CN102405405B - 用于诊断高等植物的应激和疾病的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及快速诊断高等植物的应激和疾病的方法、装置和系统。所提出的方法基于以下假设，即：当植物处于失衡状态时，其新陈代谢存在变化，导致其器官的化学成分变化。该化学变化导致树叶的物理性质如荧光性的变化。由于树叶材料的复杂性，本发明的方法提出了用统计方法来处理信号以及通过基于机器学习的软件来进行分类。作为本发明的应用的示例，显示了对于柑橘属植物的青果病的结果。当前，因为没有治疗方法对其可用，并且由于其高散播率以及其影响所有品种的橙树的事实，青果病是最严重的柑橘属植物疾病；是通过视觉检查进行的诊断，其带来高主观性、高误差百分率，并且疾病仅仅在症状表现后(～8个月)才被诊断。在无症状阶段期间，被感染的树木是疾病的散播源。本发明能够以高于80％的正确诊断百分率根据树叶进行青果病的无症状诊断。

Description

用于诊断高等植物的应激和疾病的方法

技术领域

本发明涉及用于快速诊断高等植物的应激(stress)和疾病的方法、装置和系统。将柑橘属植物的青果病情况作为示例，其中使用基于荧光光谱测定法的含有用于数据的处理和分类的软件的所述装置根据叶子进行诊断。

背景技术

从90年代以来，巴西一直作为世界上主要的橙产地，承担浓缩和冷冻橙汁的80％的国际贸易。为了获得这样的产量——估计为9亿美元——大约花费了4.1亿美元的投入，带来大约15亿美元的涉及营销柑橘属植物产品(如果汁和新鲜水果)的交易(FNP Consultoria & Comércio，2008。可以在2008年9月23日的<http://www.fnp.com.br/agricultura/citros/prod_area_laranja.php>地址获得)。第二主要产地是美国，之后是墨西哥、中国和西班牙。西班牙和美国是新鲜水果的主要出口国，分别对应于38％和18％的世界出口量(BOTEON，M.；VIDAL，A.J.Citricultura no Brasil e na Flórida.Citricultura Atual，n.23，p.3，2001)。

圣保罗州(巴西)具有大约3420万种处于开发中的植物和1.635亿种在生产中的柑橘属植物，反映了多于80％的柑橘属水果全国产量。当前，其承担97％的巴西出口量，是巴西柑橘属植物综合企业的品牌发展核心。该市场承担地区、州和城市大约15亿美元的流通，并且雇用40万人。圣保罗的柑橘属植物庄园连同称为“ Mineiro”的Minas Gerais中的区域具有1.98亿棵树。由于诸如“Hamlin”、“Lima”、 “Seleta”、“Bahia”、“Natal”、 和“Folha Murcha”等品种的组合，全年都在收获橙子。其中，一些适于生产果汁，如 其占全体果树的38％，之后是 “Natal” 和“Hamlin”，分别是17％、25％和7％(BARROS，M.H.C.；BOTEON，M..O Brasil éo único que produz o ano inteiro.Hortifruti Brasil，v.3，p.21，2002.)。

随着该领域技术的进步，植物开始通过嫁接而繁殖，这在果园的早熟性和统一性方面提供了极大的优点。然而，这同时减少了变异性，使得培植物成为一些害虫和疾病的持续不断的目标，这些害虫和疾病在面临对其发展有利的条件时能够导致不可逆的损害。植物检疫成本连同肥料高于生产成本的60％。柑橘属水果的质量和数量经常由于留在植物中的损害而受到威胁，取决于攻击的强度，这能够使植物不产出或者导致其被连根拔除。

在2004年的年中，在圣保罗的果园中报告了一种新的疾病。源于亚洲和非洲的没有治疗方法的毁灭性疾病。黄龙病(HLB)——也称为青果病——由于下述事实而成为当前在橙子生产商中最令人害怕的疾病：因为其具有高散播率并且影响所有的商业橙类品种，其不具有治疗或处理方法。到目前为止，为了使损失最小化，最高效的解决方案是一旦确认疾病的阳性诊断就立即连根拔除植物。

