MX2011004427A - Agonistas del receptor de neuropeptido-2 (y-2r) y usos de los mismos. - Google Patents

Agonistas del receptor de neuropeptido-2 (y-2r) y usos de los mismos.

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MX2011004427A
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Jefferson Wright Tilley
Nader Fotouhi
David C Fry
Wajiha Khan
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Abstract

Se proporcionan en la presente agonistas del receptor de neuropéptido 2 de la fórmula (I), (Ver fórmula (I)) así como sales, derivados y fragmentos farmacéuticamente aceptables de los mismos, en donde los sustituyentes son como aquellos descritos en la descripción. Estos compuestos, y las composiciones farmacéuticas que los contienen, son útiles para el tratamiento de enfermedades tales como, por ejemplo, obesidad y diabetes.

Description

AGONISTAS DEL RECEPTOR DE NEUROPEPTIDO-2 (Y-2R) Y USOS DE LOS MISMOS Descripción de la Invención La invención proporciona análogos truncados y lipidados de PYY3-36. Los análogos son agonistas del receptor de neuropéptido 2 y son útiles para el tratamiento de enfermedades y trastornos metabólicos, tales como, por ejemplo, obesidad, diabetes tipo 2, síndrome metabólico, resistencia a insulina y dislipidemia .
La invención se refiere en particular a un agonista del receptor de neuropéptido 2 de la fórmula (I) : L' I Z' ' Y-Rl-R2-X-R3-R4-R5-R6"R7"R8-R9"Rl0-Rl1"Rl2-Rl3-Rl4"NH2 I z I L (I), en donde : L es una porción lípida; L' es una porción lípida; X es ácido (4-oxo-6-piperazin-l-il-4H-quinazolin-3-il) -acético (Pqa) ; Y es H, una porción acilo o piro-Glu; Z es una porción separadora o está ausente; REF. : 219424 Ri es lie, Ala, (D) lie o N-metilo lie; R2 es Lys, Ala, (D)Lys, N-metilo Lys, Nle o (Lys- Gly) ; R3 es Arg, Ala, (D)Arg, N-metilo Arg o Phe; R4 es His, Ala, (D)His o N-metilo His; R5 es Tyr, Ala, (d)Tyr, N-metilo Tyr o Trp; R6 es Leu, Ala, (D) Leu o N-metilo Leu; R7 es Asn, Ala o (D)Asn; R8 es Leu o Trp; R9 es Val, Ala, (D)Val o N-metilo Val; Rio es Thr, Ala o N-metilo Thr; Ru es Arg, (D)Arg o N-metilo Arg; R12 es Gln o Ala; R13 es Arg, (D)Arg o N-metilo Arg; y Ri4 es Tyr, (D)Tyr, N-metilo Tyr, Phe o Trp; y en donde las porciones L-Z- y L'-Z'- no están ambas presentes; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Las enfermedades y trastornos metabólicos se reconocen ampliamente como serios problemas de salud para los países desarrollados, habiendo alcanzado niveles epidémicos en los Estados Unidos. De acuerdo con estudios recientes sobre obesidad, por ejemplo, más del 50% de la población estadounidense se considera con sobrepeso, con más de 25% diagnosticada como clínicamente obesa y en riesgo considerable de enfermedad cardiaca, diabetes tipo 2 y ciertos cánceres. Esta epidemia presenta una carga significativa en el sistema de salud ya que los costos proyectados para el tratamiento de obesidad de más de 70 billones de dólares anualmente se esperan tan sólo en los Estados Unidos. Las estrategias para tratar obesidad incluyen la reducción del consumo de alimentos y el incremento del gasto de energía.
El neuropéptido Y (NPY) , un neurotransmisor péptido de 36 aminoácidos, es un miembro de la clase de polipéptidos pancreáticos de neurotransmisores/neurohormonas que ha mostrado estar presente tanto en el sistema nervioso periférico como central. NPY es uno de los agentes orexogénicos más potentes conocidos y ha mostrado jugar un gran papel en la regulación de consumo de alimento en animales, incluyendo humanos.
Seis receptores NPY, los subtipos Yl, Y2, Y3, Y4 y Y5 y Y6, han sido clonados, los cuales pertenecen a los receptores que abarcan la transmembrana 7 acoplados a proteína G (GPCR) tipo rodopsina. El receptor NPY Y2 (Y2R) es un receptor de 381 aminoácidos que inhibe la activación de adenil ciclasa por medio de Gi mientras que presenta baja homología con otros receptores NPY conocidos. Existe un alto grado de conservación entre receptores Y2 de rata y humanos con 98% de identidad de aminoácidos.
El receptor Y2R está ampliamente distribuido dentro del sistema nervioso central tanto en roedores como en humanos. En el hipotálamo, ARNm de Y2 se ubica en el núcleo arqueado, núcleo preóptico y núcleo dorsomedio. En el cerebro humano, Y2R es el subtipo de receptor Y predominante. Dentro del núcleo arqueado, más del 80% de las neuronas NPY co-expresan ARNm de Y2R. La aplicación de un agonista selectivo para Y2 ha mostrado reducir la liberación de NPY de cortes hipotalámicos in vitro, mientras que el antagonista no péptido de Y2 BIIE0246 incrementa la liberación de NPY. Estos descubrimientos soportan el papel de Y2R como un autorreceptor presináptico que regula la liberación de NPY y por consiguiente puede estar implicado en la regulación de alimentación. (Kaga, T. et al., Peptides 22:501-506 (2001) y King PJ et al., Eur J Pharmacol 396:Rl-3 (2000)).
El péptido YY 3_36 (PYY 3-36) es un péptido lineal de 34 aminoácidos que tiene actividad agonista de Y2 neuropéptido . Ha sido demostrado que una inyección intra-arqueada (IC) o intra-peritoneal (IP) de PYY 3_36 redujo la alimentación en ratas y, como un tratamiento crónico, redujo la ganancia de peso corporal. La infusión intravenosa (IV) (0.8 pmoles/kg/min) durante 90 minutos de PYY 3-36 redujo el consumo de alimento en sujetos humanos obesos y normales más de 24 horas. Estos descubrimientos sugieren que el sistema PYY puede ser un objetivo terapéutico para el tratamiento de obesidad. (Batterham RL et al., Nature 418:650-654 (2002); Batter am RL et al., New Engl J Med 349:941-948 (2003)). Además, una versión ciclizada con Cys2- (D) Cys27 de PYY, en la cual los residuos 5-24 fueron reemplazados por una cadena metileno de 5 a 8 carbonos de largo, mostró activación del receptor PYY intestinal, como la evidencian preparaciones de mucosa en pinza de voltaje a través de corriente reducido de yeyuno de rata. (Krstenansky, et al. En Peptides, Proceedings of the Twelfth American Peptide Symposium. J. Smith and J. Rivier Editors, ESCOM. Leiden páginas 136-137) .
Además, datos recientes han mostrado que pacientes de derivación gástrica Roux-enY tienen un incremento temprano y exagerado en los niveles de PYY que puede ser parcialmente responsable del control glicémico temprano y mantenimiento de peso a largo plazo demostrando la importancia de este péptido en la patogénesis de enfermedades metabólicas. Otras acciones conocidas de PYY incluyen: vaciado gástrico reducido y tránsito gastrointestinal retrasado que es responsable de control glicémico postprandial mejorado. Los índices de hiperglucemia tales como HbAiC y fructosamina muestran una reducción dependiente de dosis después de la administración periférica de PYY 3-36 en modelos animales de diabetes tipo 2. Así, estos resultados indican que PYY3-35, o agonistas farmacéuticamente relacionados, pueden ofrecer un enfoque terapéutico a largo plazo al control glicémico y de peso. (Korner et al., J Clin Endocrinol Metabol 90:359-365 (2005); Chan JL et al . , Obesity 14: 194-198 (2006); Stratis C et al . , Obes Surg 16: 752-758 (2006); Borg CM et al., Br Surg 93:210-215 (2006); y Pittner RA et al . , Int J Obes 28:963-971 (2004) ) .
Por lo tanto, existe la necesidad por análogos de PYY manipulados nuevos que tengan peso molecular más bajo, en tanto que posean potencia y selectividad igual o mejor contra receptores de Yl, Y4 y Y5, propiedades farmacocinéticas y propiedades farmacológicas.
Los compuestos de la invención son de preferencia útiles para tratar enfermedades y trastornos metabólicos. Estas enfermedades y trastornos metabólicos incluyen, por ejemplo, obesidad, diabetes, de preferencia diabetes tipo 2, síndrome metabólico (también conocido como síndrome X) , resistencia a insulina, dislipidemia, alteración de la glucosa en ayunas y tolerancia alterada a glucosa.
En una modalidad más de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva del agonista del receptor de neuropéptido-2 de acuerdo con la fórmula I, o una sal del mismo, y un portador farmacéuticamente aceptable.
Los compuestos de la invención son adecuados toda vez que, por ejemplo, son versiones truncadas del PYY 3-36· Los péptidos más cortos, por ejemplo, no sólo facilitan una síntesis y purificación más temprana de los compuestos, sino que también mejoran y reducen procedimientos y gastos de fabricación. Además, los compuestos de la invención interactúan de preferencia con. receptores Y2 y no con receptores homólogos tales como NPY Yl, Y4 y Y5. Reacciones secundarias agonistas o antagonistas no deseadas son, por lo tanto, minimizadas. Los péptidos lipidados truncados exhiben también vida media más larga en vivo y propiedades farmacocinéticas favorables en comparación con péptidos nativos mientras mantienen su actividad biológica y especificidad de receptor.
Debe entenderse que la invención no está limitada a las modalidades particulares de la invención descritas en la presente, ya que variaciones de las modalidades particulares pueden hacerse y aún están dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. También se debe entender que la terminología empleada es con el motivo de describir modalidades particulares, y no se intenta que sea limitativa. En lugar de ello, el alcance de la presente invención será establecido por las reivindicaciones anexas.
Aunque cualquier método, dispositivo y material similar o equivalente a aquellos descritos en la presente pueden usarse en la práctica o prueba de la invención, los métodos, dispositivos y materiales que se prefieren se describen ahora.
Todas las secuencias de péptidos mencionadas en la presente se escriben de acuerdo con la convención usual en la cual el aminoácido N-terminal es el de la izquierda y el aminoácido C- erminal está a la derecha, a menos que se indique lo contrario. Una línea corta entre dos residuos de aminoácido incida un enlace péptido. Cuando el aminoácido tiene formas isoméricas, es la forma L del aminoácido la que se representa a menos que se indique expresamente lo contrario. Por conveniencia en describir esta invención, las abreviaturas convencionales y no convencionales para los diferentes aminoácidos son usadas . Estas abreviaturas son familiares para aquellos expertos en la técnica, pero por claridad se listan a continuación: Asp = D = Acido Aspártico; Ala = A = Alanina; Arg = R = Arginina Asn = N = Asparagina; Gly = G = Glicina; Glu = E = Acido Glutámico; Gln = Q = Glutamina; His = H = Histidina; lie = I = Isoleucina; Leu = L = Leucina; Lys = K = Lisina; Met = M = Metionina; Ph = F = Fenilalanina; Pro = P = Prolina; Ser = S = Serina; Thr = T = Treonina; Trp = W = Triptófano; Tyr = Y = Tirosina; Cys = C = Cisteína; y Val = V = Valina.
También por conveniencia, se usan las siguientes abreviaturas o símbolos para representar las porciones, reactivos y similares usados en esta invención: Pqa es ácido (4-oxo-6-piperazin-l-il-4H-quinazolin~ -il) -acético; 6-Ahx es ácido 6-aminohexanoico; Cha es ciclohexilalanina; (l)Nal es 1-naftilalanina; (2) al es 2-naftilalanina; Nle es norleucina; Alloc es aloxicarbonilo; Fmoc es 9-fluorenilmetiloxicarbonilo; Mtt es 4-metiltritilo; Pmc es 2 , 2 , 5 , 7 , 8-pentametilcroman-6-sulfonilo; Pbf es 2 , 2 , 4 , 6 , 7-pentametildihidro-benzofuran-5-sulfonilo; CH2C12 es cloruro de metileno; Ac20 es anhídrido acético; CH3CN es acetonitrilo; DMAc es dimetilacetamida; DIPEA es N,N-diisopropiletilamina; TFA es ácido trifluoroacético; iPr3SiH es triisopropilsilano; HOBt es N-hidroxibenzotriazol ; DIC es ?,?' -diisopropilcarbodiimida; BOP es hexafluorofosfato de benzotriazol-l-iloxi-tris- (dimetilamino) fosfonio; HBTU es hexafluorofosfato de 2- (lH-benzotriazol-1-il) -1, 1, 3 , 3-tetrametiluronio; 15.-ATOPA es ácido 15-amino-4 , 7 , 10 , 13 -tetraoxapentadecanoico; 12-ATODA es ácido 12-amino-4 , 7 , 10-trioxadodecanoico; 8-ADOSA es ácido N- (8-amino-3 , 6-dioxa-octil) -succinámico; 5-AOPSA es ácido N- (5-amino-3-oxa~pentil) -succinámico; NMP es 1-metil 2-pirrolidinona; FAB-MS es Bombardeo de átomos rápido espectrometría de masas; y ES-MS es espectrometría de masas por electroaspersión .
Según se usa en la presente, el término "porción lípida" significa un grupo alcanoilo lineal o ramificado sustituido opcionalmente de 4-24 átomos de carbono, de preferencia de 12-20 átomos de carbono. La porción lípida puede ser de origen natural o sintética. Las porciones lípidas que se prefieren incluyen, pero no están limitadas a, caproilo, lauroilo, mirisoilo, palmitoilo, 16-bromohexadecanoilo, 2-hexildecanoilo, eicosanoilo, y similares .
Según se usa en la presente, el término "acilo" significa un grupo alquilo, cicloalquilo, heterocíclico, arilo o heteroarilo sustituido opcionalmente unido por medio de un grupo carbonilo e incluye grupos tales como acetilo, propionilo, benzoilo, 3-piridinilcarbonilo, 2-morfolinocarbonilo, 4 -hidroxibutanoilo, 4-fluorobenzoilo, 2-naftoilo, 2-fenilacetilo, 2-metoxiacetilo y similares.
Según se usa en la presente, el término "alquilo", solo o en combinación con otros grupos, se refiere a un radical hidrocarburo alifático saturado monovalente de cadena ramificada o recta de uno a veinte átomos de carbono, de preferencia uno a dieciséis átomos de carbono, muy pre eriblemente uno a diez átomos de carbono.
El término "cicloalquilo" se refiere a un radical mono- o policarbociclico monovalente saturado o insaturado de tres a diez, de preferencia tres a seis átomos de carbono. Este término se ejemplifica más por radicales tales como ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo, bornilo, adamantilo, y similares. En una modalidad preferida, las porciones "cicloalquilo" pueden ser sustituidas opcionalmente con uno, dos, tres o cuatro sustituyentes , con el entendimiento de que estos sustituyentes no sean, a su vez, sustituidos más a menos que se indique lo contrario. Ejemplos de porciones cicloalquilo incluyen, pero no están limitadas a, ciclopropilo sustituido opcionalmente, ciclobutilo sustituido opcionalmente, ciclopentilo sustituido opcionalmente, ciclopentenilo sustituido opcionalmente, ciclohexilo sustituido opcionalmente, ciclohexeno sustituido opcionalmente, cicloheptilo sustituido opcionalmente, y similares, o aquellos que se ejemplifiquen específicamente en la presente.
El término "heterocicloalquilo" indica un anillo alquilo mono- o policíclico, en donde uno, dos o tres de los átomos de anillo de carbono es reemplazado por un heteroátomo tal como N, 0 o S. Ejemplos de grupos heterocicloalquilo incluyen, pero no están limitados a, morfolinilo, tiomorfolinilo, piperazinilo, piperidinilo, pirrolidinilo, tetrahidropiranilo, tetrahidrofuranilo, 1 , 3 -dioxanilo, y similares. Los grupos heterocicloalquilo pueden ser no sustituidos o sustituidos y la fijación puede ser a través de su marco de carbono o a través de sus heteroátomos cuando sea adecuado, con el entendimiento de que estos sustituyentes no sean a su vez sustituidos más.
El término "alquilo inferior" , solo o en combinación con otros grupos, se refiere a un radical alquilo ramificado o de cadena recta de uno a nueve átomos de carbono, de preferencia uno a seis átomos de carbono. Este término se ejemplifica más por radicales tales como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, s-butilo, isobutilo, t-butilo, n-pentilo, 3-metilbutilo, n-hexilo, 2-etilbutilo y similares .
El término "arilo" se refiere a un radical mono- o policarbocíclico aromático de 6 a 12 átomos de carbono que tiene al menos un anillo aromático. Ejemplos de estos grupos incluyen, pero no están limitados a, fenilo, naftilo, 1, 2 , 3 , 4-tetrahidronaftaleno, 1, 2-dihidronaftaleno, indanilo, lH-indenilo y similares.
Los grupos alquilo, alquilo inferior y arilo pueden ser sustituidos o no sustituidos. Cuando son sustituidos, generalmente estarán, por ejemplo, 1 a 4 sustituyentes presentes, con el entendimiento de que estos sustituyentes no sean, a su vez, sustituidos más a menos que se indique lo contrario. Estos sustituyentes pueden formar opcionalmente un anillo con el grupo alquilo, alquilo inferior o arilo con el que estén conectados .
El término "heteroarilo" se refiere a un radical mono- o policíclico aromático de 5 a 12 átomos que tiene al menos un anillo aromático que contiene uno, dos o tres heteroátomos de anillo seleccionados de N, O y S, con el resto de los átomos de anillo siendo C. Uno o dos átomos de carbono de anillo del grupo heteroarilo pueden ser reemplazados con un grupo carbonilo.
El grupo heteroarilo descrito arriba puede ser sustituido independientemente con uno, dos o tres sustituyentes, con el entendimiento de que los sustituyentes no sean, a su vez, sustituidos más a menos que se indique lo contrario .
Los compuestos de la fórmula (I) pueden tener uno o más átomos de carbono asimétricos y pueden existir en forma de enantiómeros ópticamente puros, mezclas de enantiómeros tales como, por ejemplo, racematos, diastereoisómeros ópticamente puros, mezclas de diastereoisómeros, racematos diastereoisoméricos o mezclas de racematos diastereoisoméricos . Las formas ópticamente activas pueden obtenerse por ejemplo mediante resolución de los racematos, mediante síntesis asimétrica o cromatografía asimétrica (cromatografía con adsorbentes quirales o eluyente) . La invención abarca todas estas formas así como todas las formas regioisoméricas .
Se prefiere un agonista del receptor de neuropéptido-2 de la fórmula (I) en donde la porción lípida es carpriloilo, lauroilo, miristoilo, palmitoilo, 16-bromohexadecanoilo, 2-hexildecanoilo o eicosanoilo.
Se prefiere más un agonista de receptor de neuropéptido 2 de la fórmula (I) en donde la porción separadora es 6-Ahx, Ala, Glu, Ala-Glu, Glu-Glu, 15-ATOPA, 12-ATODA, 8-ADOSA, 5-AOPSA, Ser-Ser o Thr-Thr.
