CN102083423A

CN102083423A - 生物活性剂的囊封方法

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Publication number: CN102083423A
Application number: CN2009801270058A
Authority: CN
Inventors: M·菲丹博伊卢; I·帕帕尼科劳乌
Original assignee: Glaxo Group Ltd
Current assignee: Glaxo Group Ltd
Priority date: 2008-05-06
Filing date: 2009-05-05
Publication date: 2011-06-01
Also published as: US20110059167A1; IL208666A0; EP2271324A2; MX2010012141A; ZA201007437B; JP2011519893A; BRPI0912536A2; WO2009135854A2; EA201001567A1; WO2009135854A3; AU2009245785A1

Abstract

本发明提供将生物活性剂(如蛋白)囊封在微粒载体(如纳米粒子)中的多种方法。本发明还提供包括利用这种方法可得到的微粒载体的组合物以及这些组合物在治疗中的用途。

Description

生物活性剂的囊封方法

背景技术

很多药物在大脑或眼中的靶标处具有活性，为了使这些药物到达它们的靶标，它们必须穿过生物屏障，如血脑屏障。虽然一些分子能够通过生物屏障，但是还有一些不能有效或事实上根本不能穿过这些屏障的其它分子。许多药物也仅仅当直接进入靶标组织时才有效，且如果不能到达这个靶标组织，药物实际上也不能起作用。因此，由于不能穿过这样的生物屏障，很多可能有效的药物不能在临床上使用。

现有技术中已记述了很多方法以增强药物穿透这些生物屏障的能力。

一种方法是改变屏障本身的功能。例如，渗透剂或拟胆碱药物槟榔碱类(cholinomimetic arecolines)，其能打开血脑屏障或者改变血脑屏障的穿透性(Saija A等人，J Pharm.Pha.42：135-138(1990))。

其它的方法是修饰药物分子本身。例如，修饰蛋白以试图穿过血脑屏障，包括使这些蛋白糖基化或者形成前药(WO/2006/029845)。

还有另一方法是植入可控制释放的聚合物，其从基质系统直接将活性成分释放进入神经组织。然而，如果直接植入大脑或骨髓，这种方法是浸入性的且需要外科手术介入(sable等人，美国专利4,833,666)，这存在的问题是需要病人的同意，且通常仅仅是在大脑内随给予的药物一起进行定位输送，通常很快被排出(WO/2006/029845)。

为了克服这些局限，人们使用了药物载体系统，然而，靶标的药物传输的主要问题是通过网状内皮系统(RES)尤其是通过肝和脾的巨噬细胞的注射的载体的快速调理(opsonisation)和摄取。

因此，仍然需要一种有效的方法，以将大分子(如蛋白质)输送到大脑和眼中。具体而言，需要找到一种将大分子穿过血脑屏障的方法，所述大分子在进入大脑时仍能保留活性，以及还能提供所需要的释放动力学，保持蛋白质的稳定和活性，且能够回避清除机制。

附图说明

图1所示为通过动态光散射(DLS)从纳米粒子制剂中获得的粒度数据，表明在悬液中有通过空心法制备的纳米粒子存在。

图1(a)所示为通过动态光散射对纳米粒子悬液分析之后获得的相关图。

图1(b)所示为纳米粒子的多模态粒度分布(导出数据)，绘图以说明相对于粒度范围的粒子群(数量)的分布。

图1(c)所示为所示为纳米粒子的多模态粒度分布(导出数据)，绘图以说明相对于粒度范围的粒子群(数量)的分布。

图1(d)所示为所示为纳米粒子的多模态粒度分布(导出数据)，绘图以说明相对于粒度范围的粒子群(数量)的分布。

图2所示为经SEM分析的纳米粒子。

图3所示为经TEM的空心纳米粒子的图像，以及用于比较的固态PBCA纳米粒子的叠加图像。

图4所示为单克隆IgG1(抗-CD23)的囊封效果的测量结果。

图5所示为粒子的酶降解和通过ELISA的释放的酶的分析之后得到的释放曲线。

图6所示为通过二喹啉甲酸测定(BCA测定)在空心PBCA纳米粒子中测得的域抗体(鸡蛋溶菌酶dAb)的囊封效果曲线。

图7所示为为单克隆IgG1(抗-CD23)的囊封效果的测量结果。

发明内容

在本发明的一个方面中，提供一种在微粒载体中囊封生物活性剂的方法，如在纳米粒子中，或纳米粒子中和上，或用纳米粒子囊封蛋白和/或肽的方法，和通过在纳米粒子中，或纳米粒子中和上，或用纳米粒子囊封以输送蛋白和/或肽穿过血脑屏障的方法，以及通过在微粒载体中，或微粒载体中和上，或用微粒载体囊封以将蛋白和/或肽输送到眼中的方法。

在本发明的另一实施方式中，提供一种微粒载体，其包括粒子形成物质和生物活性剂如蛋白和/或肽，以将蛋白和/或肽从血液穿过血脑屏障输送到脑或输送到眼中。在本发明的再一实施方式中，提供纳米粒子的组合物以及它们在治疗中枢神经系统和/或眼的疾病或病症中的用途。

发明详述

本发明提供一种包括粒子形成物质和生物活性剂的微粒载体，以及所述微粒载体的制备方法。

在一个实施方式中，本发明提供一种包括在空腔的水相中的生物活性剂的聚合物微粒载体。

在本发明的另一实施方式中，其提供在微粒载体中囊封生物活性剂以用于眼输送的方法，该方法包括以下步骤：

a)在有机溶剂中溶解聚合物以形成聚合物溶液；

b)将含有生物活性剂的水溶液加入到聚合物溶液中以形成在连续有机相中的水相液滴的初级乳液；

c)使初级乳液与水介质混合形成W/O/W乳液；以及

d)使有机相蒸发，并藉此得到包含空腔的微粒载体，所述空腔含有在水相中的所述生物活性剂。

在本发明的另一实施方式中，眼输送是在眼周进行的，例如经巩膜、结膜下、筋膜下、眼球周围、局部的、球后的或输送到下、上或侧直肌中。在一个实施方式中，眼输送是经巩膜输送。

可以主动或被动地使有机相蒸发。例如，主动蒸发可以通过使用加热的方式蒸发。

在本发明的另一实施方式中，其提供一种用于将蛋白输送到血脑屏障的纳米粒子的制备方法，其包括以下步骤：

a)在有机溶剂中溶解聚合物以形成聚合物溶液；

b)将含有蛋白的水溶液加入到聚合物溶液中以形成在连续有机相中的水相液滴的初级乳液；

c)使初级乳液与水介质混合形成W/O/W乳液；以及

d)使有机相蒸发，并藉此得到包含空腔的纳米粒子，所述空腔含有在水相中的所述蛋白。

在又一实施方式中，用于上述任一方法中的聚合物选自但不限于以下物质：聚-L-交酯(PLA)、聚(丙交酯-乙交酯)共聚物(PLG)、聚交酯、聚己酸内酯、聚羟基丁酸酯和/或其共聚物。合适的粒子形成物质包括但不限于：聚二烯烃如聚丁二烯等；聚烯烃如聚乙烯、聚丙烯等；聚丙烯酸类如聚丙烯酸等；聚甲基丙烯酸类如聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸羟乙酯等；聚乙烯醚类、聚乙烯醇类、聚乙烯酮类、聚乙烯基卤化物如聚氯乙烯等；聚乙烯腈类；聚乙烯酯类如聚乙酸乙烯酯、聚乙烯吡啶如聚(2-乙烯基-吡啶)、聚(5-甲基-2-乙烯吡啶)等；聚苯乙烯类；聚碳酸酯类；聚酯类；聚原酸酯；聚酯酰胺(polyesterarnides)；聚酸酐类；聚氨酯类；聚酰胺类；纤维素醚类如甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素等；纤维素酯类如醋酸纤维素、邻苯二甲酸醋酸纤维素、醋酸丁酸纤维素等；多糖、蛋白质、凝胶、淀粉、胶、树脂等等。这些材料可单独使用，作为物理混合物(共混物)或作为共聚物。还共混聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丁基氰基丙烯酸酯、聚烷基氰基丙烯酸酯、聚芳基酰胺、聚酸酐、聚原酸酯、N，N-L-赖氨酸二基对苯二甲酸酯、聚酸酐、去溶剂化的生物活性剂或碳水化合物、多糖、聚丙烯醛、聚戊二醛及其衍生物、共聚物和聚合物。

