MX2010012137A - Encapsulacion de agentes biologicamente activos. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona vehículos en forma de partícula que comprenden agentes biológicamente activos encapsulados tales como proteínas para suministro a través de la barrera hematoencefálica. También se proporcionan procedimientos para el suministro de proteínas a través de la barrera hematoencefálica en nanopartículas, y usos de dichas composiciones en un tratamiento.

Description

ENCAPSULAC10N DE AGENTES BIOLOGICAMENTE ACTIVOS Antecedentes Varios fármacos tienen actividad en objetivos en el cerebro o en el ojo, para llevar los mismos hasta su objetivo tienen que pasar a través de una barrera biológica tal como la barrera hematoencefálica . Aunque algunas moléculas son capaces de atravesar barreras biológicas, existen otras que no pasan por estas barreras de forma eficaz o, de hecho, de ningún modo. Muchos fármacos también son eficaces solamente cuando se administran directamente al tejido objetivo y si el fármaco no puede alcanzar este tejido objetivo, simplemente no puede actuar. Por lo tanto, muchos fármacos potencialmente potentes no son útiles clínicamente debido a su incapacidad de atravesar tales barreras biológicas.

En la técnica se han descrito varias estrategias para aumentar la penetración del fármaco a través de estas barreras biológicas.

Una estrategia ha sido alterar la función de la propia barrera. Por ejemplo, agentes osmóticos o arecolinas colinomiméticas dan como resultado la abertura, o un cambio en la permeabilidad, de la barrera hematoencefálica {Saija A y col, J Pharm. Pha. 42: 135-138 (1990)).

Otra estrategia se basa en la modificación de las propias moléculas del fármaco. Por ejemplo, las modificaciones de proteínas para intentar el pasaje a través de la barrera hematoencefálica incluyen la glicación de tales proteínas o, alternativamente, formar un profármaco. (Documento WO/2006/029845) .

Otra estrategia más es el implante de polímeros de liberación controlada que liberan el ingrediente activo de un sistema de matriz directamente al tejido nervioso. Sin embargo, esta estrategia es invasiva y requiere intervención quirúrgica si se implanta directamente en el cerebro o la médula espinal (Sable y col patente de Estados Unidos N° 4.833.666). Esto presenta problemas con la conformidad del paciente y a menudo permite solamente el suministro localizado dentro del cerebro drenándose habitualmente el fármaco administrado muy rápidamente. (Documento WO/2006/029845).

Para superar estas limitaciones se han usado sistemas de vehículo de fármaco, sin embargo, un problema principal en el suministro de fármaco dirigido es la opsonización rápida y la captación de los vehículos inyectados por el sistema reticuloendotelial (SER), especialmente por los macrófagos en el hígado y el bazo.

Por lo tanto, sigue habiendo . una necesidad de un medio eficiente y eficaz para suministrar macromoléculas tales como proteínas al cerebro y al ojo. En particular, sería deseable encontrar un procedimiento de suministro de macromoléculas a través de la barrera hematoencefálica, que conservara la actividad después de la entrada en el cerebro y que también puede proporcionar cinéticas de liberación deseables, mantener estabilidad y actividad de proteína y tener la capacidad de evadir los mecanismos de eliminación.

Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 muestra los datos de clasificación por tamaño obtenidos para una formulación de nanoparticulas por dispersión dinámica de luz (DLS) que indican la presencia de nanoparticulas preparadas por el procedimiento hueco en suspensión.

Fig. 1(a) Correlograma obtenido después del análisis de una suspensión de nanoparticulas por dispersión dinámica de luz.

Fig. 1(b) Distribución de tamaño multimodal (datos obtenidos) de las nanoparticulas representada para ilustrar la distribución de la población de partículas (número) a lo largo de un intervalo de tamaños.

Fig. 1(c) Distribución de tamaño multimodal (datos obtenidos) de las nanoparticulas representada para ilustrar la distribución de la población de partículas (número) a lo largo de un intervalo de tamaños.

Fig. 1(d) Distribución de tamaño multimodal (datos obtenidos) de las nanoparticulas representada para ilustrar la distribución de la población de partículas (número) a lo largo de un intervalo de tamaños.

Figura 2. - Nanoparticulas analizadas por MEB Figura 3 - Imagen de nanoparticulas huecas por MET, con una imagen superpuesta de nanoparticulas de PBCA sólidas para comparación.

Figura 4 - Mediciones de eficacia de encapsulación de lgG1 monoclonal (anti-CD23).

Figura 5 - Perfil de liberación obtenido después de la degradación enzimática de partículas y análisis de la enzima liberada por ELISA.

Figura 6 - Determinación de la eficacia de encapsulación de un anticuerpo de dominio (dAb de lisozima de huevo de gallina) por el ensayo de ácido bicinconínico (ensayo de BCA) en una nanopartícula de PBCA hueca.

Figura 7. Datos de clasificación por tamaño obtenidos por DLS que indican la presencia de nanopartículas en suspensión.

Fig 7 (a) - Correlograma obtenido después del análisis de una suspensión de nanopartículas por dispersión dinámica de luz.

Fig 7 (b) - Distribución de tamaño multimodal (datos obtenidos) de las nanopartículas representada para ilustrar la distribución de la población de partículas (número) a lo largo de un intervalo de tamaños.

Fig 7 (c) - Distribución de tamaño multimodal (datos obtenidos) de las nanopartículas representada para ilustrar la distribución de la población de partículas (número) a lo largo de un intervalo de tamaños.

Fig 7 (d) - Distribución de tamaño multimodal (datos obtenidos) de las nanopartículas representada para ilustrar la distribución de la población de partículas (número) a lo largo de un intervalo de tamaños.

Figura 8. Comparación de las cantidades de Dalargina encapsulada conseguidas con el procedimiento de HIP con las conseguidas por el procedimiento común de adsorción sobre la superficie de la partícula.

Figura 9 - Niveles de Dalargina en el cerebro después del suministro con nanopartículas de PBCA de HIP. El péptido era detectable en el cerebro solamente cuando se encapsulaba dentro de las partículas usando el procedimiento de HIP.

Figura 10. - Encapsulación de dalargina en partículas de PBCA usando el procedimiento de HIP. Determinación del efecto de pH sobre la fase acuosa de la eficacia de encapsulación.

Figura 11. - Encapsulación de anticuerpo de dominio anti-lisozima de huevo de gallina en nanopartículas de PBCA usando el procedimiento de HIP. Las nanopartículas se analizaron por secuenciación de Edman.

Figura 12 - Mediciones de eficacia de encapsulación de I g G 1 monoclonal (anti-CD23).

Figura 13 - Confirmación de encapsidación de dAb en nanopartículas de PBCA de HIP por análisis SDS-PAGE. Las nanopartículas se centrifugaron para eliminar cualquier dAb libre y los sedimentos se analizaron por SDS-PAGE para visualizar el dAb encapsidado.

Figura 14 - Determinación de la carga de dAb de VEGF (DOM15-26-593) en nanopartículas de PBCA de HIP por análisis de SDS-PAGE. Las formulaciones de nanopartículas se compararon con patrones de dAb para cuantificar la cantidad de dAb presente en las nanopartículas. Un total de 3,31 mg de dAb se ha encapsidado en las nanopartículas de la cantidad de aportación de partida de 12 mg. Por lo tanto, la eficacia de carga era deh27,6%. La carga de dAb era de 3,31% p/p.

Figura 15 - Resultados de la evaluación in vivo de nanopartículas de PBCA de HIP que contenían anticuerpos de dominio para determinar su capacidad para suministrar su carga de proteínas al cerebro en el ratón por la vía intravenosa. A los 10 minutos post-administración, el dAb en las nanopartículas dio como resultado captación por cerebro detectable que ascendía a 8,0 ng/ml. El dAb libre también era detectable en el cerebro a la concentración ligeramente inferior de 3,3 ng/ml (datos preliminares). Por lo tanto, las nanopartículas parecían aumentar ligeramente la captación cerebral de la proteína (datos preliminares). A los 60 minutos se observó lo opuesto cuando el dAb libre parecía acumularse en el cerebro dando como resultado un aumento adicional en sus niveles cerebrales hasta 13,5 ng/ml. Los niveles cerebrales se corrigieron.

Figura 16 - Proporciones de cerebro a sangre de dAb obtenidas a partir de la evaluación in vivo de nanopartículas de PBCA de HIP que contenían anticuerpos de dominio por la vía intravenosa. Los resultados muestran que proporciones mayores de dAb estaban presentes en el cerebro en comparación con la sangre cuando se administraban con nanopartículas en comparación a cuando el dAb se administraba libre en solución.

Figura 17 - Resultados de la evaluación in vivo de nanopartículas de PBCA de HIP que contenían anticuerpos de dominio para determinar su capacidad de suministrar su carga de proteína al cerebro en el ratón por la vía intracarotídea. A los 10 minutos post administración, el dAb en el grupo de nanopartículas mostró niveles altos de dAb en el cerebro con un promedio de 627,60 ng/ml.

Figura 18 - Proporciones de cerebro a sangre de dAb obtenidas a partir de la evaluación in vivo de nanopartículas de PBCA de HIP que contenían anticuerpos de dominio por la vía intracarotídea. El dAb en el grupo de nanopartículas mostró proporciones de cerebro a sangre que eran superiores a 1 en ambos puntos de tiempo (1,569 y 1,845 a los 10 y 60 minutos, respectivamente) sugiriendo que la mayoría de los dAb formulados habían alcanzado de forma exitosa el cerebro.

Figura 19 - Confirmación de generación de microesferas por microscopía óptica. Las formulaciones de microesferas se generaron todas por el procedimiento de HIP usando policaprolactona. (a) tensoactivo Vít E TPGS al 2% 4000 rpm 2 min 20x aum (b) tensoactivo Vit E TPGS al 2% 7500 rpm 2 min 20x aum (c) tensoactivo vit E TPGS al 2% 7500 rpm 2 min + dAb1 20x aum (d) tensoactivo vit E TPGS al 2% 7500 rpm 2 min + dAb2 20x aum Figura 20 - Confirmación de generación de microesferas por difracción por láser. Las formulaciones de microesferas se generaron todas por el procedimiento de HIP usando policaprolactona. (a) tensoactivo Vit E TPGS al 2% 4000 rpm 2 min 20x aum (b) tensoactivo Vit E TPGS al 2% 7500 rpm 2 min 20x aum (c) tensoactivo vit E TPGS al 2% 7500 rpm 2 min + dAbl 20x aum (d) tensoactivo vit E TPGS al 2% 7500 rpm 2 min + dAb220x aum Figura 21 - Confirmación de encapsidación de dAb en microesferas de PC de HIP por análisis SDS-PAGE. Las microesferas se filtraron, (F) centrifugaron, (3k o 13 rpm) para eliminar cualquier dAb libre y el sobrenadante, (S) y los sedimentos (P), se analizaron por SDS-PAGE para visualizar el dAb encapsidado.

Figura 22 - Confirmación de liberación de dAb encapsidado de microesferas de PC de HIP por análisis de SDS-PAGE. Las microesferas se lavaron y después se trataron térmicamente a 56°C durante 0, 20, 40 ó 60 min para liberar dAb, los restos se sedimentaron, (5 min a 5 k) y el sobrenadante, (S), se analizó por SDS-PAGE para visualizar el dAb encapsidado. Marcadores moleculares -patrón preteñido SeeBlue Plus 2, (invitrogen), peso molecular (kd), el gel confirmó que la liberación de los dAb había tenido lugar. El gel también confirmó que los dAb estaban intactos y que no se habían fragmentado debido al procedimiento de liberación.

Breve Descripción de la Invención En un aspecto de la presente invención se proporciona un procedimiento para encapsular agentes biológicamente activos en vehículos en forma de partículas tales como procedimientos para encapsular proteínas y/o péptidos en, o en y sobre, o con nanopartículas y un procedimiento para el suministro de proteínas y/o péptidos a través de la barrera hematoencefálica por encapsulación en, o en y sobre, o con nanopartículas y un procedimiento para suministrar proteínas y/o péptidos al ojo por encapsulación en, o en y sobre, o con vehículos en forma de partículas.

En otra modalidad de la presente invención se proporcionan vehículos en forma de partículas que comprenden una sustancia formadora de partículas y un agente biológicamente activo tal como una proteína y/o un péptido, para el suministro de una proteína y/o un péptido de la sangre al cerebro a través de la barrera hematoencefálica o para el suministro al ojo. En otra modalidad de la invención hay composiciones de nanopartículas y su uso para tratar trastornos o enfermedades del sistema nervioso central y/o el ojo.

Descripción Detallada de la Invención La invención proporciona vehículos en forma de partículas que comprenden una sustancia formadora de partículas y un agente biológicamente activo y procedimientos para preparar dichos vehículos en forma de partículas.

En una modalidad, las nanopartículas de la presente invención comprenden agentes biológicamente activos tales como proteínas o péptidos. Tales proteínas pueden ser moléculas de unión a antígeno que, como se usan en este documento, se refieren a anticuerpos, fragmentos de anticuerpo u otras construcciones de proteína que son capaces de unirse a un objetivo. Las moléculas de unión a antígeno pueden comprender un dominio. Un "dominio" es una estructura proteica plegada que tiene estructura terciaria independiente del resto de la proteina. Generalmente, los dominios son responsables de las propiedades funcionales separadas de proteínas y, en muchos casos, se pueden añadir, eliminar o transferir a otras proteínas sin pérdida de función del resto de la proteína y/o del dominio. Un "dominio variable de anticuerpo único" es un dominio polipeptídico plegado que comprende secuencias características de dominios variables de anticuerpos. Por lo tanto, incluye dominios variables de anticuerpos completos y dominios variables modificados, por ejemplo, en los que uno o más bucles se han sustituido por secuencias que no son características de dominios variables de anticuerpos o dominios variables de anticuerpos que se han truncado o comprenden extensiones N- o C-terminales, así como fragmentos plegados de dominios variables que conservan al menos la actividad y especificidad de unión del dominio de longitud completa.

Las moléculas de unión a antígeno pueden comprender al menos un dominio variable de inmunoglobulina, por ejemplo, tales moléculas pueden comprender un anticuerpo, un anticuerpo de dominio, Fab, Fab', F (ab')2, Fv, ScFv, diacuerpo, anticuerpo heteroconjugado. Tales moléculas de unión a antígeno pueden ser capaces de unirse a un único objetivo o pueden ser multiespecíf icas, es decir, unirse a varios objetivos, por ejemplo, pueden ser biespecíficas o triespecíficas. En una modalidad, la molécula de unión a antígeno es un anticuerpo. En otra modalidad, la molécula de unión a antígeno es un anticuerpo de dominio (dAb). En otra modalidad más, la molécula de unión a antígeno puede ser una combinación de anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno tales como, por ejemplo, uno o más dAb y/o uno o más ScFv unidos a un anticuerpo monoclonal. En otra modalidad más, la molécula de unión a antígeno puede ser una combinación de anticuerpos y péptidos. Las moléculas de unión a antígeno pueden comprender al menos un dominio de unión a no Ig tal como un domino que se une específicamente a un antígeno o epítope independientemente de una región o dominio V diferente, esto puede ser un dAb, por ejemplo, un domino variable único de inmunoglobulina humano, de camélido o tiburón o puede ser un dominio que es un derivado de un armazón seleccionado del grupo constituido por CTLA-4 (Evibody); lipocalina; moléculas derivadas de Proteína A tales como dominio Z de Proteína A (Affibody, SpA), dominio A (Avimer/Maxibody); proteínas de choque térmico tales como GroEl y GroES; transferrina (trans-body); proteína de repetición de anquirina (DARPin); aptámero de péptido; dominio de lectina de tipo C (Tetranectina); cristalina humana y ubiquitína humana (affilin); dominios PDZ; dominios de tipo Kunitz de toxina de escorpión de inhibidores de proteasa humana; y fibronectina (adnectin); que se ha sometido a ingeniería genética de proteínas para obtener la unión a un ligando diferente al ligando natural.

El CTLA-4 (Antígeno 4 asociado a Linfocitos T Citotóxicos) es un receptor de la familia CD28 expresado principalmente en células T CD4 + . Su dominio extracelular tiene un pliegue de Ig similar a dominio. Los bucles correspondientes a las CDR de anticuerpo se pueden sustituir con una secuencia heteróloga para conferir diferentes propiedades de unión. Las moléculas de CTLA-4 modificadas por ingeniería genética para tener diferentes especificidades de unión también se conocen como Evibodies. Para detalles adicionales véase Journal of Immunological Methods 248 (1-2), 31-45 (2001).

Las lipocalinas son una familia de proteínas extracelulares que transportan pequeñas moléculas hidrófobas tales como esteroides, bilinas, retinoides y lípidos: Tienen una estructura secundaria de lámina rígida con varios bucles en el extremo abierto de la estructura cónica que se pueden modificar por ingeniería genética para unirse a diferentes antígenos objetivo. Las anticalinas tienen entre 160-180 aminoácidos de tamaño y se obtienen de lipocalinas. Para detalles adicionales véase Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 (2000), el documento US7250297B1 y el documento US20070224633.

Un affibody es un armazón obtenido de la Proteína A de Staphylococcus aureus que se puede modificar por ingeniería genética para unirse a un antígeno. El domino consiste en un haz de tres hélices de aproximadamente 58 aminoácidos. Se han generado genotecas por aleatorización de restos de superficie. Para detalles adicionales véase Protein Eng. Des. Sel. 17, 455-462 (2004) y el documento EP1641818A1.

Los avimer son proteínas multidominio obtenidas de la familia de armazón de dominio A. Los dominios nativos de aproximadamente 35 aminoácidos adoptan una estructura unida por puente disulfuro definida. La diversidad se genera deshaciéndose de la variación natural mostrada por la familia de dominios A. Para detalles adicionales véase Nature Biotechnology 23(12), 1556-1561 (2005) y Expert Opinión on Investigational Drugs 16(6), 909-917 (junio 2007).

Una transferrina es una glucoproteína de transporte sérica monomérica. Las transferrina se pueden modificar por ingeniería genética para unirse a diferentes antígenos objetivo por inserción de secuencias peptídicas en un bucle de superficie permisivo. Los ejemplos de armazones de transferrina modificados por ingeniería genética incluyen el Trans-body. Para detalles adicionales véase J. Biol. Chem 274, 24066-24073 (1999).

Las Proteínas de Repetición de Anquirina Diseñadas (DARPin) se obtienen de Anquirina que es una familia de proteínas que median en la unión de proteínas integrales de membrana al citoesqueleto. Una repetición única de Anquirina es un motivo de 33 restos constituido por dos hélices y un giro. Se pueden modificar por ingeniería genética para unirse a diferentes antígenos objetivo aleatorizando restos en la primera hélice y un giro de cada repetición. Su interfaz de unión se puede aumentar aumentando el número de módulos (un procedimiento de maduración por afinidad). Para detalles adicionales véase J. Mol. Biol. 332, 489-503 (2003), PNAS 100(4), 1700-1705 (2003) y J. Mol. Biol. 369, 1015-1028 (2007) y el documento US20040132028A1.

La fibronectina es un armazón que se puede modificar por ingeniería genética para unirse a un antígeno. Las adnectina consisten en una cadena principal de la . secuencia natural de aminoácidos del 10° dominio de las 15 unidades de repetición de fíbronectina humana de tipo III (FN3). Tres bucles en un , extremo del sándwich se pueden modificar por ingeniería genética para permitir que una Adnectina reconozca específicamente un objetivo terapéutica de interés. Para detalles adicionales véase Protein Eng. Des. Sel. 18, 435-444 (2005), el documento US20080139791 , el documento WO2005056764 y el documento US6818418B1.

Los aptámeros de péptidos son moléculas de reconocimiento de combinación constituidas por una proteína de armazón constante, típicamente tioredoxina (TrxA) que contiene un bucle peptídico variable constreñido insertado en el sitio activo. Para detalles adicionales véase Expert Opin. Biol. Ther. 5, 783-797 (2005).

Los microcuerpos se obtienen de microproteínas de origen natural de 25-50 aminoácidos de longitud que contienen 3-4 puentes de cisteína - los ejemplos de microproteínas incluyen KalataBI y conotoxina y knotinas. Las microproteínas tienen un bucle que se puede modificar por ingeniería genética para incluir hasta 25 aminoácidos sin afectar al plegamiento global de la microproteína. Para detalles adicionales de dominios de knotina modificados por ingeniería genética, véase el documento WO 2008098796.

Otros dominios de unión a no Ig incluyen proteínas que se han usado como un armazón para modificar por ingeniería genética diferentes propiedades de unión a antígeno objetivo que incluyen cristalina humana y ubiquitina humana (afililin), dominios de tipo kunitz de inhibidores de proteasa humana, dominios PDZ de la proteína de unión a Ras AF-6, toxinas de escorpión (charibdotoxina), dominio de lectina de tipo C (tetranectinas) y se revisan en el Capítulo 7 - Non-Antibody Scaffolds from Handbook of Therapeutic Antibodies (2007, editado por Stefan Dubel) y Protein Science 15: 14-27 (2006). Los dominios de unión a non Ig de la presente invención se podrían obtener a partir de cualquiera de estos dominios de proteina alternativos.

En una modalidad de la invención, la molécula de unión a antígeno se une a un objetivo encontrada en el sistema nervioso central tal como, por ejemplo, en el cerebro o la médula espinal o, por ejemplo, en tejido neuronal.