Se prefiere también un agonista del receptor de neuropéptido-2 de la fórmula (I) en donde Z está ausente.
Se prefiere más un agonista del receptor de neuropéptido-2 de la fórmula (I) en donde Z' está ausente.
Además, se prefiere un agonista del receptor de neuropéptido-2 de la fórmula (I) que tiene la fórmula (II) : L' Z' I Y-lle-Lys-X-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-T r-Arg-Gln-fA/Me;Arg-Tyr-NH2 (ii); en donde L es una porción lípida; L' es una porción lípida; X es ácido (4-oxo-6-piperazin-l-il-4H-quinazolin-3 -il) -acético (Pga) ; Y es H, una porción acilo o piro-Glu; Z es 6-Ahx, Ala, Glu, Ala-Glu, Glu-Glu, 15-ATOPA, 12-ATODA, 8-ADOSA, 5-AOPSA, Ser-Ser, Thr-Thr o está ausente; Z' es 6-Ahx, Ala, Glu, Ala-Glu, Glu-Glu, 15-ATOPA, 12-ATODA, 8-ADOSA, 5-AOPSA, Ser-Ser, Thr-Thr o está ausente; y en donde las porciones L-Z- y L'-Z'- no están ambas presentes .
Se prefiere más un agonista del receptor de neuropéptido-2 de la fórmula (II) en donde la porción lípida es carpriloilo, lauroilo, mirisoilo, palmitoilo, 16-bromohexadecanoilo, 2-hexildecanoilo o eicosanoilo.
Se prefiere también un agonista del receptor de neuropéptido-2 de la fórmula (II) en donde uno de Z y Z' es Ala, Glu, Ala-Glu, Glu-Glu, Ser-Ser o Thr-T r.
Se prefiere también particularmente un agonista del receptor de neuropéptido-2 de acuerdo con la fórmula (II) en donde Z está ausente .
Se prefiere particularmente además un agonista del receptor de neuropéptido-2 de la fórmula (II) en donde Z' está ausente.
Se prefiere un agonista - del receptor de neuropéptido-2 de la fórmula (I) seleccionado del grupo que consiste en: Ac-Ile-Lys (Butirilo) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (Míe) Arg-Tyr-NH2 ; Ac-Ile-Lys (Capriloilo) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn~Trp~ Val-Thr-Arg-Gln- (Míe) Arg-Tyr-NH2 ; Ac-Ile-Lys (Lauroilo) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp- Val-Thr-Arg-Gln- (Míe) Arg- yr-NH2 ; H-Ile-Lys (Lauroilo-6-Ahx) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (Míe) Arg-Tyr-NH2; H-Ile-Lys (Lauroilo-beta-Ala) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (Míe) Arg-Tyr-NH2 ; H-Ile-Lys (Lauroilo-Glu) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (Míe) Arg-Tyr-NH2; H-Ile-Lys (Miristoilo-6-Ahx) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (Míe) Arg-Tyr-NH2 ; Ac-Ile-Lys (Palmitoilo) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (Míe) Arg-Tyr-NH2 ; H-Ile-Lys (Palmitoilo) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Va1-Thr-Arg-Gln- (Míe) Arg-Tyr-NH2 ; Palmitoilo-Ile-Lys-Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (Míe) Arg-Tyr-NH2; Palmitoilo-6 -Ahx-Ile-Lys-Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- {NMe) Arg-Tyr-NH2 ; Palmitoilo- 6-Ahx-Ile-Lys-Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (NMe) Arg-Tyr-NH2 ; H-Ile-Lys (Palmitoilo- 6-Ahx) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu- Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (Míe) Arg-Tyr-NH2 ; H-Ile-Lys (Palmitoilo-6-Ahx) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val -Thr-Arg-Gln- (Míe) Arg-Tyr~NH2 ; H-Ile-Lys (Palmitoilo-beta-Ala) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (Míe) Arg-Tyr-NH2 ; H-Ile-Lys (Palmitoilo-Glu) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (Míe) Arg-Tyr-NH2 ; H-Ile-Lys (Palmitoilo-beta-Ala-Glu) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (Míe) Arg-Tyr-NH2 ; H-Ile-Lys (Palmitoilo-Glu-Glu- ) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu- Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (Míe) Arg-Tyr-NH2 ; H-Ile-Lys (Palmitoilo-gamma-Glu) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (Míe) Arg-Tyr-NH2 ; H-Ile-Lys (Palmitoilo-gamma-Glu-gamma-Glu- ) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (Míe) Arg-Tyr-NH2.
Se prefiere más un agonista del receptor de neuropéptido-2 de la fórmula (I) seleccionado del grupo que consiste en: H-Ile-Lys (Palmitoilo-beta-Ala-gamma-Glu- ) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- {NMe) Arg-Tyr-NH2 ; H-Ile-Lys (16-Bromohexadecanoilo-gamma-Glu-gamma-Glu-) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (NMe) Arg-Tyr-NH2; Pyro-Glu.-Ile-Lys (Palmitoilo-gamma-Glu-gamma-Glu- ) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- {NMe) Arg-Tyr-NH2 ; H-Ile-Lys (2 -hexildecanoilo-6-Ahx) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- {NMe) Arg-Tyr-NH2 ; H-Ile-Lys (Eicosanoilo-6-Ahx) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (ffle) Arg-Tyr-NH2 ; H-Ile-Lys (Eicosanoilo-gamma-Glu-gamma-Glu- ) -Pga- Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (Míe) Arg-Tyr-NH2; H-Ile-Lys (Palmitoilo-15-AT0PA) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (Míe) Arg-Tyr-NH2 ; H-Ile-Lys (Eicosanoilo-15-?????) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (Míe) Arg-Tyr- ¾ ; H-Ile-Lys (Palmitoilo-12-ATODA) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (Míe) Arg-Tyr-NH2 ; H-Ile-Lys (Eicosanoilo-12 -ATODA) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (Míe) Arg-Tyr-NH2 ; H-Ile-Lys (Palmitoilo-8-AD0SA) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (Me) Arg-Tyr-NH2 ; H-Ile-Lys (Eicosanoilo-8-ADOSA) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (Míe) Arg-Tyr-N¾ ; H-Ile-Lys (Palmitoilo-5-AOPSA) -Pqa-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- {NMe) Arg-Tyr-NH2 ; H-Ile-Lys (Eicosanoilo-5-AOPSA) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (NMe) Arg-Tyr-NH2 ; H-Ile-Lys (Palmitoilo-Ser-Ser) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (NMe) Arg-Tyr-NH2; H-Ile-Lys (Eicosanoilo-Ser-Ser) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu- Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (NMe) Arg-Tyr-NH2 ; H-Ile-Lys (Palmitoilo-Thr-Thr) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Tr -Val -Thr-Arg-Gln- (NMe) Arg-Tyr- H2 ; H-Ile-Lys (Eicosanoilo-Thr-Thr) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (NMe) Arg-Tyr-NH2.
Los presentes compuestos representativos pueden ser sintetizados fácilmente mediante cualquier procedimiento convencional conocido para la formación de un enlace péptido entre aminoácidos. Estos procedimientos convencionales incluyen, por ejemplo, cualquier procedimiento en fase de solución que permita una condensación entre el grupo alfa amino libre de un aminoácido o residuo del mismo que tenga su grupo carboxilo y otros grupos reactivos protegidos y el grupo carboxilo primario libre de otro aminoácido o residuo del mismo que tenga su grupo amino u otros grupos reactivos protegidos .
Estos procedimientos convencionales para sintetizar los compuestos novedosos de la presente invención incluyen por ejemplo cualquier método de síntesis de péptidos en fase sólida. En este método la síntesis de los compuestos novedosos puede llevarse a cabo al incorporar secuencialmente los residuos de aminoácido deseados uno a la vez en la cadena de péptido creciente de acuerdo con los principios generales de los métodos en fase sólida. Estos métodos se describen en, por ejemplo, errifield, R. B., J. Amer. Chem. Soc . 85, 2149-2154 (1963); Branay et al., The Peptides Analysis, Synthesis and Biology, vol . 2, Gross, E. and Meienhofer, J. , Eds. Academic Press 1-284 (1980) .
Común para las síntesis químicas de los péptidos es la protección de grupos de cadena lateral reactivos de las diferentes porciones de aminoácido con grupos protectores adecuados, los cuales impedirán que ocurra una reacción química en ese sitio hasta que el grupo protector sea finalmente removido. Normalmente también es común la protección del grupo alfa amino en un aminoácido o fragmento mientras esa entidad reacciona en el grupo carboxilo, seguida por la remoción selectiva del grupo protector alfa amino para permitir que tenga lugar una reacción subsecuente en ese sitio. Aunque los grupos protectores específicos han sido descritos con respecto al método de síntesis en fase sólida, debe notarse que cada aminoácido puede ser protegido por un grupo protector usado convencionalmente para el aminoácido respectivo en síntesis en fase de solución.
Los grupos alfa amino pueden ser protegidos por un grupo protector adecuado seleccionado de grupos protectores tipo uretano aromáticos, tales como aliloxicarbonilo, benciloxicarbonilo (Z) y benciloxicarbonilo sustituido, tal como p-clorobenciloxicarbonilo, p-nitrobenciloxicarbonilo, p-bromobenciloxicarbonilo, p-bifenil-isopropiloxicarbonilo, 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) y p-metoxibenciloxicarbonilo (Moz) ; grupos protectores tipo uretano alifáticos, tales como t-butiloxicarbonilo (Boc) , diisopropilmetiloxicarbonilo e isopropiloxicarbonilo . Aquí, Fmoc es el que más se prefiere para la protección alfa amino.
Los grupos guanidino pueden ser protegidos por un grupo protector adecuado tal como nitro, p-toluensulfonilo (Tos), (Z) , pentametilcromansulfonilo (Pmc) , 4-metoxi-2 , 3 , 6-trimetilbencensulfonilo (Mtr) , (Pmc) , (Mtr) y (Pbf) se prefieren más para arginina (Arg) .
Los grupos épsilon amino pueden ser protegidos por un grupo protector adecuado tal como 2-cloro-benciloxicarbonilo (2-C1-Z) , 2-bromo benztloxicarbonilo (2-Br-Z)- y t-butiloxicarbonilo (Boc). Boc es el que más se prefiere para (Lys) .
Los grupos hidroxilo (OH) pueden ser protegidos por un grupo protector adecuado tal como bencilo (Bzl), 2,6-diclorobencilo (2 , 6-diCl-Bzl) y ter-butilo (t-Bu) , (t-Bu) se prefiere más para (Tyr) , (Ser) y (Thr) .
Los grupos beta- y gamma-amida de Asn y Gln pueden ser protegidos por un grupo protector adecuado tal como 4-metiltritilo (Mtt) , 2 , 4 , 6-trimetoxibencilo (Tmob) , 4,4-dimetoxiditilo Bis- (4-metoxifenil) -metilo (Dod) y tritilo (Trt) . Trt es el que más se prefiere para (Asn) y (Gln) .
El grupo indol puede ser protegido por un grupo protector adecuado seleccionado de formilo (For) , mesitil-2-sulfonilo (Mts) y t-butiloxicarbonilo (Boc) . Boc es el grupo que más se prefiere para (Trp) .
El grupo imidazol puede ser protegido por un grupo protector adecuado seleccionado de bencilo (Bzl) , t-butiloxicarbonilo (Boc) , y tritilo (Trt) . Trt es el que más se prefiere para (His) .
La síntesis del aminoácido Pqa se describe por J. Hutchinson et . al (J. Med. Chem. 1996, 39, 4583-4591). El derivado Fmoc-Pqa se compró de NeoMPS, Inc. (San Diego, CA) .
Todos los solventes, isopropanol (iPrOH) , cloruro de metileno (CH2C12) , dimetilformamida (DMF) y N-metilpirrolinona (N P) se compraron de Fisher o Burdick & Jackson y se usaron sin tratamiento adicional. Se compró el ácido trifluoroacético de Halocarbon o Fluka y se usó sin purificación adicional.
Diisopropilcarbodiimida (DIC) y diisopropiletilamina (DIPEA) se compraron de Fluka o Aldrich y se usaron sin purificación- adicional . Hidroxibenzotriazol (HOBT) , sulfuro de dimetilo (DMS) y 1, 2 -etanoditiol (EDT) se compraron de Sigma Chemical Co., y se usaron sin purificación adicional . Los aminoácidos protegidos fueron generalmente de la configuración L y se obtuvieron comercialmente de Bachem, o Neosystem. La pureza de estos reactivos se confirmó mediante cromatografía de capa delgada, R N y punto de fusión antes de usar. La resina de benzhidrilamina (BHA) fue un copolímero de estireno-1% de divinilbenceno (100-200 ó 200-400 mallas) obtenido de Bachem o Advanced Chemtech. El contenido de nitrógeno total de estas resinas generalmente fue de entre 0.3-1.2 meq/g.
En una modalidad preferida, se prepararon péptidos usando síntesis en fase sólida mediante el método descrito generalmente por Merrifield, (J. Amer. Chem. Soc, 85, 2149 (1963) ) , aunque otras síntesis químicas equivalentes conocidas en la técnica podría usarse como se indicó arriba. La síntesis en fase sólida se inicia a partir del extremo C-terminal del péptido mediante acoplamiento de un alfa-aminoácido protegido a una resina adecuada. Este material de partida se puede preparar uniendo un aminoácido alfa amino-protegido por un enlace de éster a una resina de alcohol p-benciloxibencílico (Wang) , o por un enlace de amida entre un enlazador Fmoc, tal como ácido p- ( (R, S) -a- (1- (9H-fluoren-9-il) -metoxiformamido) -2 , 4-dimetiloxibencil) -fenoxiacético (enlazador Rink) a una resina de benzhidrilamina (BHA) . La preparación de la resina de hidroximetilo se conoce bien en la técnica. Los soportes de Fmoc-enlazador-resina BHA están disponibles comercialmente y se usan generalmente cuando el péptido deseado que está siendo sintetizado tiene una amida no sustituida en el C-terminal.
Típicamente, los aminoácidos o miméticos son acoplados en el Fmoc-enlazador-resina BHA usando la forma protegida con Fmoc de aminoácido o mimético, con 2-5 equivalentes de aminoácido y un reactivo de acoplamiento adecuado. Después de los acoplamientos, la resina puede ser lavada y secada al vacío. La carga del aminoácido en la resina puede determinarse por el análisis de aminoácido de una alícuota de resina Fmoc-aminoácido o por la determinación de los grupos Fmoc mediante análisis ÜV. Cualquier grupo amino no reaccionado puede ser tapado al hacer reaccionar la resina con anhídrido acético y diisopropiletilamina en cloruro de metileno.
Los grupos protectores Fmoc alfa amino se remueven bajo condiciones básicas. Piperidina, piperazina o morfolina (20-40% p/p) en DMF se pueden usar para este propósito. De preferencia se utiliza 40% de piperidina en DMF.
Después de la remoción del grupo protector alfa amino, los aminoácidos protegidos subsecuentes son acoplados paso a paso en el orden deseado para obtener una resina protegida con péptido intermedia. Los reactivos de activación usados para el acoplamiento de los aminoácidos en la síntesis en fase sólida de los péptidos se conoce bien en la técnica. Por ejemplo, reactivos adecuados para estas síntesis son exafluorofosfato de benzotriazol-l-il-oxi-tri- (dimetilamino) fosfonio (BOP) , hexafluorofosfato de bromo-tris-pirrolidino-fosfonio (PyBroP) , hexafluorofosfato de 2- (lH-benzotriazol-l-il) -1, 1, 3 , 3-tetrametiluronio (HBTU) y diisopropilcarbodiimida (DIC) . Aquí se prefieren HBTU y DIC. Otros agentes activadores se describen por Barany y Merrifield (en The Peptides, vol . 2, J. eienhofer, ed. , Academic Press, 1979, pág. 1-284) y pueden utilizarse. Varios reactivos tales como 1-hidroxibenzotriazol (HOBT) , N-hidroxisuccinimida (HOSu) y 3 , -dihidro-3 -hidroxi-4-???-1, 2 , 3-benzotriazina (HODhBT) pueden añadirse a las mezclas de acoplamiento para utilizar así los ciclos sintéticos. Se prefiere aquí HOBt .
Para la preparación de derivados de acetilo N-terminales, la acetilación se llevó a cabo al tratar el péptido unido a resina con 20% de anhídrido acético en DMF con 5% de DIEA. Para otras acilaciones N-terminales , la acilación se llevó a cabo usando el ácido carboxílico correspondiente activado in situ con DIC/HOBt durante 30 minutos .
El protocolo para un ciclo sintético típico es el siguiente : Protocolo 1 Etapa Reactivo Tiempos 1 DMF 2 x 30 seg. 2 20% de piperidina/DMF 1 minuto 3 20% de piperidina/DMF 15 minutos 4 DMF 2 x 30 seg. 5 iPrOH 2 x 30 seg. 6 DMF 3 x 30 seg. 7 Acoplamiento 60 min-18 horas 8 DMF 2 x 30 seg. 9 iPrOH 1 x 30 seg. 10 DMF 1 x 30 seg. 11 CH2C12 2 x 30 seg.
LOS solventes para todos los lavados acoplamientos se midieron a volúmenes de 10-20 mL/g de resina. Las reacciones de acoplamiento a lo largo de las síntesis se monitorearon por la prueba de Ninhidrina de Kaiser para determinar el grado de conclusión (Kaiser et al. Anal. Biochem. 34, 595-598 (1970)). La cinética de reacción lenta se observó para Fmoc-Arg (Pmc) y para acoplamientos a aminas secundarias por ácidos estéricamente impedidos. Cualquier reacción de acoplamiento incompleta fue ya sea vuelta a acoplar con aminoácido activado recién preparado o tapada al tratar con resina péptida con anhídrido acético como se describió arriba. Las resinas de péptido completamente ensambladas„se secaron al vacío durante varias horas .
Para la mayoría de los compuestos, los grupos de bloqueo fueron removidos y el péptido cortado de la resina. Por ejemplo, las resinas de péptidos fueron tratadas con 100 de etanoditiol, 100 µ? de sulfuro de dimetilo, 300 µ?? de anisol y 9.5 mL de ácido trifluoroacético, por gramo de resina, a temperatura ambiente durante 180 min. O como alternativa las resinas de péptidos f eron tratadas con 1.0 mL de triisopropil silano y 9.5 mL de ácido trifluoroacético, por gramo de resina, a temperatura ambiente durante 180 min. La resiria se filtró y los filtrados se precipitaron en éter etílico helado. Los precipitados se centrifugaron y la capa de éter se decantó. El residuo se lavó con dos o tres volúmenes de Et20 y volvió a centrifugar. Los productos crudos se secaron al vacío.
