MX2010009100A - Antagonistas de il-17ra-il-17rb y uso de los mismos. - Google Patents

Antagonistas de il-17ra-il-17rb y uso de los mismos.

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Alison L Budelsky
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Abstract

La presente invención se refiere al ligando de lnterleucina-17 y a los miembros de la familia del receptor y el descubrimiento de que el receptor IL-17 A y el receptor IL-17 C forman un complejo receptor heteromérico que es biológicamente activo. Se describen los antagonistas del complejo receptor heteromérico IL-I7RA-IL-I7RB, así como varios métodos de uso.

Description

ANTAGONISTAS DE IL-17RA-IL-17RB Y USO DE LOS MISMOS Referencia Cruzada con Solicitudes Relacionadas La presente solicitud reclama el beneficio de acuerdo con el título 35 §119 del Código de los Estados Unidos de América, sobre la Solicitud Provisional de Patente Norteamericana Serie Número 61/145,901, presentada en Enero 20, 2009 y la Solicitud Provisional de Patente Norteamericana Serie Número 61/066,538, presentada en Febrero 21, 2008, las cuales están incorporadas a la presente descripción como referencia.
Campo de la Invención La presente invención se refiere al ligando de lnterleucina-17 y a los miembros de la familia del receptor y el descubrimiento de que el receptor IL-17 A y el receptor IL-17 B forman un complejo heteromérico que es biológicamente activo. También se describen antagonistas del complejo receptor heteromérico I L- 17 RA- 1 L- 17 RB y métodos de uso.
Antecedentes de la Invención La familia de I nterleucina- 7 es un grupo de seis citocinas relacionadas estructuralmente, designadas del IL-17A hasta el IL-17F, que son importantes en la regulación de las respuestas inmunes. En el nivel de estructura primaria, las similitudes mayores parecen ser en la región de la terminal C, la cual contiene cuatro residuos de cisteína conservados (revisados en el artículo de Kawaguchi y asociados, J. Allergy Clin Immunol 114: página 1265, 2004; Kolls y Linden, Immunity 21: página 467, 2004). La estructura de cristal del IL-17F ha sido determinada, y se encontró que comparte características estructurales con los factores de crecimiento de la familia de nudo de cisteína (Hymowitz, y asociados, 2001, EMBO J. 20: páginas 5532 a 5341 ), un grupo de ligandos homodiméricos que se enlazan y señalan a través de ambas contra-estructuras homodiméricas y heteroméricas (Lu, y asociados, 2005, Nat. Rev. Neurosci. 6: páginas 603 a 614; Barker, 2004, Neuron 42: páginas 529 a 533).
Los receptores IL-17 (IL-17R) también forman una familia de proteínas de transmembrana de Tipo I relacionadas. Cinco miembros diferentes de esta familia han sido identificados (del IL-1RA al IL-1RE), y varios de ellos también muestran un empalme alternativo que incluye formas solubles que pueden actuar como receptores de señuelo (Kolls y Linden, mencionados anteriormente; Moseley y asociados, Cytokine Growth Factor Rev. 14: página 155, 2003). Aunque el receptor IL-17RA puede multimerizar, independiente del ligando, y ha mostrado que forma un receptor heteromérico biológicamente activo con el IL-17RC (Toy y asociados, J Immunol. 177: página 36; 2007), la posibilidad de formación de otros complejos heteroméricos IL-17R (ya sea en forma de transmembrana o soluble), y la actividad biológica resultante, si la hay, era anteriormente desconocida. Se proporcionan este y otros aspectos de las modalidades de la presente invención.
Breve Descripción de las Figuras La figura 1 es una gráfica que ilustra los efectos en la capacidad de hiper-respuesta de las vías aéreas de un antagonista de IL-17RA-IL-17RB. Los círculos abiertos ilustran los resultados obtenidos en los ratones (N = 4) que se les ha administrado MSA y uFc; los cuadrados abiertos ilustran los resultados obtenidos en los ratones (N = 3) que se les ha administrado IL-25 y MuFc; los triángulos cerrados ilustran los resultados obtenidos en los ratones (N = 3) que se les ha administrado IL-25 y M751.
La figura 2 representa un Western blot, preparado substancialmente tal y como se describió en el Ejemplo 11. Las columnas 1 y 4 contienen los marcadores de peso molecular. El Pánel A fue manchado con anti-IL-17RA, el Pánel B fue manchado con anti-HIS. La columna 2 presenta un control positivo IL-17RA:HIS, la columna 3 muestra los resultados de la precipitación del IL-17RA:HIS con el IL-17RB:Fc. La columna 5 presenta un control positivo de IL-17RD:HIS, la columna 6 indica que el IL-17RD:HIS no puede ser precipitado con el IL-17RB:Fc.
La figura 3 es una gráfica que ilustra la capacidad de hiper-respuesta de las vías aéreas (AHR) de los ratones en un modelo de asma OVA del Ejemplo 14, Experimento 1. Los ratones fueron desafiados con concentraciones crecientes de metacolina y se calculó el cambio PENH arriba de la línea de base ± SEM.
La figura 4 ilustra la resistencia pulmonar (RL) en los ratones en un modelo de asma OVA tal y como se describió en el Ejemplo 14. El área promedio principal de las vías aéreas (R) bajo la curva (AUC) se muestra para cada grupo de tratamiento ± SEM. La figura 4a presenta los resultados del Experimento 2, la 4b del Experimento 3.
La figura 5 presenta el análisis de la celularidad del fluido del lavado bronquioalveolar (BALF) como se describe en el Ejemplo 14, experimento 1. Los resultados mostrados son el BALF total (4a), leucocitos, (4b) eosinófilos, (4c) neutrófilos, (4d) linfocitos, y (4e) macrófagos. Cada uno de los círculos cerrados representan la celularidad BALF de un ratón. Las comparaciones de los análisis estadísticos se realizaron utilizando un método ANOVA de una vía no paramétrico con la Prueba de Comparación Múltiple de Dunn (*p<0.05).
La figura 6 es similar a la figura 5, pero presenta los resultados del Experimento 2 del Ejemplo 14. Los resultados mostrados son el BALF total (4a), leucocitos, (4b) eosinófilos, (4c) neutrófilos, (4d) linfocitos, y (4e) macrófagos. Las comparaciones de los análisis estadísticos se realizaron utilizando el ANOVA de una vía con la Prueba de Comparación Múltiple de Bonferroni (*p<0.05).
La figura 7 presenta los resultados del Experimento 3, Ejemplo 14. Los resultados mostrados son el BALF (4a), leucocitos, (4b) eosinófilos, (4c) neutrófilos, (4d) linfocitos, y (4e) macrófagos. Cada círculo cerrado representa la celularidad BALF de un ratón. Las comparaciones de los análisis estadísticos se realizaron utilizando un método ANOVA de una vía no paramétrico con la Prueba de Comparación Múltiple de Dunn (*p<0.05).
La figura 8 ilustra las concentraciones de BALF IL-13 de los ratones en un modelo de asma OVA. Las concentraciones de IL-13 fueron medidas mediante análisis de ELISA en las muestras BALF de los ratones individuales en 3 experimentos separados como se describieron en el Ejemplo 14: (a) Experimento 1, (b) Experimento 2, (c) Experimento 3. Cada círculo cerrado indica un valor de un ratón. Las líneas horizontales indican promedios de grupo. Las comparaciones entre los grupos fueron realizadas utilizando el ANOVA de una vía. *p<0.05.
La figura 9 presenta las concentraciones de BALF IL-5 de ratones en un modelo de asma OVA. Las concentraciones de IL-5 fueron medidas mediante análisis de ELISA en muestras de BALF de ratones individuales en 3 experimentos separados como se describieron en el Ejemplo 14: (a) Experimento 1, (b) Experimento 2, (c) Experimento 3. Cada círculo cerrado indica un valor de un ratón. Las líneas horizontales indican promedios de grupo. Las comparaciones entre los grupos fueron realizadas utilizando un ANOVA de una vía. *p<0.05.
La figura 10 ilustra las concentraciones de IgE en el suero determinado mediante el análisis de ELISA en ratones individuales en un modelo de asma OVA como se describieron en el Ejemplo 14, en (a) Experimento 1 (b) Experimento 2 (c) Experimento 3. La concentración de IgE en el suero de cada ratón es indicada con un círculo cerrado. Las líneas horizontales indican promedios del grupo. Las comparaciones entre los grupos se realizaron utilizando un ANOVA de una vía. *p<0.05.
La figura 11 presenta calificaciones de histología del pulmón de grupos de ratones de un modelo de asma OVA como se describieron en el Ejemplo 14, Experimento 3. *p<0.0001 utilizando una prueba-t no emparejada para comparaciones estadísticas.
Descripción Detallada de la Invención Los encabezados de las secciones aquí utilizados son para propósitos de organización solamente y no deberán ser interpretados como limitantes del asunto materia descrito.
Se pueden utilizar técnicas estándar para el ADN recombinante, la síntesis de oligonucleótidos, cultivo de tejidos y la transformación, purificación de proteínas, etc. Las reacciones enzimáticas y técnicas de purificación pueden ser realizadas de acuerdo con las especificaciones de los fabricantes y generalmente como se llevan a cabo en la técnica o como se describen en este documento. Los procedimientos y técnicas siguientes pueden ser generalmente realizados de acuerdo con métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describen en varias referencias generales y más específicas que son citadas y explicadas en toda esta descripción. Ver por ejemplo, el libro de Sambrook y asociados, 2001, "Clonación Molecular: Un Manual de Laboratorio" (Molecular Cloning: A Laboratory Manual), 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., la cual está incorporada a la presente descripción como referencia para cualquier propósito. A menos que se proporcionen definiciones específicas, la nomenclatura utilizada en relación con, y los procedimientos de laboratorio y técnicas de, química analítica, química orgánica, y química medicinal y farmacéutica aquí descritos son aquellos bien conocidos y generalmente utilizados en la técnica. Se pueden utilizar técnicas estándar para la síntesis química, el análisis químico, la preparación farmacéutica, formulación, y administración y tratamiento de los pacientes.
La caracterización, clonación y preparación del IL-17RA se describen por ejemplo, en la Patente Norteamericana No. USPN 6,072,033, emitida en Junio 6, 2000, la cual está incorporada a la presente descripción en su totalidad como referencia. La secuencia de aminoácidos del IL-17RA humano se muestra en la SEQ ID NO:10 de la Patente Norteamericana No. USPN 6,072,033 (número de acceso al GenBank NM_014339). El IL-17RA humano tiene un péptido de señal de la terminal N con un sitio de disociación pronosticado aproximadamente entre el aminoácido 27 y el 28. El péptido de señal es seguido por un dominio extracelular de 293 aminoácidos, un dominio transmembrana de 21 aminoácidos, y una cola citoplásmica de 525 aminoácidos. Las formas solubles del IL-17RA humano (hulL-17RA) que son útiles en los métodos de la presente invención incluyen el dominio extracelular (residuos del 1 al 320 o residuos del 28 al 320 los cuales excluyen el péptido de señal) o un fragmento del dominio extracelular que retiene la capacidad de enlace del IL-17A. Otras formas de IL-17RA que son útiles en la presente invención incluyen muteinas y variantes que tienen por lo menos una identidad entre el 70% y el 99% de aminoácidos con el IL-17RA natural que retiene la capacidad de enlace de IL-17A, como se describe con mayor detalle en la Patente Norteamericana No. USPN 6,072,033.
El receptor IL-17 B (IL-17RB) y sus muchas isoformas son conocidos en la técnica, como aquellos que se describen en la publicación de Tian y asociados, Oncogene 19: página 2098 (2000). Los ejemplos adicionales incluyen secuencias disponibles en las bases de datos públicas, tales como, pero sin limitarse a, GenBank acceso No. NM_018725. Además, como se describirá más adelante, el IL-17RB también puede incluir fragmentos activos biológicamente y/o variantes.
El IL-17RA se asocia con el IL-17RB para formar el complejo receptor heteromérico que es biológicamente activo (por ejemplo, al momento del enlace del ligando, el complejo receptor es activado y transduce una señal dentro de una célula al momento en el cual es expresada, dando como resultado una actividad biológica tal como la inducción de los mARNs, secreción de citocinas, cambio en la morfología o condición de activación de la célula, etc.). Cada miembro del complejo receptor heteromérico es al que nos referimos como un "componente" o "subunidad" del mismo. Como se usa en la presente descripción, "complejo receptor heteromérico IL-17RA-IL-17RB" (o "complejo receptor heteromérico") se refiere a un complejo que comprende por lo menos IL-17RA e IL-17RB; subunidades o componentes adicionales también pueden formar parte del complejo receptor heteromérico.
Por lo tanto, ciertos aspectos de la presente invención son dirigidos a los agentes (por ejemplo, proteínas de enlace del antígeno, como se describen más adelante) y métodos para el bloqueo de la asociación de IL-17RA con IL-17RB (y/o con subunidades receptoras adicionales) y por lo tanto se previene la formación del complejo receptor funcional (un complejo receptor que tiene la capacidad de ser activado). Otros aspectos de la presente invención se dirigen a un antagonista que se enlaza al complejo receptor heteromérico IL-17RA-IL-17RB, o una subunidad o componente del mismo, e inhibe el enlace del ligando (por ejemplo, IL-25) y la activación posterior del complejo receptor. Los aspectos adicionales de la presente invención todavía se dirigen a los antagonistas que enlazan el complejo receptor heteromérico IL-17RA-IL-17RB o una subunidad del mismo, y previenen que ocurra la activación. La prevención de que sea formado un complejo receptor funcional y/o activado reduciría o prevendría la transducción de señal y reduciría los efectos pro-inflamatorios descendentes de la activación del IL-17RA/IL-17RB. Dichos métodos y antagonistas serían útiles en el tratamiento de varias enfermedades de inflamación y autoinmunes que son influenciadas por la trayectoria IL-17/IL-17R. Las modalidades de la presente invención son útiles para los ensayos in vitro para seleccionar antagonistas y agonistas del complejo receptor heteromérico IL-17RA-IL-17RB y/o identificar las células que expresan el complejo receptor heteromérico IL-17RA-IL-17RB.
Además, el conocimiento de que ambos el IL-17RA y el IL-17RB son requeridos para formar un complejo receptor IL-25 funcional conduce a agentes adicionales (tales como proteínas de enlace del antígeno) que son útiles para inhibir o antagonizar una actividad biológica del IL-25. Por ejemplo, la proteína de enlace del antígeno que se enlaza a una o más subunidades del complejo receptor (por ejemplo, un anticuerpo que se enlaza al IL-17RA, o un anticuerpo que se enlaza al IL-17RB) e inhibe el enlace o activación del complejo receptor por el IL-25 será un antagonista útil del IL-25.
En algunas modalidades, los antagonistas de la presente invención son "aislados" o "substancialmente puros" o moléculas ("substancialmente homogéneas"). El término "molécula aislada" (en donde la molécula es, por ejemplo, un polipéptido, un péptido, o un anticuerpo) es una molécula que en virtud de su origen o fuente de derivación (1) no está asociada con los componentes asociados naturalmente que la acompañan en su condición natural, (2) está substancialmente libre de otras moléculas de la misma especie (3) es expresada por una célula de una especie diferente, o (4) no ocurre en la naturaleza. Por lo tanto, una molécula que es sintetizada químicamente o sintetizada en un sistema celular diferente de la célula de la cual se origina naturalmente, será "aislada" de sus componentes asociados naturalmente.
Una molécula también se puede hacer substancialmente libre de los componentes asociados naturalmente mediante el aislamiento, utilizando técnicas de purificación bien conocidas en el arte (por ejemplo, una proteína "purificada"). La pureza u homogeneidad de la molécula pueden ser probadas por un número de medios bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la pureza de la muestra del polipéptido puede ser ensayada utilizando electroforesis de gel de poliacrilamida y tinción de gel para visualizar el polipéptido utilizando técnicas bien conocidas en el arte. Para ciertos propósitos, se puede proporcionar una resolución más alta utilizado HPLC u otros medios bien conocidos en la técnica para la purificación.
Un antagonista "aislado" (por ejemplo, una proteína, un polipéptido, o un anticuerpo) está acompañado por lo menos de algo del material con el cual está asociado normalmente en su condición natural, constituyendo en una modalidad por lo menos aproximadamente el 5%, en otra modalidad por lo menos aproximadamente el 50%, en peso, de la proteína total en una muestra determinada. Una proteína "substancialmente pura" comprende por lo menos el 75% en peso de la proteína total, siendo específica por lo menos aproximadamente el 80%, y siendo particularmente específica por lo menos aproximadamente el 90%. La definición incluye la producción de una proteína de un organismo en un organismo o célula huésped diferente. Alternativamente, la proteína se puede hacer en una concentración significativamente más alta que la que se ve normalmente, a través del uso de un promotor que se puede inducir o un promotor de alta expresión, de modo que la proteína se hace en niveles de concentración aumentados.