青果病具有作为引发成因的细菌，该细菌生活在寄主植物的韧皮部中，称为韧皮部杆菌(Candidatus Liberibacter)。存在三种类型的与青果病相关的细菌：非洲韧皮部杆菌(Candidatus Liberibacter africanus)、柑橘溃疡病菌(Candidatus Liberibacter asiaticus)和美洲韧皮部杆菌(Candidatus Liberibacter americanus)，其中后者是圣保罗州的主要引发成因。青果病的症状在视觉上是相同的，与疾病在何处发生无关。一开始，症状出现在树枝中，其由于与未受影响的树枝的树叶的绿色相比的黄色而显得明显。树叶呈现淡黄色，具有绿色部分，从而呈现不规则且不对称的斑点(呈杂色)。水果变得变形且不对称。在一些情况下，果皮的白色部分呈现高于正常的厚度。并且还发生水果的尺寸减小和密集的掉落。

由于缺乏治疗方法，青果病在当前是柑橘属植物的栽培中最令人害怕的疾病。其已经导致了多于200万棵柑橘属植物树木的连根拔除，并且这些树木中的绝大部分都处于高产季节。

特别地，圣保罗州的柑橘属植物的栽培表现出一些独特的特性， 这些特性导致栽培物对已知的疾病(如衰退病)以及新的疾病(如柑橘属植物突然死亡(CSD)和青果病)流行的发生的高度脆弱性，从而对农商业的可持续性带来了严重后果：

1)圣保罗州的柑橘属植物果园占据接近大约615,300ha的连续的区域(FNP.Citrus.AGRIANUAL 2003； da agricultura brasileira.FNP consultoria & agroinformativos， Paulo，p.295-314，2003.)，并且不存在地势起伏或物理障碍的较大差异，并且在这些果园之间具有大量的人口流动；

2)柑橘属植物是多年生的，因此终年以及多年暴露于害虫和疾病的攻击。除此之外，在一年的大部分期间，能够观察到新的嫩枝长出，这赋予了栽培季节之间易受感染的组织以及接芽的连续性；

3)圣保罗州的果园表现出非常低的基因可变性。仅仅四个品种的甜橙(Citrus sinensis Osbeck)： “Natal”、 和“Hamlin”(其通过嫁接而植物性地繁殖)就代表了92％的巴西柑橘属植物栽培。在大约85％的树木中使用的砧木(rootstock)是“Cravo”酸橙(lime)(C.limonia Osbeck)，这是由于其质朴、赋予给株冠的活力以及对州的北部和西北部的缺水环境的抵抗能力。

当前，存在一些用于青果病的诊断方法。最常用的诊断通过视觉检查表现出该疾病症状的树叶而进行的。在圣保罗州和“ Mineiro”中的青果病控制已经通过保护基金会(Fundecitrus)的技术人员或受过他们训练的人进行周期性视觉检查而实现。除了疾病仅仅在症状表现出之后才被诊断的事实(这是在树木的长期无症状阶段(大约8个月)之后)之外，该方法具有高主观性和高误差百分比的特性。在疾病的无症状阶段，受感染的树是疾病的不可见散播源，导致树木的连根拔除的非常严重的延迟。然而，在症状可视之后，连根拔起仅仅是当时的疾病控制事项。

文档JP2006267092-A描述了一种用于早期阶段的青果病的检测试剂盒，其基于受感染树木的组织中锰和铁浓度的下降的识别。检测过程包括获取含有缓冲系的植物材料的水溶提取物，然后分析吸收分光光度测定。然而，疾病的确定是非特定性的，这是因为植物中的低的锰和铁浓度能够由于多种生理因素造成，包括植物营养中这些矿物 质的缺乏。通过类似的方式，文档JP2004264101-A主张了经通过碘反应分析淀粉浓度而进行植物提取物中的青果病的检测，有缺乏生理非特定性的相同缺点。

在文档WO2007021485-A2中描述的方法保证了使用施加的极化照射散射的拉曼效应(Raman effect)在检测来自植物和动物的若干其他病原体和化学污染物之中检测青果病引发细菌。然而，检测被限制在经历了复杂处理的水性样本中，所述处理包括在胶状金属表面上进行干燥，之后与超滤膜接触。