La purificación de los péptidos crudos se llevó a cabo de preferencia en un sistema Shimadzu LC-8A mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC) en una columna C-18 de fase inversa (50x250 mm, 300 Á, 10-15 µt?) . Los péptidos fueron inyectados a las columnas en un volumen mínimo de ya sea 0.1 de AcOH/H20 o CH3CH/H20. La elución por gradientes se inició generalmente a 20% de regulador de H B, 20%-80% de B durante 70 minutos (regulador de pH A: 0.1% de TFA/¾0, regulador de pH B: 0.1% de TFA/CH3CN) a una velocidad de flujo de 50 mL/min. La detección UV se hizo a 220/280 nm. Las fracciones que contenían los productos se separaron y su pureza se juzgó en sistema analítico Shimadzu LC-10AT usando columna Ace C18 de fase inversa (4.6 x 50 moles) a una velocidad de flujo de 2 mL/min, gradiente (20-80%) durante 10 minutos (regulador de pH A: 0.1% de TFA/H20, regulador de pH B : 0.1% de TFA/CH3CN) ) . Las fracciones que se juzgó que eran de alta pureza fueron agrupadas y liofilizadas .
La pureza de los productos finales se verificó mediante HPLC analítica en una columna de fase inversa como se indicó arriba. La pureza de todos los productos se juzgó como de aproximadamente 95-99%. Todos los productos finales también se sometieron a bombardeo de átomos rápido espectrometría de masas (FAB-MS) o espectrometría de masas por electroaspersión (ES-MS) . Todos los productos dieron los iones M+H de origen esperados dentro de límites aceptables.
Los compuestos de la presente invención pueden ser provistos en forma de sales farmacéuticamente aceptables. Ejemplos de sales preferidas son aquellas formadas con ácidos orgánicos farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, ácido acético, láctico, maleico, cítrico, málico, ascórbico, succínico, benzoico, salicílico, metansulfónico, toluensulfónico, trifluoroacético o pamoico, así como ácidos poliméricos tales como ácido tánico o carboximetilcelulosa, y sales con ácidos inorgánicos, tales como ácidos halhidricos (por ejemplo, ácido clorhídrico) , ácido sulfúrico o ácido fosfórico y similares. Se puede usar cualquier procedimiento para obtener la sal farmacéuticamente aceptable conocido por un experto en la técnica.
La invención se refiere también a un agonista del receptor de neuropéptido-2 como el descrito arriba para usarse como una sustancia terapéuticamente activa.
Una composición farmacéutica que comprende un agonista del receptor de neuropéptido-2 como el descrito arriba y un portador terapéuticamente inerte también es un objetivo de la presente invención.
Además, la invención se refiere al uso de un agonista del receptor de neuropéptido-2 como el descrito arriba en la preparación de medicamentos para el tratamiento profilaxis de obesidad, diabetes tipo 2, síndrome metabólico, resistencia a insulina y dislipidemia .
La invención se refiere además a un método para el tratamiento o profilaxis de obesidad, diabetes tipo 2, síndrome metabólico, resistencia a insulina o dislipidemia, método que comprende administrar una cantidad efectiva de un agonista del receptor de neuropéptido 2 como el descrito arriba .
En la práctica del método de la presente invención, una cantidad efectiva de cualquiera de los péptidos de esta invención o una combinación de cualquiera de los péptidos de esta invención o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, se administra por medio de cualquiera de los métodos usuales y aceptables conocidos en la técnica, ya sea individualmente o en combinación. La administración puede ser, por ejemplo, una vez al día, una vez cada tres días o una vez a la semana. Los compuestos o composiciones pueden ser entonces administrados oralmente (por ejemplo, cavidad bucal) , sublingualmente, parenteralmente (por ejemplo, intramuscularmente, intravenosamente o subcutáneamente) , rectalmente (por ejemplo, por supositorios o lavados), transdérmicamente (por ejemplo, electroporación en la piel) o por inhalación (por ejemplo, por aerosol) , y en forma de dosis sólidas, líquidas o gaseosas, incluyendo tabletas y suspensiones. La administración se puede llevar a cabo en una sola forma de dosis única con terapia continua o en una terapia de una sola dosis ad libitum. La composición terapéutica también puede estar en forma de una emulsión o dispersión en aceite en conjunto con una sal lipofílica tal como ácido pamoico, o en forma de una composición de liberación prolongada biodegradable para administración subcutánea o intramuscular.
Así, el método de la presente invención se lleva a la práctica cuando el alivio de los síntomas se requiere específicamente o es tal vez inminente. Como alternativa, el método de la presente invención se lleva a la práctica de manera efectiva como un tratamiento continuo o profiláctico.
Los portadores farmacéuticos útiles para la preparación de las composiciones de la presente pueden ser sólidos, líquidos o gases; de esta manera, las composiciones pueden tener la forma de tabletas, pildoras, cápsulas, supositorios, polvos, formulaciones recubiertas entéricamente u otras formulaciones protegidas (por ejemplo, unión en resinas de intercambio iónico o empaque en vesículas de lípidos-proteínas) , formulaciones de liberación prolongada, soluciones, suspensiones, elíxires, aerosoles, y similares. El portador se puede seleccionar de los diferentes aceites incluyendo aquellos de origen de petróleo, animal, vegetal o sintético, por ejemplo, aceite de cacahuate, aceite de soya, aceite mineral, aceite de ajonjolí y similares. Agua, solución salina, dextrosa acuosa y glicoles son portadores líquidos preferidos, particularmente (cuando son isotónicos con la sangre) para soluciones inyectables. Por ejemplo, formulaciones para administración intravenosa comprenden soluciones acuosas estériles de los ingredientes activos que se preparan al disolver ingredientes activos sólidos en agua para producir una solución acuosa, y hacer a la solución estéril . Excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, celulosa, talco, glucosa, lactosa, talco, gelatina, malta, arroz, harina, greda, sílice, estearato de magnesio, estearato de sodio, monostearato de glicerol, cloruro de sodio, leche descremada seca, glicerol, propilenglicol , agua, etanol y similares. Las composiciones pueden ser sujetas a aditivos farmacéuticos convencionales tales como conservadores, agentes estabilizadores, agentes humectantes o emulsionantes, sales para ajustar presión osmótica, reguladores de pH y similares. Los portadores farmacéuticos adecuados y su formulación se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences por E. W. Martin. En cualquier caso, estas composiciones contendrán una cantidad efectiva del compuesto activo junto con un portador adecuado para de esta manera preparar la forma de dosis adecuada para su administración adecuada al receptor.
La dosis de un compuesto de la presente invención depende de un número de factores, tales como, por ejemplo, la manera de administración, la edad y el peso corporal del sujeto, y la condición del sujeto que será tratado, y finalmente será decidida por el médico o veterinario que atienda. Esta cantidad del compuesto activo determinada por el médico o veterinario que atienda se conoce en la presente, y en las reivindicaciones, como una "cantidad efectiva". Por ejemplo, la dosis para administración intranasal está típicamente en la escala de alrededor de 0.001 a aproximadamente 0.1 mg/kg de peso corporal. En humanos, la dosis subcutánea preferida con base en el contenido de péptidos es de alrededor de 0.001 mg a aproximadamente 100 mg; de preferencia de alrededor de 0.1 mg a aproximadamente 15 mg.
La invención se describirá ahora más en los siguientes ejemplos, los cuales se intenta que sean una ilustración únicamente y que no limiten el alcance de la invención.
Ej emplos Ejemplo 1 Preparación de Fmoc-enlazador-resina BHA Resina entrelazada con copoliestireno de benzhidrilamina-1% de divinilbenceno (10.0 g, 9.3 mequiv, 100-200 ASTM mesh, Advanced Chem/Tech) se hinchó en 100 mL de CH2C12, se filtró y se lavó sucesivamente con 100 mL cada uno de CH2C12, 6% de DIPEA/ CH2C12 (dos veces), CH2C12 (dos veces). La resina se trató con ácido p- ( (R, S) -a- (1- (9H-fluoren-9-il) -metoxiformamido) -2 , 4-dimetoxibencil) -fenoxiacético (Fmoc-enlazador) (7.01 g, 13.0 mmoles) , N-hidroxibenzotriazol (2.16 g, 16.0 mmoles) y ?,?' -diisopropilcarbodiimida (2.04 mL, 13.0 mmoles) en 100 mL - de DMF al 25%/C¾Cl2 durante 24 horas a temperatura ambiente. La resina se filtró y se lavó sucesivamente con 100 mL cada uno de CH2C12 (dos veces) , isopropanol (dos veces) , DMF y CH2C12 (tres veces) . Un análisis de ninhidrina de Kaiser fue negativo. La resina se secó al vacío para dar 16.12 g de Fmoc-enlazador-resina BHA. Una porción de esta resina (3.5 mg) se sometió a desprotección con Fmoc y análisis UV cuantitativo que indicó una carga de 0.56 mmoles/g.
Ejemplo 2 Protocolo para la síntesis de peptidos por el sintetizador Applied Biosystem 433A usando química de fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) Para una síntesis de péptidos a escala de 0.25 mmoles por el sintetizador Applied Biosystem 433A (Foster City, CA) , los ciclos de 0.25 mmoles de Fast oc fueron usados ya sea con el muestreo de resina o sin muestreo de resina, recipiente de reacción de 41 mL. La resina Fmoc-aminoácido se suspendió con 2.1 g de NMP, 2 g de HOBT/HBTU 0.45M en DMF y DIEA 2M, luego se transfirió al recipiente de reacción. El ciclo de acoplamiento FastMoc básico fue representado por "BADEIFD" , en donde cada letra representa un módulo (según se define por Applied Biosystems) . Por ejemplo: B representa el módulo para desprotección con Fmoc usando 20% de piperidina/NMP y lavados relacionados y lecturas durante 30 minutos (ya sea monitoreo UV o conductividad) ; A representa el módulo para la activación de aminoácido en cartuchos con HBTU/HOBt 0.45 M y DIEA 2.0 M y mezcla con burbujeo de N2; D representa el módulo para lavado NMP de resina en el recipiente de reacción; E representa el módulo para la transferencia del aminoácido activado al recipiente de reacción para acoplamiento; I representa el módulo para un periodo de espera de 10 minutos con bortexeo encendido y apagado del recipiente de reacción; y F representa el módulo para la limpieza del cartucho, acoplamiento durante aproximadamente 10 minutos y drenado del recipiente de reacción. Los acoplamientos se extendieron típicamente por la adición del módulo "I" una o varias veces. Por ejemplo, acoplamientos dobles fueron ejecutados al llevar a cabo el procedimiento "BADEIIADEIFD" . Otros módulos estuvieron disponibles tales como c para lavados con cloruro de metileno y "C" para tapado con anhídrido acético. Módulos individuales también fueron modificables mediante, por ejemplo, cambio de la sincronización de diferentes funciones, tales como tiempo de transferencia, para alterar así la cantidad de solvente o reactivos transferidos. Los ciclos anteriores se usaron típicamente para acoplamiento de un aminoácido. Para sintetizar tetra péptidos, sin embargo, los ciclos se repitieron y se juntaron. Por ejemplo, se usó BADEIIADEIFD para acoplar el primer aminoácido, seguido por BADEIIADEIFD para acoplar el segundo aminoácido, seguido por BADEIIADEIFD para acoplar el tercer aminoácido, seguido por BADEIIADEIFD para acoplar el cuarto aminoácido, seguido por BIDDcc para desprotección final y lavado.
Ejemplo 3 Preparación de H-Ile-Lys-Pro-Glu-Ala-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Ser- Pro-Glu-Glu-Leu-Asn-Arg-Tyr-Tyr-Ala-Ser-Leu-Arg-His-Tyr-Leu- Asn-Leu-Val-The-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2 (PYY 3-35) El péptido anterior se sintetizó usando química Fmoc en un sintetizador Applied Biosystem 433A. El sintetizador se programó para acoplamiento doble usando los módulos descritos en el ejemplo 2. La síntesis se llevó a cabo en una escala de 0.25 mmoles usando el Fmoc-enlazador-resina BHA (450 mg, 0.25 mmoles) del ejemplo 1. Al final de la síntesis, la resina se transfirió a un recipiente de reacción en un agitador para corte. El péptido se cortó de la resina usando 13.5 mL de TFA al 97%/H20 al 3% y 1.5 mL de triisopropilsilano durante 180 minutos a temperatura ambiente. La solución de desprotección se añadió a 100 mL de ET20 frío, y se lavó con 1 mL de TFA y 30 ttiL de Et20 frío para precipitar el péptido. El péptido se centrifugó en 2x50 mL de tubos de polipropileno. Los precipitados de los tubos individuales se combinaron en un solo tubo y se lavaron 3 veces con ET20 frío y se secaron en un desecador bajo vacío.
El material crudo se purificó mediante HPLC preparativa en una columna Pursuit C18 (250x50 miti , 10 µt? de tamaño de partícula) y se eluyó con un gradiente lineal de 2-70% de B (regulador de pH A: 0.1% de TFA/H20; regulador de pH B: 0.1% de TFA/ CH3CN) en 90 minutos, velocidad de flujo 60 mL/min, y detección 220/280 nm . Las fracciones se recogieron y se revisaron mediante HPLC analítica. Las fracciones que contenían producto puro se combinaron y liofilizaron para dar 151 mg (15%) de un polvo amorfo blanco. (ES)+-LCMS m/e calculado (cale.) para C18 0H2 7 9N5 3 O54 4049.55 encontrado 4050.20.
Ejemplo 4 Preparación de Ac-Ile-Lys-Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val- Thr-Arg-Gln- (NMe) Arg-Tyr-NH2 Fmoc-Enlazador-resina BHA (450 mg, 0.25 mmoles) del ejemplo 1 se sometió a síntesis en fase sólida y el péptido crudo se purificó siguiendo el procedimiento del ejemplo 3 para producir 68 mg (12%) del polvo amorfo blanco. (ES)+-LCMS m/e calculado (cale.) para Ci06Hi56 3 022 2257.21 encontrado 2257.19.
Ejemplo 5 Preparación de Ac-Ile-Lys (Butirilo) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn- Tr -Val-Thr-Arg-Gln- {NMe) Arg-Tyr- H2 200 mg de Ac - I le - Lys - Pqa -Arg-His - Tyr- Leu-Asn- Trp-Val -Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2 se disolvieron en 5.0 mL de DMF y 35 ih de NM y 250 ]xh de anhídrido butírico fueron añadidos. La solución se agitó durante -16 horas (durante la noche) . Se añadieron 3.0 mL de NH3 7N en MeOH y se continuó agitando durante ½ hora. El producto se precipitó después en 5.0 mL de Et20, se centrifugó, se lavó y se secó al vacío. El péptido crudo se purificó siguiendo el procedimiento del ejemplo 3 para producir 18 mg (9%) de polvo amorfo blanco. (ES)+-LCMS m/e calculado (cale.) para C1 1 0H1 62N3 4O23 2327.26 encontrado 2327.26.
Ejemplo 6 Preparación de Ac-Ile-Lys (Caprlloilo) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu- Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Qln- (NMe) Arg-Tyr-NH2 200 mg de Ac - I le - Lys - Pqa-Arg-Hi s -Tyr- Leu-Asn-Trp-Val -Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2 , se disolvieron en 5.0 mL de D F y N-hidroxibenzotriazol (425 mg , 3.15 mmoles) , DIEA (500 uL , 3.0 mmoles) y cloruro de capriloilo (2.8 mL , 2.75 mmoles) se hicieron reaccionar en 15 mL de CH2C12 durante 5 minutos y se añadieron a la resina péptida. La solución se agitó durante 16 horas (durante la noche) . Se añadieron 3.0 mL de NH3 7N en MeOH y se continuó agitando durante ¾ hora. El producto se precipitó después en 5.0 mL de Et20, se centrifugó, se lavó y se secó al vacío. El péptido crudo se purificó siguiendo el procedimiento del ejemplo 3 para dar 10 mg (5%) de un polvo amorfo blanco. (ES)+-LCMS calculado (cale.) Cn4Hi7oN34023 2383.32 encontrado 2383.32.
Ejemplo 7 Preparación de Ac-Ile-Lys (Lauroilo) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn- Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (NMe) Arg-Tyr- H2 200 mg de Ac-Ile-Lys-Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2 se disolvieron en 5.0 mL de DMF y N-hidroxibenzotriazol (425 mg, 3.150 mmoles) , DIEA (500 uL, 3.0 m) y cloruro de lauroilo (2.8 mL, 2.75 m) se hicieron reaccionar en 15 mL de CH2C12 durante 5 minutos y se añadieron a la resina péptida. La solución se agitó durante 16 horas (durante la noche) . Se añadieron 3.0 mL de NH3 7N en MeOH y se continuó agitando durante ¾ hora. El producto se precipitó después en 5.0 mL de Et20, se centrifugó, se lavó y se secó al vacío. El material crudo se purificó mediante HPLC preparativa en una columna Pursuit C18 (50x250 mm, 10 ]im de tamaño de partícula) y se eluyó con un gradiente lineal de 20-90% de B (regulador de pH A: 0.1% de TFA/H20; regulador de pH B: 0.1% de TFA/CH3CN) en 90 minutos, velocidad de flujo 60 mL/min y detección 220/280 nm. Las fracciones se recogieron y se revisaron mediante HPLC analítica. Fracciones que contenían producto puro se combinaron y liofilizaron para dar 57 mg (26%) de polvo amorfo blanco. (ES)+-LC S m/e calculado (cale.) ???8?178 34?23 2439.38 encontrado 2439.40.
Ejemplo 8 Preparación de resina Boc-Ile-Lys (sal TFA) -Pqa-Arg (Pbf) - His(Trt) -Tyr(tBu) -Leu-Asn (Trt) -Trp-Val-Thr (tBu) -Arg(Pbf) - Gln (Trt) -NMe-Arg (Mtr) -Tyr (tBu) -Knorr Resina entrelazada con copoliestireno benzhidrilamina-1% de divinilbenceno (50.0 g, 55.0 mequiv, 100-200 mallas ASTM, Advanced ChemTech cat #SB5003) se hinchó en 400 mL de CH2C12, se filtró y se lavó sucesivamente con 100 mL cada uno de CH2C12/ 6% de DIPEA/ CH2C12 (dos veces) , CH2C12 (dos veces). La resina se trató con ácido p-[(R,S)-a~ [1- (9H-fluoren-9-il) -metoxiformamido] -2 , 4-dimetoxibencil] -fenoxiacético (Fmoc-enlazador) (37.1 g, 69.0 mmoles) , N~ hidroxibenzotriazol (9.356 g, 69.0 mmoles) y ?,?'-diisopropilcarbodiimida (55.0 mL, 300 mmoles) en 400 mL de DMF durante 24 horas a temperatura ambiente.
La resina se filtró y se lavó sucesivamente con 400 mL cada uno de C¾C12 (dos veces) , isopropanol (dos veces) , DMF y CH2C12 (tres veces) . Un análisis de ninhidrina de Kaiser fue negativo. Fmoc-Tyr (But) -OH (41.40 g, 90 mmoles, N-hidroxibenzotriazol (12.2 g, 90.0 mmoles) y ?,?' -diisopropilcarbodiimida (55.0 mL, 300 mmoles) en 400 mL de DFM se añadió y se dejó reaccionar durante 24 horas a temperatura ambiente. La reacción no se completó y, entonces, se añadieron 25.0 mL de DIEA y la reacción se dejó proceder durante 1 ½ adicioal. El acoplamiento aún no estaba completo, por lo tanto la acetilación con 25% de Ac20, 5% de DIEA en DMF durante ¾ de hora se llevó a cabo para obtener una ninhidrina negativa (reacción completa) . Después del lavado y remoción con Fmoc, Fmoc-NMeArg (Mtr) -OH (43.0 g, 69.0 mmoles) , N-hidroxibenzotriazol (9.356 g, 69.0 mmoles) y ?,?' -diisopropilcarbodiimida (110.0 mL, 630 mmoles) en 400 mL de DMF se añadieron, y se dejaron reaccionar durante 24 horas, con lo cual se completó la reacción. Después del lavado y remoción con Fmoc, Fmoc-Gln (Trt) -OH (55.0 g, 90.0 mmoles), N-hidroxibenzotriazol (12.2 g, 90.0 mmoles) y ?,?' -diisopropilcarbodiimida (55.0 mL, 300 mmoles) en 400 mL de DMF fueron añadidos y la reacción se dejó transcurrir durante 24 horas. La reacción se completó como se determina por la prueba cloral .