Pero estos son algunos pocos de los muchos aspectos de las diferentes modalidades de la presente invención que aquí se describe. 1. Antagonistas de IL-17RA-IL-17RB El IL-17RA se asocia con el IL-17RB para formar el complejo receptor heteromérico que es biológicamente activo (es decir, cuando es activado por el enlace del ligando, una señal es transducida a una célula que da como resultado un cambio en la actividad biológica de la célula, por ejemplo, la inducción de mARNs, la secreción de citocinas, cambio en la morfología o condiciones de activación de la célula, etc.). Un complejo receptor heteromérico IL-17RA-IL-17RB es definido como una asociación (tal como, pero sin limitarse a, interacciones de proteína a proteína) de por lo menos las proteínas IL-17RA e IL-17RB mostradas como un complejo receptor heteromérico en la membrana extracelular de las células. El complejo receptor heteromérico, como un mínimo, es requerido para la señalización del IL-25, por ejemplo, la activación de IL-17RA y/o IL-17RB. Deberá quedar entendido que el complejo receptor heteromérico IL-17RA-IL-17RB puede comprender además proteínas adicionales (por ejemplo, proteínas "accesorias"). Por ejemplo, una molécula de señalización conocida como Act-1 es parte de la cascada de señalización de IL-17A, y la evidencia reciente indica que está comprendido en la señalización del IL-25 también (Claudio y asociados, J. Immunol. 182: página 1617, 2009; Swaidani y asociados, J. Immunol. 182: página 1631, 2009). La activación del complejo receptor heteromérico IL- 7RA-IL- 7RB es efectuada a través del enlace de miembros de la familia del ligando IL-17 tales como, pero sin limitarse a, IL-25 (IL-17E). La activación del complejo receptor heteromérico IL-17RA-IL- 17RB incluye, pero no está limitado a, al inicio de la cascada de señalización intracelular y los eventos descendentes tales como la transcripción y traducción del gen.
Las modalidades están dirigidas a antagonistas, incluyendo proteínas de enlace del antígeno, que inhiben la asociación de subunidades (por ejemplo, IL-17RA e IL-17RB y/o proteínas accesorias) para formar un complejo receptor heteromérico IL-17RA-IL-17RB, así como a antagonistas (por ejemplo, proteínas de enlace del antígeno) que inhiben el enlace del ligando (por ejemplo, el IL-25) a un complejo receptor heteromérico IL-17RA-IL-17RB o subunidad del mismo. Las modalidades adicionales están dirigidas a los antagonistas (incluyendo proteínas de enlace del antígeno) que se enlazan a una o más subunidades del complejo receptor heteromérico IL-17RA-IL-17RB y tienen como resultado un cambio en la conformación que evita la asociación de las subunidades del complejo, el enlace del ligando al mismo, o la activación del mismo.
El término "pro teína de enlace del antígeno" como se usa en la presente descripción es una proteína que se enlaza específicamente a una proteína objetivo identificada (por ejemplo, una subunidad de un complejo receptor heteromérico 17RA-IL-17RB, o un complejo receptor heteromérico mismo). El término "se enlaza específicamente" significa que la proteína de enlace del antígeno tiene una afinidad más alta para la proteína objetivo identificada que para otra proteína. Generalmente, "se enlaza específicamente" significa que la constante de disociación de equilibrio es < 10"7 a 1011 M, o <10"8 a <10"10 M, o <10-9 a <10"10 M.
Las proteínas de enlace del antígeno incluyen un anticuerpo, o un fragmento del mismo, que se enlaza específicamente a una proteína objetivo identificada, como se define en la presente descripción de manera variada, así como un péptido o polipéptido que se enlaza específicamente a la proteína objetivo identificada. Las proteínas de enlace del antígeno que inhiben la formación del complejo receptor heteromérico IL-17RA-IL-17RB o que inhibe el enlace del ligando a la misma o la señalización, por lo tanto, nos referimos a ellas en la presente descripción como antagonistas de IL-17RA-IL-17RB. Las modalidades de los antagonistas de IL-17RA-IL-17RB pueden por lo tanto enlazarse a cualquier parte del complejo receptor heteromérico IL-17RA-IL-17RB (por ejemplo, al complejo mismo o a una subunidad del mismo) e inhibir la activación del receptor. Dos subgéneros de los géneros de los antagonistas IL-17RA-IL- 7RB comprenden anticuerpos, como se definen de manera variada en la presente descripción, así como péptidos y polipéptidos.
Activar o la activación de un receptor como aquí se define como el enganche de una o más trayectorias de señalización intracelular y la transducción de la señalización intracelular (por ejemplo, transducción de señal) en respuesta a una molécula que se enlaza a un receptor enlazado a la membrana, tal como, pero sin limitarse a, una interacción de ligando:receptor. La transducción de señal, como se usa en la presente descripción, depende de una señal mediante la conversión de una forma física o química a otra; por ejemplo, en biología celular, el proceso por medio del cual una célula convierte una señal extracelular en una respuesta (tal como la secreción de citocina, proliferación o cambio de la condición de activación de la célula).
La "inhibición" puede ser medida como una disminución en una actividad del complejo receptor heteromérico IL-17RA-IL- 7RB, por ejemplo, una disminución en la formación del complejo receptor heteromérico, una disminución en el enlace del ligando (por ejemplo, IL-17A IL-17F y/o IL-25) a un complejo receptor heteromérico (o por lo menos una subunidad del mismo), o una disminución en la actividad biológica en respuesta al ligando tal como IL-17A, IL-17F y/o IL-25 (por ejemplo, el estímulo de la secreción de citocinas, cambios en los números o activación de las condiciones de las células, u otros efectos biológicos) por al menos el 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, o 100%. En una modalidad, los antagonistas de la presente invención disminuyen una actividad del complejo receptor heteromérico IL-17RA-IL-17RB por al menos el 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o 100%; en otra modalidad, los antagonistas de la presente invención inhiben una actividad en por lo menos el 35%, 45%, 55%, 65%, 75%, 85%, 95% o más.
La inhibición de la formación de un complejo receptor heteromérico puede ser medida por cualesquiera medios conocidos en la técnica tales como, pero sin limitarse a, los métodos de co-inmunoprecipitación aquí descritos. Otros ejemplos incluyen, el análisis de Transferencia del Patrocinador de Energía de Resonancia (FRET) y otros métodos que son conocidos en la técnica y que pueden ser utilizados para analizar de manera cuantitativa o cualitativa la interacción del ligando/receptor. La inhibición del enlace del ligando también puede ser medida por cualesquiera métodos conocidos en la técnica tales como FACS, EIA, RIA, los ensayos anteriormente mencionados, y métodos que son conocidos en la técnica para evaluar la interacción de dos o más moléculas, incluyendo aquellas que aquí se describen y en la Patente Norteamericana Serie No. 11/906,094.
Además, la "inhibición" puede ser medida como una pérdida de la activación de IL-25 en un complejo receptor heteromérico IL-17RA-IL-17RB como es medida por las lecturas relevantes biológicamente, tales como pero sin limitarse a, la transcripción activada del gen (por ejemplo, niveles aumentados de IL-5, IL-13, eotaxina, MCP-1, y/o mARNs de IL-17RB) y/o la traducción del gen, y/o la liberación de varios factores asociados con la activación del complejo receptor heteromérico IL-17RA-IL-17RB, el cual incluye IL-5 y/o IL-13, así como cualquier otro portador pro-inflamatorio conocido en la técnica para ser liberado de cualesquiera células que expresan IL-17RA y/o IL-17RB. Las lecturas adicionales relevantes biológicamente incluyen cambios en los números y/o apariencias de las células en una muestra biológica (tales como la celularidad aumentada en las muestras del lavado bronquioalveolar, la hiperplasia de células goblet y/o la inflamación vascular/perivascular en las muestras de tejido del pulmón).
Otras modalidades del antagonista de IL-17RA-IL-17RB se dirigen a los antagonistas de IL-17RA-IL-17RB que se enlazan al IL-17RA. En una modalidad, los antagonistas inhiben parcialmente o inhiben completamente la asociación de las subunidades del complejo receptor heteromérico IL-17RA-IL-17RB y por lo tanto previenen la formación del complejo receptor heteromérico. En algunas modalidades, el antagonista de IL-17RA-IL-17RB no necesita bloquear el enlace del complejo receptor heteromérico IL-25 para el IL-17RA-IL-17RB. En modalidades alternativas, el antagonista de IL-17RA-IL-17RB puede bloquear el enlace del IL-25 al complejo receptor heteromérico IL-17RA-IL-17RB (o a una subunidad del mismo).
En modalidades adicionales de un antagonista de IL-17RA-IL-17RB están dirigidas a los antagonistas de IL-17RA-IL-17RB que se enlazan al IL-17RB. En una modalidad, los antagonistas inhiben parcialmente o inhiben completamente la asociación de las subunidades del complejo receptor heteromérico IL-17RA-IL-17RB y por lo tanto previenen la formación del complejo receptor heteromérico. En algunas modalidades, los antagonistas de IL-17RA-IL-17RB no necesitan bloquear el enlace del IL-25 al complejo receptor heteromérico IL-17RA-IL-17RB. En modalidades alternativas, el antagonista de IL-17RA-IL-17RB puede bloquear el enlace del IL-25 al complejo receptor heteromérico IL-17RA-IL-17RB (o a una subunidad del mismo).
Las modalidades adicionales del antagonista de IL-17RA-IL-17RB están dirigidas a los antagonistas de IL-17RA-IL-17RB que se enlazan a ambos el IL-17RA y el IL-17RB, incluyendo aquellos que se enlazan a un complejo receptor heteromérico. En una modalidad, los antagonistas inhiben parcialmente o inhiben completamente la asociación de subunidades del complejo receptor heteromérico IL-17RA-IL- 17RB y por lo tanto previenen la formación del complejo receptor heteromérico. En algunas modalidades, los antagonistas de IL-17RA-IL-17RB no necesitan bloquear el enlace del IL-25 al complejo receptor heteromérico IL-17RA-IL-17RB. En modalidades alternativas, los antagonistas de IL-17RA-IL-17RB pueden bloquear el enlace del IL-25 al complejo receptor heteromérico IL-17RA-I L- 7RB (o a subunidades del mismo).
Las diferentes modalidades de los antagonistas de IL- 17RA-IL-17RB descritos anteriormente, incluyen antagonistas de IL-17RA-IL-17RB que se enlazan a IL-17RA, o IL-17RB, o al complejo receptor heteromérico, e inhiben estéricamente u obstaculizan la asociación de las subunidades del complejo receptor heteromérico, previniendo de esta manera la formación del complejo receptor heteromérico IL-17RA-IL-17RB. En un ejemplo del obstáculo estérico de la asociación de subunidades del complejo receptor heteromérico, en enlace de un antagonista de una subunidad ocurre en un sitio que es requerido para la asociación de esa subunidad como otras subunidades del complejo receptor, y lo suficientemente cerca del sitio para que la adaptación espacial del antagonista prevenga la asociación de las subunidades del complejo receptor heteromérico. Alternativamente, las diferentes modalidades de los antagonistas de I L-17RA-IL-17RB descritos anteriormente incluyen los antagonistas de IL- 7RA-IL-17RB que se enlazan al IL-17RA, o IL-17RB, o el complejo receptor heteromérico e inducen (o previenen) una alteración de conformación en una o más de las subunidades del complejo receptor heteromérico, inhibiendo de este modo la formación de un complejo receptor heteromérico I L-17RA-I L-17RB. En un ejemplo del cambio de conformación que evita la asociación de las subunidades del complejo receptor heteromérico, el enlace de un antagonista a una subunidad ocurre en un sitio que puede estar distante de un sitio que es requerido para la asociación de esa subunidad como otras subunidades del complejo receptor, y ocasiona un cambio en la conformación de la subunidad que previene la asociación de las mismas con otras subunidades, o previene un cambio de conformación que es necesario para la asociación de las subunidades. De un modo similar, las diferentes modalidades de los antagonistas de IL-17RA-IL-17RB descritas anteriormente incluyen antagonistas de IL-17RA-IL-17RB que se enlazan al IL-17RA, o al complejo receptor heteromérico IL-17RB, e inducen (o previenen) una alteración en la conformación que inhibe la transducción de señal, aunque obstaculiza esféricamente la transducción de señal por el complejo receptor heteromérico.
En otra modalidad alternativa, los diferentes antagonistas de IL-17RA-IL-17RB descritos anteriormente incluyen los antagonistas de IL-17RA-IL-17RB que se enlazan al IL-17RA, o IL-17RB, o el complejo receptor heteromérico, e inducen una alteración en la conformación en el complejo receptor heteromérico (o una subunidad del mismo) e inhibe de este modo el enlace de IL-25 (u otro ligando) al complejo receptor heteromérico I L- 17RA-I L- 17RB . Las modalidades incluyen además antagonistas del I L-17RA-I L-17RB que se enlazan al IL-17RA, o IL-17RB, o ambos el IL-17RA y el IL-17RB y obstaculiza o inhibe estéricamente el enlace del ligando (tal como IL- 25) al complejo receptor heteromérico IL-17RA-IL-17RB. También están incluidos en las presentes modalidades los antagonistas que se enlazan al IL-17RA, o IL-17RB, o ambos el IL-17RA y el IL-17RB e inhiben (parcialmente o completamente) una trayectoria de señalización del complejo receptor, inhibiendo de esta manera la señalización por medio del complejo receptor heteromérico IL-17RA-IL-17RB.
En una modalidad alternativa adicional, un antagonista del IL-17RA-IL-17RB se enlaza a un ligando (por ejemplo, IL-17A, IL-25, etc.), e inhibe la señalización por medio del complejo receptor heteromérico IL-17RA-IL-17RB. Dichos antagonistas pueden actuar inhibiendo el enlace a una subunidad de un complejo receptor heteromérico IL-17RA-IL-17RB, o a más de dichas subunidades. Por lo tanto, por ejemplo, un antagonista puede permitir que un ligando se enlace a una primera subunidad receptora, pero previene la interacción de una segunda subunidad receptora para cualquiera del ligando o la primera subunidad receptora. Dicha inhibición puede ocurrir como se describió anteriormente, por ejemplo, mediante la obstacularización estérica del enlace, la inducción de una alteración de la conformación, etc., de un modo tal como para inhibir (parcial o completamente) la señalización por medio del complejo receptor heteromérico I L- 17RA-I L- 7 RB . 1.1 Antagonista de IL-17RA-IL-17RB: Anticuerpos Las modalidades de los antagonistas de IL-17RA-IL-17RB comprenden anticuerpos, o fracciones de los mismos, como se definen variadamente en la presente descripción. Por consiguiente, los antagonistas de IL-17RA-IL-17RB incluyen anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos bi-específicos, diacuerpos, minicuerpos, anticuerpos de dominio, anticuerpos sintéticos (a los que nos referimos algunas veces en la presente descripción como "imitaciones de anticuerpos"), anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos completamente humanos, fusiones de anticuerpos (a los que nos referimos algunas veces como "conjugados de anticuerpos"), así como fragmentos de los mismos.
Los anticuerpos antagonistas de IL-17RA-IL-17RB también pueden comprender anticuerpos de un solo dominio que comprenden dímeros de dos cadenas pesadas y no incluyen cadenas ligaras, tales como aquellos encontrados en los camellos y llamas (ver, por ejemplo, las publicaciones de Muldermans, y asociados, 2001, J. Biotechnol. 74: páginas 277 a 302; Desmyter, y asociados, 2001, J. Biol. Chem. 276: páginas 26285 a 26290).
Los anticuerpos antagonistas de IL-17RA-IL-17RB pueden comprender un tetrámero, o fragmentos del mismo. Cada tetrámero está compuesto generalmente de dos pares idénticos de cadenas de polipéptidos, teniendo cada par una cadena "ligera" (que generalmente tiene un peso molecular de aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" (que generalmente tiene un peso molecular de aproximadamente 50 a 70 kDa). La porción de la terminal amino de cada cadena incluye una región variable que es principalmente responsable del reconocimiento del antígeno. La porción de la terminal carboxi de cada cadena define una región constante principalmente responsable de la función efectuadora. Las cadenas ligeras humanas son clasificadas como cadenas ligeras kappa y lambda. Las cadenas pesadas son clasificadas como mu, delta, gama, alfa, o epsilon, y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA, e IgE, respectivamente. El isotipo IgG tiene varias subclases, incluyendo, pero sin limitarse a, IgGI, lgG2, lgG3, e lgG4. El isotipo IgM tiene subclases, que incluyen, pero no están limitadas a, IgMI e lgM2. Los anticuerpos del antagonista de I L-17RA-I L-17RB incluyen todos dichos isotipos. Para propósitos de ejemplo, los fragmentos del anticuerpo incluyen pero no están limitados a F(ab), F(ab'), F(ab')2, Fv, y fragmentos Fv de cadena simple (scfv), así como anticuerpos de una sola cadena. Los anticuerpos del antagonista de IL-17RA-IL- 17RB pueden comprender cualquiera de los ejemplos anteriores.
La estructura de los anticuerpos es bien conocida en la técnica y no necesita ser reproducida aquí, pero a modo de ejemplo, las regiones variables de las cadenas pesada y ligera generalmente exhiben la misma estructura general de las regiones de la estructura relativamente conservada (FR) unida por tres regiones hipervariables, también denominadas regiones de determinación de complementariedad o CDRs. Las CDRs son las regiones hipervariables de un anticuerpo (o proteína de enlace del antígeno, como se subraya en esta descripción), que son responsables del reconocimiento y enlace del antígeno. Las CDRs de dos cadenas de cada par son alineadas por las regiones de la estructura, haciendo posible el enlace a un epítope específico. De la terminal N a la terminal C, ambas las cadenas ligera y pesada comprende los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. En algunas modalidades, la asignación de aminoácidos para cada dominio puede ser de acuerdo con las definiciones de las Secuencias de Kabat de las Proteínas de Interés Inmunológico", (Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest). Consultar las publicaciones de Chothia, y asociados, 1987, J. Mol. Biol. 196: páginas 901 a 917; Chothia, y asociados, 1989, Nature 342: páginas 878 a 883.
