KR101769858B1

KR101769858B1 - 항 Ｆａｓ 리간드 항체를 함유한 천포창 치료제

Info

Publication number: KR101769858B1
Application number: KR1020117015680A
Authority: KR
Inventors: 카를로 핀셀리; 알레산드라 마르코니
Original assignee: 핀셀 에스알엘
Priority date: 2008-12-12
Filing date: 2009-12-14
Publication date: 2017-08-21
Also published as: JP2012511550A; MX2011006203A; ZA201104130B; HK1161884A1; IL213213A; PL2376536T3; CN102405234A; WO2010066914A3; DK2376536T3; EP2376536A2; AU2009326978A1; JP5773882B2; RU2556818C2; US9255150B2; RU2011128702A; IL213213A0; NZ593312A; KR20110094327A; EP2376536B1; AU2009326978B2

Abstract

본 발명은 각질세포 극세포해리와 연관된 피부 질환의 예방 및/또는 치료, 특히 천포창의 예방 및/또는 치료를 위한, FasL 길항제, 예를 들면, 인간 Fas 리간드(CD95L 또는 Apo1L로도 지칭되고, 본 명세서에서 FasL로 약칭됨)에 대한 인간화 항체의 용도에 관한 것이다.

Description

항 Ｆａｓ 리간드 항체를 함유한 천포창 치료제{Remedies for pemphigus containing anti Fas ligand antibodies}

본 발명은 인간 Fas 리간드(CD95L 또는 Apo1L로도 지칭되며 하기에서 FasL로 약칭됨)의 길항제의 용도, 보다 구체적으로, 각질세포 극세포해리(keratinocyte acantholysis)와 연관된 피부 질환의 예방 및/또는 치료, 특히, 천포창의 예방 및/또는 치료를 위한 FasL에 대한 인간화 항체의 용도에 관한 것이다.

천포창은 데스모좀 단백질(desmosomal protein)(데스모글레인, dsg)에 대한 자가항체에 의한 각질세포 부착의 상실을 특징으로 하는 자가면역 수포성 피부 상태(autoimmune bullous skin condition)이다. 천포창은 매년 100.000명 당 약 1 내지 5명의 발병률의 전세계적 분포를 가지며, 여성에서 우세하다.

천포창은 극세포해리(acantholysis)로 알려진 과정으로 이어지는 초기저 각질세포(suprabasal keratinocyte)의 부착의 상실을 특징으로 한다. 천포창의 발병은 주로 항-데스모글레인 항체 외에, 항콜린성 수용체 항체의 새로운 그룹이 극세포해리를 유도할 수 있다는 것 때문에 주요한 정정을 겪고 있다(Kalish, 2000). 또한, 입체적 방해만으로는 항원-항체 결합시 수포 형성을 설명할 수 없다는 것이 입증되었다 (Kitajima, 2002). 또한, 데스모좀 형성은 천포창 자가항체(PVIgG)의 천포창으로의 결합에 의해 저해되지 않으나, 데스모좀 결합(desmosomal connections)이 PVIgG에 의한 치료 후 24 내지 36시간 경과시 해리된다는 것이 확인되었다. 이 동안, PVIgG에 의해 유발된 일련의 신호 전달 단계들이 일어난다.

이 관찰들은 천포창에서 아폽토시스(apoptosis)의 역할을 시사한다. 실제로, 천포창은 세포 부착의 결핍에 의한 질환이고(Payne AS et al, 1978) 세포 박리(detachment)와 연관되어 아폽토시스가 일어날 수 있다(Marconi et al, 2004). 이 개념은 병변성 천포창 피부에서 아폽토시스의 검출에 의해 완전히 확인된다. 특히, 극세포해리성(acantholytic) 세포는 아폽토시스의 주요한 마커를 발현한다(Wang X et al, 2004). 보다 흥미롭게도, TUNEL-표지 핵이 또한 수포개(blister roof)에 부착된 것으로 발견되어, 박리 전에 병변주위(perilegional) 피부에 사멸(apoptosis) 세포의 존재를 시사한다. 또한, Ig을 발현하는 아폽토시스 세포 및 활성화된 카스파아제-8이 병변의 가장자리에서 검출되고, 이 영역에서는 세포-세포 접촉의 붕괴가 관찰되지 않는다(Wang X et al, 2004). 이 데이터는 천포창에서, 극세포해리 전에 아폽토시스가 각질세포에서 일어난다는 것을 명확하게 입증한다.

아폽토시스는 세포 항상성의 조절에서 근본적인 역할을 수행하고 다수의 병태 생리학적 과정에 관여한다. 아폽토시스는 세포 대 세포 박리(Rezgui et al, 2000; Bergin et al, 2000) 및 세포-매트릭스 상호작용의 상실(Giancotti and Ruoslahti, 1999)에 이어 일어날 수 있다.

Fas (또는 FasR)은 Fas 리간드(FasL)와 결합시, 다수의 세포 시스템에서 아폽토시스를 유발하는 TNF-수용체 수퍼패밀리의 일원이다(Sharma et al, 2000). Fas-FasL-유도 아폽토시스의 세포내 신호전달은 FADD (Fas-associated death domain) 및 FLICE (FADD-like ICE, caspase 8)와 같은 다수의 어댑터 분자의 동원(recruitment)을 통해 작용하고, 뒤이어 FLIP (FLICE inhibitory protein)에 의해 억제된다(Juo et al, 1998). Fas-FasL 상호작용은 AIDS (Bahr et al, 1997) 및 전신 홍반성 루푸스 (Kovacs et al, 1997)와 같은 여러 면역-염증성 상태 및 감염성 상태의 발병기전에 관여한다. Fas-FasL 경로의 관련을 특징으로 하는 피부 질환은 급성 이식편대 숙주병(graft versus host disease), 독성 표피 괴사(toxic epidermal necrolysis) 및 흑색종을 포함한다(Wehrli et al, 2000). 또한, 극세포해리-유사 병변이 PVIgG 및 항-FasR에 의해 처리된 배양 각질세포에서 관찰되고, PvIgG는 병변 형성의 수시간 전에 세포 막 상에서 FasR, FasL 및 카스파아제-8의 클러스터링(clustering)을 유도하는 것으로 보고되었다(Wang X et al, 2004). 또한, 카스파아제-1-유사 억제제가 천포창 마우스 모델에서 수포 형성을 유의성 있게 차단했다는 것이 보고되었다(Li et al, 2006). 종합하면, 이 데이터는 FasL 및 외인성 아폽토시스 경로가 극세포해리를 유발하는 기작에서 중요한 역할을 수행한다는 것을 나타낸다. 천포창 자가항체의 속성과 관계없이, PVIgG에 대한 노출은 극세포해리 수시간 전에 FasL을 포함한, 여러 프로-아폽토시스 유전자의 발현을 상향 조절한다. 또한, 정맥내 IgG (IVIgG)는 각질세포에서 FasL의 PVIgG-유도 상향 조절 및 아폽토시스를 방지한다. IVIgG도 인 비보에서 극세포해리 및 아폽토시스를 방지한다(Arredondo J et al, 2005).