La resina se lavó y se secó y 25.0 g (18.4%) se guardaron para análogos diferentes. Los 110.0 g de resina restantes (44.6 mmoles) se continuaron usando y 1.55 equivalentes de Fmoc-Arg (Pbf) -OH (45.0 g, 73.5 mmoles), N-hidroxibenzotriazol (9.95 g, 73.5 mmoles) y ?,?'-diisopropilcarbodiimida (55.0 mL, 330 mmoles) en 400 mL de DMF fueron añadidos, y la reacción se dejó transcurrir durante 24 horas a temperatura ambiente tiempo después del cual se completó según se juzga por la prueba de ninhxdrina. Después del lavado y remoción de Fmoc, Fmoc-Thr (But) -OH (27.40 g, 73.5 mmoles) , N-hidroxibenzotriazol (9.95 g, 73.5 mmoles) y ?,?' -diisopropilcarbodiimida (55 mL, 300 mmoles) en 400 mL de DMF fueron añadidos y la reacción se dejó proceder durante 24 horas a temperatura ambiente tiempo después del cual se completó según se determina por la prueba de ninhxdrina. Después del lavado y remoción con Fmoc, Fmoc-Val-OH (23.6 g, 73.5 mmoles), N-hidroxibenzotriazol (9.95 g, 73.5 mmoles) y N, N' -diisopropilcarbodiimida (55.0 mL, 300 mmoles) en 400 mL de DMF se añadieron y se de aron reaccionar durante 6 horas a temperatura ambiente tiempo después del cual se completó.
Después del lavado y remoción del Fmoc, Fmoc-Trp-OH (29.5 g, 73.5 mmoles), N-hidroxibenzotriazol (9.95 g, 73.5 mmoles) y ?,?' -diisopropilcarbodiimida (55.0 mL, 300 mmoles) en 400 mL de DMF fueron añadidos. La reacción se completó después de 6 horas. Después del lavado y remoción de Fmoc, Fmoc-Asn (Trt) -OH (41.4 g, 73.5 mmoles), N-hidroxibenzotriazol (9.95 g, 73.5 mmoles) y ?,?' -diisopropilcarbodiimida (55 mL, 300 mmoles) en 400 mL de DMF fueron añadidos y se dejaron reaccionar durante 18 horas a temperatura ambiente tiempo después del cual se completó.
Después del lavado y remoción de Fmoc, Fmoc-Leu-OH (33.4 g, 73.5 ramoles) , N-hidroxibenzotriazol (9.95 g, 73.5 mmoles) y ?,?' -diisopropilcarbodiiniida (55.0 niL, 300 minóles) en 400 mL de DMF fueron añadidos y se dejaron reaccionar 6 horas. Después del lavado y remoción del Fmoc, Fmoc-Tyr(But)-OH (41.4 0 g, 73.5 mmoles), N-hidroxibenzotriazol (9.95 g, 73.5 mmoles) y ?,?' -diisopropilcarbodiimida (55.0 mL, 300 mmoles) en 400 mL de DMF fueron añadidos. La reacción se completó después de 18 horas. Después del lavado y remoción de Fmoc, Fmoc-His (Trt) -OH (55.5 g, 73.5 mmoles), N-hidroxibenzotriazol (9.95 g, 73.5 mmoles) y ?,,?'-diisopropilcarbodiimida (55.0 mL, 300 mmoles) en 400 mL de DMF fueron añadidos. La reacción se completó después de 20 horas. Después del lavado y remoción con Fmoc, Fmoc-Arg(Pbf)-OH (58.4 g, 73.5 mmoles), N-hidroxibenzotriazol (9.95 g, 73.5 mmoles) y ?,?' -diisopropilcarbodiimida (55.0 mL, 300 mmoles) en 400 mL de DMFfueron añadidos. La reacción se completó después de 20 horas.
Después del lavado y remoción de Fmoc, Fmoc-Pqa-OH (21.4 g, 73.5 mmoles), N-hidroxibenzotriazol (5.7 g, 42.05 mmoles) y N, N' -diisopropilcarbodiimida (55.0 mL, 300 mmoles) en 400 mL de DMF fueron añadidos. La reacción se completó después de 16 horas. Después del lavado y remoción de Fmoc, Fmoc-Lys (Alloc) -OH (18.5 g, 73.5 mmoles) y N-hidroxibenzotriazol (9.95 g, 73.5 mmoles) y ?,?' -diisopropilcarbodiimida (55.0 mL, 300 mmoles) en 400 mL de DMF fueron añadidos. La reacción se completó después de 20 horas según se determina por la prueba cloral . Después del lavado y secado, se guardó una porción para acoplamiento con Fmoc-Ile para análogos N-acetilados . La resina péptida restante se trató con Boc-Ile-OH (25.0 g, 73.5 mmoles) , N-hidroxibenzotriazol (9.95 g, 73.5 mmoles) y ?,?'-diisopropilcarbodiimida (55.0 mL, 300 mmoles) en 400 mL de DMF durante 20 horas a temperatura ambiente. Se completó la reacción.
Remoción del grupo Aloe del grupo épsilon-amino de Lys : Se burbujeó argón a través de una mezcla de 1.2 g de PdCl2 (trifenilfosfina) 2 / 5.0 mL de morfolina y 10.0 mL de ácido acético, luego se añadieron 25.0 mL de Bu3SnH. El burbujeo con Ar se continuó hasta que la solución amarilla se volviera rojiza café. La mezcla de reacción se agitó después durante ½ hora y se lavó 3 veces con DMF. El procedimiento anterior se repitió una segunda vez (esta vez la mezcla se volvió café oscuro a casi negra en color) y se continuó agitando durante ½ a ¾ de hora. La resina se lavó 2 veces con DMF, 2 veces con 5% de DIEA/DMF y 3 veces con DMF/CH2Cl2. El épsilon-amina libre de lisina se convirtió en la sal TFA por lavado con 2.35 mL de TFA añadido a CH2C12. La resina se lavó 2 veces con CH2C12 y 4 veces con MeOH y se secó hasta un peso constante al vacío.
Ejemplo 9 Preparación de H-Ile-Lys (Lauroil- 6 -Ahx) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu- Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (NMe) Arg-Tyr-NH2 1.0 Gramo de resina Boc-Ile-Lys (sal TFA) -Pqa-Arg (Pbf ) -His (Trt) -Tyr (tBu) -Leu-Asn (Trt) -Trp-Val-Thr (tBu) -Arg(Pbf) -Gln(Trt) -NMe-Arg (Mtr) -Tyr (tBu) - norr se lavó con 5% de DIEA en DMF y se acopló con ácido Fmoc-6-aminohexanoico (355.0 mg; 1.0 mmol) , N-hidroxibenzotriazol (150 mg, 1.11 mmoles) y N, N' -diisopropilcarbodiimida (1.50 mL, 2.0 mmoles) durante la noche. Después de la remoción de Fmoc y lavado con DMF, N-hidroxibenzotriazol (425 mg, 3.150 mmoles), DIEA (500 uL, 3.0 m) y cloruro de lauroilo (2.8 mL, 2.75 m) se hicieron reaccionar en 15 mL de CH2C12 durante 5 minutos y se añadieron a la resina péptida. La mezcla de reacción se agitó durante la noche y se lavó con DMF 2 veces y CH2C12 3 veces antes de llevar a cabo el corte con TFA, 17 mL, 400 uL de iPrSiH y 800 uL de propanotiol durante 6 horas. El producto se precipitó en 100.0 mL de Et20, se centrifugó, se lavó y se secó al vacío. El péptido crudo se purificó siguiendo el procedimiento del ejemplo 7 para dar 30 mg (7%) de polvo amorfo blanco. (ES)+-LC S m/e calculado (cale.) ¾22?187?35?23 2510.45 encontrado 2510.44.
E emplo 10 Preparación de H-Ile-Lys (Lauroil-beta-Ala) -Pga-Arg-His-Tyr- Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (NMe) Arg-Tyr-NH2 1.0 Gramo de resina Boc-Ile-Lys (épsilon sal TFA) -Pqa-Arg (Pbf) -His (Pbf) -His (Trt) -Tyr (tBu) -Leu-Asn (Trt) -Trp-Val-Thr (tBu) -Arg(Pbf) -Gln(Trt) -NMe-Arg (Mtr) -Tyr (tBu) -Knorr se lavó con 5% de DIEA en DMF y se acopló con Fmoc-betaAla (325.0 mg; 1.0 mmol) , N-hidroxibenzotriazol (150 mg, 1.11 mmoles) y N, N' -diisopropilcarbodiiraida (1.50 mL, 2.0 mmoles) durante la- noche. Después de la remoción de Fmoc y lavado con DMF, N-hidroxibenzotriazol (425 mg, 3.150 mmoles), DIEA (500 uL, 3.0 m) y cloruro de lauroilo (2.8 mL, 2.75 mmoles) se hicieron reaccionar en 15 mL de C¾C12 durante 5 minutos y se añadieron a la resina péptida. La mezcla de reacción se agitó durante la noche y se lavó con DMF 2 veces y CH2Cl2 3 veces antes de llevar a cabo el corte con TFA, 17 mL, 400 uL de iPrSiH y 800 uL de propanotiol durante 6 horas. El producto se precipitó en 100.0 mL de Et20, se centrifugó, se lavó y se secó al vacío. El péptido crudo se purificó siguiendo el procedimiento en el ejemplo 7 para dar 20 mg (4%) de polvo amorfo blanco. (ES)+-LCMS m/e calculado (cale.) C119H181 35O23 2468.41, encontrado 2468.6.
Ejemplo 11 Preparación de H-Ile-Lys (Lauroil-Glu) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu- Asn-Trp- al-Thr-Arg-Gln- [NMe) Arg-Tyr-NH2 1.0 Gramo de resina Boc-Ile-Lys (épsilon-sal TFA) -Pqa-Arg(Pbf) -His (Trt) -Tyr(tBu) -Leu-Asn (Trt) -Trp-Val-Thr (tBu) -Arg(Pbf) -Gln(Trt) -NMe-Arg (Mtr) -Tyr (tBu) - norr se lavó con 5% de DIEA en DMF y se acopló con Fmoc-Glu (Bu*1) (325.0 mg; 1.0 mmol) , N-hidroxibenzotriazol (150 mg, 1.11 mmoles) y ?,?'-diisopropilcarbodiimida (1.50 mL, 2.0 mmoles) durante la noche. Después de la remoción de Fmoc y lavado con DMF, N-hidroxibenzotriazol (425 mg, 3.150 mmoles), DIEA (500 uL, 3.0 mmoles) y cloruro de lauroilo (2.8 mL, 2.75 mmoles) se hicieron reaccionar en 15 mL de CH2C12 durante 5 minutos y se añadieron a la resina péptida. La mezcla de reacción se agitó durante la noche y se lavó con DMF 2 veces y CH2C12 3 veces antes de llevar a cabo el corte con TFA, 17 mL, 400 uL de iPrSiH y 800 uL de propanotiol durante 6 horas. El producto se precipitó en 100.0 mL de Et20, se centrifugó, se lavó y se secó al vacío. El péptido crudo se purificó siguiendo el procedimiento en el ejemplo 7 para dar 30 mg (7%) de polvo amorfo blanco. (ES) +-LCMS m/e calculado (calculado) C12iH183N35025 2526.41, encontrado 2526.40.
Ejemplo 12 Preparación de H-Ile-Lys (miristoil-SAhx) -Pro-Pga-Arg-His-Tyr- Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (NMe) A g-Tyr-NH2 1.0 Gramo de resina Boc-Ile-Lys (sal épsilon TFA) -Pqa-Arg(Pbf) -His (Trt) -Tyr(tBu) -Leu-Asn (Trt) -Trp-Val-Thr (tBu) -Arg(Pbf) -Gln(Trt) -NMe-Arg (Mtr) -Tyr (tBu) -Knorr se lavó con 5% de DIEA en DMF y se acopló con ácido Fmoc-6-aminohexanoico (355 mg; 1.0 mmol) , N-hidroxibenzotriazol (150 mg, 1.11 mmoles) y ?,?' -diisopropilcarbodiimida (1.50 mL, 2.0 mmoles) durante la noche. Después de la remoción de Fmoc y lavado con DMF, se acoplaron ácido miristico (230 mg, 1 mmoles) ; N-hidroxibenzotriazol (150 mg, 1.11 mmoles) y ?,?'- diisopropilcarbodiimida (1.50 mL, 2.0 mmoles) y se agitaron durante la noche . Después del lavado con DMF 2 yeces y CH2C12 3 veces, el corte se efectuó con TFA, 17 mL, 400 uL de iPrSiH y 800 uL de propanotiol durante 6 horas. El producto se precipitó en 100.0 mL de Et20, se centrifugó, se lavó y se secó al vacío. El péptido crudo se purificó siguiendo el procedimiento del ejemplo 7 para dar 66 mg (13%) de polvo amorfo blanco. (ES)+-LCMS m/e calculado (cale.) C12 H191 35O23 2538.49, encontrado 2538.47.
Ejemplo 13 Preparación de Ac-Ile-Lys (Palmitoil) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn- Trp-Val-Thr-Arg-Gln- {NMe) Arg-Tyr- H2 200 Mg de Ac-Ile-Lys-Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2, se disolvieron en 5.0 mL de DMF y N-hidroxibenzotriazol (425 mg, 3.15 mmoles), DIEA (500 uL, 3.0 mmoles) y cloruro de palmitoilo (2.8 mL, 2.8 mmoles) se hicieron reaccionar en 15 mL de CH2C12 durante 5 minutos y se añadieron a la resina péptida. La solución se agitó durante -16 horas (durante la noche) . Se añadieron 3.0 mL de NH3 7N en MeOH y se continuó agitando durante ¾ hora. El producto se precipitó después en 5.0 mL de Et20, se centrifugó, se lavó y se secó al vacío. El péptido crudo se purificó siguiendo el procedimiento del ejemplo 7 para dar 42 mg (19%) de polvo amorfo blanco. (ES)+-LCMS m/e calculado (cale.) C122H186N34O23 2495.44, encontrado 2495.43.
Ejemplo 14 Preparación de H-Ile-Lys (Palmitoilo) -Pq-a-Arg-His-Tyr-Leu-Asn- Tr -Va1 -Thr-A g-Gln- (NMe) Arg-Tyr- H2 1.0 Gramo de resina Boc-Ile-Lys (sal épsilon TFA) - Pqa-Arg(Pbf) -His (Trt) -Tyr (tBu) -Leu-Asn (Trt) -Trp-Val-Thr (tBu) -Arg (Pbf) -Gln(Trt) -NMe-Arg (Mtr) -Tyr (tBu) -Knorr se lavó con 5% de DIEA en DMF y se acopló con ácido Fmoc-6-aminohexanoico (355.0 mg; 1.0 mmol) , N-hidroxibenzotriazol (150 mg, 1.11 mmoles) y ?,?' -diisopropilcarbodiimida (1.50 mL, 2.0 mmoles) durante la noche. Después de la remoción de Fmoc y lavado con DMF, N-hidroxibenzotriazol (425 mg, 3.150 mmoles) , DIEA (500 uL, 3.0 mmoles) y cloruro de palmitoilo (2.8 mL, 2.8 mmoles) se hicieron reaccionar en 15 mL de CH2C12 durante 5 minutos y se añadieron a la resina péptida. La mezcla de reacción se agitó durante la noche y se lavó con DMF 2 veces y CH2C12 3 veces antes de llevar a cabo el corte con TFA, 17 mL, 400 uL de iPrSiH y 800 uL de propanotiol durante 6 horas. El producto se precipitó en 100.0 mL de Et20, se centrifugó, se lavó y se secó al vacío. El péptido crudo se purificó siguiendo el procedimiento en el ejemplo 7 para dar 46 mg (10%) de polvo amorfo blanco. (ES) +-LCMS xa/e calculado (cale.) Ci2o¾8 N34022 2453.43, encontrado 2453.41.
Ejemplo 15 Preparación de Palmitoilo-Ile-Lys-Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn- Trp-Val-Thr-Arg-Gln-(NMe) Arg-Tyr- H2 Fmoc-enlazador-resina BHA (450 mg, 0.25 mmoles) del ejemplo 1 se sometió a síntesis en fase sólida. La síntesis se llevó a cabo de acuerdo con el procedimiento general descrito en el ejemplo 4 en cuanto al 15 mero desprotegido IT-terminal y se aciló manualmente con cloruro de palmitoilo (288 uL, 1.0 mmol) y DIEA (200 uL, 1.15 mmoles) en CH2C12 durante ¾ hora. La resina se cortó y el producto se purificó siguiendo el procedimiento en el ejemplo 7 para dar 55 mg (9%) de polvo amorfo blanco. (ES)+-LCMS m/e calculado (cale.) para C12oHi84 34022 2453.43, encontrado 2453.41.
E emplo 16 Preparación de Palmitoilo- 6-Ahx-Ile-Lys-Pqra-Arg-His-Tyr-Leu- Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (NMe) Arg-Tyr-NH2 Fmoc-enlazador-resina BHA (450 mg, 0.25 mmoles) del ejemplo 1 se sometió a síntesis en fase sólida. La síntesis se llevó a cabo como se describe generalmente en el ejemplo 4 en cuanto al 15 mero desprotegido y se acopló manualmente con ácido Fmoc-6-aminohexanoico (355.0 mg; 1.0 mmol), N-hidroxibenzotriazol (150 mg, 1.11 mmoles) y ?,?'-diisopropilcarbodiimida (1.50 mL, 2.0 mmoles) se añadieron y la reacción se dejó proceder durante la noche. Después de la remoción de Fmoc, el péptido unido a resina se aciló con cloruro de palmitoilo (288 uL, 1.0 mmol), DIEA (200 uL, 1.15 mmoles) en CH2C12 durante ¾ hora. La resina se cortó y el péptido crudo se purificó siguiendo el procedimiento del ejemplo 7 para dar 45 mg (7%) de polvo amorfo blanco. (ES)+-LCMS m/e calculado (cale.) para Ci2sHi95 35023 2566.52, encontrado 2566.51.