Una "región de determinación de complementariedad" o "CDR", como se usa en la presente descripción, se refiere a una región de proteína de enlace que constituye los puntos de contacto de superficie mayores para el enlace del antígeno. Una proteína de enlace de la presente invención puede tener seis CDRs, por ejemplo, un CDR1 de cadena pesada ("CDRH1"), un CDR2 de cadena pesada ("CDRH2"), un CDR3 de cadena pesada ("CDRH3"), un CDR1 de cadena ligera ("CDRL1"), un CDR2 de cadena ligera ("CDRL2"), un CDR3 de cadena ligera ("CDRL3"). Generalmente el CDRH1 comprende de aproximadamente cinco (5) hasta aproximadamente siete (7) aminoácidos, el CDRH2 generalmente comprende de aproximadamente dieciséis (16) hasta aproximadamente diecinueve (19) aminoácidos, y el CDRH3 generalmente comprende de aproximadamente tres (3) hasta aproximadamente veinticinco (25) aminoácidos. El CDRL1 generalmente comprende de aproximadamente diez (10) hasta aproximadamente diecisiete (17) aminoácidos, el CDRL2 generalmente comprende aproximadamente siete (7) aminoácidos, y el CDRL3 generalmente comprende de aproximadamente siete (7) hasta aproximadamente diez (10) aminoácidos.
Como un mínimo, un anticuerpo antagonista de IL-17RA-IL-17RB comprende toda o parte de una región variable de cadena ligera o pesada, o toda o parte de ambas regiones variables de cadena pesada y ligera que se enlazan específicamente a IL-17RA, o IL-17RB, o ambos el IL-17RA y el IL-17RB. Los ejemplos de los fragmentos (por ejemplo, "parte") de las regiones variables comprenden los CDRs. Manifestado de una manera diferente, como un mínimo, un anticuerpo antagonista de IL-17RA-IL-17RB comprende por lo menos un CDR de región variable, en donde el CDR se enlaza específicamente al IL-17RA, o IL-17RB, o ambos el IL-17RA y el IL-17RB. En modalidades alternativas, un antagonista de IL- 17RA-IL-17RB comprende por lo menos dos, o por lo menos tres, o por lo menos cuatro, o por lo menos cinco, o por lo menos todos los seis CDRs de una/la región variable, en donde por lo menos uno de los CDRs se enlaza específicamente al IL-17RA, o al IL-17RB, o ambos el IL-17RA y el IL-17RB. El CDR puede ser de una cadena pesada o ligera, y puede ser uno de cualquiera de los tres CDRs dentro de cada cadena, es decir, los CDRs son cada uno seleccionados independientemente de CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 y CDRL3.
Las modalidades de los anticuerpos antagonistas de IL- 17RA-IL-17RB pueden comprender una estructura de plataforma dentro de la cual son injertados los CDR(s) útiles. Algunas modalidades incluyen componentes de la plataforma humana para anticuerpos humanizados. En una modalidad, la estructura de plataforma es una estructura de anticuerpos tetramérica tradicional. Por lo tanto, las modalidades de los anticuerpos antagonistas de IL-17RA-IL-17RB pueden incluir los componentes adicionales tales como estructura, regiones J y D, regiones constantes, etc., que forman una cadena ligera o pesada. Las modalidades de los anticuerpos antagonistas de IL-17RA-IL-17RB pueden comprender anticuerpos que tienen un dominio Fe modificado, a los que nos referimos como una variante Fe. Una "variante Fe" se refiere a una molécula o secuencia que es modificada de un Fe natural pero que todavía comprende un sitio de enlace para el receptor de salvación, FcRn. Otros ejemplos de una "variante Fe" incluye una molécula o secuencia que es humanizada de un Fe natural no humano. Además, un Fe natural comprende sitios que pueden ser removidos debido a que proporciona características estructurales o actividad biológica que no son requeridas para las moléculas de fusión de la presente invención. Por lo tanto, el término "variante Fe" comprende una molécula o secuencia que carece de uno o más sitios Fe naturales o residuos que afectan o están comprendidos en (1) formación del enlace de disulfuro, (2) incompatibilidad con la célula huésped seleccionada, (3) Heterogeneidad de la terminal N al momento de la expresión en una célula huésped seleccionada, (4) glucosilación, (5) interacción con un complemento, (6) enlace a un receptor de Fe que no es el receptor de salvación, o (7) citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC).
Las modalidades de los anticuerpos antagonistas de IL-17RA-IL-17RB comprenden anticuerpos monoclonales humanos. Los anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra el IL-17RA, o el IL-17RB, o ambos IL-17RA e IL- 17RB humanos pueden hacerse utilizando cualesquiera métodos conocidos en la técnica, tales como pero sin limitarse a la tecnología de XenoMouse™ (ver, por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Nos. 6,114,598; 6,162,963; 6,833,268; 7,049,426; 7,064,244; la publicación de Green y asociados, 1994, Nature Genetics 7: páginas 13 a 21; Méndez y asociados, 1997, Nature Genetics 15: páginas 146 a 156; Green y Jakobovitis, 1998, J. Ex. Med. 188: páginas 483 a 495). Otros ejemplos para formar anticuerpos completamente humanos incluyen el UltiMab Human Antibody Development System™ y Trans-Phage Technology™ (Medarex Corp., Princeton, NJ), la tecnología de despliegue de fago, tecnología de despliegue del ribosoma (ver por ejemplo, la Tecnología del Anticuerpo de Cambridge, RU), así como cualquier otro método conocido en la técnica.
Ciertas modalidades de los anticuerpos antagonistas de IL-17RA-IL-17RB comprenden anticuerpos quiméricos y humanizados, o fragmentos de los mismos. En general, ambos anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados se refieren a anticuerpos que se comprenden regiones de más de una especie. Por ejemplo, los anticuerpos quiméricos tradicionalmente comprenden regiones variables de una especie no humana y las regiones constantes de una especie humana. Los anticuerpos humanizados generalmente se refieren a no humanos que han tenido regiones de estructura de dominio variable intercambiadas para las secuencias encontradas en los anticuerpos humanos. Generalmente, en un anticuerpo humanizado, el anticuerpo completo, excepto los CDRs, son codificados por un polinucleótido de origen humano y son idénticos a dichos anticuerpos, excepto dentro de sus CDRs. Los CDRs, algunos o todos de los cuales son codificados por ácidos nucleicos que se originan en un organismo no humano, son injertados en la estructura de la hoja beta de una región variable del anticuerpo humano para crear un anticuerpo, cuya especificidad es determinada por los CDRs injertados. La creación de dichos anticuerpos es bien conocido en la técnica, (ver, por ejemplo, la publicación de Jones, 1986, Nature 321 páginas 522 a 525; y la de Verhoeyen, 1988, Ciencia 239: páginas 1534 a 1536). Los anticuerpos humanizados también pueden ser generados utilizando ratones con sistemas inmunes diseñados genéticamente o por cualquier otro método o tecnología conocida en la técnica (ver por ejemplo, la publicación de Roque y asociados, 2004, Biotechnol. Prog. 20 páginas 639 a 654). En algunas modalidades, los CDRs son humanos, y por lo tanto los anticuerpos humanizados y quiméricos en este contexto pueden incluir algunos CDRs no humanos; por ejemplo, los anticuerpos humanizados pueden ser generados del modo que componen las regiones CDRH3 y CDRL3 con una o más de otras regiones CDR que son de un origen especial diferente.
En una modalidad, los anticuerpos antagonistas de IL-17RA-IL-17RB comprenden un anticuerpo multi-específico. Estos son anticuerpos que se enlazan a dos antígenos diferentes (o más). Un ejemplo de un anticuerpo bi-específ ico conocido en la técnica son los "diacuerpos". Los diacuerpos pueden ser manufacturados de una variedad de modos conocidos en la técnica, por ejemplo, preparado químicamente o de hibridomas híbridos (Holliger y Winter, 1993, Current Opinión Biotechnol. 4: páginas 446 a 449). Una modalidad específica de un anticuerpo antagonista de IL-17RA-IL-17RB multi-específico es un anticuerpo que tiene la capacidad de enlazarse a ambos el IL-17RA y el IL-17RB.
En modalidades alternativas, los anticuerpos antagonistas de IL-17RA-IL-17RB comprenden un minicuerpo. Los minicuerpos son anticuerpos minimizados similares a proteínas que comprenden un Fv de una sola cadena (scFv; descrito anteriormente) unido a un dominio CH3 (ver por ejemplo, Hu, y asociados, 1996, Cáncer Res. 56: páginas 3055 a 3061).
En modalidades alternativas, los anticuerpos antagonistas de I L-17RA-I L-17RB comprenden un anticuerpo de dominio; por ejemplo, aquellos que se describen en la Patente Norteamericana No. 6,248,516. Los anticuerpos de dominio (dAbs) son dominios de enlace de anticuerpos, correspondientes a regiones variables de cualquiera de las cadenas pesada (VH) o ligera (VL) de los anticuerpos humanos. Los dAbs tienen un peso molecular de aproximadamente 13 kDa, o menor que diez décimas en tamaño de un anticuerpo completo. Los dAbs son bien expresados en una variedad de huéspedes incluyendo, sistemas de células bacteriales, de levadura, y de mamífero. Además, los dAbs son altamente estables y retienen la actividad aún después de ser sometidos a condiciones severas, tales como secado por congelación y desnaturalización por calor. Ver por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Nos. 6,291,158; 6,582,915; 6,593,081; 6,172,197; la Patente Norteamericana Serie No. 2004/0110941; la Patente Europea 0368684; la Patente Norteamericana No. 6,696,245, los documentos WO04/058821, WO04/003019 y WO03/002609.
Como se mencionó anteriormente, los anticuerpos antagonistas de I L-17RA-I L-17RB pueden comprender un fragmento de anticuerpo, por ejemplo, un fragmento de cualquiera de los anticuerpos aquí mencionados que retienen la especificidad de enlace al IL-17RA, o IL-17RB, o ambos el IL-17RA y el IL-17RB. Los fragmentos de anticuerpos específicos incluyen, pero no están limitados a, (i) el fragmento Fab consistente de los dominios VL, VH, CL y CH1, (ii) el fragmento Fd consistente de los dominios VH y CH1, (iii) el fragmento Fv consistente de los dominios VL y VH de un solo anticuerpo; (iv) el fragmento dAb (ver por ejemplo, Ward, y asociados, 1989, Nature 341: páginas 544 a 546) los cuales consisten de una sola variable, (v) las regiones CDR aisladas, (vi) los fragmentos F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados, (v¡¡) las moléculas Fv de una sola cadena (scFv), en donde el dominio VH y el dominio VL están enlazados por un enlazador péptido que permite que los dos dominios se asocien para formar un sitio de enlace del antígeno (ver, por ejemplo, Bird, y asociados, 1988 Science 242: páginas 423 a 426; Huston, y asociados, 1988, Proc. Nati. Acad. Sci. 85: páginas 5879 a 5883), (viii) dímeros Fv de una sola cadena bi-específicos, y (ix) "diacuerpos" o "triacuerpos", fragmentos multivalentes o multi-específicos construidos por la fusión genética (ver, por ejemplo, Tomlinson, y asociados, 2000, Methods Enzymol. 326: páginas 461 a 479; el documento W094/13804; Holliger, y asociados, 1993, Proc. Nati. Acad. Sci. 90: páginas 6444 a 6448). Los fragmentos de anticuerpo pueden ser modificados. Por ejemplo, las moléculas pueden ser estabilizadas mediante la incorporación de los puentes disulfuro que enlazan los dominios VH y VL (ver, por ejemplo, Reiter, y asociados, 1996, Nature Biotech. 14: páginas 1239 a 1245). Nuevamente, como aquí se subraya, los componentes que no son CDR de estos fragmentos preferentemente son secuencias humanas.
En modalidades adicionales, los anticuerpos antagonistas de IL-17RA-IL-17RB comprenden una proteína de fusión del anticuerpo (a la que algunas veces nos referimos en la presente descripción como un "conjugado de anticuerpo"). El asociado conjugado puede ser proteináceo o no proteináceo; siendo generado este último generalmente utilizando grupos funcionales en la proteína de enlace del antígeno (ver la explicación sobre modificaciones covalentes de las proteínas de enlace del antígeno) y en el asociado conjugado. Por ejemplo, en la técnica son conocidos los enlazadores; por ejemplo, los enlazadores homo- o hetero-bifuncionales como son bien conocidos (ver, por ejemplo, el catálogo de 1994 de Pierce Chemical Company, sección técnica sobre reticuladores, páginas 155 a 200, incorporado a la presente descripción como referencia). Los conjugados adecuados incluyen pero no están limitados a, etiquetas como se describen a continuación, fármacos y agentes citotóxicos que incluyen, pero no están limitados a, fármacos citotóxicos (por ejemplo, agentes quimioterapéuticos) o toxinas o fragmentos activos de dichas toxinas. Las toxinas adecuadas y sus fragmentos correspondientes incluyen la cadena de dipteria A, la cadena de exotoxina A, la cadena de ricina A, la cadena de abrina A, curcina, crotina, fenomicina, neomicina y similares. Los agentes citotóxicos también incluyen radioquímicos hechos mediante la conjugación de radio-isótopos a las proteínas de enlace del antígeno, o el enlace de un radionúclido a un agente de quelación que ha sido enlazado covalentemente a la proteína de enlace al antígeno. Las modalidades adicionales utilizan la caliqueamicina, auristatinas, geldanamicina y maitansina.
En una modalidad, los anticuerpos antagonistas de IL- 17RA-IL-17RB comprenden un análogo de anticuerpo, al que algunas veces nos referimos como "anticuerpos sintéticos". Por ejemplo, se pueden injertar una variedad de plataformas de proteína alternativa o plataformas artificiales con los CDRs de los anticuerpos antagonistas de IL-17RA-IL-17RB. Dichas plataformas incluyen, pero no están limitadas a, mutaciones introducidas para estabilizar la estructura tri-dimensional de la proteína de enlace así como plataformas completamente sintéticas que consisten, por ejemplo de polímeros biocompatibles. Ver, por ejemplo, Korndorfer, y asociados, 2003, "Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, Volumen 53, Emisión 1: páginas 121 a 129; Roque, y asociados, 2004, Biotechnol. Prog. 20: páginas 639 a 654. En modalidades alternativas, los anticuerpos antagonistas de IL-17RA-IL-17RB pueden comprender imitaciones de anticuerpos péptidos o "PAMs", así como imitaciones de anticuerpos que utilizan componente de fibronección como plataforma. 1.2 Antagonistas de IL-17RA-IL-17RB: Péptidos/Polipéptidos Las modalidades de los antagonistas de I L- 17 R A-l L-17 RB comprenden proteínas en la forma de péptidos y polipéptidos que se enlazan específicamente al IL-17RA, o IL-17RB, o ambos el IL-17RA y el IL-17RB, que inhiben una actividad del IL-17A, IL-17F y/o IL-25. En algunas modalidades, los antagonistas de IL-17RA-IL-17RB inhiben la asociación de las subunidades del complejo receptor heteromérico I L-17RA-I L-17RB, inducen (o previenen) un cambio de conformación en las subunidades del receptor inhibiendo de esta manera su interacción; inhiben el enlace del ligando (por ejemplo, IL-25) al complejo receptor heteromérico (o una subunidad del mismo) o inducen un cambio de conformación en el complejo receptor heteromérico (o una subunidad del mismo) que inhibe el enlace del ligando al mismo.
Las modalidades incluyen los antagonistas IL-17RA-IL-17RB recombinantes. Una "proteína recombinante" es una proteína hecha utilizando técnicas recombinantes, por ejemplo, a través de la expresión del ácido nucleico recombinante utilizando los métodos conocidos en la técnica.
Un "péptido", como se usa en la presente descripción se refiere a moléculas de 1 a 100 aminoácidos. Los péptidos de ejemplo que se enlazan al IL-17RA, o IL-17RB, o ambos el IL-17RA y el IL-17RB que inhiben la asociación del IL-17RA y el IL-17RB para formar un complejo receptor heteromérico IL-17RA-IL-17RB o inhiben el complejo receptor heteromérico IL-17RA-IL-17RB en su señalización puede comprender aquellos generados de las librerías aleatorias. Por ejemplo, las secuencias de péptidos de secuencias completamente aleatorias (por ejemplo, seleccionadas por medio de los métodos de despliegue de fagos o selección del péptido de ARN) y secuencias en las cuales uno o más residuos de las moléculas que ocurren de manera natural es reemplazado por un residuo de aminoácido que no aparece en esa posición en las moléculas que ocurren de manera natural. Los métodos de ejemplo para identificar las secuencias de péptidos incluyen el despliegue de fagos, el despliegue de E. coli, el despliegue de ribosomas, la selección de ARN-péptido, la selección química y similares.