在本发明的另一实施方式中，其提供一种通过制备微粒载体以囊封生物活性剂的方法，包括以下步骤：

a)在有机溶剂中溶解聚氰基丙烯酸丁酯(PBCA)以形成聚合物溶液；

c)使初级乳液与水介质混合形成W/O/W乳液；以及

d)使有机相蒸发，并藉此得到包含空腔的粒子载体，所述空腔含有在水相中的所述生物活性剂。

在本文所述的方法的又一实施方式中，步骤(d)还包括加入形成凝胶的聚合物。在再一实施方式中，形成凝胶的聚合物是琼脂糖。

在一个实施方式中，本发明的微粒载体包含生物活性剂如蛋白或肽。所述蛋白可以是抗原结合分子，本文中使用的抗原结合分子是指抗体、抗体片段和能够结合靶标的其它蛋白结构。

抗原结合分子可包括域(domain)。“域”是折叠的蛋白结构，具有独立于余下的蛋白的三级结构。

一般地，域负责蛋白的离散的功能特性，在很多的情况下可加入、移除或转移到其它的蛋白上，而不会损失该蛋白和/或域的余下部分的功能。“单抗体可变域”是折叠的多肽域，其包括抗体可变域的序列特征。因此，它包括完整的抗体可变域和修饰的可变域，例如，其中的一个或多个环已经被非特征性的抗体可变域的序列取代，或者被截短或包括N或C末端延伸部分的抗体可变域取代，以及被可变域的折叠片段取代，所述折叠片段至少保留全长域的结合活性和特异性。

抗原结合分子可包括至少一个免疫球蛋白可变域，例如，这些分子可包括抗体、域抗体、Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、ScFv、双特异抗体、异源结合抗体。这些抗原结合分子能结合单个的靶标，或可以是多特异性的，即结合多个靶标，如它们可以是双特异性的或三特异性的。在一个实施方式中，所述抗原结合分子是抗体。在另一实施方式中，所述抗原结合分子是域抗体(dAb)。在又一实施方式中，所述抗原结合分子可以是抗体和抗原结合片段的组合物，例如连接到单克隆抗体的一个或多个dAb和/或一个或多个ScFv。在又一实施方式中，所述抗原结合分子可以是抗体和肽的组合物。抗原结合分子可包括至少一个非Ig结合域，例如特异性地结合独立于不同V区或域的抗原或表位的域，这可以是dAb，例如人、骆驼或鲨鱼的免疫球蛋白单可变域，或者它可以是这样的域，其选自以下的支架的衍生物：CTLA-4(Evibody)、脂笼蛋白(Lipocalin)、蛋白A衍生的分子如蛋白A的Z-域(亲和蛋白体，SpA)、A-域(Avimer/Maxibody)、热休克蛋白如GeoEI和GroES、转铁蛋白(穿膜抗体)、锚蛋白重复蛋白(DARPin)、肽适体、C型凝集素域(四连接素)、人晶体蛋白和人泛素(亲和物)、PDZ域、人蛋白酶抑制剂的的蝎毒kunitz型域、以及纤连蛋白(adnectin)；其已经用于蛋白工程，以便使其与配体而非与天然的配体结合。

CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4)是主要在CD4+T细胞上表达的CD28家族受体。它的胞外域是可变域状的Ig折叠。对应于抗体的CDR的环可用异源序列取代，以赋予不同的结合特性。业已知道，经工程改造成具有不同结合特性的CTLA-4分子是Evibody。进一步详细的内容请参见免疫学方法杂志248(1-2)，31-45(2001)。

脂笼蛋白是转运小疏水分子如类固醇、后胆色素、类视黄醇和脂质的胞外蛋白家族。它们具有刚性折叠的二极结构，其在圆锥形结构的开始端具有很多的环，可以经工程改造以结合不同的靶标抗原。Anticalin的大小在160-180个氨基酸之间，并源自脂笼蛋白。进一步详细的内容参见Biochim Biophys Acta1482：337-350(2000)，US7250297B1和US20070224633。

亲和体是源自能经工程改造以结合抗原的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的蛋白A的支架。该域由三螺旋束的约58个氨基酸组成。通过表面残基的随机化产生库。进一步详细的内容参见Protein Eng.Des.Sel.17，455-462(2004)和EP1641818A1。

Avimer是源自A-域支架家族的多域蛋白。约35个氨基酸的天然域采用限定的二硫化物键合结构。通过慢慢移动由A域家族展现的天然变异可产生多种变化。进一步详细的内容参见Nature Biotechnology 23(12)，1556-1561(2005)和Expert Opinion on Investigational Drugs 16(6)，909-917(2007年6月)。

转铁蛋白是单体血清转运糖蛋白。通过在允许的表面环中插入肽序列，转铁蛋白可以经工程改造以结合不同的靶标抗原。工程改造的转铁蛋白支架的例子包括穿膜抗体(trans-body)。进一步详细的内容参见J.Biol.Chem 274，24066-24073(1999)。

设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)源自锚蛋白，其为一种蛋白家族，用于将整合膜蛋白的附属部分介导至细胞骨架上。单个的锚蛋白重复是由双螺旋和a转角组成的33个残基基序。通过随机化每个重复的第一螺旋和a-转角中的残基，它们可经改造以结合不同的靶标蛋白。通过增加单元的数量(亲和力成熟的方法)，可增加结合界面。进一步详细的内容参见J.Mol.Biol.332，489-503(2003)，PNAS 100(4)，1700-1705(2003)和J.Mol.Biol.369，1015-1028(2007)以及US20040132028A1。

纤连蛋白是一种能改造以结合抗原的支架。Adnectin由人的III型纤连蛋白(FN3)的15个重复单元的第十域的天然氨基酸序列的主链组成。夹心结构的一端的三个环可改造成使Adnectin特异性地识别感兴趣的治疗靶标。进一步详细的内容参见Protein Eng.Des.Sel.18，435-444(2005)、US20080139791、WO2005056764和US6818418B1。

肽适体是由连续的支架蛋白组成的组合识别分子，一般是含有在活性位点插入的限制性的可变肽环的硫氧还蛋白(TrxA)。进一步详细的内容参见Expert Opin.Biol.Ther.5，783-797(2005)。

微体源自天然生成的长度为25-50个氨基酸的微蛋白，包含3-4个半胱氨酸桥，微蛋白的例子包括KalataB1和芋螺毒素(conotoxin)和结蛋白(knottins)。微蛋白具有能够改造成包括多达25个氨基酸的环，且不影响微蛋白的整体折叠。改造的结蛋白域的进一步详细内容，参见WO2008098796。

