MX2011006203A - Remedios para penfigo que contienen anticuerpos de ligando antifas. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere al uso de antagonistas FasL, por ejemplo, de anticuerpos humanizados dirigidos contra ligandos Fas humanos (también llamados CD95L o Apo1L y abreviados en lo sucesivo como FasL) para la prevención y/o tratamiento de enfermedades de la piel asociadas con acantolisis de queratinocitos, particularmente para la prevención y/o tratamiento de pénfigo.

Description

REMEDIOS PARA PÉNFIGO QUE CONTIENEN ANTICUERPOS DE LIGANDO ANTIFAS La presente invención se refiere al uso de antagonistas de ligando Fas humano (también llamado CD95L o ApolL , y en lo sucesivo abreviados como FasL), más particularmente al uso de anticuerpos humanizados contra FasL para la prevención y/o tratamiento de enfermedades de la piel asociadas con acantolisis de querat inoci t o , particularmente para la prevención y/o tratamiento de pénfigo.

El pénfigo es una condición de la piel, ampollar, autoinmune, caracterizada por la pérdida de adhesión de queratinoci tos debido a anticuerpos dirigidos contra proteínas desmosomales ( de smogle iñas , dsg) . El pénfigo tiene distribución a nivel mundial con una incidencia de aproximadamente 1-5 per 100.000 por año, y con predominancia en mujeres.

El pénfigo se caracteriza por la pérdida de adhesión de que ra t inoci t o s suprabasales que abundan en un proceso conocido como acantolisis. La patogénesis del pénfigo está experimentando una mayor revisión, principalmente debido a que, además de los anticuerpos de an t i -de smog 1 e i na , un nuevo grupo de anticuerpos receptores ant i-colinérgicos puede inducir la acantolisis (Kalish, 2000) . Además, se ha demostrado que la obstrucción esférica por si sola no puede provocar La formación de vejigas después del enlace de ant i geno - ant i cue rpo (Kitajima, 2002) . Además, se demostró que la formación de desmosoma no se inhibe por los anticuerpos de pénfigo (PVIgG) relacionados a pénfigo, mientras que las conexiones desmosomales se disocian 24-36 horas después del tratamiento con PvIgG. Durante este tiempo, toma lugar una serie de etapas de transducción de señal activadas por PVIgG.

Estas observaciones sugieren un papel de apoptosis en pénfigo. No obstante, el pénfigo es una enfermedad debido a la falta de adhesión celular (Payne AS et al, 1978) y la apoptosis puede ocurrir en asociación con la separación celular (Marconi et al, 2004) . Estos conceptos se confirman por completo mediante la detección de apoptosis en piel con pénfigo con lesiones. En particular, las células acantoliticas expresan los principales marcadores de apoptosis ( ang X et al, 2004) . Más interesantemente, los núcleos de etiqueta TUNEL también se encuentran sujetos al techo de la vejiga, sugiriendo la presencia de células apoptóticas en piel con lesiones en la periferia antes de la separación. Además, las células apoptóticas que expresan Ig y la caspasa-8 activada se detectan en la orilla de la lesión, en áreas donde no es visible interrupción alguna de contactos célula-a-célula (Wang X et al, 2004) . Estos datos muestran definitivamente que en pénfigo, la apoptosis toma lugar en los que rat inoc i to s antes que la acantolisis.

La apoptosis juega un papel fundamental en la regulación de homeóstasis celular y se involucra en muchos procesos patof isiológicos . La apoptosis puede seguir separación tanto de célula a célula (Rezgui et al, 2000; Bergin et al, 2000) como también pérdida de interacción de cé lu 1 a -a -ma t r i z (Giancotti y Ruoslahti, 1999 ) .

Fas (o FasR) es un miembro de la superfamilia de TNF-receptor que, después de enlazarse a ligando Fas (FasL), activa la apoptosis en muchos sistemas celulares (Sharma et al, 2000) . La señalización intracelular de apoptosis inducida por Fas-FasL opera a través de la limitación de un número de moléculas adaptadoras tales como FADD (Fas-asociado con dominio de muerte) y FLICE ( FADD- como ICE, caspasa 8) , el cual a su vez se inhibe por FLIP (proteina inhibidora de FLICE) (Juo et al, 1998) . La interacción de Fas-FasL se involucra en los patomecanismos de varias condiciones inmuno- inflama torias e infecciosas, tales como SIDA (Bahr et al, 1997) y lupus sistémico eritematoso (Kovacs et al, 1997) . Las enfermedades cutáneas caracterizadas por una implicación de trayectoria de Fas-FasL incluyen el injerto agudo contra la enfermedad del huésped, necrolisis epidérmica tóxica y melanoma (Wehrli et al, 2000) . Además, se reportó que las lesiones de tipo acantolitico se observan en queratinocitos cultivados, tratados tanto con PVIgG como también con anti-FasR, mientras PvIgG induce la aglomeración de FasR, FasL y caspasa-8 en la membrana celular varias horas antes de la formación de las lesiones (Wang X et al, 2004) . Además, se reportó que el inhibidor de tipo caspasa-1 bloqueó significativamente la formación de vejigas en un modelo de ratón con pénfigo (Li et al, 2006) . Tomados en conjunto, estos datos indican que FasL y la trayectoria apoptótica extrínseca juegan un papel crítico en los mecanismos subyacentes a la acantolisis.