E emplo 17 Preparación de Palmitoilo- 6-Ahx-lle-Lys-Pga-Arg-His-Tyr-Leu- Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr- H2 Fmoc - enlazador- resina BHA (450 mg, 0.25 mmoles) del ejemplo 1 se sometió a síntesis en fase sólida. La síntesis se llevó a cabo de acuerdo con el procedimiento general descrito en el ejemplo 4 en cuanto al 15 mero desprotegido y se acopló manualmente con ácido Fmoc- 6 - aminohexanoico (355.0 mg; 1.0 mmol) , N-hidroxibenzotriazol (150 mg, 1.11 mmoles) y N , N ' - di i sopropilcarbodi imida (1.50 mL, 2.0 mmoles) durante la noche. Después de la remoción de Fmoc el péptido unido a resina fue acilado con cloruro de palmitoilo (288 uL , 1.0 mmol) y DIEA (200 uL , 1.15 moles) en CH2C12 durante ½ hora. La resina se cortó y el péptido crudo se purificó siguiendo el procedimiento del ejemplo 7 para dar 77 mg (12%) de polvo amorfo blanco. (ES)+-LCMS m/e calculado (cale.) para C125H193 35023 2552.50 encontrado 2552.49.
Ejemplo 18 Preparación de H-Ile-Lys (Palmitoilo-6-Ahx) -Pga-Arg-His-Tyr- Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (NMe) Arg-Tyr-NH2 1.0 Gramo de resina Boc-Ile-Lys (sal épsilon TFA) -Pqa-Arg (Pbf) -His (Trt) -Tyr (tBu) -Leu-As (Trt) -Trp-Val-Thr (tBu) Arg (Pbf) -Gln (Trt) -NMe-Arg (Mtr) -Tyr (tBu) -Knorr se lavó con 5% de DIEA en DMF y se acopló con ácido Fmoc~6-aminohexanoico (355.0 mg; 1.0 mmol) , N-hidroxibenzotriazol (150 mg, 1.11 mmoles) y ?,?' -diisopropilcarbodiimida (1.50 mL, 2.0 mmoles) durante la noche. Después de la remoción de Fmoc y lavado con DMF, se hicieron reaccionar N-hidroxibenzotriazol (425 mg, 3.150 mmoles), DIEA (500 uL, 3.0 m) y cloruro de palmitoilo (2.8 mL, 2.75 m) en 15 mL de CH2C12 durante 5 minutos y se añadieron a la resina péptida. La mezcla de reacción se agitó durante la noche y se lavó con DMF 2 veces y CH2C12 3 veces antes de llevar a cabo el corte con TFA, 17 mL, 400 uL de iPrSiH y 800 uL de propanotiol durante 6 horas. El producto se precipitó en 100.0 mL de Et20, se centrifugó, se lavó y se secó al vacio. El péptido crudo se purificó siguiendo el procedimiento en el ejemplo 7 para dar 14 mg (3%) de polvo amorfo blanco. (ES) +-LCMS m/e calculado (cale.) Ci26Hi95 35023 2566.51 encontrado 2566.50.
Ejemplo 19 Preparación de H-Ile-Lys (Palmitoilo-6Ahx) -Pga-Arg-His-Tyr- Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-ISIH2 Resina Boc-Ile-Lys (alloc) -Pqa-Arg (Pbf) -His (Trt) - Tyr (tBu) -Leu-Asn (Trt) -Trp-Val-Thr (tBu) -Arg(Pbf) -Gln(Trt) -Arg- Tyr (tBu) -Knorr (preparada como en el ejemplo 14) se lavó con 5% de DIEA en DMF y se acopló con ácido Fmoc-6-aminohexanoico (355.0 mg; 1.0 mraol) , N-hidroxibenzotriazol (150 mg, 1.11 mmoles) y N, ' -diisopropilcarbodiimida (1.50 mL, 2.0 mmoles) durante la noche. Después de la remoción de Fmoc y lavado con DMF, N-hidroxibenzotriazol (425 mg, 3.150 mmoles), DIEA (500 uL, 3.0 m) y cloruro de palmitoilo (2.8 mL, 2.75 m) fueron hechos reaccionar en 15 mL de CH2C12 durante 5 minutos y se añadieron a la resina péptida. La mezcla de reacción se agitó durante la noche y se lavó con DMF 2 veces y CH2C12 3 veces antes de llevar a cabo el corte con TFA, 17 mL, 400 uL de iPrSiH y 800 uL de propanotiol durante 6 horas. El producto se precipitó en 100.0 mL de Et20, se centrifugó, se lavó y se secó al vacío. El péptido crudo se purificó siguiendo el procedimiento en el ejemplo 7 para dar 52 mg (15%) de polvo amorfo blanco. (ES) +-LCMS m/e calculado (cale.) Ci25H193N35023 2552.50 encontrado 255.49.
Ejemplo 20 Preparación de H-Ile-Lys (palmitoil-beta-Ala) -Pqa-Arg-His-Tyr- 1.0 Gramo de resina Boc-Ile-Lys (sal épsilon TFA) - Pqa-Arg (Pbf) -His (Trt) -Tyr (tBu) -Leu-Asn (Trt) -Trp-Val-Thr (tBu) - Arg(Pbf) -Gln(Trt) -NMe-Arg (Mtr) -Tyr(tBu) -Knorr se lavó con 5% de DIEA en D F y se acopló con Fmoc-beta-Ala (312.0 mg; 1.0 mmol) , N-hidroxibenzotriazol (150 mg, 1.1 mmoles) y ?,?' - diisopropilcarbodiimida (1.50 mL, 2.0 mmoles) durante la noche. Después de la remoción de Fmoc y lavado con DMF, N- hidroxibenzotriazol (425 mg, 3.150 mmoles), DIEA (500 uL, 3.0 m) y cloruro de palmitoilo (2.8 mL, 2.75 m) se hicieron reaccinar en 15 mL de CH2C12 durante 5 minutos y se añadieron a la resina péptida. La mezcla de reacción se agitó durante la noche y se lavó con DMF 2 veces y CH2C12 3 veces antes de llevar a cabo el corte con TFA, 17 mL, 400 uL de iPrSiH y 800 uL de propanotiol durante 6 horas. El producto se precipitó en 100.0 mL de Et20, se centrifugó, se lavó y se secó al vacío. El péptido crudo se purificó siguiendo el procedimiento en el ejemplo 7 para dar 20 mg (4.4%) de polvo amorfo blanco. (ES)+-LCMS m/e calculado (cale.) C123Hi89 35023 2524.476, encontrado 2524.47.
Ej mplo 21 Preparación de H-Ile-Lys (palmitoilo-Glu) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu- Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (NMe) Arg-Tyr-NH2 1.0 Gramo de resina Boc-Ile-Lys (sal épsilon TFA) -Pqa-Arg (Pbf) -His (Trt) -Tyr (tBu) -Leu-Asn (Trt) -Trp-Val-Thr (tBu) -Arg(Pbf) -Gln(Trt) -NMe-Arg ( tr) -Tyr (tBu) - norr se lavó con 5% de DIEA en DMF y se acopló con Fmoc-Glu (Bufc) (312.0 mg; 1.0 mraol) , N-hidroxibenzotriazol (150 mg, 1.11 mmoles) y ?,?' -diisopropilcarbodiimida (1.50 mL, 2.0 mmoles) durante la noche. Después de la remoción de Fmoc y lavado con DMF, N-hidroxibenzotriazol (425 mg, 3.150 mmoles), DIEA (500 uL, 3.0 m) y cloruro de palmitoilo (2.8 mL, 2.75 m) se hicieron reaccionar en 15 mL de CH2C12 durante 5 minutos y se añadieron a la resina péptida. La mezcla de reacción se agitó durante la noche y se lavó con DMF 2 veces y C¾C12 3 veces antes de llevar a cabo el corte con TFA, 17 mL, 400 uL de iPrSiH y 800 uL de propanotiol durante 6 horas . El producto se precipitó en 100.0 mL de Et20, se centrifugó, se lavó y se secó al vacío. El péptido crudo se purificó siguiendo el procedimiento en el ejemplo 7 para dar 14 mg (3%) de polvo amorfo blanco. (ES+-LC S m/e calculado (cale.) C125Hi9iN35025 2582.48, encontrado 2582.48.
Ejemplo 22 Preparación de H-Ile-Lys (Palmitoilo-beta-Ala-Glu) -Pga-Arg- His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (NMe) Arg-Tyr-NH2 1.0 Gramo de resina Boc-Ile-Lys (sal épsilon TFA) -Pqa-Arg (Pbf) -His (Trt) -Tyr (tBu) -Leu-Asn (Trt) -Trp-Val-Thr (tBu) -Arg (Pbf) -Gln (Trt) -NMe-Arg (Mtr) -Tyr (tBu) -Knorr se lavó con 5% de DIEA en DMF y se acopló con Fmoc-beta-Ala (312.0 mg; 1.0 mmol) , N-hidroxibenzotriazol (150 mg, 1.11 mmles) y ?,?' -diisopropilcarbodiimida (1.50 mL, 2.0 mmoles) durante la noche. Después de la remoción de Fmoc y lavado con DMF, se añadieron Fmoc-Glu (Bu'') (312.0 mg; 1.0 mmol), N-hidroxibenzotriaol (150 mg, 1.11 mmoles) y ?,?' - diisopropilcarbodiimida (1.50 mL, 2.0 mmoles) y la reacción se dejó proceder durante la noche. Después de la remoción de Fmoc y lavado con DMF, se hicieron reaccionar N- hidroxibenzotriazol (425 mg, 3.150 mmoles), DIEA (500 uL, 3.0 m) y cloruro de palmitoilo (2.8 mL, 2.75 m) en 15 mL de CH2C12 durante 5 minutos y se añadieron a la resina péptida. La mezcla de reacción se agitó durante la noche y se lavó con DMF 2 veces y CH2C12 3 veces antes de llevar a cabo el corte con TFA, 17 mL, 400 uL de iPrSiH y 800 uL de propanotiol durante 6 horas. El producto se precipitó en 100.0 mL de Et20, se centrifugó, se lavó y se secó al vacío. El péptido crudo se purificó siguiendo el procedimiento del ejemplo 7 para dar 29 mg (6%) de polvo amorfo blanco. (ES)+-LCMS m/e calculado (cale.) Ci28Hig6 36026 2653.51, encontrado 2653.50.
Ejemplo 23 Preparación de H-Ile-Lys (Palmitoilo-Glu-Glu-) -Pga-Arg-His- Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- {NMe) Arg-Tyr- H2 1.0 Gramo de resina Boc-Ile-Lys (sal épsilo TFA) -Pqa-Arg (Pbf ) -His (Trt ) -Tyr (tBu) -Leu-Asn (Trt) -Trp-Val-Thr (tBu) -Arg(Pbf ) -Gln(Trt) -NMe-Arg (Mtr) -Tyr(tBu) -Knorr se lavó con 5% de DIEA en DMF y se acopló con Fmoc -Glu (Bu1) (426.0 mg ; 1.0 mmol), N-hidroxibenzotriazol (150 mg, 1.11 mmoles) y ?,?'-diisopropilcarbodiimida (1.50 mL , 2.0 mmoles) durante la noche. Después de la remoción de Fmoc y lavado con DMF el acoplamiento se llevó a cabo con Fmoc-Glu(Bufc) (426.0 mg; 1.0 mmol), N-hidroxibenzotriazol (150 mg, 1.11 mmoles) y N, N' -diisopropilcarbodiimida (1.50 mL, 2.0 mmoles) durante la noche. Después de la remoción de Fmoc y lavado con DMF, N-hidroxibenzotriazol (425 mg, 3.150 mmoles), DIEA (500 uL, 3.0 m) y cloruro de palmítoilo (2.8 mL, 2.75 m) se hicieron reaccionar en 15 mL de CH2C12 durante 5 minutos y se añadieron a la resina péptida. La mezcla de reacción se agitó durante la noche y se lavó con DMF 2 veces y CH2C12 3 veces antes de llevar a cabo el corte con TFA, 17 mL , 400 uL de iPrSiH y 800 uL de propanotiol durante 6 horas. El producto se precipitó en 100.0 mL de Et20, se centrifugó, se lavó y se secó al vacío. El péptido crudo se purificó siguiendo el procedimiento del ejemplo 7 para dar 25 mg (5%) de polvo amorfo blanco. (ES)+-LCMS m/e calculado (cale.) Ci3oH198N36028 2711.52 , encontrado 2711.51.
E emplo 24 Preparación de H-Ile-Lys (Palmitoilo-gamma-Glu) -Pga-Arg-His- Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (NMe) Arg-Tyr-NH2 1.0 Gramo de resina Boc-Ile-Lys (sal épsilon TFA) - Pqa-Arg(Pbf) -His (Trt) -Tyr(tBu) -Leu-Asn (Trt) -Trp-Val-Thr (tBu) - Arg (Pbf) -Gl (Trt) -NMe-Arg (Mtr) -Ty (tBu) -Knorr se lavó con 5% de DIEA en DMF y se acopló con Fmoc-gamma-Glu-alfa OBu* (426.0 mg; 1.0 mmol) , N-hidroxibenzotriazol (150 mg, 1.11 mmoles) y ?,?' -diisopropilcarbodiimida (1.50 mL, 2.0 mmoles) durante la noche . Después de la remoción de Fmoc y lavado con DMF, N-hidroxibenzotriazol (425 mg, 3.150 mmoles), DIEA (500 uL, 3.0 m) y cloruro de palmitoilo (2.8 mL, 2.75 m) se hicieron reaccionar en 15 mL de CH2Cl2 durante 5 minutos y se añadieron a la resina péptida. La mezcla de reacción se agitó durante la noche y se lavó con DMF 2 veces y CH2C12 3 veces antes de llevar a cabo el corte con TFA, 17 mL, 400 uL de iPrSiH y 800 uL de propanotiol durante 6 horas. El producto se precipitó en 100.0 mL de Et20, se centrifugó, se lavó y se secó al vacío. El péptido crudo se purificó siguiendo el procedimiento en el ejemplo 7 para dar 28 mg (6%) de polvo amorfo blanco. (ES) +-LCMS m/e calculado (cale.) C125Hi9iN35025 2582.48, encontrado 2582.47.
Ejemplo 25 Preparación ds H-Ile-Lys (Palmitoilo-ganima-Glu-ganima-Glu- ) - Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (NMe) Arg-Tyr-NH2 1.0 Gramo de resina Boc-Ile-Lys (sal épsilon TFA) -Pqa-Arg (Pbf ) -His (Trt ) -Tyr (tBu) -Leu-Asn (Trt ) -Trp-Val-Thr (tBu) -Arg (Pbf) -Gl (Trt) -NMe-Arg (Mtr) -Tyr (tBu) -Knorr se lavó con 5% de DIEA en DMF y se acopló con Fmoc-Glu-alfa-OBu1 (426.0 mg ; 1.0 mmol) , N-hidroxibenzotriazol (150 mg, 1.11 mmoles) y ?,?' -diisopropilcarbodiimida (1.50 mL , 2.0 mmoles) durante la noche. Después de la remoción de Fmoc y lavado con DMF, se añadieron Fmoc-Glu-alfaOBufc (426.0 mg; 1.0 mmol), N-hidroxibenzotriazol (150 mg, 1.11 mmoles) y , M ' - di i sopropi 1 carbodi imi da (1.50 mL, 2.0 mmoles) y la reacción se dejó proceder durante la noche.
Después de la remoción de Fmoc y lavado con D F, N-hidroxibenzotriazol (425 mg, 3.150 mmoles), DIEA (500 uL , 3.0 m) y cloruro de palmitorilo (2.8 mL, 2.75 m) se hicieron reaccionar en 15 mL de CH2C12 durante 5 minutos y se añadieron a la resina péptida. La mezcla de reacción se agitó durante la noche y se lavó con DMF 2 veces y CH2C12 3 veces antes del corte con TFA, 17 mL , 400 uL de iPrSiH y 800 uL de propanotiol durante 6 horas. El producto se precipitó en 100.0 mL de Et20, se centrifugó, se lavó y se secó al vacio. El péptido crudo se purificó siguiendo el procedimiento del ejemplo 7 para dar 40 mg (8%) de polvo amorfo blanco. (ES)+-LCMS m/e calculado (cale.) Ci3oHi98N36028 2711.52 , encontrado 2711.50.
Ejemplo 26 Preparación de H-Ile-Lys (Palmitoilo-beta-Ala-gamma-Glu-) -Pqa- Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- {NMe) Arg-Tyr- H2 1.0 Gramo de resina Boc-Ile-Lys (sal épsilon TFA) -Pqa-Arg (Pbf ) -His (Trt) -Tyr (tBu) -Leu-Asn (Trt) -Trp-Val-Thr (tBu) -Arg (Pbf ) -Gln (Trt) -NMe-Arg (Mtr) -Tyr (tBu) - norr se lavó con 5% de DIEA en DMF y se acopló con Fmoc-Glu-alfaOBu' (426.0 mg; 1.0 mmol), N- idroxibenzotriazol (150 mg, 1.11 inmoles) y ?,?'-diisopropilcarbodiimida (1.50 mL, 2.0 mmoles) durante la noche. Después de la remoción de Fmoc y lavado con DMF, Fmoc -beta-Ala (312.0 mg; 1.0 mmol), N-hidroxibenzotriazol (150 mg, 1.11 mmoles) y ?,?'-diisopropilcarbodiimida (1.50 mL , 2.0 mmoles) se añadieron y la reacción se dejó proceder durante la noche. Después de la remoción de Fmoc y lavado con DMF, N-hidroxibenzotriazol (425 mg , 3.150 mmoles), DIEA (500 uL, 3.0 m) y cloruro de palmitoilo (2.8 mL , 2.75 m) se hicieron reaccionar en 15 mL de CH2C12 durante 5 minutos y se añadieron a la resina péptida. La mezcla de reacción se agitó durante la noche y se lavó con DMF 2 veces y CH2Cl2 3 veces antes de llevar a cabo el corte con TFA, 17 mL , 400 uL de iPrSiH y 800 uL de propanotiol durante 6 horas. El producto se precipitó en 100.0 mL de Et20, se centrifugó, se lavó y se secó al vacío. El péptido crudo se purificó siguiendo el procedimiento del ejemplo 7 para dar 34 mg (7%) de polvo amorfo blanco. (ES)+-LCMS m/e calculado (cale.) Ci28Hi96N36026 2653.51 encontrado 2653.50.
Ejemplo 27 Preparación de H-Ile-Lys (16-Bromohexadecanoilo-gamma-Glu- garoma-Glu-) -Pga-Arg-His-Tyr-eu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (JWMe) Arg-Tyr-NH2 1.0 Gramo de resina Boc-Ile-Lys (sal épsilon TFA) -Pqa-Arg (Pbf) -His (Trt) -NMe-Arg (Mtr) -Tyr (tBu) -Knorr se lavó con 5% de DIEA en DMF y se acopló con Fmoc-Glu-alfaOBut (426.0 mg; 1.0 mmol) , N-hidroxibenzotriazol (150 mg, 1.11 mraoles) y ?,?' -diisopropilcarbodiimida (1.50 mL, 2.0 mmoles) durante la noche. Después déla remoción de Fmoc y lavado con DMF, Fmoc-Glu-alfaOBut (426.0 mg; 1.0 mmol), N-hidroxibenzotriazol (150 mg, 1.11 mmoles) y ?,?' -diisopropilcarbodiimida (1.50 mL, 2.0 mmoles) se añadieron y la reacción se dejó proceder durante la noche. Después de la remoción de Fmoc y lavado con DMF, N-hidroxibenzotriazol (150 mg, 1.15 mmoles), ?,?' -diisopropilcarbodiimida (1.50 mL, 2.0 mmoles) y ácido 16- bromohexadecanoico (336 mg, 1.0 mmol) se acoplaron durante la noche. Después del lavado con DMF 2 veces y CH2C12 3 veces, el corte se llevó a cabo con TFA, 17 mL, 400 uL de iPrSiH y 800 uL de propanotiol durante 6 horas. El producto se precipitó en 100.0 mL de Et20, se centrifugó, se lavó y se secó al vacío. El péptido crudo se purificó siguiendo el procedimiento del ejemplo 7 para dar 61 mg (11%) de polvo amorfo blanco. (ES+-LCMS m/e calculado (cale.) Ci3oHi97Br 36028 2789.43, encontrado 2789.41.
