CN102215830A

CN102215830A - 生物活性剂的囊封方法

Info

Publication number: CN102215830A
Application number: CN2009801268147A
Authority: CN
Inventors: I·帕帕尼科劳乌
Original assignee: Glaxo Group Ltd
Current assignee: Glaxo Group Ltd
Priority date: 2008-05-06
Filing date: 2009-05-05
Publication date: 2011-10-12
Also published as: EP2273986A2; MX2010012136A; CA2721350A1; ZA201007436B; WO2009135855A3; IL208655A0; BRPI0912230A2; WO2009135855A2; JP2011519894A; EA201001569A1; US20110059142A1; AU2009245786A1

Abstract

本发明提供使用Hip试剂将生物活性剂(如蛋白)囊封在微粒载体(如纳米粒子)中的多种方法。本发明还提供包括利用这些方法可得到的微粒载体的组合物以及这些组合物在治疗中的用途。

Description

生物活性剂的囊封方法

背景技术

很多药物在大脑或眼中的靶标处具有活性，为了使这些药物到达它们的靶标，它们必须穿过生物屏障，如血脑屏障。虽然一些分子能够通过生物屏障，但是还有一些不能有效或事实上根本不能穿过这些屏障的其它分子。许多药物也仅仅当直接进入靶标组织时才有效，且如果不能到达这个靶标组织，药物实际上也不能起作用。因此，由于不能穿过这样的生物屏障，很多可能有效的药物不能在临床上使用。

现有技术中已记述了很多方法以增强药物穿透这些生物屏障的能力。

一种方法是改变屏障本身的功能。例如，渗透剂或拟胆碱药物槟榔碱类(cholinomimetic arecolines)，其能打开血脑屏障或者改变血脑屏障的穿透性(Saija A等人，J Pharm.Pha.42：135-138(1990))。

其它的方法是修饰药物分子本身。例如，修饰蛋白以试图穿过血脑屏障，包括使这些蛋白糖基化或者形成前药(WO/2006/029845)。

还有另一方法是植入可控制释放的聚合物，其从基质系统直接将活性成分释放进入神经组织。然而，如果直接植入大脑或骨髓，这种方法是浸入性的且需要外科手术介入(sable等人，美国专利4,833,666)，这存在的问题是需要病人的同意，且通常仅仅是在大脑内随给予的药物一起进行定位输送，通常很快被排出(WO/2006/029845)。

为了克服这些局限，人们使用了药物载体系统，然而，靶标的药物传输的主要问题是通过网状内皮系统(RES)尤其是通过肝和脾的巨噬细胞的注射的载体的快速调理(opsonisation)和摄取。

因此，仍然需要一种有效的方法，以将大分子(如蛋白质)输送到大脑和眼中。具体而言，需要找到一种将大分子穿过血脑屏障的方法，所述大分子在进入大脑时仍能保留活性，以及还能提供所需要的释放动力学，保持蛋白质的稳定和活性，且能够回避清除机制。

附图说明

图1所示为通过动态光散射(DLS)获得的粒度数据，表明悬液中纳米粒子的存在。

图1(a)所示为通过动态光散射对纳米粒子悬液分析之后获得的相关图。

图1(b)所示为纳米粒子的多模态粒度分布(导出数据)，绘图以说明相对于粒度范围的粒子群(数量)的分布。

图1(c)所示为所示为纳米粒子的多模态粒度分布(导出数据)，绘图以说明相对于粒度范围的粒子群(数量)的分布。

图1(d)所示为所示为纳米粒子的多模态粒度分布(导出数据)，绘图以说明相对于粒度范围的粒子群(数量)的分布。

图2所示为用HIP方法获得的囊封的亮啡肽类似物(Dalargin)的量与通过普通方法在粒子表面吸收得到的量的对比。

图3所示为在输送HIP-PBCA纳米粒子之后脑中的亮啡肽类似物水平。仅当使用HIP方法在微粒中囊封时所述肽是可测量的。

图4所示为使用HIP方法在PBCA纳米粒子中对亮啡肽类似物的囊封。测定水相的pH对囊封效率的影响。

图5所示为使用HIP方法在PBCA纳米粒子中对抗鸡蛋溶菌酶结构域抗体的囊封。通过Edman测序分析纳米粒子。

图6所示通过SDS-PAGE分析以确认在HIP-PBCA纳米粒子中的dAb壳体化。将纳米粒子离心分离以除去任何游离的dAb并用SDS-PAGE分析颗粒以观察壳体化的dAb。

图7所示为通过SDS-PAGE分析以确认VEGA dAb(DOM15-26-593)载入HIP-PBCA纳米粒子。将纳米粒子制剂与dAb标准进行比较，以便确定在纳米粒子中存在的dAb的量。起始输入的12mg中总计3.31mg dAb已经在纳米粒子中壳体化。因此，载入效率为27.6％。dAb载入率为3.31％w/w。

图8所示为小鼠中含有域抗体的HIP PBCA纳米粒子通过静脉途径将它们载入的蛋白输送到脑中的能力的体内评估结果。在给药后10分钟，纳米粒子中的dAb形成可检测的脑吸收物，其量为8.0ng/ml。游离的dAb在脑中也可以检测到，其浓度较低，为3.3ng/ml(初始数据)。因此，纳米粒子似乎少量增加蛋白的脑吸收(初始数据)。在60分钟时，观察到相反的现象，因为游离的dAb似乎聚集在脑中，导致其脑水平进一步增加到13.5ng/ml。校正了脑水平。

图9所示为通过静脉途径从含有域抗体的HIP PBCA纳米粒子的体内评估中得到的dAb在脑和血液中的比例。结果显示，当和纳米粒子一起给予与给予在溶液中的游离dAb相比时，脑中存在的dAb比血液中存在的dAb的比例高。

图10所示为小鼠中含有域抗体的HIP PBCA纳米粒子通过静脉途径将它们载入的蛋白输送到大脑中的能力的体内评估结果。给药后10分钟，纳米粒子组中的dAb在脑中显示出高水平的dAb，平均值为627.60ng/ml。

图11所示为通过颈动脉途径从含有域抗体的HIP PBCA纳米粒子的体内评估中得到的dAb在脑和血液中的比例。纳米粒子组中的dAb显示了在两个时间点(在10和60分钟分别为1.569和1.845)处，脑与血液的比例大于1，表明大多数制备的dAb已成功地到达脑。

图12所示为通过光学显微镜对产生的微球体的确认。所有的微球体制剂都使用聚己酸内酯通过HIP方法生成。

(a)维生素E TPGS 2％表面活性剂4000rpm 2分钟20x mag

(b)维生素E TPGS 2％表面活性剂7500rpm 2分钟20x mag

(c)维生素E TPGS 2％表面活性剂7500rpm 2分钟+dAb1 20x mag

(d)维生素E TPGS 2％表面活性剂7500rpm 2分钟+dAb2 20x mag

图13所示为所示为通过激光衍射对产生的微球体的确认。所有的微球体制剂都使用聚己酸内酯通过HIP方法形成。

(a)维生素E TPGS 2％表面活性剂4000rpm 2分钟20x mag

(b)维生素E TPGS 2％表面活性剂7500rpm 2分钟20x mag

(c)维生素E TPGS 2％表面活性剂7500rpm 2分钟+dAb1 20x mag

(d)维生素E TPGS 2％表面活性剂7500rpm 2分钟+dAb2 20x mag

图14所示为通过SDS-PAGE分析对进入HIP-PC微球体的dAb壳体化的确认。过滤微球体，(F)离心过滤(3k或13k rpm)以除去游离的dAb和上清液(S)，以及小球(P)，并通过SDS-PAGE分析，以观察壳体化的dAb。

图15所示为通过SDS-PAGE分析对壳体化的dAb从HIP-PC微球体中的释放的确认。清洗微球体，接着在56℃下加热处理0、20、40或60分钟，以释放dAb、碎片小球(5分钟@5k)和上清液(S)，通过SDS-PAGE进行分析，以观察壳体化的dAb。

分子标记-参见Blue Plus 2预染色标准(invitrogen)，分子量(kd)，凝胶确认了已经有dAb释放出来。凝胶还确认了dAb是完整的，且由于释放方法，它们没有片段化。

发明内容

在本发明的一个方面中，提供一种在微粒载体中囊封生物活性剂的方法，如在纳米粒子中，或纳米粒子中和上，或用纳米粒子囊封蛋白和/或肽的方法，和通过在纳米粒子中，或纳米粒子中和上，或用纳米粒子囊封以输送蛋白和/或肽穿过血脑屏障的方法，以及通过在微粒载体中，或微粒载体中和上，或用微粒载体囊封以将蛋白和/或肽输送到眼中的方法。

在本发明的另一实施方式中，提供一种微粒载体，其包括粒子形成物质和生物活性剂如蛋白和/或肽，以将蛋白和/或肽从血液穿过血脑屏障输送到脑或输送到眼中。在本发明的再一实施方式中，提供纳米粒子的组合物以及它们在治疗中枢神经系统和/或眼的疾病或病症中的用途。

发明详述

本发明提供包括粒子形成物质和生物活性剂的微粒载体，以及所述微粒载体的制备方法。

在一个实施方式中，本发明提供一种在微粒载体中囊封生物活性剂的方法，包括以下步骤：

a)在疏水离子配对(HIP)试剂存在下使生物活性剂在有机溶剂中溶解；

b)使聚合物形成物质的单体和/或寡聚体溶解于(a)中的有机相中；

c)在连续水相中形成在(b)中形成的有机相的乳液，以使单体聚合；以及

d)得到从乳液中形成的微粒载体。

在本发明的另一个实施方式中，本发明提供一种在微粒载体中囊封生物活性剂的方法，包括以下步骤：

a)使在水相中的生物活性剂与在有机溶剂相中的疏水离子配对(HIP)试剂混合，以形成生物活性剂-HIP复合物；

b)从水相中分离复合物；

c)除去水相，并使复合物与有机相均化；

d)(i)使聚合物溶解于(c)中形成的有机相，然后在连续水相中形成有机相的乳液；或者

(ii)使聚合物形成物质的单体或寡聚物溶解于(c)中形成的有机相，然后在连续水相中形成有机相的乳液，以允许单体或寡聚体聚合形成聚合物；以及

e)得到从步骤(d)中的乳液中形成的微粒载体。

使用疏水离子配对试剂的这种方法允许生物活性剂如蛋白(如亲水蛋白)在疏水聚合物粒子的中心中囊封。疏水离子配对允许萃取出蛋白进入有机介质，因此，这种方法能用单乳液制备微粒载体。

在另一个实施方式中，本发明的微粒载体包含生物活性剂如蛋白或肽。所述蛋白可以是抗原结合分子，本文中使用的抗原结合分子是指抗体、抗体片段和能够结合靶标的其它蛋白结构。

抗原结合分子可包括域(domain)。“域”是折叠的蛋白结构，具有独立于余下的蛋白的三级结构。

一般地，域负责蛋白的离散的功能特性，在很多的情况下可加入、移除或转移到其它的蛋白上，而不会损失该蛋白和/或域的余下部分的功能。“单抗体可变域”是折叠的多肽域，其包括抗体可变域的序列特征。因此，它包括完整的抗体可变域和修饰的可变域，例如，其中的一个或多个环已经被非特征性的抗体可变域的序列取代，或者被截短或包括N或C末端延伸部分的抗体可变域取代，以及被可变域的折叠片段取代，所述折叠片段至少保留全长域的结合活性和特异性。

抗原结合分子可包括至少一个免疫球蛋白可变域，例如，这些分子可包括抗体、域抗体、Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、ScFv、双特异抗体、异源结合抗体。这些抗原结合分子能结合单个的靶标，或可以是多特异性的，即结合多个靶标，如它们可以是双特异性的或三特异性的。在一个实施方式中，所述抗原结合分子是抗体。在另一实施方式中，所述抗原结合分子是域抗体(dAb)。在又一实施方式中，所述抗原结合分子可以是抗体和抗原结合片段的组合物，例如连接到单克隆抗体的一个或多个dAb和/或一个或多个ScFv。在又一实施方式中，所述抗原结合分子可以是抗体和肽的组合物。抗原结合分子可包括至少一个非Ig结合域，例如特异性地结合独立于不同V区或域的抗原或表位的域，这可以是dAb，例如人、骆驼或鲨鱼的免疫球蛋白单可变域，或者它可以是这样的域，其选自以下的支架的衍生物：CTLA-4(Evibody)、脂笼蛋白(Lipocalin)、蛋白A衍生的分子如蛋白A的Z-域(亲和蛋白体，SpA)、A-域(Avimer/Maxibody)、热休克蛋白如GeoEI和GroES、转铁蛋白(穿膜抗体)、锚蛋白重复蛋白(DARPin)、肽适体、C型凝集素域(四连接素)、人晶体蛋白和人泛素(亲和物)、PDZ域、人蛋白酶抑制剂的的蝎毒kunitz型域、以及纤连蛋白(adnectin)；其已经用于蛋白工程，以便使其与配体而非与天然的配体结合。

CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4)是主要在CD4+T细胞上表达的CD28家族受体。它的胞外域是可变域状的Ig折叠。对应于抗体的CDR的环可用异源序列取代，以赋予不同的结合特性。业已知道，经工程改造成具有不同结合特性的CTLA-4分子是Evibody。进一步详细的内容请参见免疫学方法杂志248(1-2)，31-45(2001)。

脂笼蛋白是转运小疏水分子如类固醇、后胆色素、类视黄醇和脂质的胞外蛋白家族。它们具有刚性折叠的二极结构，其在圆锥形结构的开始端具有很多的环，可以经工程改造以结合不同的靶标抗原。Anticalin的大小在160-180个氨基酸之间，并源自脂笼蛋白。进一步详细的内容参见Biochim Biophys Acta 1482：337-350(2000)，US7250297B1和US20070224633。