附属于坎皮纳斯农艺研究所(IAC)的Apta Citrus是圣保罗州的提供对青果病诊断的技术报告的唯一中心。该报告基于称为PCR(聚合酶链式反应)的技术，该技术由树叶的基因分析组成，以搜索青果病引发细菌的DNA。然而，细菌DNA的检测仅在有症状的树叶(呈杂色)中是可行的，并且即使在这时候，其也会在10％的情况下失败。对于没有症状的树叶的诊断(没有疾病的可见征兆)，IAC使用该技术更为复杂的变型——称为实时PCR，其灵敏度是传统技术的至少1000倍高。然而，取决于其复杂性，实时PCR没有在常规检查中使用，仅仅用于科学工作。尽管PCR技术非常高效，但其成本高且费力( J.M.黄龙病的历史、病因、地域识别、传播和世界分布：一种柑橘属植物的破坏性的新出现的百年疾病，黄龙病青果病国际研讨会，v.1，p.1，2006)。使用传统的PCR对每个样本的分析成本大约为25美元，并且报告可耗时大约20天。PCR的大规模使用不是经济可行的；另外有产生时间上非常延迟的传染制图的事实。另一方面，文档CN1824802-A主张了在采样之后仅仅3个小时内进行无症状树的检测，但其限制于由细菌亚洲柑橘黄龙病菌(Candidatus Liberobacter asiaticum Jagoueix)引发的检测和中国种类的柑橘属植物。

当前，荧光成为能够起作用的相对简单且高效的决定。荧光是允许在察觉到疾病的视觉表现之前检测出现在被青果病和其他疾病影响的植物树叶中的化学变化的技术。

在文档BR200201249-A中，树叶、水果和树枝的自体荧光允许在暴露于具有短波长的光源之后，检测无症状柑橘属植物中的柑桔溃疡。然而，该技术受限于由细菌Xanthomonas axonopodis pv.citri.引发的该疾病的检测。

在Embrapa Agropecuária中开发出来的本发明的目的在于，保护用于诊断高等植物的应激和疾病(如柑橘属植物青果病)的新的诊断方法和装置。此前在Laboratório de e Lasers da Embrapa Agropecuária LOLEIA中进行的工作(文档PI 05059757-7)论证了使用商用光谱仪通过荧光发射光谱的最大比区别健康树叶与染病树叶的可能性以及区别疾病(CSD与衰退)的可能性。所提出的方法的基本构想如下：当植物达到由应激或由疾病引起的不平衡时，出现其新陈代谢的变化，导致其器官的化学成分改变。该化学变化导致物理性质的变化，诸如如树叶的反射系数和荧光性。基于该假设，开发了关于健康和染病的柑橘属植物树叶的树叶荧光发射的使用商业装置的实验室研究。通过PI 05059757-7中描述的方法的荧光发射峰值的比，发现了区分健康树木、具有衰退或CSD的树木的可能性。

在专利申请PI 05059757-7中，保护了进行树叶中的光谱测量的便携式模块的构想，用于采用使用灯泡、LED或420至480nm范围的激光器的激发来诊断柑橘属植物的突然死亡。在2006年，LOLEIA开发了使用激光致荧光谱测量(LIFS)的系统，其与文档PI 05059757-7中提出的系统相似，具有利用光纤构建的探针和由一组校正的光电二极管构成的检测系统，所述一组校正的光电二极管允许以极快的方式(～1秒)和利用470nm的激光的激发获得树叶的发射光谱。利用这种新的系统，能够以减少的时间分析大量的样本。在那时，青果病已经被认为是巴西柑橘属植物部分的最严重的疾病，因此LOLEIA开始了研究以评价使用荧光谱测量进行青果病诊断的可能性。根据初步的结果，能够发现，利用具有561nm波长激发的其他激光观察到了对青果病的最佳区分。利用重新规划的便携式模块，进行了辨识研究以评估通过树叶进行青果病诊断的可能性。从该研究得出了不同于专利申请PI 05059757-7中的方法(用于CSD)的新的疾病诊断方法。尽管当前的方法使用针对CSD而保护的相似装置，具有不同的激发波长，但是该系统整体上完全不同，下面将论述主要差别。

在当前的系统中，不像在文档PI 05059757-7中那样使用峰值比。开发了一种软件，以收集荧光光谱并进行其统计处理(图1和2)，以便以最具有辨识能力的方式评估所有的发射光谱，以获得能够实现更 精确的疾病诊断的更大量的信息。

