MX2010012141A - Encapsulacion de agentes biologicamente activos. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona procedimientos para encapsular agentes biológicamente activos tales como proteínas en vehículos en forma de partículas tales como nanopartículas. También se proporcionan composiciones que comprenden vehículos en forma de partículas que pueden obtenerse mediante dichos procedimientos y usos de dichas composiciones en un tratamiento.

Description

ENCAPSULACION DE AGENTES BIOLOGICAMENTE ACTIVOS Antecedentes Varios fármacos tienen actividad en objetivos en el cerebro o en el ojo, para llevar los mismos hasta su objetivo tienen que pasar a través de una barrera biológica tal como la barrera he m atoen cefálica. Aunque algunas moléculas son capaces , de atravesar barreras biológicas, existen otras que no pasan por estas barreras de forma eficaz o, de hecho, de ningún modo. Muchos fármacos también son eficaces solamente cuando se administran directamente al tejido objetivo y si el fármaco no puede alcanzar este tejido objetivo, simplemente no puede actuar. Por lo tanto, muchos fármacos potencialmente potentes no son útiles clínicamente debido a su incapacidad para atravesar tales barreras biológicas.

En la técnica se han descrito varias estrategias para aumentar la penetración del fármaco a través de estas barreras biológicas.

Una estrategia ha sido alterar la función de la propia barrera. Por ejemplo, agentes osmóticos o arecolinas colinomiméticas dan como resultado la abertura, o un cambio en la permeabilidad, de la barrera hematoencefálica (Saija A y col, J Pharm. Pha. 42: 135-138 (1990)).

Otra estrategia se basa en la modificación de las propias moléculas del fármaco. Por ejemplo, las modificaciones de proteínas para intentar el pasaje a través de la barrera hematoencefálica incluyen la glicación de tales proteínas o, alternativamente, formar un profármaco. {Documento WO/2006/029845) .

Otra estrategia más es el implante de polímeros de liberación controlada que liberan el ingrediente activo de un sistema de matriz directamente al tejido nervioso. Sin embargo, esta estrategia es invasiva y requiere intervención quirúrgica si se implanta directamente en el cerebro o la médula espinal (Sable y col. patente de Estados Unidos N° 4.833.666). Esto presenta problemas con la conformidad del paciente y a menudo permite solamente el suministro localizado dentro del cerebro drenándose habitualmente el fármaco administrado muy rápidamente. {Documento WO/2006/029845).

Para superar estas limitaciones se han usado sistemas de vehículo de fármaco, sin embargo, un problema principal en el suministro de fármaco dirigido es la opsonización rápida y la captación de los vehículos inyectados por el sistema reticuloendotelial (SER), especialmente por los macrófagos en el hígado y el bazo.

Por lo tanto, sigue habiendo una necesidad de un medio eficiente y eficaz para suministrar macromoléculas tales como proteínas al cerebro y al ojo. En particular, seria deseable encontrar un procedimiento de suministro de macromoléculas a través de la barrera hematoencefálica, que conservara la actividad después de la entrada en el cerebro y que también puede proporcionar cinéticas de liberación deseables, mantener estabilidad y actividad de proteína y tener la capacidad de evadir los mecanismos de eliminación.

Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 muestra los datos de clasificación por tamaño obtenidos para una formulación de nanopartículas por dispersión dinámica de luz (DLS) que indican la presencia de nanopartículas preparadas por el procedimiento hueco en suspensión.

Fig. 1(a) Correlograma obtenido después del análisis de una suspensión de nanopartículas por dispersión dinámica de luz.

Fig. 1(b) Distribución de tamaño multimodal (datos obtenidos) de las nanopartículas representada para ilustrar la distribución de la población de partículas (número) a lo largo de un intervalo de tamaños.

Fig. 1(c) Distribución de tamaño multimodal (datos obtenidos) de las nanopartículas representada para ilustrar la distribución de la población de partículas (número) a lo largo de un intervalo de tamaños.

Fig. 1(d) Distribución de tamaño multimodal (datos obtenidos) de las nanopartículas representada para ilustrar la .distribución de la población de partículas (número) a lo largo de un intervalo de tamaños.

Figura 2. - Nanopartículas analizadas por MEB Figura 3 - Imagen de nanopartículas huecas por MET, con una imagen superpuesta de nanopartículas de PBCA sólidas para comparación.

Figura 4 - Mediciones de eficacia de encapsulación de I g G 1 monoclonal (anti-CD23).

Figura 5 - Perfil de liberación obtenido después de la degradación enzimática de partículas y análisis de la enzima liberada por ELISA.

Figura 6 - Determinación de la eficacia de encapsulación de un anticuerpo de dominio (dAb de lisozima de huevo de gallina) por el ensayo de ácido bicinconínico (ensayo de BCA) en una nanopartícula de PBCA hueca.

Figura 7. Datos de clasificación por tamaño obtenidos por DLS que indican la presencié de nanopartículas en suspensión.

Breve Descripción de la Invención En un aspecto de la presente invención se proporciona un procedimiento para encapsular agentes biológicamente activos en vehículos en forma de partículas tales como procedimientos para encapsular proteínas y/o péptidos en, o en y sobre, o con nanopartículas y un procedimiento para el suministro de proteínas y/o péptidos a través de la barrera hematoencefálica por encapsulación. en, o en y sobre, o con nanopartículas y un procedimiento para suministrar proteínas y/o péptidos al ojo por encapsulación en, o en y sobre, o con vehículos en forma de partículas.

En otra modalidad de la presente invención se proporcionan vehículos en forma de partículas que comprenden una sustancia formadora de partículas y un agente biológicamente activo tal como una proteína y/o un péptido, para el suministro de una proteína y/o un péptido de la sangre al cerebro a través de la barrera hematoencefálica o para el suministro al ojo. En otra modalidad de la invención hay composiciones de nanopartículas y su uso para tratar trastornos o enfermedades del sistema nervioso central y/o el ojo.

Descripción Detallada de la Invención La invención proporciona vehículos en forma de partículas que comprenden una sustancia formadora de partículas y un agente biológicamente activo y procedimientos para preparar dichos vehículos en forma de partículas.

En una modalidad se proporciona un vehículo en forma de partículas polimérico que comprende un agente biológicamente activo en una fase acuosa en un lumen hueco.

En otra modalidad más de la presente invención se proporciona un procedimiento para encapsular agentes biológicamente activos en vehículos en forma de partículas para suministro ocular que comprende las etapas de: a) disolver un polímero en un disolvente orgánico para formar una solución polimérica; b) añadir una solución acuosa que contiene un agente biológicamente activo a la solución polimérica para formar una emulsión primaria de gotas de fase acuosa en una fase orgánica continua; c) mezclar la emulsión primaria con un medio acuoso para formar una emulsión W/O/W; y d) permitir que la fase orgánica se evapore y obtener de este modo vehículos en forma de partículas que comprenden un lumen hueco que contienen dicho agente biológicamente activo en una fase acuosa.

En una modalidad adicional, el suministro ocular es periocular, por ejemplo, trans-escleral, subconjuntival, subtenoniana,. peribulbar, tópica, retrobulbar o se suministra al músculo recto inferior, superior o lateral. En una modalidad, el suministro ocular es trans-escleral.

El permitir que la fase orgánica se evapore puede ser pasivo o activo. Por ejemplo, la evaporación a-ctiva puede ser mediante el uso de calor.

En una modalidad de la presente invención se proporciona un procedimiento para producir las nanopartículas de la invención como se describe en este documento que comprende las etapas de: a) disolver un polímero en un disolvente orgánico para formar una solución polimérica; b) añadir una solución acuosa que contiene proteína a la solución polimérica para formar una emulsión primaria de gotas d'e fase acuosa en una fase orgánica continua; c) mezclar la emulsión primaria con un medio acuoso para formar una emulsión W/O/W; y d) dejar que la fase orgánica se evapore y obtener de este modo nanopartículas que comprenden un lumen hueco que contiene dichas proteínas en una fase acuosa.

El permitir que la fase orgánica se evapore puede ser pasivo o activo. Por ejemplo, la evaporación activa puede ser mediante el uso de calor.

En una modalidad adicional, el polímero usado en cualquiera de los procedimientos como se describen en este documento se selecciona de, pero sin limitación: poli-L-lactida (PLA), poli(lacto-co-glicolida) (PLG), poli(lactida) , poli(caprolactona), poli(hidroxibutirato) y/o copolímeros de los mismos. Los materiales formadores de partículas adecuados incluyen, pero sin limitación, poli(dienos) tales como poli(butadieno) y similares; poli(alquenos), tales como polietileno, polipropileno y similares; poli(acrílicos), tales como poli(ácido acrilico) y similares; poli(metacrílícos), tales como poli(metacrilato de metilo), poli(metacrilato de hidroxietilo), y similares; poli(éteres de vinilo); poli(alcoholes vinílicos); poli(cetonas de vinilo); poli(vinilhaluros) tales como poli(cloruro de vinilo) y similares; poli(nitrilos de vinilo), poli(ésteres de vinilo), tales como poli(acetato de vinilo) y similares; poli(piridínas de vinilo) tales como poli(2-vinilpiridina), polí(5-metil-2-vinilpiridina) y similares; poli(estirenos); poli(carbonatos); poli(ésteres); poli(ortoésteres); poli(esterarnidas); poli(anhídridos); poli(uretanos); poli(amidas); éteres de celulosa tales como metil celulosa, hidroxietil celulosa, hidroxipropil metil celulosa y similares; ésteres de celulosa tales como acetato de celulosa, ftalato de acetato de celulosa, butirato de acetato de celulosa, y similares; poli(sacáridos), proteínas, gelatina, almidón, gomas, resinas y similares. Estos materiales se pueden usar solos, como mezclas físicas (combinaciones) o como copolímeros. También poliacrilatos, polimetacrilatos, polibutilcianoacrilatos, polialquilcianoacrilatos, poliarilamidas, polionhidratos, poliortoésteres, N,N-L-lisinodiiltereftalato, polianhidratos, agentes biológicamente activos desolvatados o carbohidratos, polisacáridos, poliacroleina, poliglutaraldehídos y derivados, copolímeros y combinaciones de polímeros.