En una modalidad adicional de la invención descrita en este documento, la molécula de unión a antígeno se une específicamente a un objetivo que se conoce que está ligada a enfermedades o trastornos neurológicos tales como, por ejemplo, MAG (glucoproteína asociada a mielina), NOGO (proteina inhibidora de sobrecrecimiento de neuritas) o ß-amiloide.

Tales moléculas de unión a antígeno incluyen moléculas de unión a antígeno capaces de unirse a NOGO, por ejemplo, anticuerpos anti-NOGO. Un ejemplo de un anticuerpo anti-NOGO para el uso en la presente invención es el anticuerpo definido p.or la cadena pesada de las SEC ID N° 1 y la cadena ligera de la SEC ID N° 2 o un anticuerpo anti-NOGO o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende las CDR del anticuerpo indicado en las SEC ID N° 1 y 2. Se pueden encontrar detalles adicionales de este anticuerpo (H28 L16) en la solicitud PCT WO 2007068750 que se incorpora en este documento como referencia.

Tales moléculas de unión a antígeno incluyen moléculas de unión a antígeno capaces de unirse a MAG, por ejemplo, anticuerpos anti-MAG- Un ejemplo del anticuerpo anti-MAG para el uso en la presente invención es el anticuerpo definido por la región variable de cadena pesada de la SEC ID N° 11 y la región variable de cadena ligera de la SEC ID N°, 12 o un anticuerpo anti-MAG o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende las CDR del anticuerpo indicado en las SEC ID N° 1 y 2. Se pueden encontrar detalles adicionales de este anticuerpo (BvH1 CvL1) en la solicitud PCT WO 2004014953 que se incorpora en este documento como referencia.

Tales moléculas de unión a antígeno incluyen moléculas de unión a antígeno capaces de unirse a p-amiloide, por ejemplo, anticuerpos anti-|3-amiloide. Un ejemplo del anticuerpo anti-ß-amiloide para el uso en la presente invención es el anticuerpo definido por la región cadena pesada de la SEC ID N° 5 y/o la cadena ligera de la SEC ID N° 6 o un anticuerpo anti-p-amiloide o fragmento de unión a antigeno del mismo que comprende las CDR del anticuerpo indicado en las SEC ID N° 5 y 7. Se pueden encontrar detalles adicionales de este anticuerpo (H2L1) en la solicitud PCT WO 2007113172 que se incorpora en este documento como referencia.

Las secuencias de CDR de tales anticuerpos se pueden determinar por el sistema de numeración de Kabat (Kabat y col; Secuences of proteins of Immunoiogical Interest NIH, 1987), el sistema de numeración Chothia (Al-Lazikani y col.; (1997) JMB 273, 927-948), el procedimiento de definición por contacto (MacCallum R. M. y Martín A. C. R. y Thornton J. M. (1996), Journal of Molecular Biology, 262 (5), 732-745) o cualquier otro procedimiento establecido para numerar los restos en un anticuerpo y determinar las CDR conocidas por los especialista en la técnica.

En una modalidad de la invención, la proteína de unión a antígeno se une a un objetivo encontrada en el ojo tal como, por ejemplo, TNF, TNFr-1 , TNFr-2, receptor-2 de TGFbeta, VEGF, NOGO, MAG, IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, IL-17, CD20, Beta amiloide, FGF-2, IGF-1, PEDF, PDGF, un factor de complemento, por ejemplo, C3, C5, C5Ar, CFD, CHF, CFB, CFI, sCR1 o C3.

En una modalidad de la presente invención se proporciona una composición que comprende nanopartículas de acuerdo con cualquier procedimiento de la invención como se presenta aquí. En una modalidad adicional, al menos aproximadamente el 90% de las nanopartículas en número están dentro del intervalo de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 1000 nm cuando se miden usando técnicas de dispersión dinámica de luz. En una modalidad adicional, al menos aproximadamente el 90% de las nanopartículas en número están dentro del intervalo de aproximadamente un 1 nm a aproximadamente 400 nm, o de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 250 nm o de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 150 nm, o de aproximadamente 40 nm a aproximadamente 250 nm, o de aproximadamente 40 nm a aproximadamente 150 nm, o de aproximadamente 40 nm a aproximadamente 100 nm cuando se miden usando técnicas de dispersión dinámica de luz. En otra modalidad más de la presente invención, al menos aproximadamente el 90% de las nanopartículas en número están dentro del intervalo de aproximadamente 40 nm a aproximadamente 250 nm cuando se miden usando técnicas de dispersión dinámica de luz. En otra modalidad más de la presente invención, al menos aproximadamente el 90% de las nanopartículas en número están dentro del intervalo de aproximadamente 40 nm a aproximadamente 150 nm cuando se miden usando técnicas de dispersión dinámica de luz.

En otra modalidad más, se proporciona una composición que comprende las nanopartículas de la presente invención, donde el tamaño medio de las nanopartículas en la composición es inferior a aproximadamente 1000 nm de diámetro, por ejemplo, inferior a aproximadamente 400 nm de diámetro, por ejemplo, es inferior a aproximadamente 250 nm, por ejemplo, es inferior a aproximadamente 150 nm de diámetro cuando se mide por técnicas de dispersión de luz. En otra modalidad más, el tamaño medio de las nanopartículas en la composición es de aproximadamente 40 nm a aproximadamente 250 nm. En otra modalidad más, el tamaño medio de las nanopartículas en la composición es de aproximadamente 40 nm a aproximadamente 150 nm.

En una modalidad de la presente invención se proporciona un procedimiento para encapsular un agente biológicamente activo en un vehículo en forma de partículas que comprende las etapas de: a) solubilizar un agente biológicamente activo en presencia de un agente de apareamiento de ión hidrófobo (HIP) y en un disolvente orgánico; b) disolver un monómero y/u oligómero de una sustancia formadora de polímero en la fase orgánica formada en (a); c) formar una emulsión de la fase orgánica formada en (b) en una fase acuosa continua para permitir la polimerización del monómero; y d) obtener vehículos en forma de partículas formados a partir de la emulsión.

En una modalidad adicional de la presente invención se proporciona un procedimiento para encapsular agentes biológicamente activos en un vehículo en forma de partículas que comprende las etapas de: a) mezclar un agente biológicamente activo en una fase acuosa con un agente de apareamiento de ión hidrófobo (HIP) en una fase de disolvente orgánico para formar un complejo de agente biológicamente activo-HIP; b) separación del complejo de la fase acuosa. c) eliminación de la fase acuosa y homogeneización del complejo con la fase orgánica; d) (i) disolver un polímero en la fase orgánica formada en (c) y formar después una emulsión de la fase orgánica en una fase acuosa continua; o (ii) disolver un monómero u oligómero de una sustancia formadora de polímero, en la fase orgánica formada en (c) y formar después una emulsión de la fase orgánica en una fase acuosa continua; para permitir la polimerización del monómero u oligómero para formar un polímero; y e) obtener un vehículo en forma de partículas formado a partir de la emulsión de la etapa (d).

Este procedimiento que usa agentes de apareamiento de ión hidrófobo permite la encapsulación de agentes biológicamente activos, por ejemplo, proteínas tales como, por ejemplo, proteínas hidrofilas dentro del núcleo de las partículas poliméricas hidrófobas. El apareamiento de ión hidrófobo permite la extracción de proteína en un medio orgánico y, por lo tanto, el procedimiento permite la preparación de un vehículo en forma de partículas con una única emulsión.

En una modalidad adicional, los agentes biológicamente activos a encapsular de acuerdo con el procedimiento son péptidos o proteínas, tales como proteínas terapéuticas o moléculas de unión a antígeno.

En una modalidad de la invención, la proteína se une a un objetivo encontrado en el sistema nervioso central, tal como, por ejemplo, en el cerebro o la médula espinal o, por ejemplo, en el tejido neuronal.

En otra modalidad más de la invención descrita en este documento, la proteína se une específicamente a un epítope que se conoce que está ligado a enfermedades o trastornos neurológicos tales como, por ejemplo, MAG (glucoproteína asociada a mielina), NOGO (proteína inhibidora de sobrecrecimiento de neuritas) o ß-amiloíde.

En una modalidad adicional de la invención descrita en este documento, la proteína es un anticuerpo que se une a NOGO, por ejemplo, cualquiera de los anticuerpos anti-NOGO descritos en la solicitud PCT WO2007068750, en particular, el anticuerpo denominado H28 L16 en la solicitud PCT WO2007068750 que se incorpora en este documento como referencia.

En una modalidad adicional de la invención descrita en este documento, la proteína es un anticuerpo que se une a MAG, por ejemplo, cualquiera de los anticuerpos anti-MAG descritos en la solicitud PCT WO2004014953, en particular, el anticuerpo denominado BvL1 CvL1 en la solicitud PCT WO200401 953 que se incorpora en este documento como referencia.

En una modalidad adicional de la invención descrita en este documento, la proteina es un anticuerpo que se une a ß-amiloide, por ejemplo, cualquiera de los anticuerpos anti- -amiloide descritos en la solicitud PCT WO2007113172, en particular, el anticuerpo denominado H2 L1 en la solicitud PCT WO2007113172 que se incorpora en este documento como referencia.

En una modalidad de la presente invención, los vehículos en forma de partículas pueden ser microesferas o nanopartículas. En una modalidad de este tipo, el vehículo en forma de partículas es una nanopartícula y el agente biológicamente activo es una proteína. En otra modalidad, el vehículo en forma de partículas es una nanopartícula y el agente biológicamente activo es un péptido. En una modalidad adicional, el vehículo en forma de partículas es una nanopartícula y el agente biológicamente activo comprende una molécula de unión a antígeno, por ejemplo, un anticuerpo de dominio o anticuerpo. En otra modalidad más, el vehículo en forma de partículas es una nanopartícula y el agente biológicamente activo comprende un dominio. En otra modalidad, el vehículo en forma de partículas es una microesfera y el agente biológicamente activo es una proteína. En una modalidad adicional, el vehículo en forma de partículas es una microesfera y el agente biológicamente activo es un péptido. En otra modalidad más, el vehículo en forma de partículas es una microesfera y el agente biológicamente activo comprende una molécula de unión a antígeno, por ejemplo, un anticuerpo de dominio o anticuerpo. En otra modalidad más, el vehículo en forma de partículas es una microesfera y el agente biológicamente activo comprende un dominio.

En una modalidad de la invención descrita en este documento, el agente biológicamente activo se une específicamente a un objetivo que se sabe que está ligada a enfermedades o trastornos neurológicos tales como, por ejemplo, MAG, NOGO o ß-amiloide.

En una modalidad, el agente biológicamente activo es insoluble en la fase orgánica sin presencia de agentes de apareamiento de ion hidrófobo.

En una modalidad de la invención como se describe en este documento, el agente de apareamiento de ión hidrófobo es un agente de HIP cat'iónico cuando la proteína es aniónica. En otra modalidad, el agente de apareamiento de ión hidrófobo es un agente de HIP aniónico cuando la proteína es catiónica. En una modalidad adicional, el agente de HIP aniónico se selecciona del grupo constituido por cationes de alquil amonio cuaternario, preferiblemente bromuros de alquil amonio, más preferiblemente bromuro de tetrabutilamonio, bromuro de tetrahexilamonio, bromuro de tetraoctilamonio, dodecilsulfato sódico (SDS), oleato sódico o docusato sódico (también conocido como Aerosol OT™) y el agente de HIP está presente en cantidades estequiométricas iguales o superiores al número de cargas positivas netas en la proteína. En otra modalidad, el agente de HIP catiónico se selecciona del grupo constituido por: bromuro de dimetildioctadecil-amonio (DDAB18); propano de 1 ,2-dioleoxi-3-(trimetilamonio (DOTAP); o bromuro de cetrimonio (CTAB) y el agente de HIP está presente en cantidades estequiométricas iguales o superiores al número de cargas negativas netas en la proteína.

En una modalidad adicional, cualquier catión o anión hidrófobo se podría usar potencialmente como un agente de HIP para solubilizar la proteína. El apareamiento de ión hidrófobo (HIP) implica la sustitución estequiométrica de contraiones polares con una especie de carga similar pero que se disuelve menos fácilmente. Como se describe en este documento, la invención proporciona un procedimiento que usa HIP para cambiar las propiedades de solubilidad de proteínas, permitiendo la extracción de la proteína en un disolvente orgánico, tal como cloruro de metileno. El docusato sódico (sulfosuccinato de bis(2-etilhexilo) sódico) es un ejemplo de un agente de apareamiento de ión adecuado. En una modalidad, el cloruro de metileno que contiene docusato sódico se mezcla con una solución de proteína acuosa. Esto da como resultado el apareamiento de iones del ión docusato con la proteína y la división posterior de la proteína en la fase oleosa. La disolución de la proteína en el cloruro de metileno permite que la proteína se encapsule en nanopartículas o microesferas preparadas mediante un procedimiento de emulsión única de aceite en agua.

En una modalidad de la invención descrita en este documento, la fase acuosa continua tiene un pH de aproximadamente 7,0 o superior cuando la proteína es aniónica y el agente de HIP es catiónico, por ejemplo, el pH puede ser al menos aproximadamente 8,0 o al menos aproximadamente 10,0 o es al menos aproximadamente 12,0. En una modalidad alternativa de la invención descrita en este documento, la fase acuosa continua tiene un pH de aproximadamente 7,0 o inferior cuando la proteína es catiónica y el agente de HIP es aniónico, por ejemplo, el pH puede ser inferior a aproximadamente 6,0 o inferior a aproximadamente 4,0 ó inferior a aproximadamente 2,0.

En una modalidad de este tipo, la proporción de peso/peso (p/p) de proteína a polímero puede ser del 0,5% al 90%, por ejemplo, es al menos aproximadamente el 0,5% o es al menos aproximadamente el 1% o es al menos aproximadamente el 2% o es al menos aproximadamente el 2,5% o es al menos aproximadamente el 5% o es al menos aproximadamente el 9% o es al menos aproximadamente el 10% o es al menos aproximadamente el 15% o es al menos aproximadamente el 20% o es al menos aproximadamente el 40% o es al menos aproximadamente el 50%, o es al menos aproximadamente el 60%, o es al menos aproximadamente el 70%, o es al menos aproximadamente el 80% o es al menos aproximadamente el 90%. Por ejemplo, cuando la proteína es un péptido, la proporción de péptido a polímero puede ser al menos aproximadamente el 9%, cuando la proteína es un anticuerpo, la proporción de anticuerpo a polímero puede ser al menos aproximadamente el 2% o cuando la proteína es un anticuerpo de dominio, la proporción de anticuerpo de dominio a polímero puede ser al menos aproximadamente al 2,5%.

En una modalidad de la presente invención, la proporción p/p de proteína con respecto a la formulación total (polímero + HIP y opcionalmente tensioactivos) puede ser del 0,5% al 50%, por ejemplo, es al menos aproximadamente el 5% o al menos aproximadamente el 9% o al menos aproximadamente el 15% o al menos aproximadamente el 16% o al menos aproximadamente el 20% o al menos aproximadamente el 25%. Por ejemplo, cuando la proteína es un péptido, la proporción de péptido a formulación total puede ser al menos aproximadamente el 16% o cuando la proteína es un anticuerpo, la proporción de anticuerpo a polímero puede ser al menos aproximadamente el 1% o cuando la proteína es un anticuerpo de dominio, la proporción de anticuerpo de dominio a formulación total puede ser al menos aproximadamente el 9%.

En una modalidad de la presente invención, la eficacia de encapsulación de las partículas es al menos aproximadamente el 1% o es al menos aproximadamente el 2% o es al menos aproximadamente el 10% o es al menos aproximadamente el 20% o es al menos aproximadamente el 40% o es al menos aproximadamente el 50% o es al menos aproximadamente el 60% o es al menos aproximadamente el 70% o es al menos aproximadamente el 80% o es al menos aproximadamente el 90% o es al menos aproximadamente el 95% o es al menos aproximadamente el 97% o es al menos aproximadamente el 99%. Por ejemplo, cuando la proteína es un péptido, la eficacia de encapsulación puede ser al menos aproximadamente el 90%, cuando la proteína es un anticuerpo, la eficacia de encapsulación puede ser al menos aproximadamente el 1% o cuando la proteína es un anticuerpo de dominio, la eficacia de encapsulación puede ser al menos aproximadamente el 70%.

En una modalidad de la presente invención, el monómero u oligómero se selecciona del grupo constituido por: metilmetacrilatos, alquilcianoacrilatos, hidroxietilmetacrilatos, ácido metacrílico, dimetacrilato de etilenglicol, acrilamida, N, ?/'-bismetileno acrilamida y metacrilato de 2-dimetilaminoetilo. En una modalidad adicional, el monómero es un alquilcianoacrilato, por ejemplo, es butilcianoacrilato (BCA).

En una modalidad se proporciona un vehículo en forma de partículas polimérico que comprende un agente biológicamente activo en una fase acuosa en un lumen hueco.

En otra modalidad más de la presente invención se proporciona un procedimiento para encapsular agentes biológicamente activos en vehículos en forma de partículas para suministro ocular que comprende las etapas de: a) disolver un polímero en un disolvente orgánico para formar una solución polimérica; b) añadir una solución acuosa que contiene un agente biológicamente activo a la solución polimérica para formar una emulsión primaria de gotas de fase acuosa en una fase orgánica continua; c) mezclar la emulsión primaria con un medio acuoso para formar una emulsión W/O/W; y d) permitir que la fase orgánica se evapore y obtener de este modo vehículos en forma de partículas que comprenden un lumen hueco que contienen dicho agente biológicamente activo en una fase acuosa.

El permitir que se evapore la fase orgánica puede pasivo o activo. Por ejemplo, la evaporación activa puede ser mediante el uso de calor. En una modalidad de este tipo, el suministro ocular es periocular, por ejemplo, trans-escleral, subconjuntival, subtenoniana, peribulbar, tópica, retrobulbar o se suministra al músculo recto inferior, superior o lateral. En una modalidad, el suministro ocular es trans-escleral.

En una modalidad adicional, los agentes biológicamente activos a encapsular de acuerdo con el procedimiento son péptidos o proteínas, tales como proteínas terapéuticas o moléculas de unión a antígeno.

El vehículo en forma de partículas usado en tales procedimientos puede ser una microesfera o una nanopartícula. Por ejemplo, el vehículo en forma de partículas puede ser una nanopartícula y el agente biológicamente activo, una proteína o el vehículo en forma de partículas puede ser una nanopartícula y el agente biológicamente activo un péptido o el vehículo en forma de partículas puede ser una nanopartícula y el agente biológicamente activo comprende una molécula de unión a antígeno tal como un anticuerpo de dominio o anticuerpo. En otra modalidad más, el vehículo en forma de partículas es una nanopartícula y el agente biológicamente activo comprende un dominio.

Alternativamente, el vehículo en forma de partículas puede ser una microesfera y el agente biológicamente activo, una proteína o el vehículo en forma de partículas puede ser una microesfera y el agente biológicamente activo, un péptido o el vehículo en forma de partículas puede ser una microesfera y el agente biológicamente activo comprende un molécula de unión a antígeno tal como un anticuerpo de dominio o anticuerpo o una combinación de los mismos. En otra modalidad más, el vehículo en forma de partículas es una microesfera y el agente biológicamente activo comprende un dominio.

En una modalidad de la presente invención, se proporciona una composición que comprenden microesferas de acuerdo con cualquier procedimiento de la invención como se presenta aquí. En una modalidad, al menos aproximadamente el 90% de las partículas en número tienen un diámetro dentro del intervalo de aproximadamente 1 µ?t? a aproximadamente 100 µ?? cuando se mide usando técnicas de dispersión de luz láser de ángulo pequeño. En una modalidad adicional, al menos aproximadamente el 90% de las partículas en número están dentro del intervalo de aproximadamente 1 µ?? a aproximadamente 80 µ?-?, o de aproximadamente 1 µG? a aproximadamente 60 µ?t? o de aproximadamente 1 µ?? a aproximadamente 40 µ??, o de aproximadamente 1 µ?? a aproximadamente 30 µ?? 0 de aproximadamente 1 µ?? a aproximadamente 10 µ?? cuando se miden usando técnicas de dispersión de luz láser de ángulo pequeño.

En otra modalidad más de la presente invención, al menos aproximadamente el 90% de las microesferas en número está dentro del intervalo de aproximadamente 1 µ?? a aproximadamente 60 µ?? cuando se miden usando técnicas de dispersión de luz láser de ángulo pequeño. En otra modalidad más de la presente invención, al menos aproximadamente el 90% de las microesferas en número están dentro del intervalo de aproximadamente 1 µ?t? a aproximadamente 30 µs? cuando se miden usando técnicas de dispersión de luz láser de ángulo pequeño.

En otra modalidad más se proporciona una composición que comprende las microesferas de la presente invención, donde el tamaño medio de las microesferas en la composición es inferior a aproximadamente 100 µp? de diámetro, por ejemplo, es inferior a aproximadamente 80 µ?? de diámetro, por ejemplo, es inferior a aproximadamente 60 µ?? de diámetro, por ejemplo, es inferior a aproximadamente 40 µ?t? de diámetro cuando se mide por técnicas de dispersión de luz láser de ángulo pequeño. En otra modalidad más, el tamaño medio de las microesferas en la composición es de aproximadamente 1 µ?? a aproximadamente 6 µ?t? o de 1 µ?? a aproximadamente 30µ??.