亲和体是源自能经工程改造以结合抗原的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的蛋白A的支架。该域由三螺旋束的约58个氨基酸组成。通过表面残基的随机化产生库。进一步详细的内容参见Protein Eng.Des.Sel.17，455-462(2004)和EP1641818A1。

Avimer是源自A-域支架家族的多域蛋白。约35个氨基酸的天然域采用限定的二硫化物键合结构。通过慢慢移动由A域家族展现的天然变异可产生多种变化。进一步详细的内容参见Nature Biotechnology 23(12)，1556-1561(2005)和Expert Opinion on Investigational Drugs 16(6)，909-917(2007年6月)。

转铁蛋白是单体血清转运糖蛋白。通过在允许的表面环中插入肽序列，转铁蛋白可以经工程改造以结合不同的靶标抗原。工程改造的转铁蛋白支架的例子包括穿膜抗体(trans-body)。进一步详细的内容参见J.Biol.Chem 274，24066-24073(1999)。

设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)源自锚蛋白，其为一种蛋白家族，用于将整合膜蛋白的附属部分介导至细胞骨架上。单个的锚蛋白重复是由双螺旋和a转角组成的33个残基基序。通过随机化每个重复的第一螺旋和a-转角中的残基，它们可经改造以结合不同的靶标蛋白。通过增加单元的数量(亲和力成熟的方法)，可增加结合界面。进一步详细的内容参见J.Mol.Biol.332，489-503(2003)，PNAS 100(4)，1700-1705(2003)和J.Mol.Biol.369，1015-1028(2007)以及US20040132028A1。

纤连蛋白是一种能改造以结合抗原的支架。Adnectin由人的III型纤连蛋白(FN3)的15个重复单元的第十域的天然氨基酸序列的主链组成。夹心结构的一端的三个环可改造成使Adnectin特异性地识别感兴趣的治疗靶标。进一步详细的内容参见Protein Eng.Des.Sel.18，435-444(2005)、US20080139791、WO2005056764和US6818418B1。

肽适体是由连续的支架蛋白组成的组合识别分子，一般是含有在活性位点插入的限制性的可变肽环的硫氧还蛋白(TrxA)。进一步详细的内容参见ExpertOpin.Biol.Ther.5，783-797(2005)。

微体源自天然生成的长度为25-50个氨基酸的微蛋白，包含3-4个半胱氨酸桥，微蛋白的例子包括KalataB1和芋螺毒素(conotoxin)和结蛋白(knottins)。微蛋白具有能够改造成包括多达25个氨基酸的环，且不影响微蛋白的整体折叠。改造的结蛋白域的进一步详细内容，参见WO2008098796。

其它的非Ig结合域包括已用作支架以改造不同靶标抗原结合特性的蛋白，包括人晶体蛋白和人泛素(亲和结合体)，人蛋白酶抑制剂的kunitz型域、Ras-结合蛋白AF-6的PDZ域、蝎毒素(北非蝎毒素)，C型凝集素域(四连蛋白)，其在Non-Antibody Scaffolds from Handbook of Therapeutic Antibodies(2007，Stefan Dubel编辑)的第7章和Protein Science 15：14-27(2006)中有综述。本发明的非Ig结合域可源自任意的这些可替代的蛋白域。

在本发明的一个实施方式中，所述抗原结合分子结合到在中枢神经系统中发现的靶标中，例如脑或脊髓中或者例如神经组织中。

在本文描述的本发明的再一实施方式中，抗原结合分子特异性地结合到已知与神经疾病或病症相关的靶标中，例如MAG(髓鞘相关糖蛋白)、NOGO(神经突起生长抑制蛋白)或β-淀粉样蛋白。

这些抗原结合分子包括能够结合NOGO(如抗-NOGO抗体)的抗原结合分子。用于本发明的的抗-NOGO抗体的一个例子是由SEQ ID NO 1的重链和SEQ ID NO 2的轻链限定的抗体，或包含SEQ ID NO 1和2所示的抗体的CDR的抗-NOGO抗体或其抗原结合片段。该抗体(H28L16)的进一步详细的内容可在PCT申请WO2007068750中找到，其内容纳入本文中作为参考。

这种抗原结合分子包括能够结合MAG(如抗-MAG抗体)的抗原结合分子。用于本发明的抗-MAG抗体的一个例子是由SEQ ID NO 11的重链可变区和SEQ ID NO 12的轻链可变区限定的抗体，或包含SEQ ID NO 1和2所示的抗体的CDR的抗-MAG抗体或其抗原结合片段。该抗体(BvH1CvL1)的进一步详细的内容可在PCT申请WO2004014953中找到，其内容纳入本文中作为参考。

这种抗原结合分子包括能够结合β-淀粉样蛋白(如抗β-淀粉样蛋白抗体)的抗原结合分子。用于本发明的抗β-淀粉样蛋白抗体的一个例子是由SEQ ID NO 5的重链和/或SEQ ID NO 6的轻链限定的抗体，或包含SEQ ID NO 5和6所示的抗体的CDR的抗-β-淀粉样蛋白抗体或其抗原结合片段。该抗体(H2L1)的进一步详细的内容可在PCT申请WO2007113172中找到，其内容纳入本文中作为参考。用于本发明的可替代的抗β-淀粉样蛋白抗体是由SEQ ID NO 7的重链和/或SEQ ID NO 8的轻链限定的抗体，或包含SEQ ID NO 7和8所示的抗体的CDR的抗-β-淀粉样蛋白抗体或其抗原结合片段。

这种抗体的CDR序列可由以下方法确定：Kabat编号系统(Kabat等人；Sequences of proteins of Immunological Interest NIH，1987)、Chothia编号系统(Al-Lazikani等人，(1997)JMB 273，927-948)、接触定义方法(MacCallum R.M.，和Martin A.C.R.和Thornton J.M，(1996)，Journal of Molecular Biology，262(5)，732-745)或本领域的技术人员已知的对抗体的残基编号并确定CDR的任何其它确定的方法。

在本发明的一个实施方式中，该抗原结合蛋白结合到眼中的靶标中，例如TNF、TNFr-1、TNFr-2、TGFβ受体-2、VEGF、NOGO、MAG、IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、IL-17、CD20、β-淀粉样蛋白、FGF-2、IGF-1、PEDF、PDGF或补体因子，如C3、C5、C5aR、CFD、CFH、CFB、CFI、sCR1或C3。

在本发明的另一实施方式中，该抗原结合蛋白结合VEGF。在本发明的另一个可替代的实施方式中，该抗原结合蛋白结合β-淀粉样蛋白。

在本发明的一个实施方式中，所述微粒载体可以是微球体或纳米粒子。在一个这样的实施方式中，所述微粒载体是纳米粒子，且生物活性剂是蛋白。在另一实施方式中，所述微粒载体是纳米粒子，且生物活性剂是肽。在又一实施方式中，所述微粒载体是纳米粒子，且生物活性剂包含抗原结合分子，如域抗体或抗体。在又一实施方式中，所述微粒载体是纳米粒子，且生物活性剂包含域。在另一实施方式中，所述微粒载体是微球体，且生物活性剂是蛋白。在又一实施方式中，所述微粒载体是微球体，且生物活性剂是肽。在又一实施方式中，所述微粒载体是微球体，且生物活性剂包含抗原结合分子，如域抗体或抗体。在再一实施方式中，所述微粒载体是微球体，且生物活性剂包含域。

在本发明的一个实施方式中，其提供包括本发明所述的方法制备的纳米粒子的组合物。在另一实施方式中，当用动态光散射技术测量时，数量上至少约90％的纳米粒子在约1nm-约1000nm之间的范围内。在又一实施方式中，当用动态光散射技术测量时，数量上至少约90％的纳米粒子在约1nm-约400nm之间，或约1nm-约250nm之间，或约1nm-约150nm之间，或约40nm-约250nm之间，或约40nm-约150nm之间，或约40nm-约100nm之间的范围内。

在本发明的又一实施方式中，当用动态光散射技术测量时，数量上至少约90％的纳米粒子在约40nm-约250nm之间的范围内。

在本发明的又一实施方式中，当用动态光散射技术测量时，数量上至少约90％的纳米粒子在约40nm-约150nm之间的范围内。

在本发明的又一实施方式中，其提供一种包括本发明的纳米粒子的组合物，其中当用动态光散射技术测量时，组合物中的纳米粒子的粒径中间值小于约1000nm，例如粒径小于约400nm，例如粒径小于约250nm，例如粒径小于约150nm。

在另一实施方式中，组合物中的纳米粒子的粒度中间值为约40nm-约250nm。

在另一实施方式中，组合物中的纳米粒子的粒度中间值为约40nm-约150nm。

在本发明的一个实施方式中，其提供包括本发明所述的任一种方法制备的微球体的组合物。在另一实施方式中，当用小角激光光散射技术测量时，数量上至少约90％的微球体的直径在约1μm-约100μm之间的范围内。在又一实施方式中，当用小角激光光散射技术测量时，数量上至少约90％的粒子在约1μm-约80μm之间，或在约1μm-约60μm之间，或在约1μm-约40μm之间，或在约1μm-约30μm之间，或在约1μm-约10μm之间的范围内。

在另一实施方式中，当用小角激光光散射技术测量时，数量上至少约90％的微球体在约1μm-约60μm之间的范围内。

在另一实施方式中，当用小角激光光散射技术测量时，数量上至少约90％的微球体在约1μm-约30μm之间的范围内。

在本发明的又一实施方式中，其提供一种包括本发明的微球体的组合物，其中当用小角激光光散射技术测量时，组合物中的微球体的粒径中间值小于约100μm，例如粒径小于约80μm，例如粒径小于约60μm，例如粒径小于约40μm。

在另一实施方式中，组合物中微球体的粒度中间值为约1μm-约6μm或1μm-约30μm。

在本发明的另一实施方式中，所述微粒载体在超过至少3个月或更长的时间内，或长达6个月或更长的时间或者长达12个月或更长的时间内持续释放治疗量的活性生物分子。

在一个实施方式中，在没有疏水离子配对试剂存在时，所述生物活性剂不溶于有机相。

在本文所述的本发明的一个实施方式中，当蛋白是阴离子时，疏水离子配对试剂是阳离子HIP试剂。在另一实施方式中，当蛋白是阳离子时，疏水离子配对试剂是阴离子HIP试剂。在又一实施方式中，阴离子HIP试剂选自：烷基季铵盐阳离子，优选烷基溴化铵，更优选四丁基溴化铵、四己基溴化铵、四辛基溴化铵、十二烷基硫酸钠(SDS)、油酸钠或多库脂钠(aka Aerosol OT^TM)，且HIP试剂以化学计量等于或大于蛋白上的净正电荷的数量的的量存在。在另一实施方式中，阳离子HIP试剂选自：二甲基二(十八烷基)溴化铵(DDAB18)、1，2-二油酰基氧基-3-三甲铵丙烷(DOTAP)、或十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，且HIP试剂以化学计量的量等于或大于蛋白上的净负电荷的量存在。

在进一步的实施方式中，任何疏水阳离子或阴离子可潜在地用作HIP试剂以溶解蛋白。疏水离子配对(HIP)包含带有类似电荷种类，但是不容易被溶剂化的极性平衡离子的化学计量取代。如本文所述，本发明提供一种使用HIP改变蛋白溶解性的方法，这允许萃取蛋白进入有机溶剂中，例如二氯甲烷中。多库脂钠(双(2-乙己基)琥珀酸酯磺酸钠)是合适的离子配对试剂的一个例子。在一个实施方式中，使含有多库脂钠的二氯甲烷与水性蛋白溶液混合。这导致多库酸酯离子与蛋白形成离子对，并随后隔开蛋白进入油相。蛋白分散于二氯甲烷中使得蛋白被囊封在通过单水包油乳化法制备的纳米粒子或微球体中。

在本文所述的本发明的一个实施方式中，当蛋白是阴离子型，而HIP试剂是阳离子型时，连续水相的pH为约7.0或更高，例如，pH可以是至少约8.0或至少约10.0或至少约12.0。

在本文所述的本发明的另一个替代性的实施方式中，当蛋白是阳离子型，而HIP试剂是阴离子型时，连续水相的pH为约7.0或更低，例如，pH可以是小于约6.0或小于约4.0或小于约2.0。

在这样的一个实施方式中，蛋白与聚合物的重量/重量比(w/w)可以是0.5％-90％，例如是至少约0.5％，或至少约1％，或至少约2％，或至少约2.5％，或至少约5％，或至少约9％，或至少约10％，或至少约15％，或至少约20％，或至少约40％，或至少约50％，或至少约60％，或至少约70％，或至少约80％或至少约90％。例如，当蛋白是肽时，该肽与聚合物的比率可以是至少约9％，当蛋白是抗体时，该抗体与聚合物的比率可以至少是约2％，或当蛋白是域抗体时，该域抗体与聚合物的比率可以至少是约2.5％。

在本发明的一个实施方式中，蛋白与总制剂(聚合物+HIP和可选的表面活性剂)的w/w比可以是0.5％-50％，例如是至少约5％，或至少约9％，或至少约15％，或至少约16％，或至少约20％或至少约25％。例如，当蛋白是肽时，该肽与总制剂的重量比可以是至少约16％，或蛋白是抗体时，抗该体与聚合物的重量比可以是至少约1％，或当蛋白是域抗体时，该域抗体与总制剂的重量比可以是至少约9％。

在本发明的一个实施方式中，粒子的囊封效率是至少约1％，或至少约2％，或至少约10％，或至少约20％，或至少约40％，或至少约50％，或至少约60％，或至少约70％，或至少约80％，或至少约90％，或至少约95％，或至少约97％，或至少约99％。例如，当蛋白是肽时，囊封效率可以是至少约90％，当蛋白是抗体时，囊封效率可以是至少约1％，或当蛋白是域抗体时，囊封效率可以是至少约70％。

在本发明的一个实施方式中，单体或寡聚体选自：甲基丙烯酸甲酯、氰基丙烯酸烷基酯、甲基丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸、二甲基丙烯酸乙二醇酯、丙烯酰胺、N，N’-亚甲基双丙烯酰胺和甲基丙烯酸2-二甲胺乙酯。在进一步的实施方式中，该单体是氰基丙烯酸烷基酯，如氰基丙烯酸丁酯(BCA)。