En otra modalidad de la presente invención se proporciona un procedimiento para encapsular agentes biológicamente activos produciendo vehículos en forma de partículas que comprenden las etapas de: a) disolver polibutilcianoacrilato (PBCA) en un disolvente orgánico para formar una solución polimérica; b) añadir una solución acuosa que contiene un agente biológicamente activo a la solución polimérica para formar una emulsión primaria de gotas de fase acuosa en una fase orgánica continua ; c) mezclar la emulsión primaria con un medio acuoso para formar una emulsión W/O/W; y d) dejar que la fase orgánica se evapore y obtener de este modo vehículos en forma de partículas que comprenden un lumen hueco que contiene dicho agente biológicamente activo en una fase acuosa.

El permitir que la fase orgánica se evapore puede ser pasivo o activo. Por ejemplo, la evaporación activa puede ser mediante el uso de calor.

En una modalidad adicional del procedimiento como se describe aquí, la etapa (d) además comprende la adición de polímeros formadores de gel. En otra modalidad más, el polímero formador de gel es agarosa.

En una modalidad, las nanopartículas de la presente invención comprenden agentes biológicamente activos tales como proteínas o péptidos. Tales proteínas pueden ser moléculas de unión a antígeno que, como se usan en este documento, se refieren a anticuerpos, fragmentos de anticuerpo u otras construcciones de proteína que son capaces de unirse a un objetivo. Las moléculas de unión a antígeno pueden comprender un dominio. Un "dominio" es una estructura proteica plegada que tiene estructura terciaria independiente del resto de la proteína. Generalmente, los dominios son responsables de las propiedades funcionales separadas de proteínas y, en muchos casos, se pueden añadir, eliminar o transferir a otras proteínas sin pérdida de función del resto de la proteina y/o del dominio. Un "dominio variable de anticuerpo único" es un dominio polipeptídíco plegado que comprende secuencias características de dominios variables de anticuerpos. Por lo tanto, incluye dominios variables de anticuerpos completos y dominios variables modificados, por ejemplo, en los que uno o más bucles se han sustituido por secuencias que no son características de dominios variables de anticuerpos o dominios variables de anticuerpos que se han truncado o comprenden extensiones En- o C-terminales, así como fragmentos plegados de dominios variables que conservan al menos la actividad y especificidad de unión del dominio de longitud completa.

Las moléculas de unión a antígeno pueden comprender al menos un dominio variable de inmunoglobulina, por ejemplo, tales moléculas pueden comprender un anticuerpo, un anticuerpo de dominio, Fab, Fab', F (ab')2, Fv, ScFv, diacuerpo, anticuerpo heteroconjugado. Tales moléculas de unión a antígeno pueden ser capaces de unirse a una única objetivo o pueden ser multiespecíficas, es decir, unirse a varias dianas, por ejemplo, pueden ser biespecíf icas o triespecíficas. En una modalidad, la molécula de unión a antígeno es un anticuerpo. En otra modalidad, la molécula de unión a antígeno es un anticuerpo de dominio (dAb). En otra modalidad más, la molécula de unión a antígeno puede ser una combinación de anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno tales como, por ejemplo, uno o más dAb y/o uno o más ScFv unidos a un anticuerpo monoclonal.. En otra modalidad más, la molécula de unión a antígeno puede ser una combinación de anticuerpos y péptidos. Las moléculas de unión a antígeno pueden comprender al menos un dominio de unión a no Ig tal como un domino que se une específicamente a un antígeno o epítope independientemente de una región o dominio V diferente, esto puede ser un dAb, por ejemplo, un domino variable único de inmunoglobulina humano, de camélido o tiburón o puede ser un dominio que es un derivado de un armazón seleccionado del grupo constituido por CTLA-4 (Evibody); lipocalina; moléculas derivadas de Proteína A tales como dominio Z de Proteína A (Affibody, SpA), dominio A (Avimer/Maxibody); proteínas de choque térmico tales como GroEl y GroES; transferrina (trans-body); proteína de repetición de anquirina (DARPin); aptámero de péptido; dominio de lectina de tipo C (Tetranectina); cristalina humana y ubiquitina humana (affilin); dominios PDZ; dominios de tipo Kunitz de toxina de escorpión de inhibidores de proteasa humana; y fibronectina (adnectin); que se ha sometido a ingeniería genética de proteínas para obtener la unión a un ligando diferente al ligando natural.

El CTLA-4 (Antígeno 4 asociado a Linfocitos T Citotóxicos) es un receptor de la familia CD28 expresado principalmente en células T CD4 + . Su dominio extracelular tiene un pliegue de Ig similar a dominio. Los bucles correspondientes a las CDR de anticuerpo se pueden sustituir con una secuencia heteróloga para conferir diferentes propiedades de unión. Las moléculas de CTLA-4 modificadas por ingeniería genética para tener diferentes especificidades de unión también se conocen como Evibodies. Para detalles adicionales véase Journal of Immunological Methods 248 (1-2), 31-45 (2001).

Las lipocalinas son una familia de proteínas extracelulares que transportan pequeñas moléculas hidrófobas tales como esferoides, bilinas, retinoides y lípidos. Tienen una estructura secundaria de lámina rígida con varios bucles en el extremo abierto de la estructura cónica que se pueden modificar por ingeniería genética para unirse a diferentes antígenos objetivo. Las anticalinas tienen entre 160-180 aminoácidos de tamaño y se obtienen de iipocalinas. Para detalles adicionales véase Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 (2000), el documento US7250297B1 y el documento US20070224633.

Un affibody es un armazón obtenido de la Proteína A de Staphylococcus aureus que se puede modificar por ingeniería genética para unirse a un antigeno. El domino consiste en un haz de tres hélices de aproximadamente 58 aminoácidos. Se han generado genotecas por aleatorización de restos de superficie. Para detalles adicionales véase Protein Eng. Des. Sel. 17, 455-462 (2004) y el documento EP1641818A1.

Los avimer son proteínas multidominio obtenidas de la familia de armazón de dominio A. Los dominios nativos de aproximadamente 35 aminoácidos adoptan una estructura unida por puente disulfuro definida. La diversidad se genera deshaciéndose de la variación natural mostrada por la familia de dominios A. Para detalles adicionales véase Nature Biotechnology 23(12), 1556-1561 (2005) y Expert Opinión on I nvestigational Drugs 16(6), 909-917 (junio 2007).

Una transferrina es una glucoproteína de transporte sérica monomérica. Las transferrina se pueden modificar por ingeniería genética para unirse a diferentes antígenos objetivo por inserción de secuencias peptídicas en un bucle de superficie permisivo. Los ejemplos de armazones de transferrina modificados por ingeniería genética incluyen el Trans-body. Para detalles adicionales véase J. Bíol. Chem 274, 24066-24073 (1999).

Las Proteínas de Repetición de Anquirina Diseñadas (DARPin) se obtienen de Anquirina que es una familia de proteínas que medían en la unión de proteínas integrales de membrana al citoesqueleto. Una repetición única de Anquirina es un motivo de 33 restos constituido por dos hélices y un giro. Se pueden modificar por ingeniería gen tica para unirse a diferentes antígenos objetivo aleatorizando restos en la primera hélice y un giro de cada repetición. Su interfaz de unión se puede aumentar aumentando el número de módulos (un procedimiento de maduración por afinidad). Para detalles adicionales véase J. Mol. Biol. 332, 489-503 (2003), PNAS 100(4), 1700-1705 (2003) y J. Mol. Biol. 369, 1015-1028 (2007) y el documento US20040132028A1.

La fibronectina es un armazón que se puede modificar por ingeniería genética para unirse a un antígeno. Las adnectinas consisten en una cadena principal de la secuencia natural de aminoácidos del 10° dominio de las 15 unidades de repetición de fibronectina humana de tipo III (FN3). Tres bucles en un extremo del sándwich se pueden modificar por ingeniería genética para permitir que una Adnectina 'reconozca específicamente una objetivo terapéutica de interés. Para detalles adicionales véase Protein Eng. Des. Sel. 18, 435-444 (2005), el documento US20080139791 , el documento WO2005056764 y el documento US6818418B1.

Los aptámeros de péptidos son moléculas de reconocimiento de combinación constituidas por una proteína de armazón constante, típicamente tioredoxina (TrxA) que contiene un bucle peptídico variable constreñido insertado en el sitio activo. Para detalles adicionales véase Expert Opin. Biol. Ther. 5, 783-797 (2005).

Los m icrocuerpos se obtienen de microproteínas de origen natural de 25-50 aminoácidos de longitud que contienen 3-4 puentes de cisteína - los ejemplos de microproteínas incluyen KalataBI y conotoxina y knotinas. Las microproteínas tienen un bucle que se puede modificar por ingeniería genética para incluir hasta 25 aminoácidos sin afectar al plegamiento global de la mícroproteína. Para detalles adicionales de dominios de knotina modificados por ingeniería genética, véase el documento Wo 2008098796.