Cualquiera que sea la naturaleza de los auto-anticuerpos de pénfigo, la exposición a PVIgG sobre-regula la expresión de varios genes apoptóticos, incluyendo FasL, muchas horas antes de la acantolisis. Además, el IgG intravenoso (IVIgG) previene el sobre-regulación inducida por PvIgG de FasL y la apoptosis en los queratinoci tos . IVIgG también previene la acantolisis y la apoptosis in vivo (Arredondo J et al, 2005) .

Sin tratamiento, la mortandad de pénfigo vulgar se aproxima al 100%. Se requiere terapia sistémica temprana para controlar el pénfigo, pero los efectos secundarios que se desprenden de la terapia son una complicación importante. El tratamiento incluye la administración de corticoesteroides, medicamentos que contienen oro, el fármaco anti-inf lamatorio dapsona o medicamentos que suprimen el sistema inmune (tal como azatioprina, metotrexato, ciclosporina , ciclofos famida o micofenolato mofetil) . El tratamiento más común para pénfigo son, en la actualidad, los esteroides que necesitan, administrarse de por vida y pueden provocar severos efectos secundarios. La mayoría de los pacientes de pénfigo mueren por estos efectos secundarios. Algunos antibióticos también son eficaces, particularmente minociclina y doxiciclina. Ocasionalmente se utiliza inmunoglobul ina intravenosa (IVIg) . La pl asma fé re s i s es un proceso mediante el cual el plasma que contiene el anticuerpo se retira de la sangre y se reemplaza con fluidos intravenosos o plasma donado. La plasmaféresis puede usarse además de las medicaciones sistémicas a fin de reducir la cantidad de anticuerpos en la corriente sanguínea. Un número de moléculas nuevas también se encuentra bajo desarrollo: micofenolato mofetil, PI-0824, PRTX-100, anti-CD20 son fármacos inmuno-supresores que actúan sobre células T y B.

El actual índice de mortandad aún varía desde 5 hasta 25%; la infección es la causa más frecuente de muerte y la terapia inmuno-supresora a largo plazo (principalmente cort icoes teroide ) es uno de los factores significativos que aún provocan un elevado Indice de mortandad. La i nmunog 1 obu 1 i na puede producir cierta mejora a corto plazo, pero no parece inducir remisiones duraderas y su costo no lo hace práctico para uso a largo plazo.

También existen varias advertencias en el uso de la plasma fé res i s . Los pacientes suprimidos con prednisona u otros agentes inmunosupresores y que reciben plasmaféresis, se encuentran en mayor riesgo de muerte repentina por sepsis. Además, el tratamiento es muy costoso y es necesario un periodo de hospitalización de 2 semanas para administrar la terapia. Por consiguiente, debido al riesgo de muerte repentina por sepsis y al elevado costo, la p 1 a sma fé re s i s se indica solo en los casos más refractarios donde el paciente se encuentra claramente en riesgo de morir a causa de la enfermedad en sí.

Un objeto de la presente invención es proporcionar un agente terapéutico para pénfigo. El desarrollo de un nuevo fármaco que bloquee FasL permitirla prevenir por completo la separación celular y la formación de la lesión en la piel.

En general, la presente invención se refiere, al tratamiento de una enfermedad de la piel asociada con acantolisis de queratinoci to mediante la administración de un antagonista FasL. Los antagonistas FasL pueden seleccionarse a partir de anticuerpos de anti FasL, particularmente anticuerpos de anti FasL humanizados o humanos, moléculas efectoras de ácido nucléico de expresión Fas, tales como moléculas de ant i - de te cción o moléculas capaces de interferencia de ARN tales como moléculas de siARN, moléculas receptoras de Fas soluble, muteinas de FasL antagonista y compuestos químicos de bajo peso molecular que inhiben la interacción de Fas-FasL. Los antagonistas de FasL previenen la apoptosis de queratinoci to y la posterior separación de célula-a-célula (acantolisis) . Por lo tanto, los antagonistas de FasL son pa ticularmente adecuados para la prevención y/o tratamiento de pénfigo, por ejemplo, para la prevención y/o tratamiento de pénfigo mucocutáneo .

La presente invención se refiere a un medicamento que contiene al menos un compuesto que inhibe los efectos biológicos de FasL. La expresión "compuesto que inhibe los efectos biológicos de FasL" usada .en la presente, se refiere a todos los compuestos que pueden inhibir o neutralizar por completo o al menos parcialmente los efectos biológicos de FasL. Por ejemplo, el efecto inhibidor o neutralizante puede basarse en la supresión del enlace de FasL con su receptor natural y, por consiguiente, las asi provocadas transmisiones de señal. Esto puede lograrse, por ejemplo, mediante el uso de anticuerpos que se enlazan a FasL en si o a receptores solubles que imitan Fas o muteinas de FasL antagonistas, bloqueando asi el enlace de FasL a los receptores celulares. La interferencia con Fas o la expresión de FasL por siARN bloqueará el sistema Fas/FasL.

La terapia antagonista de FasL es ya sea una monoterapia o se da en combinación con otros medicamentos adecuados para el tratamiento de pénfigo u otras enfermedades de la piel, particularmente según se describe arriba. Por ejemplo, una terapia de combinación de antagonistas de FasL y esteroides podría permitir una drástica reducción de las dosis de esteroides.

En una modalidad preferida de la presente invención, se proporciona un agente terapéutico para pénfigo, que comprende un anticuerpo contra un ligando fas humano o un fragmento activo del mismo como un ingrediente activo. El anticuerpo es preferentemente unos anticuerpos quiméricos, humanizados o de humano anti-FasL o un fragmento o derivado de enlace a antígeno, por ejemplo, un anticuerpo de cadena individual recombinante . Si se desea, el anticuerpo puede conjugarse con moléculas efectoras, por ejemplo, compuestos ci tostát icos , citotóxicos y/o radioactivos.