치료하지 않으면, 심상성 천포창(pemphigus vulgaris)의 사망률은 100%에 이른다. 천포창을 제어하기 위해 조기 전신 요법이 요구되나, 전신 요법의 부작용은 심각한 합병증이다. 치료는 코르티코스테로이드, 금 함유 약제, 항-염증성 약물 다프손(dapsone), 또는 면역계를 억제하는 약제(예를 들면, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 사이클로스포린, 사이클로포스파미드, 또는 미코페놀레이트 모페틸)의 투여를 포함한다. 현재 천포창에 대한 가장 일반적인 치료제는 평생 투여되어야 하고 심각한 부작용을 유발할 수 있는 스테로이드이다. 대부분의 천포창 환자들은 이 부작용에 의해 사망한다. 일부 항생제, 특히, 미노사이클린 및 독시사이클린도 효과적이다. 정맥내 면역글로불린(IVIg)이 종종 이용된다. 혈장분리교환술(Plasmapheresis)은 항체-함유 혈장이 혈액으로부터 제거되고 정맥 수액(intravenous fluid) 또는 공여된 혈장에 의해 대체되는 과정이다. 혈장분리교환술은 혈류 중 항체의 양을 감소시키기 위해 전신 투약(systemic medication)에 더해 이용될 수 있다. 또한, 다수의 신규한 분자들이 현재 개발되고 있다: 미코페놀레이트 모페틸, PI-0824, PRTX-100, 항-CD20은 T 세포 및 B 세포에 대해 작용하는 면역억제제이다.

현재 사망률은 여전히 5 내지 25% 범위이다; 감염이 사망의 가장 빈번한 원인이고, 장기적 면역억제 요법(주로 코르티코스테로이드)이 여전히 높은 사망률을 유발하는 중요한 인자들 중 하나이다. 면역글로불린은 일부 단기 개선을 가져올 수 있으나, 지속적인 완화를 유도하는 것으로 보이지 않으며, 그 비용 때문에 장기 사용은 비현실적이다.

또한, 혈장분리교환술의 이용에는 여러 고려사항(caveat)이 있다. 프레드니손 또는 기타 면역억제제에 의해 면역이 억제되고 혈장분리교환술을 받은 환자들은 패혈증에 의한 급사의 더 높은 위험을 갖는다. 또한, 치료는 매우 비싸고, 치료제의 투여하기 위해 2주의 입원 기간이 필요하다. 따라서, 패혈증에 의한 급사의 위험 및 고비용 때문에, 혈장분리교환술은 환자가 명백하게 그 질환 자체로 인해 사망할 위험이 있는 가장 난치성(refractory) 케이스에만 적용된다.

본 발명의 목적은 천포창의 치료제를 제공하는 것이다. FasL을 차단하는 신규한 약물의 개발이 세포 박리 및 피부 병변의 형성을 완전히 예방할 수 있게 할 것이다.

전반적으로, 본 발명은 FasL 길항제를 투여하는 것에 의한 각질세포 극세포해리와 연관된 피부 질환의 치료에 관한 것이다. FasL 길항제는 항 FasL 항체, 특히, 인간화 항-FasL 항체 또는 인간 항-FasL 항체, 안티센스 분자와 같은, Fas 발현의 핵산 효능자(effector) 분자, 또는 siRNA 분자와 같은 RNA 간섭을 수행할 수 있는 분자, 가용성 Fas 수용체 분자, 길항적 FasL 뮤테인(mutein), 및 Fas-FasL 상호작용을 억제하는 저분자량 화학적 화합물로부터 선택될 수 있다. FasL 길항제는 각질세포 아폽토시스 및 뒤이은 세포-세포 박리(극세포해리)를 방지한다. 따라서, FasL 길항제는 천포창의 예방 및/또는 치료, 예를 들면, 점막피부 천포창(mucocutaneous pemphigus)의 예방 및/또는 치료를 위해 특히 적합하다.

본 발명은 FasL의 생물학적 효과를 억제하는 하나 이상의 화합물을 포함하는 약제에 관한 것이다. 본 명세서에서 사용된 표현 "FasL의 생물학적 효과를 억제하는 화합물(compound inhibiting the biological effects of FasL)"은 FasL의 생물학적 효과를 완전히 또는 적어도 실질적으로 억제하거나 또는 중화시킬 수 있는 모든 화합물을 의미한다. 예를 들면, 억제 또는 중화 효과는 FasL의 그의 천연 수용체로의 결합 및 따라서, 그에 의해 유발되는 신호 전달을 저해하는 것에 기반할 수 있다. 이는 예를 들면, FasL 자체에 결합하는 항체, 또는 Fas를 모사하는 가용성 수용체, 또는 길항적 FasL 뮤테인(mutein)을 이용하여, FasL의 세포 수용체로의 결합을 차단하는 것에 의해 이루어질 수 있다. siRNA에 의한 Fas 또는 FasL 발현의 간섭은 Fas/FasL 시스템을 차단할 것이다.

FasL 길항제 요법은 단독요법(monotherapy)이거나 또는 천포창 또는 특히, 전술된 바와 같은, 다른 피부 질환의 치료를 위해 적합한 다른 약제와 조합되어 적용될 수 있다. 예를 들면, FasL 길항제와 스테로이드의 조합 요법은 스테로이드 투여량의 급격한 감소를 가능하게 할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 인간 FasL 리간드에 대한 항체, 또는 그의 활성 단편을 활성 성분으로 포함하는, 천포창 치료제가 제공된다. 상기 항체는 바람직하게는 키메라 항-FasL 항체, 인간화 또는 인간 항-FasL 항체 또는 항원-결합 단편 또는 유도체, 예를 들면, 재조합 단쇄 항체(single chain antibody)이다. 필요한 경우, 상기 항체는 효능자(effector) 분자, 예를 들면, 세포증식억제(cytostatic) 화합물, 세포독성 화합물 및/또는 방사성활성 화합물에 접합될 수 있다.