En otra modalidad de la invención, los vehículos en forma de partículas continúan liberando cantidades terapéuticas de moléculas biológicas activas a lo largo de un periodo de al menos 3 meses o más, o hasta 6 meses o más o hasta 12 meses o más.

Procedimiento hueco (limitado a nanopartículas de la invención) En una modalidad de la presente invención se proporciona un procedimiento para producir las nanopartículas de la invención como se describe en este documento que comprende las etapas de: a) disolver un polímero en un disolvente orgánico para formar una solución polimérica; b) añadir una solución acuosa que contiene proteína a la solución polimérica para formar una emulsión primaria de gotas de fase acuosa en una fase orgánica continua; c) mezclar la emulsión primaria con un medio acuoso para formar una emulsión W/O/W; y d) dejar que la fase orgánica se evapore y obtener de este modo nanopartículas que comprenden un lumen hueco que contiene dichas proteínas en una fase acuosa.

El permitir que la fase orgánica se evapore puede ser pasivo o activo. Por ejemplo, la evaporación activa puede ser mediante el uso de calor.

En una modalidad adicional, el polímero usado en cualquiera de los procedimientos como se describen en este documento se selecciona de, pero sin limitación: poli-L-lactida (PLA), poli(lacto-co-glicolida) (PLG), poli(lactida) , po>li(caprolactona), poli(hidroxibutirato) y/o copolímeros de los mismos. Los materiales formadores de partículas adecuados incluyen, pero sin limitación, poli(dienos) tales como poli(butadieno) y similares; poli(alquenos), tales como polietileno, polipropileno y similares; poli(acrílico's), tales como poli(ácido acrílico) y similares; poli(metacrílicos), tales como polí(metacrilato de metilo), poli(metacrilato de hidroxietilo), y similares; poli(éteres de vinilo); poli(alcoholes vinílicos); poli(cetonas de vinilo); ppli(vinilhaluros) tales como poli(cloruro de vinilo) y similares; poli(nitrilos de vinilo), poli(ésteres de vinilo), tales como poli(acetato de vinilo) y similares; p o I i ( p i r i d i n a s de vinilo) tales como poli(2-vinilpiridina), poli(5-metil-2-vinilpiridina) y similares; poli(estirenos); poli(carbonatos); poli(ésteres); poli(ortoésteres); poli(esterarnidas); poli(anhídridos); poli(uretanos); poli(amidas); éteres de celulosa tales como metil celulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa y similares; esteres de celulosa tales como acetato de celulosa, ftalato de acetato de celulosa, butirato de acetato de celulosa, y similares; poli(sacáridos), proteínas, gelatina, almidón, gomas, resinas y similares. Estos materiales se pueden usar solos, como mezclas físicas (combinaciones) o como copolímeros. También poliacrilatos, polimetacrilatos, polibutilcianoacrilatos, polialquilcianoacrilatos, poliarilamidas, polianhidratos, poliortoésteres, N,N-L-lisinodiiltereftalato, polianhidratos, agentes biológicamente activos desolvatados o carbohidratos, polisacáridos, poliacroleína, políglutaraldehídos y derivados, copolímeros y combinaciones de polímeros.

En otra modalidad de la presente invención se proporciona un procedimiento para encapsular agentes biológicamente activos produciendo vehículos en forma de partículas que comprenden las etapas de: a) disolver polibutilcianoacrilato (PBCA) en un disolvente orgánico para formar una solución polimérica; b) añadir una solución acuosa que contiene un agente biológicamente activo a la solución polimérica para formar una emulsión primaria de gotas de fase acuosa en una fase orgánica continua; c) mezclar la emulsión primaria con un medio acuoso para formar una emulsión W/O/W; y d) dejar que la fase orgánica se evapore y obtener de este modo vehículos en forma de partículas que comprenden un lumen hueco que contiene dicho agente biológicamente activo en una fase acuosa.

El permitir que la fase orgánica se evapore puede ser pasivo o activo. Por ejemplo, la evaporación activa puede ser mediante el uso de calor.

En una modalidad, los vehículos en forma de partículas pueden ser microesferas o nanopartículas. Én una modalidad adicional, el vehículo en forma de partículas es una nanopartícula y el agente biológicamente activo es una proteína. En una modalidad adicional, el vehículo en forma de partículas es una nanopartícula y el agente biológicamente activo es un péptido. En otra modalidad más, el vehículo en forma de partículas es una nanopartícula y el agente biológicamente activo es una molécula de unión a antígeno, por ejemplo, un mAb o un dAb, o una combinación de los mismos. En otra modalidad más, el vehículo en forma de partículas es una nanopartícula y el agente biológicamente activo comprende un dominio.

En una modalidad adicional, el vehículo en forma de partículas es una microesfera y el agente biológicamente activo es una proteína. En una modalidad adicional, el vehículo en forma de partículas es una microesfera y el agente biológicamente activo es un péptido. En otra modalidad más, el vehículo en forma de partículas es una microesfera y el agente biológicamente activo es una molécula de unión a antígeno, por ejemplo, un mAb o un dAb o una combinación de los mismos. En otra modalidad más, el vehículo en forma de partículas es una microesfera y el agente biológicamente activo comprende un dominio.

En una modalidad, la proporción p/p de proteína a polímero puede ser del 0,5% al 50%, por ejemplo, es de al menos aproximadamente el 0,5% o es al menos aproximadamente el 1% o es al menos aproximadamente el 2% o es al menos aproximadamente el 5% o es al menos aproximadamente el 7% o es al menos aproximadamente el 10% o es al menos aproximadamente el 11% o es al menos aproximadamente el 14% o es al menos aproximadamente el 20% o es al menos aproximadamente el 40% o es al menos aproximadamente el 50%. Por ejemplo, cuando la proteína es un péptido, la proporción de péptido a polímero puede ser al menos aproximadamente 11 o cuando la proteína es un anticuerpo, la proporción de anticuerpo a polímero al menos aproximadamente el 14% o cuando la proteína es un anticuerpo de dominio, la proporción de anticuerpo de dominio a polímero puede ser al menos aproximadamente el 11%.

En una modalidad de la presente invención, la eficacia de encapsulación de las partículas es al menos aproximadamente el 1% o es al menos aproximadamente el 2% o es al menos aproximadamente el 10% o es al menos aproximadamente el 20% o es al menos aproximadamente el 40% o es al menos aproximadamente el 50% o es al menos aproximadamente el 60% o es al menos aproximadamente el 70% o es al menos aproximadamente el 80% o es al menos aproximadamente el 90% o es al menos aproximadamente el 95% o es al menos aproximadamente el 97% o es al menos aproximadamente el 99%. Por ejemplo, cuando la proteína es un péptido, la eficacia de encapsulación puede ser al menos aproximadamente 60%, cuando la proteína es un anticuerpo, la eficacia de encapsulación puede ser al menos aproximadamente el 90% o cuando la proteina es un anticuerpo de dominio, la eficacia de encapsulación puede ser al menos aproximadamente el 60%.

En una modalidad adicional del procedimiento, la etapa (d) comprende adicionalmente la adición de polímeros formadores de gel. En una modalidad adicional, el polímero formador de gel es agarosa.

Los ejemplos de disolventes orgánicos adecuados para el uso con los procedimientos de la invención incluyen, pero sin limitación, ésteres inmiscibles en agua tales como acetato de etilo, acetato de isopropilo, acetato de n-propilo, acetato de isobutilo, acetato de n-butilo, isobutirato de isobutilo, acetato de 2-etilhexilo, díacetato de etilenglicol; cetonas inmiscibles en agua, tales como etil metil cetona, metil isobutil cetona, metil isoamil cetona, metil n-amilcetona, diisobutil cetona; aldehidos inmiscibles en agua tales como acetaldehído, n- butiraldehído, crotonaldehído, 2-etilhexaldehído, isobutilaldeh ido y propionaldeh ido; ésteres de éter inmiscible en agua tales como 3-etoxipropionato de etilo; hidrocarburos aromáticos inmiscibles en agua tales como xileno de tolueno y benceno; halohidrocarburos inmiscibles en agua tales como 1 , 1 , 1 -tricloroetano; ésteres de éter de glicol inmiscibles en agua tales como acetato de monometil éter de propilenglicol, acetato de monometil éter de eti lengl icol , acetato de monobutil éter de et i leng I icol , acetato de monobutil éter de dietilenglicol; plastif ¡cantes de ftalato inmiscibles en agua tales como ftalato de dibutilo, ftalato de dietilo, ftalato de dimetilo, ftalato de dioctilo, tereftalato de dioctilo, ftalato de butil octilo, ftalato de butil bencilo, ftalato de alquil bencilo; plastificantes inmiscibles en agua tales como adipato de dioctilo, di-2-etilhexanoato de trietilenglicol, trimelitato de trioctilo, triacetato de glicerilo, diisobutirato de glicerilo/tripropionina, 2 , 2 , 4-tri meti I- 1 ,3-pentanodiol, cloruro de metileno, etilacetato o dimetilsulfóxido, tetracloruro de carbono, cloroformo, ciclohexano, 1 ,2-dicloroetano, diclorometano, dietiléter, dimetil formamida, heptano, hexano y otros hidrocarburos, metil-terc-butil éter, pentano, tolueno, 2,2,4-trimetilpentano, 1-octanol y sus isómeros o alcohol bencílico.

En una modalidad de la invención, el disolvente usado en los procedimientos de la invención se seleccionará de cloruro de metileno, etilacetato o dimetilsulfóxido, tetracloruro de carbono, cloroformo, ciclohexano, 1 ,2-dicloroetano, diclorometano, dietiléter, dimetil formamida, heptano, hexano y otros hidrocarburos, metil-terc-butil éter, pentano, tolueno, 2,2,4-trimetílpentano, 1-octanol y sus isómeros, alcohol bencílico.

Los vehículos en forma de partículas, las composiciones que comprenden los mismos o los procedimientos para preparar los mismos en todos los aspectos de la presente invención como se describe en este documento pueden comprender adicionalmente la adición de un tensoactivo tal como, pero sin limitación: colato sódico, poloxámero 188 (pluronic F68™ o F127), alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, polisorbato 80, dextranas, poloxámeros, poloxaminas, ésteres de ácido carboxílico de alcoholes multifuncionales, éteres alcoxilados, mono-, di- y triglicéridos alcoxilados, fenoles y difenoles alcoxilados, éteres etoxilados, ésteres etoxilados, triglicéridos etoxilados, sustancias de la serie GenapoIR™ y BaukiR™, sales metálicas de ácidos grasos, sales metálicas de ácidos carboxílicos, sales metálicas de sulfatos de alcohol y sales metálicas de sulfatos de alcoholes grasos y sales metálicas de sulfosuccinatos y mezclas de dos o más de dichas sustancias. En una modalidad adicional, el tensoactivo se selecciona de colato sódico, poloxámero 188 (pluronic F68™), alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, polisorbato 80 y dextranas.

En una modalidad de la presente invención se proporcionan vehículos en forma de partículas que comprenden agentes biológicamente activos, que se pueden obtener mediante cualquiera de los procedimientos de la invención descrita en este documento.

El agente biológicamente activo encapsulado en vehículos en forma de partículas y/o composiciones de la ' presente invención mantiene al menos cierta actividad biológica después de su liberación del vehículo en forma de partículas, por ejemplo, una proporción de las moléculas en la composición puede mantener al menos cierta capacidad de unirse a su objetivo cuando el agente es un agente de unión y suscita una respuesta biológica después de la liberación del agente biológicamente activo de las partículas. Tal unión se puede medir en un ensayo de unión biológica adecuado, los ejemplos de ensayos adecuados incluyen, pero sin limitación, ELISA o Biacore™. En una modalidad adicional, la composición mantiene al menos el 50% de su afinidad por el objetivo o al menos el 70% o al menos el 90% de su afinidad (Kd) por el objetivo cuando se mide en un ensayo de unión biológica después de la liberación de las partículas, por ejemplo, en una modalidad como se determina por ELISA, Biacore. En' una modalidad, la composición será capaz de suscitar un efecto terapéutico en el sujeto al que se administra. La actividad biológica de las composiciones de la invención se puede medir mediante cualquier ensayo adecuado que mida la actividad de la molécula biológicamente activa encapsulada, por ejemplo, cuando la molécula biológicamente activa es un dAb de VEGF, se puede usar el ensayo descrito en el Ejemplo 18.

En una modalidad de la presente invención se proporciona un procedimiento para suministrar una proteína a través de una barrera biológica tai-como la barrera hematoencefálica por encapsulación de la proteína en una nanopartícula a un paciente. En una modalidad adicional, el paciente es un ser humano.

En una modalidad de la presente invención se proporciona un procedimiento para suministrar una proteína encapsulada en un vehículo en forma de partículas tal como una microesfera al ojo de un mamífero, por ejemplo, un ser humano.

En otra modalidad se proporciona una composición farmacéutica que comprende un agente biológicamente activo encapsulado en un vehículo en forma de partículas de la presente invención como se describe en este documento.

En una modalidad adicional se proporciona una composición farmacéutica que comprende una proteína encapsulada en las nanopartículas de la presente invención como se describe en este documento. En una modalidad adicional, se proporciona una composición farmacéutica que comprende una proteína encapsulada en microesferas para suministro ocular como se describe en este documento para tratar y/o prevenir una enfermedad del ojo.

En una modalidad adicional se puede usar una composición de la invención como se describe en este documento para tratar y/o prevenir trastornos o enfermedades del sistema nervioso central, por ejemplo, se puede usar para tratar y/o prevenir la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, encefalopatía espongiforme bovina, encefalitis del virus del Nilo Occidental, SIDA del sistema nervioso, lesión cerebral, lesión de médula espinal, cáncer metastásico del cerebro o esclerosis múltiple, apoplejía.

En una modalidad adicional, la composición puede comprender un anticuerpo anti-MAG para el tratamiento y/o la prevención de apoplejía o lesión neuronal.

En otra modalidad, la composición puede comprender un anticuerpo anti-NOGO para tratamiento y/o la prevención de apoplejía o lesión neuronal o, por ejemplo, para el tratamiento o la profilaxis de enfermedades neurodegenerativas tales como enfermedad de Alzheimer.

En otra modalidad, la composición puede comprender un anticuerpo anti-p-amiloide para el tratamiento y/o la prevención de apoplejía o lesión neuronal o, por ejemplo, para el tratamiento o profilaxis de enfermedades neurodegenerativas tales como enfermedad de Alzheimer.

En una modalidad de la invención como se describe en este documento, los vehículos en forma de partículas se pueden administrar al paciente mediante inyección o infusión parenteral, administración intravenosa o intra-arterial.

En una modalidad adicional, las composiciones de la invención como se describen en este documento se pueden usar para tratar y/o prevenir trastornos o enfermedades del ojo. En una modalidad adicional se puede usar una composición de la invención como se describe en este documento para tratar y/o prevenir trastornos tales como, pero sin limitación, degeneración macular relacionada con la edad (neovascular/húmeda), retinopatía diabética, enfermedad oclusiva venosa retiniana, uveítis, neovascularización corneal o glaucoma.

En otra modalidad más, la composición se usa para tratar y/o prevenir AMD (degeneración macular relacionada con la edad), por ejemplo, AMD húmeda o AMD seca.

En otra modalidad de la presente invención se proporcionan agentes biológicamente activos encapsulados en nanopartículas y/o microesferas como se describe en este documento para el uso en medicina.

En una modalidad de la presente invención se proporciona el uso de composiciones de la invención como se describe en este documento en la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad del sistema nervioso central. En otra modalidad más se proporciona el uso de una composición de la invención como se describe en este documento en la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de la enfermedad de Alzheimer. En otra modalidad más se proporciona el uso de una composición de la invención como se describe en este documento en la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de apoplejía o lesión neuronal.

En otra modalidad de la invención se proporciona el uso de una composición de la invención como se describe en este documento en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de enfermedades oculares tales como, por ejemplo, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de AMD.

La invención proporciona procedimientos para tratar y/o prevenir una enfermedad del sistema nervioso central usando una composición de la presente invención. En una modalidad adicional se proporciona un procedimiento para tratar la enfermedad de Alzheimer usando una composición de la presente invención. En otra modalidad más de la presente invención se proporciona un procedimiento para tratar y/o prevenir apoplejía o lesión neuronal usando una composición de la presente invención.

La invención también proporciona procedimientos para tratar y/o prevenir enfermedad ocular usando una composición de la presente invención. En una modalidad adicional se proporciona un procedimiento para tratar y/o prevenir AMD usando una composición de la presente invención.

Definiciones: Como se usa en este documento, la expresión "sustancia formadora de partículas" se usa para describir cualquier monómero y/u oligómero capaz de polimerizar o un polímero que puede formar una partícula insoluble en un entorno acuoso, por ejemplo, PBCA, PLGA. La sustancia formada de partículas será soluble en un disolvente orgánico cuando no está polimerizada.

La expresión "vehículo en forma de partículas" como se usa a lo largo de esta memoria descriptiva se usa para incluir tanto nanopartículas como microesferas. Las "microesferas" son partículas compuestas por diversos materiales naturales y sintéticos con diámetros superiores a 1 µ??, mientras que "nanopartículas" como se usa en este documento son partículas de tamaño subm jcrométrico tales como, por ejemplo, de 1-100 nm. En una modalidad, las expresiones vehículo en forma de partículas, nanopartículas y microesferas como se usan en este documento indican una estructura de vehículo que es biocompatible y suficientemente resistente a destrucción química y/o física por el entorno de uso de tal forma que una cantidad suficiente de las partículas permanece sustancialmente intacta después de la entrada en el cuerpo humano o animal después de la administración y durante un tiempo suficiente para ser capaz de alcanzar el órgano o tejido objetivo deseado, por ejemplo, el cerebro o el ojo.

La expresión "agente biológicamente activo" como se usa en este documento es una expresión usada para indicar que la molécula tiene que ser capaz de realizar al menos cierta actividad biológica cuando alcance su objetivo deseada. Para evitar dudas, la expresión "agente biológicamente activo" y la "molécula biológicamente activa" como se usan a lo largo de la memoria descriptiva tienen por objeto tener el mismo significado y son susceptibles de usarse de forma intercambiable.

El término "solubilización" se define como formulación de una solución, en forma de moléculas individuales en el disolvente, o formación de un sólido en suspensión líquida, en forma de agregados sólidos finos de moléculas suspendidas en el líquido. El procedimiento de solubilización también puede dar como resultado una mezcla de moléculas completamente disueltas y agregados sólidos suspendidos.

El término "proteína", como se usa a lo largo de esta memoria descriptiva para encapsulacion en vehículos en forma de partículas, incluye proteínas que tienen un peso molecular de al menos 11 KDa, o al menos 12 kDa, o al menos 50 kDa, o al menos 100 kDa, o al menos 150 kDa o al menos 200 kDa. Las proteínas para encapsulacion también pueden ser de longitud considerable tal como al menos 70 aminoácidos de longitud o al menos 100 aminoácidos de longitud o al menos 150 aminoácidos de longitud o al menos 200 aminoácidos de longitud.

El término "péptido" como se usa a lo largo de esta memoria descriptiva para encapsulacion en vehículos en forma de partículas incluye secuencias más cortas de aminoácidos que tienen un peso molecular de no más de aproximadamente 10 kDa, o no más de aproximadamente 8 kDa, o no más de aproximadamente 5 kDa, o no más de aproximadamente 2 kDa o no más de aproximadamente 1 kDa o es inferior a 1 Kda. Los péptidos para encapsulacion tienen no más de 70 aminoácidos de longitud o tienen no más de 50 aminoácidos de longitud, o tienen no más de 40 aminoácidos de longitud o tienen no más de 20 aminoácidos de longitud o tienen una longitud inferior a 10 aminoácidos.

La expresión "peri-ocular" se refiere a administración local en posiciones que rodean el exterior del ojo e incluye, pero sin limitación: "Sub-conjuntival" - debajo de la conjuntiva - una membrana mucosa transparente que cubre el globo ocular sobre la esclerótica; "Sub-tenoniana" - debajo de la membrana de Tenon que envuelve el ojo pero fuera de la esclerótica; "peribulbar" - el espacio debajo del globo del ojo donde se asienta en la órbita; "retrobulbar" -el espacio en la parte posterior del globo del ojo, cerca del nervio óptico; "supra-coroideo" - debajo de la esclerótica pero fuera de la coroidea en el espacio supra-coroideo; "trans-escleral"- esta expresión también se puede usar para referirse a suministro a través, es decir, desde el exterior de la esclerótica.