Los anticuerpos humanizados preferidos, adecuados para el tratamiento de enfermedad de la piel asociada con acantolisis de que ra t i no c i t o , en particular pénfigo, de acuerdo con la presente invención, se describen en O 1997/002290A1 ("Anticuerpos de ligando anti-Fas y método de ensayo que usa el mismo anticuerpo") o en la WO 1998/010070 Al ("Inmunoglobulina humanizada que reacciona específicamente con Ligando Fas o fragmentos activos de la misma y región que induce apoptosis que se origina en anticuerpos humanizados de Ligando Fas"), el contenido de las cuales se incorpora en la presente para referencia. Se prefieren además los anticuerpos humanos adecuados para el tratamiento de enfermedad de la piel asociada con acantolisis de queratinocito, en particular pénfigo, de acuerdo con la presente invención, descritos en la US 7,262,277 ("Anticuerpos humanos de ligando Anti-hFas antagonista y fragmentos de los mismos"), el contenido de la cual se incorpora en la presente también para referencia .

Los anticuerpos humanos o humanizados tienen al menos tres ventajas potenciales sobre los de ratón y en algunos casos los anticuerpos quiméricos para uso en terapia humana: 1) debido a que la porción efectora es humana puede interactuar mejor con las otras partes del sistema humano; 2) el sistema inmune humano no debe reconocer la estructura o región C del anticuerpo humanizado como extraño y, por consiguiente, la respuesta de anticuerpo contra tal anticuerpo inyectado debe ser- menor que contra un anticuerpo de ratón totalmente ajeno o un anticuerpo quimérico parcialmente ajeno; 3) los. anticuerpos humanizados inyectados tendrán presumiblemente una vida útil en promedio más similar a la de los anticuerpos humanos naturalmente ocurrentes, permitiendo que se den dosis menores y menos frecuentes.

Los antagonistas FasL más preferidos son moléculas FasR solubles que comprenden la parte soluble extracelular del receptor Fas o moléculas FasL antagonistas modificadas que tienen una actividad antagónica, competitiva o no competitiva. Estas moléculas inhiben las interacciones FasL/FasR ya que FasL se enlaza al análogo receptor soluble o la molécula antagonista FasL se enlaza al receptor natural, reduciendo asó o eliminando por completo el enlace de FasL biológicamente activo al receptor natural. Durante el tratamiento con siARN, puede utilizarse un análisis de proteina Fas y/o FasL o niveles de ARN para determinar el tipo de tratamiento y el curso de la terapia en el tratamiento de un sujeto. El monitoreo de proteina Fas y/o FasL o niveles de ARN puede usarse para predecir el resultado del tratamiento y para determinar la eficacia de compuestos y composiciones que modulan el nivel y/o actividad de ciertas proteínas Fas y/o FasL asociadas con una complicación, condición o enfe rmedad .

En un aspecto especialmente preferido, la presente invención se refiere al uso de (i) un anticuerpo monoclonal o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, específico para proteína de ligando Fas humano (FasL) , en donde el anticuerpo monoclonal comprende al menos una región variable de cadena pesada y al menos una región variable de cadena ligera, en donde las secuencias aminoácidas de la región determinante complementaria (CDRs) son: (ai) CDR Hl: Asn Tyr Trp lie Gly (SEQ ID NO : 1 ) , (bi) : CDR H2 : Tyr Leu Tyr Pro Gly Gly Leu Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly (SEQ I D NO : 2 ) , (Ci) : CDR H3: Tyr Arg Asp Tyr Asp Tyr Ala Met Asp Tyr (SEQ ID NO: 3) o (di) : una secuencia derivada por sustitución de 1 , 2 ó 3 amino ácidos de las SEQ ID Nos: 1, 2 y/o 3 y/o las secuencias aminoácidas de las regiones determinantes complementarias (CDRs) de la cadena ligera son: (a2) CDR Ll : Lys Ser Thr Lys Ser Leu Leu Asn Ser Asp Gly Phe Thr Tyr Leu Gly (SEQ ID NO: 4) , (b2) CDR L2 : Leu Val Ser Asn Arg Phe Ser (SEQ ID NO: 5) , (c2) CDR L3 : Phe Gln Ser Asn Tyr Leu Pro Leu Thr (SEQ ID NO: 6) o (d2) una secuencia derivada mediante sustitución de 1, 2 ó 3 amino ácidos de las SEQ ID Nos : 4 , 5 y/o 6 o (ii)un anticuerpo o un fragmento de anti-enlace del mismo, el cual reconoce el mismo epitope en FasL humano que el anticuerpo (i) , para la elaboración de un medicamento para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad de la piel asociada con acantolisis de querat inoci to , particularmente de pénfigo.

En un segundo aspecto especialmente preferido, la presente invención se refiere al uso de (i) un anticuerpo monoclonal o un fragmento de enlace a anticuerpo del mismo, especifico para proteina de ligando Fas humano (FasL), en donde el anticuerpo monoclonal se produce por la célula hibridoma bajo el No. de Acceso FERM BP-5045 o un anticuerpo o fragmento de anticuerpo derivado de la misma, o (ii)un anticuerpo monoclonal o un fragmento de enlace a anticuerpo del mismo, el cual reconoce el mismo epitope de FasL humano que el anticuerpo de (i) para la elaboración de un medicamento para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad de la piel asociada con acantolisis de queratinoci to , particularmente de pénfigo.