El término "proteína", como se usa en la presente descripción significa por lo menos dos aminoácidos enlazados de manera covalente, el cual incluye proteínas, polipéptidos, oligopéptidos y péptidos. En algunas modalidades, los dos o más aminoácidos enlazados de manera covalente son enlazados por medio de un enlace péptido. La proteína puede estar formada de aminoácidos que ocurren de manera natural y enlace de péptidos, por ejemplo, cuando la proteína está hecha de manera recombinante utilizando los sistemas de expresión y células huésped, que se señalan más adelante. Alternativamente, en algunas modalidades (por ejemplo, cuando los agentes de candidatos proteináceos son seleccionados por su capacidad para inhibir la asociación de IL-17RA y IL-17RB) la proteína puede incluir aminoácidos sintéticos (por ejemplo, homofenilalanina, citrulina, ornitina, y norleucina), o estructuras péptido miméticas, por ejemplo, "péptidos o análogos de proteínas", tales como peptoides (consultar la publicación de Simón y asociados, 1992, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA. 89: página 9367, incorporada como referencia a la presente descripción), los cuales pueden resistir a las proteasas u otras condiciones de almacenamiento y/o fisiológicas. Dichos aminoácidos sintéticos pueden ser incorporados en particular cuando la proteína es sintetizada in vitro mediante métodos convencionales bien conocidos en la técnica. Además, se puede utilizar cualquier combinación de residuos/estructuras peptidomiméticas, sintéticas y que ocurren de manera natural. "Aminoácido" también incluye residuos de iminoácidos tales como prolina e hidroxiprolina. Los aminoácidos "grupo R" o " de cadena lateral" pueden ser en cualquier configuración (L) o (S). En modalidades específicas, los aminoácidos son de configuración (L) o (S).
Un ejemplo de una proteína antagonista es un receptor heteromérico IL-17RA-IL-17RB soluble. Los métodos de preparación de dichos receptores heteroméricos solubles son conocidos en la técnica, y se describen, por ejemplo, en la Patente Norteamericana No. 6,589,764, emitida en Julio 8, 2003, incorporada a la presente descripción como referencia. Los complejos receptores de I L-17A-I L-17B incluyen IL-17RA e IL-17RB (y/o subunidades adicionales) como proteínas coexpresadas en la misma célula, o como subunidades del receptor enlazadas entre ellas (por ejemplo, por medio de enlaces covalentes por cualesquiera medios adecuados, tales como por medio de un reactivo de reticulación o un enlazador polipéptido). En una modalidad, un receptor heteromérico es formado de una proteína de fusión de cada componente del receptor con una porción de una molécula de anticuerpos, tal como una región Fe. Alternativamente, el receptor heteromérico IL-17A-IL-17B puede ser formado a través de interacciones no covalentes, tales como aquellas de biotina con avidina. 2.0 Antagonistas de IL-17RA-IL-17RB Como se mencionó anteriormente, los antagonistas de IL-17RA-IL-17RB incluyen las proteínas de enlace del antígeno IL-17RA-IL-17RB, las cuales incluyen, pero no están limitadas a, anticuerpos, péptidos y polipéptidos, así como otros antagonistas (incluyendo otros polipéptidos o proteínas). Las modalidades alternativas de los antagonistas IL-17RA-IL-17RB (por ejemplo, las proteínas de enlace al antígeno IL-17RA-IL-17RB) comprenden las modificaciones covalentes de antagonistas IL-17RA-IL-17RB. Dichas modificaciones pueden ser hechas después de la traducción. Por ejemplo, se introducen varios tipos de modificaciones covalentes de los antagonistas de IL-17RA-IL-17RB dentro de la molécula haciendo reaccionar los residuos de aminoácidos específicos del antagonista con un agente de derivatización orgánico que tiene la capacidad de reaccionar con las cadenas laterales seleccionadas o los residuos de la terminal N o C. Los siguientes representan ejemplos de dichas modificaciones para los antagonistas de IL-17RA-IL-17RB.
Los residuos de c i s te i n i I o más generalmente se hacen reaccionar con a-haloacetatos (y las aminas correspondientes), tales como ácido cloroacético o cloroacetamída, para producir los derivados carboximetilo o carboxiamidometilo. Los residuos de cisteinilo también son derivados mediante la reacción con bromotrifluoroacetona, ácido a-bromo-p-(5- ¡midozoil)propiónico, fosfato de cloroacetilo, N-alquilmaleimidas, disulfuro de 3-nitro-2-p¡rid¡lo, disulfuro metil 2-piridilo, p-cloromercuribenzoato, 2-cloromercuri-4-nitro fenol, o cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1 ,3-diazol. Los residuos de histidilo son derivados mediante la reacción con dietilpirocarbonato en un pH de 5.5 a 7.0 debido a que este agente es relativamente específico para la cadena lateral histidilo. El bromuro de para-bromofenacilo también es útil; la reacción preferentemente se lleva a cabo en cacodilato de sodio 0.1 M en un pH de 6.0. Los residuos de lisinilo y la terminal amino se hacen reaccionar con anhídrido de ácido succínico u otros ácidos carboxílicos. La derivatización con estos agentes tiene el efecto de invertir la carga de los residuos de lisinilo. Otros reactivos adecuados para la derivatización de los residuos que contienen alfa-amino incluyen imidoésteres tales como metil picolinimidato; piridoxal fosfato; piridoxal; cloroborohidruro; ácido trinitrobencenosulfónico; O-metilisourea; 2,4-pentanodiona; y la reacción catalizada por transaminasa con glioxilato. Los residuos de arginilo son modificados mediante la reacción con uno o varios reactivos convencionales, entre ellos, fenilglioxal, 2,3-butanodiona, 1 ,2-ciclohexanodiona, y ninhidrina. La derivatización de los residuos de arginina requiere que la reacción sea realizada en condiciones alcalinas debido al pKa alto del grupo funcional guanidina. Además, estos reactivos pueden funcionar con los grupos de lisina así como con el grupo de arginína epsilon-amino.
La modificación específica de los residuos de tirosilo se puede hacer, con interés particular al introducir las etiquetas del espectro en los residuos de tirosilo mediante la reacción con compuestos de diazonio aromático o tetranitrometano. Más generalmente, se utiliza N-acetilimidazol y tetranitrometano para formar las especies de O-acetil tirosilo y los derivados 3-nitro, respectivamente. Los residuos de tirosilo son yodinados utilizando 125l o 131l para preparar las proteínas etiquetadas para utilizarse en el radio-inmunoensayo de IL-17RA, el método de cloramina T descrito anteriormente es el adecuado. Los grupos laterales carboxilo (aspartilo y glutamilo) son modificados selectivamente mediante la reacción con carbodiimidas (R'— N = C = N--R'), en donde R y R' son grupos alquilo opcionalmente diferentes, tales como 1 -ciclohexil-3-(2-morfolinil-4-etil)carbodiimida o 1 -etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpent¡l)carbodiim¡da. Además, los residuos de aspartilo y glutamilo son convertidos en residuos de asparaginilo y glutaminilo mediante la reacción con iones de amonio.
La derivatización con agentes bifuncionaies es útil para la reticulación de los antagonistas de IL-17RA-IL-17RB a una matriz o superficie de soporte insoluble en agua para utilizarse en una variedad de métodos. Los agentes de reticulación generalmente utilizados incluyen, por ejemplo, 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldehído, ésteres de N- hidroxisuccinimida, por ejemplo, ésteres con ácido 4-azidosalicílico, imidoésteres homobifuncionales, incluyendo ésteres de disuccinimidilo tales como 3,3'-ditiobis(succinimidilpropionato), y maleimidas bif u ncionales tales como bis-N-maleimido-1 ,8-octano. Los agentes de derivatización tales como metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato producen intermediarios que se pueden foto-activar que tienen la capacidad de formar reticulaciones en la presencia de la luz. Alternativamente, las matrices insolubles en agua reactivas tales como carbohidratos activados por bromuros de cianógeno y los substratos reactivos descritos en las Patentes Norteamericanas Nos. 3,969,287; 3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4,229,537; y 4,330,440 son empleados para la inmovilización de las proteínas.
Los residuos glutaminilo y asparaginilo son frecuentemente desamidados a los residuos glutamilo y aspartilo correspondientes, respectivamente. Alternativamente, estos residuos son desamidados bajo condiciones medianamente ácidas. Ya sea cualquier forma de estos residuos se encuentran dentro del alcance de la presente invención. Otras modificaciones incluyen la hidroxilación de prolina y Usina, la fosforilación de los grupos hidroxilo de los residuos de serilo o treonilo, la metilación de los grupos alfa-amino de Usina, arginina, y las cadenas laterales de histidina (T. E. Creighton, "Proteínas: Estructura y Propiedades Moleculares", (Proteins: Structure and Molecular Properties), W. H. Freeman & Co., San Francisco, páginas 79 a 86
[1983]), la acetilación de la amina de la terminal N, y amidación de cualquier grupo carboxilo de la terminal C.
Otro tipo de modificación covalente de los antagonistas de IL-17RA-IL-17RB incluidos dentro del alcance de la presente invención comprenden alterar el patrón de glucosilación de la proteína. Como es conocido en la técnica, los patrones de glucosilación pueden depender de ambas la secuencia de la proteína (por ejemplo, la presencia o ausencia de residuos particulares de glucosilación de aminoácidos, que se explicará más adelante), o la célula huésped u organismo en el cual es producida la proteína. La glucosilación de los polipéptidos generalmente es ya sea enlazada a N o enlazada a O. Enlazada al N se refiere al enlace de la porción de carbohidratos a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias de tri-péptidos de asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, en donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para el enlace enzimático de la porción de carbohidratos a la cadena lateral de asparagina. Por lo tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tri-péptidos en un polipéptido crea un sitio de glucosilación potencial. La glucosilación enlazada a O se refiere al enlace de uno de los azúcares de N-acetilgalactosamina, galactosa, o xilosa, a un ácido hidroxiamino, y más generalmente serina o treonina, aunque también se puede utilizar 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina. La adición de los sitios de glucosilación a los antagonistas de IL-17RA-IL-17RB se lleva convenientemente mediante la alteración de la secuencia de aminoácidos de modo que contiene una o más de las secuencias de tri-péptidos descritas anteriormente (para los sitios de glucosilación enlazados N). La alteración también se puede hacer mediante la adición de, o la substitución de, uno o más residuos de serina o treonina para la secuencia de partida (para sitios de glucosilación enlazados a O). Para facilidad, la secuencia de aminoácidos de la proteína de enlace al antígeno preferentemente es alterada a través de los cambios en el nivel de ADN, particularmente mutando el ADN que codifica el polipéptido objetivo en la base preseleccionada de modo que los codones son generados y se traducirán en los aminoácidos deseados.
Otros medios para aumentar el número de porciones de carbohidratos en los antagonistas de IL-17RA-IL-17RB es mediante el acoplamiento químico o enzimático de los glicósidos a la proteína. Estos procedimientos son provechosos debido a que no requieren la producción de la proteína en una célula huésped que tiene capacidades de glucosilación para la glucosilación enlazada a N y O. Dependiendo del modo de acoplamiento utilizado, el azúcar puede ser enlazado a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxilo libres, (c) grupos sulfhídrico libres tales como los de cisteína, (d) grupos hidroxilo libres tales como los de serina, treonina, o hidroxiprolina, (e) residuos aromáticos tales como aquellos de fenilalanina, tirosina, o triptofano, o (f) el grupo amida de glutamina. Estos métodos se describen en el documento WO 87/05330 publicado en Septiembre, 11, 1987, y en la publicación de Aplin y Wriston, 1981, CRC Crit. Rev. Biochem . , páginas 259 a 306.
La remoción de las porciones de carbohidratos presentes en los antagonistas IL-17RA-IL-17RB de partida puede ser realizada químicamente o enzimáticamente. La desglucosilación química requiere la exposición de una proteína al compuesto de ácido trifluorometanosulfónico, o un compuesto equivalente. Este tratamiento da como resultado la disociación de la mayor parte o todos los azúcares excepto el enlace de azúcar (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina), mientras se deja intacto el polipéptido. La desglucosilación química la describen Hakimuddin y asociados, 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259: página 52 y Edge y asociados, 1981, Anal. Biochem. 118: página 131. La disociación enzimática de las porciones de carbohidratos en los polipéptidos puede ser lograda mediante el uso de una variedad de endo- y exo-glicosidasas que las describe Thotakura y asociados, 1987, Meth. Enzymol. 138: página 350. La glucosilación en los sitios potenciales de glucosilación puede ser evitada mediante el uso del compuesto de tunicamicina como lo describen Duskin y asociados, 1982, J. Biol. Chem. 257: página 3105. La tunicamicina bloquea la formación de enlaces de proteína-N-glicósido.
Otro tipo de modificación covalente de los antagonistas IL-17RA-IL-17RB comprende el enlace de la proteína de enlace del antígeno a varios polímeros no proteináceos, incluyendo pero sin limitarse a, varios polioles tales como polietilénglicol (PEG), polipropilénglicol o polioxialquilenos, de la manera establecida en las Patentes Norteamericanas Nos. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 ó 4,179,337. Además, como es conocido en la técnica, se pueden hacer substituciones de aminoácidos en diferentes posiciones dentro de la proteína de enlace del antígeno para facilitar la adición de polímeros tales como PEG.
Las modificaciones covalentes de los antagonistas de IL- 17RA-IL-17RB son incluidas dentro del alcance de la presente invención, y generalmente, pero no siempre, se hacen posteriores a la traducción. Por ejemplo, varios tipos de modificaciones covalentes de los antagonistas de IL-17RA-IL-17RB son introducidos en la molécula por medio de la reacción de residuos de aminoácidos específicos de los antagonistas de IL-17RA-IL-17RB con un agente de derivatización orgánico que tiene la capacidad de reaccionar con las cadenas laterales seleccionadas o los residuos de la terminal N o la terminal C.
En algunas modalidades, la modificación covalente de las proteínas de enlace del antígeno de la presente invención comprenden la adición de una o más etiquetas. En general, las etiquetas se encuentran dentro de una variedad de clases, dependiendo del ensayo en las que van a ser detectadas: a) etiquetas isotópicas, las cuales pueden ser isótopos radioactivos o pesados; b) etiquetas magnéticas (por ejemplo, partículas magnéticas); c) porciones redox activas; d) tintes ópticos; grupos enzimáticos (por ejemplo, peroxidasa de rábano, beta-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina); e) grupos biotinilados; y f) epítopes predeterminados del polipéptido reconocidos por un reportador de enlace (por ejemplo, secuencias del par del cierre de leucina, sitios de enlace para anticuerpos secundarios, dominios de enlace de metal, etiquetas de epítopes, etc.). En algunas modalidades, el grupo de etiquetación está acoplado a la proteína de enlace del antígeno por medio de brazos separadores de diferentes longitudes para reducir el obstáculo estérico potencial. Varios métodos para las proteínas de etiquetación son conocidos en la técnica y pueden ser utilizados para realizar la presente invención.
Las etiquetas específicas incluyen tintes ópticos, incluyendo pero sin limitarse a, cromoforos, fósforos y fluoroforos, siendo el último específico en muchos casos. Los fluororforos pueden ser ya sea fluoros de "molécula pequeña", o fluoros proteináceos. El término "etiqueta fluorescente" significa cualquier molécula que puede ser detectada por medio de sus propiedades inherentes fluorescentes. Las etiquetas fluorescentes adecuadas incluyen, pero no están limitadas a, fluoresceína, rodamina, tetrametilrodamina, eosina, eritrosina, coumarina, metil-coumarinas, pireno, verde Malaquita, estilbeno, Amarillo Lucifer, Azul J de Cascada, Rojo Texas, IAEDANS, EDANS, BODIPY FL, Rojo LC 640, Cy 5, Cy 5.5, Rpjo LC 705, verde Oregon, tintes de Alexa-Flúor (Alexa Flúor 350, Alexa Flúor 430, Alexa Flúor 488, Alexa Flúor 546, Alexa Flúor 568, Alexa Flúor 594, Alexa Flúor 633, Alexa Flúor 660, Alexa Flúor 680), Azul Cascada, Amarillo Cascada y R-ficoeritrina (PE) (Molecular Probes, Eugene, OR), FITC, Rodamina, y Rojo Texas (Pierce, Rockford, IL), Cy5, Cy5.5, Cy7 (Amersham Life Science, Pittsburgh, PA). Los tintes ópticos adecuados, que incluyen fluoroforos, se describen en el "Manual de Muestras Moleculares" (Molecular Probes Handbook) de Richard P. Haugland, expresamente incorporado a la presente descripción como referencia.
Las etiquetas fluorescentes proteináceas adecuadas también incluyen, pero sin limitarse a, proteína verde fluorescente, incluyendo una especie de Renilla, Ptilosarcus, o Aequorea de GFP (Chalfie y asociados, 1994, Science 263: página 802-805), EGFP (Clontech Laboratories, Inc., Genbank Número de Acceso U55762), proteína azul fluorescente (BFP, Quantum Biotechnologies, Inc. 1801 de Maisonneuve Blvd.
West, 8th Floor, Montreal, Quebec, Canadá H3H 1J9; Stauber, 1998, Biotechniques 24: páginas 462 a 471; Heim y asociados, 1996, Curr. Biol. 6: página 178 a 182), proteína fluorescente amarilla mejorada (EYFPi Clontech Laboratories, Inc.), luciferasa (Ichikí y asociados, 1993, J. Immunol. 150: página 5408 a 5417), ß galactosidasa (Nolan y asociados, 1988, Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 85: páginas 2603 a 2607) y Renilla (documentos W092/15673, WO95/07463, WO98/14605, W098/26277, WO99/49019, Patentes Norteamericanas Nos. 5292658, 5418155, 5683888, 5741668, 5777079, 5804387, 5874304, 5876995, 5925558). Todas las referencias anteriormente citadas están expresamente incorporadas a la presente descripción como referencia.