La frase "dominio variable único de inmunoglobulina" se refiere a un dominio variable de un anticuerpo (VH, VHH, Vl) que se une específicamente a un antígeno o un epítope independiente de una región V o dominio diferente. Un dominio variable único de inmunoglobulina puede estar presente en un formato (por ejemplo, homo- o hetero-multímero) con otras regiones variables diferentes o dominios variables donde las otras regiones o dominios no se requieren para la unión a antígeno por el dominio variable de inmunoglobulina único (es decir, cuando el dominio variable único de inmunoglobulina se une al antígeno independientemente de los dominios variables adicionales). Un "anticuerpo de dominio" o "dAb" es igual que un "dominio variable único de inmunoglobulina" que es capaz de unirse a un antígeno como se usa la expresión en este documento. Un dominio variable único de inmunoglobulina puede ser un dominio variable de anticuerpo humano, pero también incluye dominios variables de anticuerpo únicos de otras especies tales como de roedores (por ejemplo, como se describe en el documento WO 00/29004, dAb de tiburón nodriza y VHH de Gamélido. Los VHH de Camélido son polipéptidos de dominio variable único de ¡nmunoglobulina que se obtienen de especies que incluyen camello, llama, alpaca, dromedario y guanaco, que producen anticuerpos de cadena pesada desprovistos de forma natural de cadenas ligeras. Tales dominios VHH se pueden humanizar de acuerdo con técnicas convencionales disponibles en la técnica y tales dominios todavía se consideran "anticuerpos de dominio" de acuerdo con la invención. Como se usa en este documento, VH incluye dominios VHH de camélido.

La expresión "molécula de unión a antígeno" como se usa en este documento se refiere a anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y otras construcciones de proteína que son capaces de unirse a un objetivo.

Un "dominio" es una estructura de proteína plegada que tiene estructura terciaria independiente del resto de la proteína. Generalmente, los dominios son responsables de propiedades funcionales separadas de proteínas y, en muchos casos, se pueden añadir, eliminar o transferir a otras proteínas sin pérdida de función del resto de la proteína y/o del dominio. Una "dominio variable de anticuerpo único" es un dominio polipeptídico plegado que comprende secuencias características de dominios variables de anticuerpo. Por lo tanto, incluye dominios variables de anticuerpos completos y dominios modificados, por ejemplo, en los que uno o más bucles se han sustituido por secuencias que no son características de dominios variables de anticuerpos o dominios variables de anticuerpos que se han truncado o que comprenden extensiones N- o C-terminales, así como fragmentos plegados de dominios variables que conservan al menos la actividad y especificidad de unión del dominio de longitud completa.

La expresión "técnicas de dispersión de luz" como se usa en este documento es un medio usado para determinar el perfil de distribución de tamaño de partículas pequeñas en solución -tales como, por ejemplo, dispersión dinámica de luz que se usa para medir nanopartículas y dispersión de luz estática usada para medir microesferas. La expresión "dispersión dinámica de luz" (DLS) como se usa en este documento es un procedimiento que utiliza la luz dispersada por dispersiones de partículas para obtener información sobre el tamaño de las partículas. La dispersión dinámica de luz depende del hecho de que cuando en suspensión líquida, el movimiento Browniano de las partículas depende del tamaño de partículas y que el movimiento Browniano de las partículas produce fluctuaciones en la intensidad de luz dispersada por una muestra de partículas. El diámetro de partícula se obtiene analizando estas fluctuaciones mediante una función de correlación. Después se aplica la ecuación de Stokes-Einstein para conseguir el diámetro hidrodinámico medio de las partículas. Un análisis multi-exponencial puede producir una distribución de tamaño, proporcionando comprensión con respecto a la presencia de diferentes especies dentro de una muestra. La DLS está aceptada generalmente para el análisis de nanopartículas.

La "dispersión de luz estática" o "dispersión de luz láser de ángulo pequeño" como se usa a lo largo de la memoria descriptiva se denomina en ocasiones difracción Láser. La difracción láser depende del hecho de que el ángulo de difracción es inversamente proporcional al tamaño de partícula. El procedimiento utiliza la teoría de Mié completa que resuelve completamente las ecuaciones para la interacción de luz con materia. La difracción láser se puede usar para el análisis de nanopartículas y micropartículas (de 0,02 a 2000 micrómetros de diámetro).

La expresión "barrera hematoencefálica" (BHE) como se usa en este documento es una estructura de membrana que actúa principalmente protegiendo el cerebro agentes químicos en la sangre, mientras que todavía permite una función metabólica esencial. Está compuesta por células endoteliales microvasculares cerebrales, que están empaquetadas muy estrechamente en capilares cerebrales. Esta mayor densidad restringe el pasaje de sustancias desde el torrente sanguíneo mucho más que las células endoteliales en capilares en cualquier otro lugar en el cuerpo.

A lo largo de esta memoria descriptiva, el porcentaje de carga de fármacos se define como el porcentaje de peso de fármaco por peso de material usado en la formulación de partículas (peso de polímero) p/p. % de carga de fármaco = (peso de fármaco /peso de material usado en la formulación de partículas) x 100%.

Dentro de esta memoria descriptiva se ha descrito la invención, con referencia, a modalidades, de un modo que permite que se escriba una memoria descriptiva clara y concisa. Se pretende y se debe entender que las modalidades se pueden combinar de forma diversa o separarse sin apartarse de la invención.

Ejemplos Ejemplo 1 - Polimerización de monómero de BCA (butilcianoacrilato): Se usó una reacción de polimerización rápida en disolvente orgánico para formar el polímero: Se añadió monómero de BAC (200 µ?, Vetbond, 3 M) a 1 mi de etanol absoluto en un vaso de precipitados de 25 mi con agitación lenta. La solución resultante se mezcló cuidadosamente hasta que se inició la reacción de polimerización. La reacción de polimerización dio como resultado la formación de una dispersión sólida blanca. La mezcla de la dispersión se detuvo en cuanto la mezcla de reacción se convirtió en demasiado viscosa para agitar la misma.

Después, se dejó que el etanol en la mezcla de reacción se evaporara en la campana de humos durante al menos 1 hora. Después de la evaporación del etanol, se obtuvo una torta sólida blanco agrietada. El sólido se recogió y usó en. el procedimiento de preparación de nanopartículas.

Ejemplo 2 - Preparación de nanopartículas huecas mediante el procedimiento de emulsión doble: El polímero de PBCA se disolvió en diclorometano en una concentración del 1% p/v y se usó para preparar nanopartículas de PBCA huecas mediante formación de emulsión en una emulsión doble (agua en aceite en agua, w/o/w) del siguiente modo: (i) Emulsión primaria (W/O) Fase interna (w): colato sódico al 5% (SIGMA) en agua o regulador de pH, preparado mezclando: 500 µ? de agua o regulador de pH; y 500 µ? de colato sódico (solución madre al 10% p/v).

El volumen total de la fase acuosa interna fue de 1 mi. La solución se mantuvo en hielo hasta que fue el momento de usar la misma. Cada solución se introdujo en una jeringa de insulina de 1 mi (Terumo 1 mi, BD aguja de microlanceta 19G 3,81 cm) antes del uso.

Fase (orgánica) externa (o): polímero de PBCA (p/v al 1%) en diclorometano (DCM, Fischer).

La fase orgánica (polímero de PBCA en DCM, 6 mi) se vertió en un vaso de precipitados de 10 mi (en reposo en hielo para mantener la misma fría) y se insertó la sonda del homogeneizador (Ultra-Turrax, T25, sonda de 50 mi). La solución se cubrió con parafilm (unido al vaso de precipitados y la sonda) y se homogeneizó a una velocidad de 24,000 rpm usando un homogeneizador de estator de rotor (Ulltra-Turrax T25 basic).

Formación de una emulsión primaria: En cuanto el homogeneizador alcanzó la velocidad requerida, la fase acuosa interna se añadió por inyección al interior de la solución cerca de la sonda. La emulsión resultante se homogeneizo durante 2 minutos (en hielo) y después se transfirió a una jeringa de vidrio (SGE, 25 mi, impermeable a gas, adecuada para los disolventes orgánicos, P/N 009462 25MDR-LL-GT, Lote # F06-A2190, equipada con una aguja roma de 5 cm 2R2, DI de 0,7 mm) (ii) Emulsión secundaria (w/o/w) Fase interna (w/o): emulsión primaria de la etapa de homogeneización que se ha descrito anteriormente.

Fase Externa (w): colato sódico (al 1,25% p/v) en agua.

Formación de la emulsión secundaria: La emulsión única primaria (w/o) se usó para formar una emulsión doble (w/o/w) mediante adición a una fase acuosa secundaria (colato sódico al 1,25%) con homogeneización. La solución de colato sódico (al 1,25% p/v, 30 mi) se transfirió a un vaso de precipitados de 50 mi alto (que reposaba en hielo para mantener la emulsión fría) y se insertó la sonda de un homogeneizador Silverson L4RT (sonda de 1,91 centímetros, tamiz de emulsión alta). La solución se cubrió con parafilm (unido al vaso de precipitados y la sonda) y se homogeneizo a una velocidad de 8.000 rpm. La emulsión primaria se inyectó en la solución cerca de la sonda en cuanto se alcanzó la velocidad de 8.000 rpm. La emulsión resultante se homogeneizó durante 6 minutos.

La emulsión doble que se formó se transfirió a un vaso de precipitados de 50 mi bajo y se dejó que la fase orgánica se evaporara en la campana de humos con agitación constante (agitador magnético IKA, ajuste 4) durante 3 horas.

Lavado de las nanopartículas por centrifugación: Después de la retirada del disolvente orgánico, las nanopartículas que se formaron se lavaron una vez por centrifugación a 16,200 rcf y se re-suspendieron en agua (10 mi).

Ejemplo 3 - Confirmación de formación de nanopartículas por dispersión dinámica de luz La formación de nanopartículas se confirmó mediante clasificación por tamaño usando dispersión de luz cuasi eléctrica (QELS), también conocida como dispersión dinámica de luz (DLS). Las partículas se analizaron usando un analizador de tamaño de partícula de Brookhaven Instruments corporation (BIC 90 plus) siguiendo el procedimiento convencional proporcionado por el fabricante. La suspensión de partícula se diluyó 200x en agua y se clasificó por tamaño usando parámetros de clasificación por tamaño convencionales (temperatura de 25°C, ángulo de haz láser de 90°, longitud de onda de láser de 658 nm). Las partículas se analizaron realizando 10 procedimientos de clasificación por tamaño de 1 I minuto de duración cada uno.

El instrumento presentó los datos sin procesar en la forma convencional de un correlograma. Éste ilustra la función de autocorrelación C (t) de intensidad de luz dispersada de las partículas en diferentes intervalos de tiempo y cómo la auto-correlación disminuye con el tiempo de disminución (t). La disminución en la auto-correlación de luz dispersada depende del diámetro de partícula y es más rápida para partículas menores. El instrumento obtiene información sobre el tamaño de partícula aplicando la ecuación de Stokes-Einstein. Esto proporciona el diámetro hidrodinámico medio de las partículas en la muestra y datos obtenidos adicionales sobre la población de partículas.

La dispersión dinámica de luz es muy sensible a la presencia de partículas grandes, que, incluso cuando representan menos del 1% de la muestra, pueden influir significativamente en las mediciones. Como resultado, el diámetro hidrodinámico medio que proporciona el instrumento, que está influido en gran por las grandes partículas en la muestra, podría variar sustancialmente. Como resultado, se pueden observar diferencias de tamaño de decenas de nanómetros entre lotes y por este motivo es importante mirar en el conjunto de datos completo que proporciona el instrumento, siendo el correlograma el más importante. Mirando en el conjunto de datos completo, es posible caracterizar de forma precisa una muestra ya que el instrumento puede detectar de forma sencilla la mayoría de partículas pequeñas que están presentes en la muestra a pesar de la presencia de pocas partículas grandes. La forma del propio correlograma proporciona una indicación muy clara de si las partículas son pequeñas, así como si la muestra está polidispersada. El índice basal también da una representación precisa de la calidad de los datos. Todos los datos en este documento mostraron un índice basal que no disminuyó por debajo de 5, siendo 10 el máximo para la máxima calidad posible de una lectura.

La Figura 1a muestra el correlograma (datos sin procesar) obtenido después de la clasificación por tamaño de la suspensión de partículas por QELS. El correlograma mostró claramente que una suspensión en nanopartículas se había generado mediante el procedimiento de preparación de partículas, ya que la ausencia de partículas no generaría ninguna dispersión de luz. La forma del correlograma sugirió que la suspensión era de buena calidad farmacéutica, ya que las partículas eran pequeñas y no estaban presentes grandes agregados. La clasificación por tamaño de las suspensión de nanopartículas por QELS mostró que se habían formado nanopartículas con un diámetro hidrodinámico medio de 262,6 nm (figura 1a). También se observó que la población de partículas era relativamente monodispersa, con el índice de polidíspersídad, que es una medición de cómo de ancho es el intervalo de tamaños de partícula en la muestra, en 0,262 (figura 1a). Esto está por debajo del valor máximo aceptable de 0,300 para una formulación de partículas. En general, el correlograma confirmó que el procedimiento de emulsión doble había generado de forma exitosa una suspensión de buena calidad de nanopartículas de PBCA.

Los datos obtenidos (generados por el instrumento que usa la ecuación de Stokes Einstein) sugirieron que la mayoría de las partículas eran pequeñas (Figuras 1b-d). Los resultados sugieren que aproximadamente el 87,5% de la población de partículas tenía un diámetro de 138,19 nm o inferior (figura 1b). Se observó que la suspensión carecía de grandes agregados y no contenía ninguna partícula que superara 506,81 nm de diámetro, siendo la mayoría de la población de partículas significativamente inferior (figura 1c). Además, la formulación no contenía ninguna partícula que fuera menor de 99,86 nm (figura 1d). Por lo tanto, la mayoría de las partículas tenían un diámetro entre 99,86 y 138,19 nm, un tamaño que es ideal para administración intravenosa, pero no tan pequeño que se compromete la carga del fármaco.

Figura 1. - Datos de clasificación por tamaño obtenidos por QELS que indican la presencia de nanopartículas en suspensión.

Fig. 1 (a) Correlograma obtenido después del análisis de una suspensión de nanopartículas mediante dispersión dinámica de luz. De acuerdo con los datos obtenidos, el diámetro hidrodinámico medio de las partículas fue 262,6 nm y el índice de polidispersidad 0,262. Fig. 1 (b) Distribución de tamaño multimodal (datos obtenidos) de las nanopartículas representadas para ilustrar la distribución de la población de partículas (número) a lo largo de un intervalo de tamaños. La mayoría (87,5%) de la población de partículas pareció tener un diámetro de 138,19 nm o inferior.

Fig. 1 (c) Distribución de tamaño multimodal (datos obtenidos) de las nanopartículas representada para ilustrar la distribución de la población de partículas (número) a lo largo de un intervalo de tamaños. Los datos sugieren que el 87,5% poseía un diámetro de 138,19 nm o inferior y que el 100% de la muestra de partículas poseía un diámetro de 506,81 nm o inferior. Por lo tanto, la suspensión carecía de grandes agregados y, por lo tanto, se consideró que era adecuada para administración intravenosa.

Fig. 1 (d) Distribución de tamaño multimodal (datos obtenidos) de las nanopartículas representada para ilustrar la distribución de la población de partículas (número) a lo largo de un intervalo de tamaños. Los datos sugieren que el 14,9% de la muestra de partículas posee un diámetro de 99,86 nm o inferior.

Se observó que el procedimiento proporcionaba tamaños de nanopartículas similares cuando se prepararon diferentes formulaciones de nanopartículas. El Cuadro 1 resume los tamaños de clasificación por tamaño obtenidos a partir de una serie de cuatro procedimientos de formulación diferentes: Cuadro 1 En general, se observó que el procedimiento de preparación de nanopartículas de PBCA huecas generaba suspensiones de nanopartículas que tenían el diámetro y la polidispersidad deseados.

Ejemplo 4 - Análisis de nanopartículas - confirmación de formación de nanopartículas v morfología hueca por microscopía electrónica Para confirmar que las partículas se formaron y que eran huecas se visualizaron muestras por microscopía electrónica. Las suspensiones de nanopartículas se examinaron mediante microscopía electrónica de transmisión (MET). Las nanopartículas secadas por congelación se analizaron mediante microscopía electrónica de barrido (MEB). El análisis mediante ambas técnicas de microscopía confirmó la formación de nanopartículas. La MEB mostró que se formaron nanopartículas estables. La MET confirmó que las nanopartículas eran huecas, poseyendo un núcleo acuoso rodeado por una pared polimérica de PBCA.

La Figura 2 muestra nanopartículas analizadas por MEB.

La Figura 3 muestra una imagen de nanopartículas huecas por MET, con una imagen superpuesta de nanopartículas de PBCA sólidas para comparación.

Ejemplo - 5 - Encapsulación de anticuerpo monoclonal (anti-CD23 humano) dentro de las nanopartículas de PBCA huecas Se capturó anticuerpo monoclonal (mAb anti-CD 23 humano como se describe en el documento W099/58679) dentro del núcleo acuoso de las nanopartículas mediante inclusión en la fase acuosa interna del procedimiento de homogeneización. Se usó una solución del anticuerpo para preparar la emulsión primaria (w/o), que después se homogeneizó con la fase acuosa secundaria para formar la emulsión doble (w/o/w) del siguiente modo: (iii) Emulsión Primaria (w/o) Fase interna (w): mAb anti-CD23 como se describe en el documento. W099/58679 (600 µg en colato sódico al 5% (SIGMA)), preparando mezclando: 78 µ? de solución de mAb (7,2 mg/ml) 344 µ? de H20 500 µ? de solución de colato sódico (solución madre al 10% p/v) El volumen total de la fase acuosa interna fue 1 mi. La solución se mantuvo en hielo hasta que fue el momento de usar la misma. Cada solución se introdujo en una jeringa de insulina de 1 mi (Terumo 1 mi, BD aguja de microlanceta 19G 3,81 cm) antes del uso.

Fase externa (o): polímero de PBCA (p/v al 1%) en diclorometano (Fischer).

La fase orgánica (polímero de PBCA en DMC, 6 mi) se vertió en un vaso de precipitados de 10 mi (en reposo en hielo para mantener la misma fría) y se insertó la sonda del homogeneizador (Ultra -Turrax, T25, sonda de 50 mi). La solución se cubrió con parafilm (unido al vaso de precipitados y la sonda) y se homogeneizó a una velocidad de 24.000 rpm.

Formación de una emulsión primaria: En cuanto el homogeneizador alcanzó la velocidad máxima, la fase acuosa interna se añadió por inyección al interior de la solución cerca de la sonda. La emulsión resultante se homogeneizó durante 2 minutos (en hielo) y después se transfirió a una jeringa de vidrio (SGE, 25 mi, impermeable a gas, adecuada para disolventes orgánicos, P/N 009462 25MDR-LL-GT, lote # F06 -A2190, equipada con aguja roma de 5 cm 2R2, DI de 0,7 mm). (¡v) Emulsión secundaria (w/o/w) Fase interna (w/o): emulsión primaria de la etapa homogeneización que se ha descrito anteriormente.

Fase Externa (w): colato sódico (al 1,25% p/v) en agua.

Formación de la emulsión secundaria: La emulsión primaria, única (w/o) se usó para formar una emulsión doble (w/o/w) por adición a una fase acuosa secundaria (colato sódico al 1,25% p/v) con homogeneización . La solución de colato sódico (al 1,25% p/v, 30 mi) se transfirió a un vaso de precipitados de 50 mi alto (en reposo en hielo para mantener fría la emulsión) y se insertó la sonda de un homogeneizador Silverson L4RT (sonda de 1,91 centímetros, tamiz de emulsión alta). La solución se cubrió con parafílm (unida al vaso de precipitados y la sonda) y se homogeneizó a una velocidad de 8.000 rpm. La emulsión primaria se inyectó en la solución cerca de la sonda en cuanto se alcanzó la velocidad de 8.000 rpm. La emulsión resultante se homogeneizó durante 6 minutos. La emulsión doble que se formó se transfirió a un vaso de precipitados de 50 mi bajo y se dejó que la fase orgánica se evaporara en la campana de humos con agitación constante (agitador magnético IKA, ajuste 4) durante 3 horas.

Lavado de las nanopartículas por centrifugación: Las nanopartículas resultantes se sedimentaron por centrifugación para separar anticuerpo libre de encapsulado. Tanto el sedimento (anticuerpo capturado) como el sobrenadante (anticuerpo libre) se analizaron por un ensayo de proteína total para determinar la eficacia de encapsulación.

Se observó que la eficacia de encapsulación era del 52% cuando se usó una cantidad total de 600 µg de anticuerpo. Se observó que la eficacia de encapsulación era suficientemente elevada para permitir el suministro de cantidades potencialmente terapéuticas de anticuerpos sin superar la dosis máxima tolerada de polímero de PBCA (50 mg/kg en el ratón) Además, posteriormente fue posible preparar partículas que contenían un anticuerpo monoclonal diferente, anti-l L 13 humano que sugiere que el procedimiento se puede aplicar a cualquier biofarmacéutico soluble en agua.

La Figura 4 muestra los resultados obtenidos a partir de las mediciones de eficacia de encapsulación.

Ejemplo 6 - Liberación de anticuerpo monoclonal de las nanopartículas Además de conseguir una encapsulación eficaz de un biofarmacéutico, fue necesario demostrar que el material se podría liberar de las partículas después de la administración y que conservaba su actividad. La liberación de anticuerpo activo de las partículas se investigó inicialmente in vitro mediante degradación de las partículas seguido de detección de cualquier anticuerpo liberado por ELISA. Para liberar el anticuerpo encapsulado, las partículas se trataron con una butil esterasa (de hígado porcino, SIGMA), que se había descrito que escinde el butil éster del polímero de PBCA. Durante la reacción (solución de Ringer, pH 7,0, 37°C), se tomaron muestras en diferentes puntos de tiempo (0, 1, 2, 3, 4 y 24 h) y se analizaron para determinar la presencia de anticuerpo activo mediante ELISA.