En un tercer aspecto especialmente preferido, la presente invención se refiere al uso de (i) un anticuerpo monoclonal o un fragmento de enlace a antigeno del mismo, especifico para proteina de ligando Fas humano (FasL), en donde el anticuerpo monoclonal comprende al menos una región variable de cadena pesada y al menos una región variable de cadena ligera, en donde las secuencias aminoácidas de la región determinante complementaria (CDRs) de la cadena pesada son: (ai) CDR Hl: Glu Tyr Pro Met His (SEQ ID NO : 7 ) , (bi) : CDR H2: Met lie Tyr Thr Asp Thr Gly Glu Pro Ser Tyr Ala Glu Glu Phe Lys Gly (SEQ ID NO: 8 ) , (Ci) CDR H3 : Phe Tyr Trp Asp Tyr Phe Asp Tyr (SEQ ID NO: 9) o (di) una secuencia derivada por la sustitución de 1, 2 ó 3 amino ácidos de las SEQ ID Nos : 7 , 8 y/o 9 , y/o las secuencias aminoácidas de las regiones determinantes complementarias (CDRs) de la cadena ligera son (a2) CDR Ll : Arg Ala Ser Gln Asp lie Ser Asn Tyr Leu Asn (SEQ ID NO: 10), (b2) CDR L2 : Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser (SEQ ID NO: 11 ) , (c2) CDR L3 : Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Trp Thr (SEQ ID NO: 12) o (d2) una secuencia derivada por la sustitución de 1, 2 ó 3 amino ácidos de las SEQ ID Nos: 10, 11 y/o 12 o (ii)un anticuerpo o un fragmento de enlace a antigeno del mismo, . el cual reconoce el mismo epitope en FasL humano que el anticue rpo ( i ) , para la elaboración de un medicamento para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad de la piel asociada con acantolisis de querat inocito , particularmente de pénfigo.

Un en cuarto aspecto preferido, la presente invención se refiere al uso de (i) un anticuerpo monoclonal o un fragmento de enlace a anticuerpo del mismo, especifico para proteina de ligando Fas humano (FasL) , en donde el anticuerpo monoclonal se produce por la célula hibridoma bajo el No. de Acceso FER BP-5533, FERM BP-5534 y/o FERM BP-5535 o un anticuerpo o fragmento de anticuerpo derivado del mismo, o (ii)un anticuerpo monoclonal o un fragmento de enlace a antigeno del mismo, el cual reconoce el mismo epitope de FasL humano que el anticuerpo de (i) para la elaboración de un medicamento para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad de la piel asociada con acantolisis de que rat inoci t o , particularmente de pénfigo.

En una modalidad especialmente preferida, la presente invención se dirige al uso de anticuerpos humanos anti-FasL, o porciones de enlace a antigeno de los mismos, que comprenden una región variable de cadena ligera y/o una región variable de cadena pesada, según se describe en la US 7,262,277, el contenido de la cual se incorpora en la presente para referencia. En particular, los anticuerpos humanos anti-FasL preferidos, adecuados para el tratamiento de una enfermedad de la piel asociada con acantolisis de querat inoci to , de acuerdo con la presente invención, comprenden una región variable de cadena ligera que comprende un polipéptido con la secuencia mostrada en la SEQ ID NO 2 de la EU 7,262,277 (incorporada en la presente para referencia) y que comprenden además una región variable de cadena pesada que comprende un polipéptido con la secuencia mostrada en la SEQ ID NO 10 ó 18 de la US 7,262,277 (incorporada en la presente para referencia) . Más particularmente, la invención se refiere al uso del anticuerpo humano anti-hFas 3E1 (producido por la célula hibridoma con número de acceso ATCC PTA-4018) según se describe en la US 7,262,277 (incorporada en la presente para referencia) para la elaboración de un medicamento para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad de la piel asociada con acantolisis de querat inoci to , particularmente de pén f i go .

En un aspecto preferido aún adicional, la presente invención se refiere al uso de (i) un anticuerpo humano monoclonal o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, especifico para proteina de ligando Fas humano (FasL) , en donde el anticuerpo monoclonal comprende al menos una región variable de cadena pesada y al menos una región variable de cadena ligera, en donde las secuencias aminoácidas de las regiones determinantes complementarias (CDRs) de la cadena pesada son: (ai) CDR Hl: Arg His Gly lie Thr (SE QID NO: 13) o (a2) CDR Hl : Ser His Gly lie Ser (SEQ ID NO : 14 ) , (bx) CDR H2 : Trp lie Asn Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Val Gln Gly (SEQ ID NO: 15) o (b2) CDR H2 : Trp lie Asn Ala Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu Gln Gly (SEQ ID NO : 16), (Ci) CDR H3 : Glu Thr et Val Arg Gly Val Pro Leu Asp Tyr (SEQ ID NO: 17) o (c2) CDR H3 : Glu Thr Met Val Arg Gly Val Pro Cys Asp Tyr (SEQ ID NO: 18), o (di) una secuencia derivada por sustitución de 1, 2 ó 3 amino ácidos de las SEQ ID Nos: 13, 14, 15, 16, 17 y/o 18, y/o las secuencias aminoácidas de las regiones determinantes complementarias (CDRs) de la cadena ligera son (a3) CDR Ll: Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala (SEQ ID NO: 19), (b3) CDR L2: Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr (SEQ ID NO: 20 ) , (c3) CDR L3: Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr (SEQ ID NO: 21) o (d3) una secuencia derivada por sustitución de 1, 2 ó 3 amino ácidos de las SEQ ID Nos : 19, 20 y/o 21 o (ii)un anticuerpo o un fragmento de enlace a antigeno del mismo, el cual reconoce el mismo epitope en FasL humano que el anticuerpo (i), para la elaboración de un medicamento para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad de la piel asociada con acantolisis de que ra t i noc i t o , particularmente de pénfigo.