其它的非Ig结合域包括已用作支架以改造不同靶标抗原结合特性的蛋白，包括人晶体蛋白和人泛素(亲和结合体)，人蛋白酶抑制剂的kunitz型域、Ras-结合蛋白AF-6的PDZ域、蝎毒素(北非蝎毒素)，C型凝集素域(四连蛋白)，其在Non-Antibody Scaffolds from Handbook of Therapeutic Antibodies(2007，Stefan Dubel编辑)的第7章和Protein Science 15：14-27(2006)中有综述。本发明的非Ig结合域可源自任意的这些可替代的蛋白域。

在本发明的进一步的实施方式中，抗原结合分子结合到在中枢神经系统中发现的靶标中，例如脑或脊髓中或者例如神经组织中。

在本文描述的本发明的再一实施方式中，抗原结合分子特异性地结合到已知与神经疾病或病症相关的靶标中，例如MAG(髓鞘相关糖蛋白)、NOGO(神经突起生长抑制蛋白)或β-淀粉样蛋白。

这些抗原结合分子包括能够结合NOGO(如抗-NOGO抗体)的抗原结合分子。用于本发明的的抗-NOGO抗体的一个例子是由SEQ ID NO 1的重链和SEQ ID NO 2的轻链限定的抗体，或包含SEQ ID NO 1和2所示的抗体的CDR的抗-NOGO抗体或其抗原结合片段。该抗体(H28L16)的进一步详细的内容可在PCT申请WO2007068750中找到，其内容纳入本文中作为参考。

这种抗原结合分子包括能够结合MGA(如抗-MGA抗体)的抗原结合分子。用于本发明的抗-MGA抗体的一个例子是由SEQ ID NO 11的重链可变区和SEQ ID NO 12的轻链可变区限定的抗体，或包含SEQ ID NO 1和2所示的抗体的CDR的抗-MGA抗体或其抗原结合片段。该抗体(BvH1CvL1)的进一步详细的内容可在PCT申请WO2004014953中找到，其内容纳入本文中作为参考。

这种抗原结合分子包括能够结合β-淀粉样蛋白(如抗β-淀粉样蛋白抗体)的抗原结合分子。用于本发明的抗β-淀粉样蛋白抗体的一个例子是由SEQ ID NO 5的重链和/或SEQ ID NO 6的轻链限定的抗体，或包含SEQ ID NO 5和7所示的抗体的CDR的抗-β-淀粉样蛋白抗体或其抗原结合片段。该抗体(H2L1)的进一步详细的内容可在PCT申请WO2007113172中找到，其内容纳入本文中作为参考。用于本发明的可替代的抗β-淀粉样蛋白抗体是由SEQ ID NO 7的重链和/或SEQ ID NO 8的轻链限定的抗体，或包含SEQ ID NO 7和8所示的抗体的CDR的抗-β-淀粉样蛋白抗体或其抗原结合片段。

这种抗体的CDR序列可由以下方法确定：Kabat编号系统(Kabat等人；Sequences of proteins of Immunological Interest NIH，1987)、Chothia编号系统(Al-Lazikani等人，(1997)JMB 273，927-948)、接触定义方法(MacCallum R.M.，和Martin A.C.R.和Thornton J.M，(1996)，Journal of Molecular Biology，262(5)，732-745)或本领域的技术人员已知的对抗体的残基编号并确定CDR的任何其它确定的方法。

在本发明的一个实施方式中，该抗原结合蛋白结合到眼中的靶标中，例如TNF、TNFr-1、TNFr-2、TGFβ受体-2、VEGF、NOGO、MAG、IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、IL-17、CD20、β-淀粉样蛋白、FGF-2、IGF-1、PEDF、PDGF或补体因子，如C3、C5、C5aR、CFD、CFH、CFB、CFI、sCR1或C3。

在本发明的一个实施方式中，该抗原结合蛋白结合VEGF。在本发明的另一个可替代的实施方式中，该抗原结合蛋白结合β-淀粉样蛋白。

在本发明的一个实施方式中，所述微粒载体可以是微球体或纳米粒子。在一个这样的实施方式中，所述微粒载体是纳米粒子，且生物活性剂是蛋白。在另一实施方式中，所述微粒载体是纳米粒子，且生物活性剂是肽。在又一实施方式中，所述微粒载体是纳米粒子，且生物活性剂包括抗原结合分子，如域抗体或抗体。在又一实施方式中，所述微粒载体是纳米粒子，且生物活性剂包含域。在另一实施方式中，所述微粒载体是微球体，且生物活性剂是蛋白。在又一实施方式中，所述微粒载体是微球体，且生物活性剂是肽。在又一实施方式中，所述微粒载体是微球体，且生物活性剂包含抗原结合分子，如域抗体或抗体。在再一实施方式中，所述微粒载体是微球体，且生物活性剂包含域。

在本发明的一个实施方式中，其提供包括本发明所述的任一种方法制备的纳米粒子的组合物。在另一实施方式中，当用动态光散射技术测量时，数量上至少约90％的纳米粒子在约1nm-约1000nm之间的范围内。在又一实施方式中，当用动态光散射技术测量时，数量上至少约90％的纳米粒子在约1nm-约400nm之间，或约1nm-约250nm之间，或约1nm-约150nm之间，或约40nm-约250nm之间，或约40nm-约150nm之间，或约40nm-约100nm之间的范围内。

在本发明的又一实施方式中，当用动态光散射技术测量时，数量上至少约90％的纳米粒子在约40nm-约250nm之间的范围内。

在本发明的又一实施方式中，当用动态光散射技术测量时，数量上至少约90％的纳米粒子在约40nm-约150nm之间的范围内。

在本发明的又一实施方式中，其提供一种包括本发明的纳米粒子的组合物，其中当用动态光散射技术测量时，组合物中的纳米粒子的粒径中间值小于约1000nm，例如粒径小于约400nm，例如粒径小于约250nm，例如粒径小于约150nm。

在另一实施方式中，组合物中的纳米粒子的粒度中间值为约40nm-约250nm。

在另一实施方式中，组合物中的纳米粒子的粒度中间值为约40nm-约150nm。

在本发明的一个实施方式中，其提供包括本发明所述的任一种方法制备的微球体的组合物。在另一实施方式中，当用小角激光光散射技术测量时，数量上至少约90％的微球体的直径在约1μm-约100μm之间的范围内。在又一实施方式中，当用小角激光光散射技术测量时，数量上至少约90％的粒子在约1μm-约80μm之间，或在约1μm-约60μm之间，或在约1μm-约40μm之间，或在约1μm-约30μm之间，或在约1μm-约10μm之间的范围内。

在另一实施方式中，当用小角激光光散射技术测量时，数量上至少约90％的微球体在约1μm-约60μm之间的范围内。

在另一实施方式中，当用小角激光光散射技术测量时，数量上至少约90％的微球体在约1μm-约30μm的范围之间。

在本发明的又一实施方式中，其提供一种包括本发明的微球体的组合物，其中当用小角激光光散射技术测量时，组合物中的微球体的直径的粒度中间值小于约100μm，例如直径小于约80μm，例如直径小于约60μm，例如直径小于约40μm。

在另一实施方式中，组合物中微球体的粒度中间值为约1μm-约6μm或1μm-约30μm。

在本发明的又一实施方式中，所述微粒载体在超过至少3个月或更长的时间内，或长达6个月内或更长的时间或者长达12个月内或更长的时间内持续释放治疗量的活性生物分子。

在一个实施方式中，蛋白与聚合物的重量比可以是0.5％-50％，例如是至少约0.5％，或至少约1％，或至少约2％，或至少约5％，或至少约7％，或至少约10％，或至少约11％，或至少约14％，或至少约20％，或至少约40％，或至少约50％。例如，当蛋白是肽时，该肽与聚合物的比率可以是至少约11，当蛋白是抗体时，该抗体与聚合物的比率可以至少是约14％，或当蛋白是域抗体时，该域抗体与聚合物的比率可以至少是约11％。