La Figura 5 muestra el perfil de liberación obtenido después de degradación enzimática de las partículas y análisis de la enzima liberada mediante ELISA.

Ejemplo 7 - Encapsulación de anticuerpo de dominio (dAb anti-lisozima de huevo de gallina) dentro de las nanopartículas de PBCA huecas En los siguientes ejemplos se realizó el ensayo de BCA usando un equipo de BCA obtenido en Sigma (QPBCA) y realizado de acuerdo con las instrucciones. Se diluyó el dAb libre 2 veces y 10 veces para el análisis. El dAb encapsulado se diluyó 10 veces.

El anticuerpo de dominio (dAb anti-lisozima de huevo de gallina) se capturó dentro del núcleo acuoso de las nanopartículas mediante inclusión en la fase acuosa interna del procedimiento de homogeneización. En este caso, la fase acuosa interna se preparó mezclando 0,5 mi de una solución de 20 mg/ml de dAb (10 mg de proteína) y 0,5 mi de solución de estabilizante (colato sódico, al 10% p/v). Después se prepararon las nanopartículas mediante el procedimiento de emulsión doble como se ha descrito en el ejemplo 4. Las nanopartículas resultantes se sedimentaron mediante centrifugación para separar anticuerpo libre de encapsulado. Tanto el sedimento (anticuerpo capturado) como el sobrenadante (anticuerpo libre) se analizaron mediante ensayo de proteína total (ensayo con ácido bicinconínico) para determinar la eficacia de encapsulación. Los resultados de los análisis se muestran en la figura 6. Se observó que la cantidad de dAb encapsulado era 6,66 mg. La cantidad de dAb libre era 4,83 mg. La eficacia de encapsulación, por lo tanto, estaba aproximadamente en el 66,6%, con la eficacia de carga en el 11,1%. Por lo tanto, fue posible encapsular de forma eficaz cantidades de miligramos de proteína en las nanopartículas de PBCA huecas usando el procedimiento de emulsión doble.

Ejemplo 8 - Preparación de nanopartículas de PBCA mediante el procedimiento de HIP Las nanopartículas se prepararon añadiendo 100 µ? de monómero de BCA a una fase orgánica que contenía ión de HIP solubilizado (docusato sódico, 3,058-6,116% p/v en 1 mi de diclorometano). La solución resultante se pipeteó en una fase acuosa (dextrana al 1% p/v, pluronic F68 al 0,2% p/v, 10 mi, pH 7,0) con homogeneización a 7.000 usando un homogeneizador Silverson L4RT. La exposición al pH neutro de la fase acuosa dio como resultado la polimerización rápida del monómero de BCA para formar polímero de PBCA. La emulsión que se formó se homogeneizó durante 45 segundos y después se incubó en una campana de humos durante 3 horas para dejar que se evaporara el disolvente orgánico y se formaran las nanopartículas. La suspensión de nanopartículas resultante se almacenó a 4°C.

Ejemplo 9 - Confirmación de formación de nanopartículas mediante dispersión dinámica de luz La formación de nanopartículas de PBCA por el procedimiento de HIP se confirmó mediante clasificación por tamaño usando dispersión dinámica de luz (DLS). Las partículas se analizaron usando un analizador de tamaño de partícula de Brookhaven Instruments Corporation (BIC 90 plus). La Figura 7 muestra los datos de clasificación por tamaño obtenidos por DLS que indica la presencia de nanopartículas en suspensión. La clasificación por tamaño por DLS mostró que se habían formado nanopartículas con un diámetro hidrodinámico medio de 291,4 nm (figura 7a). También se observó que la población de partículas era relativamente monodispersa, con un índice de polidispersidad, que es una medida de cómo de ancho es el intervalo de tamaños de partícula, en 0,242 (figura 7a). Esto está por debajo del valor máximo aceptable de 0,300 para una formulación de partículas. En general, el correlograma confirmó que el procedimiento de preparación de partículas había generado de forma exitosa una suspensión de buena calidad de nanopartículas de PBCA.

Los datos obtenidos sugieren que la mayoría de las partículas son pequeñas (Figuras 7 b-d). Los resultados sugieren que aproximadamente el 96,3% de la población de partículas tenía un diámetro de 201,37 nm o inferior (figura 7b). La suspensión también parecía carecer generalmente de grandes agregados y no contenía ninguna partícula que superara 732,05 nm de diámetro, siendo la mayoría de la población de partículas significativamente menor (figura 7c). La formulación tampoco parecía contener ninguna partícula que fuera menor de 143,38 nm (figura 7d). Por lo tanto, la mayoría de las partículas tenían un diámetro entre 143,38 y 201,37 nm, un tamaño que es seguro para administración intravenosa pero no demasiado pequeño, de tal forma que reduzca la eficacia de carga de fármaco.

Fig. 7 (a) - Correlograma obtenido después del análisis de una suspensión de nanopartículas mediante dispersión dinámica de luz. De acuerdo con los datos obtenidos, el diámetro hidrodinámico medio de las partículas era 291,4 nm y el índice de polidispersidad 0,242.

Fig. 7 (b) - Distribución de tamaño multimodal (datos obtenidos) de las nanopartículas representada para ilustrar la distribución de la población de partículas (número) a lo largo de un intervalo de tamaños. Los datos sugieren que el 96,3% de la población de partículas parecía tener un diámetro de 201,37 nm o inferior.

Fig. 7 (c) - Distribución de tamaño multimodal (datos obtenidos) de las nanopartículas representada para ilustrar la distribución de la población de partículas (número) a lo largo de un intervalo de tamaños. Los datos sugieren que el 96,3% de la población de partículas parecía tener un diámetro de 201.37 nm o inferior y que el 100% de la muestra de partículas poseía un diámetro de 732,05 nm o menor. Por lo tanto, se observó que la suspensión carecía de grandes agregados y, por lo tanto, se consideró que es segura para administración intravenosa.

Fig. 7 (d) - Distribución de tamaño multimodal (datos obtenidos) de las nanopartículas representada para ilustrar la distribución de la población de partículas (número) a lo largo de un intervalo de tamaños. Los datos sugieren que el 6,2% de la muestra de partículas posee un diámetro de 143,38 nm o menor.

Se observó que el procedimiento proporciona tamaños de nanopartícula similares cuando se prepararon diferentes formulaciones de nanopartículas. El Cuadro 2 resume los datos de clasificación por tamaño obtenidos a partir de una serie de seis formulaciones diferentes de composiciones diferentes: Cuadro 2 En. general, se observó que el procedimiento de HIP generaba suspensiones de nanopartículas que tenían el diámetro y la polidispersidad deseadas.

Ejemplo 10 - Solubilización de péptidos en la fase orgánica usando el procedimiento de HIP y encapsulación en nanopartículas de PBCA Se preparó una solución del hexapéptido dalargina disolviendo 30-60 mg del péptido en 3 mi de CaCI2 (18,3'mM) y disminuyendo el pH hasta 3,05 mediante adición de HCI concentrado (2 M). La solución resultante (500 µ?, 10-20 mg/ml y cantidad total de péptido 5-10 mg) se añadió a una solución del agente de HIP docusato sódico en diclorometano (1 mi, al 3,058-6,116% p/v) en un tubo Eppendorf de 2 mi. El volumen de la solución de HIP usada era el doble que la de la solución de péptido (1 mi de solución de HIP para 500 µ? de solución de péptido). La proporción molar de HIP: péptido era de 10:1 con 5 mg de péptido y 5:1 con 10 mg de péptido. Las fases orgánica y acuosa se mezclaron agitando vorticialmente a velocidad máxima durante 1 minuto. Después, la solución resultante se centrifugó para separar las dos fases a 20,817 rcf durante 50 minutos. La capa orgánica (que contenía péptido solubilizado) se recogió y usó para preparar nanopartículas. Para confirmar que el procedimiento había sido exitoso solubilizando el péptido en la fase orgánica, se determinó la cantidad de péptido remanente en la fase acuosa. El análisis por EM-CL y la secuenciación de Edman mostraron que al menos el 99% del péptido se había extraído de forma exitosa al interior de la fase orgánica.

Ejemplo 11 - Encapsulación de péptido dentro de las nanoparticulas de PBCA Las nanoparticulas se prepararon añadiendo 100 µ? de monómeros de BCA a la fase orgánica que contenía péptido solubilizado y HIP (1 mi). La solución resultante se pipeteó en una fase acuosa (dextrana al 1% p/v, pluronic F68 al 0,2% p/v, 10 mi, pH 7,0) con homogeneización a 7.500 usando un homogeneizador Silverson L4RT (pantalla de emulsión fina, sonda de 1,91 centímetros). La exposición al pH neutro de la fase acuosa dio como resultado la rápida polimerización del monómero de BCA para formar polímero de PBCA. La emulsión que se formó se homogeneizó durante 45 segundos y después se incubó en una campana de humos con agitación (agitador magnético IKA, ajuste de velocidad 4) durante 1 hora para evaporar la fase orgánica. El ajuste de velocidad se disminuyó después a 3 y las formulaciones se incubaron durante 2 horas adicionales para garantizar la evaporación en la fase orgánica y la formación de nanoparticulas. Las suspensiones de nanoparticulas se recogieron y almacenaron a 4°C.

Las nanoparticulas resultantes se centrifugaron para eliminar cualquier péptido libre y se resuspendieron en agua o PBS.

Se determinó la eficacia de encapsulación analizando las partículas por EM-CL. Se observó que aproximadamente el 90% de la dosis de péptido estaba encapsulada, incluso cuando se usaron grandes cantidades de péptido (10 mg). La comparación de las cantidades de péptido encapsulado conseguido con el HIP con las conseguidas por procedimiento común de adsorción sobre la superficie de partículas demostró claramente la superioridad del procedimiento de PBCA de HIP (figura 8). Cuando se usó el procedimiento de adsorción solamente el 1,5% de la dosis de péptido se cargó sobre las partículas. El análisis de las nanopartículas cargadas con dalargina por el procedimiento de adsorción se realizó en un momento diferente. Se prepararon las partículas adsorbidas de Kreuter y se analizaron antes del desarrollo del procedimiento de HIP actual como un medio que tenía como objetivo evaluar la técnica antecedente. El procedimiento de EM/CL y el procedimiento de HPLC que se usaron son igualmente sensibles.

Ejemplo 12 - Evaluación del sistema de suministro de nanopartículas de PBCA de HIP in vivo (modelo de ratón) Se determinó la capacidad de las nanopartículas de PBCA de HIP para suministrar su carga peptídica al cerebro in vivo en el modelo de ratón. Se compararon nanopartículas de PBCA de HIP que contenían dalargina encapsulada usando el procedimiento de HIP con nanopartículas de PBCA de HIP que tenían el péptido adsorbido sobre la superficie de partícula como se describió por Kreuter y col. Las nanopartículas se prepararon para el suministro al cerebro por la vía intravenosa revistiendo su superficie con tensoactivo polisorbato 80. En resumen, las nanopartículas se incubaron en PBS que contenía tensoactivo al 1% p/v durante 30 minutos antes de la inyección. Se ha descrito en la bibliografía que el tensoactivo dirige indirectamente las nanopartículas al cerebro promoviendo la adsorción de apolipoproteínas séricas sobre la superficie de la nanoparticula. Esto permite que las partículas se unan al receptor de apolipoproteína en la barrera hematoencefálica y realizan trancitosis para alcanzar el cerebro. Se compararon las siguientes formulaciones: 1. nanopartículas de PBCA de HIP solas (contenido 5:1 de HIP) 2. nanopartículas de PBCA de HIP solas (contenido 10:1 de HIP) 3. Dalargina en solución (2,0 mg/kg) 4. nanopartículas de PBCA de HIP con dalargina adsorbida sobre la superficie (2,0 mg/kg de dosis total usada en formulación) 5. nanopartículas de PBCA de HIP (proporción molar de HIP: dalargina de 5:1) con dalargina encapsulada (2,0 mg/kg de dosis total usada en la formulación) 6. nanopartículas de PBCA de HIP (proporción molar de HIP: dalargina 5:1) con dalargina encapsulada (2,0 mg/kg de dosis total usada en la formulación) - la misma formulación que anteriormente, pero inyectada a 1/10 de la dosis. 7. nanopartículas de PBCA de HIP (proporción molar de HIP: dalargina de 10:1) con dalargina encapsulada (2,0 mg/kg de dosis total usada en formulación) Los ratones se sacrificaron a los 20 minutos después de la inyección, se recogieron muestras de cerebro y sangre y se analizaron para determinar la presencia de péptido por EM-EM-CL. Los datos se corrigieron para contaminación con sangre asumiendo una contaminación con sangre de 15 µ? por gramo de cerebro. Los resultados obtenidos se muestran en la figura 9: Los resultados del estudio in vivo sugieren que la encapsulacion del péptido dentro del núcleo de las nanopartículas de PBCA de HIP usando el procedimiento de HIP es superior a la adsorción del péptido sobre la superficie de la partícula.

Ejemplo 13 - Efecto del pH sobre la eficacia de encapsulacion de dalarqina en nanopartículas de PBCA de HIP En la técnica anterior, las nanopartículas de PBCA se forman por polimerización lenta del monómero de BCA en una emulsión de agua en aceite acida, donde el pH de la fase acuosa está aproximadamente en 2,0 (HCI 0,01 N). La reacción de polimerización en condiciones ácidas requiere un periodo de al menos 3 horas para conseguir la finalización. Sin embargo, este procedimiento emplea un pH neutro para permitir la polimerización rápida. La fase acuosa que se usa es solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,2). A pH neutro, se conoce que el monómero de BCA polimeriza rápidamente (en el intervalo de segundos). Como resultado, la producción de nanopartículas de PBCA de HIP requiere la formación muy rápida de una emulsión. Esto es consigue en este procedimiento mediante homogeneizacion a alta velocidad (7.500 rpm o superior) usando un homogeneizador Silverson L4RT. Se estableció la hipótesis de que una reacción de polimerización más rápida en un pH neutro mejoraría la eficacia de encapsulación, capturando rápidamente el péptido en las partículas. Por el contrario, la polimerización prolongada podría conducir a pérdida gradual de péptido de la emulsión en la fase acuosa. Para ensayar la hipótesis, se prepararon nanopartículas, usando el procedimiento de PBCA de HIP, emulsionando el monómero de BCA con péptido extraído en PBCS o en medio original de la técnica anterior, HCI 0,01 N. Tanto las fases acuosas acida como neutra contenían los estabilizantes requeridos (pluronic F68 al 0,2%, dextrana al 1%). Las nanopartículas se prepararon siguiendo el procedimiento descrito en el ejemplo 3. La cantidad de péptido usado por formulación fue 5 mg. Se prepararon las siguientes formulaciones (una preparación cada vez): 1. nanopartículas de PBCA de HIP solas (contenido 35:1 de HIP); pH 2 2. nanopartículas de PBCA de HIP solas (contenido 35:1 de HIP); pH 7 3. nanopartículas de PBCA de HIP (proporción molar de HIP:dalargina de 35:1) con dalargina encapsulada (5,0 mg de cantidad de aportación); pH 2 4. nanopartículas de PBCA de HIP (proporción molar de HIP:dalargina de 35:1) con dalargina encapsulada (5,0 mg de cantidad de aportación); pH 7 5. nanopartículas de PBCA de HIP (proporción molar de HIP:dalargina de 10:1) con dalargina encapsulada (5,0 mg de cantidad de aportación); pH 2 6. nanopartículas de PBCA de HIP (proporción molar de HlP.dalargina de 10.1) con dalargina encapsulada (5,0 mg de cantidad de aportación); pH 7 7. nanopartículas de PBCA de HIP (proporción molar de HIP:dalargina de 5:1) con dalargina encapsulada (5,0 mg de cantidad de aportación): pH 2 8. nanopartículas de PBCA de HIP (proporción molar de HIP:dalargina de 5:1) con dalargina encapsulada (5,0 mg de cantidad de aportación); pH 7 Las formulaciones de nanopartículas se centrifugaron para eliminar cualquier péptido libre y se resuspendieron en agua o PBS. Se determinó la eficacia de encapsulacion alterando las partículas en NaOH 10 mM (incubación durante una noche a temperatura ambiente) y después analizando mediante EM-CL. Los resultados obtenidos se muestran en la figura 10.

Los resultados refuerzan la hipótesis de que la formación rápida del polímero de PBCA a pH neutro daría como resultado una mayor eficacia de encapsulacion de péptido que la formación lenta del polímero a pH ácido como es el caso en la técnica anterior. A pesar de la pérdida de algo del péptido debido a degradación por el tratamiento con NaOH, los resultados obtenidos muestran claramente los beneficios de formar las partículas a pH neutro. A una proporción de HIP:dalargina de 10:1, el 63,23% del péptido de la cantidad de aportación se capturó en las nanopartículas cuando las partículas se formaron a pH 7. A pH 2, la eficacia de encapsulación era significativamente menor en el 2,36%. Globalmente, la eficacia de encapsulación era mayor cuando las partículas se prepararon a pH 7 que cuando se prepararon a pH 2.

Ejemplo 14 - Encapsulación de anticuerpo de dominio en nanopartículas de PBCA usando el procedimiento de HIP Un anticuerpo de dominio (dAb anti-lisozima de huevo de gallina) se formuló en nanopartículas de PBCA siguiendo el procedimiento descrito en el ejemplo 3. La cantidad de proteína usada en la formulación era 10 mg. Se preparó un total de dos formulaciones. Para determinar la cantidad de dAb encapsulado, las partículas se centrifugaron para eliminar cualquier proteína libre y después se analizaron por secuencíación de Edman. Además de la información de secuencia, la secuencíación de Edman también se puede usar para proporcionar información cuantitativa. El procedimiento implica tratamiento químico riguroso que destruye las partículas y permite la detección del material encapsulado. Los resultados obtenidos se muestran en la figura 11. Los resultados sugieren que es posible encapsular una molécula de mayor tamaño usando el procedimiento de PBCA de HIP, pero con una menor eficacia. Sin embargo, puede ser posible aumentar la eficacia de encapsulación optimizando el protocolo para el uso con el anticuerpo de dominio. Con el protocolo actual, que se ha optimizado para dalargina, fue posible encapsular aproximadamente 2,56 mg de los 10 mg usados. Esto asciende hasta una eficacia de encapsulación del 25,6%, que es alta para un procedimiento de emulsión única en el que una proteína se captura dentro de una matriz de partículas hidrófoba.

Ejemplo 15 - Encapsulación de anticuerpo monoclonal (mAb anti-IL-13) dentro de las nanopartículas de PBCA huecas El anticuerpo monoclonal (mAb anti-IL-13) se capturó dentro del núcleo acuoso de las nanopartículas mediante inclusión en la fase acuosa interna del procedimiento de homogeneizacíón. La fase acuosa interna se preparó mezclando 0,5 mi de una solución de 20 mg/ml de mAb (10 mg de' proteína) y 0,5 mi de una solución de estabilizante (colato sódico, al 10 % p/v). Después, las nanopartículas se prepararon por el procedimiento de emulsión doble como se ha descrito en el ejemplo 5. Las nanopartículas resultantes se sedimentaron por centrifugación para separar anticuerpo libre de encapsulado. Tanto el sedimento (anticuerpo capturado) como el sobrenadante (anticuerpo libre) se analizaron por ensayo de proteína total (ensayo de ácido bicinconínico) para determinar la eficacia de encapsulación. Los resultados de los análisis se muestran en la Figura 12. Se observó que la cantidad de mAb encapsulado era 8,62 mg. La cantidad de mAb libre era 1,79 mg. La eficacia de encapsulación era de 86,2%, con la eficacia de carga del 14,4% p/p.