在由主成分分析(PCA)统计方法处理之后，第一主要成分的三维图形中的块如图3所示地被清楚地限定。

由于系统变得非常敏感，所以其还区分株冠的品种和砧木的品种，这是名为“Método e Equipamento para de Mudas de Citros(用于柑橘属植物秧苗的检定的方法和设备)”的另一个专利申请就此主题详细阐述的原因。这样，对于株冠和砧木的每种组合都进行系统校正过程。对于株冠和砧木的每种组合，使用含有健康树叶和染病树叶的一组样本，以将每类样本的典型光谱的信息提供给系统。通常，评估下面的类别：健康的样本，表现出在有症状阶段的青果病的染病样本、表现出在无症状阶段的青果病的染病样本、具有CSD和具有衰退。

使用机器学习的工具开发了另一种软件，使得以下述方式使用校正数据库：系统能够测量完全未知的树叶，并且将树的状态分类为健康的或染病的，并且如果是染病的则识别疾病。在青果病的情况下，能够识别在有症状阶段以及在无症状阶段的疾病。该结果表明了该技术能够进行疾病的早期诊断的极大潜力。

在CSD的专利中，光谱分析仅仅在通过荧光图像获得果园的图之后进行，其进行健康树木与染病树木的区分。在本专利中，诊断仅仅使用荧光谱测量来进行。

因此，不同于专利PI 05059757-7，其所保护的装置本身不能够进行自动诊断。完整的系统需要数据的采集软件和统计处理、校正数据库和分类软件。这样，在本专利中，要求由以下项构成的完整系统的保护：用于进行荧光谱测量的装置、采集软件和数据的统计处理、数据库以及分类软件用于通过柑橘属植物树叶进行青果病诊断。

发明内容

本发明示出了，通过直接在树叶和植物的其他部分中进行荧光谱测量的方式，连同机器学习的数据库和预测模型或统计、数学和/或计算区分的产生，能够以快速、精确、早期和经济可行的方式检 测高等植物中的应激和疾病，如青果病(例如，其是巴西的柑橘属植物栽培的当前主要问题)，这样，有助于疾病的控制。

本发明的第一实施例是用于诊断高等植物的疾病和应激的方法，尤其是青果病，其中包括以下步骤：

a)校正分类软件，收集来自染病树木的至少150片树叶和来自健康树木的150片树叶的发射光谱；

b)收集来自要分析的果园的每棵地理参照(georeference)树的至少03片树叶；

c)检测和测量在(b)中收集的所有树叶的荧光发射光谱；

d)分析在(c)中产生的光谱；以及

e)产生每棵树的报告。

f)基于坐标和在所述每棵树的报告，构建果园的健康状态图。

本发明的第二实施例是用于诊断高等植物的疾病的装置，其中该装置包括激发源、激发光缆、可调滤光器、光纤适配器、混合光缆、探针、发射光缆、迷你光谱仪以及数据处理分类软件。

本发明的另一个实施例是一种系统，其中所述方法用于通过荧光发射谱测量与用于诊断高等植物的疾病和应激的谱测量装置相关联地诊断高等植物的疾病和应激。

附图说明

图1-采集软件的屏幕截图。

图2-用于数据处理的软件的屏幕截图。

图3-对于在健康的Sunky砧木(38)中的、具有有症状的青果病(39)和无症状的青果病(40)的甜橙 树，从由LOLEIA研发的便携式系统所捕捉的荧光发射光谱产生的的三个第一主要成分的图形。

图4-分类软件的屏幕截图，突出显示了分类窗口(41)。

图5-用于诊断青果病的装置。

图6-在LOLEIA研发并构建的激光致荧光谱测量(LIFS)的便携式系统中获得的Hamlin橙的树叶的典型发射光谱，所述Hamlin橙具有“Cravo”酸橙的砧木。

图7-通过具有健康的“Cravo”酸橙和染病的“Cravo”酸橙(在雨季具有AG、SG、CSD和衰退)的砧木的Hamlin橙树的树叶的光谱产生的PCA图形。所有的光谱在LOLEIA研发并构建的激光致荧光谱测量(LIFS)的便携式系统中获得。