본 발명에 따른, 각질세포 극세포해리와 연관된 피부 질환, 특히, 천포창의 치료를 위해 적합한 바람직한 인간화 항체가 WO 1997/002290A1 ("Anti-Fas ligand antibodies and assay method using the same antibody") 또는 WO 1998/010070 A1 ("Humanized immunoglobulin reacting specifically with Fas Ligand or active fragments thereof and region inducing apoptosis originating in Fas Ligand humanized antibodies")에 기재되며, 상기 특허출원의 내용은 참조에 의해 본 명세서에 포함된다. 본 발명에 따른, 각질세포 극세포해리와 연관된 피부 질환, 특히, 천포창의 치료를 위해 적합한 추가적인 바람직한 인간화 항체가 US 7,262,277 ("Antagonistic Anti-hFas ligand human antibodies and fragments thereof)에 기재되며, 상기 특허의 내용도 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.

인간 항체 또는 인간화 항체는 인간 치료에서의 사용을 위한 마우스 항체 및 일부 경우에 키메라 항체에 대해 적어도 3가지 잠재적 장점을 갖는다: 1) 효능자 부분이 인간 유래이기 때문에, 인간 계통(system)의 다른 부분들과 보다 효과적으로 상호작용할 수 있다; 2) 인간 면역계는 인간화 항체의 프레임워크 또는 C-영역을 외래 인자로 인식하지 않고, 따라서, 그와 같은 주입된 항체에 대한 항체 반응이 완전한 외래 마우스 항체 또는 부분적 외래인 키메라 항체에 대한 것보다 더 낮다; 3) 주입된 인간화 항체는 아마도 천연 인간 항체와 보다 유사한 반감기를 가져서, 보다 적은 투여량을 보다 낮은 빈도로 투여할 수 있게 한다.

또 다른 바람직한 FasL 길항제는 Fas 수용체의 세포외 가용성 부분을 포함하는 가용성 FasR 분자 또는 경쟁적 또는 비-경쟁적 길항제 활성을 갖는 변형된 길항적 FasL 분자이다. 이 분자들은 FasL이 가용성 수용체 유사체에 결합하거나 또는 길항적 FasL 분자가 천연 수용체에 결합하여, 생물학적 활성 FasL의 천연 수용체로의 결합을 감소시키거나 또는 완전히 제거한다는 점에서 FasL/FasR 상호작용을 저해한다. siRNA에 의한 치료 동안, Fas 및/또는 FasL 단백질 또는 RNA 수준의 분석이 개체의 치료에서 치료 유형 및 치료의 경과(course of therapy)를 결정하기 위해 이용될 수 있다. Fas 및/또는 FasL 단백질 또는 RNA 수준의 모니터링이 치료 결과를 예측하고 소질(trait), 상태 또는 질환과 연관된 특정한 Fas 및/또는 FasL 단백질의 수준 및/또는 활성을 조절하는 화합물 및 조성물의 효능을 결정하기 위해 이용될 수 있다.

제1의 특별히 바람직한 양태에서, 본 발명은

(i) 인간 Fas 리간드 단백질 (FasL)에 대해 특이적인 단일클론 인간 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로서, 상기 단일클론 항체는 하나 이상의 중쇄 가변 영역 및 하나 이상의 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 중쇄의 상보성 결정 영역(complementary determining region, CDR)의 아미노산 서열은:

(a₁) CDR H1: Asn Tyr Trp Ile Gly (서열번호 1),

(b₁) CDR H2: Tyr Leu Tyr Pro Gly Gly Leu Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys (서열번호 2),

(c₁) CDR H3: Tyr Arg Asp Tyr Asp Tyr Ala Met Asp Tyr (서열번호 3) 또는

(d₁) 서열번호 1, 2 및/또는 3의 1개, 2개 또는 3개의 아미노산의 치환에 의해 유래된 서열이고,

및/또는 상기 경쇄의 상보성 결정 영역(CDR)의 아미노산 서열은

(a₂) CDR L1: Lys Ser Thr Lys Ser Leu Leu Asn Ser Asp Gly Phe Thr Tyr Leu Gly (서열번호 4),

(b₂) CDR L2: Leu Val Ser Asn Arg Phe Ser (서열번호 5),

(c₂) CDR L3: Phe Gln Ser Asn Tyr Leu Pro Leu Thr (서열번호 6) 또는

(d₂) 서열번호 4, 5 및/또는 6의 1개, 2개 또는 3개의 아미노산의 치환에 의해 유래된 서열인 것인 단일클론 인간 항체 또는 그의 항원 결합 단편이거나, 또는

(ii) 상기 (i)의 항체와 동일한 인간 FasL의 에피토프를 인식하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 각질세포 극세포해리(keratinocyte acantholysis)와 연관된 피부 질환, 특히, 천포창의 예방 및/또는 치료를 위한 약제의 제조를 위한 용도에 관한 것이다.

제2의 특별히 바람직한 구체예에서, 본 발명은

(i) 수탁번호 FERM BP-5045 하에 기탁된 하이브리도마 세포에 의해 제조되는 것인 인간 Fas 리간드 단백질(FasL)에 특이적인 단일클론 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 그로부터 유래된 항체 또는 항체 단편, 또는

(ii) 상기 (i)의 항체와 동일한 인간 FasL의 에피토프를 인식하는 단일클론 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 각질세포 극세포해리와 연관된 피부 질환, 특히, 천포창의 예방 및/또는 치료를 위한 약제의 제조를 위한 용도에 관한 것이다.

제3의 특별히 바람직한 양태에서, 본 발명은

각질세포 극세포해리와 연관된 피부 질환, 특히 천포창의 예방 및/또는 치료를 위한 약제의 제조를 위한,

(i) 인간 Fas 리간드 단백질 (FasL)에 대해 특이적인 단일클론 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로서, 상기 단일클론 항체는 하나 이상의 중쇄 가변 영역 및 하나 이상의 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 중쇄의 상보성 결정 영역CDR)의 아미노산 서열은:

(a₁) CDR H1: Glu Tyr Pro Met His (서열번호 7),

(b₁) CDR H2: Met Ile Tyr Thr Asp Thr Gly Glu Pro Ser Tyr Ala Glu Glu Phe Lys Gly (서열번호 8),

(c₁) CDR H3: Phe Tyr Trp Asp Tyr Phe Asp Tyr (서열번호 9) 또는

(d₁) 서열번호 7, 8 및/또는 9의 1개, 2개 또는 3개의 아미노산의 치환에 의해 유래된 서열이고,

(a₂) CDR L1: Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn (서열번호 10),

(b₂) CDR L2: Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser (서열번호 11),

(c₂) CDR L3: Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Trp Thr (서열번호 12) 또는

(d₂) 서열번호 10, 11 및/또는 12의 1개, 2개 또는 3개의 아미노산의 치환에 의해 유래된 서열인 것인 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는

(ii) 상기 (i)의 항체와 동일한 인간 FasL의 에피토프를 인식하는 단일클론 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 용도에 관한 것이다.