Ejemplo 16 - Optimización del procedimiento de HIP para encapsulación mejorada del anticuerpo de dominio en nanopartículas de PBCA Para mejorar la carga de anticuerpos de dominio, el protocolo de dalargina se optimizó adicionalmente. El protocolo para dalargina que se usó como punto de partida para la optimización se describe en los ejemplos 10 y 11. El objetivo de la modificación del protocolo fue conseguir la solubilización completa del anticuerpo en la fase orgánica y la incorporación eficaz en las nanopartículas. Esto se consiguió incluyendo una etapa de homogeneización adicional para formar una suspensión del complejo de HIP-dAb en la fase orgánica. En general, se realizaron los siguientes cambios en el protocolo de dalargina: El dAb que se usó fue el dAb de VEGF-myc. El dAb se denomina DOM 15-26-593 y se describe en el documento PCT WQ2008/149147. El dAb se formuló con una cantidad de aportación de 12 mg (0,843 µ????) por 100 mg de PBCA de polímero (dAb al 12% p/p/PBCA, 12 mg de dAb por 100 mg de polímero de PBCA). El dAb formó complejos con el HIP (docusato sódico) a una proporción molar de 82:1. La concentración de solución de HIP fue 30,581 mg/ml (0,06879 mmoles en 1 mi). La acidificación de la solución de dAb se realizó gradualmente y con mezcla constante para evitar la exposición de la molécula a valores de pH demasiado bajos y degradación. El pH de la solución de dAb se disminuyó hasta un pH de 3,6 con HCI. El CaCl2 no se usó ya que podría interferir con la unión del HIP al dAb. El dAb acidificado se extrajo de la fase acuosa por mezcla vorticial de 500 µ? de solución de dAb acidificada (24 mg/ml, 12 mg de proteína) con 1000 µ? de docusato sódico en DCM (30.581 mg/ml, al 3,058% p/p) seguido de centrifugación para separar las dos fases. A diferencia de la dalargina, se observó que el dAb no se solubiliza completamente en la fase orgánica. En lugar de esto, forma un precipitado blanco en la ¡nterfaz. El precipitado estaba constituido claramente por el complejo dAb:HIP ya que su volumen parecía ser proporcional a las cantidades de HIP y dAb usadas en la extracción. Los intentos de extraer completamente el dAb usando un volumen reducido de fase acuosa de 500 µ? a 367,76 µ? (ninguna adición de agua) fueron menos exitosos que usando el volumen de 500 µ?. Una serie de experimentos sugirió que un punto isoeléctrico alto era favorable, pero fue posible precipitar de forma exitosa los dAb con pl bajos (VEGF-dAb-myc, pl = 6,6 en este caso) del mismo modo. Después de la centrifugación se recogió la capa acuosa y se almacenó a 4°C. La capa orgánica, incluyendo el sedimento sólido de HIP-dAb se usó para preparar las nanopartículas. Para preparar las nanopartículas, fue necesario solubilizar el sedimento de HIP-dAb en la fase orgánica. Esto se consiguió introduciendo la siguiente etapa de homogeneización adicional en el procedimiento: La fase acuosa se retiró y la fase orgánica y el precipitado de dAb se homogeneizaron en el Eppendorf de 2 mi usando un homogeneizador Ultra-Turrax (T25 basic, ajuste de velocidad 1). La formulación se homogeneizó durante 15 segundos para formar una suspensión blanca. Fue importante garantizar que el sedimento de HIP-dAb se pusiera en contacto con la sonda del homogeneizador y comenzara a mezclarse inmediatamente. La homogeneización durante un periodo más prolongado de 1 minuto dio una mejor suspensión, pero el dAb perdió actividad. Después de la homogeneización, la fase orgánica se dejó en el Eppendorf de 2 mi y se añadieron 100 µ? de monómero de BCA. Se observó que el monómero líquido se mezcla de forma sencilla con la fase orgánica. Después se usó la fase orgánica para preparar las nanopartículas como se ha descrito en el ejemplo 12.

El procedimiento modificado también se aplicó a la preparación de nanopartículas de PBCA de HIP que contenían mAb encapsidado. Se formuló un anticuerpo monoclonal de longitud completa (mAb anti-CD23 mAb como se describe en el documento PCT W099/58679, 150.000 Da, 12 mg por 100 mg de polímero de PBCA, proporción molar de HIP:mAb de 860:1) siguiendo el protocolo desarrollado para dAb. Se realizaron las siguientes observaciones: Se observó que el mAb (anti-CD23 como se describe en el documento W099/58679) requería cantidades mayores de HCI que el dAb de VEGF. Cuando se extrajeron usando el agente de HIP, se observó que los mAb se comportan de forma similar a los dAb: no se solubilizan completamente en la fase orgánica y forman un precipitado blanco en la interfaz. La alta concentración de la solución madre de mAb permitió experimentar con el uso de un volumen de 250 µ? de fase acuosa en vez de 500 µ? para conseguir extracción completa del mAb en la fase orgánica. Esta proporción de 4:1 de fase orgánica a fase acuosa trabajó peor, parecía comprometer la actividad del mAb ya que se expuso a más disolvente. Una proporción 1:1 de fase orgánica a acuosa era claramente preferible tanto con mAb como dAb. Para preparar las nanopartículas, el sedimento de HIP-mAb se s o I u b i I izó en la fase orgánica mediante por homogeneizacion mediante la misma etapa de homogeneizacion que se empleó con los dAb. Se observó que la homogeneizacion era exitosa, pero la suspensión tenía más grumos, probablemente debido al mayor tamaño de los complejos de HIP-mAb. La homogeneizacion durante un periodo más prolongado de 1 minuto dio una mejor suspensión, pero el mAb parecía desnaturalizarse. Por lo tanto, la etapa de homogeneizacion se mantuvo corta en 15 segundos. Después se prepararon las nanopartículas siguiendo el protocolo de dAb como se ha descrito anteriormente en este ejemplo. En general, se observó que la encapsidación de biofarmacéuticos de mayor tamaño de péptidos requiere modificaciones sustanciales en el protocolo de dalargina. Tanto los dAb como los mAb requirieron proporciones molares de HIP:biofarmacéutico superiores para la solubilización (82:1 y 860, respectivamente). Se observó que tanto los dAb como los mAb no se solubilizan completamente en la fase orgánica. En su lugar, formaron un precipitado en la interfaz. Para solubilizarse en la fase orgánica, el precipitado .se homogeneizo en la fase orgánica para formar una suspensión de sólido en aceite. Esto dio como resultado una formación de partículas exitosa.

Ejemplo 17 - Encapsulación de anticuerpos de dominio en nanopartículas de PBCA usando el procedimiento de HIP modificado El protocolo de HIP modificado para dAb como se ha descrito en el ejemplo 16 se usó para encapsidar una serie de moléculas de dAb. Los dAb se seleccionaron basándose en su punto isoeléctrico. El objetivo fue abarcar el intervalo de puntos isoeléctricos (pl) que se usaría probablemente en el procedimiento para confirmar que el procedimiento era versátil y adecuado para una diversidad de dAb. Los siguientes dAb se seleccionaron para el experimento (Cuadro 3): Cuadro 3 El número DOM se refiere al anticuerpo de dominio como se ha descrito en el documento WO2008/149146. El myc se refiere al marcador myc en el anticuerpo de dominio o HA se refiere a un marcador HA en el anticuerpo de dominio. Cada dAb se formuló individualmente en nanopartículas de PBCA usando docusato sódico como el agente de HIP a una proporción molar de 70:1.

Los reactivos usados en las extracciones con HIP se enumeran en el siguiente Cuadro (Cuadro 4): Cuadro 4 Acidificación de solución de dAb para extracción.

Las soluciones de dAb se diluyeron antes de la acidificación por adición de agua del siguiente modo (Cuadro 5): Cuadro 5 Las soluciones se acidificaron por adición de HCI (2 M). Todas las soluciones de dAb se acidificaron hasta un pH de aproximadamente 3,0 medido por tiras indicadoras. El volumen final de cada solución acidificada se llevó hasta 500 µ? con agua. Después, los dAb se extrajeron en la fase orgánica como se ha descrito en el ejemplo 16. Se observó que todos los dAb no se solubilizan completamente en la fase orgánica y forman un precipitado en la interfaz. Se observó que el dAb no marcado (NT) proporciona un precipitado que era mucho más delgado que el de los demás dAb. El alto punto isoeléctrico y la carga positiva fuerte del dAb aparentemente habían permitido la formación de un complejo más hidrófobo, más fuerte con el HIP y dio como resultado un mayor grado de solubilización y transferencia a la capa orgánica.

Después de la retirada de la fase acuosa (capa superior), la fase orgánica y el precipitado de dAb se solubilizaron por homogeneización y las nanopartículas se prepararon como se ha descrito en el ejemplo 16.

Análisis de las nanopartículas por SDS-PAGE para evaluar la carga de los dAb.

Para analizar las suspensiones de nanopartículas por SDS-PAGE, las muestras se centrifugaron durante 10 minutos a 13,000 rpm en una micro-centrífuga. El sobrenadante se aspiró y el sedimento se resuspendió en 100 µ? de PBS. Las fracciones de sobrenadante y sedimentos se rompieron con NuPAGE LD 1x y agente reductor, se calentaron hasta 80°C durante 4 minutos y se examinaron por SDS-PAGE usando geles NuPAGE obtenidos en el mercado. También se examinó una muestra de sobrenadante de formulaciones huecas que contenían dAb y se usó como un control positivo.

Carriles 1 y 6: marcadores de peso molecular. Carril 2: dAb de VEGF DOM 15-10-11 , no marcado encapsidado en nanopartículas de PBCA de HIP. Carril 3: dAb de VEGF DOM15-10-11, marcado con myc, encapsidado en nanopartículas de PBCA de HIP. Carril 4: dAb de VEGF de DOM 15-10-11 , marcado con HA, encapsidado en nanopartículas de PBCA de HIP. Carril 5: dAb de VEGF DOM15-11-10, no marcado, encapsulado en nanopartículas huecas (control positivo). El gel confirmó que la encapsidación de los dAb había tenido lugar. El gel también confirmó que los dAb estaban intactos y que no se habían fragmentado debido al procedimiento de preparación de partículas. El gel mostró claramente que el dAb se había encapsidado dentro de las partículas, ya que se co-localizan con los sedimentos de nanopartícula después de la retirada de cualquier dAb libre (figura 13). El dAb se había encapsidado claramente dentro de las nanopartículas, ya que el análisis del sedimento en condiciones no desnaturalizantes (gel nativo) no produjo ninguna banda en el gel ya que el dAb permaneció en las partículas (resultados no mostrados). Fue necesario analizar las partículas por SDS-PAGE, ya que se requirieron las condiciones de desnaturalización (tratamiento térmico en presencia de SDS) para que el dAb se liberara de las partículas y avanzara en el gel. Se observó que la encapsidación fue exitosa con todos los dAb ensayados. Esto sugiere que la etapa de homogeneízación adicional solubilizó exitosamente el complejo de HIP-dAb en la fase orgánica para permitir la captura de dAb en las partículas. Como resultado, el hecho de que los complejos de HIP-dAb precipitaran en la interfaz después de la extracción, como fue el caso especialmente con dAb con pl bajo, no comprometió la encapsidación de los dAb en las partículas. Por lo tanto, se observó que el protocolo modificado para la encapsidación de dAb en partículas de PBCA de HIP era independiente del pl para los intervalos ensayados y adecuado para una variedad de dAb.

Ejemplo 18 - Ertcapsulación de anticuerpos de dominio en nanopartículas de PBCA usando el procedimiento de HIP modificado; determinación de la eficacia de carga v medición de la actividad de dAb formulados Para determinar la eficacia de carga que conseguiría el protocolo de HIP modificado, se preparó una formulación de nanopartículas de PBCA de HIP con un dAb como herramienta (dAb de VEGF-myc, DOM15-26-593 como se describe en el documento WO2008/149147. El dAb se formuló como una cantidad de aportación de 12 mg (0,843 µp???) por 100 mg de polímero de PBCA (dAb al 12% p/p/PBCA, 12 mg de dAb por 100 mg de polímero de PBCA). Las formulaciones se prepararon usando el protocolo de HIP modificado para dAb como se describe en el ejemplo 16.

Después de la preparación, las nanopartículas se caracterizaron mediante SDS-PAGE para confirmar que el dAb había permanecido intacto y que había quedado capturado con éxito dentro de las partículas. El análisis mediante SDS-PAGE se realizó como se describe en el ejemplo 17. También se analizó un conjunto de patrones de dAb de cantidades^ conocidas sobre el gel al lado de la formulación y se usaron para determinar la cantidad de dAb encapsulado (figura 14). Esto se consiguió fotografiando el gel y midiendo la intensidad de señal de las bandas de los patrones usando el programa informático labworks V4.6. El gel se preparó de la forma siguiente: Carriles 1 y 7: marcadores de pesos moleculares. Carriles 2-4: formulaciones dé nanopartículas de dAb. Carril 5: nanopartículas vacías (control negativo). Carriles 7-10: patrones de dAb (500, 125, 31,25 y 7,8 µ?/???). Carriles 11-14: patrones de dAb (7,8, 31,25, 125 y 500 9 /m I ) . El gel confirmó que había tenido lugar la encapsulación de los dAb y que el dAb estaba intacto. La comparación de las intensidades de banda de muestra con las de los patrones sugería que la concentración de dAb en la muestra de nanopartículas era de 413,7 µg/ml.

Las intensidades de banda se usaron para construir una curva patrón. La curva se usó después para calcular la cantidad de dAb en la formulación de nanopartículas a partir de la intensidad de la banda de la muestra de nanopartículas.

El gel confirmó que el dAb había quedado capturado con éxito dentro de las partículas y que había permanecido intacto después de la encapsulación. A partir de la comparación con los patrones, se descubrió que la concentración de dAb en la formulación de nanopartículas era de 413,7 µg ml. Esto se traducía en un total de 3,31 mg de dAb encapsulado en las nanopartículas de la aportación de 12 mg. Por lo tanto, la eficacia de carga era del 27,6%. La carga de dAb era del 3,31 % p/p.

Para liberar, el dAb encapsulado y evaluar su actividad, las muestras de nanopartículas se sometieron también a tratamiento térmico. El dAb se liberaba de las nanopartículas por incubación a temperatura que variaban de 4 a 65°C durante 1 hora en presencia de Tween 20 al 1%. Se sabe que el procedimiento consigue la liberación de al menos parte del dAb encapsulado de las partículas, sin embargo también puede causar cierta pérdida de actividad de dAb. Para minimizar la pérdida de actividad de dAb como resultado del tratamiento térmico, las muestras se incubaron también a 65°C durante 5 minutos, seguido de un tratamiento más suave a la temperatura inferior de 37°C durante 55 minutos.

Después de la incubación, las muestras se centrifugaron a 10,000 rcf durante 10 minutos para separar cualquier dAb liberado de las partículas. Los sobrenadantes, que contenían el dAb liberado, se recogieron y se analizaron mediante ELISA para determinar su actividad.

El dAb liberado se analizó por ELISA de la forma siguiente: Se recubrieron placas de 96 cavidades Nunc maxisorb con rVEGF 0,5 µg/ml durante una noche a 4°C. Después, las placas se lavaron con regulador de pH de lavado (PBS + Tween al 0,1%) 4 veces y después se bloquearon con regulador de pH de bloqueo (PBS + BSA al 1%) durante 1 hora a temperatura ambiente mientras se agitaban por balanceo. Las placas se lavaron como anteriormente, después se añadieron 50 µ? de muestras de sobrenadante por triplicado a las cavidades y las placas se incubaron como anteriormente. Las placas se lavaron, después se añadieron 50 µ? por cavidad de solución de Ab anti-myc (ratón) y las placas se incubaron de nuevo como se ha descrito anteriormente. Después de lavar las placas, se añadieron 50 µ? por cavidad de anti-ratón con HRP y las placas se incubaron como anteriormente. Las placas se lavaron finalmente como anteriormente y después se añadieron 50 µ?/cavidad de reactivo TMB. Se dejó que se desarrollara al color y la reacción se detuvo por adición de 50 µ? por cavidad de HCI (1 M). La absorbancia se midió a 450 nm usando un lector de placas Versamax y el programa informático Softmax Pro V5.3.

Los resultados obtenidos del ensayo de ELISA se muestran en el Cuadro 6: Cuadro 6 Se descubrió que el dAb liberado era activo, liberando las altas temperaturas una mayor cantidad de proteína de las partículas. Se descubrió que las muestras tratadas en las dos temperaturas de 65 y 37°C presentan la mayor cantidad de dAb activo liberado. El nivel original de actividad en la formulación era difícil de estimar ya que se sabe que el procedimiento de liberación compromete la actividad, pero, considerando el resultado de PAGE, el procedimiento 65/37 producía material con aproximadamente el 50% de la actividad específica de los patrones.

El dAb liberado se analizó mediante ELISA, que dio una lectura de dAb activo, así como mediante SDS-PAGE, que detectaba el dAb total. El dAb se analizó en el gel al lado de una serie de patrones. La cantidad de dAb se determinó después por medio de una curva patrón que se construyó midiendo las intensidades de banda de los patrones. Se descubrió que la concentración de dAb activo (61 µ?/???, medido por ELISA) era el 44% del dAb total (137,89 µglm\, medido por SDS-PAGE). - Por lo tanto, se descubrió que al menos el 50% del dAb formulado en las nanopartículas era activo. Se consideraba que esto era un muy buen nivel de actividad, considerando que el procedimiento de formulación implicaba solubilización en una fase orgánica seguida de exposición a mezcla por homogeneización. Por lo tanto, en el procedimiento de preparación de partículas parece ser adecuado para la formulación de anticuerpos de dominio.

Ejemplo 19 - Evaluación in vivo de nanopartículas de PBCA de HIP que contienen anticuerpos de dominio para determinar su capacidad para suministrar su carga de proteína al cerebro en el ratón mediante la vía intravenosa La formulación de nanopartículas descrita en el ejemplo 18 se evaluó por su capacidad para suministrar su carga de dAb en el cerebro en el modelo de ratón.

Se compararon nanopartículas que contenían dAb de VEGF encapsulado con dAb libre para determinar si las partículas podían aumentar la captación cerebral del dAb en comparación con la de moléculas de dAb libre. También se preparó y se evaluó un lote de nanopartículas vacías como control negativo.

Diseño del estudio in vivo.

El estudio implicó dos puntos de tiempos diferentes en los que evaluar los niveles cerebrales de dAb: 10 minutos y 60 minutos postadministración. El punto de tiempo más temprano se selecciona en caso de que la concentración de dAb alcanzara un máximo en el cerebro en cuestión de minutos después de la inyección, como se observó con el péptido dalargina. El punto de tiempo posterior se seleccionó para permitir que se produjera cierta eliminación del dAb de la circulación sanguínea. Cualquier dAb que estuviera presente en la sangre podría contaminar las muestras de cerebro y distorsionar los datos obtenidos. La corta vida media del dAb en la circulación sanguínea (20 minutos) quizá podría limitar la contaminación con sangre en el punto de tiempo posterior, permitiendo de este modo una lectura más clara de la penetración cerebral.

Corrección de la contaminación con sangre en muestras de cerebro: Para representar la cantidad de dAb en las muestras de cerebro que no se debía a captación cerebral sino que estaba simplemente presente en los vasos sanguíneos cerebrales y no en el propio tejido cerebral (contaminación con sangre), se realizó un estudio de inicio-seguimiento. Todos los ratones recibieron una dosis de una molécula de seguimiento que se sabe que permanece en la sangre y no penetra en el cerebro. La molécula de seguimiento que se seleccionó era el anticuerpo de longitud completa anti-CD23 como se describe en el documento W099/58679 que presenta una captación cerebral insignificante. Por lo tanto, cualquier cantidad de mAb anti-CD23 detectada en las muestras de cerebro se debería únicamente a su presencia en la sangre que contamina el tejido cerebral. La molécula de seguimiento se administró a los animales 5 minutos antes de sacrificarlos para asegurar que el anticuerpo permanecía en la sangre y no había tenido lugar ninguna captación tisular en otras áreas del cuerpo.

Grupos de animales: A: Partículas de control administradas a t =J0, seguidas de molécula de seguimiento a t = 5 minutos.

B: dAb en nanopartículas, administradas a t = 0, seguidas de molécula de seguimiento a t = 5 minutos.

C: dAb libre en solución (control), administrado a t = 0, seguido de molécula de seguimiento a t = 5 minutos.

Los grupos anteriores se sacrificaron a t = 10 minutos, a 5 minutos post-administración de la molécula de seguimiento.

D: Partículas de control, administradas a t = 0, seguidas de molécula de seguimiento a t = 55 minutos.

E: dAb en nanopartículas, administradas a t = 0, seguidas de molécula de seguimiento a t = 55 minutos.

F: dAb libre en solución (control no formulado), administrado a t = 0, seguido de molécula de seguimiento a t = 55 minutos.

Los grupos anteriores se sacrificaron a t = 60 minutos, a 5 minutos post-administración de la molécula de seguimiento.

Preparación de las dosis.

Molécula de seguimiento: mAb anti-CD 23 como se describe en el documento PCT W099/58679, 2,0 mg/kg.

Las dosis se prepararon diluyendo la solución madre de mAb 68 mg/ml hasta 500 9/???. Esto equivalía a una dosis de 50 µg en un volumen de 100 µ? para un ratón de 25 g.

Nanopartículas con dAb: 1,584 mg/kg, polímero de PBCA 50 mg/kg.

La suspensión de nanopartículas se preparó para inyección añadiendo 160 µ? de solución de polisorbato 80 (25% p/p) a 3600 µ? de suspensión de nanopartículas. Esto dio como resultado una concentración final de dAb formulado de 396,1 µ9/???. Esto equivalía a una dosis de dAb de 39,6 µ^ en un volumen de 100 µ? para un ratón de 25 g.

Nanopartículas vacías (control negativo): polímero de PBCA 50 mg/kg.

La suspensión de nanopartículas se preparó para inyección añadiendo 160 µ? de una solución de polisorbato 80 (25% p/p) a 3600 µ? de una suspensión de nanopartículas como anteriormente. Esto dio como resultado una concentración final de polímero de PBCA de 1,25 mg/ml. Esto equivalía a una dosis de PBCA de 125 ? en un volumen de 100 µ? para un ratón de 25g. dAb libre en solución (control no formulado): 1,584 mg/kg.

La solución se preparó para inyección diluyendo la solución madre de 2,0 mg/ml hasta 396,1 µ?/?t??. Esto equivalía a una dosis de dAb de 39,6 µ9 en un volumen de 100 µ? para un ratón de 25g.