在又一实施方式中，用于本文所述的任一方法中的聚合物选自但不限于以下物质：聚-L-交酯(PLA)、聚(丙交酯-乙交酯)共聚物(PLG)、聚交酯、聚己酸内酯、聚羟基丁酸酯和/或其共聚物。合适的粒子形成物质包括但不限于：聚二烯烃如聚丁二烯等；聚烯烃类如聚乙烯、聚丙烯等；聚丙烯酸类如聚丙烯酸等；聚甲基丙烯酸类如聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸羟乙酯等；聚乙烯醚类、聚乙烯醇类、聚乙烯酮类、聚乙烯基卤化物如聚氯乙烯等；聚乙烯腈类；聚乙烯酯类如聚乙酸乙烯酯等、聚乙烯吡啶类如聚(2-乙烯基-吡啶)、聚(5-甲基-2-乙烯吡啶)等；聚苯乙烯类；聚碳酸酯类；聚酯类；聚原酸酯类；聚酯酰胺类(polyesterarnides)；聚酸酐类；聚氨酯类；聚酰胺类；纤维素醚类如甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素等；纤维素酯类如醋酸纤维素、邻苯二甲酸醋酸纤维素、醋酸丁酸纤维素等；多糖、蛋白质、凝胶、淀粉、胶、树脂等等。这些材料可单独使用，作为物理混合物(共混物)或作为共聚物使用。还共混聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丁基氰基丙烯酸酯、聚烷基氰基丙烯酸酯、聚芳基酰胺、聚酸酐、聚原酸酯、N，N-L-赖氨酸二基对苯二甲酸酯、聚酸酐、去溶剂化的生物活性剂或碳水化合物、多糖、聚丙烯醛、聚戊二醛及其衍生物、共聚物和聚合物。

适合用于本发明的方法的有机溶剂的例子包括但不限于：不溶于水的酯如乙酸乙酯、乙酸异丙酯、乙酸正丙酯、乙酸异丁酯、乙酸正丁酯、异丁酸异丁酯、2-乙基乙酸己酯、乙二醇二乙酸酯；不溶于水的酮如甲基乙基酮、甲基异丁基酮、甲基异戊基酮、甲基正戊基酮、二异丁基酮；不溶于水的醛如乙醛、正丁醛、巴豆醛、二乙基己醛、异丁醛和丙醛；不溶于水的醚酯如3-乙氧基丙酸乙酯；不溶于水的芳香烃如甲苯二甲苯和苯；不溶于水的卤代烃如1，1，1-三氯乙烷；不溶于水的乙醇醚酯如丙二醇单甲醚醋酸酯、乙二醇单乙醚醋酸酯、乙二醇单丁醚醋酸酯、二乙二醇单丁醚醋酸酯；不溶于水的邻苯二甲酸增塑剂如邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二辛酯、对苯二甲酸二辛酯、辛基邻苯二甲酸丁酯、邻苯二甲酸丁基苄酯、邻苯二甲酸烷基苄酯；不溶于水的增塑剂如己二酸二辛酯、乙二醇二-2-乙基己酸三乙烯酯、偏苯三酸三辛酯、三醋酸甘油酯、甘油基/三丙酸菌素(glyceryl/tripropionin)、2，2，4-三甲基-1，3-戊二醇二异丁酸酯、二氯甲烷、乙酸乙酯或二甲基亚砜、四氯化碳、氯仿、环己烷、1，2-二氯乙烷、二氯甲烷、二乙醚、二甲基甲酰胺、庚烷、己烷或其它的烃；甲基叔丁基醚、戊烷、甲苯、2，2，4-三甲基戊烷、1-辛醇及其异构体或苯甲醇。

在本发明的一个实施方式中，用于本发明的方法的溶剂选自：二氯甲烷、乙酸乙酯或二甲基亚砜、四氯化碳、氯仿、环己烷、1，2-二氯乙烷、二氯甲烷、二乙醚、二甲基甲酰胺、庚烷、己烷或其它的烃；甲基叔丁基醚、戊烷、甲苯、2，2，4-三甲基戊烷、1-辛醇及其异构体或苯甲醇。

本文所述的本发明的所有方面的微粒载体、包含它们的组合物或它们的制备方法可进一步包括加入表面活性剂，其例如但不限于：胆酸钠、泊洛沙姆188(poloxamer)(pluronic F68^TM，或F127)、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚山梨醇酯80、葡聚糖、泊洛沙姆、poloxamines、多功能醇的羧酸酯类、烷氧基化醚类、烷氧基酯类、烷氧基化甘油单、二、三酯类、烷氧基酚类以及联苯酚类、乙氧基醚类、乙氧基酯类、乙氧基甘油三酸酯类、GenapolR^TM和BaukiR^TM系列的物质、脂肪酸的金属盐、羧酸的金属盐、醇硫酸金属盐以及脂肪醇硫酸金属盐和磺基琥珀酸金属盐以及两种或更多种上述物质的混合物。

在又一实施方式中，所述表面活性剂选自：胆酸钠、泊洛沙姆188(pluronic F68^TM)、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚山梨醇酯80和葡聚糖。

在本发明的一个实施方式中，其提供包含生物活性剂的微粒载体，其可由本文所述的本发明的任意方法制备。

囊封在本发明的微粒载体和/或组合物内的生物活性剂在它从微粒载体释放时保留至少一些生物活性，例如，当药剂是结合的药剂并对生物活性剂从粒子中释放产生生物应答时，该组合物中的一定比例的分子可保留至少一些结合它们的靶标的能力。可用合适的生物结合测定测量这样的结合，合适的测定的例子包括但不限于ELISA或Biacore^TM。在另一实施方式中，当通过生物活性测定对粒子的释放进行测量时，例如在一个实施方式中通过ELISA、Biacore测量时，组合物保留至少50％它对靶标的亲和力，或对靶标保留至少70％或至少90％的亲和力(Kd)。在一个实施方式中，组合物能够在给药的对象中引出治疗效果。本发明的组合物的生物活性可通过任意合适的测定进行测量，其测量的是囊封的生物活性分子的活性，例如当生物活性分子是VEGF dAb时，可使用实施例18记载的测定。

在另一个实施方式中，其提供一种包含囊封在本文所述的本发明的微粒载体中的生物活性剂的药物组合物。

在另一个实施方式中，其提供一种包含囊封在本文所述的本发明的纳米粒子中的蛋白的药物组合物。

在另一个实施方式中，本发明的组合物可用来治疗和/或预防涉及微粒载体穿过血脑屏障的疾病或病症。

在另一个实施方式中，本文所述的本发明的组合物可用来治疗和/或预防中枢神经系统的疾病或病症，例如可用来治疗和/或预防阿尔茨海默病、亨廷顿舞蹈症、牛海绵状脑病、西尼罗河病毒性脑炎、神经艾滋病、脑损伤、脊髓损伤、转移性脑癌、多发性硬化、中风。

在另一个实施方式中，所述组合物可包含抗MAG-抗体，以治疗和/或预防中风或神经损伤。

在另一个实施方式中，所述组合物可包含抗-NOGO-抗体，以治疗和/或预防中风或神经损伤，或者例如治疗或预防神经退化性疾病如阿尔茨海默病。

在另一个实施方式中，所述组合物可包含抗-β-淀粉样蛋白抗体，以治疗和/或预防中风或神经损伤，或者例如治疗或预防神经退化性疾病如阿尔茨海默病。

在本文所述的本发明的一个实施方式中，所述微粒载体可通过肠胃外注射或输注、静脉或动脉给药的方式给予患者。

在另一个实施方式中，本文所述的本发明的组合物可用来治疗和/或预防眼睛疾病或病症。在另一个实施方式中，本文所述的本发明的组合物可用来治疗和/或预防疾病，其例如但不限于年龄相关的黄斑变性(新生血管/湿的)、糖尿病性视网膜病变、视网膜静脉闭塞症、葡萄膜炎、角膜新生血管形成或青光眼。

在另一个实施方式中，所述组合物可用来治疗和/或预防AMD(年龄相关的黄斑变性)，例如湿性AMD或干性AMD。

在本发明的另一个实施方式中，其提供一种囊封在本文所述的纳米粒子和/或微球体中的生物活性剂，用作药物。

在本发明的一个实施方式中，其提供本文所述的本发明的组合物在制备治疗和/或预防中枢神经系统疾病的药物中的用途。在另一个实施方式中，本发明提供本文所述的本发明的组合物在制备治疗和/或预防阿尔茨海默病的药物中的用途。在又一个实施方式中，本发明提供本文所述的本发明的组合物在制备治疗和/或预防中风或神经损伤的药物中的用途。

在本发明另一个实施方式中，提供本文所述的本发明的组合物在制备治疗或预防眼病的药物(如在制备治疗和/或预防AMD的药物)中的用途。

本发明提供使用本发明的组合物治疗和/或预防中枢神经系统疾病的方法。在另一个实施方式中，本发明提供使用本发明的组合物治疗阿尔茨海默病的方法。在另一个实施方式中，本发明提供使用本发明的组合物治疗和/或预防中风或神经损伤的方法。

本发明还提供使用本发明的组合物治疗和/或预防眼病的方法。在另一个实施方式中，本发明提供使用本发明的组合物治疗和/或预防AMD的方法。

定义

本文使用的术语“粒子形成的物质”用来描述任意的能够聚合的单体和/或寡聚体，或能形成不溶于水性环境中的粒子的聚合物，如PBCA、PLGA。在未聚合时，该粒子形成物质可溶于有机溶剂中。

本说明书全文使用的术语“微粒载体”用于包含纳米粒子和微球体。“微球体”是由直径大于1μm的各种天然和合成的材料组成的粒子，而本文使用的“纳米粒子”是亚微米级的粒子，如1-1000nm。

在一个实施方式中，本文使用的术语微粒载体、纳米粒子和微球体具有载体结构，其具有生物相容性且足以抵抗使用环境导致的化学和/或物理损坏，以至于在给药进入人或动物体之后，足量的粒子基本上保持完整，并能保持足够的时间，以便能够到达所需要的靶器官或组织，如脑或眼睛。

本文所使用的术语“生物活性剂”是用于表示当到达它们应到的靶标时，该分子必须能够至少部分具有生物活性的术语。为避免术语“生物活性剂”和“生物活性分子”在本说明书全文中重复使用表示歧义，两个术语表示相同的含义，且能够互换。

术语“溶解”定义为形成溶剂中的单独分子形式的溶液，或形成液体悬液中的固体，其形式为分子微小固体聚集块悬浮于液体中。溶解过程也可以得到完全溶解的分子和悬浮的固体聚集块的混合物。

整份说明书中所使用的用于在微粒载体中囊封的术语“蛋白”包括分子量至少为11kDa、或至少12kDa、或至少50kDa、或至少100kDa、或至少150kDa或至少200kDa的蛋白。囊封用的蛋白也可以有很长的长度，例如至少为70个氨基酸的长度或至少为100个氨基酸的长度或至少为150个氨基酸的长度或至少为200个氨基酸的长度。

整份说明书中所使用的用于在微粒载体中囊封的术语“肽”包括较短序列的氨基酸，其分子量不大于约10kDa、或不大于约8kDa、或不大于约5kDa、或不大于约2kDa或不大于约1kDa或小于1kDa。囊封用的肽的长度不超过70个氨基酸的长度或不超过50个氨基酸的长度或不超过40个氨基酸的长度、或不超过20个氨基酸的长度、或小于10个氨基酸的长度。

术语“眼周”是指局部给药至眼外周的位置，其包括但不限于：“结膜下”-结膜的下面-在巩膜上覆盖整个眼球的的清澈的黏液膜；“筋膜下”-包裹眼睛的筋膜的下面但在巩膜外面；“眼球周围”-眼球下的空间，其中眼球位于眼框中；“眼球后”-眼球正后方的空间，邻近视神经；“脉络膜上层”-巩膜的下面，但在脉络膜进入脉络膜上层空间的外部；“经巩膜”-该术语也用来指输送通过，即从巩膜的外部通过。

短语“免疫球蛋白单可变域”是指特异性地结合到独立于不同V区或域的抗原或表位的抗体可变域(V_H、V_HH、V_L)。免疫球蛋白单可变域可以与其它不同的可变区或可变域的形式(例如同源或异源多聚体)存在，其中，通过单个免疫球蛋白可变域的抗原结合不需要所述的其它的区或域(即免疫球蛋白单可变域独立于其它的可变域结合抗原)。“域抗体”或“dAb”与本文所使用的术语能够结合抗原的“免疫球蛋白单可变域”一致。免疫球蛋白单可变域可以是人抗体可变域，但是也包括其它物种的单抗体可变域，如啮齿目动物(例如在WO 00/29004中揭示的铰口鲨和骆驼V_HH dAbs)。骆驼V_HH是源自包括骆驼、美洲驼、羊驼、单峰骆驼和骆马的物种的免疫球蛋白单可变域多肽，其产生天然地缺少轻链的重链抗体。这种V_HH域可根据本领域中的标准技术进行人源化处理，根据本发明，这种域仍然被认为是“域抗体”。本文使用的“V_H包括骆驼V_HH域”。

本文使用的术语“抗原结合分子”是指抗体、抗体片段和能够结合到靶标的其它蛋白结构。

“域”是折叠蛋白结构，具有独立于余下的蛋白的三级结构。一般地，域负责蛋白的离散的功能特性，在很多的情况下可加入、移除或转移到其它的蛋白上，而不损失该蛋白和/或域的余下部分的功能。“单抗体可变域”是折叠的多肽域，其包括抗体可变域的序列特征。因此，它包括完整的抗体可变域和修饰的可变域，例如，其中的一个或多个环已经被非特征性的抗体可变域的序列取代，或者被截短或包括N或C末端延伸部分的抗体可变域，以及可变域的折叠片段取代，所述折叠片段至少保留结合活性和全长域的特异性。