제4의 바람직한 양태에서, 본 발명은

(i) 수탁번호 FERM BP-5533, FERM BP-5534 및/또는 FERM BP-5535 하에 기탁된 하이브리도마 세포에 의해 제조되는 것인 인간 Fas 리간드 단백질(FasL)에 특이적인 단일클론 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 그로부터 유래된 항체 또는 항체 단편, 또는

특히 바람직한 구체예에서, 본 발명은 참조에 의해 그 내용이 본 명세서에 포함된, US 7,262,277에 기재된 바와 같은 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 항-FasL 인간 항체, 또는 그의 항원-결합 부분의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명에 따른 각질세포 극세포해리와 연관된 피부 질환의 치료를 위해 적합한 바람직한 항-FasL 인간 항체는 (참조에 의해 본 명세서에 포함된) US 7,262,277의 서열번호 2에 표시된 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, (참조에 의해 본 명세서에 포함된) US 7,262,277의 서열번호 10 또는 18에 표시된 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 중쇄 가변 영역을 더 포함한다. 보다 구체적으로, 본 발명은 각질세포 극세포해리와 연관된 피부 질환, 특히, 천포창의 예방 및/또는 치료를 위한 약제의 제조를 위한, (참조에 의해 본 명세서에 포함된) US 7,262,277에 기재된 항-hFas 인간 항체 (수탁번호 ATCC PTA-4017의 하이브리도마 세포에 의해 제조된) 3E1 및/또는 (수탁번호 ATCC PTA-4018에 의해 제조된) 4G11의 용도에 관한 것이다.

또 다른 바람직한 양태에서, 본 발명은

(i) 인간 Fas 리간드 단백질 (FasL)에 대해 특이적인 단일클론 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로서, 상기 단일클론 항체는 하나 이상의 중쇄 가변 영역 및 하나 이상의 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 중쇄의 상보성 결정 영역(CDR)의 아미노산 서열은:

(a₁) CDR H1: Arg His Gly Ile Thr (서열번호 13) 또는

(a₂) CDR H1: Ser His Gly Ile Ser (서열번호 14),

(b₁) CDR H2: Trp Ile Asn Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Val Gln Gly (서열번호 15) 또는

(b₂) CDR H2: Trp Ile Asn Ala Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu Gln Gly (서열번호 16),

(c₁) CDR H3: Glu Thr Met Val Arg Gly Val Pro Leu Asp Tyr (서열번호 17) 또는

(c₂) CDR H3: Glu Thr Met Val Arg Gly Val Pro Cys Asp Tyr (서열번호 18), 또는

(d₁) 서열번호 13, 14, 15, 16, 17 및/또는 18의 1개, 2개 또는 3개의 아미노산의 치환에 의해 유래된 서열이고,

(a₃) CDR L1: Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala (서열번호 19),

(b₃) CDR L2: Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr (서열번호 20),

(c₃) CDR L3: Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr (서열번호 21) 또는

(d₃) 서열번호 19, 20 및/또는 21의 1개, 2개 또는 3개의 아미노산의 치환에 의해 유래된 서열인 것인 단일클론 인간 항체 또는 그의 항원-결합 단편이거나, 또는

최종적인 추가적 양태에서, 본 발명은

(i) 수탁번호 ATCC PTA-4017 및/또는 ATCC PTA-4018 하에 기탁된 하이브리도마 세포에 의해 제조되는 것인 인간 Fas 리간드 단백질(FasL)에 특이적인 단일클론 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 그로부터 유래된 항체 또는 항체 단편, 또는

수탁번호 ATCC PTA-4017 및 ATCC PTA-4018의 하이브리도마 세포는 미국 버지니아주 20110-2209, 마나사스, 블러바드(Boulevard) 대학교, 10801, 미국 미생물 균주보존 센터(ATCC, American Type Culture Collection)에 2002년 1월 29일에 기탁했다.

본 발명의 약제는 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 약제학적 조성물로 제공될 수 있다. 바람직하게는, 상기 약제학적 조성물은 주사 또는 주입에 의해, 예를 들면, 정맥내로, 동맥내로, 피하로, 복막내로, 또는 기타 적합한 수단에 의해 투여된다. 상기 조성물은 국소로 또는 전신으로 투여될 수 있다. 바람직하게는, 상기 조성물은 전신으로 투여된다.

본 발명에서 사용하기에 적합한 약제학적 조성물은 의도된 목적을 달성하기 위한 유효량(effective dose)의 활성제를 포함한다. 본 발명의 약제의 유효 투여량은 투여 경로에 따라 0.1 ㎍ 내지 100 mg의 범위, 최대 약 1 g의 총 투여량일 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 매일, 예를 들면, 1일 1회 또는 수회 투여되거나, 또는 2 내지 4일 간격으로, 매주 또는 2주당 1회씩 투여될 수 있다. 약제는 1회 내지 수회의 약제 투여로 구성된 단일 투여 사이클로 투여되거나 또는 각각 1회 내지 수회의 약제 투여로 구성된 수회의 투여 사이클로 투여될 수 있다. 각 치료 사이클은 1일 내지 수주, 수개월 또는 심지어 수년의 지속기간을 가질 수 있다.

따라서, 본 발명에 따라, 약제는 또한 각질세포 극세포해리와 연관된 피부 질환 및 특히 천포창에 대해 효과적인 하나 이상의 추가적인 치료제와의 조합 요법(combination therapy)으로 이용될 수 있다. 상기 약제는 단독으로 이용되거나, 또는 투여량을 감소시키고 및/또는 만성적 부작용을 최소화하기 위해, 다른 면역억제제, 특히, 스테로이드와 조합되어 이용될 수 있다. 조합으로 이용되는 경우, 상기 약제는 바람직하게는 월 단위로 투여될 것이다. 단독으로 이용되는 경우, 상기 약제는 바람직하게는 개별적 케이스에 따라 시간 계획 내에서 지속적으로 투여될 것이다.

또한, 본 발명은 하기의 실시예에 의해 보다 상세하게 설명될 것이다.

본 발명자들은 먼저 TUNEL 염색에 의해 미치료(untreated) 천포창 환자로부터의 동결 절편으로 병변주위 피부로부터의 표피에서 아폽토시스의 존재를 평가하였다. 형광 표본을 공초점 스캐닝 레이저 현미경으로 분석하였다. 병변주위 표피로부터의 초기저층(suprabasal layer)에서, 대부분의 각질세포는 정상 세포 대비 아폽토시스 상태였다(도 1).