在本发明的一个实施方式中，粒子的囊封效率是至少约1％，或至少约2％，或至少约10％，或至少约20％，或至少约40％，或至少约50％，或至少约60％，或至少约70％，或至少约80％，或至少约90％，或至少约95％，或至少约97％，或至少约99％。例如，当蛋白是肽时，囊封效率可以是至少约60％，当蛋白是抗体时，囊封效率可以是至少约90％，当蛋白是域抗体时，囊封效率可以是至少约60％。

适合用于本发明的方法的有机溶剂的例子包括但不限于：不溶于水的酯如乙酸乙酯、乙酸异丙酯、乙酸正丙酯、乙酸异丁酯、乙酸正丁酯、异丁酸异丁酯、2-乙基乙酸己酯、乙二醇二乙酸酯；不溶于水的酮如甲基乙基酮、甲基异丁基酮、甲基异戊基酮、甲基正戊基酮、二异丁基酮；不溶于水的醛如乙醛、正丁醛、巴豆醛、二乙基己醛、异丁醛和丙醛；不溶于水的醚酯如3-乙氧基丙酸乙酯；不溶于水的芳香烃如甲苯二甲苯和苯；不溶于水的卤代烃如1，1，1-三氯乙烷；不溶于水的乙醇醚酯如丙二醇单甲醚醋酸酯、乙二醇单乙醚醋酸酯、乙二醇单丁醚醋酸酯、二乙二醇单丁醚醋酸酯；不溶于水的邻苯二甲酸增塑剂如邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二辛酯、对苯二甲酸二辛酯、辛基邻苯二甲酸丁酯、邻苯二甲酸苄丁酯、邻苯二甲酸烷基苄酯；不溶于水的增塑剂如己二酸二辛酯、乙二醇二-2-乙基己酸三乙烯酯、偏苯三酸三辛酯、三醋酸甘油酯、甘油基/三丙酸菌素(glyceryl/tripropionin)、2，2，4-三甲基-1，3-戊二醇二异丁酯、二氯甲烷、乙酸乙酯或二甲基亚砜、四氯化碳、氯仿、环己烷、1，2-二氯乙烷、二氯甲烷、二乙醚、二甲基甲酰胺、庚烷、己烷或其它的烃；甲基叔丁基醚、戊烷、甲苯、2，2，4-三甲基戊烷、1-辛醇及其异构体或苯甲醇。

在本发明的一个实施方式中，用于本发明的方法的溶剂选自：二氯甲烷、乙酸乙酯或二甲基亚砜、四氯化碳、氯仿、环己烷、1，2-二氯乙烷、二氯甲烷、二乙醚、二甲基甲酰胺、庚烷、己烷或其它的烃；甲基叔丁基醚、戊烷、甲苯、2，2，4-三甲基戊烷、1-辛醇及其异构体或苯甲醇。

本文所述的本发明的所有方面的微粒载体、包含它们的组合物或它们的制备方法可进一步包括加入表面活性剂，其例如但不限于：胆酸钠、泊洛沙姆188(poloxamer)(pluronic F68^TM，或F127)、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚山梨醇酯80、葡聚糖、泊洛沙姆、poloxamines、多功能醇的羧酸酯类、烷氧基化醚类、烷氧基酯类、烷氧基化甘油单、二、三酯类、烷氧基酚类以及联苯酚类、乙氧基醚类、乙氧基酯类、乙氧基甘油三酸酯类、GenapolR^TM和BaukiR^TM系列的物质、脂肪酸的金属盐、羧酸的金属盐、醇硫酸金属盐以及脂肪醇硫酸金属盐和磺基琥珀酸金属盐以及两种或更多种上述物质的混合物。

在又一实施方式中，表面活性剂选自：胆酸钠、泊洛沙姆188(pluronicF68^TM)、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚山梨醇酯80和葡聚糖。

在本发明的一个实施方式中，其提供包含生物活性剂的微粒载体，其可由本发明的任意方法制备。

囊封在本发明的微粒载体和/或组合物内的生物活性剂在它从微粒载体释放时保留至少一些生物活性，例如，当药剂是结合的药剂并对生物活性剂从粒子中释放产生生物应答时，该组合物中的一定比例的分子可保留至少一些结合它们的靶标的能力。可用合适的生物结合测定测量这样的结合，合适的测定的例子包括但不限于ELISA或Biacore^TM。在另一实施方式中，当通过生物活性测定对粒子的释放进行测量时，例如在一个实施方式中通过ELISA或Biacore测量时，组合物保留至少50％它对靶标的亲和力，或对靶标保留至少70％或至少90％的亲和力(Kd)。在一个实施方式中，组合物能够在给药的对象中引出治疗效果。本发明的组合物的生物活性可通过任意合适的测定进行测量，其测量的是囊封的生物活性分子的活性。

在本发明的一个实施方式中，其提供一种通过在纳米粒子中囊封蛋白，以输送蛋白穿过患者的生物屏障如血脑屏障的方法。在另一实施方式中，所述患者是人。

在本发明的一个实施方式中，其提供一种将在微粒载体(如微球体)中囊封的蛋白输送到哺乳动物(如人)的眼中的方法。

在另一个实施方式中，其提供一种包含囊封在本文所述的本发明的微粒载体中的生物活性剂的药物组合物。

在另一个实施方式中，其提供一种包含囊封在本文所述的本发明的微纳米粒子中的蛋白的药物组合物。在另一个实施方式中，其提供一种药物组合物，其包含囊封在本文所述的微球体中的用于眼睛输送的蛋白，以治疗或预防眼疾。

在另一个实施方式中，本发明的组合物可用来治疗和/或预防涉及微粒载体穿过血脑屏障的疾病或病症。

在另一个实施方式中，本文所述的本发明的组合物可用来治疗和/或预防中枢神经系统的疾病或病症，例如可用来治疗和/或预防阿尔茨海默病、亨廷顿舞蹈症、牛海绵状脑病、西尼罗河病毒性脑炎、神经艾滋病、脑损伤、脊髓损伤、转移性脑癌、多发性硬化、中风。

在另一个实施方式中，所述组合物可包含抗MAG-抗体，以治疗和/或预防中风或神经损伤。

在另一个实施方式中，所述组合物可包含抗-NOGO-抗体，以治疗和/或预防中风或神经损伤，或者例如治疗或预防神经退化性疾病如阿尔茨海默病。

在另一个实施方式中，所述组合物可包含抗-β-淀粉样蛋白抗体，以治疗和/或预防中风或神经损伤，或者例如治疗或预防神经退化性疾病如阿尔茨海默病。

在本文所述的本发明的一个实施方式中，所述微粒载体可通过肠胃外注射或输注、静脉或动脉给药的方式给予患者。

在另一个实施方式中，本文所述的本发明的组合物可用来治疗和/或预防眼睛疾病或病症。在另一个实施方式中，本文所述的本发明的组合物可用来治疗和/或预防疾病，其例如但不限于年龄相关的黄斑变性(新生血管/湿的)、糖尿病性视网膜病变、视网膜静脉闭塞症、葡萄膜炎、角膜新生血管形成或青光眼。