Otros dominios de unión a no Ig incluyen proteínas que se han usado como un armazón para modificar por ingeniería genética diferentes propiedades de unión a antígeno objetivo que incluyen cristalina humana y ubiquitina humana (afililin), dominios de tipo kunitz de inhibidores de proteasa humana, dominios PDZ de la proteína de unión a Ras AF-6, toxinas de escorpión (charibdotoxina), dominio de lectina de tipo C (tetranectinas) y se revisan en el Capítulo 7 - Non-Antibody Scaffolds from Handbook of Therapeutic Antibodies (2007, editado por Stefan Dubel) y Protein Science 15: 14-27 (2006). Los dominios de unión a non Ig de ja presente invención se podrían obtener a partir de cualquiera de estos dominios de proteína alternativos.

En una modalidad de la invención, la molécula de unión a antígeno se une a un objetivo encontrada en el sistema, nervioso central tal como, por ejemplo, en el cerebro o la médula espinal o, por ejemplo, en tejido neuronal.

En una modalidad adicional de la invención descrita en este documento, la molécula de unión a antígeno se une específicamente a una objetivo que se conoce que está ligada a enfermedades o trastornos neurológicos tales como, por ejemplo, MAG (glucoproteína asociada a mielina), NOGO (proteína inhibidora de sobrecrecimiento de neuritas) o ß-amiloide.

Tales moléculas de unión a antígeno incluyen moléculas de unión a antígeno capaces de unirse a NOGO, por ejemplo, anticuerpos anti-NOGO. Un ejemplo de un anticuerpo anti-NOGO para el uso en la presente invención es el anticuerpo definido por la cadena pesada de las SEC ID N° 1 y la cadena ligera de la SEC ID N° 2 o un anticuerpo anti-NOGO o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende las CDR del anticuerpo indicado en las SEC ID N° 1 y 2. Se pueden encontrar detalles adicionales de este anticuerpo (H28 L16) en la solicitud PCT WO 2007068750 que se incorpora en este documento como referencia.

Tales moléculas de unión a antígeno incluyen moléculas de unión a antígeno capaces de unirse a MAG, por ejemplo, anticuerpos anti-MAG. Un ejemplo del anticuerpo anti-MAG para el uso en la presente invención es el anticuerpo definido por la región variable de cadena pesada de la SEC ID N° 11 y la región variable de cadena ligera de la SEC ID N°, 12 o un anticuerpo anti-MAG o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende las CDR del anticuerpo indicado en las SEC ID N° 1 y 2. Se pueden encontrar detalles adicionales de este anticuerpo (BvH1 CvL1) en la solicitud PCT WO 2004014953 que se incorpora en este documento como referencia.

Tales moléculas de unión a antígeno incluyen moléculas de unión a antigeno capaces de unirse a ß-amiloide, por ejemplo, anticuerpos anti-p-amiloide. Un ejemplo del anticuerpo anti-ß-amiloide para el uso en la presente invención es el anticuerpo definido por la región cadena pesada de la SEC ID N°5 y/o la cadena ligera de la SEC ID N° 6 o un anticuerpo anti-p-amiloide o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende las CDR del anticuerpo indicado en las SEC ID N° 5 y 7. Se pueden encontrar detalles adicionales de este anticuerpo (H2L1) en la solicitud PCT WO 2007113172 que se incorpora en este documento como referencia. Un anticuerpo anti-[3-amiloide alternativo, el cual es de uso en la presente invención es el anticuerpo definido por la cadena pesada de SEC ID N° 7 y/o la cadena ligera de SEC ID N° 8 o un anticuerpo ant¡- -am¡loide o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende las CDR del anticuerpo establecidas en SEC ID N° 7 y 8.

Las secuencias de CDR de tales anticuerpos se pueden determinar por el sistema de numeración de Kabat (Kabat y col; Secuences of proteins of Immunological Interest NIH, 1987), el sistema de numeración Chothia (Al-Lazikani y col.; (1997) JMB 273, 927-948), el procedimiento de definición por contacto (MacCallum R. M. y Martín A. C. R. y Thornton J. M. (1996), Journal of Molecular Biology, 262 (5), 732-745) o cualquier otro procedimiento establecido para numerar los restos en un anticuerpo y determinar las CDR conocidas por los especialista en la técnica.

En una modalidad de la invención, la proteína de unión a antígeno se une a una objetivo encontrada en el ojo tal como, por ejemplo, TNF, TNFr-1, TNFr-2, receptor-2 de TGFbeta, VEGF, NOGO, MAG, IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, IL-17, CD20, Beta amiloide, FGF-2, IGF-1, PEDF, PDGF, un factor de complemento, por ejemplo, C3, C5, CFD o CFI, sCR1 o C3.

En una modalidad de la invención, la proteína de unión a antígeno se une a VEGF. En una modalidad alternativa de la invención, la proteína de unión a antígeno se une a ß-amiloide.

En una modalidad de la presente invención, los vehículos en forma de partículas pueden ser microesferas o nanopartículas. En una modalidad de este tipo, el vehículo en forma de partículas es una nanopartícula y el agente biológicamente activo es una proteína. En otra modalidad, el vehículo en forma de partículas es una nanopartícula y el agente biológicamente activo es un péptido. En una modalidad adicional, el vehículo en forma de partículas es una nanopartícula y el agente biológicamente activo comprende una molécula de unión a antígeno, por ejemplo, un anticuerpo de dominio o anticuerpo. En otra modalidad más,, el vehículo en forma de partículas es una nanopartícula y el agente biológicamente activo comprende un dominio. En otra modalidad, el vehículo en forma de partículas es una microesfera y el agente biológicamente activo es una proteína. En una modalidad adicional, el vehículo en forma de partículas es una microesfera y el agente biológicamente activo es un péptido. En otra modalidad más, el vehículo en forma de partículas es una microesfera y el agente biológicamente activo comprende una molécula de unión a antígeno, por ejemplo, un anticuerpo de dominio o anticuerpo. En otra modalidad más, el vehículo en forma de partículas es una microesfera y el agente biológicamente activo comprende un dominio.

En una modalidad de la presente invención se proporciona una composición que comprende nanopartículas de la invención. En una modalidad adicional, al menos aproximadamente el 90% de las nanopartículas en número están dentro del intervalo de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 1000 nm cuando se miden usando técnicas de dispersión dinámica de luz. En una modalidad adicional, al menos aproximadamente el 90% de las nanopartículas en número están dentro del intervalo de aproximadamente un 1 nm a aproximadamente 400 nm , o de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 250 nm o de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 150 nm , o de aproximadamente 40 nm a aproximadamente 250 nm, o de aproximadamente 40 nm a aproximadamente 150 nm, o de aproximadamente 40 nm a aproximadamente 100 nm cuando se miden usando técnicas de dispersión dinámica de luz. En otra modalidad más de la presente invención, al menos aproximadamente el 90% de las nanopartículas en número están dentro del intervalo de aproximadamente 40 nm a aproximadamente 250 nm cuando se miden usando técnicas de dispersión dinámica de luz. En otra modalidad más de la presente invención, al menos aproximadamente el 90% de las nanopartículas en número están dentro del intervalo de aproximadamente 40 nm a aproximadamente 150 nm cuando se miden usando técnicas de dispersión dinámica de luz.

En otra modalidad más, se proporciona una composición que comprende las nanopartículas de la presente invención, donde el tamaño medio de las nanopartículas en la composición es inferior a aproximadamente 1000 nm de diámetro, por ejemplo, inferior a aproximadamente 400 nm de diámetro, por ejemplo, es inferior a aproximadamente 250 nm, por ejemplo, es inferior a aproximadamente 150 nm de diámetro cuando se mide por técnicas de dispersión de luz. En otra modalidad más, el tamaño medio de las nanopartículas en la composición es de aproximadamente 40 nm a aproximadamente 250 nm. En otra modalidad más, el tamaño medio de las nanopartículas en la composición es de•aproximadamente 40 nm a aproximadamente 150 nm.

En una modalidad de la presente invención, se proporciona una composición que comprende microesferas de acuerdo con cualquier procedimiento de la invención según presentado aquí. En una modalidad, al menos aproximadamente el 90% de las partículas en número tienen un diámetro dentro del intervalo de aproximadamente 1 µ?t? a aproximadamente 100 µ? cuando se mide usando técnicas de dispersión de luz láser de ángulo pequeño. En una modalidad adicional, al menos aproximadamente el 90% de las partículas en número están dentro del intervalo de aproximadamente 1 µ?? a aproximadamente '80 µ??, o de aproximadamente 1 µ?t? a aproximadamente 60 µp? o de aproximadamente 1 µ?? a aproximadamente 40 µG??, o de aproximadamente 1 µ?t? a aproximadamente 30 µ?? o de aproximadamente 1 µp? a aproximadamente 10 µ?? cuando se miden usando técnicas de dispersión de luz láser de ángulo pequeño.

En otra modalidad más de la presente invención, al menos aproximadamente el 90% de las microesferas en número está dentro del intervalo de aproximadamente 1 µ?? a aproximadamente 60 µ?? cuando se miden usando técnicas de dispersión de luz láser de ángulo pequeño. En otra modalidad más de la presente invención, al menos aproximadamente el 90% de las microesferas en número están dentro del intervalo de aproximadamente 1 µ?? a aproximadamente 30 µ?t? cuando se miden usando técnicas de dispersión de luz láser de ángulo pequeño.