Todas las modificaciones descritas anteriormente de las proteínas de enlace al antígeno también se pueden hacer para cualquier otro antagonista del IL-17RA-IL-17RB proteináceo. Por ejemplo, un complejo heteromérico IL-17RA-IL-17RB, o un antagonista péptido o polipéptido como aquí se describen. 3.0 Métodos de Uso La presente invención también proporciona métodos para utilizar los antagonistas de IL-17RA-IL-17RB, incluyendo por ejemplo, el uso de los antagonistas IL-17RA-IL-17RB para propósitos de diagnóstico, o para propósitos de tratamiento. Deberá quedar entendido que, el tratamiento, del uso de los antagonista de I L-17RA-I L-17RB generalmente es para la reducción o alivio de los signos y/o síntomas de la enfermedad o padecimiento para el cual es administrado el tratamiento. La presente invención proporciona los antagonistas de IL-17RA-IL-17RB como se describen en toda esta especificación que pueden ser utilizados en la preparación o manufactura de un medicamento para el tratamiento de diferentes enfermedades aquí descritas. Adicionalmente, una cantidad efectiva de un antagonista de IL-17RA-IL-17RB y una cantidad terapéuticamente efectiva de uno o más agentes activos adicionales como aquí se describen puede ser utilizada en la preparación o manufactura de un medicamento útil para los tratamientos descritos. Algunas modalidades incluyen un equipo de partes que comprenden un antagonista de IL-17RA-IL-17RB; opcionalmente, tal como un equipo puede incluir por lo menos un ingrediente activo adicional para la administración separada, simultánea o subsecuente a un sujeto que necesita el tratamiento.
Las modalidades adicionales que incluyen métodos para inhibir la activación del IL-17RA y/o IL-17RB en las células que expresan el IL-17RA e IL-17RB utilizando uno o más de los antagonistas de IL-17RA-IL-17RB aquí descritos. Por ejemplo, un método para inhibir la activación del IL-17RA y/o IL-17RB en las células que expresan el IL-17RA y el IL-17RB comprende la exposición de dichas células a un antagonista de IL-17RA-IL-17RB, en donde el antagonista de IL- 17RA-IL-17RB se enlaza por lo menos a una subunidad o componente del complejo receptor heteromérico e inhibe parcialmente o inhibe completamente la asociación del mismo con otra subunidad o componente del complejo receptor heteromérico (ya sea por medio del obstáculo estérico o el cambio de conformación) evitando de esta manera la formación del complejo receptor heteromérico IL-17RA-IL-17RB. En algunas modalidades, los antagonista de IL- 17RA-IL-17RB enlazan una subunidad del complejo receptor heteromérico. En modalidades alternativas, el antagonista de IL-17RA-IL- 7RB enlaza más de una subunidad del complejo receptor heteromérico, o enlaza el complejo receptor heteromérico mismo. En algunas modalidades, los antagonistas de IL-17 RA- 1 L- 17RB no necesitan inhibir el enlace del ligando (tal como, el IL-25) a uno o más componentes del complejo receptor heteromérico para inhibir la activación del IL-17RA y/o IL-17RB. En modalidades alternativas, el antagonista de IL- 7RA-IL- 7RB inhibe el enlace del ligando (por ejemplo, el IL-25) al IL-17RA y/o IL-17RB, e inhibe la activación del IL-17RA y/o IL-17RB. Las modalidades adicionales comprenden un método en donde dicho antagonista de IL-17RA-IL-17RB es una proteína de enlace del antígeno, como aquí se define, opcionalmente una proteína de enlace del antígeno es en la forma de una composición farmacéutica.
Las modalidades adicionales incluyen métodos para inhibir la activación del IL-17RA y/o IL-17RB en células que expresan por lo menos el IL-17RA e IL-17RB in vivo utilizando uno o más de los antagonistas de IL-17RA-IL-17RB aquí descritos. Por ejemplo, un método para inhibir la activación del IL-17RA y/o el IL-17RB en células que expresan el IL-17RA e IL-17RB in vivo comprende exponer dichas células a un antagonista de IL-17RA-IL-17RB, en donde el antagonista de IL-17RA-IL-17RB enlaza por lo menos una subunidad o componente del complejo receptor heteromérico y parcialmente inhibe o inhibe completamente la asociación del mismo con otra subunidad o componente del complejo receptor heteromérico (ya sea por medio del obstáculo estérico o el cambio de conformación) inhibiendo de esta manera la activación del complejo receptor heteromérico IL-17RA-IL-17RB. En algunas modalidades, el antagonista de IL-17RA-IL-17RB se enlaza a una subunidad del complejo receptor heteromérico. En modalidades alternativas, el antagonista de I L-17RA-I L-17RB enlaza a más de una subunidad del complejo receptor heteromérico, o enlaza el complejo receptor heteromérico mismo. En algunas modalidades, el antagonista de IL-17RA-IL-17RB no necesita bloquear el enlace del ligando (tal como el IL-25) para uno o más componentes del complejo receptor heteromérico para inhibir la activación del IL-17RA y/o IL-17RB. En modalidades alternativas, el antagonista de IL-17RA-IL-17RB inhibe el enlace del ligando (por ejemplo, el IL-25) al IL-17RA y/o IL-17RB, e inhibe la activación del IL-17RA y/o IL-17RB. Las modalidades adicionales comprenden un método en donde dicho antagonista de IL-17RA-I L-17RB es una proteína de enlace del antígeno, como aquí se describe; y opcionalmente una proteína de enlace del antígeno es en la forma de una composición farmacéutica.
Las modalidades adicionales incluyen métodos para reducir los portadores pro-inflamatorios liberados después de la activación del complejo receptor heteromérico IL-17RA-IL-17RB en células que expresan dicho complejo in vivo utilizando uno o más de los antagonistas de IL-17RA-IL-17RB aquí descritos. Por ejemplo, un método para reducir la liberación de los mediadores pro-inflamatorios después de la activación del complejo receptor heteromérico IL- 7RA-IL-17RB en las células que expresan dicho complejo in vivo comprende la exposición de dichas células a un antagonista de I L- 17RA-I L- 17RB , en donde el antagonista de IL-17RA-IL-17RB enlaza por lo menos una subunidad o componente del complejo receptor heteromérico e inhibe parcialmente o inhibe completamente la formación o activación de un complejo receptor heteromérico IL-17RA-IL-17RB (ya sea por medio del obstáculo esférico o el cambio de conformación) por lo tanto reduciendo la liberación de portadores pro-inflamatorios. En algunas modalidades, el antagonista de IL-17RA-IL-17RB enlaza una subunidad del complejo receptor heteromérico. En modalidades alternativas, el antagonista de IL-17RA-IL-17RB enlaza más de una subunidad del complejo receptor heteromérico o enlaza el complejo receptor heteromérico mismo. En algunas modalidades, el antagonista de IL-17RA-IL-17RB no necesita inhibir el enlace del ligando (tal como, el IL-25) a uno o más componentes del complejo receptor heteromérico para reducir la liberación de los portadores pro-inflamatorios. En modalidades alternativas, el antagonista de IL-17RA-IL-17RB inhibe el enlace del ligando (por ejemplo, IL-25) al IL-17RA y/o IL-17RB, y reduce la liberación de los mediadores pro-inflamatorios. Las modalidades adicionales comprenden un método en donde el antagonista de IL-17RA-IL-17RB es una proteína de enlace del antígeno, como aquí se define; opcionalmente la proteína de enlace del antígeno es en la forma de una composición farmacéutica.
Las modalidades adicionales comprenden métodos, como se describieron anteriormente, en donde el portador pro-inflamatorio es por lo menos uno de los siguientes: IL-5, IL-6, IL-8, IL-12, IL-13, CXCL1, CXCL2, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, IL-1ß, TNFa, RANK-L, LIF, PGE2, MP3, MMP9, GROa, NO, eotaxina, MCP-1, e IL-17RB, así como cualquier otro mediador pro-inflamatorio conocido en la técnica para liberar la formación de cualquiera de las células a través de la activación del IL-17RA y/o el IL-17RB.
Las modalidades adicionales incluyen métodos, como se describieron anteriormente, de tratamiento de enfermedades asociadas con miembros de la familia IL-17 , tales como pero sin limitarse a, enfermedades inflamatorias y auto-inmunes con los antagonistas de I L-17RA-I L-17RB.
Las enfermedades adicionales incluyen métodos de tratamiento de la inflamación, en donde el complejo receptor heteromérico IL-17RA-IL-17RB es parcialmente o completamente bloqueado de ser activado mediante la administración de uno o más de los antagonistas de IL-17RA-IL-17RB aquí descritos. Por ejemplo, un método de tratamiento de la inflamación en un paciente que lo necesita comprende la administración a dicho paciente de un antagonista de IL-17RA-IL-17RB, en donde el antagonista de IL-17RA-IL-17RB enlaza por lo menos una subunidad o componentes del complejo receptor heteromérico e inhibe parcialmente o completamente la formación o activación del complejo receptor heteromérico (ya sea por medio del obstáculo esférico o el cambio de conformación) facilitando de esta manera el tratamiento de la inflamación. En algunas modalidades, los antagonistas de IL-17RA-IL-17RB enlazan una subunidad del complejo receptor heteromérico. En modalidades alternativas, el antagonista de IL-17RA-IL-17RB enlaza más de una subunidad del complejo receptor heteromérico o enlaza el complejo receptor heteromérico mismo. En algunas modalidades, los antagonistas de IL-17RA-IL-17RB no necesitan bloquear el enlace del ligando (tal como IL-25) a uno o más componentes del complejo receptor heteromérico, para que sea útil en el tratamiento de la inflamación. En modalidades alternativas, el antagonista de IL- 17RA-IL-17RB inhibe el enlace del ligando (por ejemplo, IL-25) al IL-17RA y/o IL-17RB, y es útil para el tratamiento de la inflamación. Las modalidades adicionales comprenden un método en donde dicho antagonista de IL-17RA-IL-17RB es un anticuerpo, como aquí se define; opcionalmente el anticuerpo se encuentra en la forma de una composición farmacéutica.
Las modalidades adicionales incluyen métodos de tratamiento de una enfermedad autoinmune, en donde el complejo receptor heteromérico IL-17RA-IL-17RB es bloqueado parcial o totalmente de ser activado mediante la administración de uno o más de los antagonistas de IL-17RA-IL-17RB, aquí descritos. Por ejemplo, un método de tratamiento de una enfermedad autoinmune en un paciente que lo necesita comprende la administración a dicho paciente de un antagonista de IL-17RA-IL-17RB, en donde el antagonista de IL-17RA-IL-17RB se enlaza por lo menos a una subunidad o componente del complejo receptor heteromérico e inhibe parcialmente o inhibe completamente la formación o activación del complejo receptor heteromérico facilitando de esta manera el tratamiento de la enfermedad autoinmune. En algunas modalidades, el antagonista de IL- 7RA-IL-17RB enlaza una subunidad del complejo receptor heteromérico. En modalidades alternativas, el antagonista de IL-17RA-IL-17RB enlaza más de una subunidad del complejo receptor heteromérico, o enlaza el complejo receptor heteromérico mismo. En algunas modalidades, el antagonista de IL-17RA-IL-17RB no necesita bloquear el enlace del ligando (tal como IL-25) a uno o más componentes del complejo receptor heteromérico para ser útil en el tratamiento de una enfermedad autoinmune. En modalidades alternativas, el antagonista de IL-17RA-IL-17RB inhibe el enlace del ligando (por ejemplo, IL-25) al IL-17RA y/o IL-17RB, y es útil en el tratamiento de una enfermedad autoinmune. Las modalidades adicionales comprenden un método en donde dicho antagonista de IL-17RA-IL-17RB es un anticuerpo, como aquí se define; opcionalmente el anticuerpo se encuentra en la forma de una composición farmacéutica.
Las modalidades adicionales incluyen métodos para el tratamiento de la inflación y/o enfermedades autoinmunes, como aquí se describen, en donde las enfermedades incluyen pero no están limitadas a, inflamación de cartílago, y/o degradación del hueso, artritis, artritis reumatoide, artritis juvenil, artritis reumatoide juvenil, artritis reumatoide juvenil pauciarticular, artritis reumatoide juvenil poliarticular, artritis reumatoide juvenil de presentación sistémica, espondilitis alquilosante juvenil, artritis enteropática juvenil, artritis reactiva juvenil, síndrome juvenil de Reter, Síndrome SEA (Síndrome de Seronegatividad , Entesopatía, Artropatía), dermatomiositis juvenil, artritis psoriática juvenil, escleroderma juvenil, lupus eritematoso sistémico juvenil, vasculitis juvenil, artritis reumatoide pauciarticular, artritis reumatoide poliarticular, artritis reumatoide de presentación sistémica, espondilitis alquilosante, artritis enteropática, artritis reactiva, el Síndrome de Reter, el síndrome de SEA (Síndrome de Seronegatividad, Entesopatía, Artropatía), dermatomiositis, artritis psoriática, escleroderma, lupus eritematoso sistémico, vasculitis, miolitis, polimyolitis, dermatomiolitis, osteoartritis, poliarteritis nodosa, granulomatosis de Wegener, arteritis, ploimialgia reumática, sarcoidosis, escleroderma, esclerosis, esclerosis biliar primaria, colangitis esclerosante, síndrome de Sjogren, psoriasis, psoriasis de placa, psoriasis de guttata, psoriasis inversa, psoriasis pustular, psoriasis eritrodérmica, dermatitis, dermatitis atópica, ateroesclerosis, lupus, enfermedad de Still, Lupus Eritematoso Sistémico (SLE), miastenia gravis, enfermedad inflamatoria del intestino delgado (IBD), enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, enfermedad ciliaca, esclerosis múltiple (MS), asma (incluyendo asma extrínseca e intrínseca así como condiciones inflamatorias crónicas, o capacidad de hiper-respuesta, de las vías aéreas), enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC, por ejemplo, bronquitis crónica, enfisema), Síndrome de Enfermedad Respiratoria Aguda (ARDS), síndrome de agotamiento respiratorio, fibrosis quística, hipertensión pulmonar, vasoconstricción pulmonar, lesión aguda del pulmón, aspergilosis bronquiopulmonar alérgica, neumonía de hipersensibilidad, neumonía eosinofílica, bronquitis, bronquioectasis de bronquitis alérgica, tuberculosis, neumonitis de hipersensibilidad , asma ocupacional, enfermedades similares al asma, sarcoides, enfermedad reactiva de las vías respiratorias o síndrome de (disfunción), bisinosis, enfermedad intersticial del pulmón, síndrome hiper-eosinof ílico, rinitis, sinusitis, y enfermedad parásita del pulmón, capacidad de hiper-respuesta de las vías aéreas asociadas con padecimientos inducidos por virus (por ejemplo, virus sincitial respiratorio (RSV), virus de parainfluenza (PIV), rinovirus (RV) y adenovirus), enfermedad de Guillain-Barre, diabetes melitus Tipo I, enfermedad de Grave, enfermedad de Addison, fenómeno de Raynaud, hepatitis autoinmune, GVHD, y similares.
Las modalidades adicionales incluyen composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de uno o más de un antagonista de I L- 17 R A-l L- 17RB junto con un diluyente, vehículo, solubilizador, emulsificador, conservador, y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable. Además, la presente invención proporciona métodos de tratamiento de un paciente administrando dicha composición farmacéutica así como métodos para la preparación o manufactura de un medicamento para utilizarse en el tratamiento de los padecimientos anteriormente mencionados. Los materiales aceptables de formulación son no tóxicos para los receptores en las dosificaciones y concentraciones empleadas. En ciertas modalidades, la composición farmacéutica puede contener materiales de formulación para modificar, mantener o preservar, por ejemplo, el pH, osmolaridad, viscosidad, claridad, color, isotonicidad, olor, esterilidad, estabilidad, índice de disolución o liberación, adsorción o penetración de la composición. En dichas modalidades, los materiales adecuados de la formulación incluyen, pero no están limitados a, aminoácidos, (tales como, glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina); antimicrobiales; antioxidantes (tales como ácido ascórbico, sulfito de sodio o hidrogén-sulfito de sodio); reguladores (tales como borato, bicarbonato, Tris-HCI, citratos, fosfatos u otros ácidos orgánicos); agentes de volumen (tales como manitol o glicina); agentes de quelantes (tales como ácido etilendiamin tetra-acético (EDTA)); agentes de elaboración de complejo (tales como cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina o hidroxipropil-beta-ciclodextrina); rellenadores; monosacáridos; disacáridos; y otros carbohidratos (tales como glucosa, mañosa o dextrinas); proteínas (tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas); colorantes, saborizantes y agentes de dilución; agentes de emulsificación; polímeros hidrofílicos (tales como polivinilpirrolidona); polipéptidos de bajo peso molecular; contra-iones formadores de sal (tales como sodio); conservadores (tales como cloruro de benzalconio, ácido benzoico, ácido salicílico, timerosal, alcohol fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, ácido ascórbico o peróxido de hidrógeno); solventes (tales como glicerina, propilénglicol o polietilénglicol); alcoholes de azúcar (tales como manitol o sorbitol); agentes de suspensión; tensioactivos o agentes de humidificación (tales como pluronics, PEG, ésteres de sorbitan, polisorbatos tales como polisorbato 20, polisorbato, tritón, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapal); agentes de aumento de estabilidad (tales como sacarosa o sorbitol); agentes mejoradores de tonicidad (tales como haluros de metal alcalino, preferentemente cloruro de sodio o potasio, manitol, sorbitol); vehículos de administración; diluyentes; excipientes y/o adyuvantes farmacéuticos. Ver el libro "CIENCIAS FARMACÉUTICAS DE REMINGTON", (REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES), 18a Edición, (A.R. Genrmo, ed.), 1990, Mack Publishing Company.