在另一个实施方式中，所述组合物可用来治疗和/或预防AMD(年龄相关的黄斑变性)，例如湿性AMD或干性AMD。

在本发明的另一个实施方式中，其提供一种囊封在本文所述的纳米粒子和/或微球体中的生物活性剂，用作药物。

在本发明的一个实施方式中，其提供本文所述的本发明的组合物在制备治疗和/或预防中枢神经系统疾病的药物中的用途。在另一个实施方式中，本发明提供本文所述的本发明的组合物在制备治疗和/或预防阿尔茨海默病的药物中的用途。在又一个实施方式中，本发明提供本文所述的本发明的组合物在制备治疗和/或预防中风或神经损伤的药物中的用途。

在本发明另一个实施方式中，提供本文所述的本发明的组合物在制备治疗或预防眼病的药物(如在制备治疗和/或预防AMD的药物)中的用途。

本发明提供使用本发明的组合物治疗和/或预防中枢神经系统疾病的方法。在另一个实施方式中，本发明提供使用本发明的组合物治疗阿尔茨海默病的方法。在另一个实施方式中，本发明提供使用本发明的组合物治疗和/或预防中风或神经损伤的方法。

本发明还提供使用本发明的组合物治疗和/或预防眼病的方法。在另一个实施方式中，本发明提供使用本发明的组合物治疗和/或预防AMD的方法。

定义

本文使用的术语“粒子形成的物质”用来描述任意的能够聚合的单体和/或寡聚体，或能形成不溶于水性环境中的粒子的聚合物，如PBCA、PLGA。在未聚合时，该粒子形成物质可溶于有机溶剂中。

本说明书全文使用的术语“微粒载体”包含纳米粒子和微球体。“微球体”是由直径大于1μm的各种天然和合成的材料组成的粒子，而本文使用的“纳米粒子”是亚微米级的粒子，如1-1000nm。

在一个实施方式中，本文使用的术语微粒载体、纳米粒子和微球体具有载体结构，其具有生物相容性且足以抵抗使用环境导致的化学和/或物理损坏，以至于在给药进入人或动物体之后，足量的粒子基本上保持完整，并能保持足够的时间，以便能够到达所需要的靶器官或组织，如脑或眼睛。

本文所使用的术语“生物活性剂”是用于表示当到达它们应到的靶标时，该分子必须能够至少部分具有生物活性的术语。为避免术语“生物活性剂”和“生物活性分子”在本说明书全文中重复使用表示歧义，两个术语表示相同的含义，且能够互换。

术语“溶解”定义为形成溶剂中的单独分子形式的溶液，或形成液体悬液中的固体，其形式为分子微小固体聚集块悬浮于液体中。溶解过程也可以得到完全溶解的分子和悬浮的固体聚集块的混合物。

整份说明书中所使用的用于在微粒载体中囊封的术语“蛋白”包括分子量至少为11kDa、或至少12kDa、或至少50kDa、或至少100kDa、或至少150kDa或至少200kDa的蛋白。囊封用的蛋白也可以有很长的长度，例如至少为70个氨基酸的长度或至少为100个氨基酸的长度或至少为150个氨基酸的长度或至少为200个氨基酸的长度。

整份说明书中所使用的用于在微粒载体中囊封的术语“肽”包括较短序列的氨基酸，其分子量不大于约10kDa、或不大于约8kDa、或不大于约5kDa、或不大于约2kDa或不大于约1kDa或小于1kDa。囊封用的肽的长度不超过70个氨基酸的长度或不超过50个氨基酸的长度或不超过40个氨基酸的长度、或不超过20个氨基酸的长度、或小于10个氨基酸的长度。

术语“眼周”是指局部给药至眼外周的位置，其包括但不限于：“结膜下”-结膜的下面-在巩膜上覆盖整个眼球的的清澈的黏液膜；“筋膜下”-包裹眼睛的筋膜的下面但在巩膜外面；“眼球周围”-眼球下的空间，其中眼球位于眼框中；“眼球后”-眼球正后方的空间，邻近视神经；“脉络膜上层”-巩膜的下面，但在脉络膜进入脉络膜上层空间的外部；“经巩膜”-该术语也用来指输送通过，即从巩膜的外部通过。

短语“免疫球蛋白单可变域”是指特异性地结合到独立于不同V区或域的抗原或表位的抗体可变域(V_H、V_HH、V_L)。免疫球蛋白单可变域可以与其它不同的可变区或可变域的形式(例如同源或异源多聚体)存在，其中，通过单个免疫球蛋白可变域的抗原结合不需要所述的其它的区或域(即免疫球蛋白单可变域独立于其它的可变域结合抗原)。“域抗体”或“dAb”与本文所使用的术语能够结合抗原的“免疫球蛋白单可变域”一致。免疫球蛋白单可变域可以是人抗体可变域，但是也包括其它物种的单抗体可变域，如啮齿目动物(例如在WO 00/29004中揭示的铰口鲨和骆驼V_HH dAbs)。骆驼V_HH是源自包括骆驼、美洲驼、羊驼、单峰骆驼和骆马的物种的免疫球蛋白单可变域多肽，其产生天然地缺少轻链的重链抗体。这种V_HH域可根据本领域中的标准技术进行人源化处理，根据本发明，这种域仍然被认为是“域抗体”。本文使用的“V_H包括骆驼V_HH域”。

本文使用的术语“抗原结合分子”是指抗体、抗体片段和能够结合到靶标的其它蛋白结构。

“域”是折叠蛋白结构，具有独立于余下的蛋白的三级结构。一般地，域负责蛋白的离散的功能特性，在很多的情况下可加入、移除或转移到其它的蛋白上，而不损失该蛋白和/或域的余下部分的功能。“单抗体可变域”是折叠的多肽域，其包括抗体可变域的序列特征。因此，它包括完整的抗体可变域和修饰的可变域，例如，其中的一个或多个环已经被非特征性的抗体可变域的序列取代，或者被截短或包括N或C末端延伸部分的抗体可变域，以及可变域的折叠片段取代，所述折叠片段至少保留结合活性和全长域的特异性。

本文使用的术语“光散射技术”是指用来确定溶液中的小粒子的粒度分布特征的方法-光散射技术的一个例子是可用来测量纳米粒子的动态光散射，光散射的另一例子是可用于测量微球体的静态光散射或小角度光散射。

本位使用的术语“动态光散射”(DLS)是使用通过粒子分散利用散射光以得出粒度的信息的方法。动态光散射取决于这样的事实，即当在液体悬液中时，粒子的Browian运动依赖粒度，且粒子的Browian运动使来自粒子样品的散射光的强度产生波动。通过相关的函数分析这些波动，以得出粒径。接着利用斯托克斯-爱因斯坦方程算出粒子的平均流体力学直径。

“多指数分析”可得出粒度分布，可确定不同样品内部的不同物种的存在。DLS通常可用于纳米粒子的分析。

整份说明书中可换用的术语“静态光散射”或“小角度激光光散射”有时是指激光衍射。激光衍射依赖的是衍射角与粒度成反比的事实。该方法使用全米氏理论，其完全解答了光与物质的相互作用的方程。激光衍射可用来分析纳米粒子和微粒子(直径为0.02-2000微米)。

本文使用的术语“血脑屏障”(BBB)是指主要保护大脑不受血液中的化学物质影响，但仍允许基础代谢功能的膜结构。它由脑微血管内皮细胞组成，其在脑毛细血管中紧密聚集。与身体其它任何部位的毛细血管的内皮细胞相比，这种较高的密度更能限制物质从血流通过。