Inyección de ratón: los ratones CD1 recibieron inyecciones por vía intravenosa (inyección en la vena la cola). Los volúmenes de inyección se calcularon en base al peso del los ratón. Después del final del procedimiento in vivo, se recogieron muestras de cerebro y suero de todos los ratones y se congelaron. Las muestras de tejido se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido. Todas las muestras se almacenaron a -80°C.

Homogeneización de cerebros para análisis.

Los cerebros se descongelaron y se pesaron. Se añadió un volumen de PBS que era el doble del peso del volumen cerebral a cada cerebro. Los cerebros se homogeneizaron después usando un procesador de tejidos Covaris acoustic (Covaris E210).

Análisis de cerebros mediante descubrimiento de mesoescala (MSD) Los homogeneizados de cerebro y muestras de suero se analizaron mediante MSD. Esto se consiguió adaptando el ensayo de ELISA anti-VEGF en el ejemplo 18 a un formato de MSD. Las muestras de suero se analizaron a 1:1000 en diluciones 1:10000. Las muestras de cerebro se analizaron en diluciones 1:5.

Resultados Los datos se procesaron y se generaron los resultados que se muestran en la figura 15. A los 10 minutos post-administración, el dAb en nanopartículas daba como resultado una captación cerebral detectable que equivalía a 8,0 ng/ml. El dAb libre también era detectable en el cerebro a la concentración ligeramente inferior de 3,3 ng/ml (datos preliminares). Los datos preliminares no incluían las lecturas de dos animales que no pudieron corregirse por contaminación con sangre ya que las lecturas del suero eran demasiado elevadas para cuantificarse. En general, las nanopartículas parecían aumentar marginalmente la captación cerebral de la proteína en el punto de tiempo de 10 minutos.

Sin embargo, a los 60 minutos, la situación se invertía. El dAb libre parecía acumularse en el cerebro dando como resultado un aumento adicional en sus niveles cerebrales hasta 13,5 ng/ml. El resultado observado puede explicarse de la forma siguiente: 1. La vida media (t1/2) del dAb libre en la circulación sanguínea era probablemente más prolongada que la de las partículas debido a su hidrofilicidad. Esto significaba probablemente que una mayor cantidad del dAb libre estaba disponible para captación cerebral en comparación con dAb formulado en nanopartículas. 2. La carga de dAb en las partículas no era suficientemente alta para compensar la pérdida de formulación debido a la eliminación rápida de la circulación sistémíca. La carga de fármaco en las partículas era del 3,31% p/p. Las formulaciones de dalargina habían requerido anteriormente una carga del 5,0% p/p para generar niveles cerebrales de 45 ng/ml. Cargas peptídicas superiores del 8,9% habían proporcionado concentraciones peptídicas en el cerebro que eran de hasta 833 ng/ml. Parece que una carga del 3,31% p/p, especialmente para el biof armacéutico de alto peso molecular, no es suficiente para un suministro cerebral significativo por lo que sería necesaria por lo tanto una optimización adicional de la carga. 3. Quizá los puntos de tiempo de 10 y 60 minutos eran demasiado tarde. Todos los estudios anteriores con dalargina y loperamida habían demostrado que el suministro es rápido, en 2-3 minutos desde la inyección. Los estudios previos también han sugerido que los mayores niveles de fármaco en el cerebro se conseguían en 5 minutos desde la administración o antes. Se seleccionó un punto de tiempo de 10 minutos para asegurar un tiempo suficiente para realizar un estudio de inicio-seguimiento y se seleccionaron 60 minutos para detectar cualquier efecto de larga duración del anticuerpo de dominio. 4. El sistema de PBCA de HIP sólo se dirige de forma pasiva al cerebro. Cuando se administra por vía intravenosa, se sabe que dichas partículas que presentan una superficie hidrófoba se dirigen de forma pasiva a varios órganos además del cerebro. Estos órganos incluyen el hígado y el bazo. Cuando se administran por vía intravenosa, las nanopartículas alcanzarán primero el hígado y el bazo, antes de encontrarse con el cerebro. Como resultado, la mayoría de la dosis inyectada podría suministrarse a esos tejidos, dejando sólo una fracción disponible para el suministro al cerebro. Esto podría haber comprometido gravemente la capacidad de las partículas para alcanzar el cerebro en este experimento.

Para destacar el impacto de la pérdida de dAb de la circulación sanguínea, se calcularon también las proporciones de cerebro con respecto a sangre (figura 16). Los resultados muestran claramente que había presentes proporciones mucho mayores de dAb en el cerebro en comparación con la sangre cuando se administraba con nanopartículas en comparación a cuando el dAb se administraba libre en solución. De hecho, el dAb formulado presentaba una proporción en cerebro con respecto a sangre de 0,04 (60 minutos), que es superior a la proporción a la que se considera que un compuesto penetra en el cerebro. El dAb libre no superó este umbral de penetración cerebral en ninguno de los puntos de tiempo que se analizaron. Por lo tanto, a pesar de la pérdida significativa de la dosis inyectada, en términos de capacidad global para atravesar la barrera hematoencefálica, las partículas pueden ser en última instancia superiores al dAb libre.

En general, se sabe que la vía intravenosa es la vía más desafiante de administración para partículas dirigidas pasivamente tales como el sistema HIP-PBCA. Por lo tanto, la administración intravenosa no era el procedimiento ideal para evaluar la capacidad del sistema HIP-PBCA para suministrar su carga farmacológica a través de la BHE desde la sangre. Por esta razón, también se realizó un estudio intracarotídeo. La administración mediante la vía intracarotídea evita tejidos tales como el hígado y el bazo y proporciona una vía más directa hacia el cerebro. Como resultado, una mayor cantidad de la dosis de nanopartículas inyectada está disponible para el suministro al cerebro. En una comparación mano a mano entre fármaco libre y formulado, es más probable que la vía intracarotídea proporcione una medida verdadera de la capacidad de las nanopartículas para superar la BHE.

Ejemplo 20 - Evaluación in vivo de nanopartículas de PBCA de HIP que contienen anticuerpos de dominio por su capacidad para suministrar su carga proteica en el cerebro en el ratón mediante la vía intracarotídea Evaluación in vivo de la formulación de nanopartículas administración intracarotídea.

La formulación de nanopartículas se evaluó por su capacidad para suministrar su carga de dAb en el cerebro en el ratón mediante la vía intracarotídea.

La vía se seleccionó porque proporciona una vía directa hacia el cerebro. Cuando se administra una sustancia en la arteria carotídea, el primer tejido que alcanza es el cerebro. Por el contrario, cuando se administra un fármaco por vía intravenosa, se encontrará tejidos tales como el hígado antes de alcanzar el cerebro. Se descubrió que esto limitaba la capacidad de las nanopartículas para suministrarse al cerebro, puesto que se sabe que también son captadas por tejidos tales como el hígado y bazo. De hecho, Kreuter y col han observado que con sus partículas adsorbidas con PBCA la mayor parte de la dosis de nanopartículas vacías inyectada (-60%) se captaba por el hígado cuando se administraba a través de la vena de la cola.

En general es bien conocido que la vía intravenosa es la menos favorable y la vía más desafiante de administración para sistemas de suministro dirigidos pasivamente tales como las nanopartículas de HIP-PBCA.

Por lo tanto, se pensaba que la vía intracarotídea proporcionaría más probablemente indicios precisos de la capacidad de las nanopartículas para superar la barrera hematoencefálica.

Diseño del estudio in vivo.

El diseño del estudio era el mismo que para el estudio intravenoso, siendo las únicas diferencias las siguientes: 1. Los anímales se mantuvieron bajo anestesia terminal a lo largo de todo el experimento. Esto era necesario debido a la complejidad de los procedimientos quirúrgicos implicados. 2. Las formulaciones de nanopartículas y de dAb libre se administraron medíante la vía intracarotídea por medio de una cánula preparada quirúrgicamente. 3. La molécula de seguimiento se administró por vía intravenosa a través de la vena de la cola, pero a diferencia del estudio anterior el anticuerpo se administró por medio de una cánula.

Grupos de animales: ' A: Partículas de control, administradas a t = 0, seguidas de molécula de seguimiento a t = 5 minutos.

E: dAb en nanopartículas, administradas a t = 0, seguidas de molécula de seguimiento a t = 5 minutos.

C: dAb libre en solución (control), administrado a t = 0, seguido de molécula de seguimiento a t = 5 minutos.

Los grupos anteriores se sacrificaron a t = 10 minutos, a 5 minutos post-administración de la molécula de seguimiento.

B: Partículas de control, administradas a t = 0 seguidas de molécula de seguimiento a t = 55 minutos.

F: dAb en nanopartículas, administrado a t = 0, seguido de molécula de seguimiento a t = 55 minutos D: dAb libre en solución (control no formulado), administrado a t = 0, seguido de molécula de seguimiento a t = 55 minutos.

Los grupos anteriores se sacrificaron a t = 60 minutos, 5 minutos post-administración de la molécula de seguimiento.

Preparación de las dosis.

Molécula de seguimiento: mAb anti-CD23 como se describe en el documento PCT W099/58679, 2,0 mg/kg.

Las dosis se prepararon diluyendo la solución madre de mAb 68 mg/ml hasta 500 µ9/?t??. Esto equivalía a una dosis de 50 µ9 en un volumen de 100 µ? para un ratón de 25 g.

Nanopartículas con dAb: 1,584 mg/kg, polímero de PBCA 50 mg/kg; La suspensión de nanopartículas se preparó para inyección añadiendo 160 µ? de una solución de polisorbato 80 (25% p/p) a 3600 µ? de una suspensión de nanopartículas. Esto daba como resultado una concentración final de dAb formulado de 396,1 µ?/???. Esto equivalía a una dosis de dAb de 39,6 µ9 en un volumen de 100 µ I para un ratón de 25 g.

Nanopartículas vacías (control negativo): polímero de PBCA 50 mg/kg.

La suspensión de nanopartículas se preparó para inyección añadiendo 160 µ? de solución de polisorbato 80 (25% p/p) a 3600 µ? de una suspensión de nanopartículas como anteriormente. Esto daba como resultado una concentración final de polímero de PBCA de 1,25 mg/ml. Esto equivalía a una dosis de PBCA de 125 µ9 en un volumen de 100 µ? para un ratón de 25 g. dAb libre en solución (control no formulado): 1,584 mg/kg.

La solución de dAb se preparó para inyección por dilución de la solución madre de 2,0 mg/ml hasta 396,1 µ?/???. Esto equivalía a una dosis de dAb de 39,6 µ9 en un volumen de 100 µ? para un ratón de 25 g.

Resultados Los datos se procesaron y se generaron los resultados que se muestran en la figura 17. A los 10 minutos post-administración, el grupo de dAb en nanopartículas presentaba altos niveles de dAb en el cerebro, a un promedio de 627,60 ng/ml. La concentración real de dAb en el cerebro era probablemente superior, puesto que la figura anterior no incluía las lecturas de dos animales. Las dos muestras proporcionaron señales que eran demasiado elevadas para cuantificación pero desafortunadamente no se analizaron a tiempo para su inclusión en este documento. Uno de los animales era un resultado aislado claro que dio una concentración cerebral relativamente baja de 45,45 ng/ml. Esto daba como resultado los grandes errores observados con el grupo. No obstante, la concentración promedio de dAb formulado en el cerebro era casi 9 veces superior que la de dAb libre, que era de 71,67 ng/ml.

A los 60 minutos post-inyección, los niveles de dAb en el cerebro permanecían elevados a 146,51 ng/ml. La concentración de dAb libre en su lugar había caído hasta un promedio de 3,17 ng/ml. Por lo tanto, a los 60 minutos post-inyección la concentración cerebral de dAb administrado en nanopartículas era 46 veces superior que la conseguida con dAb desnudo. En general, se descubrió que las nanopartículas suministraban con gran éxito el dAb en el cerebro mediante la vía intracarotídea.

Esto también era evidente a partir de la determinación de las proporciones de cerebro con respecto a sangre para los grupos (figura 18). El dAb en el grupo de nanopartículas presentaba proporciones de cerebro con respecto a sangre que eran superiores a 1 en ambos puntos de tiempo (1,569 y 1,845 a 10 y 60 minutos, respectivamente) sugiriendo que la mayoría del dAb formulado había alcanzado con éxito el cerebro. Por el contrario, los grupos de dAb libre se caracterizaban por proporciones de cerebro con respecto a sangre que eran significativamente inferiores, a 0,012 y 0,286 para los puntos de 10 y 60 minutos, respectivamente.

En conclusión, se descubrió que el sistema de suministro en nanopartículas mejoraba enormemente el suministro de dAb en el cerebro cuando se administraba mediante la vía intracarotídea. Esto era porque la vía alcanza el cerebro antes que el hígado y el bazo, que son tejidos a los que la formulación también se dirige pasivamente además de al cerebro.

La vía intravenosa no tuvo tanto éxito, proporcionando una señal transitoria de un aumento en captación cerebral de dAb. Esto se debía probablemente a la carga insuficiente de dAb en las partículas, así como debido a que el sistema de suministro se estaba captando por otros tejidos, dando como resultado que sólo una fracción de las partículas inyectadas alcanzase el cerebro.

Por lo tanto, para mejorar el sistema y conseguir un suministro eficaz en el cerebro mediante la vía intravenosa, es necesario mejorar adicionalmente la carga de dAb en las nanopartículas. Esto podría conseguirse empleando el sistema de PBCA hueco, que se ha demostrado que tiene una mayor capacidad para la carga de dAb que el sistema de PBCA de HIP. A condición de que sean suficientemente estables in vivo, las partículas de PBCA hueco pueden tener más éxito que el sistema de PBCA de HIP en el suministro del dAb en el cerebro. Para asegurar su estabilidad, puede ser necesario emplear mezclas del polímero PBCA con otros polímeros de mayor peso molecular tales como PLGA, PLA o PCL. El sistema de suministro también puede beneficiarse del uso de copolímeros pegilados. Dichos polímeros podrían mejorar el tiempo de circulación de las nanopartículas en la sangre y por lo tanto mejorar el suministro cerebral .

Un medio adicional de mejorar el sistema de suministro es alterar su mecanismo de direccionamiento al cerebro. Es probable que una nanopartícula activamente dirigida que presenta un ligando que se une a un objetivo en la BHE mejore la captación cerebral y al mismo tiempo limite la pérdida de partículas en otros tejidos. Para conseguir el direccionamiento activo probablemente será necesario pegilar exhaustivamente la superficie de las nanopartículas para limitar cualquier direccionamiento inespecífico a otros órganos.

En general, el sistema de nanopartículas descrito en este documento tiene un gran potencial para conseguir el suministro eficaz de anticuerpos de dominio en el cerebro, sin embargo, para conseguir esto todavía es necesaria una optimización significativa.

Ejemplo 21 - Encapsulación de anticuerpos de dominio en microesferas de PCL usando un procedimiento de HIP modificado Se usó el polímero policaprolactona, (PCL, Lactel), como un caso de ensayo tanto para la generación de microesferas como para el uso de polímeros de liberación lenta con el procedimiento de HIP para encapsulación de dAb. Los experimentos iniciales usaban modificaciones de los protocolos de encapsulación de HIP descritos en los Ejemplos 14 y 17 para adaptar el uso de PCL para generar tanto nanopartículas vacías como microesferas.

Las formulaciones iniciales usaban reservas de PCL en diclorometano (DCM) 100 mg/ml, y pluronic F68 al 1% (Sigma) como tensoactivo con velocidades de homogeneización de 4000-7500 rpm durante 45 segundos, pero se prepararon pocas microesferas o nanopartículas (no se muestran los datos). El procedimiento se optimizó adicionalmente probando diferentes tensioactivos: también colato de sodio al 1% (Sigma) o Lutrol F127 Poloxamer 407 al 1% (BASF Corp.) o Vitamina E TPGS al 1% (succinato de D-alfa tocoferil polietilenglicol 1000), (Peboc/Eastman) con escasa mejora inicial (no se muestran los datos) hasta que se redujo la cantidad de polímero de aportación hasta 10 mg/ml, cuando podían observarse unas pocas microesferas grandes frágiles de >20 µ?? bajo el microscopio de luz (no se muestran los datos) pero la mayoría del PCL se salía de la suspensión como partículas macroscópicas una vez que se había evaporado el disolvente orgánico (no se muestran los datos). El procedimiento se mejoró adicionalmente en términos de estabilidad de partículas usando los dos tensioactivos más prometedores de los experimentos descritos anteriormente al 2% para ayudar a estabilizar más las suspensiones: Lutrol F127 Polaxomer 407, (BASF Corp.) o vitamina E TPGS y velocidades de homogeneización de 7500-9000 rpm durante de 45 segundos a 2 min. Usando este procedimiento se generaron partículas de aproximadamente 1 µ?t? de tamaño en todos los casos (no se muestran los datos) pero se seleccionó la vitamina E TPGS al 2% como tensoactivo con una homogeneización de 2 min para un protocolo para encapsular dAb que se muestra a continuación.

Preparación de microesferas de HIP-PCL, (M/P), que encapsulan dAb.

Se prepararon microesferas de HIP-PCL de acuerdo con la metodología del ejemplo 16 anterior y cualquier cambio en este protocolo se detalla a continuación.

Formulaciones usadas: Se prepararon cuatro formulaciones de PCL (poli-e-caprolactona): i) partículas vacías con HIP para PCL como M/P - 4000 rpm (Vitamina E [TPGS] al 2% como tensoactivo) - 2 min ii) partículas vacias con HIP para PCL como M/P - 7500 rpm (Vitamina E [TPGS] al 2% como tensoactivo) - 2 min iii) partículas con HIP para PCL como M/P + dAb para análisis, (dAb1) - 7500 rpm (Vitamina E [TPGS] al 2% como tensoactivo) - 2 min iv) partículas con HIP para PCL como M/P + dAb para clasificación por tamaños, (dAb2) - 7500 rpm (Vitamina E [TPGS] al 2% como tensoactivo) - 2 min Soluciones necesarias: (1) dAb a extraer: anti-VEGF (DOM15-26-593 como se describe en el documento WO2008/149147.), lote TB090220 1,5 mg/ml (14,246 Da) - usaba 4 x 5 mi (una nueva lectura real de la concentración de dAb usando un espectrofotómetro Nanodrop 1000, Thermo Scientific, confirmó que la concentración era de hecho de 1,04 mg/ml) (2) solución de HIP 82:1 (1 mi, 30,58 mg/ml) (3) solución de dAb acidificada (25 mg/ml) N/A (4) fase acuosa: dextrana al 1% p/v, tensoactivo* al 2% p/v en PBS (5) polímero de PCL disuelto en DCM *Reserva de Vitamina E [TPGS] al 10% Preparación de solución de PCL en DCM.

El objetivo era proporcionar 10 mg de PCL disueltos en DCM por formulación - la solubilidad era de ~100 mg/ml en DCM, como máximo, pero podía disolverse más a ~10 mg/ml. Se preparó suficiente PCL para 5 formulaciones, es decir, 50 mg en 5 mi de DCM. Se pesaron 50 mg de PCL (desecador al vacío de descongelado abierto cuando se calentaba a una temperatura ambiente de ~20°C), se pesó (balanza de precisión) - se agitó en un vaso de precipitados de 10 mi con PCL + 4 mi DCM - se agitó con agitador de vidrio en una campana de humos bajo cubierta. Una vez disuelto se midió en un cilindro de medición de vidrio y se enrasó hasta 5 mi con DCM y después se volvió a mezclar (por agitación en vaso de precipitados) y se usó rápidamente.

Concentración de solución de dAb.

La preparación se realizó inicialmente durante una noche a temperatura ambiente a 600 rpm y se diluyó de nuevo hasta una concentración correcta. La solución se concentró usando concentradores Vivaspin (Vivaspin 6, Sartorius, VS0691, MWCO 3000 PES) y siguiendo las instrucciones de los fabricantes en una centrífuga de. sobremesa a temperatura ambiente Sorvall legend. La concentración era desde los 1,5 mg/ml esperados (20,0 mi como 5 mi en Vivaspin 4x) hasta 25 mg/ml (-700 µ?). El procedimiento llevó 2 horas a 1000-1500 rpm y -1 hora adicional a 3000 rpm. 400 µ? de dAb iniciales a una dilución 1 en 75 dieron 0,56 mg/ml por Nanodrop - esto se diluyó después hasta 760 µ? a 25 mg/ml y se trató con ácido para reducir el pH hasta ~3,7. El material con tratamiento simulado se trató con ácido a pH ~2,5. El dAb estaba a 25 mg/ml ~pH 5,5/4,5 -el objetivo es disminuirlo hasta pH 3,7 - el pH se comprobó con una tira de pH 2,5 a 4,5. Se usaron 380 µ? de dAb, por ejemplo, solamente 9,5 mg por formulación (y se ajustó una concentración de aportación inicial de 1mg/ml no de 1,5 mg/ml).

Cuadro 7: Preparación de soluciones acidificadas.

Cuadro 8; Formulaciones y reactivos para extracciones de HIP (protocolo de volumen patrón) (A) dAb en fase orgánica dAb en formulación dAb 10-12,0 mg, HIP 82:1, 10 mg de PCL Cantidad de dAb (mg) o -9,5 dAb w/o Concentración (mg/ml) 25,00 Volumen necesario (µ?) 380 (B) HIP en fase orgánica El objetivo era preparar una mezcla 1:2 de dAb (ac): DCM/HIP -la anterior es para una mezcla 1x, es decir, -500 µ?:1000 µ? de fase orgánica.