En ciertas modalidades, la composición farmacéutica óptima será determinada por un experto en la técnica dependiendo de, por ejemplo, la ruta de administración pretendida, el formato de administración y la dosificación deseada. Ver por ejemplo, el libro de "CIENCIAS FARMACÉUTICAS DE REMINGTON", (REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES), mencionado anteriormente. En ciertas modalidades, dichas composiciones pueden influir en la condición física, estabilidad, índice de liberación in vivo e índice de disociación in vivo de los antagonistas de IL-17RA-IL-17RB. En ciertas modalidades, el vehículo o portador primario en una composición farmacéutica que puede ser ya sea de naturaleza acuosa o no acuosa. Por ejemplo, un vehículo adecuado o portador puede ser agua para inyección. La solución salina fisiológica o el fluido cerebroespinal artificial, posiblemente suplementado con otros materiales comunes en las composiciones para la administración parenteral. La solución salina regulada neutral o salina mezclada con albúmina de suero son vehículos de ejemplo adicionales. En modalidades específicas, las composiciones farmacéuticas comprenden un regulador Tris de aproximadamente un pH de 7.0 a 8.5, o un regulador de acetato de aproximadamente un pH de 4.0 a 5.5, y puede incluir además sorbitol o un substituto adecuado. En ciertas modalidades, las composiciones antagonistas de IL-17RA-IL-17RB pueden ser preparadas para el almacenamiento mezclando la composición seleccionada que tiene el grado deseado de pureza con agentes de formulación opcionales (REMI NGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, mencionado anteriormente) en la forma de una torta liofilizada o una solución acuosa. Además, en ciertas modalidades, el producto antagonista de IL-17RA-I L-17RB puede ser formulado como un liofilizato utilizando excipientes apropiados tales como sacarosa.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden ser seleccionadas para la administración parenteral. Alternativamente, las composiciones pueden ser seleccionadas para inhalación o para la administración a través del aparato digestivo, tales como oralmente. La preparación de dichas composiciones farmacéuticamente aceptables se encuentra dentro del conocimiento de los expertos en la técnica. Los componentes de la formulación están presentes preferentemente en concentraciones que son aceptables a los sitios de administración. En ciertas modalidades, se usan reguladores para mantener la composición en un pH fisiológico o en un pH ligeramente más bajo, generalmente dentro de un rango de pH de aproximadamente 5 hasta aproximadamente 8.
Cuando están contemplados para la administración parenteral, los antagonistas de IL-17RA-IL-17RB pueden ser proporcionados en la forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable libre de pirógenos que comprende la proteína de enlace del antígeno del receptor IL-17 en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Un vehículo particularmente adecuado para la inyección parenteral es agua destilada estéril en la cual el antagonista de IL-17RA-IL-17RB es formulado como una solución estéril, isotónica, conservada de manera correcta. En ciertas modalidades, la composición puede comprender la formulación de la molécula deseada con un agente, tal como microesferas inyectables, partículas que se pueden erosionar biológicamente, compuestos poliméricos (tales como ácido poliláctico o ácido poliglicólico), cuentas o liposomas, que pueden proporcionar la liberación controlada o sostenida del producto el cual puede ser administrado por medio de la inyección de un depósito. En ciertas modalidades, también se puede utilizar ácido hialurónico, que tiene el efecto de promover la duración sostenida en la circulación. En ciertas modalidades, los aparatos de administración de fármacos implatables pueden ser utilizados para introducir la proteína de enlace del antígeno deseada.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden ser formuladas para la inhalación. En estas modalidades, los antagonistas de IL-17RA-IL-17RB pueden ser formulados en la forma de polvo seco inhalable. Las soluciones de inhalación pueden también ser formuladas con un propulsor para la administración en aerosol. En ciertas modalidades, las soluciones pueden ser nebulizadas. La administración pulmonar y los métodos de formulación por lo tanto se describen adicionalmente en la Solicitud de Patente Internacional No. PCT/US94/001875, la cual está incorporada a la presente descripción como referencia y describe la administración pulmonar de las proteínas modificadas químicamente.
También está contemplado que las formulaciones pueden ser administradas oralmente. Los antagonistas de IL-17RA-IL-17RB que son administrados de esta manea pueden ser formulados con o sin vehículos acostumbrados en la elaboración de compuestos de formas de dosificación sólida tales como tabletas y cápsulas. En ciertas modalidades, se puede diseñar una cápsula para liberar la porción activa de la formulación en el punto en el aparato gastrointestinal en donde se maximiza la biodisponibilidad y se minimiza la degradación pre-sistémica. Se pueden incluir agentes adicionales para facilitar la absorción de los antagonistas de I L-17RA-I L-17RB. Los diluyentes, saborizantes, ceras de bajo punto de ebullición, aceites vegetales, lubricantes, agentes de suspensión, agentes desintegradores de tabletas, y enlazadores pueden ser también empleados.
Una composición farmacéutica de la presente invención preferentemente se proporciona para que comprenda una cantidad efectiva de uno o más de los antagonistas de IL-17RA-IL-17RB en una mezcla con excipientes no tóxicos que son adecuados para la manufactura de tabletas. Disolviendo las tabletas en agua estéril, u otro vehículo apropiado, pueden ser preparadas las soluciones en forma de dosificación unitaria. Los excipientes adecuados incluyen, pero no están limitados a, diluyentes inertes, tales como carbonato de calcio, carbonato de sodio o bicarbonato, lactosa, o fosfato de calcio; o agentes de enlace, tales como almidón, gelatina, o acacia; o agentes lubricantes tales como estearato de magnesio, ácido esteárico o talco.
Las composiciones farmacéuticas adicionales serán evidentes para los expertos en la técnica, incluyendo formulaciones que comprenden los antagonistas de IL-17RA-IL-17RB en formulaciones de administración sostenida o controlada. Las técnicas para la formulación de una variedad de otros medios de administración sostenida o controlada, tales como vehículos de liposoma, micropartículas que se pueden bio-erosionar o cuentas porosas e inyecciones de depósito, son también conocidos para los expertos en la técnica. Ver por ejemplo, la Solicitud de Patente Internacional No. PCT/US93/00829, la cual está incorporada como referencia y describe la liberación controlada de micropartículas poliméricas porosas para la administración de composiciones farmacéuticas. Las preparaciones de liberación sostenida pueden incluir matrices de polímero semipermeable en la forma de artículos formados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Las matrices de liberación sostenida pueden incluir poliésteres, hidrogeles, poliláctidos (como se describen en la Patente Norteamericana No. 3,773,919 y la Publicación de solicitud de Patente Europea No. EP 058481, cada una de las cuales está incorporada a la presente descripción como referencia), copolímeros de ácido L-glutámico y gama etil-L-glutamato (Sidman y asociados, 1983, Biopolymers 2: páginas 547 a 556), poli(2-hidroxietil-inetacrilato) (Langer, y asociados, 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15: páginas 167 a 277 y Langer, 1982, Chem. Tech. 12: páginas 98 a 105), acetato de vinilo de etileno (Langer, y asociados, 1981, mencionado anteriormente) o ácido poli-D(-)-3-hidroxibutírico (Publicación de Solicitud de Patente Europea No. EP 133,988). Las composiciones de liberación sostenida también pueden incluir liposomas que pueden ser preparados mediante cualquiera de varios métodos conocidos en la técnica. Ver por ejemplo, la publicación de Eppstein, y asociados, 1985, Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A.. 82: páginas 3688 a 3692; las Publicaciones de Solicitud de Patente Europea Nos. EP 036,676; EP 088,046 y EP 143,949, incorporadas a la presente descripción como referencia.
Las composiciones farmacéuticas utilizadas para la administración in vivo generalmente son proporcionadas como preparaciones estériles. La esterilización se puede lograr mediante filtración a través de membranas de filtración estériles. Cuando la composición es liofilizada, la esterilización utilizando este método puede ser realizada ya sea antes o después de la liofilización y reconstitución. Las composiciones para administración parenteral pueden ser almacenadas en una forma liofilizada o en solución. Las composiciones parenterales generalmente son colocadas en un contenedor que tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa o frasco de solución intravenosa que tiene un tapón que se puede perforar con una aguja de inyección hipodérmica.
Una vez que la composición farmacéutica ha sido formulada, puede ser almacenada en frascos estériles como una suspensión, gel, emulsión, solución, sólido, cristal, o como un polvo liofilizado o deshidratado. Dichas formulaciones pueden ser almacenadas ya sea en una forma lista para utilizarse o en una forma (por ejemplo, liofilizada) que es reconstituida antes de la administración. La presente invención también proporciona equipos para producir una unidad de administración de una sola dosis. Los equipos de la presente invención pueden contener cada uno ambos, un primer contenedor que tiene una proteína seca y un segundo contenedor que tiene una formulación acuosa. En ciertas modalidades de la presente invención, los equipos que contienen jeringas previamente llenadas de cámaras múltiples o sencillas (por ejemplo, se proporcionan, jeringas líquidas o liojeringas).
La cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que contiene el antagonista de IL-17RA-IL-17RB para ser empleado dependerá, por ejemplo, del contexto terapéutico y los objetivos. Un experto en la técnica apreciará que los niveles de dosificación apropiados para el tratamiento variarán dependiendo en parte, de la molécula administrada, la indicación para la cual el antagonista de IL-17RA-IL-17RB está siendo utilizado, la ruta de administración, y el tamaño (peso corporal, superficie del cuerpo o tamaño del órgano) y/o el padecimiento (la edad y salud general) del paciente. En ciertas modalidades, el médico puede titular la dosificación y modificar la ruta de administración para obtener un efecto terapéutico óptimo. Una dosificación típica puede encontrarse en un rango de aproximadamente 0.1 pg/kg hasta aproximadamente 30 mg/kg o mayor, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. En las modalidades específicas, la dosificación puede estar en un rango de 0.1 pg/kg hasta aproximadamente 30 mg/kg, opcionalmente de 1 Mg/kg hasta aproximadamente 30 mg/kg o de 10 µg/kg hasta aproximadamente 5 mg/kg. Por supuesto, deberá quedar entendido que esto va a ser determinado por médicos calificados y que estas dosis son únicamente de ejemplo. La frecuencia de dosificación dependerá de parámetros farmacocinéticos del antagonista de IL-17RA-IL-17RB particular en la formulación utilizada. Generalmente, un médico administra la composición hasta que es alcanzada una dosis la cual logra el efecto deseado. La composición puede por lo tanto ser administrada como una sola dosis, o como dos o más dosis (las cuales pueden o no contener la misma cantidad de la molécula deseada) con el paso del tiempo, o como una infusión continua por medio de un aparato o catéter de implante. El refinamiento adicional de la dosificación apropiada se hace de manera rutinaria por los expertos en la técnica y se encuentra dentro del ámbito de las tareas realizadas rutinariamente por ellos. Las dosificaciones apropiadas pueden ser aseguradas a través del uso de datos apropiados de respuesta a la dosis. En ciertas modalidades, los antagonistas de IL-17RA-IL-17RB pueden ser administrados a pacientes en un período de tiempo prolongado. La administración crónica de un antagonista de IL-17RA-IL-17RB puede minimizar la respuesta alérgica o inmune adversa generalmente asociada cuando el antagonista de IL-17RA-IL-17RB que no es completamente humano, por ejemplo, un anticuerpo originado contra un antígeno humano en un animal no humano, por ejemplo, un anticuerpo no completamente humano o un anticuerpo no humano producido en una especie no humana.
La ruta de administración de la composición farmacéutica se encuentra de acuerdo con los métodos conocidos, por ejemplo, oralmente, a través de inyección mediante la administración de rutas intravenosa, intraperitoneal, intracerebral (intra-parenquimal), intracerebroventricular, intramuscular, intra-ocular, intra-arterial, intraportal, o intralesional mediante sistemas de liberación sostenida o mediante aparatos de implante. En ciertas modalidades, las composiciones pueden ser administradas en la forma de una inyección de bolo o continuamente por infusión, o mediante el aparato de implante.
La composición también puede ser administrada localmente por medio de un implante de una membrana, esponja u otro material apropiado sobre el cual se desea que la molécula haya sido absorbida o encapsulada. En ciertas modalidades, en donde se utiliza un aparato de implante, el aparato puede ser implantado en un tejido u órgano adecuado, y la administración de la molécula deseada puede ser por medio de infusión, bolo de liberación programada, o administración continua.
Los antagonistas de IL-17RA-IL-17RB aquí descritos pueden ser utilizados en combinación (pre-tratamiento, posttratamiento, o concurrente con el tratamiento) con agentes farmacéuticos utilizados en el tratamiento de enfermedades y padecimientos aquí descritos. En una modalidad, los antagonistas de IL-17RA-IL-17RB aquí descritos pueden ser utilizados en combinación, (pre-tratamiento, post-tratamiento, o tratamiento concurrente) con cualquiera de uno o más inhibidores de TNF para el tratamiento o prevención de las enfermedades y padecimientos aquí mencionados, tal como, pero son limitarse a, todas las formas de receptores TNF solubles incluyendo Etanercept (tal como ENBREL®), así como todas las formas de moléculas del receptor TNF p75 y/o p55 monoméricas o multiméricas y fragmentos de las mismas; anticuerpos anti-humanos TNF, tal como pero sin limitarse a, Infliximab (tal como REMICADE®), y D2E7 (tal como HUMIRA®), y similares. Dichos inhibidores de TNF incluyen compuestos y proteínas que bloquean la síntesis in vivo o la liberación extracelular del TNF. En una modalidad específica, la presente invención se refiere al uso de un antagonista de IL-17RA-IL-17RB en combinación (pre-tratamiento, post-tratamiento o tratamiento concurrente) con cualquiera de uno o más de los siguientes inhibidores de TNF: proteínas de enlace de TNF (receptor de TNF soluble tipo I y receptor de TNF soluble tipo II ("sTNFRs"), como aquí se define), anticuerpos anti-TNF, factor estimulante de colonias de granulocitos, talidomida; BN 50730; tenidap, E 5531; tiapafant PCA 4248; nimesulida; panavir; rolipram; RP 73401; péptido T; MDL 201.449A; clorhidrato de (1R,3S)-Cis-1-[9-2,6-diaminopurinil)]-3-h¡droxi-4-c¡clopenteno, (1R-3R)-trans-1-9(2,6-diamino)purina]3-acetoxiciclopentano; clorhidrato de (1 R,3R)-trans-1 -[9-adenil)-3-azidociclopentano y (1R,3R)-trans-1-(6-hidroxi-purin-9-il)-3-azidociclopentano. Las proteínas de enlace de TNF se describen en la técnica (Patentes Europeas EP 308 378, EP 422 339, Patente Británica GB 2 218 101, Patente Europea EP 393 438, documento WO 90/13575, Patentes Europeas EP 398 327, EP 412 486, documento WO 91/03553, Patente Europea EP 418 014, Patente Japonesa JP 127 800/1991, Patente Europea EP 433 900, Patente Norteamericana No. 5,136,021, Patente Británica GB 2 246 569, Patente Europea PE 464 533, documentos WO 92/01002, WO 92/13095, WO 92/16221, Patentes Europeas EP 512 528, EP 526 905, documento WO 93/07863, Patente Europea EP 568 928, documentos WO 93/21946, WO 93/19777, Patente Europea PE 417 563, documento WO 94/06476, y Solicitud de Patente Internacional PCT No. PCT/US97/12244). Por ejemplo, las Patentes Europeas EP 393 438 y EP 422 339 enseñan la secuencia de aminoácidos y ácido nucleico de un receptor de TNF soluble tipo I (también conocido como "sTNFR-l" o "inhibidor de TNF de 30 kDa"), y un receptor de TNF soluble tipo II (también conocido como "sTNFR-M" o "inhibidor de TNF de 40 kDa"), denominados colectivamente "sTNFRs", así como las formas modificadas de los mismos (por ejemplo, fragmentos, derivados funcionales y variantes). Las Patentes Europeas EP 393 438 y EP 422 339 también describen métodos para aislar los genes responsables de la codificación de los inhibidores, clonando los genes en vectores adecuados y los tipos de células y expresando el gen para producir los inhibidores. Adicionalmente, las formas polivalentes (por ejemplo, moléculas que comprenden más de una porción activa) de los sTNFR-l y sTNFR-ll también han sido descritos. En una modalidad, la forma polivalente puede ser construida mediante el acoplamiento químico de por lo menos un inhibidor de TNF y otra porción con cualquier enlazador clínicamente aceptable, por ejemplo, polietilénglicol (documentos WO 92/16221 y WO 95/34326), un enlazador péptido (Nevé y asociados (1996), Cytokine, 8(5): páginas 365 a 370, mediante el acoplamiento químico a biotina y luego el enlace a avidina (documento WO 91/03553) y, finalmente, combinando las moléculas del anticuerpo quimérico (Patente Norteamericana No. 5,116,964, documentos WO 89/09622, WO 91/16437 y Patente Europea EP 315062. Los anticuerpos anti-TNF incluyen el anticuerpo Fab 195F de MAK (Holler y asociados (1993), "Primer Simposio Internacional sobre Citocinas en el Trasplante de Médula Ósea" (1st International Symposium on Cytokines in Bone Marrow Transplantation), página 147); los anticuerpos monoclonales anti-TNF de CDP 571 (Rankin y asociados (1995), British Journal of Rheumatology, 34: páginas 334 a 342); el anticuerpo monoclonal de factor de necrosis anti-tumor múrido BAY X 1351, (Kieft y asociados (1995), "Séptimo Congreso Europeo de Microbiología Clínica y Enfermedades Infecciosas" (7th European Congress of Clinical M icrobíology and Infectious Diseases), página 9); anticuerpo monoclonal CenTNF cA2 anti-TNF (Elliott y asociados (1994), Lancet, 344: páginas 1125 a 1127 y Elliott y asociados (1994), Lancet, 344: páginas 1105 a 1110).