En otra modalidad más se proporciona una composición que comprende las microesferas de la presente invención, donde el tamaño medio de las microesferas en la composición es inferior a aproximadamente 100 µ?t? de diámetro, por ejemplo, es inferior a aproximadamente 80 µ?? de diámetro, por ejemplo, es inferior a aproximadamente 60 µ?t? de diámetro, por ejemplo, es inferior a aproximadamente 40 µ?? de diámetro cuando se mide por técnicas de dispersión de luz láser de ángulo pequeño. En otra modalidad más, el tamaño medio de las microesferas en la composición es de aproximadamente 1 µ?? a aproximadamente 6 µ?? o de 1 µp? a aproximadamente 30µ??.

En otra modalidad de la invención, los vehículos en forma de partículas continúan liberando cantidades terapéuticas de moléculas biológicas activas a lo largo de un periodo de al menos 3 meses o más, o hasta 6 meses o más o hasta 12 meses o más.

En una modalidad, la proporción p/p de proteína a polímero puede ser del 0,5% al 50%, por ejemplo, es de al menos aproximadamente el 0,5% o es al menos aproximadamente el 1% o es al menos aproximadamente el 2% o es al menos aproximadamente el 5% o es al menos aproximadamente el 7% o es al menos aproximadamente el 10% o es al menos aproximadamente el 11% o es al menos aproximadamente el 14% o es al menos aproximadamente el 20% o es al menos aproximadamente el 40% o es al menos aproximadamente el 50%. Por ejemplo, cuando la proteína es un péptido, la proporción de péptido a polímero puede ser al menos aproximadamente 11 o cuando la proteína es un anticuerpo, la proporción de anticuerpo a polímero al menos aproximadamente el 14% o cuando la proteína es un anticuerpo de dominio, la proporción de anticuerpo de dominio a polímero puede ser al menos aproximadamente el 11%.

En una modalidad de la presente invención, la eficacia de encapsulación de las partículas es al menos aproximadamente el 1% o es al menos aproximadamente el 2% o es al menos aproximadamente el 10% o es al menos aproximadamente el 20% o es al menos aproximadamente el 40% o es al menos aproximadamente el 50% o es al menos aproximadamente el 60% o es al menos aproximadamente el 70% o es al menos aproximadamente el 80% o es al menos aproximadamente el 90% o es al menos aproximadamente el 95% o es al menos aproximadamente el 97% o es al menos aproximadamente el 99%. Por ejemplo, cuando la proteína es un péptido, la eficacia de encapsulación puede ser al menos aproximadamente 60%, cuando la proteína es un anticuerpo, la eficacia de encapsulación puede ser al menos aproximadamente el 90% o cuando la proteína es un anticuerpo de dominio, la eficacia de encapsulación puede ser al menos aproximadamente el 60%.

Los ejemplos de disolventes orgánicos adecuados para el uso con los procedimientos de la invención incluyen, pero sin limitación, ésteres inmiscibles en agua tales como acetato de etilo, acetato de isopropilo, acetato de n-propilo, acetato de isobutilo, acetato de n-butilo, isobutirato de isobutilo, acetato de 2-eti I hexil o , diacetato de etilenglicol; cetonas inmiscibles en agua, tales como etil metil cetona, metil isobutil cetona, metil isoamil cetona, metil n-amilcetona, diisobutil cetona; aldehidos inmiscibles en agua tales como acetaldehído, n- butiraldehído, crotonaldehído, 2-etilhexaldehído, isobutilaldehído y propionaldehído; ésteres de éter inmiscible en agua tales como 3- etoxipropionato de etilo; hidrocarburos aromáticos inmiscibles en agua tales como xileno de tolueno y benceno; haiohidrocarburos inmiscibles en agua tales como 1 , 1 , 1 -tricloroetano; ésteres de éter de glicol inmiscibles en agua tales como acetato de monometil éter de propi leng licol , acetato de monometil éter de etilenglicol, acetato de monobutil éter de etileng licol , acetato de monobutil éter de dietilenglicol; plastificantes de ftalato inmiscibles en agua tales como ftalato de dibutilo, ftalato de dietilo, ftalato de dimetilo, ftalato de dioctilo, tereftalato de dioctilo, ftalato de butil octilo, ftalato de butil bencilo, ftalato de alquil bencilo; plastificantes inmiscibles en agua tales como adipato de dioctilo, di-2-etilhexanoato de trietilenglicol, trimelitato de trioctilo, triacetato de g I i ce r i I o , diisobutirato de glicerilo/tripropionina, 2 , 2 , 4-t r i m et i ! - 1 ,3-pentanodiol, cloruro de metileno, etilacetato o dimetilsulfóxido, tetracloruro de carbono, cloroformo, ciclohexano, 1 ,2-dicloroetano, diclorometano, dietileter, dimetil formamida, heptano, hexano y otros hidrocarburos, metil-terc-butil éter, pentano, tolueno, 2,2,4-trimetilpentano, 1-octanol y sus isómeros o alcohol bencílico.

En una modalidad de la invención, el disolvente usado en los procedimientos de la invención se seleccionará de cloruro de metileno, etilacetato o dimetilsulfóxido, tetracloruro de carbono, cloroformo, ciclohexano, 1 ,2-dicloroetano, diclorometano, dietileter, dimetil formamida, heptano, hexano y otros hidrocarburos, metil-terc-butil éter, pentano, tolueno, 2,2,4-trimetilpentano, 1-octanol y sus isómeros, alcohol bencílico.

Los vehículos en forma de partículas, las composiciones que comprenden los mismos o los procedimientos para preparar los mismos en todos los aspectos de la presente invención como se describe en este documento pueden comprender adicionalmente la adición de un tensioactivo tal como, pero sin limitación: colato sódico, poloxámero 188 (pluronic F68™ o F127), alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, polisorbato 80, dextranas, poloxámeros, poloxaminas, ésteres de ácido carboxílico de alcoholes multifuncionales, éteres alcoxilados, mono-, di- y triglicéridos alcoxilados, fenoles y difenoles alcoxilados, éteres etoxilados, ésteres etoxilados, triglicéridos etoxilados, sustancias de la serie GenapoIR™ y BaukiR™, sales metálicas de ácidos grasos, sales metálicas de ácidos carboxílicos, sales metálicas de sulfatos de alcohol y sales metálicas de sulfatos de alcoholes grasos y sales metálicas de sulfosuccinatos y mezclas de dos o más de dichas sustancias. En una modalidad adicional, el tensioactivo se selecciona de colato sódico, poloxámero 188 (pluronic F68™), alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, polisorbato 80 y dextranas.

En una modalidad de la presente invención se proporcionan vehículos en forma de partículas que comprenden agentes biológicamente activos, que se pueden obtener mediante cualquiera de los procedimientos de la invención descrita en este documento.

El agente biológicamente activo encapsulado en vehículos en forma de partículas y/o composiciones de la presente invención mantiene al menos cierta actividad biológica después de su liberación del vehículo en forma de partículas, por ejemplo, una proporción de las moléculas en la composición puede mantener al menos cierta capacidad de unirse a su objetivo cuando el agente es un agente de unión y suscita una respuesta biológica después de la liberación del agente biológicamente activo de las partículas. Tal unión se puede medir en un ensayo de unión biológica adecuado, los ejemplos de ensayos adecuados incluyen, pero sin limitación, ELISA o Biacore™. En una modalidad adicional, la composición mantiene al menos el 50% de su afinidad por la objetivo o al menos el 70% o al menos el 90% de su afinidad (Kd) por la objetivo cuando se mide en un ensayo de unión biológica después de la liberación de las partículas, por ejemplo, en una modalidad como se determina por ELISA, Biacore. En una modalidad, la composición será capaz de suscitar un efecto terapéutico en el sujeto al que se administra. La actividad biológica de las composiciones de la invención se puede medir mediante cualquier ensayo adecuado que mida la actividad de la molécula biológicamente activa encapsulada.

En una modalidad de la presente invención se proporciona un procedimiento para suministrar una proteina a través de una barrera biológica tal como la barrera hematoencefálica por encapsulacion de la proteína en una nanopartícula a un paciente. En una modalidad adicional, el paciente es un ser humano.

En una modalidad de la presente invención se proporciona un procedimiento para suministrar una proteína encapsulada en un vehículo en forma de partículas tal como una microesfera al ojo de un mamífero, por ejemplo, un ser humano.

En otra modalidad se proporciona una composición farmacéutica que comprende un agente biológicamente activo encapsulado en un vehículo en forma de partículas de la presente invención como se describe en este documento.

En una modalidad adicional se proporciona una composición farmacéutica que comprende una proteína encapsulada en las nanopartículas de la presente invención como se describe en este documento. En una modalidad adicional, se proporciona una composición farmacéutica que comprende una proteína encapsulada en microesferas para suministro ocular como se describe en este documento para tratar y/o prevenir una enfermedad del ojo.

En otra modalidad adicional, una composición de la presente invención puede ser utilizada para tratar y/o prevenir trastornos o enfermedades que involucran los vehículos en forma de partícula cruzando la barrera hematoencefálica.