En un aspecto aún finalmente preferido, la presente invención se refiere al uso de (i) un anticuerpo monoclonal o un fragmento de enlace a antigeno del mismo, especifico para proteina de ligando Fas humano (FasL), en donde el anticuerpo monoclonal se produce por la célula hibridoma bajo No. de Acceso ATCC PTA-4017 y/o ATCC PTA-4018 o un anticuerpo o fragmento de anticuerpo derivado del mismo, o (ii) un anticuerpo monoclonal o un fragmento de enlace a antigeno del mismo, el cual reconoce el mismo epitope de FasL humano que el anticuerpo de (i) para la elaboración de un medicamento para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad de la piel asociada con acantolisis de querat inocito , particularmente de pénfigo.

La célula hibridoma bajo el No. de Acceso ATCC PTA-4017 y ATCC PTA-4018 se han depositado el 29 de enero de 2002 con la Colección de Cultivos de Tipo Americano, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209 (EUA) .

El medicamento de la presente invención puede proporcionarse como una composición farmacéutica junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Preferentemente, la composición farmacéutica se administra mediante inyección o infusión, por ejemplo, de manera intravenosa, i nt raa rt er i a 1 , subcutánea, intraperi toneal o mediante otro medio adecuado. La composición puede administrarse de manera local o sistémica. Preferentemente, la composición se administra de manera sistémica.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para usarse en la invención comprenden el agente activo en una cantidad eficaz para lograr el propósito propuesto. Una dosis eficaz de un medicamento de la presente invención puede encontrarse en el rango de 0.1 µg hasta 100 mg, hasta una dosis total de aproximadamente 1 g, dependiendo de la ruta de administración. Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse diariamente, por ejemplo, una o varias veces, o cada dos a cuatro dias, cada semana o una vez cada dos semanas. El medicamento puede administrarse en un solo ciclo de tratamiento que consiste en una o varias administraciones de medicamento o en varios ciclos de tratamiento que consiste cada uno en una o varias administraciones de medicamento. Cada ciclo de tratamiento puede tener una duración de un día hasta varias semanas, meses o incluso años.

Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, el medicamento también puede usarse en una terapia de combinación al menos una terapia adicional, eficaz contra una enfermedad de la piel asociada con acantolisis de querat inocito y, en particular, contra pénfigo. El medicamento se usará ya sea solo o en combinación con otros fármacos i nmuno s up re s o re s , particularmente con esferoides, con objeto de reducir su dosis y/o reducir sus efectos secundarios crónicos. Cuando se usa en combinación, el medicamento preferentemente se administrará de manera continua dentro de una estructura de tiempo, dependiendo del caso individual.

Además, la presente invención deberá explicarse con mayor detalle por los siguientes e j emplos .

Ejemplos Evaluamos primero la presencia de apoptosis en epidermis proveniente de piel periférica a las lesiones en secciones congeladas de pacientes con pénfigo, no tratados, mediante teñido TUNEL. Los especímenes fluorescentes se analizaron mediante microscopio láser de exploración confocal. En estratos suprabasales de epidermis periférica a las lesiones, la mayoría de los queratinocitos son apoptóticos, en comparación con piel normal (Fig. 1) .

Con objeto de confirmar la apoptosis en lesiones de pénfigo, usamos biopsias incrustadas en parafina y fijadas a formalina y se detectó la forma activa de caspasa-3. El protocolo de teñido se llevó a cabo por el Polímero AP del Sistema de detección LP UltraVision y Chromogen Fast Red (Lab Vision Corporation, CA, EUA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La visuali zación se obtuvo con tabletas Fast Red en substrato de naftol fosfato. En muestras. de pénfigo, encontramos que el fragmento de caspasa-3 se localiza tanto en el techo como también en el suelo de la ampolla, siendo positivas algunas células en la epidermis periférica a las lesiones (Fig. 2) . Este resultado parece indicar que la muerte celular de querat inoci tos ocurre antes de la separación de los querat inoci tos , que conduce a la acantolisis.

Ya que los querat inoci tos apoptóticos se expresan de manera abundante en pénfigo, deseamos explorar si el suero de pénfigo es capaz de inducir apoptosis en querat inoci tos humanos normales. Para este propósito, los que ra t i no c i t o s se colocaron en placas en platinas de cámara y se cultivaron en medio libres de suero (KGM) hasta pre-conf luencia . Las células se cultivaron entonces en medio básales de querat inocitos y se trataron durante 48 h con la adición de 25% de suero proveniente de cualquier paciente no tratado o pacientes tratados con corticoesteroides sistémicos. El suero de sujetos saludables se usó como controles. La apoptosis se evaluó por teñido TUNEL in sítu. Se evaluaron aproximadamente 100 células en campos seleccionados de manera aleatoria y se cuantificó el porcentaje de células TUNEL-posit ivas . El suero proveniente de pénfigo pero no proveniente de sujetos saludables o pacientes que experimentan apoptosis inducida por tratamiento con esteroides en querat inocitos humanos (Fig.3A-3B) .