Los antagonistas de I L- 17RA-I L- 7RB aquí descritos pueden ser utilizados en combinación con todas las formas de inhibidores de IL-1, tales como, pero sin limitarse a, ciniret (por ejemplo, ANAKINRA®) (pre-tratamiento, post-tratamiento o tratamiento concurrente), el antagonista del receptor de interleucina-1 (IL-1ra) es una proteína humana que actúa como un inhibidor natural de la interleucina-1. Los antagonistas del receptor de interleucina-1, así como los métodos para elaborarlos y métodos de uso de los mismos, se describen en la Patente Norteamericana No. 5,075,222; en los documentos WO 91/08285, WO 91/17184; la Patente Australiana AU 9173636; los documentos WO 92/16221, WO 93/21946 ; WO 94/06457, WO 94/21275, la Patente Francesa FR 2706772, el documento WO 94/21235; la Patente Alemana DE 4219626; y los documentos WO 94/20517, WO 96/22793 y WO 97/28828. Las proteínas incluyen glucosilados así como antagonistas del receptor IL-1 también no glucosilado. Específicamente, las tres formas de I L- 1 ra (IL-1raa, I L- 1 ra ß e IL-1rax), siendo cada una codificada por la misma secuencia de ADN que codifica y las variantes de las mismas, que se describen en la Patente Norteamericana No. 5,075,222. Los métodos de producción de los inhibidores de IL-1, particularmente el IL-1ras, también se describe en la Patente Norteamericana No. 5,075,222. Una clase adicional de inhibidores de interleucina-1 incluye compuestos que tienen la capacidad de prevenir específicamente la activación de los receptores celulares a IL-1. Dichos compuestos incluyen proteínas de enlace IL-1, tales como receptores solubles y anticuerpos monoclonales. Dichos compuestos también incluyen anticuerpos monoclonales para los receptores. Una clase adicional de inhibidores de interleucina-1 incluyen compuestos y proteínas que bloquean la síntesis in vivo y/o la liberación extracelular de IL-1. Dichos compuestos incluyen agentes que afectan la transcripción de los genes IL-1 o el procesamiento de las preproteínas IL-1.
Los antagonistas de IL-17RA-IL-17RB aquí descritos pueden ser utilizados en combinación con todas las formas de inhibidores de CD28, tales como, pero sin limitarse a, abatacept (por ejemplo ORENCIA®) (pre-tratamiento, post-tratamiento o tratamiento concurrente). Los antagonistas de IL-17RA-IL-17RB pueden ser utilizados en combinación con una o más citocinas, linfocinas, factores hematopoyéticos, y/o un agente antiinflamatorio (pre-tratamiento, post-tratamiento o tratamiento concurrente).
El tratamiento de las enfermedades y padecimientos aquí descritos puede incluir el uso de fármacos de primera línea para el control del dolor y/o la inflamación en combinación (pre-tratamiento, post-tratamiento o tratamiento concurrente) con el tratamiento con uno o más de los antagonistas de IL-17RA-IL-17RB aquí proporcionados. Estos fármacos son clasificados como no esteroidales, fármacos anti-i nf lamatorios (NSAIDs). Los tratamientos secundarios incluyen corticoesteroides, fármacos anti-reumáticos de acción lenta (SAARDs), o fármacos modificadores de la enfermedad (DM). La información con respecto a los compuestos siguientes puede ser encontrada en "El Manual de Merck de la Diagnosis y Terapia" (The Merk Manual of Diagnosis and Therapy), 18a Edición, Merck, Sharp & Dohme Research Laboratories, Merck & Co., Rahway, N.J. (2006) y en Pharmaprojects de PJB Publications Ltd.
En una modalidad específica, la presente invención se relaciona con el uso de un antagonista de I L-17RA-I L-17RB y cualquiera de uno o más NSAIDs para el tratamiento de las enfermedades y padecimientos aquí descritos (pre-tratamiento, post-tratamiento, o tratamiento concurrente). Los NSAIDs poseen su acción anti-inflamatoria, por lo menos en parte, para la inhibición de la síntesis de prostaglandina (Goodman y Gilman en "Las Bases Farmacológicas de la Terapéutica" (The Pharmacological Basis of Terapeutics) MacMillan 7a Edición (1985)). Los NSAIDs pueden ser caracterizados en por lo menos nueve grupos: (1) derivados de ácido salicílico; (2) derivados de ácido propiónico; (3) derivados de ácido acético; (4) los derivados de ácido fenámico; (5) derivados de ácido carboxílico, (6) derivados de ácido butírico; (7) oxicamos; (8) pirazoles y (9) pirazolonas.
En otra modalidad específica, la presente invención se relaciona con el uso de un antagonista de IL- 7RA-IL-17RB en combinación (pre-tratamiento, post-tratamiento o tratamiento concurrente) con cualquiera o más de los derivados de ácido salicílico, ásteres de profármaco o las sales farmacéuticamente aceptables del mismo. Dichos derivados de ácido salicílico, ésteres de profármaco y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos comprenden: acetaminosalol, aloxiprina, aspirina, benorilato, bromosaligenina, acetilsalicilato de calcio, trisalicilato de magnesio colina, salicilato de magnesio, salicilato de colina, diflusinal, etersalato, fendosal, ácido gentísico, salicilato de glicol, salicilato de imidazol, acetilsalicilato de Usina, mesalamina, salicilato de morfolina, salicilato de 1-naftilo, olsalazina, parsalmida, acetilsalicilato fenilo, salicilato de fenilo, salacetamida, ácido salicilamida O-acético, salsalato, salicilato y sulfasalazina de sodio. Los derivados de ácido salicílico relacionados estructuralmente que tienen propiedades analgésicas y anti-inflamatorias similares también pretenden estar comprendidos en este grupo.
En una modalidad específica adicional, la presente invención se refiere al uso de los antagonistas de IL-17RA-IL-17RB en combinación (pre-tratamiento, post-tratamiento o tratamiento concurrente) con cualquiera o más de los derivados de ácido propiónico, ésteres de profármacos o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Los derivados de ácido propiónico, ésteres de profármacos y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos comprenden: alminoprofeno, benoxaprofeno, ácido buclóxico, carprofeno, dexindoprofeno, fenoprofeno, flunoxaprofeno, fluprofeno, flurbiprofeno, furcloprofeno, ibuprofeno, aluminio de ibuprofeno, ibuproxamo, indoprofeno, isoprofeno, ketoprofeno, ioxoprofeno, miroprofeno, naproxeno, naproxeno sódico, oxaprozina, picetoprofeno, pimeprofeno, pirprofeno, pranoprofeno, ácido protizínico, piridoxiprofeno, suprofeno, ácido tiaprofénico y tioxaprofeno. Los derivados de ácido propiónico relacionados estructuralmente que tienen propiedades analgésicas y antiinflamatorias también pretenden estar incorporados por este grupo.
Todavía en otra modalidad específica, la presente invención se refiere al uso de antagonistas de IL-17RA-IL-17RB en combinación (pre-tratamiento, post-tratamiento o tratamiento concurrente) con cualquiera de uno o más derivados de ácido acético, ésteres de profármaco o sales farmacéuticamente aceptables del mismo. Los derivados de ácido acético, ésteres de profármaco y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos comprenden: acemetacina, alclofenaco, amfenaco, bufexamaco, cinmetacina, clopirac, delmetacina, diclofenaco de potasio, diclofenaco sódico, etodolaco, felbinaco, fenclofenaco, fencloraco, ácido fenclozico, fentiazaco, furofenaco, glucametacina, ibufenaco, indometacina, isofezolaco, isoxepaco, lonazolaco, ácido metiazínico, oxametacina, oxpinaco, pimetacina, proglumetacina, sulindaco, talmetacina, tiaramida, tiopinaco, tolmetina, tolmetina sódica, zidometacina y zomepiraco. También se pretende que estén comprendidos por este grupo los derivados de ácido acético relacionados estructuralmente que tienen propiedades similares analgésicas y anti-inflamatorias.
En otra modalidad específica, la presente invención se refiere al uso de un antagonista de I L-17RA-I L-17RB en combinación (pre-tratamiento, post-tratamiento o tratamiento concurrente) con cualquiera de uno o más derivados del ácido fenámico, ésteres de profármaco o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Los derivados de ácido fenámico, ésteres de profármaco y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos comprenden: ácido enfenámico, etofenamato, ácido flufenámico, isonixina, ácido meclofenámico, meclofenamato de sodio, ácido medofenámico, ácido mefenámico, ácido niflúmico, talniflumato, terofenamato, ácido tolfenámico y ufenamato. También se pretende que estén incluidos en este grupo, los derivados de ácido fenámico relacionados estructuralmente que tienen propiedades analgésicas y anti-inflamatorias.
En una modalidad específica adicional, la presente invención se refiere al uso de un antagonista de IL-17RA-IL-17RB en combinación (pre-tratamiento, post-tratamiento o tratamiento concurrente) con cualquiera de uno o más de los derivados de ácido carboxílico, ésteres de profármaco o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Los derivados de ácido carboxílico, ésteres de profármaco, y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos los cuales pueden ser utilizados comprenden: clidanaco, diflunisal, flufenisal, inoridina, ketorolaco y tinoridina. También pretendemos que estén incluidos en este grupo los derivados del ácido carboxílico relacionados estructuralmente que tienen propiedades analgésicas y anti-inflamatorias similares.
Todavía en otra modalidad específica, la presente invención se refiere al uso de un antagonista de IL-17RA-IL-17RB en combinación (pre-tratamiento, post-tratamiento o tratamiento concurrente) con cualquiera de uno o más derivados de ácido butírico, ésteres de profármaco o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Los derivados de ácido butírico, ésteres de profármaco y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos comprenden: bumadizona, butibufeno, fenbufeno y xenbucina. También pretendemos que estén comprendidos por este grupo los derivados de ácido butírico relacionados estructuralmente que tienen propiedades analgésicas y anti-inflamatorias similares.
En otra modalidad específica, la presente invención se refiere al uso de un antagonista de IL-17RA-IL-17RB en combinación (pre-tratamiento, post-tratamiento o tratamiento concurrente) con cualquiera de uno o más oxicamos, ésteres de profármaco, o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Los oxicamos, ésteres de profármaco y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos comprenden: droxicamo, enolicamo, isoxicamo, piroxicamo, sudoxicamo, tenoxicamo y 4-hidroxíl-1 ,2-benzotiazina, 1,1-dióxido de 4-(N-fenil)-carboxamida. También pretendemos que estén incluidos por este grupo los oxicamos relacionados estructuralmente que tienen propiedades analgésicas y anti-inflamatorias similares.
Todavía en otra modalidad específica, la presente invención se refiere al uso de un antagonista de IL-17RA-IL-17RB en combinación (pre-tratamiento, post-tratamiento o tratamiento concurrente) con cualquiera de uno o más pirazoles, ésteres de profármaco, o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Los pirazoles, ásteres de profármaco y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos que pueden ser utilizados comprenden: difenamizol y epirizol. También pretendemos que estén comprendidos por este grupo los pirazoles relacionados estructuralmente que tienen propiedades analgésicas y anti-inflamatorias similares.
En una modalidad específica adicional, la presente invención se refiere al uso de un antagonista de IL-17RA-IL-17RB en combinación (pre-tratamiento, post-tratamiento o tratamiento concurrente) con cualquiera de uno o más pirazolonas, ásteres de profármaco, o sales farmacéuticamente aceptables del mismo. Las pirazolonas, los ésteres de profármaco y las sales farmacéuticamente aceptables del mismo los cuales pueden ser utilizados comprenden: apazona, azapropazona, benzpiperilona, feprazona, mofebutazona, morazona, oxifenbutazona, fenilbutazona, pipebuzona, propilfenazona, ramifenazona, suxibuzona y tiazolinobutazona. También pretendemos que estén comprendidos por este grupo las pirazolonas relacionadas estructuralmente que tienen propiedades analgésicas y antiinflamatorias similares.
En otra modalidad específica, la presente invención se refiere al uso de un antagonista de IL-17RA-IL-17RB en combinación (pre-tratamiento, post-tratamiento o tratamiento concurrente) con cualquiera de uno o más de los siguientes NSAIDs: ácido e-acetamidocaproico, S-adenosil-metioni na , ácido 3-amino-4-hidroxibutírico, amixetrina, anitrazafeno, antrafenina, bendazaco, lisinato de bendazaco, bencidamina, beprozina, broperamol, bucoloma, bufezolaco, ciprocuazona, cloximato, dazidamina, deboxamet, detomidina, difenpiramida, difisalamina, ditazol, emorfazona, mesilato de fanetizol, fenflumizol, floctafenina, flumizol, flunixina, fluprocuazona, fopirtolina, fosfosal, guaimesal, guayazolona, isonixirn, HCI de lefetamina, leflunomida, lofemizol, lotifazol, clonixinato de lisina, meseclazona, nabumetona, nictindol, nimesulida, orgoteina, orpanoxina, oxaceprol, oxapadol, paranilina, perisoxal, citrato de perisoxal, pifoxima, piproxeno, pirazolaco, pirfenidona, procuazona, proxazol, tielavina B, tiflamizol, timegadina, tolectina, tolpadol, triptamida y aquellos designados por el número de código de la compañía tales como 480156S1 AA861, AD1590, AFP802, AFP860, AI77B, AP504, AU8001, BPPC, BW540C, CHINOIN 127, CN100, EB382, EL508, F1044, FK-506, GV3658, ITF182, KCNTEI6090, KME4, LA2851, MR714, MR897, MY309, ON03144, PR823, PV102, PV108, R830, RS2131, SCR152, SH440, SIR133, SPAS510, SQ27239, ST281, SY6001, TA60, TAI-901 (ácido 4-benzoil-1-indancarboxilico), TVX2706, U60257, UR2301 y WY41770. También pretendemos que estén comprendidos por este grupo los NSAIDs relacionados estructuralmente que tienen propiedades analgésicas y anti-inflamatorias similares.
Todavía en otra modalidad específica, la presente invención se refiere al uso de un antagonista de IL-17RA-IL-17RB en combinación (pre-tratamiento, post-tratamiento o tratamiento concurrente) con cualquiera de uno o más corticoesteroides, esteres de profármaco o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos para el tratamiento de las enfermedades y padecimientos aquí mencionados. Los corticoesteroides, ésteres de profármacos y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos incluyen hidrocortisona y compuestos que son derivados de hidrocortisona, tales como 21 -acetoxipregnenolona, alclomerasona, algestona, amcinonida, beclometasona , betametasona, betametasona valerato, budesonida, cloroprednisona, clobetasol, propionato de clobetasol, clobetasona, butirato de clobetasona, clocortolona, cloprednol, corticosterona, cortisona, cortivazol, deflazacona, desonida, desoximerasona, dexametasona , diflorasona, diflucortolona, difluprednato, enoxolona, fluazacort, flucloronida, flumetasona, pivalato de flumetasona, acetonida de flucinolona, flunisolida, fluocinonida, acetonido de fluorocinolona, butil fluocortina, fluocortolona, hexanato de fluocortolona, valerato de diflucortolona, fluorometolona, acetato de fluperolona, acetato de fluprednideno, fluprednisolona, flurandenolida, formocortal, halcinonida, halometasona, acetato de halopredona, hidro-cortamato, hidrocortisona, acetato de hidrocortisona, butirato de hidrocortisona, fosfato de hidrocortisona, succinato de hidrocortisona 21-sódica, tebutato de hidrocortisona, mazipredona, medrisona, meprednisona, metilprednisolona, furoato de mometasona, parametasona, prednicarbato, prednisolona, diedriaminoacetato de prednisolona-21 , fosfato sódico de prednisolona, succinato sódico de prednisolona, m-sulfobenzoato sódico de prednisolona-21 , estearoglicolato de prednisolona sódica-21, tebutato de prednisolona, trimetilacetato de prednisolona-21, prednisona, prednival, prednilideno, prednilideno 21 -dietilaminoacetato, tixocortol, triamcinolona, acetonido de triamcinolona, benetonida de triamcinolona y hexacetonida de triamcinolona. También pretendemos comprender en este grupo los corticoesteroides relacionados estructuralmente que tienen propiedades analgésicas y anti-inflamatorias similares.