En una modalidad adicional se puede usar una composición de la invención como se describe en este documento para tratar y/o prevenir trastornos o enfermedades del sistema nervioso central, por ejemplo, se puede usar para tratar y/o prevenir la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, encefalopatía espongiforme bovina, encefalitis del virus del Nilo Occidental, SIDA del sistema nervioso, lesión cerebral, lesión de médula espinal, cáncer metastásico del cerebro o esclerosis múltiple, apoplejía.

En una modalidad adicional, la composición puede comprender un anticuerpo anti-MAG para el tratamiento y/o la prevención de apoplejía o lesión neuronal.

En otra modalidad, la composición puede comprender un anticuerpo anti-NOGO para tratamiento y/o la prevención de apoplejía o lesión neuronal o, por ejemplo, para el tratamiento o la profilaxis de enfermedades neurodegenerativas tales como enfermedad de Alzheimer.

En otra modalidad, la composición puede comprender un anticuerpo anti-|3-amiloide para el tratamiento y/o la prevención de apoplejía o lesión neuronal o, por ejemplo, para el tratamiento o profilaxis de enfermedades neurodegenerativas tales como enfermedad de Alzheimer.

En una modalidad de la invención como se describe en este documento, los vehículos en forma de partículas se pueden administrar al paciente mediante inyección o infusión parenteral, administración intravenosa o intra-arterial.

En una modalidad adicional, las composiciones de la invención como se describen en este documento se pueden usar para tratar y/o prevenir trastornos o enfermedades del ojo. En una modalidad adicional se puede usar una composición de la invención como se describe en este documento para tratar y/o prevenir trastornos tales como, pero sin limitación, degeneración macular relacionada con la edad (neovascular/húmeda), retinopatía diabética, enfermedad oclusiva venosa retiniana, uveítis, neovascularización corneal o glaucoma.

En otra modalidad más, la composición se usa para tratar y/o prevenir AMD (degeneración macular relacionada con la edad), por ejemplo, AMD húmeda o AMD seca.

En otra modalidad de la presente invención se proporcionan agentes biológicamente activos encapsulados en nanopartículas y/o microesferas como se describe en este documento para el uso en medicina.

En una modalidad de la presente invención se proporciona el uso de composiciones de la invención como se describe en este documento en la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad del sistema nervioso central. En otra modalidad más se proporciona el uso de una composición de · la invención como se describe en este documento en la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de la enfermedad de Alzheimer. En otra modalidad más se proporciona el uso de una composición de la invención como se describe en este documento en la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de apoplejía o lesión neuronal.

En otra modalidad de la invención se proporciona el uso de una composición de la invención como se describe en este documento en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de enfermedades oculares tales como, por ejemplo, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de AMD.

La invención proporciona procedimientos para tratar y/o prevenir una enfermedad del sistema nervioso central usando una composición de la presente invención. En una modalidad adicional se proporciona un procedimiento para tratar la enfermedad de Alzheimer usando una composición de la presente invención. En otra modalidad más de la presente invención se proporciona un procedimiento para tratar y/o prevenir apoplejía o lesión neuronal usando una composición de la presente invención.

La invención también proporciona procedimientos para tratar y/o prevenir enfermedad ocular usando una composición de la presente invención. En una modalidad adicional se proporciona un procedimiento para tratar y/o prevenir AMD usando una composición de la presente invención.

Definiciones: Como se usa en este documento, la expresión "sustancia formadora de partículas" se usa para describir cualquier monómero y/u oligómero capaz de polimerizar o un polímero que puede formar una partícula insoluble en un entorno acuoso, por ejemplo, PBCA, PLGA. La sustancia formada de partículas será soluble en un disolvente orgánico cuando no está polimerizada.

La expresión "vehículo en forma de partículas" como se usa a lo largo de esta memoria descriptiva se usa para incluir tanto nanopartículas como microesferas. Las "microesferas" son partículas compuestas por diversos materiales naturales y sintéticos con diámetros superiores a 1 µ??, mientras que "nanopartículas" como se usa en este documento son partículas de tamaño submicrométrico tales como, por ejemplo, de 1-100 nm. En una modalidad, las expresiones vehículo en forma de partículas, nanopartículas y microesferas como se usan en este documento indican una estructura de vehículo que es biocompatible y suficientemente resistente a destrucción química y/o física por el entorno de uso de tal forma que una cantidad suficiente de las partículas permanece sustancialmente intacta después de la entrada en el cuerpo humano o animal después de la administración y durante un tiempo suficiente para ser capaz de alcanzar el órgano o tejido objetivo deseado, por ejemplo, el cerebro o el ojo.

La expresión "agente biológicamente activo" como se usa en este documento es una expresión usada para indicar que la molécula tiene que ser capaz de realizar al menos cierta actividad biológica cuando alcance su objetivo deseada. Para evitar dudas, la expresión "agente biológicamente activo" y la "molécula biológicamente activa" como se usan a lo largo de la memoria descriptiva tienen por objeto tener el mismo significado y son susceptibles de usarse de forma intercambiable.

El término "solubilización" se define como formulación de una solución, en forma de moléculas individuales en el disolvente, o formación de un sólido en suspensión líquida, en forma de agregados sólidos finos de moléculas suspendidas en el líquido. El procedimiento de solubilización también puede dar como resultado una mezcla de moléculas completamente disueltas y agregados sólidos suspendidos.

El término "proteina", como se usa a lo largo de esta memoria descriptiva para encapsulación en vehículos en forma de partículas, incluye proteínas que tienen un peso molecular de al menos 11 kDa, o al menos 12 kDa, o al menos 50 kDa, o al menos 100 kDa, o al menos 150 kDa o al menos 200 kDa. Las proteínas para encapsulacion también pueden ser de longitud considerable tal como al menos 70 aminoácidos de longitud o al menos 100 aminoácidos de longitud o al menos 150 aminoácidos de longitud o al menos 200 aminoácidos de longitud.

El término "péptido" como se usa a lo largo de esta memoria descriptiva para encapsulacion en vehículos en forma de partículas incluye secuencias más cortas de aminoácidos que tienen un peso molecular de no más de aproximadamente 10 kDa, o no más de aproximadamente 8 kDa, o no más de aproximadamente 5 kDa, o no más de aproximadamente 2 kDa o no más de aproximadamente 1 kDa 0 es inferior a 1 Kda. Los péptidos para encapsulacion tienen no más de 70 aminoácidos de longitud o tienen no más de 50 aminoácidos de longitud, o tienen no más de 40 aminoácidos de longitud o tienen no más de 20 aminoácidos de longitud o tienen una longitud inferior a 10 aminoácidos.

La expresión "peri-ocular" se refiere a administración local en posiciones que rodean el exterior del ojo e incluye, pero sin limitación: "Sub-conjuntival" - debajo de la conjuntiva - una membrana mucosa transparente que cubre el globo ocular sobre la esclerótica; "Sub-tenoniana" - debajo de la membrana de Tenon que envuelve el ojo pero fuera de la esclerótica; "peribulbar" - el espacio debajo del globo del ojo donde se asienta en la órbita; "retrobulbar" -el espacio en la parte posterior del globo del ojo, cerca del nervio óptico; "supra-coroideo" - debajo de la esclerótica pero fuera de la coroidea en el espacio supra-coroideo; "trans-escleral"- esta expresión también se puede usar para referirse a suministro a través, es decir, desde el exterior de la esclerótica.

La frase "dominio variable único de inmunoglobulina" se refiere a un dominio variable de un anticuerpo (VH, VHH, VL) que se une específicamente a un antígeno o un epítope independiente de una región V o dominio diferente. Un dominio variable único de inmunoglobulina puede estar presente en un formato (por ejemplo, homo- o hetero-multímero) con otras regiones variables diferentes o dominios variables donde las otras regiones o dominios no se requieren para la unión a antígeno por el dominio variable de inmunoglobulina único (es decir, cuando el dominio variable único de inmunoglobulina se une al antígeno independientemente de los dominios variables adicionales). Un "anticuerpo de dominio" o "dAb" . es igual que un "dominio variable único de inmunoglobulina" que es capaz de unirse a un antígeno como se usa la expresión en este documento. Un dominio variable único de inmunoglobulina puede ser un dominio variable de anticuerpo humano, pero también incluye dominios variables de anticuerpo únicos de otras especies tales como de roedores (por ejemplo, como se describe en el documento WO 00/29004, dAb de tiburón nodriza y VHH de Camélido. Los VHH de Camélido son polipéptidos de dominio variable único de inmunoglobulina que se obtienen de especies que incluyen camello, llama, alpaca, dromedario y guanaco, que producen anticuerpos de cadena pesada desprovistos de forma natural de cadenas ligeras. Tales dominios VHH se pueden humanizar de acuerdo con técnicas convencionales disponibles en la técnica y tales dominios todavía se consideran "anticuerpos de dominio" de acuerdo con la invención. Como se usa en este documento, VH incluye dominios VHH de camélido.

La expresión "molécula de unión a antígeno" como se usa en este documento se refiere a anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y otras construcciones de proteína que son capaces de unirse a un objetivo.

Un "dominio" es una estructura de proteína plegada que tiene estructura terciaria independiente del resto de la proteína. Generalmente, los dominios son responsables de propiedades funcionales separadas de proteínas y, en muchos casos, se pueden añadir, eliminar o transferir a otras proteínas sin pérdida de función del resto de la proteína y/o del dominio. Una "dominio variable de anticuerpo único" es un dominio polipeptídico plegado que comprende secuencias características de dominios variables de anticuerpo. Por lo tanto, incluye dominios variables de anticuerpos completos y dominios modificados, por ejemplo, en los que uno o más bucles se han sustituido por secuencias que no son características de dominios variables de anticuerpos o dominios variables de anticuerpos que se han truncado o que comprenden extensiones N- o C-termínales, así como fragmentos plegados de dominios variables que conservan al menos la actividad y especificidad de unión del dominio de longitud completa.