Ya que el sistema Fas/ Fas L se implica en muchos procesos apoptóticos también a nivel dérmico (Wherli et al, 2000) , medimos los niveles de FasL en suero de pacientes con pénfigo mediante un inmunoensayo de enzima de dos sitios (ELISA) . La concentración de suero se determinó por absorción a 450 nm contra proteína estándar de FasL humano recombinante . Los niveles de FasL fueron muy elevados en suero de pacientes no tratados y por debajo del límite de detección en suero de pacientes tratados con corticoesteroides o en suero de sujetos saludables. El suero de pacientes de HBV se utilizó como control positivo (Fig. 4A) . En un paciente, los niveles de FastL disminuyeron progresivamente con la terapia sistémica de esteroides (Fig. 4B) .

Ya que FasL se contiene en grandes cantidades en suero de pénfigo, buscamos la expresión de su receptor cognado FasR. Para este propósito, usamos biopsias incrustadas en parafina y fijadas en formalina. El protocolo de teñido se llevó a cabo mediante Polímero AP de Sistema de Detección LP UltraVision y Chromogen Fast Red (Lab Vision Corporation, CA, EÜA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La visualizacion se obtuvo con tabletas Fast Red en substrato de naftol fosfato. Mientras que FasR se expresa solo en querat inoci tos básales en piel normal, en lesiones activas de pénfigo. FasR se detecta tanto en las células básales como en las supra básales. De manera incluso más intrigante, en pénfigo mucocutáneo ( PMC ) , FasR parece expresarse a través de todos los estratos epidérmicos e incluso antes de la formación de la ampolla (Fig. 5) .

FasL es uno de los principales activadores de la trayectoria apoptótica extrínseca, activada por caspasa-8. Por consiguiente, deseamos evaluar si esta trayectoria desempeña un papel en la apoptosis de pénfigo. .Para este propósito, el suero del paciente se pre-trató con anticuerpo neutralizante anti-FasL o inhibidor de caspasa-8 y se agregó a cultivos de que ra t i no c i t o s . Los querat inoci tos se cultivaron en KGM y se trataron con suero de pénfigo o con suero de pacientes no tratados. El suero se pre-trató con anticuerpo neutralizante anti-FasL (2.5 mg por mi durante 30 min) o inhibidor de caspasa-8 Z-IETD-FMK (100 µ? durante 30 min) . La apoptosis se evaluó mediante teñido TUNEL. La adición de anticuerpo neutralizante anti-FasL o inhibidor de caspasa-8 previno parcialmente la apoptosis de querat inoci tos , inducida por suero de pénfigo (Fig. 6) .

Además, los qu e ra t i noci t o s se trataron como en la Fig. 6 y se proporcionaron ya sea con anticuerpo anti-FasL o inmunoglobul inas irrelevantes. Las células se homogeni zaron entonces en regulador RIPA para análisis de manchado Western. Las membranas se incubaron con anticuerpos anti-b-actin o caspasa-8 anti humana. La intensidad relativa de bandas en auto radiogramas se cuantificó mediante densitometria láser de exploración. Los resultados mostraron que la caspasa-8 se activó notablemente en queratinocitos tratados con suero de pénfigo, en comparación con células no tratadas, mientras que la disociación de caspasa se inhibió parcialmente por el pre-tratamiento con anticuerpo anti-FasL (Fig. 7) .

Tomados en conjunto, estos datos sugieren que el suero de pénfigo induce apoptosis de querat inocito a través de la trayectoria apoptótica extrínseca activada por el sistema Fas/FasL.

Los estudios recientes han demostrado que los componentes del complejo de adhesión caderin-catenin en uniones de adherencias epiteliales, se dirigen por caspasas durante la apoptosis ( eiske et al, 2001) . Con objeto de evaluar si la trayectoria apoptótica inducida por Fas/FasL también es responsable de separación desmosomal, tratamos durante 72 horas los "queratinocitos confluentes, cultivados en KGM en presencia de 1.8 mM de CaCl2 con suero de pénfigo con o sin terapia. Los extractos de proteina provenientes del cultivo se analizaron mediante manchado Western usando anticuerpos anti-Dsgl y anti-Dsg3. Se utilizó ß-actin como control interno.

Encontramos que el suero de pénfigo puede disociar Dsgl y Dsg3. En particular, el suero proveniente de pacientes no tratados, pero no el proveniente de pacientes bajo terapia de esteroides, disocian de tajo a Dsgl y Dsg3 (Fig. 8) .

De manera más importante, el tratamiento de querat inocitos con cantidades crecientes de FasL (0.1, 10, 100 ng/ml) durante 72 horas, disoció los Dsgs en una manera dependiente de dosis. Los extractos de proteina provenientes del cultivo se analizaron mediante manchado Western usando anticuerpos anti-Dsgl y anti-Dsg-3. La ß-actin se utilizó como control interno. Estas dosis son consistentes con las detectadas en suero de pénfigo (Fig. 9) .

Dados que FasL ejerce una importante función en la patogénesis de pénfigo, hemos examinado un anticuerpo anti-FasL (NOK2, anticuerpo producido mediante la linea de célula hibridoma N0K2, número de acceso No. FERM BP-5045) . Los que rat i noci to s confluentes, cultivados en KGM con 1.8mM de CaCl2, se trataron durante 72 horas con: 1. KGM solo; 2. anti-FasL (N0K2, ?dµ?/pa?) Ab; 3. FasL (50ng/ml); 4. FasL + anti-FasL Ab . Presentamos evidencia de que anti-FasL Ab (N0K2) previene la disociación de dsg inducida por FasL. También demostramos que anti-FasL Ab (NOK2) inhibe la apoptosis inducida por caspasa-8 (Fig. 10A) . La Fig. 10B muestra que anti-FasL (NOK2) Ab previene la separación de célula-a-célula inducida por FasL, es decir, acantol i sis.