本文使用的术语“光散射技术”是指用来确定溶液中的小粒子的粒度分布特征的方法-光散射技术的一个例子是可用来测量纳米粒子的动态光散射，光散射的另一例子是可用于测量微球体的静态光散射或小角度光散射。

本位使用的术语“动态光散射”(DLS)是使用通过粒子分散利用散射光以得出粒度的信息的方法。动态光散射取决于这样的事实，即当在液体悬液中时，粒子的Browian运动依赖粒度，且粒子的Browian运动使来自粒子样品的散射光的强度产生波动。通过相关的函数分析这些波动，以得出粒径。接着利用斯托克斯-爱因斯坦方程算出粒子的平均流体力学直径。

“多指数分析”可得出粒度分布，可确定不同样品内部的不同物种的存在。DLS通常可用于纳米粒子的分析。

整份说明书中可换用的术语“静态光散射”或“小角度激光光散射”有时是指激光衍射。激光衍射依赖的是衍射角与粒度成反比的事实。该方法使用全米氏理论，其完全解答了光与物质的相互作用的方程。激光衍射可用来分析纳米粒子和微粒子(直径为0.02-2000微米)。

本文使用的术语“血脑屏障”(BBB)是指主要保护脑不受血液中的化学物质影响，但仍允许基础代谢功能的膜结构。它由脑微血管内皮细胞组成，其在脑毛细血管中紧密聚集。与身体其它任何部位的毛细血管的内皮细胞相比，这种较高的密度更能限制物质从血流通过。

在整篇说明书中，药物载入的百分比定义为在粒子制剂中使用的每份物料的重量(聚合物重量)中含有的药剂的重量百分比w/w。

药物载入％＝(药物重量/粒子制剂中使用的物料重量)x100％。

在整篇说明书中，参考多个实施方式以清楚简洁的语言描述了本发明。应该理解的是，在不脱离本发明的范围内实施方式可有多种组合或者分开使用。

实施例

实施例1 通过HIP方法制备PBCA纳米粒子

通过在含有溶解的HIP离子(在1ml二氯甲烷中的多库酯钠，3.058-6.116％w/v)的有机相中加入100μl BCA单体以制备纳米粒子。将得到的溶液经移液器移入水相(1％w/v葡聚糖，0.2％pluronic F68，10ml，pH7.0)中，使用Silveron L4RT均化器以7000的速度进行均化处理。接触中性pH的水相使BCA单体快速聚合形成PBCA聚合物。将形成的乳液均化处理45秒，接着在通风橱中孵育3小时，使有机相蒸发并形成纳米粒子。将得到的纳米粒子悬液在4℃下储存。

实施例2 通过动态光散射确认纳米粒子形成

使用动态光散射(DLS)通过测量粒度来确认经HIP方法形成的PBCA纳米粒子。使用Brookhaven仪器公司微粒粒度分析仪(BIC 90plus)来分析粒子。图1所示为经DLS得到的粒度数据，表明悬液中有纳米粒子存在。通过DLS得到的粒度表明形成了平均流体力学直径为291.4nm的纳米粒子(图1a)。也发现粒子群是相对单分散的，而测量样品中的粒度范围有多宽的多分散指数为0.242(图1a)。这低于粒子制剂的最大的可接受值0.300。一般而言，该相关图确认了粒子制备方法已经成功地产生了高质量的PBCA纳米粒子悬液。

得到的数据表明大多数的粒子是小的(图1b-d)。结果表示，约96.3％的粒子群的直径为210.37nm或更小(图1b)。还发现悬液似乎也没有大的聚集块，且不含有直径大于732.05nm的任何粒子，大多数的粒子群显然更小(图1c)。此外，该制剂看来还不含直径小于143.38nm的任何粒子(图1d)。因此，大多数粒径在143.38nm-210.37nm之间，一种静脉给药的安全粒度，但不是非常的小，以至于减小药物加载的效率。

图1(a)-通过动态光散射对纳米粒子悬液分析后获得的相关图。根据得到的数据，粒子的平均流体力学直径为291.4nm，多分散指数为0.242。

图1(b)-纳米粒子的多模态粒度分布(得到的数据)，绘图以描述粒子群(数量)相对于粒度范围的分布。数据表明96.3％的粒子群的直径似乎为201.37nm或更小。

图1(c)-纳米粒子的多模态粒度分布(得到的数据)，绘图以描述粒子群(数量)相对于粒度范围的分布。数据表明96.3％的直径为201.37nm或更小，100％的粒子样品的直径为732.05nm或更小。因此，悬液中没有发现大的聚集块，且因而认为对静脉给药是安全的。

图1(d)-纳米粒子的多模态粒度分布(得到的数据)，绘图以描述粒子群(数量)相对于粒度范围的分布。数据表明6.2％的粒子样品直径为143.38nm或更小。

当制备不同的纳米粒子制剂时，还发现该方法得到了相似的纳米粒子粒度。表1总结了一系列的从6个不同的组合物制剂得到的粒度数据：

一般而言，业已发现HIP方法制备了具有所需要的粒径和多分散性的纳米粒子悬液。

实施例3 使用HIP方法将肽溶于有机相中并囊封入PBCA纳米粒子中

通过将30-60mg的肽溶于3ml CaCl₂(18.3mM)中并加入浓盐酸(2M)将pH降至3.05，以制备六肽亮啡肽类似物溶液。将得到的溶液(500μl，10-20mg/ml，肽的总量为5-10mg)加入装在2ml埃彭道夫管中的在二氯甲烷中的HIP试剂多库酯钠的溶液中(1ml，3.058-6.116％w/v)。所用的HIP溶液的体积是肽溶液的2倍(1ml HIP相对于500μl肽溶液)。5mg肽时，HIP：肽的摩尔比为10∶1，10mg肽时，为5∶1。以最大的速度将有机相和水相涡旋混合1分钟。接着以20817rcf离心分离得到的悬液，以分离两相，进行50分钟。收集有机层(含有溶解的肽)并用来制备纳米粒子。

为了确认所述的方法将溶解的肽成功地融入有机相中，测定在水相中剩余的肽的量。经LC-MS分析和Edman测序表明至少99％的肽已经成功地萃取进入有机相中。

实施例4 在PBCA纳米粒子中囊封肽

通过将100μl BCA单体加入含有溶解的肽和HIP(1ml)的有机相中制备纳米粒子。将得到的溶液转移到有机相(1％w/v葡聚糖，0.2％w/v pluronic F68，10ml，pH7.0)中，使用Silveron L4RT均化器以7500的速度进行均化处理(精细乳化筛，3/4英寸探针)。接触中性pH的水相将使BCA单体快速聚合形成PBCA聚合物。将形成的乳液均化处理45秒，接着在通风橱中孵育并搅拌(IKA磁搅拌棒，速度设为4)1小时，以蒸发有机相。接着将设定的速度降到3，进一步将制剂孵育2小时，以确保有机相的蒸发和纳米粒子的形成。收集纳米粒子悬液并在储存在4℃下。

将得到的纳米粒子离心分离以除去任何游离的肽并重新悬浮在水中或PBS中。

通过LC-MS分析粒子以确定囊封效率。发现即使使用较高的肽量(10mg)时，也有近90％的肽的剂量被囊封。将用HIP方法得到的囊封的肽的量与在粒子表面吸收的普通方法得到的那些量进行比较，清楚地表明HIP-PBCA方法的优越性(图2)。当使用吸收方法时，仅1.5％的肽剂量被加载到粒子上。在不同的时间使用吸收法分析亮啡肽类似物(dalargin)加载的纳米粒子。在开发当前HIP方法作为评估现有技术的手段之前，制得并分析Kreuter吸收的粒子。使用的LC/MS法和HPLC法具有相同的敏感度。

实施例5 HIP-PBCA纳米粒子体内输送系统的评估(小鼠模型)

在小鼠模型中体内确定HIP-PBCA纳米粒子将它们加载的肽输送脑中的能力。将使用HIP方法制得的含有囊封的亮啡肽类似物的HIP-PBCA纳米粒子与如Kreuter报道的在纳米粒子表面上具有吸收的肽的HIP-PBCA纳米粒子进行比较。通过用聚山梨醇酯80表面活性剂包覆它们的表面制备经静脉途径输送至脑的纳米粒子。简而言之，在注射之前，将所述纳米粒子在含有1％w/v的表面活性剂的PBS中孵育30分钟。文献中业已报道，通过促使血清载脂蛋白在纳米粒子表面的吸收，表面活性剂间接地将纳米粒子靶标到脑。这允许粒子结合到血脑屏障上的载脂蛋白受体上并胞吞转运到脑。比较以下的制剂：

1、单独的HIP-PBCA纳米粒子(5∶1HIP含量)

2、单独的HIP-PBCA纳米粒子(10∶1HIP含量)

3、溶液中的亮啡肽类似物(2.0mg/kg)

4、含有在表面上吸收的亮啡肽类似物(制剂中使用的总剂量为2.0mg/kg)的HIP-PBCA纳米粒子

5、含有囊封的亮啡肽类似物(制剂中使用的总剂量为2.0mg/kg)的HIP-PBCA纳米粒子(HIP与亮啡肽类似物的摩尔比为5∶1)

6、含有囊封的亮啡肽类似物(制剂中使用的总剂量为2.0mg/kg)的HIP-PBCA纳米粒子(HIP与亮啡肽类似物的摩尔比为5∶1)，与前一个相同，但是以1/10剂量注射

7、含有囊封的亮啡肽类似物(制剂中使用的总剂量为2.0mg/kg)的HIP-PBCA纳米粒子(HIP与亮啡肽类似物的摩尔比为10∶1)

注射20分钟后，处死小鼠，收集大脑和血液样品，并经LC-MS-MS分析肽的存在。假设血液污染为15μl/g大脑，校正由于血液污染得到的大脑数据。得到的数据参见图3：

体内研究的结果表明，使用HIP方法使肽在HIP-PBCA纳米粒子核中的囊封优于肽在粒子表面的吸收。

实施例6 pH对亮啡肽类似物在HIP-PBCA纳米粒子中的囊封效率的影响

根据现有技术，通过在酸性油包水乳液中缓慢聚合BCA单体以形成PBCA纳米粒子，其中，水相的pH约为2.0(0.01N HCL)。酸性条件下的聚合反应需要至少3小时的一段时间才能完成反应。然而，这种方法使用中性的pH以实现快速聚合。使用的水相是磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.2)。在中性pH，已知BCA单体是快速聚合的(数秒内)。结果是HIP-PBCA纳米粒子的制备需要乳液很快形成。在这个方法中，其通过使用Silveron L4RT均化器进行高速(7500rpm或更高)均化处理来实现。假设通过快速捕获粒子中的肽，在中性pH下，更快的聚合反应将提高囊封效率。而相反，延长的聚合过程将导致肽从乳液进入水相的逐渐损失。为验证这个假设，使用HIP方法通过使用在PBCS或现有技术的初始介质(0.01N HCL)中萃取的肽来乳化BCA单体，以制备纳米粒子。酸性和中性水相都含有需要的稳定剂(0.2％ pluronic F68，1％葡聚糖)。根据实施例3中描述的方法制备纳米粒子。每种制剂中使用的肽的量为5mg。制备了以下的制剂(各配一种制剂)：

1、单独的HIP-PBCA纳米粒子(35∶1 HIP含量)，pH2

2、单独的HIP-PBCA纳米粒子(35∶1 HIP含量)，pH7

3、含有囊封的亮啡肽类似物(输入5.0mg)的HIP-PBCA纳米粒子(HIP与亮啡肽类似物的摩尔比为35∶1)，pH2

4、含有囊封的亮啡肽类似物(输入5.0mg)的HIP-PBCA纳米粒子(HIP与亮啡肽类似物的摩尔比为35∶1)，pH7

5、含有囊封的亮啡肽类似物(输入5.0mg)的HIP-PBCA纳米粒子(HIP与亮啡肽类似物的摩尔比为10∶1)，pH2

6、含有囊封的亮啡肽类似物(输入5.0mg)的HIP-PBCA纳米粒子(HIP与亮啡肽类似物的摩尔比为10∶1)，pH7

7、含有囊封的亮啡肽类似物(输入5.0mg)的HIP-PBCA纳米粒子(HIP与亮啡肽类似物的摩尔比为5∶1)，pH2

8、含有囊封的亮啡肽类似物(输入5.0mg)的HIP-PBCA纳米粒子(HIP与亮啡肽类似物的摩尔比为5∶1)，pH7

离心分离纳米粒子制剂，除去任何游离的肽，并重新悬浮在水或PBS中。通过在10mM NaOH(室温下孵育过夜)中打碎粒子，接着用LC/MS分析，以确定囊封效率。得到的结果示于图4中。

该结果支持了上述假设，即在中性pH下PBCA聚合物快速形成将导致肽囊封效率比现有技术的酸性pH中缓慢形成聚合物的效率要高。尽管由于用NaOH处理而导致的降解会损失一些肽，但得到的结果清楚地显示，在中性pH下形成粒子的益处。在HIP∶亮啡肽类似物的比例为10∶1的情况下，在pH7时，输入的肽的63.23％被捕捉进入纳米粒子中。在pH2时，囊封效率明显低于2.36％。总体而言，在pH7下制备粒子比pH2下制备粒子的囊封效率高。

实施例7 在使用HIP方法制备的PBCA纳米粒子中的域抗体囊封

根据实施例3所述的方法在PBCA纳米粒子中制备域抗体(抗鸡蛋溶菌酶dAb)。制剂中使用的蛋白的量为10mg。一共制备了两种制剂。为确定囊封的dAb的量，离心分离粒子以除去任何游离的蛋白，然后用Edman测序进行分析。除了序列信息，Edman测序也可用于提供定量信息。所述的方法包括严格的化学处理，其破坏该粒子并可检测囊封材料。得到的结果示于图10中。该结果表明，使用HIP-PBCA方法有可能囊封较大的分子，但是效率较低。然而，也有可能通过优化以域抗体使用的方法来提高囊封效率。使用当前对亮啡肽类似物已经优化的方法，有可能囊封使用的10mg中的约2.56mg。囊封效率为25.6％的这一量对于单乳化法是较高的，其中，蛋白被疏水粒子基质捕获。