Ejemplo 28 Preparación de Pyro-Glu-Ile-Lys (Palmitoil-gamma-Glu-gamma- Glu-) Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (NMe) Arg- Fmoc-enlazador-resina BHA (450 mg, 0.25 mmoles) del ejemplo 1 se sometió a síntesis en fase sólida con Boc-Ile y Lys (alloc) de terminal amina en la posición para modificación de cadena lateral adecuada. Después de la desprotección catalizada con paladio como se describió en el ejemplo 8 y neutralización Fmoc-Glu-alfaOBut (426.0 mg; 1.0 mmol), N-hidroxibenzotriazol (150 mg, 1.11 mmoles) y ?,?'-diisopropilcarbodiimida (1.50 mL, 2.0 mmoles) fueron acoplados durante la noche. Después de la remoción de Fmoc y lavado con DMF, Fmoc-Glu-alfaOBut (426.0 mg; 1.0 mmol) , N-hidroxibenzotriazol (150 mg, 1.11 mmoles) y ?,?' -diisopropilcarbodiimida (1.50 mL, 2.0 mmoles) se acoplaron durante la noche. Después de la remoción de Fmoc y lavado con DMF, N-hidroxibenzotriazol (425 mg, 3.150 mmoles), DIEA. (500 uL, 3.0 m) y cloruro de palmitoilo (2.8 mL, 2.75 m) se hicieron reaccionar en 15 mL de CH2C12 durante 5 minutos y se añadieron a la resina péptida. La mezcla de reacción se agitó durante la noche y se lavó con DMF 2 veces y CH2CI2 3 veces antes de llevar a cabo el corte con TFA, 17 mL, 400 uL de iPrSiH y 800 uL de propanotiol durante 6 horas. El producto se precipitó en 100.0 mL de Et20, se centrifugó, se lavó y se secó al vacío. El péptido crudo se purificó siguiendo el procedimiento del ejemplo 7 para dar 58 mg (8.3%) de polvo amorfo blanco. (ES)+-LCMS m/e calculado (cale.) C135H203 37O302822.55, encontrado 2822.55.
Ejemplo 29 Preparación de H-Ile-Lys (2-Hexadenoilo-6Ahx) -Pga-Arg-His-Tyr- Leu-Asn- r -Va1-Thr-Arg-Gln- {NMe) Arg-Ty -NH2 1.0 Gramo de resina Boc-Ile-Lys (sal épsilon TFA)-Pqa-Arg (Pbf) -His (Trt) -Tyr (tBu) -Leu-Asn (Trt) -Trp-Val-Thr (tBu) -Arg (Pbf) -Gln (Trt) -NMe-Arg (Mtr) -Tyr (tBu) -Knorr se lavó con 55 de DIEA en DMF y se acopló con ácido Fmoc-6-aminohexanoico (355.0 mg; 1.0 mmol) , N-hidroxibenzotriazol (150 mg, 1.11 mmoles) y ?,?' -diisopropilcarbodiimida (1.50 mL, 2.0 mmoles) durante la noche . Después de la remoción de Fmoc y lavado con DMF, N-hidroxibenzotriazol (150 mg, 1.15 mmoles), ?,?'-diisopropilcarbodiimida (1.50 mL, 2.0 mmoles) y ácido 2-hexildecanoico (286 mg, 1.0 mmol) se acoplaron durante la noche. Después de lavar con DMF 2 veces y CH2C12 3 veces, el corte se llevó a cabo con TFA, 17 mL, 400 uL de iPrSiH y 800 uL de propanotiol durante 6 horas. El producto se precipitó en 100.0 mL de Et20, se centrifugó, se lavó y se secó al vacío. El péptido crudo se purificó siguiendo el procedimiento del ejemplo 7 para dar 94 mg (18%) de polvo amorfo blanco. (ES)+-LCMS m/e calculado (wcalc.) C126Hi95 35023 2566.52, encontrado 2566.51.
Ejemplo 30 Preparación de H-Ile-Lys (Eicosanoilo-6Ahx) -Pga-Arg-His- yr- Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (flMe) Arg-Tyr-NH2 1.0 Gramo de resina Boc-Ile-Lys (sal épsilon TFA) Pqa-Arg(Pbf) -His (Trt) -Tyr (tBu) -Leu-Asn (Trt) -Trp-Val-Thr (tBu) -Arg (Pbf) -Gln (Trt) -NMe-Arg (Mtr) -Tyr (tBu) -Knorr se lavó con 5% de DIEA en DMF y se acopló con ácido Fmoc-6-aminohexanoico (355.0 mg; 1.0 mmol) , N-hidroxibenzotriazol (150 mg, 1.11 mmoles) y ?,?' -diisopropilcarbodiimida (1.50 mL, 2.0 mmoles) durante la noche. Después de la remoción de Fmoc y lavado con DMF, ácido eicosanoico (315 mg, 1 mmoles) ; N-hidroxibenzotriazol (150 mg, 1.11 mmoles) y ?,?' -diisopropilcarbodiimida (1.50 mL, 2.0 mmoles) se acoplaron y se agitaron durante la noche. Después de lavar con DMF 2 veces y C¾C12 3 veces, el corte se efectuó con TEA, 17 mL, 400 uL de iPrSiH y 800 uL de propanotiol durante 6 horas. El producto se precipitó en 100.0 mL de Et20, se centrifugó, se lavó y se secó al vacío. El péptido crudo se purificó siguiendo el procedimiento del ejemplo 7 para dar 75 mg (14%) de polvo amorfo blanco. (ES)+-LOYIS m/e calculado (cale.) Ci3oH2o3N350232622.58, encontrado 2622.57.
Ejemplo 31 Preparación de H-Ile-Lys (EicoBanoilo-gamma-Glu-Gamma-Gl -) - Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (NMe) Arg-Tyr-NH2 1.0 Gramo de resina Boc-Ile-Lys (sal épsilon TFA) -Pqa-Arg(Pbf) -His(Trt) -Tyr(tBu) -Leu-Asn (Trt) -Trp-Val-Th (tBu) -Arg (Pbf) -Gln (Trt) -NMe-Arg (Mtr) -Tyr (tBu) -Knorr se lavó con 5% de DIEA en DMF y se acopló con Fmoc-Glu-alfaOBut (426.0 mg; 1.0 mmol) , N-hidroxibenzotriazol (150 mg, 1.11 mmoles) y ?,?' -diisopropilcarbodiimida (1.50 mL, 2.0 mmoles) durante la noche. Después de la remoción de Fmoc y lavado con DMF, se añadieron Fmoc-Glu-alfaOBufc (426.0 mg; 1.0 mmol), N-hidroxibenzotriazol (150 mg, 1.11 mmoles) y ?,?' -diisopropilcarbodiimida (1.50 mL , 2.0 mmoles) y la reacción se dejó proceder durante la noche. Después de la remoción de Fmoc y lavado con DMF, ácido eicosanoico (315 mg, 1 mmoles); N-hidroxibenzotriazol (150 mg , 1.11 mmoles) y ?,?' -diisopropilcarbodiimida (1.50 mL , 2.0 mmoles) se añadieron a péptido unido a resina y la mezcla se agitó durante la noche. Después de lavar con DMF 2 veces y CH2CI2 3 veces, el corte se llevó a cabo con TFA, 17 mL, 400 uL de iPrSiH y 800 uL de propanotiol durante 6 horas. El producto se precipitó en 100.0 mL de Et20, se centrifugó, se lavó y se secó al vacío. El péptido crudo se purificó siguiendo el procedimiento del ejemplo 7 para dar 66 mg (12%) de polvo amorfo blanco. (ES)+-LCMS m/e calculado (cale.) C134H2o6 36028 2767.58 , encontrado 2767.58.
Ejemplo 32 Preparación de H-Ile-Lys (Palmitoil-15-AT0PA) -Pga-Arg-His-Tyr- Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- [NMe) Arg-Tyr-NH2 Fmoc-enlazador-resina BHA (450 mg, 0.25 mmoles) del ejemplo 1 se sometió a síntesis en fase sólida con Boc-Ile y Lys (alloc) de terminal amina en posición para modificación de cadena lateral adecuada. Después de la desprotección catalizada con paladio como la descrita en el ejemplo 8 y de la neutralización, el acoplamiento con ácido Fmoc-15-amino-4, 7, 10, 13 -tetraoxapentadecnoico (488 mg; 1.0 mm) , N-hidroxibenzotriazol (150 mg, 1.11 mmoles) y ?,?'-diisopropilcarbodiimida (1.50 mL, 2.0 mmoles) se llevó a cabo durante la noche. Después de la remoción de Fmoc y lavado con DMF, N-hidroxibenzotriazol (425 mg, 3.150 mmoles), DIEA (500 uL, 3.0 m) y cloruro de palmitoilo (2.8 mL, 2.75 m) se hicieron reaccionar en 15 mL de CH2C12 durante 5 minutos y se añadieron a la resina péptida. La mezcla de reacción se agitó durante la noche y se lavó con DMF 2 veces y C¾C12 3 veces antes de llevar a cabo el corte con TFA, 17 mL, 400 uL de iPrSiH y 800 uL de propanotiol durante 6 horas. El producto se precipitó en 100.0 mL de Et20, se centrifugó, se lavó y se secó al vacío. El péptido crudo se purificó siguiendo el procedimiento del ejemplo 7 para dar 95 mg (14%) de polvo amorfo blanco. (ES)+-LCMS m/e calculado (cale.) Ci3iH205 35O27 2700.57, encontrado 2700.56.
Ejemplo 33 Preparación de H-Ile-Lya (Eicosanoilo-15-?????) -Pqa-Arg-His- Tyr-Leu-Asn-Trp-val-Thr-Arg-Gln- {NMe) Arg-Tyr-NH2 Fmoc-enlazador-resina BHA (450 mg, 0.25 mmoles) del ejemplo 1 se sometió a síntesis en fase sólida con Boc-Ile y Lys (alloc) amina terminal en posición para modificación de cadena lateral adecuada. Después de la desprotección catalizada con paladio como la descrita en el ejemplo 8 y la neutralización, se llevó a cabo durante la noche el acoplamiento con ácido Fmoc-15-amino-4 , 7 , 10 , 13 -tetraoxapentadecanoico (488 mg; 1.0 mmol) , N- hidroxibenzotriazol (150 mg, 1.11 mmoles) Y ?,?'-diisopropilcarbodiimida (1.50 mL, 2.0 mmoles) . Después de la remoción de Fmoc y lavado con DMF, ácido eicosanoico (315 mg, 1 mmoles); N-hidroxibenzotriazol (150 mg, 1.11 mmoles) y ?,?'-diisopropilcarbodiimida (1.50 mL, 2.0 mmoles) se acoplaron y se agitaron durante la noche. Después del lavado con DMF 2 veces y CH2C12 3 veces, el corte se llevó a cabo con TFA, 17 mL, 400 uL de iPrSiH y 800 uL de propanotiol durante 6 horas. El producto se precipitó en 100.0 mL de Et20, se centrifugó, se lavó y se secó al vacío. El péptido crudo se purificó siguiendo el procedimiento del ejemplo 7 para dar 140 mg (20%) de polvo amorfo blanco. (ES)+-LC S m/e calculado (cale. C135H213N35O272756.64, encontrado 2756.62.
Ejemplo 34 Preparación de H-Ile-Lys (Palmifcoilo-12-ATODA) -Pq-a-Arg-His- Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (NMe) Arg-Tyr-N¾ Fmoc-enlazador-resina BHA (450 mg, 0.25 mmoles) del ejemplo 1 se sometió a síntesis en fase sólida con Boc-Ile y Lys (alloc) amino terminal en posición para modificación de la cadena lateral adecuada. Después de desprotección catalizada con paladio como la descrita en el ejemplo 8 y neutralización, el acoplamiento con ácido Fmoc-12-amino-4, 7, 10-trioxadodecanoico (488.0 mg; 1.0 mmol) , N-hidroxibenzotriazol (150 mg, 1.11 mmoles) y ?,?' -diisopropilcarbodiimida (1.50 mL, 2.0 mmoles) se llevó a cabo durante la noche. Después de la remoción de Fraoc y lavado con DMF, N-hidroxibenzotriazol (425 mg, 3.150 mmoles), DIFA (500 uL, 3.0 m) y cloruro de palmitoilo (2.8 mL, 2.75 m) se hicieron reaccionar en 15 mL de CH2C12 durante 5 minutos y se añadieron a la resina péptida. La mezcla de reacción se agitó durante la noche y se lavó con DMF 2 veces y CH2CI23 veces antes de llevar a cabo el corte con TFA, 17 mL, 400 uL de iPrSiH y 800 uL de propanotiol durante 6 horas. El producto se precipitó en 100.0 mL de Et20, se centrifugó, se lavó y se secó al vacío. El péptido crudo se purificó siguiendo el procedimiento del ejemplo 7 para dar 134 mg (20%) de polvo amorfo blanco. (ES)+-LCMS m/e calculado (cale.) ?p^???^?^ 2656.55, encontrado 2656.54.
E emplo 35 Preparación de H-Ile-Lys (Eicosanoilo-12-ATODA) -Pga-Arg-His- Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- {NMe) Arg-Tyr-NH2 Fmoc-enlazador-resina BHA (450 mmoles) del ejemplo 1 se sometió a síntesis en fase sólida con Boc-Ile y Lys(alloc) amino terminal en posición para modificación de cadena lateral adecuada. Después de la desprotección catalizada con paladio como la descrita en el ejemplo 8 y neutralización, el acoplamiento con ácido Fmoc-12-amino-4 , 7 , 10 - trioxadodecanoico (488.0 mg ; 1.0 mmol), N-hidroxibenzotriazol (150 mg , 1.11 mmoles) y ?,?'-diisopropilcarbodiimida (1.50 mL , 2.0 mmoles) se llevó a cabo durante la noche. Después de la remoción de Fmoc y lavado con DMF , se acoplaron ácido eicosanoico (315 mg, 1 mmoles) ; N-hidroxibenzotriazol (150 mg, 1.11 mmoles) y N, N' -diisopropilcarbodiimida (1.50 mL, 2.0 mmoles) y se agitaron durante la noche. Después del lavado con DMF 2 veces y CH2C12 3 veces, el corte se llevó a cabo con TFA, 17 mL, 400 uL de iPrSiH y 800 uL de propanotiol durante 6 horas. El producto se precipitó en 100.0 mL de Et20, se centrifugó, se lavó y se secó al vacío. El péptido crudo se purificó siguiendo el procedimiento del ejemplo 7 para dar 128 mg (19%) de polvo amorfo blanco. (ES)+-LCMS m/e calculado (cale.) C3.33 H2 0 9N3 5 O 2 6 2712.61, encontrado 2712.59.
Ejemplo 36 Preparación de H-Ile-Lys (Palmitoilo-8-AD0SA) -Pga-Arg-His-Tyr- Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- {NMe) Arg-Tyr- H2 Fmoc-enlazador-resina BHA (450 mg, 0.25 mmoles) del ejemplo 1 se sometió a síntesis en fase sólida con Boc-Ile y Lys(alloc) amino terminal en posición para modificación de cadena lateral adecuada. Después de la desprotección catalizada con paladio y neutralización, el acoplamiento con ácido Fmoc- (8-amino-3 , 6-dioxa-octil) succínico (488.0 mg; 1.0 mmol) , N-hidroxibenzotriazol (150 mg, 1.11 mmoles) y ?,?'-diisopropilcarbodiimida (1.50 mL, 2.0 mmoles) se llevó a cabo durante la noche . Después de la remoción de Fmoc y lavado con DMF, N-hidroxibenzotriazol (425 mg, 3.150 mmoles), DIEA (500 uL, 3.0 m) y cloruro de palmitoilo (2.8 mL, 2.75 m) se hicieron reaccionar en 15 mL de CH2C12 durante 5 minutos y se añadieron a la resina péptida. La mezcla de reacción se agitó durante la noche y se lavó con DMF 2 veces y CH2C12 3 veces antes de llevar a cabo el corte con TFA, 17 mL, 400 uL de iPrSiH y 800 uL de propanotiol durante 6 horas. El producto se precipitó en 100.0 mL de Et20, se centrifugó, se lavó y se secó al vacío. El péptido crudo se purificó siguiendo el procedimiento del ejemplo 7 para dar 114 mg (17%) de polvo amorfo blanco. (ES)+-LCMS m/e calculado (cale.) C130H202 36026 2683.56 encontrado 2683.55.
Ejemplo 37 Preparación de H-Ile-Lys (Eicosanoil-8-ADOSA) -Pga-Arg-HiB-Tyr- Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (NMe) Arg-Tyr-NH2 Fmoc-enlazador-resina BHA (450 mg, 0.25 mmoles) del ejemplo 1 se sometió a síntesis en fase sólida con Boc-Ile y Lys (alloc) amino terminal en posición para modificación de cadena lateral adecuada. Después de la desprotección con paladio y neutralización, el acoplamiento con ácido Fmoc-N- (8-amino-3, 6-dioxa-octil) succinámico (488.0 mg; 1.0 mmol) , N-hidroxibenzotriazol (150 mg, 1.11 mmoles) y ?,?' -diisopropilcarbodiimida (1.50 mL, 2.0 mmoles) se llevó a cabo durante la noche. Después de la remoción de Fmoc y lavado con DMF, ácido eicosanoico (315 mg, 1 mmoles) ; N-hidroxibenzotriazol (150 mg, 1.11 mmoles) y ?,?'- diisopropilcarbodiimida (1.50 mL, 2.0 mmoles) fueron acoplados y agitados durante la noche . Después de lavar con DFM 2 veces y CH2C12 3 veces, el corte se efectuó con TFA, 17 mL, 400 uL de iPrSiH y 800 uL de propanotiol durante 6 horas. El producto se precipitó en 100.00 mL de Et20, se centrifugó, se lavó y se secó al vacío. El péptido crudo se purificó siguiendo el procedimiento en el ejemplo 7 para dar 100 mg (16%) de polvo amorfo blanco. (ES)+-LCMS m/e calculado (cale.) C134H2io 36026 2739.62, encontrado 2739.60.