천포창 병변에서 아폽토시스를 확인하기 위해, 본 발명자들은 포르말린-고정되고 파라핀 포매된 생검을 이용하고 카스파아제-3의 활성 형태를 검출하였다. 염색 프로토콜은 제조사의 설명서에 따라, UltraVision LP Detection System AP Polymer 및 Fast Red Chromogen (Lab Vision Corporation, CA, USA)에 의해 수행하였다. 나프톨 포스페이트 기질(naphtol phosphate substrate)에서 Fast Red 정제에 의해 가시화를 수득하였다. 천포창 시료에서, 본 발명자들은 카스파아제-3 단편이 수포개(roof) 및 수포층(floor) 모두에 존재하고, 일부 세포는 병변주위 표피에서 양성이라는 것을 발견했다(도 2). 이 결과는 극세포해리를 초래하는 각질세포의 박리 전에 각질세포 사멸이 일어난다는 것을 나타내는 것으로 보인다.

아폽토시스(apototic) 각질세포가 천포창에서 풍부하게 발현되기 때문에, 본 발명자들은 천포창 혈청이 정상 인간 각질세포에서 아폽토시스를 유도할 수 있는지 여부를 탐색하고자 하였다. 이 목적을 위해, 각질세포를 챔버 슬라이드에 플레이팅하고 무혈청 배지(KGM)에서 합류전 상태(preconfluence)까지 배양하였다. 그 후, 세포들을 각질세포 기본 배지(keratinocyte basal medium)에서 배양하고 미치료 환자 또는 전신성 코르티코스테로이드(systemic corticosteroid)로 치료된 환자로부터 유래된 25% 혈청의 첨가에 의해 48시간 동안 처리하였다. 건강한 개체로부터의 혈청을 대조군으로 이용하였다. 아폽토시스는 인 시투(in situ) TUNEL 염색에 의해 평가하였다. 무작위로 선택된 영역(field)에서, 약 100개의 세포를 평가하고, TUNEL-양성 세포의 비율을 측정하였다. 천포창 환자로부터의 혈청은 인간 각질세포에서 아폽토시스를 유도했으나, 건강한 개체나 스테로이드 치료를 받고 있는 환자로부터의 혈청은 그렇지 않았다(도 3A-B).

Fas/FasL 시스템이 피부 수준에서도 다수의 아폽토시스 과정에 관여되기 때문에 (Wehrli et al, 2000), 본 발명자들은 2-부위 효소 면역분석법(two-site enzyme immunoassay)(ELISA)에 의해 천포창 환자로부터의 혈청에서 FasL 수준을 측정했다. 혈청 농도는 재조합 인간 FasL 표준 단백질 대비 450 nm에서의 흡광도에 의해 결정하였다. FasL 수준은 미치료 환자로부터의 혈청에서 매우 높았고, 코르티코스테로이드로 치료된 환자로부터의 혈청 또는 건강한 개체로부터의 혈청에서는 검출 한계 미만이었다. HBV 환자로부터의 혈청을 양성 대조군으로 이용하였다(도 4A). 한 환자에서, FasL 수준은 전신 스테로이드 요법에 의해 점진적으로 감소하였다(도 4B).

FasL이 천포창 혈청에 다량으로 존재하기 때문에, 본 발명자들은 그의 동족(cognate) 수용체 FasR의 발현을 관찰하였다. 이 목적을 위해, 본 발명자들은 포르말린-고정되고 파라핀 포매된 생검을 이용하였다. 염색 프로토콜은 제조사의 설명서에 따라, UltraVision LP Detection System AP Polymer 및 Fast Red Chromogen (Lab Vision Corporation, CA, USA)에 의해 수행하였다. 나프톨 포스페이트 기질에서 Fast Red 정제에 의해 가시화를 수득하였다. FasR은 정상 세포의 기저 각질세포에서만 발현되나, 활성 천포창 병변에서 FasR은 기저 세포 및 초기저 세포 모두에서 검출된다. 훨씬 더 흥미로운 것은, 점막세포 천포창(mucocutaneous pemphigus, PMC)에서 FasR은 표피층 전체에서 수포 형성 전에도 발현되는 것으로 보인다는 것이다(도 5).

FasL은 카스파아제-8 활성화 외인성 아폽토시스 경로의 주요한 유발자(trigger) 중 하나이다. 따라서, 본 발명자들은 이 경로가 천포창 아폽토시스에서 역할을 수행하는지 여부를 평가하고자 하였다. 이 목적을 위해, 환자 혈청을 항-FasL 중화 항체 또는 카스파아제-8 억제제로 전처리하고, 각질세포 배양물에 첨가하였다. 각질세포를 KGM에서 배양하고 천포창 혈청 또는 미치료 환자로부터의 혈청으로 처리하였다. 혈청을 항-FasL 중화 항체 (30분 동안 ml 당 2.5 mg) 또는 카스파아제-8 억제제 Z-IETD-FMK (30분 동안 100 μM)로 전처리하였다. 아폽토시스는 TUNEL 염색에 의해 평가하였다. 항-FasL 중화 항체 또는 카스파아제-8 억제제의 첨가는 천포창 혈청-유도 각질세포 아폽토시스를 부분적으로 방지하였다 (도 6).

또한, 각질세포를 도 6에서와 같이 처리하고 항-FasL 항체 또는 관련없는 면역글로불린을 제공하였다. 그 후, 웨스턴 블롯팅 분석을 위해 세포들을 RIPA 완충액 중에서 균질화시켰다. 막을 항 인간 카스파아제-8 또는 항-β-액틴 항체와 함께 인큐베이션시켰다. 자가방사선상(autoradiogram)의 밴드의 상대적 강도를 스캐닝 레이저 농도계측기(densitometry)에 의해 정량하였다. 결과는 카스파아제-8은 미처리 세포 대비, 천포창 혈청으로 처리된 각질세포에서 현저하게 활성화되고, 카스파아제 절단은 항-FasL 항체에 의한 전처리에 의해 부분적으로 억제되었다는 것을 보여주었다(도 7).

종합하면, 이 데이터는 천포창 혈청이 Fas/FasL 시스템에 의해 유발된 외인성 아폽토시스 경로를 통해 각질세포 아폽토시스를 유도한다는 것을 시사한다.

최근의 연구는 상피 결합 연접부(epithelial adherent junction)에서 카데린-카테닌 결합 복합체(cadherin-catenin adhesion complex)의 성분이 아폽토시스 동안 카스파아제의 표적이 된다는 것을 밝혔다(Weiske et al, 2001). Fas/FasL-유도 아폽토시스 경로가 또한 데스모좀 분리(desmosomal separation)를 일으키는지 여부를 평가하기 위해, 본 발명자들은 1.8 mM CaCl₂의 존재 하에 KGM에서 배양된, 합류된(confluent) 각질세포를 치료받거나 또는 치료받지 않은 천포창 혈청으로 72시간 동안 처리하였다. 배양물로부터의 단백질 추출물을 항-Dsg1 및 항-Dsg3 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다. β-액틴을 내부 대조군으로 이용하였다. 본 발명자들은 천포창 혈청이 Dsg1 및 Dsg3을 절단할 수 있다는 것을 발견했다. 특히, 미치료 환자로부터의 혈청은 Dsg1 및 Dsg3을 현저하게 절단했으나, 스테로이드 요법을 받고 있는 환자로부터의 혈청은 그렇지 않았다(도 8).