实施例8 HIP方法优化，以改善域抗体在PBCA纳米粒子中的囊封

为了提高域抗体的载入量，进一步优化亮啡肽类似物方法。作为优化起始点的亮啡肽类似物的方法在实施例3和4中有描述。

校正方法的目的在于获得抗体在有机相中完全溶解，并有效地并入纳米粒子中。

这是通过另外的均化步骤来完成的，从而在有机相中形成HIP dAb复合物的悬液。一般而言，对亮啡肽类似物方法做如下改动：

使用的dAb是VEGF-myc dAb。该dAb名为DOM15-26-593且在PCT WO2008/149147中有描述；

以每100mg PBCA聚合物(12％w/w dAb/PBCA)输入12mg(0.843μmol)的量制备dAb(12mg dAb/100mgPBCA，每100mg PBCA聚合物含12mg dAb)。

以摩尔比为82∶1使dAb与HIP(多库酯钠)复合。该HIP溶液浓度为30.581mg/ml(在1ml中0.06879mmol)。

逐渐使dAb溶液酸化，并持续混合以防止与很低的pH值接触并降解。使用HCl将dAb溶液的pH降到pH3.6。

不使用CaCl₂，因为它会干扰HIP与dAb的结合。

通过涡旋混合500μl酸化的dAb溶液(24mg/ml，12mg蛋白)和在DCM中的1000μl多库酯钠(30.581mg/ml，3.058％w/w)以从水相中萃取酸化的dAb，接着进行离心分离两相。与亮啡肽类似物不同，发现dAb没有完全溶于有机相中。取而代之的是，它在分界面形成了白色沉淀。显然，该沉淀是由dAb:HIP复合物组成的，因为它的体积似乎与在萃取中使用的HIP和dAb的量成比例。将水相的体积从500μl减少到367.76μl(不加水)以试图完全地萃取dAb，这种成功的可能性比使用500μl体积时要小。一系列的实验表明，高的等电点是有益的，但是也有可能成功地用低pI(VEGF dAb-myc，在这种情况下pI＝6.6)沉淀dAb。离心分离后，收集水层并储存在4℃下。使用包括HIP-dAb固体小球的有机层来制备纳米粒子。

为制备纳米粒子，有必要将HIP-dAb小球溶于有机相中。这通过在所述的方法中引入以下额外的均化步骤来实现：

除去水相，使用Ultra-Turrax均化器(基本的T25，速度设为1级)在2ml埃彭道夫管使有机相和dAb沉淀进行均化处理。该制剂均化处理15秒以形成白色的悬液。

重要的是确保HIP-dAb小球与均化器接探针触，并立即开始混合。

1分钟较长时间的均化处理会得到更好的悬液，但是dAb会失去活性。

均化之后，将有机相留在2ml埃彭道夫管中，并加入100μl BCA单体。发现液态单体能容易地与有机相混合。接着将有机相用来制备实施例1所述的纳米粒子。

校正后的方法也用来制备含有壳体化的mAb的HIP-PBCA纳米粒子。通过以下开发的用于dAb的方法来制备全长的单克隆抗体(如PCT WO99/58679公开的抗CD23mAb，150000Da，12mg/100mgPBCA聚合物，HIP与mAb的摩尔比为860∶1)。进行以下的观察：

发现mAb(WO99/58679公开的抗CD23)比VEGF dAb需要更多量的HCl。当使用HIP试剂萃取时，发现mAb与dAb的表现相似：它们没有完全溶解进入有机相中，并在分界面形成白色沉淀。

使用250μl体积的水相代替500μl的水相与高浓度的mAb储备溶液进行试验，以达到mAb完全萃取进入有机相中。有机相∶水相＝4∶1的比例得到的结果不是很好，看起来mAb的活性有所降低，这是由于它接触更多的溶剂。显然，对于mAb和dAb，有机相∶水相＝1∶1的比例是较佳的。

为制备纳米粒子，通过使用与用于dAb的相同的均化步骤经过均化处理将HIP-mAb颗粒溶于有机相中。发现均化处理是成功的，但是悬液不太均匀，可能是由于HIP-mAb复合物的粒度较大。1分钟较长时间的均化处理得到更好的悬液，但是mAb似乎有变性。因此，将均化步骤缩短为15秒。

接着根据此实施例前述的dAb方法制备纳米粒子。

一般而言，发现比肽大的生物药品的壳体化需要对亮啡肽类似物方法进行基本的校正。

dAb和mAb都需要较高的HIP∶生物药品的摩尔比例来溶解(分别为82∶1和860)。

也发现dAb和mAb都未完全溶解进入有机相中。取而代之的是，在界面形成了沉淀。为了溶解入有机相，将该沉淀进行均化处理以进入有机相，形成在油性悬液中的固体。这成功地形成了粒子制剂。

实施例9 使用校正的HIP方法在PBCA纳米粒子中囊封域抗体

实施例8中所述的用于dAb的校正的HIP方法用来使一系列的dAb分子壳体化。基于它们的等电点来选择dAb。目的是覆盖有可能用于该方法中的等电点(pI)范围，以确认该方法是通用的，并适合于大范围的dAb。选择以下的dAb进行试验(表2)

表2

DOM编号是指WO2008/149146中描述的域抗体。myc是指域抗体上的myc-标签或HA是指域抗体上的HA标签。

使用摩尔比为70∶1的多库酯钠作为HIP试剂使每种dAb单独地配制进入PBCA纳米粒子。

HIP萃取中使用的试剂列于以下的表中(表3)：

表3

使dAb溶液酸化以用于萃取。

在通过加入水进行酸化之前，该dAb溶液稀释如下(表4)：

表4

通过加入HCl(2M)酸化溶液。将所有的dAb溶液酸化到pH约为3.0，用酸度指示条来确定。用水将每种酸化后的溶液的最终体积加到500μl。

接着如实施例16所述的将dAb萃取进入有机相中。发现所有的dAb都未在有机相完全溶解，并在界面形成沉淀。发现未标记的dAb(NT)形成的沉淀比其它的dAb的沉淀要薄很多。dAb的高的等电点和强的正电荷已明显使得与HIP形成更强的、更具疏水性的复合物，引起溶解度明显增大且转移进入有机相中。

在除去水相(上层)之后，使有机相和dAb沉淀通过均化处理溶解，并根据实施例8制备纳米粒子。

通过SDS-PAGE分析纳米粒子，以评估dAb的载入量。

为通过SDS-PAGE分析纳米粒子悬液，将样品在微量离心机中以13000rpm旋转10分钟。吸出上清液并使小球重新悬浮在100μl PBS中。使用1xNuPAGELD和还原剂破坏上清液和小球片段，加热到80℃，保持4分钟，并使用商售的NuPAGE凝胶通过SDS PAGE进行检测。也同时检测含有dAb的空心制剂的上清液的样品，用作正对照。

1和6道：分子量标记。2道：VEGF dAb DOM 15-10-11，未标记的，在HIP-PBCA纳米粒子中壳体化。3道：VEGF dAb DOM 15-10-11，myc标记的，在HIP-PBCA纳米粒子中壳体化。4道：VEGF dAb DOM 15-10-11，HA标记的，在HIP-PBCA纳米粒子中壳体化。5道：VEGF dAb DOM 15-10-11，未标记的，在空心HIP-PBCA纳米粒子中(阳性对照)壳体化。该凝胶确认发生了dAb壳体化。该凝胶还确认dAb是完整的，且由于粒子的制备方法，它们没有片段化。

该凝胶清楚地表明dAb在粒子中已被壳体化，因为在除去任何游离的dAb之后，它们与纳米粒子小球共同定位(图6)。

显然，dAb已在纳米粒子中壳体化，在非变性条件下(天然凝胶)对小球的分析并没有在凝胶上产生任何条带，这是因为dAb保留在粒子中(结果未示)。有必要通过SDS-PAGE来分析粒子，因为dAb从粒子中释放出来并在凝胶上进行分析需要变性的条件(在SDS存在下的热处理)。对于所有测试的dAb，发现壳体化是成功的。这表明额外的均化步骤成功地将HIP-dAb复合物溶解进入有机相中，使dAb被捕捉后进入粒子中。结果，在萃取之后，HIP-dAb复合物在界面上沉淀，尤其是在使用低的pI的dAb的情况下，这并没有使dAb在粒子中的壳体化受到损害。因此，业已发现，用于将dAb在HIP-PBCA中壳体化的校正方法在测试的范围内独立于pI，并适合一系列的dAb。

实施例10 使用校正的HIP方法将域抗体囊封在PBCA纳米粒子中；载入效率的测定和制备的dAb的活性的测量

为了确定校正的HIP方法能达到的载入效率，用工具dAb(VEGF-myc dAb，即WO2008/149147公开的DOM15-26-593)制备HIP PBCA纳米粒子制剂。以输入量为12mg(0.843μmol)/100mg PBCA聚合物(12％w/wdAb/PBCA，12mg dAb/100mg PBCA聚合物)制备所述的dAb。使用实施例9所述的用于dAb的校正的HIP方法制备该制剂。

制备之后，通过SDS-PAGE表征纳米粒子，以便确认dAb保持完整，以及它在粒子中被成功地捕捉。如实施例9所述的方法进行SDS-PAGE分析。还在凝胶上制剂的旁边分析已知量的一组dAb标准品，并将其用来确定壳体化的dAb的量(图7)。这通过对凝胶拍照并使用labworks v4.6测量标准品条带的信号强度达到。

以如下方式设定凝胶：

1道和7道：分子量标记。2-4道：dAb纳米粒子制剂。5道：空心纳米粒子(阴性对照)。7-10道：dAb标准品(500、125、31.25和7.8μg/ml)。11-14道：dAb标准品(7.8、31.25、125和500μg/ml)。该凝胶确认已经发生了dAb的壳体化，以及dAb是完整的。样品条带的强度与标准品条带的强度对比表明dAb在纳米粒子样品中的浓度为413.7μg/ml。

条带强度用来形成标准曲线。接着根据纳米粒子样品条带的强度，将该曲线用来计算在纳米粒子制剂中的dAb的量。

该凝胶确认dAb已在粒子内被成功地捕获，且在壳体化之后dAb保持完整。与标准品比较后，发现dAb在纳米粒子制剂中的浓度为413.7μg/ml。这转化后得出：输入12mg的dAb，纳米粒子中壳体化的dAb总量为3.31mg。因此，载入效率为27.6％。dAb载入为3.31％w/w。

为了释放壳体化的dAb并评估其活性，也将纳米粒子样品进行热处理。在1％Tween20存在下，在4℃-65℃的范围内孵育1小时后，dAb从纳米粒子中释放出来。已知该方法能实现至少部分壳体化的dAb从纳米粒子中释放，然而，这样也会损失dAb的一些活性。为使热处理后dAb的活性损失最小化，也将样品在65℃下孵育5分钟，接着在37℃的较低温度下温和地处理55分钟。

孵育之后，以10000rcf的速度将该样品离心处理10分钟，以从粒子中分开任何释放的dAb。收集含有释放的dAb的上清液，并经ELISA分析其活性。

通过以下的ELISA分析释放的dAb：

4℃下，用0.5μg/ml rVEGF将Nunc maxisorb 96孔板涂层，过夜。接着用缓冲液(PBS+0.1％Tween)将该板清洗4次，接着用封闭液(PBS+1％BSA)在室温下封闭1小时，同时摇动。以前述方式清洗该板，接着在孔中加入50μl一式三份上清液样品，并将该板以前述的方式孵育。清洗该板，接着在每个孔中加入50μl抗-myc Ab(小鼠)溶液，再以前述的方式将该板进行孵育。清洗该板之后，接着在每个孔中加入50μl抗小鼠HRP，再以前述的方式将该板进行孵育。最后再以前述方式清洗该板，接着在每个孔中加入50μl TMB试剂。显色，通过每个孔中加入50μl HCl(1M)使反应停止。使用Versamax板阅读器和Softmax Pro V5.3软件，在450nm处测定吸光度。

从ELISA实验得到的结果示于表5中：

表5

温度	4℃	56℃	65℃	65/37℃
					浓度(μg/ml)	0.44	4.0	＞50	61

发现释放的dAb有活性，且温度越高，从粒子中释放的蛋白的量越多。在65和37℃两个温度下对样品进行处理时，发现样品释放的活性dAb的量最多。制剂中的活性的初始水平很难估计，因为已知释放方法对活性有损害，然而，考虑到PAGE的结果，65/37方法得到具有标准品的大约50％的特异性活性的物质。

通过ELISA分析释放的dAb，得到有活性的dAb的读数，也用SDA-PAGE进行分析，测出总的dAb。将该dAb和一组标准品一起在凝胶上进行分析。然后dAb的量通过标准曲线确定，所述的曲线通过测量标准品的条带强度形成。业已发现有活性的dAb的浓度(61μg/ml，经ELISA测出)是总的dAb(137.89μg/ml，经SDS-PAGE测出)的44％。

因此，发现至少50％的在纳米粒子中制备的dAb是有活性的。考虑到制备方法涉及在有机相中的溶解以及随后通过均化处理进行的混合，这认为是非常好的活性水平。因此，粒子制备方法看来适合于域抗体的制备。

实施例11 在小鼠模型中对含有域抗体的HIP PBCA纳米粒子通过静脉途径将它们载入的蛋白输送到脑中的能力的体内评估

在小鼠模型中评估实施例10中描述的纳米粒子制剂将它载入的dAb输送到脑中的能力。

将含有壳体化的VEGF dAb的纳米粒子与游离的dAb进行比较，以确定粒子与游离的dAb分子相比，是否能够提高脑对dAb的吸收。还制备一批空的纳米粒子，并作为阴性对照进行评估。