La expresión "técnicas de dispersión de luz" como se usa en este documento es un medio usado para determinar el perfil de distribución de tamaño de partículas pequeñas en solución -tales como, por ejemplo, dispersión dinámica de luz que se usa para medir nanoparticulas y dispersión de luz estática usada para medir microesferas. La expresión "dispersión dinámica de luz" (DLS) como se usa en este documento es un procedimiento que utiliza la luz dispersada por dispersiones de partículas para obtener información sobre el tamaño de las partículas. La dispersión dinámica de luz depende del hecho de que cuando en suspensión líquida, el movimiento Browniano de las partículas depende del tamaño de partículas y que el movimiento Browniano de las partículas produce fluctuaciones en la intensidad de luz dispersada por una muestra de partículas. El diámetro de partícula se obtiene analizando estas fluctuaciones mediante una función de correlación. Después se aplica la ecuación de Stokes-Einstein para conseguir el diámetro hidrodinámico medio de las partículas. Un análisis multi-exponencial puede producir una distribución de tamaño, proporcionando comprensión con respecto a la presencia de diferentes especies dentro de una muestra. La DLS está aceptada generalmente para el análisis de nanoparticulas.

La "dispersión de luz láser de ángulo pequeño" como se usa a lo largo de la memoria descriptiva se denomina en ocasiones difracción Láser. La difracción láser depende del hecho de que el ángulo de difracción es inversamente proporcional al tamaño de partícula. El procedimiento utiliza la teoría de Mié completa que resuelve completamente las ecuaciones para la interacción de luz con materia. La difracción láser se puede usar para el análisis de nanopartículas y micropartículas (de 0,02 a 2000 micrómetros de diámetro).

La expresión "barrera hematoencefálica" (BHE) como se usa en este documento es una estructura de membrana que actúa principalmente protegiendo el cerebro agentes químicos en la sangre, mientras que todavía permite una función metabólica esencial. Está compuesta por células endoteliales microvasculares cerebrales, que están empaquetadas muy estrechamente en capilares cerebrales. Esta mayor densidad restringe el pasaje de sustancias desde el torrente sanguíneo mucho más que las células endoteliales en capilares en cualquier otro lugar en el cuerpo.

A lo largo de esta memoria descriptiva, el porcentaje de carga de fármacos se define como el porcentaje de peso de fármaco por peso de material usado en la formulación de partículas (peso de polímero) p/p. % de carga de fármaco = (peso de fármaco /peso de material usado en la formulación de partículas) x 100%.

Dentro de esta memoria descriptiva se ha descrito la invención, con referencia a realizaciones, de un modo que permite que se escriba una memoria descriptiva clara y concisa. Se pretende y se debe entender que las realizaciones se pueden combinar de forma diversa o separarse sin apartarse de la invención.

Ejemplos Ejemplo 1 - Polimerización de monómero de BCA (butilcianoacrilato): Se usó una reacción de polimerización rápida en disolvente orgánico para formar el polímero: Se añadió monómero de BAC (200 µ?, Vetbond, 3 M) a 1 mi de etanol absoluto en un vaso de precipitados de 25 mi con agitación lenta. La solución resultante se mezcló cuidadosamente hasta que se inició la reacción de polimerización. La reacción de polimerización dio como resultado la formación de una dispersión sólida blanca. La mezcla de la dispersión se detuvo en cuanto la mezcla de reacción se convirtió en demasiado viscosa para agitar la misma.

Después, se dejó que el etanol en la mezcla de reacción se evaporara en la campana de humos durante al menos 1 hora. Después de la evaporación del etanol, se obtuvo una torta sólida blanco agrietada. El sólido se recogió y usó en el procedimiento de preparación de nanopartículas.

Ejemplo 2 - Preparación de nanopartículas huecas mediante el procedimiento de emulsión doble: El polímero de PBCA se disolvió en diclorometano en una concentración del 1% p/v y se usó para preparar nanopartículas de PBCA huecas mediante formación de emulsión en una emulsión doble (agua en aceite en agua, w/o/w) del siguiente modo: (i) Emulsión primaria (W/O) Fase interna (w): colato sódico al 5% (SIGMA) en agua o regulador de pH, preparado mezclando: 500 µ? de agua o regulador de pH; y 500 µ? de colato sódico (solución madre al 10% p/v).

El volumen total de la fase acuosa interna fue de 1 mi. La solución se mantuvo en hielo hasta que fue el momento de usar la misma. Cada solución se introdujo en una jeringa de insulina de 1 mi (Terumo 1 mi, BD aguja de microlanceta 19G 3,81 cm) antes del uso.

Fase (orgánica) externa (o): polímero de PBCA (p/v al 1%) en diclorometano (DCM, Fischer).

La fase orgánica (polímero de PBCA en DCM, 6 mi) se vertió en un vaso de precipitados de 10 mi (en reposo en hielo para mantener la misma fría) y se insertó la sonda del homogeneizador (Ultra-Turrax, T25, sonda de 50 mi). La solución se cubrió con parafilm (unido al vaso de precipitados y la sonda) y se homogeneizó a una velocidad de 24000 rpm usando un homogeneizador de estator de rotor (Ulltra-Turrax T25 basic).

Formación de una emulsión primaria: En cuanto el homogeneizador alcanzó la velocidad requerida, la fase acuosa interna se añadió por inyección al interior de la solución cerca de la sonda. La emulsión resultante se homogeneizó durante 2 minutos (en hielo) y después se transfirió a una jeringa de vidrio (SGE, 25 mi, impermeable a gas, adecuada para los disolventes orgánicos, P/N 009462 25MDR-LL-GT, Lote # F06-A2190, equipada con una aguja roma de 5 cm 2R2, DI de 0,7 mm) (ii) Emulsión secundaria (w/o/w) Fase interna (w/o): emulsión primaria de la etapa de homogeneización que se ha descrito anteriormente.

Fase Externa (w): colato sódico (al 1,25% p/v) en agua.

Formación de la emulsión secundaria: La emulsión única primaria (w/o) se usó para formar una emulsión doble (w/o/w) mediante adición a una fase acuosa secundaria (colato sódico al 1,25%) con homogeneización. La solución de colato sódico (al 1,25% p/v, 30 mi) se transfirió a un vaso de precipitados de 50 mi alto (que reposaba en hielo para mantener la emulsión fría) y se insertó la sonda de un homogeneizador Silverson L4RT (sonda de 1,91 centímetros, tamiz de emulsión alta). La solución se cubrió con parafilm (unido al vaso de precipitados y la sonda) y se homogeneizo a una velocidad de 8.000 rpm. La emulsión primaria se inyectó en la solución cerca de la sonda en cuanto se alcanzó la velocidad de 8.000 rpm. La emulsión resultante se homogeneizo durante 6 minutos.

La emulsión doble que se formó se transfirió a un vaso de precipitados de 50 mi bajo y se dejó que la fase orgánica se evaporara en la campana de humos con agitación constante (agitador magnético IKA, ajuste 4) durante 3 horas.

Lavado de las nanopartículas por centrifugación: Después de la retirada del disolvente orgánico, las nanopartículas que se formaron se lavaron una vez por centrifugación a 16,200 rcf y se re-suspendieron en agua (10 mi).

Ejemplo 3 - Confirmación de formación de nanopartículas por dispersión dinámica de luz La formación de nanopartículas se confirmó mediante clasificación por tamaño usando dispersión de luz cuasi eléctrica (QELS), también conocida como dispersión dinámica de luz (DLS). Las partículas se analizaron usando un analizador de tamaño de partícula de Brookhaven Instruments Corporation (BIC 90 plus) siguiendo el procedimiento convencional proporcionado por el fabricante. La suspensión de partícula se diluyó 200x en agua y se clasificó por tamaño usando parámetros de clasificación por tamaño convencionales (temperatura de 25°C, ángulo de haz láser de 90°, longitud de onda de láser de 658 nm). Las partículas se analizaron realizando 10 procedimientos de clasificación por tamaño de 1 minuto de duración cada uno.

El instrumento presentó los datos sin procesar en la forma convencional de un correlograma. Éste ilustra la función de autocorrelacíón C (t) de intensidad de luz dispersada de las partículas en diferentes intervalos de tiempo y cómo la auto-correlación disminuye con el tiempo de disminución (t). La disminución en la auto-correlación de luz dispersada depende del diámetro de partícula y es más rápida para partículas menores. El instrumento obtiene información sobre el tamaño de partícula aplicando la ecuación de Stokes-Einsteín. Esto proporciona el diámetro hidrodinámico medio de las partículas en la muestra y datos obtenidos adicionales sobre la población de partículas.

La dispersión dinámica de luz es muy sensible a la presencia de partículas grandes, que, incluso cuando representan menos del 1% de la muestra, pueden influir significativamente en las mediciones. Como resultado, el diámetro hidrodinámico medio que proporciona el instrumento, que está influido en gran por las grandes partículas en la muestra, podría variar sustancialmente. Como resultado, se pueden observar diferencias de tamaño de decenas de nanómetros entre lotes y por este motivo es importante mirar en el conjunto de datos completo que proporciona el instrumento, siendo el correlograma el más importante. Mirando en el conjunto de datos completo, es posible caracterizar de forma precisa una muestra ya que el instrumento puede detectar de forma sencilla la mayoría de partículas pequeñas que están presentes en la muestra a pesar de la presencia de pocas partículas grandes. La forma del propio correlograma proporciona una indicación muy clara de si . las partículas son pequeñas, así como sí la muestra está polidispersada. El índice basal también da una representación precisa de la calidad de los datos. Todos los datos en este documento mostraron un índice basal que no disminuyó por debajo de 5, siendo 10 el máximo para la máxima calidad posible de una lectura.