Ejemplo 38 Preparación de H-Ile-Lys (Palmitoil-5-A0PSA) -Pga-Arg-His-Tyr- Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (NMe) Arg-Tyr- H2 Fmoc-enlazador-resina BHA (450 mg, 0.25 mmoles) del ejemplo 1 se sometió a síntesis en fase sólida con Boc-Ile y Lys (alloc) amino terminal en posición para modificación de cadena lateral adecuada. Después de la desprotección catalizada con paladio como la descrita en el ejemplo 8 neutralización, el acoplamiento se llevó a cabo con ácido N- Fmoc- (5-amino-3-oxa-pentil) succinámico (427.0 mg; 1.0 mmol) , N-hidroxibenzotriazol (150 mg, 1.11 mmoles) ? ?,?'-diisopropilcarbodiimida (1.50 mL, 2.0 mmoles) durante la noche. Después de la remoción de Fmoc y lavado con DMF, N-hidroxibenzotriazol (425 mg, 3.150 mmoles), DIEA (500 uL, 3.0 m) y cloruro de palmitoilo (2.8 mL, 2.75 m) se hicieron reaccionar en 15 mL de CH2C12 durante 5 minutos y se añadieron a la resina péptida. La mezcla de reacción se agitó durante la noche y se lavó con DFM 2 veces y CH2C12 3 veces antes de llevar a cabo el corte con TFA, 17 mL, 400 uL de iPrsSiH y 800 uL de propanotiol durante 6 horas. El producto se precipitó en 100.0 mL de Et20, se centrifugó, se lavó y se secó al vacío. El péptido crudo se purificó siguiendo el procedimiento del ejemplo 7 para dar 158 mg (24%) de polvo amorfo blanco. (ES)+-LCMS m/e calculado (cale.) Ci28H198 36025 2639.53, encontrado 2639.50.
Ejemplo 39 Preparación de H-Ile-Lys (Eicosanoil-5-AOPSA) -Pqa-Arg-His-Tyr- Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (NMe) rg-Tyr- H2 Fmoc - enl'azador - resina BHA (450 mg, 0.25 mmoles) del ejemplo 1 se sometió a síntesis en fase sólida con Boc-Ile y Lys(alloc) amino terminal en posición para modificación de cadena lateral adecuada. Después de la desprotección catalizada con paladio como la descrita en el ejemplo 8 y neutralización, el acoplamiento con ácido Fmoc- (5-amino- 3 - oxa-pent il ) succinámi co (427.0 mg; 1.0 mmol), N-hidroxibenzotriazol (150 mg , 1.11 mmoles) y ?,?'-diisopropilcarbodiimida (1.50 mL , 2.0 mmoles) se llevó a cabo durante la noche. Después de la remoción de Fmoc y lavado con DMF , se añadieron ácido eicosanoico (315 mg , 1 mol) ; N-hidroxíbenzotriazol (150 mg, 1.11 mmoles) y N, ' -diisopropilcarbodiimida (1.50 mL, 2.0 mmoles) y la mezcla se agitó durante la noche. Después de lavar con DMF 2 veces y CH2C12 3 veces, el corte se llevó a cabo con TFA, 17 mL, 400 uL de iPrSiH y 800 uL de propanotiol durante 6 horas, el producto se precipitó en 100.0 mL de Et20, se centrifugó, se lavó y se secó al vacío. El péptido crudo se purificó siguiendo el procedimiento del ejemplo 7 para dar 128 mg (19%) de polvo amorfo blanco. (ES)+-LCMS m/e calculado (cale.) C13 2H2 0 6N3 6 O 25 2695.60, encontrado 2695.59.
Ejemplo 40 Preparación de H-Ile-Lys (Palmitoil-Ser-Ser) -Pga-Arg-His-Tyr- Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- [NMe) Arg-Tyr- H2 Fmoc-enlazador-resina BHA (450 mg, 0.25 mmoles) del ejemplo 1 se sometió a síntesis en fase sólida con Boc-Ile y Lys (alloc) amino terminal en posición para modificación de cadena lateral adecuada. Después de la desprotección catalizada con paladio y neutralización, el acoplamiento Fmoc-Ser (Bufc) (384.0 mg; 1.0 mmol) , N-hidroxibenzotriazol (150 mg, 1.11 mmoles) y ?,?' -diisopropilcarbodiimida (1.50 mL, 2.0 mmoles) se llevó a cabo durante la noche. Después de la remoción de Fmoc y lavado con DMF, el péptido unido a resina se acopló de nuevo con Fmoc-Ser (Bu^ (384.0 mg; 1.0 mmol), N-hidroxibenzotriazol (150 mg, 1.11 mmoles) y ?,?'-diisopropilcarbodiimida (1.50 mL, 2.0 mmoles) durante la noche. Después de la remoción de Fmoc y lavado con DMF, N-hidroxibenzotriazol (425 mg, 3.150 mmoles), DIEA (500 uL, 3.0 m) y cloruro de palmitoilo (2.8 mL, 2.75 m) se hicieron reaccionar en 15 mL de CH2C12 durante 5 minutos y se añadieron a la resina péptida. La mezcla de reacción se agitó durante la noche y se lavó con DMF 2 veces y CH2C12 3 veces antes de llevar a cabo el corte con TFA, 17 mL, 400 uL de iPrSiH y 800 uL de propanotiol durante 6 horas. El producto se precipitó en 100.0 mL de Et20, se centrifugó, se lavó y se secó al vacío. El péptido crudo se purificó siguiendo el procedimiento del ejemplo 7 para dar 98 mg (15%) de polvo amorfo blanco. (ES)+-LCMS m/e calculado (cale.) 12sHi94 36026 2627.50, encontrado 2627.49.
Ejemplo 41 Preparación de H-Ile-Lys (Eicosanoil-Ser-Ser) -P<ja-Arg-His-Tyr- Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (NMe) Arg-Tyr-NH2 Fmoc-enlazador-resina BHA (450 mg, 0.25 mmoles) del ejemplo 1 se sometió a síntesis en fase sólida con Boc-Ile y Lys (alloc) amino terminal en posición para modificación de cadena lateral adecuada. Después de la desprotección catalizada con paladio como la descrita en el ejemplo 8 y neutralización, el acoplamiento con Fmoc-Ser(Bu11) (384.0 mg; 1.0 mmol) , N-hidroxibenzotriazol (150 mg, 1.11 mmoles) y ?,?'-diisopropilcarbodiimida (1.50 mL, 2.0 mmoles) se llevó a cabo durante la noche. Después de la remoción de Fmoc y lavado con DMF la resina se acopló de nuevo con Fmoc-Ser(Bu1) (384.0 mg; 1.0 mmol), N-hidroxibenzotriazol (150 mg, 1.11 mmoles) y ?,?'-diisopropilcarbodiimida (1.50 mL, 2.0 mmoles) durante la noche. Se acoplaron ácido eicosanoico (315 mg, 1 mol) ; N-hidroxibenzotriazol (150 mg, 1.11 mmoles) y ?,?' -diisopropilcarbodiimida (1.50 mL, 2.0 mmoles) al pép ido unido a resina durante la noche. Después de lavar con DMF 2 veces y CH2C123 veces, el corte se llevó a cabo con TFA, 17 mL, 400 uL de iPrSiH y 800 uL de propanotiol durante 6 horas. El producto se precipitó en 100.0 mL de Et20, se centrifugó, se lavó y se secó al vacío. El péptido crudo se purificó siguiendo el procedimiento del ejemplo 7 para dar 107 mg (16%) de polvo amorfo blanco. (ES)+-LCS m/e calculado (cale.) ¾3??2?2 36?262683.56, encontrado 2683.55.
Ejemplo 42 Preparación de H-Ile-Lys (Palmitoil-Thr-Thr) -Pga-arg-His-Tyr- Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (NMe) Arg-Tyr-NH2 Fmoc-enlazador-resina BHA (450 mg, 0.25 mmoles) del ejemplo 1 se sometió a síntesis en fase sólida con Boc-Ile y Lys (alloc) amino terminal en posición para modificación de cadena lateral adecuada. Después de la desprotección catalizada con paladio como la descrita en el ejemplo 8 y neutralización, el acoplamiento con Fmoc-Thr (Bu1^ (398.0 mg; 1.0 mmol) , N-hidroxibenzotriazol (150 mg, 1.11 mmoles) y ?,?' -diisopropilcarbodiimida (1.50 mL, 2.0 mmoles) se llevó a cabo durante la noche. Después de la remoción de Fraoc y lavado con DMF la resina se acopló de nuevo con Fmoc-Thr (Bu*) (398.0 mg; 1.0 mmol), N-hidroxibenzotriazol (150 mg, 1.11 mmoles) y N, N' -diisopropilcarbodiimida (1.50 mL, 2.0 mmoles) durante la noche. Después de la remoción de Fmoc y lavado con DMF, N-hidroxibenzotriazol (425 mg, 3.150 mmoles), DIEA (500 uL, 3.0 m) y cloruro de palmitoilo (2.8 mL, 2.75 m) se hicieron reaccionar en 15 mL de CH2C12 durante 5 minutos y se añadieron a la resina péptida. La mezcla de reacción se agitó durante la noche y se lavó con DMF 2 veces y CH2C12 3 veces antes de llevar a cabo el corte con TFA, 17 mL, 400 uL de iPrSiH y 800 uL de propanotiol durante 6 horas. El producto se precipitó en 100.0 mL de Et20, se centrifugó, se lavó y se secó al vacío. El péptido crudo se purificó siguiendo el procedimiento en el ejemplo 7 para dar 73 mg (11%) del polvo amorfo blanco. (ES) +-LCMS m/e calculado (cale.) Ci28H198N36026 2655.53, encontrado 2655.51.
Ejemplo 43 Preparación de H-Ile-Lys (Eicosanoilo-Thr-Thr) -Pqa-Arg-His- Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (NMe) Arg-Tyr-NH2 Fmoc-enlazador-resina BHA (450 mg, 0.25 mmoles) del ejemplo 1 se sometió a síntesis en fase' sólida con Boc-Ile y Lys (alloc) amino terminal en posición para modificación de cadena lateral adecuada. Después de la desprotección catalizada con paladio como la descrita en el ejemplo 8 y neutralización, el acoplamiento con Fmoc-Thr (Bufc) (398.0 mg; 1.0 mmol) , N-hidroxibenzotriazol (150 mg, 1.11 mmoles) y ?,?' -diisopropilcarbodiimida (1.50 mL, 2.0 mmoles) se llevó a cabo durante la noche . Después de la remoción de Fmoc y lavado con DMF la resina se acopló de nuevo con Fmoc-Thr (Bufc) (398.0 mg; 1.0 mmol), N-hidroxibenzotriazol (150 mg, 1.11 mmoles) y ?,?' -diisopropilcarbodiimida (1.50 mL, 2.0 mmoles) durante la noche. Se añadieron ácido eicosanoico (315 mg, 1 mmoles); N-hidroxibenzotriazol (150 mg, 1.11 mmoles) y ?,?'-diisopropilcarbodiimida (1.50 mL, 2.0 mmoles) y la mezcla se agitó durante la noche. Después de lavar con DMF 2 veces y CH2C12 3 veces el corte se llevó a cabo con TFA, 17 mL, 400 uL de iPrSiH y 800 uL de propanotiol durante 6 horas. El producto se precipitó en 100.0 mL de Et20, se centrifugó, se lavó y se secó al vacío. El péptido crudo se purificó siguiendo el procedimiento del ejemplo 7 para dar 69 mg (10%) de polvo amorfo blanco. (ES)+-LCMS m/e calculado (cale.) C132H206N36O26 2711.59, encontrado 2711.57.
E emplo 44 Ensayo de agonista de cAMP En este ejemplo, se usaron los siguientes materiales: placa de 384 pocilios; Tropix cAMP-Screen Kit; cAMP ELISA System (Applied Biosystems, cat . #T1505; CS 20000); Forskolin (Calbiochem cat. #344270); células; HEK293/h PY2R; medio de crecimiento: medio Eagle modificado por Dulbecco (D-MEM, Gibco) ; 10% de suero bovino fetal (FBS, Gibco) , inactivado con calor; 1% de penicilina/estreptomicina (Pen 10000 unidades/mL; Strep 10000 mg/mL, Gibco) ; 500 mg/mL de G418 (Geneticina, Gibco cat. #11811-031); y medio de plaqueo: D EM/F12 sin rojo fenol (Gibco) ; 10% de FBS (Gibco, cat. #10082-147), inactivado con calor; 1% de penicilina/estreptomicina (Gibco, cat. #15140-122); 500 mg/mL G418 (Geneticina, Gibco, cat. #11811-031) .
El primer día, el medio se descartó, y las células de monocapa se lavaron con 100 mL de PBS por matraz (T225) .
Después de decantar con PBS, se usaron 5 mL de VERSENE (Gibco, cat . #1504006) para desprender las células (5 minutos a 37°C) . El matraz se inclinó suavemente y la suspensión celular se agrupó. Cada matraz se enjuagó con 10 mL de medio de plaqueo y se centrifugó a 1, 000 rpm durante 5 min. La suspensión se agrupó y contó. La suspensión se resuspendió en medio de plaqueo a una densidad de 2.0 X 105 células/mL para HE 293/hNPY2R, 50 microlitros de células (HEK293/hNPY2R-10,000 células/pocilio) se transfirieron a la placa de 384 pocilios usando un despachador Multi-dro . Las placas se incubaron a 37°C durante la noche. El segundo día, las células fueron revisadas para 75-85% de confluencia. El medio y reactivos se dejaron llevar a la temperatura ambiente. Antes de preparar las diluciones, la solución de abastecimiento de compuesto estimulador en sulfóxido de dimetilo (DMSO, Sigma, cat # D2650) se dejó calentar a 32°C durante 5-10 min. Las diluciones se prepararon en DMEM/F12 con 0.5 de 3-isobutil-l-metilxantina (IBMX, Calbiochem, cat#410957) y 0.5 mg/mL de BSA. La concentración de DMSO final en el medio de estimulación fue de 1.1% con concentración de Forskolin de 5 uM. El medio celular fue golpeado con una inversión suave de la placa celular en una toalla de papel. 50 ]il¡ de medio de estimulación se pusieron por pocilio (cada concentración hecha en cuatro réplicas) . Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos, y las células se verificaron bajo un microscopio para toxicidad. Después de 30 minutos de tratamiento, el medio de estimulación se descartó y se añadieron 50 mL/pocillo de regulador de pH de lisis de ensayo (provisto en el kit Tropix) . Las placas se incubaron durante 45 minutos a 37°C. 20 pL del lisado se trans irieron de placas de estimulación a placas de anticuerpos pre-recubiertas (384 pocilios) del kit Tropix. Se añadieron 10 µL de conjugado AP y 20 µL de anticuerpo anti-cAMP. Las placas se incubaron a temperatura ambiente mientras se agitaba durante 1 hora. Las placas se lavaron después 5 veces con regulador de pH de lavado, 70 µL por pocilio para cada lavado. Las placas se inclinaron para secar. Se añadieron 30 pL/pocillo de CSPD/substrato Saphire-II TU/solución potenciadora y se incubaron durante 45 minutos a temperatura ambiente (agitar) . La señal para 1 seg/pocillo en un luminómetro. (VICTOR-V) fue medida.
E emplo 45 Ensayo CaFl x Células Hek-293 fueron transfectadas establemente con la quimera de proteína G Gaqi9 y el gen de resistencia a higromicina B se transfectaron además con el receptor NPY2 humano y selección de antibiótico G418. Después de la selección tanto en higromicina-B como en G418, clones individuales se ensayaron para su respuesta a PYY. Las células transfectadas se cultivaron en medio DMEM complementado con 10% de suero bovino fetal, 50 pg/mL de higromicina-B , 2 raM de glutamina, 100 U/mL de penicilina, 100 µg/mL de estreptomicina y 250 µg/mL de G418. Las células se cosecharon con tripsina-EDTA y se contaron usando un reactivo ViaCount . El volumen de suspensión de células se ajusta a 4.8xl05 células/mL con medio de crecimiento completo. Alícuotas de 25 µ?? se colocan en microplacas negras/ transparentes revestidas con poli-D lisina de 384 pocilios (Falcon) y las microplacas se ponen en una incubadora de CO2 a 37°C durante la noche. Regulador de pH de Carga (Calcium-3 Assay it, Molecular Devices) se preparó al disolver los contenidos de un vial (Express Kit) en 1 , 000 mL de Solución Salina Balanceada de Hank que contenía 20 mM de HEPES y 5 mM de probenecid. Alícuotas de 25 µ?? de colorante diluido se colocaron en las placas de células y las placas se incubaron después durante 1 hora a 37°C. Durante la incubación, los compuestos de prueba se prepararon a 3.5X la concentración deseada en HBSS (20 mM de HEPES) /0.05% de BSA/1% de DMSO y se transfirieron a una placa de 384 pocilios para usarse en FLIPR. Después de la incubación, tanto las placas de células como de compuestos se llevaron a FLIPR y 20 µ?? de los compuestos diluidos se transfirieron a las placas de células por el FLIPR. Durante el ensayo, las lecturas de fluorescencia se tomaron simultáneamente de todos los 384 pocilios de la placa de células cada 1.5 segundos. Se tomaron cinco lecturas para establecer una linea de base estable, y luego 20 µ]1? de muestra se añadieron rápidamente (30 µL/segundo) y simultáneamente a cada pocilio de la placa de células. La fluorescencia se monitoreó continuamente antes, durante y después de la adición de muestras para un tiempo transcurrido total de 100 segundos. Las respuestas (incremento en fluorescencia pico) en cada pocilio después de la adición fueron determinadas . La lectura de fluorescencia inicial de cada pocilio, antes de la estimulación de ligando, se usó como un valor de línea de base cero para los datos de ese pocilio. Las respuestas se expresan como % de respuesta máxima del control positivo.
Los compuestos de la presente invención exhibieron actividad selectiva para el receptor de neuropéptido- 2 in vitro, como lo demuestra el ensayo cAMP y el Ensayo CaFlux (FLIPR) . El resumen de los resultados in vitro, IC50 y EC50 para compuestos representativos de la invención, se ilustran en la tabla 1 a continuación.