在整篇说明书中，药物载入的百分比定义为每份在粒子制剂中使用的物料的重量(聚合物重量)中含有的药剂的重量百分比w/w。

药物载入％＝(药物重量/粒子制剂中使用的物料重量)x100％。

在整篇说明书中，参考多个实施方式以清楚简洁的语言描述了本发明。应该理解的是，在不脱离本发明的范围内实施方式可有多种组合或者分开使用。

实施例实施例1 BCA(氰基丙烯酸丁酯)单体的聚合

用在有机溶剂中的快速聚合反应形成聚合物：

将BCA单体(200μl，Vetbond，3M)加入在25ml的烧杯中的1ml无水乙醇中，缓慢旋转烧杯。将得到的溶液轻轻混合，直到聚合反应开始。聚合反应完毕后形成白色的固体分散物。当反应混合物变得很粘而不能搅动时，停止分散物的混合。

在通风橱中使反应混合物中的乙醇蒸发至少1小时。乙醇蒸发之后，得到破裂的白色固体块。收集该固体，并将其用于纳米粒子的制备方法。

实施例2 通过复乳法制备空心纳米粒子

将PBCA聚合物以浓度为1％w/v溶于二氯乙烷中，并通过以下的乳化成复乳液(水/油/水，w/o/w)的方法将其用来制备空心PBCA纳米粒子：

(i)初级乳化(w/o)

内相(w)：在水或缓冲液中的5％的胆酸钠(SIGMA)，其通过以下混合过程制备：

500μl水或缓冲液；以及

500μl胆酸钠(10％w/v储备液)。

内水相的总体积为1ml。将溶液保存在冰上直到拿出使用之时。使用之前，将每种溶液吸入至胰岛素注射器(Terumo 1ml，BD microlance needle 19G 1.5″)中。

外部(有机)相(o)：在二氯甲烷(DCM，Fischer)中的PBCA聚合物(1％w/v)。

将有机相(在DCM中的PBCA聚合物，6ml)倒入10ml烧杯(置于冰上冷却)中，并插入均化器的探针(Ultra-Turrax，T25，50ml探针)。溶液被石蜡膜(附着于烧杯和探针)覆盖，并使用转子定子均化器(UIltra-Turrax T25 basic)以24,000rpm的速度进行均化处理。

初级乳液的形成

当均化器达到需要的速度，通过将其注射到靠近探针的溶液内部加入内部水相。得到的乳液进行均化处理2分钟(在冰上)，接着转移到玻璃注射器(SGE，25ml，气密的，适合于有机溶剂，P/N 009462 25MDR-LL-GT，批号#F06-A2190，配有钝的5cm 2R2针头，0.7mm ID)中。

(ii)次级乳液(w/o/w)

内相(w/o)：从上述的均化步骤得到的初级乳液

外相(w)：水中的胆酸钠(1.25％w/v)。

次级乳液的形成

初级单乳液(w/o)通过加入到第二水相(1.25％w/v胆酸钠)并均化形成复乳液。将胆酸钠溶液(1.25％w/v 30ml)转移到高的50ml的烧杯(置于冰上保持乳液冷冻)中，插入Silverson L4RT均化器的探针(3/4英寸，高乳化剂筛选)。溶液被石蜡膜(附着于烧杯和探针)覆盖，并以8000rpm的速度进行均化处理。当达到8,000rpm的速度时，将初级乳液注入溶液靠近探针处。将得到的乳液均化处理6分钟。

将形成的复乳液转移到矮的50ml烧杯中，并在连续搅拌(IKA磁搅拌器，设置为4级)下，使有机相在通风橱中蒸发3小时。

离心法清洗纳米粒子

除去有机溶剂后，通过16200rcf的离心分离将形成的纳米粒子清洗一次，再重新悬于水(10ml)中。

实施例3 经动态光散射确认纳米粒子形成

使用准弹性光散射，也称动态光散射(DLS)以确定粒度的方式确定纳米粒子的形成。根据生产商提供的标准方法，使用Brookhaven仪器公司的粒度分析仪(BIC 90plus)来分析粒子。将粒子悬液在水中稀释200x，使用标准的粒度测定的参数(温度：25℃，激光束角度90度，激光波长：658nm)进行粒度测量。在每个时间段内，1分钟内进行10次粒度测量，以分析粒子。

通过仪器得到的是相关图的标准形式的原始数据。这描述的是粒子在不同时间间隔的散射光强度的自动相关函数C(τ)，以及自动相关是如何随衰减时间τ衰减的。散射光的自动相关的衰减取决于粒径，且较小的粒子衰减更快。利用斯托克斯-爱因斯坦方程，使仪器导出粒子的粒度信息。这得到样品中的粒子的平均流体力学直径，并进一步导出粒子群数据。

动态光散射对大粒子的存在非常敏感，即使当它们呈现出小于样品的1％时也能显著的影响测量结果。因此，在样品中受大粒子严重影响的由仪器导出的平均流体力学直径可有实质的变化。因此，可以观察到批次之间的很多纳米粒子的粒度差别，且因该原因，查看仪器提供的全部的数据组非常重要，而相关图是最重要的。

通过查看完整的数据组，有可能准确地表征样品，这是因为尽管还存在有极少数的大粒子，仪器仍可以轻易地检测存在于样品沉积中的大多数的小粒子。粒子是否是小的，以及样品是否是多分散的，相关图本身的形状提供非常清楚的说明。基线指数也给出了准确的数据质量表示。此文件中所有的数据都展现了不低于5的基线指数，其中读数的最高的可能质量的最大值是10。

图1a所示为在经QELS对粒子悬液进行粒度测量之后得到的相关图(原始数据)。该相关图清楚地表明，纳米粒子悬液已经通过粒子制备方法得到，因为没有粒子存在，就不会产生任何的光散射。该相关图的形状表明，该悬液具有很好的制药质量，因为粒子小且无大的聚集块存在。通过QELS对粒子悬液进行粒度测量表明形成了平均流体力学直径为262.6nm的纳米粒子(图1a)。也发现粒子群是相对单分散的，而测量样品中的粒度有多宽的范围的多分散指数为0.262(图1a)。这低于粒子制剂的最大的可接受值0.300。一般而言，该相关图确认了复乳化方法已经成功地产生了高质量的PBCA纳米粒子悬液。

得到的数据(利用斯托克斯-爱因斯坦方程通过仪器产生)表明大多数的粒子是小的(图1b-d)。结果表示，约87.5％的粒子群的直径为138.19nm或更小(图1b)。还发现悬液没有大的聚集块，且不含有直径大于506.81nm的任何粒子，大多数的粒子群显然更小(图1c)。此外，该制剂未含有直径小于99.86nm的任何粒子(图1d)。因此，大多数粒子的直径在99.86nm-138.19nm之间，是一种静脉给药的理想粒度，但不是非常的小以至于使得药物加载受到损害。

图1-经QELS得到的粒度数据，表明悬液中纳米粒子的存在。

图1(a)-通过动态光散射对纳米粒子悬液分析后获得的相关图。根据得到的数据，粒子的平均流体力学直径为262.6nm，多分散指数为0.262。

图1(b)-纳米粒子的多模态粒度分布(得到的数据)，绘图以描述粒子群(数量)相对于粒度范围的分布。大多数(87.5％)的粒子群的直径似乎为138.19nm或更小。

图1(c)-纳米粒子的多模态粒度分布(得到的数据)，绘图以描述粒子群(数量)相对于粒度范围的分布。数据表明87.5％的直径为138.19nm或更小，100％的粒子样品的直径为506.81nm或更小。因此，悬液中没有大的聚集块，且因而认为适合于静脉给药。