La Figura 1a muestra el correlograma (datos sin procesar) obtenido después de la clasificación por tamaño de la suspensión de partículas por QELS. El correlograma mostró claramente que una suspensión en nanopartículas se había generado mediante el procedimiento de preparación de partículas, ya que la ausencia de partículas no generaría ninguna dispersión de luz. La forma del correlograma sugirió que la suspensión era de buena calidad farmacéutica, ya que las partículas eran pequeñas y no estaban presentes grandes agregados. La clasificación por tamaño de las suspensión de nanopartículas por QELS mostró que se habían formado nanopartículas con un diámetro hidrodinámico medio de 262,6 nm (figura 1a). También se observó que la población de partículas era relativamente monodispersa, con el índice de polidispersídad, que es una medición de cómo de ancho es el intervalo de tamaños de partícula en la muestra, en 0,262 (figura 1a). Esto está por debajo del valor máximo aceptable de 0,300 para una formulación de partículas. En general, el correlograma confirmó que el procedimiento de emulsión doble había generado de forma exitosa una suspensión de buena calidad de nanopartículas de PBCA.

Los datos obtenidos (generados por el instrumento que usa la ecuación de Stokes Einstein) sugirieron que la mayoría de las partículas eran pequeñas (Figuras 1b-d). Los resultados sugieren que aproximadamente el 87,5% de la población de partículas tenia un diámetro de 138,19 nm o inferior (figura 1b). Se observó que la suspensión carecía de grandes agregados y no contenía ninguna partícula que superara 506,81 nm de diámetro, siendo la mayoría de la población de partículas significativamente inferior (figura 1c). Además, s la formulación no contenía ninguna partícula que fuera menor de 99,86 nm (figura 1d). Por lo tanto, la mayoría de las partículas tenían un diámetro entre 99,86 y 138,19 nm, un tamaño que es ideal para administración intravenosa, pero no tan pequeño que se compromete la carga del fármaco.

Figura 1. - Datos de clasificación por tamaño obtenidos por QELS que indican la presencia de nanopartículas en suspensión.

Fig. 1 (a) Correlograma obtenido después del análisis de una suspensión de nanopartículas mediante dispersión dinámica de luz. De acuerdo con los datos obtenidos, el diámetro hidrodinámico medio de las partículas fue 262,6 nm y el índice de polidispersidad 0,262. Fig. 1 (b) Distribución de tamaño multimodal (datos obtenidos) de las nanopartículas representadas para ilustrar la distribución de la población de partículas (número) a lo largo de un intervalo de tamaños. La mayoría (87,5%) de la población de partículas pareció tener un diámetro de 138,19 nm o inferior.

Fig. 1 (c) Distribución de tamaño multimodal (datos obtenidos) de las nanopartículas representada para ilustrar la distribución de la población de partículas (número) a lo largo de un intervalo de tamaños. Los datos sugieren que el 87,5% poseía un diámetro de 138,19 nm o inferior y que el 100% de la muestra de partículas poseía un diámetro de 506,81 nm o inferior. Por lo tanto, la suspensión carecía de grandes agregados y, por lo tanto, se consideró que era adecuada para administración intravenosa.

Fig. 1 (d) Distribución de tamaño multimodal (datos obtenidos) de las nanopartículas representada para ilustrar la distribución de la población de partículas (número) a lo largo de un intervalo de tamaños. Los datos sugieren que el 14,9% de la muestra de partículas posee un diámetro de 99,86 nm o inferior.

Se observó que el procedimiento proporcionaba tamaños de nanopartículas similares cuando se prepararon diferentes formulaciones de nanopartículas. El Cuadro 1 resume los tamaños de clasificación por tamaño obtenidos a partir de una serie de cuatro procedimientos de formulación diferentes: Cuadro 1 Formulación Diámetro Indice de hidrodinámico medio polidispersidad (nm) 1 259,6 0,164 5 2 437,6 0,281 3 319,2 0,303 4 320,6 0,248 Promedio 334,25 0,249 En general, se observó que el procedimiento de preparación de nanopartículas de PBCA huecas generaba suspensiones de nanopartículas que tenían el diámetro y la polidispersidad deseados.

Ejemplo 4 - Análisis de nanopartículas - confirmación de formación de nanopartículas v morfología hueca por microscopía electrónica Para confirmar que las partículas se formaron y que eran huecas se visualizaron muestras por microscopía electrónica. Las suspensiones de nanopartículas se examinaron mediante microscopía electrónica de transmisión (MET). Las nanopartículas secadas por congelación se analizaron mediante microscopía electrónica de barrido (MEB). El análisis mediante ambas técnicas de microscopía confirmó la formación de nanopartículas. La MEB mostró que se formaron nanopartículas estables. La MET confirmó que las nanopartículas eran huecas, poseyendo un núcleo acuoso rodeado por una pared polimérica de PBCA.

La Figura 2 muestra nanopartículas analizadas por MEB.

La Figura 3 muestra una imagen de nanopartículas huecas por MET, con una imagen superpuesta de nanopartículas de PBCA sólidas para comparación.

Ejemplo - 5 - Encapsulación de anticuerpo monoclonal (anti-CD23 humano) dentro de las nanopartículas de PBCA huecas Se capturó anticuerpo monoclonal (mAb anti-CD 23 humano como se describe en el documento W099/58679) dentro del núcleo acuoso de las nanopartículas mediante inclusión en la fase acuosa interna del procedimiento de homogeneización . Se usó una solución del anticuerpo para preparar la emulsión primaria (w/o), que después se homogeneizó con la fase acuosa secundaria para formar la emulsión doble (w/o/w) del siguiente modo: I (iii) Emulsión Primaria (w/o) Fase interna (w): mAb anti-CD23 como se describe en le documento W099/58679 (600 ng en colato sódico al 5% (SIGMA)), preparando mezclando: 78 µ? de solución de mAb (7,2 mg/ml) 344 µ? de H20 500 µ? de solución de colato sódico (solución madre al 10% p/v) El volumen total de la fase acuosa interna fue 1 mi. La solución se mantuvo en hielo hasta que fue el momento de usar la misma. Cada solución se introdujo en una jeringa de insulina de 1 mi (Terumo 1 mi, BD aguja de microlanceta 19G 3,81 cm) antes del uso.

Fase externa (o): polímero de PBCA (p/v al 1%) en diclorometano (Fischer).

La fase orgánica (polímero de PBCA en DMC, 6 mi) se vertió en un vaso de precipitados de 10 mi (en reposo en hielo para mantener la misma fría) y se insertó la sonda del homogeneizador (Ultra -Turrax, T25, sonda de 50 mi). La solución se cubrió con parafilm (unido al vaso de precipitados y la sonda) y se homogeneizó a una velocidad de 24.000 ipm.

Formación de una emulsión primaria: En cuanto el homogeneizador alcanzó la velocidad máxima, la fase acuosa interna se añadió por inyección al interior de la solución cerca de la sonda. La emulsión resultante se homogeneizó durante 2 minutos (en hielo) y después se transfirió a una jeringa de vidrio (SGE, 25 mi, impermeable a gas, adecuada para disolventes orgánicos, P/N 009462 25MDR-LL-GT, lote # F06 -A2190, equipada con aguja roma de 5 cm 2R2, DI de 0,7 mm). (iv) Emulsión secundaria (w/o/w) Fase interna (w/o): emulsión primaria de la etapa de homogeneización que se ha descrito anteriormente.

Fase Externa (w): colato sódico (al 1,25% p/v) en agua.

Formación de la emulsión secundaria: La emulsión primaria, única (w/o) se usó para formar una emulsión doble (w/o/w) por adición a una fase acuosa secundaria (colato sódico al 1,25% p/v) con homogeneización. La solución de colato sódico (al 1,25% p/v, 30 mi) se transfirió a un vaso de precipitados de 50 mi alto (en reposo en hielo para mantener fría la emulsión) y se insertó la sonda de un homogeneizador Silverson L4RT (sonda de 1,91 centímetros, tamiz de emulsión alta). La solución se cubrió con parafilm (unida al vaso de precipitados y la sonda) y se homogeneizó a una velocidad de 8.000 rpm. La emulsión primaria se inyectó en la solución cerca de la sonda en cuanto se alcanzó la velocidad de 8.000 rpm. La emulsión resultante se homogeneizó durante 6 minutos. La-emulsión doble que se formó se transfirió a un vaso de precipitados de 50 mi bajo y se dejó que la fase orgánica se evaporara en la campana de humos con agitación constante (agitador magnético IKA, ajuste 4) durante 3 horas.

Lavado de las nanopartículas por centrifugación: Las nanopartículas resultantes se sedimentaron por centrifugación para separar anticuerpo libre de encapsulado. Tanto el sedimento (anticuerpo capturado) como el sobrenadante (anticuerpo libre) se analizaron por un ensayo de proteína total para determinar la eficacia de encapsulación.