具体实施方式

首先，为了研发本发明中提出的方法，使用传统的荧光光谱仪进行树叶和从树叶中提取出的光合色素的光谱测定表征，以观察健康材料与染病材料之间的光谱差异。

在该研究之后，对为诊断CSD而研发的装置(PI 05059757-7)进行改变，以使得能够进行青果病的诊断。然而，限制于装置的光学改变的改动是不足的。

在图5中，示出了本发明的目的——研发的新系统的示意图：42-要分析的柑橘属植物树叶；43-探针；44-光缆；45-光纤适配器；46-可调滤光器；47-激发光纤；48-二极管激光器；49-发射光纤；50-迷你光谱仪；51-膝上型电脑；52-信号/数据处理；53-数据库；54-分类软件；55-报告；在插图中示出了探针的侧向轮廓(56)，其含有下面的部分：57-激发光纤；和58-发射光纤。

研发了用于诊断青果病的新方法，其也是本发明的目的。该方法由三个步骤组成：

1-构建数据库—最初，系统需要具有来自株冠和砧木的给定组合的树叶的可能荧光发射光谱的信息的数据库。为了实现该数据库，收集至少来自健康树木的150片树叶、有症状的染病树木的150片树叶以及无症状的染病树木的150片树叶。这些450片树叶的光谱被本申请的装置(正为其申请专利)捕捉，并通过同样特别为该装置研发的软件由统计方法处理。

为数据的收集研发的程序允许多个采集参数(图1)的调节，这 些参数中有积分时间(ms)，即在向程序发送关于光谱的信息之前迷你光谱仪获得光的时间间隔(1)。其还允许修改程序进行的收集的数量，以通过平均计算组成单个光谱(2)；这在噪声减少中是有用的过程。还存在矩形函数(boxcar)调节(3)，其控制程序施加的光谱的平滑强度。

主屏幕中的另一类可调元件关于收集到的光谱的可视化。能够确定以nm(4)和强度极限(5)用任何单位表现在屏幕上的波长下限和波长上限。还能够使一个或多个收集到的光谱可视化，以及稍后将其从屏幕中去除(6)。在这种情况下，光谱以不同的颜色表现，并且用户具有接受或禁用自动生成的子标题的选择(7)。

在屏幕中存在多于一个光谱的情况下，用户必须指定哪个光谱必须保存在数据库中(8)。然而，为了保存光谱，必须提供其描述(如产生该光谱的激发属性(9))，以及分析样本的描述。关于样本的必要数据为：砧木品种(10)和株冠品种(11)、正在感染植物的疾病(12)以及其来源的地方(13)。用于这些情况中的每一个的该组选择能够通过点击相应区域的右侧按钮来编辑。

还存在必须由用户本人填写的关于样本的数据：场地编号(14)，街道编号(15)，以及编号数(16)，其识别植物和样本(18)的收集日期。树叶的编号(17)由程序自动分配(attribute)，以在存在来自同一棵植物的多于一个样本的情况下避免混淆。光谱获取的日期(19)也被自动地登记。程序还允许登记用户关于所讨论的样本可能需要做的附加观察(20)。

通过采集屏幕，用户还能够开始或者中断数据在屏幕中的即时可视化(21)，存取迷你光谱仪的配置(22)，最后将当前选择的光谱连同相应区域(23)中的插入信息保存在数据库中。

存储的数据的分析(图2)必须由用户选择的名称(24)来识别。这还必须选择要在分析中使用的光谱范围(25)，并指定要考虑的十进制分隔符的数量(26)。还存在选择与每个波长相关联的标准偏差的极限值的选项，标准偏差低于该极限的变量被丢弃，以避免出现除以零(27)。通过在两个波长之间建立对于程序考虑所需的最小的差作为独特变量(28)，避免了另外的问题。这防止了由程序进行的 波长值的四舍五入的任何偶然最小差导致分析中的错误。还存在用于用户登记关于所讨论的分析的观察数据的可用区域(29)。

能够选择在屏幕中视觉化的光谱(31)，以选择是否通过使用不同的颜色(33)来区分它们，从而从分析中排除选定光谱(32)，或者以与其他程序兼容的格式将其输出(37)。