体内研究的设计

该研究包括两个不同的时间点，在此时间点上评估dAb脑水平：给药后10分钟和60分钟。如果在注射后几分钟内dAb在脑中达到峰值，如用亮啡肽类似物肽所发现的一样，则选择较早的时间点。为了从血液循环中清除一些dAb，选择较晚的时间点。在血液中存在的任何的dAb将会污染脑样品，并使得到的数据失真。dAb在血液循环中的短的半衰期(20分钟)可能限制在较晚的时间点的血液污染，因此使脑渗透的读数更清楚。

在脑样品中校正血液污染

为了计算不是由于脑吸收而是仅仅在脑血管中存在且未在脑组织本身(血液污染)中的脑样品中dAb的量，进行了start-chase研究。所有的小鼠都接受一剂量的chase分子，已知该分子留在血液中并不会穿透脑。选择的所述的chase分子是WO99/58679公开的抗-CD23全长抗体，其显示可忽略不计的脑吸收。因此，在脑样品中检测到的任意量的抗CD-23mAb将仅仅因为它在血液中的存在污染了脑组织。在处死动物之前5分钟将所述的chase给予动物，以确保该抗体保留在血液中，且在身体的其它部位没有组织吸收。

动物组

A：对照粒子，给定t＝0，接着在t＝5分钟时给予chase；

B：在纳米粒子中的dAb，给定t＝0，接着在t＝5分钟时给予chase；

C：溶液中游离的dAb(对照)，给定t＝0，接着在t＝5分钟时给予chase；

在t＝10分钟时，即在给予chase之后5分钟时处死上述组的动物。

D：对照粒子，给定t＝0，接着在t＝55分钟时给予chase；

E：在纳米粒子中的dAb，给定t＝0，接着在t＝55分钟时给予chase；

F：溶液中游离的dAb(未配制的对照)，给定t＝0，接着在t＝55分钟时给予chase。

在t＝60分钟时，即在给予chase之后5分钟时处死上述组的动物。

剂量的制备

Chase：在PCT WO99/58679公开的抗CD-23mAb，2.0mg/kg

通过将68mg/ml mAb储备液稀释到500μg/ml制备剂量。

对于25g的小鼠，在100μl体积中总计有50μg的剂量。

含有mAb的纳米粒子：1.584mg/kg，50mg/kg PBCA聚合物。

通过将160μl聚山梨醇酯80溶液(25％w/w)加入到3600μl纳米粒子悬液中制备纳米粒子悬液，以供注射。配制的dAb的最终浓度为396.1μg/ml。对于25g的小鼠，在100μl体积中总计有39.6μg的dAb剂量。

空的纳米粒子(阴性对照)：50mg/kg PBCA聚合物

如上通过将160μl聚山梨醇酯80溶液(25％w/w)加入到3600μl纳米粒子悬液中制备纳米粒子悬液，以供注射。PBCA聚合物的最终浓度为1.25mg/ml。对于25g的小鼠，在100μl体积总计中有125μg的PBCA剂量。

溶液中游离的dAb(未配制的对照)：1.584mg/kg。

通过将2.0mg/ml储备溶液稀释到396.1μg/ml以制备dAb溶液，以供注射。对于25g的小鼠，在100μl体积中总计有39.6μg的dAb剂量。

小鼠的注射：静脉方式注射(尾静脉注射)CD1小鼠。基于小鼠的重量计算注射的体积。体内步骤结束之后，从所有的小鼠中收集脑和血清样品并冷冻。将组织样品在液态氮中快速冷冻。将所有的样品保存在-80℃下。

将脑均化处理以备分析：

将脑解冻并称重。在每个脑中加入体积是该脑体积的重量的2倍的PBS。接着使用Covaris声组织处理器(Covaris E210)对脑进行均化处理。

通过Meso Scale Discovery(MSD)对脑的分析

通过MSD分析脑的的均化物和血清样品。这通过将实施例18所述的抗-VEGF ELISA测定改变成MSD模式完成。在1∶10000的稀释液中以1∶1000分析血清样品。在1∶5的稀释液中分析脑样品。

结果

处理数据，得到图8所示的结果。在给药后10分钟，在脑中吸收的在纳米粒子中的dAb是可检测的，其量为8.0ng/ml。脑中游离的dAb也是可检测的，其浓度稍低，为3.3ng/ml(初始数据)。初始数据不包括血液污染不能校正的两个动物的读数，因为该血清的读数太高，而不能定量。总体而言，在第10分钟的时间点，纳米粒子似乎少量增加脑对蛋白的吸收。

然而，在第60分钟时，观察到相反的情况。游离的dAb似乎聚集在脑中，导致脑水平进一步增加到13.5ng/ml。观察到的结果可进行如下的解释：

1、由于其亲水性，血液循环中游离的dAb的半衰期(t1/2)比粒子的dAb半衰期可能更长。这可能是指与在纳米粒子中配制的dAb相比，有更多游离的dAb供大脑吸收。

2、载入粒子的dAb的量不足以高至抵消由于全身循环的快速消除所形成的制剂的损失。载入粒子中的药剂为3.31％w/w。亮啡肽类似物制剂之前需要的载入量为5.0％w/w，以得到45ng/ml的脑水平。8.9％的较高的肽载入量在脑中得到的肽的浓度高达833ng/ml。似乎3.31％w/w的载入量，尤其对于高分子量的生物药品，对基本脑输送是不够的，因此必需进一步优化载入量。

3、也许第10和60分钟的时间点太晚。之前使用亮啡肽类似物和洛哌丁胺(loperamide)的研究均证明输送是较快的，即在注射后的2-3分钟内。之前的研究也表明，脑中最高的药物水平在给药后5分钟内或更早达到。选择10分钟的时间点确保有足够的时间进行start chase研究，并选择60分钟以检测域抗体的任何长时间的持续效应。

4、HIP PBCA系统仅是被动地靶标到脑。当静脉给药时，已知表现出疏水表面的这些微粒被动靶标到除了脑以外的很多器官。这些器官包括肝和脾。当静脉给药时，纳米粒子在进入脑之前将首先到达肝和脾。其结果是大部分的注射剂量将会输送到那些组织，只剩下一部分可供输送到脑。这将严重损害粒子在该试验中到达脑的能力。

为强调从血液循环中损失dAb的影响，还计算脑与血液的比例(图9)。其结果清楚地表明，当dAb和纳米粒子一起给予时与当给予在溶液中游离的dAb时相比，在脑中比在血液中有更高比例的dAb存在。事实上，配制的dAb显示脑与血液的比例是0.04(60分钟)，该数值高于以下比例，在此比例下认为化合物是脑渗透剂。游离的dAb在任何的时间点都没有超过分析的脑渗透临界值。因此，尽管注射的剂量损失较多，就穿透血脑屏障的整体能力而言，则该粒子可最终优于游离的dAb。

一般而言，已知静脉途径是对被动靶标粒子(如HIP-PBCA系统)最具挑战的给药途径。因此，对评估HIP-PBCA系统将其载入的药物从血液输送穿过BBB，静脉途径不是理想的方法。为此，还进行了颈动脉研究。经颈动脉途径的给药绕过组织如肝和脾，并为输送到脑提供更直接的途径。结果是多数注射的纳米粒子剂量可供脑输送。在游离的和配制的药剂之间的正面直接比较中，颈动脉途径更可能为纳米粒子克服BBB的能力提供真实的量度。

实施例12 在小鼠模型中对含有域抗体的HIP PBCA纳米粒子通过颈动脉途径将它们载入的蛋白输送到脑中的能力的体内评估

体内评估纳米粒子制剂-颈动脉给药。

在小鼠中评估纳米粒子制剂通过颈动脉途径输送其dAb到脑中的能力。

之所以选择这样的途径，是因为它提供通往脑的直接的路径。当物质从颈动脉给予时，第一个到达的组织是脑。相反，当静脉给药时，在到达脑之前会先到达一些组织，如肝。据发现这限制纳米粒子输送到大脑中的能力，因为业已知道它们是通过组织吸收的，例如肝和脾。事实上，Kreuter等人已发现，当经过尾静脉给药，大多数注射的空的纳米粒子剂量(～60％)与它们的PBCA吸收的粒子被肝吸收。

一般而言，对于被动式靶标输送系统如HIP-PBCA纳米粒子，已知静脉途径是最不合适的，且是最具挑战性的给药途径。

因此，对于纳米粒子克服血脑屏障的能力，颈动脉途径被认为更可能提供确切的指示。

体内研究的设计

该研究的设计与对静脉途径的研究相同，唯一的区别在于以下：

1、在整个实验中，动物都保持终端麻醉。鉴于涉及的外科手术方法的复杂性，这是必须的。

2、通过颈动脉途径经外科准备的插管给予纳米粒子制剂和游离的dAb。

3、通过尾静脉从静脉给予chase，但与前述研究不同，抗体通过插管给予。

动物组

A：对照粒子，给定t＝0，接着在t＝5分钟时给予chase；

E：在纳米粒子中的dAb，给定t＝0，接着在t＝5分钟时给予chase；

B：对照粒子，给定t＝0，接着在t＝55分钟时给予chase；

F：在纳米粒子中的dAb，给定t＝0，接着在t＝55分钟时给予chase；

D：溶液中游离的dAb(未配制的对照)，给定t＝0，接着在t＝55分钟时给予chase。

剂量的制备

Chase：在PCT WO99/58679公开的抗CD-23mAb，2.0mg/kg

通过将68mg/ml mAb储备液稀释到500μg/ml制备该剂量。

对于25g的小鼠，在100μl体积中总计有50μg的剂量。

含mAb的纳米粒子：1.584mg/kg，50mg/kg PBCA聚合物。

通过将160μl聚山梨醇酯80溶液(25％w/w)加入到3600μl纳米粒子悬液中制备纳米粒子悬液，以供注射。得到的配制dAb的最终浓度为396.1μg/ml。对于25g的小鼠，在100μl体积中总计有39.6μg的dAb剂量。

空的纳米粒子(阴性对照)：50mg/kg PBCA聚合物

如上通过将160μl聚山梨醇酯80溶液(25％w/w)加入到3600μl纳米粒子悬液中制备纳米粒子悬液，以供注射。PBCA聚合物的最终浓度为1.25mg/ml。对于25g的小鼠，在100μl体积中总计有125μg的PBCA剂量。

溶液中游离的dAb(未配制的对照)：1.584mg/kg。

结果

处理该数据，得到图9所示的结果。在给药后10分钟，纳米粒子组中的dAb在脑中表现出高水平的dAb，平均值为627.60ng/ml。大脑中dAb的实际浓度可能更高，因为上述数字未包括两个动物的读数。这两个样品给出的信号数值太高，而不能定量，但不幸的是，也未及时进行分析，引入本文件中。其中的一个动物为清楚的异常值，其为相当低的脑浓度45.45ng/ml。这导致在组中观察到较大的误差。然而，脑中形成的dAb的平均浓度近乎游离dAb的9倍，游离dAb的浓度为71.67ng/ml。

在注射后60分钟，大脑的dAb的水平依然较高，为146.51ng/ml。而游离dAb的浓度降到平均值为3.17ng/ml。因此，注射后60分钟，纳米粒子中的dAb的脑浓度是裸dAb达到的数值的46倍。

一般而言，业已发现，通过颈动脉途径，纳米粒子能成功地将dAb输送到脑。

这也从确定动物组中脑与血液的比例得到证实(图11)。纳米粒子组中的dAb所显示的脑与血液的比例在两个时间点均大于1(在第10和60分钟分别为1.569和1.854)，表明大多数配制的dAb已成功地到达脑。相反，游离的dAb组的特征是大脑与血液的比例显著偏低，在第10和60分钟分别为0.012和0.286。

总之，业已发现，通过颈动脉途径给予时，纳米粒子输送系统显著改善dAb到脑的输送。这是因为该途径在到达肝和脾之前到达脑，所述的肝和脾是除了脑以外制剂也被动标靶的组织。

静脉途径没有如此成功，这提供了在大脑中增加dAb的吸收的瞬时线索。这可能是因为载入粒子dAb不足，以及因为输送系统被其它组织吸收，导致仅一部分注射粒子到达脑。

因此，为改善系统并实现经静脉途径有效输送到脑，有必要进一步提高dAb至纳米粒子的载入。这可以通过使用空心PBCA系统实现，其已表明比HIPPBCA系统具有更高的载入dAb的能力。在其在体内足够稳定的条件下，对于将dAb输送到脑，空心PBCA粒子比HIP PBCA系统更成功。为确保它们的稳定性，有必要将PBCA聚合物与其它高分子量的的聚合物如PLGA、PLA或PCL共混。使用聚乙二醇化的共聚物也使输送系统受益。这些聚合物可延长纳米粒子在血液中的循环时间，藉此改善脑的输送。

改善输送系统的其它方法是改变其脑靶标的机制。表现具有结合BBB上的靶标的配体的主动靶标的纳米粒子可能改善脑的吸收，并同时限制粒子损失在其它组织中。为实现主动靶标，有可能必需广泛地将纳米粒子表面聚乙二醇化，以限制任何非特异性地靶标到其它器官。

一般而言，本文件中描述的纳米粒子具有很大的潜力实现将域抗体有效输送到脑中，然而，为了达到此目的，仍然需要将方法进行显著的优化。

实施例13使用校正的HIP方法在PCL微球体中囊封域抗体

将聚合物聚己酸内酯(PCL，lactel)用作试验例子，以测试使用dAb壳体化的HIP方法的微球体生成和缓释聚合物的用途。初始的实验使用实施例7和8所述的HIP囊封方法的校正方法，以允许使用PCL得到空心纳米粒子和微球体。