가장 중요하게는, 72시간 동안 증가되는 양의 FasL (0.1, 10, 100 ng/ml)에 의한 각질세포의 처리는 투여량-의존적 방식으로 dsg를 절단했다. 배양물로부터의 단백질 추출물을 항-Dsg1 및 항-Dsg3 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다. β-액틴을 내부 대조군으로 이용하였다. 이 투여량들은 천포창 혈청에서 검출된 것들과 일치한다(도 9).

FasL이 천포창의 발병에서 중요한 역할을 수행한다는 것을 고려하여, 본 발명자들은 항-FasL 항체(NOK2, 하이브리도마 세포주 NOK2, 수탁번호 FERM BP-5045에 의해 생산된 항체)를 테스트하였다. 1.8 mM CaCl₂의 존재 하에 KGM에서 배양된, 합류된 각질세포를 72 시간 동안 하기로 처리하였다: 1. KGM 단독; 2. 항-FasL (NOK2, 15 ㎍/ml) Ab; 3. FasL (500 ng/ml); 4. FasL + 항-FasL Ab. 본 발명자들은 항-FasL Ab (NOK2)가 FasL-유도 dsg 절단을 방지한다는 증거를 제시한다. 본 발명자들은 또한 항-FasL Ab (NOK2)가 카스파아제-8-유도 아폽토시스를 억제한다는 것을 보여준다(도 10A). 도 10B는 항-FasL (NOK2) Ab가 FasL-유도 세포-대-세포 박리, 즉, 극세포해리를 방지한다는 것을 보여준다.

FasL의 중심적 역할을 더 확인하기 위해, 본 발명자들은 다른 항-FasL 항체(F918-7-3, 수탁번호 FERM BP-5533의 하이브리도마 세포주에 의해 제조된 항체; F918-7-4, 수탁번호 FERM BP-5534의 하이브리도마 세포주에 의해 제조된 항체; F919-9-18, 수탁번호 FERM BP-5535의 하이브리도마 세포주에 의해 제조된 항체)를 이용했다. 1.8 mM CaCl₂의 존재 하에 KGM에서 배양된, 합류된 각질세포를 72 시간 동안 KGM 단독; 재조합 FasL (50 ng/ml); KGM에 1:1로 희석된 하이브리도마 배지; FasL + KGM 중의 상이한 희석 비율의 하이브리도마 배지로 처리하였다. 본 발명자들은 항-FasL 항체가 FasL-유도 dsg3 절단을 투여량-의존적 방식으로 방지하고 (도 11A 및 도 11B), 카스파아제-8 유도 아폽토시스 활성화를 억제한다(도 11A)는 증거를 제시한다. 도 11C는 하이브리도마 세포주 FERM BP-5535로부터의 배지에 함유된 FasL Ab가 FasL-유도 세포-대-세포 박리, 즉, 극세포해리를 방지한다는 것을 보여준다.

외인성 아폽토시스 경로가 dsg 절단을 일으키는지 여부를 조사하기 위해, 본 발명자들은 합류된 각질세포를 카스파아제-8 억제제 Z-IETD-FMK (30분간 100 μM) 또는 항-FasL (NOK2, 15 ㎍/ml) Ab로 전처리하였다. 그 후, 세포들을 건강한 혈청 또는 미치료 천포창 혈청과 함께 72시간 동안 인큐베이션시켰다. 배양물로부터의 단백질 추출물을 항-Dsg3 항체 및 항-카스파아제-8 Ab를 이용하여 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다. 빈쿨린을 내부 대조군으로 이용하였다(도 12A). 도 12B는 세포 박리(즉, 극세포해리)가 항-FasL Ab 또는 카스파아제-8 억제제에 의해 방지된다는 것을 보여준다. 이 결과들은 FasL 또는 카스파아제-8-활성화 아폽토시스 경로를 억제하는 것이 카스파아제-8 활성화 및 dsg 절단을 방지하고, 따라서 극세포해리를 차단한다는 것을 나타낸다.

또한, 인간 항-FasL 항체(수탁번호 ATCC PTA-4017의 하이브리도마 세포주에 의해 제조된 인간 항체 3E1(항체 PTA-4017) 및 수탁번호 ATCC PTA-4018의 하미브리도마 세포주에 의해 제조된 인간 항체 4G11(항체 PTA-4018))의 역할을 평가하기 위해, 인간 각질세포를 KGM(1.8 nM CaCl₂)에서 배양하고, 단독 또는 상이한 희석 비율의 PTA-4017 및 PTA-4018 항체와 조합된 재조합 FasL(50 ng/ml)로 처리했다. 도 10 및 12에서 이미 테스트된 항-FasL 인간화 항체 BP-5035 및 BP-5045를 대조군으로 이용했다. 도 13a는 FasL 단독은 Dsg3을 절단하고 카스파아제-8을 활성화시키나, 항체 PTA-4017 및 PTA-4018과 인간화 항체 BP-5035 및 BP-5045는 이 효과를 방지한다는 것을 보여준다(웨스턴 블롯팅). 도 13b는 FasL 단독은 세포-대-세포 해리 및 극세포해리를 유도하나, 상이한 농도의 인간 항-FasL 항체 PTA-4017 및 PTA-4018은 이 효과를 방지한다는 것을 보여준다.

결론적으로, 본 발명자들은 FasL이 카스파아제-8 매개 외인성 아폽토시스 경로 및 Dsg 절단을 활성화시키는 것에 의해 이중 활성을 발휘한다는 것을 보여주었다. 본 발명자들의 연구와 일치하게, Wang과 동료들(Wang et al, 2004)은 아폽토시스가 극세포해리 현상의 원인일 수 있다는 것을 시사했다. 그들은 PV-IgG 및 Fas 수용체에 대한 항체(항-FasR)가 유사한 방식으로 인 비트로에서 병변을 유도하여: (1) 가용성 FasL의 분비; (2) FasR, FasL (가용성 FasL 및 막 FasL), Bax 및 p53 단백질의 세포내 량(cellular amount) 증가; (3) 세포 Bcl-2 수준의 감소; (4) 카스파아제 8의 증대(enrichment), 및 카스파아제 1 및 3의 활성화; (5) 막 사망-유도 신호전달 복합체(death-inducing signaling complex, DISC)에서 FasL 및 FasR과 카스파아제 8의 공집합(coaggregation)을 유발한다는 것을 보여주었다. 따라서, Fas-매개 사망 신호전달 경로가 병변 형성에 관여되는 것으로 보인다.