Tabla 1 Y2R Y2R Y1R Y4R Y5R Ej. Secuencia EC50 EC50 EC50 EC50 EC50 (n ) (nM) (nM) (nM) (nM) FLIPR CAMP FLIPR FLIPR FLIPR 1 Fmoc-enlazador-resina BHA 2 Protocolo ABI 3 IKIPEAPGEDASPEELMRYYASLRHYLNLYTRQRY 0.013 0.038 356 1187 121 (PYY 3-36) 4 Ac-IK-Pqa-RHYLNWVTRQ (N-metilo) RY 0.21 0.34 >5000 >5000 >5000 5 Ac-IK(Butirilo) -Pqa-RHYLNWVTRQ (N- 0.18 0.39 >5000 31633 24896 metilo) Y 6 Ac-I (Capriloilo) -Pqa-RHYLNWVTRQ (N- 1.45 1.7 5200 2467 99894 metilo) RY 7 Ac-IK(Lauroilo) -Pqa-RHYLNWVTRQ (N- 4.7 5.4 6433 14467 12845 metilo) Y 8 Resina péptida protegida 9 IK(Lauroilo-6Ahx) -Pqa-RHYLNWVTRQ (N- 0.031 3.5 >5000 2449 3793 metil)RY 10 IK(Lauroilo-beta-Ala) -Pqa- 0.016 5.2 >5000 3507 4743 RHYLNWVTRQ (N-metilo) RY 11 IK(Lauroilo-Glu) -Pqa-RHYLNWVTRQ (N- 0.026 3.6 =¦5000 2427 3554 metilo) Y 12 IK(Mirisoilo-6Ahx) -Pqa-RHYLNWVTRQ (N- 0.14 0.16 >5000 >5000 1422 metilo) RY 13 Ac-IK (Palmitoilo) -Pqa-RHYLNWVTRQ (N- 1.31 1.2 29233 32167 9379 metilo) Y 14 IK (Palmitoilo) -Pqa-RHYLNWVTRQ (N- 0.73 1 >5000 >5000 12666 metilo)RY 15 Palmitoilo-IK-Pqa-RHYLNWVTRQ (N- 1.03 0.97 >5000 1355 >5000 metilo)RY 16 Palmitoilo-SAhx-IK-Pqa-RHYLNWVTRQ (N- 0.18 0.23 >5000 13700 544 metilo)RY 17 Palmitoilo- SAhx-IK-Pqa-RHYLNWVTRQRY 0.09 0.25 >5000 14500 27 18 IK (Palmitoilo-6A x) -Pqa-RHYLNWVTRQ (N- 0.012 0.18 >5000 >5000 1185 metilo)RY 19 IK(Palmitoilo-6Ahx) -Pqa-RHYLNWVTRQRY 0.004 0.15 >5000 >5000 45 20 IK(Palmitoilo-beta-Ala) -Pqa- 0.015 0.26 >5000 >5000 1878 RHYLNWVTRQ (N-metilo) Y 21 IK(Palmitoilo-Glu) -Pqa-RHYLNWVTRQ (N- 0.43 1 >5000 >5000 4185 metilo)RY 22 I (Palmitoilo-beta-Ala-Glu) -Pqa- 0.048 0.15 >5000 >5000 227 RHYLNWVTRQ (N-metilo) Y (70%) 23 IK(Palmitoilo-Glu-Glu) -Pqa- 0.033 0.29 >5000 >5000 459 RHYLNWVTRQ (N-metilo) RY (70%) 24 IK(Palmitoilo-gamaGl ) -Pqa- 0.039 0.21 >5000 >5000 168 RHYLNWVTRQ (N-metilo) RY (70%) 25 IK(Palmitoilo-gamGlu-gamaGlu) -Pqa- 0.08 0.22 >5000 >5000 443 RHYLNWVTRQ (N-metilo) RY (70%) 26 IK(Palmitoilo-beta-Ala-gamaGlu) -Pqa- 0.045 0.15 >5000 >5000 129 RHYLNWVTRQ (N-metilo) RY (70%) 27 I (15-Bromohexadecanoilo-gamaGlu- 0.23 0.4 >5000 >5000 2535 gamaGl ) -Pqa-RHYLNWVTRQ (N-metilo) RY 28 PyroGlu-IK (Palmitoilo-gamGlu- 0.176 0.21 >5000 >5000 2062 gamaGlu) -Pqa-RHYLNWVTRQ (N-metilo) RY 29 I (2-Hexildecanoilo-6Ahx) -Pqa- 0.361 2.8 >5000 >5000 >5000 RHYLNWVTRQ (N-metilo) RY 30 IK (Eicosanoilo-6Ahx) -Pqa- 0.96 0.14 >5000 >5000 306 RHYLNWVTRQ (N-metilo) RY (28%) 31 I (Eicosanoilo-gamaGlu-gamaGlu) -Pqa- 0.091 0.07 >5000 >5000 634 RHYLNWVTRQ (N-metilo) RY (50%) 32 IK (Palmitoilo-15-?????) -Pqa- 0.26 0.19 >5000 >5000 973 RHYLNWVTRQ (N-metilo) RY (28%) 33 IK(Eicosanoilo-15-ATOPA) -Pqa- 1.08 0.13 >5000 >5000 241 RHYLNWVTRQ (N-metilo) RY (53%) 34 IK(Palmitoilo-12-ATODA) -Pqa- 0.003 0.1 >5000 >5000 2337 RHYLNWVTRQ (N-metilo) RY (80%) 35 IK(Eicosanoilo-12-ATODA) -Pqa- 1.02 0.11 >5000 >5000 501 RHYLNWVTRQ (N-metilo) RY (65%) 35 IK(Palmitoilo-8-ADOSA) -Pqa- 0.138 0.15 >5000 >5000 481 RHYL WVTRQ (N-metilo) RY (73%) 37 IK(Eicosanoilo-8-ADOSA) -Pqa- 0.367 0.13 >5000 >5000 77.9 RHYLNWVTRQ (N-me xlo) RY (48%) 38 IK(Palmitoilo-5-APOSA) -Pqa- 0.003 0.17 >5000 >5000 644 RHYLNWVTRQ (N-metilo) Y (83%) 39 IK(Eicosannilo-5~APOSA) -Pqa- 0.073 0.21 >5000 >5000 285 RHYLNWVTRQ (N-metilo) RY (50%) 40 IK(Palmitoilo-Ser-Ser) -Pqa- 0.36 0.18 >5000 >5000 602 RHYLNWVTRQ (N-metilo) RY (85%) 41 IK (Eicosanoilo-Ser-Ser) -Pqa- 0.165 0.11 >5000 >5000 1833 RHYLNWVTRQ (N-metilo) RY (37%) 42 I (Palmitoilo-Thr-Thr) -Pqa- 0.018 0.14 >5000 >5000 193 RHYLNWVTRQ (N-metilo) RY (46%) 43 IK (Eicosanoilo-Thr-Thr) -Pqa- 0.074 0.26 >5000 >5000 243 RHYLNWVTRQ (n-metilo) RY (23%) Los compuestos de acuerdo con la fórmula (I) tienen una actividad en uno de los ensayos anteriores (Y2R EC50) , de 0.001 nM a 10 nM. Los compuestos de la formula (I) que más se prefieren tienen una actividad de 0.001 nM a 5 nM en uno de los ensayos anteriores (Y2R EC50) , de preferencia de 0.001 nM a 1 nM.
Ejemplo A Pueden fabricarse tabletas recubiertas con película que contengan los siguientes ingredientes de una manera convencional : Ingredientes : Por tableta Núcleo : Compuesto de la fórmula (I) 10 .0 mg 200 • 0 mg Celulosa microcristalina 23 .5 mg 43. 5 mg Lactosa hidratada 60 .0 mg 70. 0 mg Povidone K30 12 .5 mg 15. 0 mg Glicolato de almidón de sodio 12 .5 mg 17. 0 mg Estearato de magnesio 1.5 mg 4.5 mg (Peso de Núcleo) 120.0 mg 350.0 mg Recubrimiento de Película: Hidroxipropilmetilcelulosa 3.5 mg 7.0 mg Polietilenglicol 6000 0.8 mg 1.6 mg Talco 1.3 mg 2.6 mg Oxido de hierro (amarillo) 0.8 mg 1.6 mg Dióxido de titanio 0.8 mg 1.6 mg El ingrediente activo se tamiza y se mezcla con celulosa microcristalina y la mezcla se granula con una solución de polivinilpirrolidona en agua. El granulado se mezcla con glicolato de almidón de sodio y estearato de magnesio y se comprime para crear núcleos de 120 ó 350 mg respectivamente. Los núcleos son barnizados con una solución/suspensión acuosa del recubrimiento de película mencionado arriba.
E emplo B Se pueden fabricar cápsulas que contengan los siguientes ingredientes de una manera convencional : Ingredientes Por cápsula Compuesto de la fórmula (I) 25.0 mg Lactosa 150.0 mg Almidón de maíz 20.0 mg Talco 5.0 mg Los componentes se tamizan y se mezclan y se llenan en cápsulas tamaño 2.
Ejemplo C Soluciones para inyección pueden tener la siguiente composición : Compuesto de la fórmula (I) 3.0 mg Polietilenglicol 400 150.0 mg Acido acético cantidad suficiente hasta pH 5.0 Agua para soluciones de inyección hasta 1.0 mi El ingrediente activo se disuelve en una mezcla de polietilenglicol 400 y agua para inyección (parte) . El pH se ajusta a 5.0 con ácido acético. El volumen se ajusta a 1.0 mi mediante la adición de una cantidad residual de agua. La solución se filtra, se llena en viales usando un exceso adecuado y se esteriliza.
Ejemplo D Cápsulas de gelatina suave que contengan los siguientes ingredientes pueden elaborarse de una manera convencional : Contenidos de la cápsula Compuesto de la fórmula (I) 5.0 mg Cera amarilla 8.0 mg Aceite de frijol de soya hidrogenado 8.0 mg Aceites vegetales parcialmente hidrogenados 34.0 mg Aceite de soya 110.0 mg Peso de contenidos de cápsula 165.0 mg Cápsula de gelatina Gelatina 75.0 mg Glicerol 85% 32.0 mg arion 83 8.0 mg (materia seca) Dióxido de titanio 0.4 mg Oxido de hierro amarillo 1.1 mg El ingrediente activo se disuelve en un baño fundido caliente de los demás ingredientes y la mezcla se llena en cápsulas de gelatina suave de tamaño adecuado. Las cápsulas de gelatina suave rellenas se tratan de acuerdo con los procedimientos normales .
Ej emplo E Sobres que contengan los siguientes ingredientes pueden elaborarse de una manera convencional : Compuesto de la fórmula (I) 50.0 mg Lactosa, polvo fino 1,015.0 mg Celulosa microcristalina (AVICEL PH 102) 1,400.0 mg Carboximetilcelulosa de sodio 14.0 mg Polivinilpirrolidona K 30 10.0 mg Estearato de magnesio 10.0 mg Aditivos saborizantes 1.0 mg El ingrediente activo se mezcla con lactosa, celulosa microcristalina y carboximetilcelulosa de sodio y se granula con una mezcla de polivinilpirrolidona en agua.
El granulado se mezcla con estearato de magnesio y los aditivos saborizantes , y se rellena en sobres.
Debe entenderse que la invención no está limitada a las modalidades particulares de la invención descrita arriba, ya que variaciones de las modalidades particulares pueden hacerse y aún están dentro del alcance de las reivindicaciones anexas .
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (14)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :
1. Un agonista del receptor de neuropeptido 2 de la fórmula (I) : L' I Z' I Y-Ri-R2-X-R3-R4-R5- R6" 7-Re-R9-R"l 0~ l 1-Rl 2-Rl 3"Rl 4"NH 2 I z I L (i), caracterizado porque: L es capriioilo, lauroilo, miristoilo, palmitoilo, 16-bromohexadecanoilo, 2-hexadecanoilo o eicosanoilo; L' es capriioilo, lauroilo, miristoilo, palmitoilo, 16-bromohexadecanoilo, 2-hexadecanoilo o eicosanoilo; X es ácido (4-oxo-6-piperazin-l-il-4H-quinazolin-3-il) -acético; Y es H, una porción acilo o piro-Glu; Z es una porción separadora o está ausente; Rx es lie, Ala, (D) lie o N-metilo lie; R2 es Lys, Ala, (D)Lys, N-metilo Lys, Nle o (Lys- Gly) ; R3 es Arg, Ala, (D)Arg, N-metilo Arg o Phe; R es His, Ala, (D)His o N-metilo His; R5 es Tyr, Ala, (d)Tyr, N-metilo Tyr o Trp; Rs es Leu, Ala, (D)Leu o N-metilo Leu; R7 es Asn, Ala o (D)Asn; R8 es Leu o Trp; R9 es Val, Ala, (D)Val o N-metilo Val; Rio es Thr, Ala o N-metilo Thr; Rn es Arg, (D)Arg o N-metilo Arg; R12 es Gln o Ala; Ri3 es Arg, (D)Arg o N-metilo Arg; y Ri4 es Tyr, (D)Tyr, N-metilo Tyr, Phe o Trp; y en donde las porciones L-Z- y L'-Z'- no están ambas presentes ; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
2. El agonista del receptor de neuropéptido 2 de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la porción separadora es 6-Ahx, Ala, Glu, Ala-Glu, Glu-Glu, 15-ATOPA, 12-ATODA, 8-ADOSA, 5-AOPSA, Ser-Ser o Thr-Thr.
3. El agonista del receptor de neuropéptido 2 de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque Z está ausente.
4. El agonista del receptor de neuropéptido 2 de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque Z' está ausente.
5. El agonista del receptor de neuropéptido 2 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque tiene la fórmula (II) : L' I Z' 1 Y-lle-Lys-X-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln-CNMe Arg-Tyr-NH2 I Z I L (ID; en donde L es carpriloilo, lauroilo, mirisoilo, palmitoilo, 16-bromohexadecanoilo, 2-hexildecanoilo o eicosanoilo; L' es carpriloilo, lauroilo, mirisoilo, palmitoilo, 16-bromohexadecanoilo, 2-hexildecanoilo o eicosanoilo; X es ácido (4-oxo-6-piperazin-l-il-4H-quinazolin-3-il) -acético; Y es H, una porción acilo o piro-Glu; Z es 6-Ahx, Ala, Glu, Ala-Glu, Glu-Glu, 15-ATOPA, 12-ATODA, 8-ADOSA, 5-AOPSA, Ser-Ser, Thr-Thr o está ausente; Z' es 6-Ahx, Ala, Glu, Ala-Glu, Glu-Glu, 15-ATOPA, 12-ATODA, 8-ADOSA, 5-AOPSA, Ser-Ser, Thr-Thr o está ausente; Y en donde las porciones L-Z- y L'-Z'- no están ambas presentes .
6. El agonista del receptor de neuropép ido 2 de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque uno de Z y Z' es Ala, Glu, Ala-Glu, Glu-Glu, Ser-Ser o Thr-Thr.
7. El agonista del receptor de neuropéptido 2 de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque Z está ausente.
8. El agonista del receptor de neuropéptido 2 de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque Z' está ausente.
9. El agonista del receptor de neuropéptido 2 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste en: Ac-Ile-Lys (Butirilo) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (NMe) Arg-Tyr-N¾; Ac-Ile-Lys (Capriloilo) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (NMe) A g- yr-NH2 ; Ac-Ile-Lys (Lauroilo) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp- Val -Thr-Arg-Gln- (NMe) Arg-Tyr-NH2 ; H-Ile-Lys (Lauroilo-6-Ahx) -Pqa-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- {NMe) Arg-Tyr-NH2; H-Ile-Lys (Lauroilo-beta-Ala) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (NMe) Arg-Tyr-NH2 ; H-Ile-Lys (Lauroilo-Glu) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (NMe) Arg-Tyr-NH2 ; H-Ile-Lys (Miristoilo-6-Ahx) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (Míe) Arg-Tyr-NH2 ; Ac-Ile-Lys (Palmitoilo) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (IWe) Arg-Tyr-NH2; H-Ile-Lys (Palmitoilo) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (Míe) Arg-Tyr-NH2 ; Palmitoilo-Ile-Lys-Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (Míe) Arg-Tyr-NH2; Palmitoilo-6-Ahx~Ile-Lys-Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn~ Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (Míe) Arg-Tyr-NH2 ; Palmitoilo-6-Ahx-Ile-Lys-Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (Míe) Arg-Tyr-NH2 ; H-Ile-Lys (Palmitoilo-6-Ahx) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu- Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- ( íe) Arg-Tyr-NH2 ; H-Ile-Lys (Palmitoilo-6-Ahx) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (Míe) Arg-Tyr-NH2 ; H-Ile-Lys (Palmitoilo-beta-Ala) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (Míe) Arg-Tyr-NH2 ; H-Ile-Lys (Palmitoilo-Glu) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (Míe) Arg-Tyr-N¾; H-Ile-Lys (Palmitoilo-beta-Ala-Glu) -Pga-Arg-His-Tyr Leu-Asn- r -Val-Thr-Arg-Gln- ( íe) Arg- yr-NH2 ; H-Ile-Lys (Palmitoilo-Glu-Glu- ) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (Míe) Arg-Tyr-NH2 ; H-Ile-Lys (Palmitoilo-gamma-Glu) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Tr -Val-Thr-Arg-Gln- (Míe) Arg-Tyr-NH2 ; H-Ile-Lys (Palmitoilo-gamma-Glu-gamma-Glu- ) -Pga-Arg His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (Míe) Arg-Tyr-N¾ .
10. El agonista del receptor de neuropéptido 2 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste en: H-Ile-Lys (Palmitoilo-beta-Ala-gamma-Glu- ) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (Míe) Arg-Tyr-NH2 ; H-I1e-Lys (16-Bromohexadecanoi1o-gamma-Glu-gamma-Glu-) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (Míe)Arg-Tyr-N¾ ; Pyro-Glu-Ile-Lys (Palmitoilo-gamma-Glu-gamma-Glu- ) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (Míe) Arg-Tyr-NH2 ; H-Ile-Lys (2-hexildecanoilo-6-Ahx) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (Míe) Arg-Tyr-NH2 ; H-Ile-Lys (Eicosanoilo-6-Ahx) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (Míe) Arg-Tyr-NH2 ; H-Ile-Lys (Eicosanoilo-gamma-Glu-gamma-Glu- ) -Pga- Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (Míe) Arg-Tyr-NH2; H-Ile-Lys (Palmitoilo-15-?????) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (Míe) Arg-Tyr-NH2 ; H-Ile-Lys (Eicosanoilo-15-AT0PA) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (Míe)Arg-Tyr-NH2; H-Ile-Lys (Palmitoilo-12-AT0DA) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-T r-Arg-Gln- (Míe) Arg-Tyr-NH2 ; H-Ile-Lys (Eicosanoilo-12-ATODA) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (Míe)Arg-Tyr-NH2 ; H-Ile-Lys (Palmitoilo-8-AD0SA) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val -Thr-Arg-Gln- (NMe) Arg-Tyr-NH2 ; H-Ile-Lys (Eicosanoilo-8-ADOSA) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- [NMe) Arg-Tyr-N¾ ; H-Ile-Lys (Palmitoilo-5-AOPSA) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (NMe) Arg-Tyr-NH2 ; H-Ile-Lys (Eicosanoilo-5-AOPSA) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-T r-Arg-Gln- (NMe) Arg-Tyr-NH2 ; H-Ile-Lys (Palmitoilo-Ser-Ser) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (We) Arg-Tyr-NH2 ; H-Ile-Lys (Eicosanoilo-Ser-Ser) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu- Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (NMe) Arg-Tyr- H2 ; H-Ile-Lys (Palmitoilo-Thr-Thr) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-T r-Arg-Gln- (JWe) Arg-Tyr-NH2 ; H-Ile-Lys (Eicosanoilo-Thr-Thr) -Pga-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln- (NMe) Arg-Tyr-NH2.
11. El agonista del receptor de neuropéptido 2 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque es para usarse como una sustancia terapéuticamente activa.
12. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende el agonista del receptor de neuropéptido 2 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, y un portador terapéuticamente inerte.
13. Uso del agonista del receptor de neuropéptido 2 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la preparación de medicamentos para el tratamiento o profilaxis de obesidad, diabetes tipo 2, síndrome metabólico, resistencia a insulina y dislipidemia .
14. Un método para el tratamiento o profilaxis de obesidad, diabetes tipo 2, síndrome metabólico, resistencia a insulina o dislipidemia, caracterizado porque comprende administrar una cantidad efectiva del agonista del receptor de neuropéptido 2 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
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