初始的制剂使用100mg/ml在二氯甲烷(DCM)中的PCL储备液和1％pluronic F68(Sigma)作为表面活性剂，以4000-7500rpm的速度均化处理45秒钟，但仅制得很少量的微球体或纳米粒子(数据未示)。通过使用以下不同的表面活性剂进一步优化所述的方法：还是1％胆酸钠(Sigma)，或1％Lutrol F127泊洛沙姆407(BASF公司)，或1％维生素E TPGS(d-ALPHA聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯)，(Peboc/Eastman)，但对初始的改进甚微(数据未示)，直到输入的聚合物的量降到10mg/ml，在光学显微镜下可观察到＞20μm的少量的大且易碎的微球体(数据未示)，但是一旦蒸发掉有机溶剂，大多数的PCL以肉眼可见的粒子从悬液中出来(数据未示)。鉴于粒子的稳定性，通过使用2％的上述试验中的两种最有希望的表面活性剂来帮助更好地稳定悬液，以进一步改进所述的方法：Lutrol F127泊洛沙姆407(BASF公司)或维生素E TPGS，并以7500-9000rpm的速度均化处理45秒-2分钟。使用所述的方法，所有情况下都得到粒度约1μm的粒子(数据未示)，但是选择2％维生素E TPGS作为步骤中的2分钟均化处理的表面活性剂，以使如下所示的dAb壳体化。

使dAb壳体化的HIP-PCL微球体(M/P)的制备

通过上述实施例13的方法学制备HIP-PCL微球体，对此方法的任何变化如下详述：

使用的制剂：

制备4种PCL(聚-e-己酸内酯)制剂

i)PCL作为M/P的HIP方法制备的空粒子-4000rpm(2％维生素E[TPGS]作为表面活性剂)-2分钟

ii)PCL作为M/P的HIP方法制备的空粒子-7500rpm(2％维生素E[TPGS]作为表面活性剂)-2分钟

iii)PCL作为M/P的HIP方法制备的粒子+分析用的dAb，(dAb1)-7500rpm(2％维生素E[TPGS]作为表面活性剂)-2分钟

iv)PCL作为M/P的HIP方法制备的粒子+测粒度用的dAb，(dAb2)-7500rpm(2％维生素E[TPGS]作为表面活性剂)-2分钟

需要的溶液：

(1)待萃取的dAb：抗VEGF(WO2008/149147公开的DOM15-26-593)、批号TB090220 1.5mg/ml(14246Da)-使用4x5ml(使用Nanodrop 1000分光光度计，Thermo Scientific再次读取dAb的实际浓度，确认的浓度事实上为1.04mg/ml)

(2)82∶1 HIP溶液(1ml，30.58mg/ml)

(3)酸化的dAb溶液(25mg/ml)N/A

(4)水相：1％w/v葡聚糖，2％w/v在PBS中的表面活性剂^*

(5)溶解于DCM中的PCL聚合物

^*储备的10％维生素E[TPGS]

在DCM中的PCL溶液的制备

目的是提供每个制剂在DCM中溶解的10mg PCL-在DCM中的溶解度为约～100mg/ml，为最大值，但是@～10mg/ml可溶解更多。为5种制剂准备足够的PCL，即在5ml DCM中50mg。称出50mg PCL，(当从-20℃加热到室温时，打开解冻的真空干燥器)，称重(精确平衡)-在10ml装有PCL+4ml DCM的烧杯中搅拌-在有盖的通风橱中用玻璃搅拌器搅拌。一溶解就在玻璃测量筒中测量，并以DCM使容积加到5ml，接着再次混合(搅拌烧杯)，再快速使用。

dAb溶液的浓度

开始在室温下O/N，以600rpm制备制剂，并稀释至校正浓度。根据在Sorvalllegend RT Bench Top centrifuge中的生产商的说明，使用Vivaspin浓缩器(Vivaspin6，Sartorius，VS0691，MWCO3000PES)浓缩溶液。浓度从期望的1.5mg/ml(20.0ml，在4x Vivaspin，5ml)至25mg/ml(～700μl)。所述的方法以1000-1500rpm进行2小时，并以3000rpm再进行～1小时。通过Nanodrop测得初始的dAb 400μl在75倍稀释液中得到的浓度为0.56mg/ml，接着以25mg/ml的浓度稀释到760μl，再用酸处理，使pH降低至～3.7。以pH～2.5的酸对模拟材料进行酸处理。dAb为25mg/ml，～pH5.0/4.5-目的是使pH降低至3.7-用pH2.5-4.5的试纸检查pH。使用380μl dAb，例如，仅为9.5mg/制剂，(且拟合初始的输入1mg/ml的浓度，而非1.5mg/ml)。

表6 酸化溶液的制备

表7 HIP萃取的制剂和试剂(标准体积方法)。

(A)有机相dAb

(B)有机相HIP

目的是制得dAb(aq)：DCM/HIP为1∶2的混合物-前述是1x混合物，即～500μl∶1000μl有机相

表8：空对照的制备(有机相)

使用多库酯钠作为HIP试剂将dAb或模拟液(空粒子)萃取进入有机相。

在2ml埃彭道夫管中将酸化的dAb或模拟溶液和有机相混合，并加入到水相中。以最大的速度涡旋混合混合物1分钟，接着置于Bench top混合器5432中5分钟。以最大的速度(20817rcf，14000rpm，在微量离心机中)将得到的白色混合物离心分离50分钟。dAb-HIP复合物似乎在界面上形成厚的白色沉淀。收集水相，并储存在4℃下。除去上面的水相并储存，再用下面的有机相继续进行实验。

将HIP-dAb复合物均化处理进入有机相

使用IKA T25均化器(polytron，速度设为1级)，将有机相在2ml埃彭道夫管中均化处理7-10秒。目的是达到将白色沉淀(dAb和HIP复合物)完全均化进入有机相(DCM)中。HIP-dAb复合物容易地溶解在有机相中形成看起来均质的乳液。将有机相进行总共10秒钟的均化处理。在均化处理和除去有机相之后，只有很少的沉淀留在管中。

微球体的制备

取出1ml均质物的有机相，并使用移液管吸入和排出将其与溶解在DCM(100mg)中的1ml PCL进行混合。

在探针进入液面下的点时，将得到的白色悬液(2ml)移入水相(在水中的10ml葡聚糖，和在PBS中的2％表面活性剂溶液，装在25ml烧杯中)中。使用Silverson L4RT均化器以7500rpm(M/P)或4000rpm(M/P)将该水相均化处理。将乳液均化处理2分钟。接着将制剂在通风橱中搅拌(速度设为4级)孵育3小时，以蒸发掉有机相。将速度降低至3级孵育1小时，以防止乳液的过度混合，因为过度混合导致在烧杯的表面块状物沉积。

实施例14 微球体的粒度测量

(a)光学显微镜

使用可见光在Nikon Eclipse E400显微镜上测量上述四种制剂(i)-(iv)的粒度。表示这些粒子的图像的数据示于图12中。从那些含有或不含有dAb的四种制剂中都能观察到相似粒度范围的可见的微球体。这些数据表明使用该方法在dAb存在的条件下类似地形成了微球体。

(b)多角度静态光散射

将所有的四种样品均在Micromeitics Saturn DigiSizer 5200，高分辨率粒度分析仪上进行粒度测定。

以这样的方式测定样品粒度：通过将来自上述微粒粒度内的足够量的材料载入固定在Saturn Digiszer 5200上的小体积样品处理单元中，以允许在排气的PBS的基质中遮光5-30％，优选超过15％(其需要50-100％的制剂)。接着使用聚己酸内酯模型的分析来分析样品，使用的实际的分层的折射指数为1.476，想象的分层的折射指数为0.0001。流速为6L/分，停止的光束角度为45度，介质是PBS，并进行3次计数。报告体积和数量分布，得到的数据是组合的报告、累积图和频率图，所述方法的详细内容参见Micromeritics Saturn Digisizer 5200操作手册V1.12(2007年3月)和快速入门。

图13(a)-(d)展示的相关制剂(i)-(iv)的数据，图形描述的是粒子的数量的频率与粒度。参见以下的对应于这些图的数据。

图13(a)

总的报告

样品

样品浓度：0.01069％

遮光率：29.1％

体积分布几何统计

标准偏差8 标准偏差8

平均值 8.355 2.926 模式 10.00 4.017

中间值 9.754 3.951 标准偏差Log 0.382 0.047

偏度 -0.267 0.106 峰度 -0.436 0.180

数量分布几何统计

标准偏差8 标准偏差8

平均值 1.393 0.070 模式 1.000 0.000

中间值 1.033 0.009 标准偏差.Log 0.214 0.022

偏度 1.504 0.388 峰度 2.001 2.445

图13(b)

总的报告

样品

样品浓度：0.00284％

遮光率：16.7％

体积分布几何统计

标准偏差8 标准偏差8

平均值 5.366 3.943 模式 2.239 2.744

中间值 4.304 5.816 标准偏差.Log 0.521 0.033

偏度 0.523 0.450 峰度 -0.370 0.178

数量分布几何统计

标准偏差8 标准偏差8

平均值 1.231 0.016 模式 1.000 0.000

中间值 1.048 0.013 标准偏差.Log 0.141 0.012

偏度 1.954 0.198 峰度 4.737 1.339

图13(c)

总的报告

样品

样品浓度：0.00771％

遮光率：21.6％

体积分布几何统计

标准偏差6 标准偏差6

平均值 9.346 7.368 模式 2.239 12.53

中间值 10.45 7.174 标准偏差.Log 0.421 0.115

偏度 -0.234 0.252 峰度 -0.185 3.125

数量分布几何统计

标准偏差6 标准偏差6

平均值 1.355 1.046 模式 1.000 0.751

中间值 1.048 0.731 标准偏差.Log 0.196 0.070

偏度 1.711 0.234 峰度 3.196 1.059

图13(d)

总的报告

样品

样品浓度：0.01069％

遮光率：29.1％

体积分布几何统计

标准偏差8 标准偏差8

平均值 8.355 2.926 模式 10.00 4.017

中间值 9.754 3.951 标准偏差.Log 0.382 0.047

偏度 -0.267 0.106 峰度 -0.436 0.180

数量分布几何统计

标准偏差8 标准偏差8

平均值 1.393 0.070 模式 1.000 0.000

中间值 1.033 0.009 标准偏差.Log 0.214 0.022

偏度 1.504 0.388 峰度 2.001 2.445

平均粒度的最清楚的测定值来自几何平均数量分布，其给出以下的平均粒度：

i)PCL作为M/P的HIP方法制备的空粒子-4000rpm(2％维生素E[TPGE]作为表面活性剂)-2分钟，平均粒度1.231

ii)PCL作为M/P的HIP方法制备的空粒子-7500rpm(2％维生素E[TPGE]作为表面活性剂)-2分钟，平均粒度1.181

iii)PCL作为M/P的HIP方法制备的粒子+分析用的dAb1-7500rpm(2％维生素E[TPGE]作为表面活性剂)-2分钟，平均粒度1.355

iv)PCL作为M/P的HIP方法制备的粒子+测粒度用的dAb2-7500rpm(2％维生素E[TPGE]作为表面活性剂)-2分钟，平均粒度1.393

结论是尽管在这些条件下以较低的速度得到了稍微大的微球体，但影响是不大的-所述的7500rpm的均化条件在dAb存在下得到的微球体的平均直径为1.4μm，比该方法中的空粒子稍大。

实施例15 含有dAb的HIP-PCL微球体的分析

如以上述实施例13所述的那样制备含有dAb的HIP PCL微球体。

每种制剂取出50μl(dAb1和dAb2)，各：-

i)在1.5ml微量离心管中以3k rpm旋转5分钟，产生上清液(S)-移出30μl到干净的微量离心管中，小球(P)碎片重新悬在50μl PBS中；

ii)在1.5ml微量离心管中以13k rpm旋转5分钟，产生上清液(S)-移出30μl到干净的微量离心管中，小球(P)碎片重新悬在50μl PBS中；

iii)在Vivaspin500(1000000分子量的截断值)以5k rpm旋转5分钟，以除去任何结合的dAb，粒子保留在柱和作为穿过的上清液(F)的50μl PBS中，并收集。

根据生产商的用户指南使用Vivaspin500(Sartorius stedim biotech)。

制备样品，以通过加入21μl样品到8μl的4x加载染料中，加到3μl的10x还原剂中，得到的最终体积为32μl，将其中的10μl在加热到80℃之后载入置于PCR仪(PTC-100，MJ研究公司)的96孔PCR板的孔中，保持5分钟。

接着根据生产商的指示，将样品载入在MES SDS中的(2-N吗啉代乙磺酸，十二烷基硫酸钠)电泳胶上，缓冲35分钟(invitrogen)，并使用微波调节形式的Simplyblue SafeStain方法染色(invitrogen)，也在凝胶上加载未壳体化的dAb标准品并电泳，以协助计算浓度，即如上述样品制备所述的稀释的3.28μg、0.82μg、0.21μg和0.05μg，10μl分别加载了：500ng/μl、125ng/μl、31.25ng/μl和7.8ng/μl储备液。染色的凝胶的图像示于图14中。

凝胶设置如下：

1道：全部dAb1，2道：dAb1 3k S，3道：dAb1 3k P，4道：dAb1 13k S，5道：dAb1 13k P，6道：dAb1 F，7道：全部dAb2，8道：dAb2 3k S，9道：dAb2 3k P，10道：dAb2 13k S，11道：dAb2 13k P，12道：dAb2 F，13道：分子标记物-参见Blue Plus 2预染色标准(invitrogen)，分子量(kd)，14道：3.28μg dAb标准品，15道：0.82μg dAb标准品，16道：0.21μg dAb标准品，17道：0.05μg dAb标准品，该凝胶确认发生了dAb的壳体化。该凝胶还确认dAb是完整的，且由于粒子的制备方法，它们没有产生片段。

使用Labworks 4.6软件(UVP)的条带捕获和1D凝胶定量套装来核实dAb1在PCL HIP的全部，上清液和小球片段中的材料的量。使用配有奥林巴斯摄像头的Vision工作站在白光下捕获图像以供分析。数据示于表9中。