잘 정립된 동물 모델이 천포창을 연구하기 위해 오랫동안 널리 이용되었다. PVIgG의 신생(neonatal) 마우스로의 수동적 전달은 세포 박리 및 수포(bulla)의 형성을 유도한다. 이 모델은 천포창의 발병에서 아폽토시스와 FasL의 관여를 평가하기 위해 이용되었다. 본 발명자들은 신생 C57BL/6N CrI 마우스에 환자 혈청으로부터 정제된 PVIgG (5mg/g/BW)를 피하로 주사하였다. 건강한 개체의 혈청으로부터 정제된 IgG(NIgG)로 처리된 정상 신생 마우스를 대조군으로 이용하였다. 동물들을 주사 후 20시간에 희생시켰다.

헤마톡실린 및 에오신 염색은 PVIgG로 처리된 마우스에서만 수포가 형성되고, 정상 인간 IgG로 처리된 마우스에서는 수포가 형성되지 않는다는 것을 보여준다 (도 14A). 아폽토시스는 PVIgG로 처리된 마우스에서만 TUNEL에 의해 또는 카스파아제-3 활성화에 의해 검출되었다 (도 14B).

인 비보에서 FasL의 역할을 평가하기 위해, 마우스를 PVIgG 또는 PVIgG + 항-FasL 항체(MFL3 클론, 마우스 특이적)로 처리하였다. 항-FasL (40 ㎍/마우스)을 PVIgG 주사 3시간 후에 투여하고 H & E 염색에 의해 나타난 바와 같이, 마우스에서 수포 형성을 방지했다. 또한, 항-FasL 처리 마우스에서 틈새(cleft)의 길이는 현저하게 감소되었다(도 15).

결론적으로, 본 발명자들은 FasL이 카스파아제-8 매개 외인성 아폽토시스 경로 및 Dsg 절단을 활성화시키는 것에 의해 이중 활성을 발휘한다는 것을 발견했다. 가장 중요하게는, FasL을 차단시키는 것은 인 비트로 및 인 비보에서 극세포해리로부터 보호한다.

참조문헌

Aoudjit F and Vuori K: Matrix attachment regulates FAS-induced apoptosis in endothelial cells: a role for c-FLIP and implications for anoikis. J Cell Biol 152: 633-643, 2001

Arredondo J et al Am J Pathol 167:1531-1544, 2005

Bahr GM, Capron A, Dewulf J, Nagata S1 Tanaka M, Bourez JM, Mouton Y. Elevated serum level of Fas ligand correlates with the asymptomatic stage of human immunodeficiency virus infection. Blood 90:896-898, 1997

Bergin E, Levine JS, Koh JS, Lieberthal W: Mouse proximal tubular cell-cell adhesion inhibits apoptosis by a cadherin-dependent mechanism. Am J Physiol Renal Physiol 278:F758-F768, 2000

Du1 Z., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1996 226, 595-600

Frisch SM: Evidence for a function of death-receptor-related, death-domain-containing proteins in anoikis. Current Biol 9:1047-1049, 1999

Frisch SM, Francis H: Disruption of epithelial cell-matrix interactions induces apoptosis. J Cell Biol 124:619-626, 1994

Frisch SM, Screaton RA: Anoikis mechanisms. Curr Opin Cell Biol 13:555-562, 2001

Giancotti FG1 Ruoslahti E: lntegrin signaling. Science 285: 1028-1032, 1999

Gniadecki R, Jemec GBE, Thomsen BM1 Hansen M: Relationship between keratinocyte adhesion and death: anoikis in acantholytic diseases. Arch Dermatol Res 290:528-532, 1998

Grossman J, Walther K, Artinger M, Kiessling S, Scholmerich J: Apoptotic signaling during initiation of detachment-induced apoptosis ("anoikis") of primary human intestinal epithelial cells. Cell Growth & Diff 12:147-155, 2001

Jolles S, Hughes J, Whittaker S: Dermatological uses of high-dose intravenous immunoglobulin. Arch Dermatol 134:80-86, 1998

Juo P, Kuo CJ, Yuan J, Blenis J: Essential requirement for caspase-8/FLICE in the initiation of the Fas-induced apoptotic cascade. Curr Biol 8: 1001 -1008, 1998

Kalish RS: pemphigus vulgaris: the other half of the story. J Clin Invest 106: 1433-1435, 2000

Kitajima Y:Mechanisms of desmosome assembly and disassembly. Clin Exp Dermatol. 27:684-90, 2002

Kovacs B, Liossis SN, Dennis GJ, Tsokos GC: Increased expression of functional Fas ligand in activated T-cells from patients with systemic lupus erythematosus. Autoimmunity 25:213-221, 1997

Lee, J., et al. Endocrinology, 1997, 138, 2081-2088

Li N, Zhao M, Liu Z, Diaz LA: Pathogenic role of apoptosis in experimental pemphigus. J Invest Dermatol 126: 173 Abstract, 2006

Marconi A, Atzei P, Panza C1 FiIa C, Tiberio R1 Truzzi F, Wachter T, Leverkus M, Pincelli C: FLICE/caspase-8 activation triggers anoikis induced by βi integrin blockade in human keratinocytes. J Cell Sci 117: 5815-5823, 2004

Marconi A, Vaschieri C, Zanoli S, Giannetti A, Pincelli C Nerve growth factor protects human keratinocytes from ultraviolet-B-induced apoptosis. J Invest Dermatol 113:920-927, 1999

Nishimura S, Adachi M, lshida T, Matsunaga T, Uchida H, Hamada H, lmai K: Adenovirus-mediated transfection of caspase-8 augments anoikis and inhibits peritoneal dissemination of human gastric carcinoma cells. Cancer Res 61:7009-7014, 2001

O'Connell, J., et al. J. Exp. Med.,, 184, 1075-1082, 1996

Payne AS Curr Opin Cell Biol 16: 536-543, 2004

Pincelli C, Haake AR, Benassi L, Grassilli E, Magnoni C, Ottani D, Polakowska R, Franceschi C, Giannetti A Autocrine nerve growth factor protects human keratinocytes from apoptosis through its high affinity receptor (trk): a role for bcl-2. J Invest Dermatol 109: 757-764, 1997

Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 10029, and Verhoeyan et al., Science 239 (1988), 1534