图1(d)-纳米粒子的多模态粒度分布(得到的数据)，绘图以描述粒子群(数量)相对于粒度范围的分布。数据表明14.9％的粒子样品直径为99.86nm或更小。

当制备不同的纳米制剂时，还发现该方法得到了相似的纳米粒子粒度。表1总结了从一系列4个不同的制剂得到的粒度数据：

一般而言，业已发现空心PBCA纳米粒子制备方法产生具有所需要的直径和多分散性的纳米粒子悬液。

实施例4 纳米粒子的分析-纳米粒子形成的确认及经过电子显微镜观察的空心形态

为了确认形成了粒子且是空心粒子，使用电子显微镜来观察样品。使用透射电子显微镜(TEM)来检测纳米粒子悬液。使用扫描电子显微镜(SEM)分析冻干的纳米粒子。两种显微镜技术的分析确认了纳米粒子的形成。SEM表明形成了稳定的纳米粒子。TEM核实了纳米粒子是空心的，具有PBCA聚合物壁包围的水性核。

图2表示经SEM分析的纳米粒子。

图3表示通过TEM得到的空心纳米粒子的图像，以及用于比较的固体PBCA纳米粒子叠加图像。

实施例5在空心PBCA纳米粒子中的单克隆抗体(人抗-CD23)的囊封

通过加入到均化过程的内部水相，使单克隆抗体(在WO99/58679中揭示的人抗-CD23mAb)包埋在纳米粒子的水性核中。使用抗体溶液制备初级乳液(w/o)，接着与第二水相均化形成以下的复乳液(w/o/w)：

(iii)初级乳液(w/o)

内相(w)：在WO99/58679中揭示的人抗-CD23mAb(600μg，在5％胆酸钠中(SIGMA))，通过混合以下的物质制备得到：

78μl mAb溶液(7.2mg/ml)

344μl水

500μl胆酸钠溶液(10％w/v储备溶液)

内部水相的总体积为1ml。将溶液冷冻直到使用时。使用之前，将每种溶液吸入1ml胰岛素注射器(Terumo 1ml，BD microlance needle 19G 1.5″)中。

外相(o)：在二氯甲烷中的PBCA聚合物(1％w/v)(Fischer)。

将有机相(在DCM中的PBCA聚合物，6ml)倒入10ml烧杯(置于冰上冷却)中，并插入均化器的探针(Ultra-Turrax，T25，50ml探针)。溶液用石蜡膜(附着于烧杯和探针)覆盖，并以24,000rpm的速度进行均化处理。

初级乳液的形成

当均化器达到最大的速度时，通过将其注射到靠近探针的溶液内部加入内部水相。使得到的乳液进行均化处理2分钟(在冰上)，接着转移到玻璃注射器(SGE，25ml，气密的，适合于有机溶剂，P/N 009462 25MDR-LL-GT，批号#F06-A2190，配有钝的5cm 2R2针头，0.7mm ID)中。

(iv)次级乳液(w/o/w)

内相(w/o)：从上述的均化处理得到的初级乳液

外相(w)：水中的胆酸钠(1.25％w/v)。

次级乳液的形成

用初级单乳液(w/o)通过加入到第二水相(1.25％w/v胆酸钠)并均化以形成复乳液。将胆酸钠溶液(1.25％w/v 30ml)转移到高的50ml的烧杯(置于冰上保持乳液冷冻)中，插入Silverson L4RT均化器的探针(3/4英寸探针，高乳化剂筛选)。溶液用石蜡膜(附着于烧杯和探针)覆盖，并以8,000rpm的速度进行均化处理。当达到8,000rpm的速度时，将初级乳液注入靠近探针处的溶液。将得到的乳液均化处理6分钟。

通过离心法对纳米粒子进行清洗

将得到的纳米粒子进行经离心形成小球，以从囊封的抗体中分离游离抗体。小球(包埋抗体)和上清液(游离的抗体)都经总蛋白测定进行分析，以确定囊封效率。

当使用总量600μg抗体时，囊封效率为52％。得到的囊封效率足够高，足以输送潜在治疗量的抗体，而不超过PBCA聚合物的最大的耐受剂量(小鼠为50mg/kg)。而且，有可能接着制备含有不同单克隆抗体人抗-IL13的粒子，这表明该方法适合于任何的水溶性的生物药剂。

图4表示囊封效率测量后得到的结果。

实施例6单克隆抗体从纳米粒子中释放

除了实现生物药剂的高效囊封，有必要证明给药之后，材料能从粒子中释放出来并能保持活性。活性抗体从粒子中的释放最初在体外通过降解粒子进行研究，接着通过ELISA检测任意释放的粒子。为了释放囊封的抗体，用丁基酯酶(源自猪肝，SIGMA)处理粒子，据报道，该丁基酯酶可裂解PBCA聚合物的丁酯。在反应过程中(Ringers溶液，pH 7.0，37℃)，在不同的时间点(0、1、2、3、4和24小时)取样。并用ELISA分析活性抗体的存在。

图5所示为粒子的酶降解并通过ELISA对释放的酶进行分析后得到的释放曲线。

实施例7空心PBCA纳米粒子中的域抗体(抗鸡蛋溶菌酶dAb)的囊封

在以下的实施例中，使用从Sigma(QPBCA)得到的BCA试剂盒进行BCA测定，并根据说明进行测定。将游离dAb进行2倍和10倍稀释，以供分析。将囊封的dAb进行100倍稀释。

通过注入到均化过程的内部水相的方法将域抗体(抗鸡蛋溶菌酶dAb)包埋在纳米粒子的水性核中。在这种情况下，通过混合0.5ml 20mg/ml的dAb溶液(10mg蛋白)和0.5ml的稳定剂溶液(胆酸钠，10％v/w)，以制备内部水相。接着通过实施例4中记述的复乳法制备纳米粒子。将得到的纳米粒子经离心形成小球，以从囊封的抗体中分离游离抗体。小球(包埋的抗体)和上清液(游离的抗体)都用总蛋白测定(二喹啉甲酸(bicinchoninic acid)测定)进行分析，以确定囊封效率。分析结果示于图6中。囊封的dAb的量为6.66mg。游离的dAb的量为4.83mg。因此，囊封效率约为66.6％，载入率为11.1％。因此，使用复乳法有可能在空心PBCA纳米粒子中有效地囊封毫克量的蛋白。

实施例8 单克隆抗体(抗-IL-13-mAb)在空心PBCA纳米粒子中的囊封

通过注入到均化过程的内部水相的方法将单克隆抗体(抗-IL-13-mAb)包埋在纳米粒子的水性核中。通过混合0.5ml 20mg/ml的mAb(10mg蛋白)溶液和0.5ml的稳定剂溶液(胆酸钠，10％v/w)，以制备内部水相。接着通过实施例5中记述的复乳法制备纳米粒子。将得到的纳米粒子经离心形成小球，以从囊封的抗体中分离游离抗体。小球(包埋的抗体)和上清液(游离的抗体)都用总蛋白测定(二喹啉甲酸测定)进行分析，以确定囊封效率。分析结果示于图12中。囊封的mAb的量为8.62mg。游离的mAb的量为1.79mg。因此，囊封效率约为86.2％，载入率为14.4％w/w。

序列表

序列

SEQ ID NO.1：重链人源化构建体H28

MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHW

VRQAPGQGLEWIGNINPSNGGTNYNEKFKSKATMTRDTSTSTAYMELSSLRSEDTA

VYYCELMQGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFP

EPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPS

NTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV

DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY

KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDI

AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAL

HNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO.2：2A10轻链人源化构建体L16

MGWSCIILFLVATATGVHSDIVMTQSPLSNPVTLGQPVSISCRSSKSLLYKDGKTYLN

WFLQRPGQSPQLLIYLMSTRASGVPDRFSGGGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQ

QLVEYPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV

QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGL

SSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO.3：重链人源化构建体H28

ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCAC

TCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCT

CAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCATCTGGATACACCTTCACCAGCTACTGGATGC

ACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATCGGAAATATTAAT

CCTAGCAATGGTGGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACCATG

ACCAGGGACACGTCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATC

TGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGAACTGATGCAGGGCTACTGGGGCCAGG

GAACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCC

TGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCT

GGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCC

TGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACT

CCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTAC

ATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAG

CCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTC

GCGGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCAT

GATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAG

ACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCC

AAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGT

CCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGG

TCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAG

GGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTG

ACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGA

CATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCA

CGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACC

GTGGACAAGAG CAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCA

TGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAA

ATGA

SEQ ID NO.4：2A10轻链人源化构建体L16

ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCAC

TCCGATATTGTGATGACCCAGTCTCCACTCTCCAACCCCGTCACCCTTGGACAG

CCGGTCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTATATAAGGATGGGAAG

ACATACTTGAATTGGTTTCTCCAGAGGCCAGGCCAATCTCCACAGCTCCTAATTT

ATTTGATGTCCACCCGTGCATCTGGGGTCCCAGACAGATTCAGCGGCGGTGGG

TCAGGCACTGATTTCACACTGAAAATCAGCAGGGTGGAGGCTGAGGATGTTGG

GGTTTATTACTGCCAACAACTTGTAGAGTATCCGCTCACGTTTGGCCAGGGGAC

CAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCC

ATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAA

CTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTCCAATC

GGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACA

GCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTC

TACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTT

CAACAGGGGAGAGTGTTAG

SEQ ID NO.5：成熟的H2重链氨基酸序列

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFTFSDNGMAWVRQAPGKGLEWVSFISNLA

YSIDYADTVTGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCVSGTWFAYWGQGTLV

TVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT

FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTC

PPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV

EVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA

KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP

PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO.6：成熟的轻链氨基酸序列

DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRVSQSLLHSNGYTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVS

NRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQTRHVPYTFGGGTKVEIKR

TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVT

EQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO.7：成熟的H11重链氨基酸序列

QVQLVQSGAEVKEPGASVKVSCKGSGFNIKVYYVHWLRQLPGKGLEWIGRIDPEN

GETIYTPKFQDKATLTVDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCVSSGYWGQGTLVTVS

SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA

VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPP

CPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEV

HNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG

QPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV

LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO.8：成熟的L9轻链氨基酸序列

DIVMTQSPLSNPVTPGEPASISCRSSKSLLHRNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMS

NLASGVPDRFSSSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELWTFGQGTKVEIKRT

VAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTE

QDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO.9：亮啡肽类似物

YAGFLR

SEQ ID NO.10：DOM15-26-593 VEGF dAb序列：

EVQLLVSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKAYPMMWVRQAPGKGLEWVSEISPSG

SYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPRKLDYWGQGTL

VTVSSAAAEQKLISEEDLN

SEQ ID NO.11：CvL1可变区

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSHSVLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYW

ASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCHQYLSSLTFGQGTKLEIKR

TV

SEQ ID NO.12：BvH1可变区

QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTY

TGEPTYADDFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARNPINYYGINYEGYV

MDYWGQGTLVTVSS.

SEQ ID NO.13：H2全长DNA序列

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCC

TGAGACTCTCCTGTGCAGTCTCTGGATTCACCTTCAGTGACAACGGAATGGCGT

GGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTTTCATTCATTAGTAAT

TTGGCATATAGTATCGACTACGCAGACACTGTGACGGGCCGATTCACCATCTCC

AGAGACAATGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAG

GACACGGCTGTGTATTACTGTGTCAGCGGGACCTGGTTTGCTTACTGGGGCCA

GGGCACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCC

CCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTG

CCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCG

CCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTC

TACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGAC

CTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGT

TGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGA

ACTCGCGGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCC

TCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAC

GAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAA

TGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCA

GCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGC

AAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCC

AAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGA

GCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCA

GCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAA

GACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCT

CACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGA

TGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCG

GGTAAA

SEQ ID NO.14：优化的L1轻链DNA

GACATCGTGATGACCCAGAGCCCCCTGAGCCTGCCCGTGACCCCTGGCGAGCC

CGCCAGCATCAGCTGTAGAGTGAGCCAGAGCCTGCTGCACAGCAACGGCTACA

CCTACCTGCACTGGTATCTGCAGAAGCCTGGCCAGAGCCCTCAGCTGCTGATCT

ACAAGGTGTCCAACCGGTTCAGCGGCGTGCCTGATAGATTCAGCGGCAGCGGC

TCCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCAGAGTGGAGGCCGAGGATGTGGG

CGTGTACTACTGCTCCCAGACCAGACACGTGCCTTACACCTTTGGCGGCGGAA

CAAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCC

CCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAA

CAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGC

AGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCAC

CTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACA

AGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAG

AGCTTCAACCGGGGCGAGTGC

SEQ ID NO.15：L1全长

GATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCG

GCCTCCATCTCCTGCAGAGTTAGTCAGAGCCTTTTACACAGTAATGGATACACCT

ATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTATA

AAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAG

GCACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTT

ATTACTGCTCTCAAACTAGACATGTTCCGTACACGTTCGGCGGAGGGACCAAGG

TGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTG

ATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTA

TCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTCCAATCGGGTA

ACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTC

AGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGC

CTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACA

GGGGAGAGTGT

Claims

1.一种制备微粒载体的方法，包括以下步骤：

b)将含有生物活性剂的水溶液加入到该聚合物溶液中以在连续有机相中形成水相液滴的初级乳液；

c)使初级乳液与水介质混合形成次级乳液；以及

d)使有机相蒸发，并藉此得到包括含有在水相中的生物活性剂的空腔的微粒载体。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)中还包括加入凝胶形成剂。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的凝胶形成剂是琼脂糖。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述的聚合物是聚乙二醇化的。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述的微粒载体是微球体。

6.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述的微粒载体是纳米粒子。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，所述的生物活性剂是蛋白或肽。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的生物活性剂是抗原结合分子。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的生物活性剂包括域。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的生物活性剂是抗体。

11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的生物活性剂是域抗体。

12.一种微粒载体，其特征在于，该微粒载体包括前述任意一项权利要求所述的方法得到的囊封的生物活性剂。

13.根据权利要求12所述的微粒载体，其特征在于，所述的微粒载体是纳米粒子。

14.根据权利要求13所述的微粒载体，其特征在于，所述的生物活性剂是蛋白。

15.根据权利要求14所述的微粒载体，其特征在于，纳米粒子中所述的蛋白与聚合物的比例至少是约5％w/w，或至少约10％w/w或者至少是约14％w/w。

16.根据权利要求13所述的微粒载体，其特征在于，所述的生物活性剂是肽。

17.根据权利要求16所述的微粒载体，其特征在于，纳米粒子中所述的肽与聚合物的比例至少是约5％w/w，或至少约10％w/w。

18.根据权利要求13所述的微粒载体，其特征在于，所述的生物活性剂是抗体。

19.根据权利要求18所述的微粒载体，其特征在于，纳米粒子中所述的抗体与聚合物的比例至少是约5％w/w，或至少约10％w/w。

20.根据权利要求13所述的微粒载体，其特征在于，所述的生物活性剂是dAb。

21.根据权利要求20所述的微粒载体，其特征在于，纳米粒子中所述的dAb与聚合物的比例至少是约5％w/w，或至少约10％w/w或至少是约14％w/w。

22.药物组合物，其特征在于，所述的组合物包括权利要求12-21中任一项所述的微粒载体。

23.如权利药物22所述的组合物在治疗或预防疾病中的用途。