Con objeto de confirmar aún más la función principal de FasL, hemos usado otros anticuerpos anti-FasL (F918-7-3, anticuerpo producido por la linea de célula hibridoma con número de acceso No. FERM BP-5533; F918-7-4, anticuerpo producido por la linea de célula hibridoma con número de acceso No. FERM BP-5534/ F919-9-18, anticuerpo producido por la linea de célula hibridoma con número de acceso No. FERM BP-5535) . Los que rat i noc i t os confluentes, cultivados en KGM con 1.8mM de CaCl2, se trataron durante 72 hrs con: KGM solo; FasL recombinante ( 5 Ong/ml ) ; medio de hibridoma diluido en 1:1 en KGM; FasL + medio de hibridoma a diferente dilución en KGM. Presentamos evidencia de que los anticuerpos de anti-FasL previenen la disociación de dsg3 inducida por FasL en una manera dependiente de dosis (Fig. 11A. y Fig. 11B) , inhibiendo la activación de apoptosis inducida por caspasa-8 (Fig. 11A) . La Fig. 11C muestra que FasL Ab contenido en el medio de la linea de célula hibridoma FERM BP-5535, previene la separación de célula-a-célula inducida por FasL, es decir, acantolisis .

Para investigar si la trayectoria apoptótica extrínseca es responsable de la disociación de dsg, pre-tratamos los queratinoci tos confluentes con inhibidor de caspasa-8 Z-IETD-FMK (???µ? durante 30 min) o con anti-FasL (NOK2, 15µg/ml) Ab . Después las células se incubaron durante 72 hrs con suero de pénfigo, saludable o no tratado. Los extractos de proteína provenientes del cultivo se analizaron mediante manchado Western como control interno. (Fig. 12A) . La Fig. 12B muestra que la separación de la célula (es decir, acantolisis) se previene por anti-FasL Ab o inhibidor de caspasa-8. Estos resultados indican que la inhibición de FasL o la trayectoria apoptótica previene tanto la activación de caspasa-8 como también la disociación de dsg, bloqueando así la acantol i s i s .

Con objeto de evaluar también la función de los anticuerpos anti-FasL humanos (anticuerpo humano 3E1, producido por la línea de célula hibridoma con número de acceso No. ATCC PTA-4017 (anticuerpo PTA-4017) y anticuerpo humano 4G11, producido por la línea de célula hibridoma con número de acceso No. ATCC PTA-4018 (anticuerpo PTA-4018)) , los querat inoc i tos humanos se cultivaron en G (1,8 nM CaC12) y se trataron con FasL recombinante (50 ng/ml) solo o en combinación con los anticuerpos PTA-4017 y PTA-4018 a diferentes diluciones. Los anticuerpos humanizados anti-FasL BP-5035 y BP-5045 ya examinados en las Figuras 10a-10b a 12a-12b, se utilizaron como controles. La Figura 13A control interno. (Fig. 12A) . La Fig. 12B muestra que la separación de la célula (es decir, acantolisis) se previene por anti-FasL Ab o inhibidor de caspasa-8. Estos resultados indican que la inhibición de FasL o la trayectoria apoptótica previene. tanto la activación de caspasa-8 como también la disociación de dsg, bloqueando asi la acantol isis .

Con objeto de evaluar también la función de los anticuerpos anti-FasL humanos (anticuerpo humano 3E1, producido por la linea de célula hibridoma con número de acceso No. ATCC PTA-4017 (anticuerpo PTA-4017) y anticuerpo humano 4G11, producido por la linea de célula hibridoma con número de acceso No. ATCC PTA-4018 (anticuerpo PTA-4018) ) , los que rat inoc i tos humanos se cultivaron en KGM (1,8 nM CaC12) y se trataron con FasL recombinante (50 ng/ml) solo o en combinación con los anticuerpos PTA-4017 y PTA-4018 a diferentes diluciones. Los anticuerpos humanizados anti-FasL BP-5035 y BP-5045 ya io a examinados en las Figuras lOa-b a 12a-b, se utilizaron como controles. La Figura 13A muestra que aunque FasL por si solo disocia Dsg3 y activa caspasa-8, ambos anticuerpos humanos PTA-4017 y PTA-4018 y los anticuerpos humanizados BP-5035 y BP-5045 previenen este efecto (manchado Western) . La Figura 13B demuestra que aunque FasL por si solo induce la separación de célula-a-célula y la acantolisis, diferentes concentraciones del anticuerpo anti-FasL humano PTA-4017 y PTA-4018 previenen este efecto .

En conclusión, hemos demostrado que FasL ejerce doble actividad, tanto mediante activación de la trayectoria apoptótica extrínseca mediada por caspasa-8 como también disociación de Dsg. De acuerdo con nuestro trabajo, Wang y colaboradores (Wang et al, 2004) han sugerido que la apoptosis podría ser la causa del fenómeno a cant o 1 i t i ca . Mostraron que PV-IgG y un anticuerpo contra receptor Fas (anti-FasR) inducen lesiones in vitro en una manera similar, provocando: (1) secreción de FasL soluble; (2) cantidades celulares elevadas de FasR, FasL (soluble y de membrana) , proteínas p53 y Bax; (3) reducción en niveles de Bcl-2 celular; (4) enriquecimiento en caspasa 8 y activación de caspasas 1 y 3; (5) co-adición de FasL y FasR con caspasa 8 en complejo de señalización de inducción de muerte por membrana (DISC) . Por lo tanto, la trayectoria de la señalización de muerte mediada por Fas parece involucrarse en la formación de la lesión.