Reed JC: Mechanisms of apoptosis. Am J Pathol 157:1415-1430

Rezgui SS, Honore S, Rognoni J-B, Martin P-M, Penel C: Up-regulation of α2β1 integrin cell-surface expression protects A431 cells from epidermal growth factor-induced apoptosis. lnt J Cancer 87: 360-367, 2000

Rytomaa M, Martins LM, Downward J: Involvement of FADD and caspase-8 signalling in detachment-induced apoptosis. Current Biol 9:1043-1046, 1999

Sharma K, Wang RX, Zhang LY, Yin DL, Luo XY, Solomon JC, Jiang RF1 Markos K, Davidson W, Scott DW, Shi YF: Death the Fas way: regulation and pathophysiology of Fas and its ligand. Pharmacol Ther. 88:333-347, 2000

Tiberio R, Marconi A, FiIa C, Fumelli C1 Pignatti M, Krajewski S, Giannetti A, Reed JC, Pincelli C: Keratinocytes enriched for stem cells are protected from anoikis via an integrin signaling pathway, in a Bcl-2 dependent manner. FEBS Letters 26318:1-6, 2002

Turley, J. M., et al. Cancer Res., 1997, 57, 881-890

Viard I, Wehrli P, Bullani R1 Schneider P, Holler N, Salomon D, Hunzinker T, Saurat J-H, Tschopp J, French L: Inhibition of toxic epidermal necrolysis by blockade of Fas with human intravenous immunoglobulin. Science 282:490-493, 1998

Wang X. et al: Possible apoptotic mechanism in epidermal cell acantholysis induced by pemphigus vulgaris autoimmunoglobulins Apoptosis 2004; 9: 131-143

Wehrli P, Viard I, Bullani R1 Tschopp J, French LE. Death receptors in cutaneous biology and disease. J Invest Dermatol 115:141-148, 2000

Weiske J, Schoneberg T, Schroder W, Hatzfeld M1 Tauber R, Huber O: The fate of desmosomal proteins in apoptotic cells. J Biol Chem 276:41175-41181, 2001

Yang, Y., et al., J. Exp. Med., 1995, 181 , 1673-1682

Yu, W. et al. Cancer Res., 1999, 59, 953-961

SEQUENCE LISTING <110> Pincell srl <120> Remedies for pemphigus containing anti Fas ligand antibodies <130> 39926P WO-1 <140> PCT/EP2009/067129 <141> 2010-02-22 <160> 22 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR H1 <400> 1 Asn Tyr Trp Ile Gly 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR H2 <400> 2 Tyr Leu Tyr Pro Gly Gly Leu Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR H3 <400> 3 Tyr Arg Asp Tyr Asp Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR L1 <400> 4 Lys Ser Thr Lys Ser Leu Leu Asn Ser Asp Gly Phe Thr Tyr Leu Gly 1 5 10 15 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR L2 <400> 5 Leu Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR L3 <400> 6 Phe Gln Ser Asn Tyr Leu Pro Leu Thr 1 5 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR H1 <400> 7 Glu Tyr Pro Met His 1 5 <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR H2 <400> 8 Met Ile Tyr Thr Asp Thr Gly Glu Pro Ser Tyr Ala Glu Glu Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 9 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR H3 <400> 9 Phe Tyr Trp Asp Tyr Phe Asp Tyr 1 5 <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR L1 <400> 10 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR L2 <400> 11 Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR L3 <400> 12 Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Trp Thr 1 5 <210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR H1 <400> 13 Arg His Gly Ile Thr 1 5 <210> 14 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR H1 <400> 14 Ser His Gly Ile Ser 1 5 <210> 15 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR H2 <400> 15 Trp Ile Asn Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Val Gln 1 5 10 15 Gly <210> 16 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR H2 <400> 16 Trp Ile Asn Ala Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu Gln 1 5 10 15 Gly <210> 17 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR H3 <400> 17 Glu Thr Met Val Arg Gly Val Pro Leu Asp Tyr 1 5 10 <210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR H3 <400> 18 Glu Thr Met Val Arg Gly Val Pro Cys Asp Tyr 1 5 10 <210> 19 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR L1 <400> 19 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 20 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR L2 <400> 20 Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR L3 <400> 21 Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr 1 5 <210> 22 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> caspase-8 inhibitor Z-IETD-FMK <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Z (Benzyloxycarbonyl) at N-terminus <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> METHYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> METHYLATION; FMK (Fluoromethylketone) at C-terminus <400> 22 Ile Glu Thr Asp 1

Claims

인간 Fas 리간드 단백질 (FasL)에 특이적인 단일클론 인간 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는, 각질세포 극세포해리(keratinocyte acantholysis)와 연관된 피부 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물로서,
상기 단일클론 항체는 하나 이상의 중쇄 가변 영역 및 하나 이상의 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 중쇄의 상보성 결정 영역(complementary determining region, CDR)의 아미노산 서열은:
(a₁) CDR H1: Arg His Gly Ile Thr (서열번호 13) 또는
(a₂) CDR H1: Ser His Gly Ile Ser (서열번호 14),
(b₁) CDR H2: Trp Ile Asn Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Val Gln Gly (서열번호 15) 또는
(b₂) CDR H2: Trp Ile Asn Ala Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu Gln Gly (서열번호 16), 및
(c₁) CDR H3: Glu Thr Met Val Arg Gly Val Pro Leu Asp Tyr (서열번호 17) 또는
(c₂) CDR H3: Glu Thr Met Val Arg Gly Val Pro Cys Asp Tyr (서열번호 18)이고,
상기 경쇄의 상보성 결정 영역(CDR)의 아미노산 서열은
(a₃) CDR L1: Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala (서열번호 19),
(b₃) CDR L2: Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr (서열번호 20), 및
(c₃) CDR L3: Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr (서열번호 21)이고,
상기 각질세포 극세포해리와 연관된 피부 질환은 천포창인, 약학적 조성물.
인간 Fas 리간드 단백질 (FasL)에 특이적인 단일클론 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는, 각질세포 극세포해리와 연관된 피부 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물로서,
상기 단일클론 항체는 수탁번호 ATCC PTA-4017 또는 ATCC PTA-4018 하에 기탁된 하이브리도마 세포에 의해서 제조되며,
상기 각질세포 극세포해리와 연관된 피부 질환은 천포창인, 약학적 조성물.
청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 항체, 또는 그의 항원-결합 단편은 부분적 인간화 항체 또는 완전한 인간화 항체, 부분적 인간화 단쇄 항체 또는 완전한 인간화 단쇄 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로부터 선택된, 약학적 조성물.
청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 피부 질환은 아폽토시스 경로의 활성화 및 데스모글레인의 절단 중 하나 이상과 연관된, 약학적 조성물.
삭제
삭제
삭제