA se realizaron con los datos del conjunto completo de hojas recolectadas para una mejor separación de enfermedades, como se muestra en la Figura 7, que contienen el mismo tipo de muestras: sano (64) con CSD (65) , con Decaimiento (66) , con Greening asintomático (67) y con Greening sintomático (68) .

A partir de este conjunto de datos, se construyó un software cuyo modelo de clasificación es capaz de realizar diagnóstico de hojas Hamlin en rizomas de lima "Cravo" con una precisión sobre el 80%.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (25)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. - Un método para diagnóstico de enfermedades y estrés en plantas más altas, en donde se utiliza espectroscopia, caracterizado porque consiste de los siguientes pasos: a) calibrar el software de clasificación, recolectando el espectro de emisión de al menos 150 hojas de los árboles enfermos y 150 hojas de los árboles sanos; b) recolectar al menos 03 hojas de cada árbol geo-referenciado del huerto para analizarse; c) detectar y medir el espectro de emisión de fluorescencia de todas las hojas recolectadas en (b) ; d) analizar los espectros generados en (c) ; y e) generar un reporte para cada árbol; f) con base en las coordenadas y en el reporte para cada árbol, la construcción de un mapa de estado de salud del huerto.

2. - El método para diagnóstico de enfermedades y estrés en plantas más altas de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es para el diagnóstico de enfermedad de Greening en los cítricos .

3.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque es para el diagnóstico de enfermedad de Greening en cítricos con diferentes combinaciones de copa y rizomas .

4. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se utiliza para la elaboración de un mapa de salud del huerto.

5. - El método para el diagnóstico de enfermedades y estrés en plantas más altas de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la señal se difracta y detecta mediante un mini espectrómetro.

6. - El método para el diagnóstico de enfermedades y estrés en plantas más altas, de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la calibración previa del sistema se realiza al utilizar herramientas de aprendizaje de máquina.

7. - El método para el diagnóstico de enfermedades y estrés en plantas más altas, de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque utiliza un software de clasificación dedicado al sistema.

8. - El método para el diagnóstico de enfermedades y estrés en plantas más altas de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las variaciones en los espectros de fluorescencia reflejan el resultado de alteraciones en la composición química de los constituyentes de las plantas .

9. - El método para el diagnóstico de enfermedades y estrés en plantas más altas de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque los constituyentes son fluorescentes.

10. - El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque los constituyentes fluorescentes son pigmentos fotosintéticos de la planta.

11. - El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque los constituyentes fluorescentes son, principalmente, clorofila a y b, y algunos pigmentos de accesorio, tal como carotenoides y xantófilas.

12. - El método para el diagnóstico de enfermedades y estrés en plantas más altas de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque las hojas son fluorescentes bajo longitud de onda entre 600 y 800 nm.

13. - El método para el diagnóstico de enfermedades y estrés en plantas más altas de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque la longitud de onda utilizada para el diagnóstico de la enfermedad de Greening es aproximadamente 561 nm.

1 . - Un aparato para el diagnóstico de enfermedades y estrés en plantas más altas, caracterizado porque comprende una fuente de estimulación, un cable óptico de estimulación, un filtro óptico ajustable, un adaptador de fibra óptica, un cable óptico mezclado, una sonda, un cable óptico de emisión, un mini espectrómetro y un software de clasificación de procesamiento de datos .

15. - El aparato para el diagnóstico de enfermedades y estrés en plantas más altas de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la fuente de estimulación de fluorescencia es una bombilla, un led o un láser.

16. - El aparato de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la fuente de estimulación de fluorescencia emite radiación en el intervalo UV hasta ser visible (200 a 700 nm) .

17. - El aparato de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la luz de estimulación se conduce a la hoja a través de fibra óptica.

18. - El aparato de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la captura de señal se realiza a través de fibra óptica.

19. - El aparato de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la señal se difracta mediante la rejilla de difracción.

20.- El aparato de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el software de diagnóstico y de análisis utiliza aprendizaje de máquina, modelos estadísticos y/o matemáticos.

21.- El aparato de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque es responsable de realizar las medidas espectrométricas de emisión de fluorescencia .

22.- El aparato de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el cable óptico mezclado comprende fibras ópticas de estimulación y fibras ópticas para capturar la emisión.

23. - El aparato de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el cable óptico mezclado comprende 6 fibras ópticas de estimulación y 1 fibra óptica para capturar la emisión.

24. - El aparato de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la detección de la señal ocurre a través de la disposición de fotodiodos calibrados .

25. - Un sistema caracterizado porque el método de conformidad con la reivindicación 1, se utiliza en asociación con un aparato de conformidad con la reivindicación 14 para el diagnóstico de enfermedades y estrés en plantas más altas, a través de la espectroscopia de emisión de fluorescencia.