Se ha utilizado por largo tiempo un modelo animal bien establecido para el estudio del pénfigo. La transferencia pasiva de PVIgG en ratones neonatales induce la separación celular y la formación de la ampolla. Este modelo se ha usado para determinar el involucramiento de la apoptosis y FasL en la patogénesis de pénfigo. Inyectamos subcutáneamente PVIgG (5 mg/g/BW) purificado a partir de suero de pacientes en ratones Crl C57BL/6N. Los ratones normales, recién nacidos, tratados con IgG purificado de suero de individuos saludables (NIgG) se utilizará como controles. Los animales se sacrificaron 20 horas después de la inyección.

El teñido con eosin y hematoxilin muestra el desarrollo de ampollas solo en ratones tratados con PVIgG, pero no en ratones tratados con IgG humano normal (Fig. 14A) . La apoptosis se detectó ya sea por TUNEL o mediante activación de caspasa-3 solo en ratones tratados con PVIgG (Fig. 14B) .

Con objeto de evaluar la función de FasL in vivo, .los ratones se trataron con PVIgG o PVIgG más anticuerpo anti-FasL (clon MFL3, especifico para ratón) . Anti-FasL (40 µg/ratón) se administraron 3 hrs después de la inyección de PVIgG y previno la formación de ampollas en ratones, como se muestra por el teñido de H y E. Además, la longitud de las hendiduras en ratones tratados con anti-FasL se redujo notablemente (Fig. 15) .

En conclusión, hemos demostrado que FasL ejerce doble actividad, tanto al activar la trayectoria apoptótica extrínseca mediada por caspasa-8 como también por la disociación de Dsg. De manera más importante, el bloqueo de FasL protege de la acantolisis in vitro e in vi vo .

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Claims (7)

REIVINDICACIONES

1. Uso de (i) un anticuerpo humano monoclonal o un fragmento de enlace a antigeno del mismo, especifico para proteína de ligando fas humano (FasL) , en donde el anticuerpo monoclonal comprende al menos una región variable de cadena pesada y al menos una región variable de cadena ligera, en donde las secuencias aminoácidas de las regione s determinantes complementarias ( CDRs ) de la cadena pesada son: (ai) CDR Hl : Arg His Gly lie Thr (SE QID NO: 13) o (a2) CDR Hl : Ser His Gly lie Ser (SEQ ID NO: 14 ) , (bi) CDR H2 : Trp lie Asn Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Val Gln Gly (SEQ ID NO: 15) o (b2) CDR H2 : Trp lie Asn Ala Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu Gln Gly (SEQ ID NO: 16) , (Ci) CDR H3 : Glu Thr Met Val Arg Gly Val Pro Leu Asp Tyr (SEQ ID NO: 17) o (c2) CDR H3 : Glu Thr Met Val Arg Gly Val Pro Cys Asp Tyr (SEQ ID NO : 18) , o (di) una secuencia derivada por sustitución de 1, 2 : ó 3 amino ácidos de las SEQ ID ; Nos : 13, 14, 15, 16, 17 y/o 18, y/o las secuencias aminoácidas de las regiones determinantes complementarias (CDRs) de la cadena ligera son (a3) CDR Ll : Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala (SEQ ID NO: 19) , (b3) CDR L2: Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr (SEQ ID NO: 20) , (c3) CDR L3 : Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr (SEQ ID NO : 21) o (d3) una secuencia derivada por sustitución de 1, 2 ó 3 amino ácidos de las SEQ ID Nos: 19, 20 y/o 21 o (ii) un anticuerpo o un fragmento de enlace a antigeno del mismo, el cual reconoce el mismo epitope en FasL humano que el anticuerpo (i) , para la elaboración de un medicamento para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad de la piel asociada con acantolisis de queratinocito .

2. Uso de un anticuerpo monoclonal o un fragmento de enlace a anticuerpo del mismo, especifico para proteina de ligando Fas humano (FasL), en donde el anticuerpo monoclonal se produce por la célula hibridoma bajo el No. de Acceso ATCC PTA-4017 y/o ATCC PTA-4018 o un anticuerpo o fragmento de anticuerpo derivado de la misma, o (ii) un anticuerpo monoclonal o un fragmento de enlace a anticuerpo del mismo, el cual reconoce el mismo epitope de FasL humano que el anticuerpo de (i) para la elaboración de un medicamento para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad de la piel asociada con acantolisis de queratinocito .

3. El uso según las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque el anticuerpo o un fragmento de enlace a antigeno del mismo se selecciona a partir de un anticuerpo parcial o completamente humanizado, un anticuerpo de cadena individual parcial o completamente humanizado o un fragmento del mismo.

4. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la enfermedad de la piel se asocia con la activación de una trayectoria apoptótica y/o la disociación de desmogleina.

5. El uso según cualquiera de las reivindic ciones 1-4, en donde la enfermedad de la piel es pénfigo.

6. El uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes en una terapia de combinación con al menos una terapia adicional, eficaz contra la enfermedad de la piel.

7. El uso según la reivindicación 6 en combinación con al menos un fármaco inmuno-supresor adicional, en particular con al menos un esteroide adicional.