Cuadro 9: Preparación de controles vacíos (fase orgánica) Extracción de dAb o muestra con tratamiento simulado (partículas vacías) en la fase orgánica usando docusato sódico como agente de HIP.

La solución de dAb o "muestra con tratamiento simulado" acidificada y la fase orgánica se mezclaron en tubos Eppendorf de 2 mi y se añadieron a la fase acuosa. Las mezclas se mezclaron por agitación vorticial a velocidad máxima durante 1 minuto y después se colocaron en una mezcladora de sobremesa 5432 durante 5 minutos. Las mezclas blancas resultantes se centrifugaron velocidad máxima (20817 rcf, 14000 rpm en microfuga) durante 50 minutos. El complejo dAb-HIP parecía formar un precipitado blanco espeso en la interfaz. La fase acuosa se recogió y se almacenó a 4 grados C. La fase acuosa superior se retiró y se almacenó y el procedimiento continuó con la fase orgánica inferior.

Homogeneización del complejo HIP-dAb en la fase orgánica.

La fase orgánica se homogeneizó en el tubo Eppendorf de 2 mi usando un homogeneizador ??? T25 (polytron, ajuste de velocidad 1) durante 7-10 segundos. El objetivo era conseguir una homogeneización completa del precipitado blanco (complejo de dAb y HIP) en el disolvente orgánico (DCM). El complejo de HIP-DAB se solubilizaba fácilmente en la fase orgánica para formar una emulsión que parecía homogénea. La fase orgánica se homogeneizó durante un total de 10 segundos. Existía un escaso precipitado restante en el tubo después de la homogeneización y retirada de la fase orgánica.

Preparación de las microesferas.

Se tomó el 1 mi de fase orgánica de los homogeneizados y se mezcló 1ml de PCL disuelto en DCM (100 mg) pipeteando arriba y abajo.

La suspensión blanca resultante (2 mi) se pipeteó en la fase acuosa (10 mi de dextrana en agua y solución de tensoactivo al 2% en solución de PBS en un vaso de precipitados de 25 mi) en el punto de entrada de la sonda por debajo de la superficie líquida. La fase acuosa se estaba homogeneizando a 7500 rpm, (M/P.) o 4000 rpm (M/P) usando un homogeneizador Silverson L4RT. La emulsión se homogeneizó durante 2 minutos. Después, la formulación se incubó en una campana de humos con agitación (ajuste de velocidad 4) durante 3 horas para evaporar la fase orgánica. El ajuste se disminuyó hasta 3 a 1 h en la incubación para prevenir una mezcla excesiva de la emulsión ya que esto daba como resultado el depósito de agregados en la superficie del vaso de precipitados.

Ejemplo 22 - Clasificación por tamaños de las microesferas (a) Microscopía óptica.

Las cuatro formulaciones, (i) a (iv) anteriores se clasificaron por tamaños en el microscopio Nikon Eclipse E400 usando luz visible. Los datos que muestran imágenes de estas partículas se muestran en la Fig. 19. Podían observarse microesferas visibles de un intervalo de tamaño similar a partir de las cuatro formulaciones tanto las que contenían como las que no contenían dAb. Los datos sugieren que las microesferas se forman de forma similar en presencia de dAb usando este procedimiento. (b) Dispersión de luz estática multiángulo.

Las cuatro muestras se clasificaron por tamaños en el analizador de tamaño de partícula de alta definición Saturn DigiSizer 5200.

Las muestras se clasificaron por tamaños cargando material suficiente de las clasificaciones por tamaño de micro-partículas anteriores en la unidad de manipulación de muestras de bajo volumen unida al Saturn DigiSizer 5200 para permitir un oscurecimiento del 5 - 30%, preferiblemente superior al 15% en una matriz de PBS desgasificado (que necesita el 50-100% de la formulación). Después, las muestras se analizaron usando un modelo de análisis de policaprolactona usando un reparto real del índice de refracción de 1,476 y un reparto imaginario del índice de refracción del 0,0001. El caudal era de 6 l/mín, el ángulo del rayo de detención era de 45 grados, los medios eran PBS y los recuentos se realizaron por triplicado. Se describieron tanto el volumen como la distribución en número, los datos se obtuvieron como un informe combinado, una gráfica acumulativa y una gráfica de frecuencia, para detalles de los procedimientos véase el Micromeritics Saturn Digisizer 5200 Operators Manual V1.12, (marzo 2007) y la guía de referencia rápida.

Los datos se presentaron para las formulaciones pertinentes: (i) a (iv) en las Figuras 20 (a) a (d) como gráficas que representan la frecuencia del número de partículas frente al tamaño de partícula. Véanse a continuación los datos correspondientes a estas gráficas.

Figura 20 (a) Informe Resumen Muestra Concentración de muestra: 0,01069 % Oscurecimiento: 29,1 % Estadística Geométrica de Distribución de Volumen Desv. Típ. de 8 Desv. Típ. de 8 Media 8,355 2,926 Modo 10,00 4,017 Mediana 9,754 3,951 Log. Desv. 0,382 0,047 Típ.

Asimetría -0,267 0,106 Curtosis -0,436 0,180 Estadística Geométrica de Distribución de Número Desv. Típ. de 8 Desv. Típ. de 8 Media 1,393 0,070 Modo 1,000 0,000 Mediana 1,033 0,009 Log. Desv. 0,214 0,022 Típ.

Asimetría 1,504 0,388 Curtosis 2,001 2,445 Fig. 20 (b) Informe Resumen Muestra Concentración de muestra: 0,00284% Oscurecimiento: 16,7% Estadística Geométrica de Distribución de Volumen Desv. Típ. de 8 Desv. Típ. de 8 Media 5,366 3,943 Modo 2,239 2,744 Mediana 4,304 5,816 Log. Desv. 0,521 0,033 Típ Asimetría 0,523 0,450 Curtosis 0,178 Estadística Geométrica de Distribución de Número . Desv. Típ. de 8 Desv. Típ. de 8 Media 1,231 0,016 Modo 1,000 0,000 Mediana 1,048 0,013 Log. Desv. 0,141 0,012 Típ Asimetría 1,954 0,198 Curtosis 4,737 1 ,339 Figura 20 (c) Informe Resumen Muestra Concentración de muestra: 0,00771% Oscurecimiento: 21,6% Estadística Geométrica de Distribución de Volumen Desv. Típ. de 6 Desv. Típ. de 6 Media 9,346 7,368 Modo 2,239 12,53 Mediana 10,45 7,174 Log. Desv. 0,421 0,115 Típ Asimetría -0,234 0,252 Curtosis -0,185 3,125 Estadística Geométrica de Distribución de Número Desv. Típ. de 6 Desv. Típ. de 6 Media 1,355 1,046 Modo 1,000 0,751 Mediana 1,048 0,731 Log. Desv. 0,196 0,070 Típ Asimetría 1,711 0,234 Curtosis 3,196 1,059 Figura 20 (d) Informe Resumen Muestra Concentración de muestra: 0,01069% Oscurecimiento: 29,1% Estadística Geométrica de Distribución de Volumen Desv. Típ. de 8 Desv. Típ. de 8 Media 8,355 2,926 Modo 10,00 4,017 Mediana 9,754 3,951 Log. Desv. 0,382 0,047 Típ Asimetría -0,267 0,106 Curtosis -0,436 0,180 Estadística Geométrica de Distribución de Número Desv. Típ. de 8 Desv. Típ. de 8 Media 1,393 0,070 Modo 1 ,000 0,000 Mediana 1,033 0,009 Log. Desv. 0,214 0,022 Típ.

Asimetría 1,504 0,388 Curtosis 2,001 2,445 La determinación más clara del tamaño medio de partícula es de la distribución en número media geométrica que dio los siguientes tamaños medios de partícula: i) partículas vacías con HIP para PCL como M/P - 4000 rpm (Vitamina E [TPGS] al 2% como tensoactivo) - 2 min, tamaño medio de partícula 1,231. ¡i) partículas vacías con HIP para PCL como M/P - 7500 rpm (Vitamina E [TPGS] al 2% como tensoactivo) - 2 min, tamaño medio de partícula 1,181. iii) partículas con HIP para PCL como M/P + dAb1 para análisis - 7500 rpm (Vitamina E [TPGS] al 2% como tensoactivo) - 2 min, tamaño medio de partícula 1,355. iv) partículas con HIP para PCL como M/P + dAb2 para clasificación por tamaños - 7500 rpm (Vitamina E [TPGS] al 2% como tensoactivo) - 2 min, tamaño medio de partícula 1,393.

La conclusión era que aunque una velocidad inferior en estas condiciones generaba microesferas ligeramente más grandes el impacto no era grande - las condiciones descritas para homogeneización a 7500 rpm generaban microesferas en presencia de dAb con un diámetro medio de 1.4 µ?t?, por lo tanto ligeramente mayor que las partículas vacías en este procedimiento.

Ejemplo 23 - Análisis de microesferas de HIP-PCL que contienen dAb Se prepararon microesferas de PCL de HIP que contenían dAb, como en el ejemplo 21 anterior. Se tomaron 50 µ? de cada formulación (dAb1 y dAb2) y: i) Se centrifugó en un tubo de microfuga de 1,5 mi a 3 K rpm durante 5 min para generar un sobrenadante (S) - se retiraron 30 µ? a un tubo de microfuga limpio y se resuspendió una fracción de sedimento (P) en 50 µ? de PBS; ii) Se centrifugó en un tubo de microfuga de 1,5 mi a 13 K rpm durante 5 min para generar un sobrenadante (S) - se retiraron 30 µ? a un tubo de microfuga limpio y se resuspendió una fracción de sedimento (S) en 50 µ? de PBS; iii) Se centrifugó en un Vivaspin 500 (límite de peso molecular de 1,000,000) a 5 K rpm durante 5 min para eliminar cualquier dAb incorporado puesto que las partículas se retienen en la columna y los 50 µ? de PBS como sobrenadante (F) se pasan a través de ella y se recogen. El Vivaspin 500 (Sartorius stedim biotech) se usó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se prepararon muestras para carga por adición de 21 µ? de muestra a 8 µ? de colorante de carga 4x a 3 µ? de agente reductor 10x para generar un volumen final de 32 µ? del que se cargaron 10 µ? después de calentar a 80°C en una placa de PCR de 96 cavidades situada en un bloque de PCR, (PTC-100, MJ research Inc) durante 5 minutos.

Después, las muestras se cargaron en una modalidad de gel de acuerdo con las instrucciones del fabricante en regulador de pH de MES SDS (ácido 2-N morfolino etanosulfónico, dodecilsulfato sódico) durante 35 minutos (Invitrogen). y se tiñeron usando la versión mediada por microondas del protocolo SirnplyBlue SafeStain (Invitrogen). También se procesaron patrones de carga de dAb no encapsulado al lado en el gel para ayudar a calcular las concentraciones, es decir, como 3,28 µg, 0,82 µg, 0,21 µg y 0,05 µg de diluidos, como se ha descrito anteriormente en la preparación de muestras, cargas de 10 µ? de reservas de 500 ng/µ?, 125 ng/µ?, 31,25 ng/µ? y 7,8 ng/µ?. Se muestra una imagen del gel teñido en la Figura 21.

El gel se preparó de la forma siguiente: Carril 1: dAb1 total, Carril 2: dAb1 3K S, Carril 3: dAb1 3K P, Carril 4: dAb1 13K S, Carril 5: dAb1 13K P, Carril 6: dAb1 F, Carril 7: dAb2 total, Carril 8: dAb2 3K S, Carril 9: dAb2 3K P, Carril 10: dAb2 13K S, Carril 11: dAb2 13K P, Carril 12: dAb2 F, Carril 13: Marcadores moleculares - patrón preteñido SeeBlue Plus 2 (Invitrogen), peso molecular (KD), Carril 14: patrón de dAb de 3,28 ng, Carril 15: patrón de dAb de 0,82 ^ig, Carril 16: patrón de dAb de 0,21 µg, Carril 17: patrón de dAb de 0,05 µg. El gel confirmó que había tenido lugar la encapsulación de los dAb. El gel también confirmó que los dAb estaban intactos y que no se habían fragmentado debido al procedimiento de preparación de partículas.

La cantidad de material en. la totalidad, fracciones de sobrenadante y sedimento de las partículas de PCL de HIP se determinó para dAb1 usando captura de bandas y el paquete de cuantificación en Gel 1D del programa informático Labworks 4.6 (UVP). Se capturaron las imágenes para análisis usando una estación de trabajo Vision equipada con una cámara Olympus bajo luz blanca. Los datos se muestran en el Cuadro 9.

Cuadro 10: Determinación de carga dé dAb en microesferas de PCL-HIP Carril 1: dAb1 total, Carril 2: dAb1 3K S, Carril 3: dAb1 3K P, Carril 4: dAb1 13K S, Carril 5: dAb1 13K P, Carril 6: dAb1 F, Carril 7: dAb2 total , Carril 8: dAb2 3K S, Carril 9: dAb2 3K P, Carril 10: dAb2 13K S, Carril 11: dAb2 13K P, Carril 12: dAb2 F, Carril 13: Marcadores moleculares - patrón preteñido SeeBlue Plus 2 (Invitrogen), peso molecular (KD), Carril 14: patrón de dAb de 3,28 µ?, Carril 15: patrón de dAb de 0.82 µg, Carril 16: patrón de dAb de 0,21 µ^, Carril 17: patrón de dAb de 0,05 µg.

Las lecturas de gel para intensidad de dAb se convirtieron en cantidades de dAb en µ9 (Cuadro 10) usando una representación de los patrones de dAb frente a la intensidad de bandas, (no se muestran los datos).

La formulación media de dAb total se leyó como (carriles 1 y 7), 3,5 µg + 4, ng/2 = 4 ng - la muestra se diluyó 21 en 32 al cargar los 10 µ? de modo que el dAb total en 10 µ? = 32/21 x 4 = 6 Sobrenadante de dAb1 (carriles 2, 4 y 6) = 1,0 + 0,9 + 0,73/3 = 0,9 g, corregido por dilución es 1.4 g.

Sedimento de dAb1 (carriles 3 y 5) = 3,0 + 3,1/2 = 3,0 µg, corregido por dilución es 4,6 µg.

Las fracciones parecen concordar con dAb total a 6 µ? = sobrenadante de dAb 1 (1,4 µg) + sedimento de dAb 1 (4,6 µg) usando estas figuras el porcentaje de dAb encapsulado es el 77% del dAb total (4,6/6,0).

Sin embargo el porcentaje de dAb de aportación - 10 µ? (9,5 µ9) que está encapsulado es 4,6/9,5 x 100 = 48%.

Ejemplo 24 - Liberación de dAb a partir de m icroesferas de PCL de HIP Para liberar el dAb de partículas de PCL de HIP para análisis de actividad funcional - se tomaron muestras de alícuotas de 50 µ? de las formulaciones de PCL de HIP de dAb1 y dAb2 y se colocaron en un Eppendorf de 1,5 mi. Estas se lavaron 2x con 1 mi de PBS, con una centrifugación de 5 min a 5000 rpm en una microfuga Eppendorf 5417C. El sedimento se resuspendió en 50 µ? de PBS y un transcurso de tiempo de 0, 20, 40 y 60 min de incubación a 56°C en un termobloque Techne. Después, la muestra se precipitó con una centrifugación de 5 min a 5000 rpm y se retiraron 30 µ? de sobrenadante (S) y se colocaron en hielo para análisis. El sedimento (P) se secó después y se resuspendió en 50 µ?.

Todas las fracciones se sometieron a análisis en gel - los sobrenadantes liberados se analizaron en un gel y los sedimentos liberados se analizaron en otro gel. El gel de sobrenadantes se muestra en la Fig. 22, las cargas se ajustaron como se ha descrito para el gel de análisis inicial en la Fig. 21.

La cantidad de material en el sobrenadante liberado y las fracciones de sedimento de las partículas de PCL de HIP se determinaron para dAb 1 y dAb 2 usando captura de bandas y el paquete de cuantificación en Gel 1D del programa informático Labworks 4.6 (UVP). Se capturaron imágenes para análisis usando una estación de trabajo Vision equipada con una cámara Olympus bajo luz blanca.

Las lecturas de gel para intensidad de dAb se convirtieron en cantidades de dAb en ng, (Cuadro 10, columna 2), usando una representación gráfica de los patrones de dAb frente a la intensidad de bandas (no se muestran los datos).

Obsérvese que la cantidad de material liberado por este procedimiento variaba de 120-189 ng (no se muestran los datos) a partir de una fuente de sedimento de aproximadamente 882-1000 ng en las partículas - en las que el 12-19% del material se liberaba Análisis funcional de dAb liberado de partículas de PCL de HIP mediante ELISA.

El protocolo de ensayo de ELISA describe un ensayo de unión para medir la capacidad de anticuerpos de dominio soluble (VEGF dAb) para unirse a VEGF recombinante. El ensayo usa VEGF humana recombinante (R & D Systems) recubierta sobre la superficie de placas de ELISA (Nunc Immunosorb) para capturar dAb de VEGF. Las placas se lavaron para eliminar cualquier dAb no unido. El dAb unido se detectó posteriormente usando un anticuerpo contra el marcador myc del dAb de VEGF (9E10, Sigma). Se eliminó el exceso de anticuerpo por lavado y el anticuerpo anti-myc unido se detectó usando un conjugado de IgG anti-ratón con peroxidasa (Sigma). El ensayo se reveló usando solución de TMB y se detuvo usando ácido. La señal del ensayo es proporcional a la cantidad de dAb.

Se preparó una placa de ELISA para analizar las muestras enumeradas a continuación y también muestras de dAb 1 y dAb 2 "liberadas" después de 0 min. A partir de la muestra liberada retirada de 30 µ? - se usaron 21 µ? para análisis de SDS PAGE y se dejaron 9 µ? para hacer diluciones de 1 en 100, 1 en 1000 y 1 en 10000.

Se muestra una comparación de dAb liberado total calculado y dAb funcionalmente activo medido por ELISA en el Cuadro 11.

Cuantif icación de dAb funcionalmente activo y liberado Puede observarse que usando este procedimiento de liberación puede detectarse dAb funcionalmente activo a partir de material liberado de microesferas en un intervalo que concuerda con el 60-100% del encapsulado que conserva actividad medido por ELISA.

El dAb total frente al activo oscilará de acuerdo con el dAb liberado, la inactivación por calor o cualquier degradación de dAb, sin embargo, no se considera que la varianza sea significativamente diferente.

Lista de secuencias

Claims (17)

REIVINDICACIONES

1. Nanopartículas que comprenden una sustancia formadora de partículas y una proteína para el suministro de la proteína de la sangre al cerebro a través de la barrera hematoencefálica.

2. Nanopartículas de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la proteína es una molécula de unión a antígeno.

3. Nanopartículas de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la molécula de unión a antígeno comprende un dominio.

4. Nanopartículas de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la molécula de unión a antigeno es un anticuerpo.

5. Nanopartículas de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la molécula de unión a antígeno es un anticuerpo de dominio.

6. Nanopartículas de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en donde la proteína se une a un objeto que se encuentra en el sistema nervioso central.

7. Nanopartículas de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la proteína se une a NOGO, ß-amiloide o glucoproteína asociada a mielina.

8. Una composición que comprende las nanopartículas de cualquier reivindicación precedente, en donde al menos el 90% de las nanopartículas en número en la composición está dentro del intervalo de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 1000 nm en diámetro, como se mide por técnicas de dispersión de luz dinámica.

9. Una composición que comprende las nanopartículas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde al menos el 90% de las nanopartículas en número en la composición están dentro del intervalo de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 400 nm en diámetro, como se mide por técnicas de dispersión de luz dinámica.

10. Una composición que comprende las nanopartículas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde al menos el 90% de las nanopartículas en número en la composición están dentro del intervalo de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 150 nm en diámetro como se mide por técnicas de dispersión de luz dinámica.

11. Una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en donde el tamaño medio de partícula es de aproximadamente 40 nm a aproximadamente 100 nm.

12. Un procedimiento para suministrar una proteína a través de la barrera hematoencefálica encapsulando la proteína en una nanopartícula y administrando la proteína a un ser humano o un animal que lo necesite.

13. Nanopartículas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la proporción de proteína a polímero en la nanopartícula es al menos aproximadamente el 1% p/p, o es al menos aproximadamente el 2,5% p/p, o es al menos aproximadamente el 5% p/p, o es al menos aproximadamente el 9% p/p o es al menos aproximadamente el 14% p/p.

14. Una composición farmacéutica que comprende las nanopartículas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.

15. Uso de la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 14 para la profilaxis o el tratamiento de trastornos o enfermedades del sistema nervioso central.

16. Uso de la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 15 para la profilaxis o el tratamiento de trastornos o enfermedades neurológicas o neurodegenerativas.

17. Uso de la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 15 para la profilaxis o el tratamiento de lesión neuronal, apoplejía, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, encefalopatía espongiforme bovina, encefalitis del virus del Nilo occidental, SIDA del sistema nervioso, lesión cerebral, lesión de médula espinal, cáncer metastásico del cerebro o esclerosis múltiple.