可用的分析行为(proceding)是计算最大点的强度与最小点的强度的商和PCA。在第一种情况下，用户能够选择两个间隔的极限，其中将计算将用于指数(index)确定的最大(或最小)点(30)，并且还能够图形可视化结果(35)。在第二种情况下，用户必须选择三个主要的成分(34)，以使含有它们的三维图形可视化(37)。

这样，获得了三维图形(图3)，其具有将不同种类的树(健康的(38)、有症状的(40)和无症状的(39))分开的块和具有每个样本类型的特征信息的数据库。

2-分类软件—使用机器学习的工具、统计和/或数学和数据库，开发了分类模型。

在图4中，显示树叶诊断的窗口用(41)表示。对于刚刚保存的光谱和根据先前产生的分类器的标准提供的诊断，分类实际上是即时的。连同结果一起，屏幕显示进行的诊断的置信度的估算值(41)。用户具有在任何时刻将正在使用的分类器改为程序的数据库中可用的另一个分类器的选项。

03-果园评价—收集果园中每棵树的至少三片树叶。对树木进行地理参照，以提供传染图的构造。测量树叶的发射光谱，并且通过产生的收集树叶的诊断的流行程度(prevalence)获得每棵树的报告。这样，每个进行了地形参照的树都具有报告，并且能够构建传染图。

在“Cravo”酸橙砧木的 橙的1000棵树的场地上利用新的装置和方法进行的实验中，获得了高于80％的正确结果的指标，甚至是在无症状的树中。

示例

在图6的图形中，示出了对于“Cravo”酸橙砧木的Hamlin在具有561nm激光的便携式系统中获得的典型光谱。这组样本代表健康的植物(59)、具有衰退(60)、具有柑橘属植物突然死亡(61)、具有无症状青果病(62)和有症状青果病(63)。

如图7所示，为了更好地区分疾病，利用整组所收集的树叶的数据进行PCA分析，其含有相同类型的样本：健康的(64)、具有CSD(65)、具有衰退(66)、具有无症状青果病(67)和有症状青果病(68)。

从这组数据构建软件，其分类模型能够以高于80％的精度进行“Cravo”酸橙砧木的Hamlin树叶的诊断。

Claims (13)

1.一种用于诊断高等植物的疾病和应激的方法，其中使用谱测量，所述方法由下列步骤组成：

　　a）校正分类软件，收集来自染病的树木的至少150片树叶和来自健康树木的至少150片树叶的发射光谱；

　　b）收集来自要分析的栽培区域的每棵地理参照树木的至少03片树叶；

　　c）检测和测量在（b）中收集的树叶的荧光发射光谱；

　　d）分析在（c）中产生的光谱；以及

　　e）产生每棵树木的报告；

　　f）基于坐标和在每棵树木的报告中，构建所述栽培区域的健康状态图。

2.根据权利要求1所述的用于诊断高等植物的疾病和应激的方法，其中所述方法用于诊断柑橘属植物的青果病。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述方法用于诊断具有株冠和砧木的不同组合的柑橘属植物的青果病。

4.根据权利要求1所述的用于诊断高等植物的疾病和应激的方法，其中通过迷你光谱仪衍射和检测信号。

5.根据权利要求1所述的用于诊断高等植物的疾病和应激的方法，其中利用机器学习的工具进行预先校正。

6.根据权利要求1所述的用于诊断高等植物的疾病和应激的方法，其中所述方法使用专用的分类软件。

7.根据权利要求1所述的用于诊断高等植物的疾病和应激的方法，其中所述荧光发射光谱的变化反映植物的组成部分的化学成分的变化结果。

8.根据权利要求7所述的用于诊断高等植物的疾病和应激的方法，其中所述组成部分是发荧光的。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述发荧光的组成部分是所述植物的光合色素。

10.根据权利要求8所述的方法，其中所述发荧光的组成部分主要是叶绿素a和b以及辅助色素。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述辅助色素是类胡萝卜素和叶黄素。

12.根据权利要求1或2所述的用于诊断高等植物的疾病和应激的方法，其中所述树叶在600至800 nm的波长下发荧光。

13.根据权利要求1或2所述的用于诊断高等植物的疾病和应激的方法，其中用于诊断青果病的波长为大约561 nm。