表9：载入PCL-HIP微球体中加载的dAb的测定结果

1道：全部dAb1，2道：dAb1 3k S，3道：dAb1 3k P，4道：dAb1 13k S，5道：dAb1 13k P，6道：dAb1 F，7道：全部dAb2，8道：dAb2 3k S，9道：dAb2 3k P，10道：dAb2 13k S，11道：dAb2 13k P，12道：dAb2F，13道：分子标记物-参见Blue Plus 2预染色标准(invitrogen)，分子量(kd)，14道：3.28μg dAb标准品，15道：0.82μg dAb标准品，16道：0.21μg dAb标准品，17道：0.05μg dAb标准品。

使用dAb标准品相对于条带强度作图(数据未示)，将dAb强度的凝胶读数转化成μg形式的dAb的量(表9)。

平均全部dAb制剂读作：(1道和7道)，3.5μg+4.5μg/2＝4μg-在载入10μl后，样品从21稀释到32，所以10μl中的总dAb＝32/21x4＝6μg。

dAb1上清液，(2道、4道和6道)＝1.0+0.9+0.73/3＝0.9μg，稀释校正后为1.4μg。

dAb1小球，(3道和5道)＝3.0+3.1/2＝3.0μg，稀释校正后为4.6μg。

使用这些图，分数计算如下：6μg的全部dAb＝dAb1上清液(1.4μg)+dAb1小球(4.6μg)，壳体化的dAb的百分比为全部dAb的77％(4.6/6.0)。

然而，输入的dAb的百分比-壳体化的10μl(9.5μg)为4.6/9.5x100％＝48％。

实施例16-dAb从HIP PCL微球体中的释放

为了从HIP PCL粒子中释放dAb以分析功能活性-从dAb1和dAb2HIP PCL制剂中取出50μl等分样品，并放在1.5ml埃彭道夫管中。用1ml PBS清洗2次，并在Eppendorf 5417C微量离心机中以5000rpm旋转5分钟。将小球重新悬浮在50μlPBS中，并在Techne加热箱中，在56℃下分别孵育0、20、40和60分钟。然后以5000rpm将样品旋转离心沉淀5分钟，除去30μl上清液(S)，并置于冰上，以供分析。接着干燥小球(P)并重新悬浮于50μl中。

将所有的部分都进行凝胶分析-在一块凝胶上分析释放的上清液，在另一块凝胶上分析释放的小球。上清液凝胶的分析示于图15中，其中，根据图14的初始分析的凝胶设置加载物。

对于dAb1和dAb2，使用条带捕获和Labworks 4.6软件(UVP)的1D凝胶定量套装来核实在释放PCL HIP粒子的上清液和小球片段中的材料的量。使用装有奥林巴斯摄像头的Vision工作站在白光下捕获图像，以供分析。

采用dAb标准品与条带强度为参数作曲线图(数据未示)，将dAb强度的凝胶读数转换成ng形式的dAb的量(表10第2列)。

需要注意的是，采用这个方法从粒子中约882-1000ng的小球源中释放的材料的量的范围为120-189ng之间(数据未示)-其中12-19％的材料释放。

通过ELISA对从PCL HIP粒子中释放的dAb进行功能分析。

ELISA方法描述了一种结合测定，以测量可溶的域抗体(VEGF dAb)结合重组VEGF的能力。所述的测定使用涂层到ELISA板(Nunc Immunosorb)表面的重组人VEGF(R&D Systems)来捕获VEGF dAb。将该板清洗以除去任何未结合的dAb。接着使用VEGF dab(9E10，Sigma)的Myc标记的抗体来检测结合的dAb。清洗除去过剩的抗体，并使用抗-小鼠IgG过氧化物酶缀合物(Sigma)以检测结合的抗-myc抗体。采用TMB溶液使该测定显色，再用酸停止显色。测定的信号与dAb的量成比例。

设置ELISA板以分析以下列出的样品，还分析0分钟后“释放”的dAb1和dAb2样品。在30μl清除的释放样品中-使用其中的21μl进行SDS PAGE分析，剩下的9μl用来制备1∶100、1∶1000和1∶10000的稀释液。

表10所述的是计算的总的释放的dAb与经ELISA测量的功能活性dAb的比较结果。

表10 功能活性和总的释放的dAb的定量。

可以看出，使用这种释放方法，可从微球体中释放的材料中检测到功能活性的dAb，其范围与通过ELISA测量出的60-100％的壳体化保留活性一致。

根据释放的dAb、热失活或任何的dAb的降解，总dAb与活性dAb的比值会波动，但是该变化被认为不会有显著的差别。

序列表

7	成熟的H11重链氨基酸序列
		8	成熟的L9轻链氨基酸序列
9	亮啡肽类似物六肽
		10	DOM15-26-593 VEGF dAb氨基酸序列
11	CvL1可变区氨基酸序列MAG抗体

12	BvH1可变区氨基酸序列MAG抗体
		13	H2全长DNAβ-淀粉样蛋白抗体
14	优化的L1轻链DNAβ-淀粉样蛋白抗体
		15	L1全长DNAβ-淀粉样蛋白抗体

序列

SEQ ID NO.1：重链人源化构建体H28

MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHW

VRQAPGQGLEWIGNINPSNGGTNYNEKFKSKATMTRDTSTSTAYMELSSLRSEDTA

VYYCELMQGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFP

EPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPS

NTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV

DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY

KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDI

AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAL

HNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO.2：2A10轻链人源化构建体L16

MGWSCIILFLVATATGVHSDIVMTQSPLSNPVTLGQPVSISCRSSKSLLYKDGKTYLN

WFLQRPGQSPQLLIYLMSTRASGVPDRFSGGGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQ

QLVEYPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV

QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGL

SSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO.3：重链人源化构建体H28

ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCAC

TCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCT

CAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCATCTGGATACACCTTCACCAGCTACTGGATGC

ACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATCGGAAATATTAAT

CCTAGCAATGGTGGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACCATG

ACCAGGGACACGTCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATC

TGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGAACTGATGCAGGGCTACTGGGGCCAGG

GAACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCC

TGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCT

GGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCC

TGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACT

CCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTAC

ATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAG

CCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTC

GCGGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCAT

GATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAG

ACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCC

AAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGT

CCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGG

TCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAG

GGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTG

ACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGA

CATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCA

CGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACC

GTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCA

TGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAA

ATGA

SEQ ID NO.4：2A10轻链人源化构建体L16

ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCAC

TCCGATATTGTGATGACCCAGTCTCCACTCTCCAACCCCGTCACCCTTGGACAG

CCGGTCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTATATAAGGATGGGAAG

ACATACTTGAATTGGTTTCTCCAGAGGCCAGGCCAATCTCCACAGCTCCTAATTT

ATTTGATGTCCACCCGTGCATCTGG GGTCCCAGACAGATTCAGCGGCGGTGGG

TCAGGCACTGATTTCACACTGAAAATCAGCAGGGTGGAGGCTGAGGATGTTGG

GGTTTATTACTGCCAACAACTTGTAGAGTATCCGCTCACGTTTGGCCAGGGGAC

CAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCC

ATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAA

CTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTCCAATC

GGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACA

GCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTC

TACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTT

CAACAGGGGAGAGTGTTAG

SEQ ID NO.5：成熟的H2重链氨基酸序列

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFTFSDNGMAWVRQAPGKGLEWVSFISNLA

YSIDYADTVTGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCVSGTWFAYWGQGTLV

TVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT

FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTC

PPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV

EVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA

KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP

PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO.6：成熟的轻链氨基酸序列

DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRVSQSLLHSNGYTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVS

NRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQTRHVPYTFGGGTKVEIKR

TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVT

EQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO.7：成熟的H11重链氨基酸序列

QVQLVQSGAEVKEPGASVKVSCKGSGFNIKVYYVHWLRQLPGKGLEWIGRIDPEN

GETIYTPKFQDKATLTVDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCVSSGYWGQGTLVTVS

SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA

VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPP

CPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEV

HNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG

QPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV

LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO.8：成熟的L9轻链氨基酸序列

DIVMTQSPLSNPVTPGEPASISCRSSKSLLHRNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMS

NLASGVPDRFSSSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELWTFGQGTKVEIKRT

VAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTE

QDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO.9：亮啡肽类似物

YAGFLR

SEQ ID NO.10：DOM15-26-593VEGF dAb序列：

EVQLLVSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKAYPMMWVRQAPGKGLEWVSEISPSG

SYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPRKLDYWGQGTL

VTVSSAAAEQKLISEEDLN

SEQ ID NO.11：CvL1可变区

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSHSVLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYW

ASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCHQYLSSLTFGQGTKLEIKR

TV

SEQ ID NO.12：BvH1可变区

QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTY

TGEPTYADDFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARNPINYYGINYEGYV

MDYWGQGTLVTVSS.

SEQ ID NO.13：H2全长DNA序列

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCC

TGAGACTCTCCTGTGCAGTCTCTGGATTCACCTTCAGTGACAACGGAATGGCGT

GGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTTTCATTCATTAGTAAT

TTGGCATATAGTATCGACTACGCAGACACTGTGACGGGCCGATTCACCATCTCC

AGAGACAATGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAG

GACACGGCTGTGTATTACTGTGTCAGCGGGACCTGGTTTGCTTACTGGGGCCA

GGGCACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCC

CCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTG

CCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCG

CCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTC

TACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGAC

CTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGT

TGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGA

ACTCGCGGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCC

TCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAC

GAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAA

TGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCA

GCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGC

AAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCC

AAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGA

GCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCA

GCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAA

GACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCT

CACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGA

TGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCG

GGTAAA

SEQ ID NO.14：优化的L1轻链DNA

GACATCGTGATGACCCAGAGCCCCCTGAGCCTGCCCGTGACCCCTGGCGAGCC

CGCCAGCATCAGCTGTAGAGTGAGCCAGAGCCTGCTGCACAGCAACGGCTACA

CCTACCTGCACTGGTATCTGCAGAAGCCTGGCCAGAGCCCTCAGCTGCTGATCT

ACAAGGTGTCCAACCGGTTCAGCGGCGTGCCTGATAGATTCAGCGGCAGCGGC

TCCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCAGAGTGGAGGCCGAGGATGTGGG

CGTGTACTACTGCTCCCAGACCAGACACGTGCCTTACACCTTTGGCGGCGGAA

CAAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCC

CCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAA

CAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGC

AGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCAC

CTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACA

AGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAG

AGCTTCAACCGGGGCGAGTGC

SEQ ID NO.15：L1全长

GATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCG

GCCTCCATCTCCTGCAGAGTTAGTCAGAGCCTTTTACACAGTAATGGATACACCT

ATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTATA

AAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAG

GCACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTT

ATTACTGCTCTCAAACTAGACATGTTCCGTACACGTTCGGCGGAGGGACCAAGG

TGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTG

ATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTA

TCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTCCAATCGGGTA

ACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTC

AGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGC

CTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACA

GGGGAGAGTGT

Claims

1.一种在微粒载体中囊封生物活性剂的方法，包括以下步骤：

a)在疏水离子配对(HIP)试剂存在下使生物活性剂在有机溶剂中溶解以形成有机相；

b)使聚合物形成物质的单体或寡聚体溶解于(a)中形成的有机相中；

d)得到从乳液中形成的微粒载体。

2.一种在微粒载体中囊封生物活性剂的方法，包括以下步骤：

b)从水相中分离复合物；

c)除去水相，并使复合物与有机相均化；

(ii)使聚合物形成物质的单体或寡聚体溶解于(c)中形成的有机相中，然后在连续水相中形成有机相的乳液，以允许单体或寡聚体聚合形成聚合物；以及

e)得到从步骤(d)中的乳液中形成的微粒载体。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的单体包含氰基丙烯酸烷基酯(ACA)。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的单体包含氰基丙烯酸丁酯(BCA)。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的聚合物包括：聚-L-交酯(PLA)、聚氰基丙烯酸丁酯(PBCA)或聚(丙交酯-乙交酯)共聚物(PLG)或聚己酸内酯、聚羟基丁酸酯和/或其共聚物。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的聚合物包括聚己酸内酯。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的聚合物包括聚(丙交酯-乙交酯)共聚物(PLG)。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的聚合物包括聚-L-交酯(PLA)。

9.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述连续水相的pH为约6或更高。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，所述的微粒载体是纳米粒子。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其特征在于，所述的生物活性剂是蛋白或肽。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述的生物活性剂是抗原结合分子。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述的抗原结合分子包括域。

14.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述的抗原结合分子是抗体。

15.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述的抗原结合分子是域抗体。

16.根据前述任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述的生物活性剂在没有疏水离子配对试剂存在的条件下不溶于有机相中。

17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其特征在于，当生物活性剂是阳离子时，所述的HIP试剂是阴离子HIP试剂。

18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述的HIP试剂是多库酯钠。

19.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其特征在于，当生物活性剂是阴离子时，所述的HIP试剂是阳离子HIP试剂。

20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述的HIP试剂是二甲基二(十八烷基)溴化铵(DDAB18)、1，2-二油酰基氧基-3-三甲铵丙烷(DOTAP)、或十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)。

21.一种微粒载体，其特征在于，该微粒载体包括由前述任意一项权利要求所述的方法可得到的囊封的生物活性剂。

22.根据权利要求21所述的微粒载体，其特征在于，所述的蛋白与聚合物的比例至少是约1.0％w/w，或至少约2.5％w/w或者至少是约5％w/w。

23.根据权利要求21所述的微粒载体，其特征在于，所述的肽与聚合物的比例至少是约5％w/w，或至少约9％w/w。

24.根据权利要求21所述的微粒载体，其特征在于，所述的抗体与聚合物的比例至少是约1％w/w，或至少约2.5％w/w。

25.根据权利要求21所述的微粒载体，其特征在于，纳米粒子中所述的域抗体与聚合物的比例至少是约5％w/w。

26.一种药物组合物，其特征在于，所述的组合物包括权利要求21-25中任一项所述的微粒载体。

27.根据权利要求26所述的药物组合物在治疗或预防疾病中的用途。