Se observó que la eficacia de encapsulación era del 52% cuando se usó una cantidad total de 600 ng de anticuerpo. Se observó que la eficacia de encapsulación era suficientemente elevada para permitir el suministro de cantidades potencialmente terapéuticas de anticuerpos sin superar la dosis máxima tolerada de polímero de PBCA (50 mg/kg en el ratón). Además, posteriormente fue posible preparar partículas que contenían un anticuerpo monoclonal diferente, a nt i - 1 L 13 humano que sugiere que el procedimiento se puede aplicar a cualquier biofarmacéutico soluble en agua.

La Figura 4 muestra los resultados obtenidos a partir de las mediciones de eficacia de encapsulación.

Ejemplo 6 - Liberación de anticuerpo monoclonal de las nanopartículas Además de conseguir una encapsulación eficaz de un biofarmacéutico, fue necesario demostrar que el material se podría liberar de las partículas después de la administración y que conservaba su actividad. La liberación de anticuerpo activo de las partículas se investigó inicialmente in vitro mediante degradación de las partículas seguido de detección de cualquier anticuerpo liberado por ELISA. Para liberar el anticuerpo encapsulado, las partículas se trataron con una butil esterasa (de hígado porcino, SIGMA), que se había descrito que escinde el butil éster del polímero de PBCA. Durante la reacción (solución de Ringer, pH 7,0, 37°C), se tomaron muestras en diferentes puntos de tiempo (0, 1, 2, 3, 4 y 24 h) y se analizaron para determinar la presencia de anticuerpo activo mediante ELISA.

La Figura 5 muestra el perfil de liberación obtenido después de degradación enzimática de las partículas y análisis de la enzima liberada mediante ELISA.

Ejemplo 7 - Encapsulación de anticuerpo de dominio (dAb anti-lisozima de huevo de gallina) dentro de las nanopartículas de PBCA huecas En los siguientes ejemplos se realizó el ensayo de BCA usando un equipo de BCA obtenido en Sigma (QPBCA) y realizado de acuerdo con las instrucciones. Se diluyó el dAb libre 2 veces y 10 veces para el análisis. El dAb encapsulado se diluyó 10 veces.

El anticuerpo de dominio (dAb anti-lisozima de huevo de gallina) se capturó dentro del núcleo acuoso de las nanoparticulas mediante inclusión en la fase acuosa interna del procedimiento de homogeneización. En este caso, la fase acuosa interna se preparó mezclando 0,5 mi de una solución de 20 mg/ml de dAb (10 mg de proteína) y 0,5 mi de solución de estabilizante (colato sódico, al 10% p/v). Después se prepararon las nanoparticulas mediante el procedimiento de emulsión doble como se ha descrito en el ejemplo 4. Las nanoparticulas resultantes se sedimentaron mediante centrifugación para separar anticuerpo libre de encapsulado. Tanto el sedimento (anticuerpo capturado) como el sobrenadante (anticuerpo libre) se analizaron mediante ensayo de proteína total (ensayo con ácido bicinconínico) para determinar la eficacia de encapsulación. Los resultados de los análisis se muestran en la figura 6. Se observó que la cantidad de dAb encapsulado era 6,66 mg. La cantidad de dAb libre era 4,83 mg. La eficacia de encapsulación, por lo tanto, estaba aproximadamente en el 66,6%, con la eficacia de carga en el 11,1%. Por lo tanto, fué posible encapsular de forma eficaz cantidades de miligramos de proteína en las nanoparticulas de PBCA huecas usando el procedimiento de emulsión doble.

Ejemplo 8 - Encapsulación de anticuerpo monoclonal (mAb anti-IL-13) dentro de las nanoparticulas de PBCA huecas El anticuerpo monoclonal (mAb anti-IL-13) se capturó dentro del núcleo acuoso de las nanoparticulas mediante inclusión en la fase acuosa interna del procedimiento de homogeneización. La fase acuosa interna se preparó mezclando 0,5 mi de una solución de 20 mg/ml de mAb (10 mg de proteína) y 0,5 mi de una solución de estabilizante (colato sódico, al 10 % p/v). Después, las nanoparticulas se prepararon por el procedimiento de emulsión doble como se ha descrito en el ejemplo 5. Las nanoparticulas resultantes se sedimentaron por centrifugación para separar anticuerpo libre de encapsulado. Tanto el sedimento (anticuerpo capturado) como el sobrenadante (anticuerpo libre) se analizaron por ensayo de proteína total (ensayo de ácido bicinconínico) para determinar la eficacia de encapsulación. Los resultados de los análisis se muestran en la Figura 12. Se observó que la cantidad de mAb encapsulado era 8,62 mg. La cantidad de mAb libre era 1,79 mg. La eficacia de encapsulación era de 86,2%, con la eficacia de carga del 14,4% p/p.

Lista de secuencias.

SEC ID N°. Descripción 1 Construcción humanizada de secuencia de aminoácidos de cadena pesada H28 de anticuerpo anti-NOGO 2 Construcción humanizada de secuencia de aminoácidos de cadena ligera de 2A10 L16 de anticuerpo anti-NOGO 3 Construcción de ADN humanizada de cadena pesada H28 de anticuerpo anti-NOGO 4 Construcción de ADN humanizada de cadena ligera de 2A10 L16 de anticuerpo anti-NOGO 5 Secuencia de aminoácidos de cadena pesada H2 madura (Fe mutada doble mutación negrita) de anticuerpo beta-amiloide 6 Secuencia de aminoácidos de cadena ligera madura de anticuerpo beta-amiloide 7 Secuencia de aminoácidos de cadena pesada H11 madura 8 Secuencia de aminoácidos de cadena ligera L9 madura 9 Hexapéptido dalargina 10 Secuencia de aminoácidos de DOM 15-26-593 de dAb de VEGF 11 Secuencia de aminoácidos de la región variable CvL1 de anticuerpo MAG 12 Secuencia de aminoácidos de la región variable BvH1 de anticuerpo MAG 13 ADN longitud completa de H2 de anticuerpo beta-amiloide 14 ADN de cadena ligera L1 optimizado de anticuerpo beta- amiloide 15 ADN de longitud completa L1 de anticuerpo beta-amiloide

Claims (23)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para producir un vehículo en forma de partículas que comprende las etapas de: a) disolver polibutilcianoacrilato (PBCA) en un disolvente orgánico para formar una solución polimérica; b) añadir una solución acuosa que contiene un agente biológicamente activo a la solución polimérica para formar una emulsión primaria de gotas de fase acuosa en una fase orgánica continua; c) mezclar la emulsión primaria con un medio acuoso para formar una emulsión secundaria; y d) permitir que la fase orgánica se evapore y por lo tanto obtener vehículos en forma de partículas que comprenden una luz hueca que contiene el agente biológicamente activo en una fase acuosa.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en donde la etapa (a) comprende además la adición de un agente formador de gel.

3. El procedimiento de la reivindicación 3, en donde el agente formador de gel es agarosa.

4. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las rei indicaciones 1 a 3, en donde el polímero está pegilado.

5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el vehículo en forma de partículas es una microesfera.

6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el vehículo en forma de partículas es una nanopartícula.

7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el agente biológicamente activo es una proteína o péptido.

8. El procedimiento de la reivindicación 7, en donde el agente biológicamente activo es una molécula de unión a antigeno.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, en donde el agente biológicamente activo comprende un dominio.

10. El procedimiento de la reivindicación 9, en donde el agente biológicamente activo es un anticuerpo.

11. El procedimiento de la reivindicación 9, en donde el agente biológicamente activo es un anticuerpo de dominio.

12. Un vehículo en forma de partículas que comprende un agente biológicamente activo encapsulado que puede obtenerse mediante el procedimiento de cualquier reivindicación anterior.

13. El vehículo en forma de partículas de la reivindicación 12, en donde el vehículo en forma de partículas es una nanopartícula.

14. El vehículo en forma de partículas de la reivindicación 13, en donde el agente biológicamente activo es una proteína.

15. El vehículo en forma de partículas de la reivindicación 14, en donde la proporción de proteína con respecto a polímero en la nanopartícula es de al menos aproximadamente el 5% p/p, o es de al menos aproximadamente el 10% p/p o es de al menos aproximadamente el 14% p/p.

16. El vehículo en forma de partículas de la reivindicación 13, en donde el agente biológicamente activo es un péptido.

17. El vehículo en forma de partículas de la reivindicación 16, en donde la proporción de péptido con respecto a polímero en la nanopartícula es de al menos aproximadamente el 5% p/p o es de al menos aproximadamente el 10% p/p.

18. El vehículo en forma de partículas de la reivindicación 13, en donde el agente biológicamente activo es un anticuerpo.

19. El vehículo en forma de partículas de la reivindicación 18, en donde la proporción de anticuerpo con respecto a polímero en la nanopartícula es de al menos aproximadamente el 5% p/p, o es de al menos aproximadamente el 10% p/p.

20. El vehículo en forma de partículas de la reivindicación 13, en donde el agente biológicamente activo es un dAb.

21. El vehículo en forma de partículas de la reivindicación 20, en donde la proporción de dAb con respecto a polímero en la nanopartícula es de al menos aproximadamente el 5% p/p, o es de al menos aproximadamente el 10% p/p o es de al menos aproximadamente el 14% p/p.

22. Una composición farmacéutica que comprende el vehículo en forma de partículas de una cualquiera de' las reivindicaciones 12 a 21.

23. Uso de la composición de la reivindicación 22 en el tratamiento o profilaxis de una enfermedad.