En otra modalidad específica, la presente invención se refiere al uso de un antagonista de IL-17RA-IL-17RB en combinación (pre-tratamiento, post-tratamiento o tratamiento concurrente) con cualquiera de uno o más fármacos anti-reumáticos de acción lenta (SAARDs) o fármacos antireumáticos modificadores de la enfermedad (DMARDs), ésteres, profármacos o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos para el tratamiento de las enfermedades y padecimientos aquí mencionados. Los SAARDs o DMARDs, ésteres de profármaco y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos comprenden: alocupreido sódico, auranofina, aurotioglucosa, aurotioglicanida, azatioprina, brequinar sódico, bucilamina, calcio 3-aurotio-2-propan-1 -sulfonato, clorambucil, cloroquina, clobuzarit, uproxolina, ciclofosfamida, ciclosporina, dapsona, 15-desoxispergualina, diacereina, glucosamina, sales de oro (por ejemplo, sal de cicloquina de oro, tiomalato de sodio de oro, tiosulfato de sodio de oro), hidroxicloroquina, sulfato de hidroxicloroquina, hidroxiurea, cebuzona, levamisol, lobenzarit, melitina, 6 -mercaptopurina, metotrexato, mizoribina, micofenolato mofetilo, mioral, mostaza de nitrógeno, D-penicilamina, imidazoles de piridinol tales como SKNF86002 y SB203580, rapamicina, tioles, timopoyetina y vincristina. SAARDs o DMARDs relacionados estructuralmente que tienen propiedades analgésicas y anti-inflamatorias similares también pretenden estar comprendidos por este grupo.
En otra modalidad específica, la presente invención está relacionada con el uso de un antagonista de IL-17RA-IL-17RB (pre-tratamiento, post-tratamiento o tratamiento concurrente) con cualquiera de uno o más inhibidores de COX2, ésteres de profármaco o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos para el tratamiento de las enfermedades y padecimientos aquí citados. Los ejemplos de los inhibidores de COX2, ésteres de profármaco o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos incluyen, por ejemplo, celecoxib. El COX2 relacionado estructuralmente que tiene propiedades analgésicas y anti-inflamatorias similares se pretenden también que sean comprendidos en este grupo. Los ejemplos de los inhibidores selectivos de COX-2 incluyen, pero no están limitados a etoricoxib, valdecoxib, celecoxib, licofelona, lumiracoxib, rofecoxib, y similares.
El tratamiento de las enfermedades y padecimientos aquí mencionados pueden incluir el uso de fármacos de primera línea para el control de las respuestas inflamatorias, tales como la capacidad de hiper-respuesta en las vías aéreas de un individuo afligido en combinación (pre-tratamiento, post-tratamiento o tratamiento concurrente) con el tratamiento con uno o más de los antagonistas de IL-17RA-IL-17RB aquí proporcionados. Los fármacos que son utilizados frecuentemente en el tratamiento de dichas enfermedades o padecimientos incluyen beta2 agonista, inhibidores de leucotrieno, metilxantinas, agentes anti-inflamatorios, agentes anticolinérgicos, broncodilatadores, corticoesteroides, y combinaciones de dichos agentes. La información con respecto a los siguientes compuestos puede ser encontrada en "El Manual Merck de Diagnosis y Terapia", 18a Edición, Merck, Sharp & Dohme Research Laboratories, Merck & Co., Rahway, N.J. (2006) y en Pharmaprojects, Publicaciones de PJB Ltd.
En una modalidad específica adicional, la presente invención se refiere al uso de un antagonista de IL-17RA-IL-17RB (pre-tratamiento, post-tratamiento o tratamiento concurrente) con cualquiera de uno o más agonistas beta-2, ásteres de profármaco o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos para el tratamiento de las enfermedades y padecimientos aquí mencionados. Los ejemplos de los agonistas de beta-2, ésteres de profármacos o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos incluyen, por ejemplo, albuterol (Accuneb®, Proair HFA®, Proventil® HFA, Ventolín HFA®), metaproterenol (Alupent®, Alupent® Solución de Inhalación, Alupent®), acetato de pirbuterol (Maxaír Autohaler®), y sulfato de terbutalina (Brethair®, Brethine®). Los agonistas de beta-2 de larga acción, algunos de los cuales son combinados con otros agentes (por ejemplo, Advair®, Symbicort®, Serevent® y Foradil®) también son conocidos, y son útiles en combinación con los antagonistas de IL-17RA-IL-17RB.
Una modalidad adicional de la presente invención se refiere al uso de un antagonista de IL-17RA-IL-17RB (pre-tratamiento, post-tratamiento o tratamiento concurrente) con cualquiera de uno o más inhibidores de leucotrieno, ésteres de profármaco o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos para el tratamiento de las enfermedades y padecimientos aquí descritos. Los ejemplos de los inhibidores de leucotrieno, ésteres de profármaco o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos incluyen por ejemplo, zileuton (Zyflo®), zafirlukast (Accolate®), y montelukast (Singulair®).
En una modalidad específica adicional, la presente invención se refiere al uso de un antagonista de IL-17RA-IL-17RB (pre-tratamiento, post-tratamiento o tratamiento concurrente) con cualquiera de una o más metilxantinas, ásteres de profármaco o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos para el tratamiento de las enfermedades y padecimientos aquí descritos. Los ejemplos de las metilxantinas, ésteres de profármaco o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos incluyen, por ejemplo, teofilina (por ejemplo, Bronkodyl®, Elixophyllin®, Slo-bid®, Slo-Phyllin®, Theo-24®, Theo-Dur®, Theolair®, Uniphyl®) y aminofilina (por ejemplo, Phyllocontin®, Truphylline®).
En otra modalidad específica, la presente invención se refiere al uso de un antagonista de IL-17RA-IL-17RB (pre-tratamiento, post-tratamiento o tratamiento concurrente) con cualquiera de uno o más agentes anti-inflamatorios, ésteres de profármaco o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos para el tratamiento de las enfermedades y padecimientos aquí descritos. Los ejemplos de dichos agentes anti-inflamatorios incluyen, pero no están limitados a, Cromolina (Nasalcrom®, Intal®, Opticrom®) y nedocromil (Tilade®).
Una modalidad adicional de la presente invención se refiere al uso de un antagonista de IL-17RA-IL-17RB (pre- tratamiento, post-tratamiento o tratamiento concurrente) con cualquiera de uno o más agentes anticolinérgicos, ésteres de profármaco o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos para el tratamiento de las enfermedades y padecimientos aquí descritos. Los ejemplos de dichos agentes anticolinérgicos, ésteres de profármaco o sales farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no están limitados a bromuro de ipratropio (Atrovent®) y tiotropio (Spiriva®).
En una modalidad específica adicional, la presente invención se refiere al uso de un antagonista de IL-17RA-IL-17RB (pre-tratamiento, post-tratamiento, o tratamiento concurrente) con cualquiera de uno o más corticoesteroides, ésteres de profármaco o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos para el tratamiento de las enfermedades y padecimientos aquí descritos. Los ejemplos de los corticoesteroides inhalados incluyen beclometasona dipropionato (Beclovent®, Beconase®, Vancenase®, y Vanceril®), acetonida de triamcinolona (Azmacort®, Nasacort®, Tri-Nasal®), y flunisolida (Aerobid®, Nasalide®). Los ejemplos de otros corticoesteroides útiles en la presente invención incluyen prednisona (Prednisone Intensol®, Sterapred®) y prednisolona (Orapred®, Pediapred®, Prelone®).
Todavía otra modalidad específica de la presente invención se refiere al uso de un antagonista de IL-17RA-IL-17RB (pre-tratamiento, post-tratamiento, o tratamiento concurrente) con cualquiera de uno o más de los agonistas beta-2 inhalados, ásteres de profármaco o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos para el tratamiento de una enfermedad o padecimiento aquí descrito. Los ejemplos de los corticoesteroides, esteres de profármaco o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos incluyen, por ejemplo, albuterol (Ventolín®, Proventil®), metaproterenol (Alupent®), acetato de pirbuterol (Maxair®), terbutalina (Brethine®, Brethaire®), ¡soetarina (Bronkosol®) y levalbuterol (Xopenex®).
En una modalidad específica adicional, la presente invención se refiere al uso de un antagonista de IL-17RA-IL-17RB (pre-tratamiento, post-tratamiento, o tratamiento concurrente) con cualquiera de uno o más broncodilatadores (o agentes anticolinérgicos), ésteres de profármaco o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos para el tratamiento de las enfermedades y padecimientos aquí descritos. Los ejemplos de los broncodilatadores incluyen ipratropio (Atrovent®) y tiotropio (Spiriva®).
El tratamiento de las enfermedades y padecimientos aquí descritos puede incluir el uso de fármacos de primera línea para el tratamiento o control de una enfermedad infecciosa en combinación (pre-tratamiento, post-tratamiento, o tratamiento concurrente) con el tratamiento con uno o más de los antagonistas de IL-17RA-IL-17RB aquí proporcionados. Los fármacos que son utilizados frecuentemente en el tratamiento de dichas enfermedades o padecimientos incluyen antibióticos, antimicrobiales, agentes antivirales, y combinaciones de los mismos. La información con respecto a los siguientes compuestos puede ser encontrada en "el Manual de Merck de Diagnosis y Terapia" (The Merck Manual of Diagnosis and Therapy), 18a Edición, Merck, Sharp & Dohme Research Laboratories, Merck & Co., Rahway, N.J. (2006) y en Pharmaprojects, PJB Publications Ltd.
Todavía en otra modalidad específica, la presente invención se refiere al uso de un antagonista de IL-17RA-IL-17RB en combinación (pre-tratamiento, post-tratamiento, o tratamiento concurrente) con cualquiera de uno o más antimicrobiales, ésteres de profármaco o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos para el tratamiento de las enfermedades y padecimientos aquí descritos. Los antimicrobiales incluyen, por ejemplo, la amplia clase de penicilinas, cefalosporinas y otros beta-lactamos, aminoglicósidos, azoles, quinolonas, macrolidos, rifamicinas, tetraciclinas, sulfonamidas, lincosamidas y polimixinas. Las penicilinas incluyen, pero no están limitadas a penicilina G, penicilina V, meticilina, nafcilina, oxacilina, cloxacilina, dicloxacilina, floxacilina, ampicilina, ampicilina/sulbactamo, amoxicilina, amoxicilin/clavulanato, hetacilina, ciclacilina, bacampicilina, carbenicilina, carbenicilina indanilo, ticarcilina, ticarcilina/clavulanato, azlocilina, mezlocilina, piperacilina, y mecilinamo. Las cefalosporinas y otros beta-lactamos incluyen, pero no están limitados a, cefalotiina, cefapirina, cefalexina, cefradina, cefazolina, cefadroxil, cefaclor, cefamandol, cefotetano, cefoxitina, ceruroxima, cefonicida, ceforadina, cefixima, cefotaxima, moxalactamo, ceftizoxima, cetriaxona, cefoperazona, ceftazidima, imipenemo y aztreonamo. Los aminoglicósidos incluyen, pero no están limitados a, estreptomicina, gentamicina, tobramicina, amicacina, netilmicina, canamicina y neomicina. Los azoles incluyen, pero no está limitados a fluconazol. Las quinolonas incluyen, pero no están limitadas a ácido nalidíxico, norfloxacina, enoxacina, ciprofloxacina, ofloxacina, esparfloxacina y temafloxacina. Los macrólidos incluyen, pero no están limitados a eritomicina, espiramicina y azitromicina. Las rifamicinas incluyen, pero no están limitadas a rifampina. Las tetraciclinas incluyen, pero no están limitadas a espiciclina, clortetraciclina, clomociclina, demeclociclina, desoxiciclina, guameciclina, limeciclina, mecloiclina, metaciclina, minociclina, oxitetraciclina, penimepiciclina, pipaciclina, rolitetraciclina , sanciclina, senociclina y tetraciclina. Las sulfonamidas incluyen pero no están limitadas a sulfanilamida, sulfametoxazol , sulfacetamida, sulfadiazina, sulfisoxazol y co-trimoxazol (trimetoprim/sulfametoxazol). Las lincosamidas incluyen, pero no están limitadas a clindamicina y lincomicina. Las polimixinas (polipéptidos) incluyen, pero no están limitadas a polimixina B y colistina. 4.0 Ensayos de Selección Las modalidades adicionales incluyen métodos de selección para los antagonistas del complejo receptor heteromérico IL-17RA-IL-17RB. Están contemplados los formatos de los ensayos de selección que son conocidos en la técnica y se pueden adaptar para identificar los antagonistas del complejo del receptor heteromérico IL-17RA-IL-17RB. Por ejemplo, un método de selección para un antagonista de un complejo receptor heteromérico IL-17RA-IL-17RB que comprende proporcionar un complejo del receptor heteromérico IL-17RA y un IL-17RB en un complejo receptor heteromérico IL-17RA-I L-17RB; expone un agente candidato a dicho complejo del receptor; y determina la cantidad de la formación del complejo de receptor en relación con no haber sido expuesto al agente candidato. El paso de exponer un agente candidato al complejo del receptor puede ser antes, durante, o después de que el IL-17RA e IL-17RB forma un complejo receptor heteromérico IL-17RA-IL-17RB.
Las modalidades adicionales incluyen un método de selección para un antagonista de la activación del complejo receptor heteromérico IL-17RA-IL-17RB, que comprende proporcionar un IL-17RA y un IL-17RB en un complejo del receptor heteromérico 17RA-I L-17RB; exponiendo un agente candidato a dicho complejo del receptor; agregando uno o más ligandos IL-17; y determinando la cantidad de activación del complejo receptor heteromérico IL-17RA-IL-17RB en relación por no haber sido expuesto al agente candidato. Los agentes candidatos que disminuyen la activación del complejo del receptor heteromérico IL-17RA-IL-17RB en la presencia de uno o más de los ligandos IL-17 ligandos, medido por una lectura biológicamente relevante (ver más adelante), se consideran positivo. El ligando IL-17 puede ser IL-17A, IL-17 F , IL-25 o cualquier otro ligando IL-17 que se enlaza y activa el IL-17RA, IL-17RB, o el complejo del receptor heteromérico IL-17RA-IL-17RB. La activación es definida en cualquier parte de esta descripción. Las lecturas biológicas relevantes incluyen IL-5, IL-6, IL-8, IL-13, CXCL1 , CXCL2, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, IL-1ß, TNFa, RANK-L, LIF, PGE2, IL-12, MMP3, MMP9, GROa, NO, así como cualquier otra molécula conocida en la técnica que va a ser liberada de cualesquiera células que expresan el IL-17RA y/o IL-17RB. El paso de exposición de un agente candidato al complejo receptor puede ser antes, durante o después de que IL-17RA e IL-17RB formen un complejo del receptor heteromérico IL-17RA-IL-17RB. Deberá quedar entendido que un agente candidato puede inhibir parcialmente el complejo del receptor heteromérico IL-17RA-IL-17RB, por ejemplo, menos del 100% de inhibición. Bajo ciertas condiciones de ensayo, un agente candidato puede inhibir completamente el complejo del receptor heteromérico IL-17RA-IL-17RB.
En un aspecto, la presente invención proporciona ensayos basados en células para detectar el efecto de los agentes candidatos en asociación con el IL-17RA y el IL-17RB, el complejo receptor heteromérico 17RA-IL-17RB, así como la activación del complejo receptor heteromérico 17RA-IL-17RB. Por lo tanto la presente invención proporciona la adición de agentes candidatos a las células para seleccionar los antagonistas del complejo receptor heteromérico 17RA-I L-17RB.
Los términos "agente candidato" o "fármaco candidato" como se usa en la presente descripción describe cualquier molécula, tal como, pero sin limitarse a péptidos, proteínas de fusión de péptidos (por ejemplo, péptidos que enlazan el IL-17RA, IL-17RB, o el complejo receptor heteromérico 17RA-IL-17RB que son covalentemente o no covalentemente enlazados a otras proteínas, tales como fragmentos de anticuerpos o plataformas basadas en proteínas conocidas en la técnica), proteínas, anticuerpos, moléculas orgánicas pequeñas incluyendo fármacos conocidos y candidatos de fármacos, polisacáridos, ácidos grasos, vacunas, ácidos nucleicos, etc., que pueden ser seleccionados por su actividad tal y como aquí se señalan.
Los agentes candidatos comprenden numerosas clases químicas. En una modalidad, el agente candidato es una molécula orgánica, preferentemente compuestos orgánicos pequeños que tienen un peso molecular no mayor de 100 y menor de aproximadamente 2,500 daltons. Están incluidos los compuestos orgánicos pequeños que tienen un peso molecular mayor de 100 y menos de aproximadamente 2,000 daltons, preferentemente menos de aproximadamente 1500 daltons, más preferentemente menos de aproximadamente 1000 daltons, y más preferentemente menos de aproximadamente 500 daltons. Los agentes funcionales comprenden grupos funcionales necesarios para la interacción estructural con proteínas, particularmente de enlace de hidrógeno, y generalmente incluyen por lo menos uno de un grupo amina, carbonilo, hidroxilo o carboxilo, preferentemente por lo menos dos de los grupos químicos funcionales. Los agentes candidatos con frecuencia comprenden estructuras cíclicas de carbono o heterocíclicas y/o estructuras aromáticas o poli-aromáticas substituidas por uno o más de los grupos funcionales anteriores. Los agentes candidatos también se encontraron en biomoléculas incluyendo péptidos, sacáridos, ácidos grasos, esteroides, purinas, pirimidinas, derivados, análogos estructurales o combinaciones de los mismos.
Los agentes candidatos son obtenidos de una amplia variedad de Fuentes incluyendo librerías de compuestos sintéticos o naturales. Por ejemplo, están disponibles numerosos medios para la síntesis aleatoria o dirigida de una amplia variedad de compuestos orgánicos y biomoléculas, incluyendo la expresión y/o síntesis de oligonucleótidos y péptidos aleatorizados. Alternativamente, las librerías de compuestos naturales en la forma de extractos bacteriales, micóticos, de plantas y animales están disponibles o se pueden producir fácilmente. Adicionalmente, las librerías producidas natural o sintéticamente y los compuestos son modificados fácilmente a través de medios químicos, físicos y bioquímicos convencionales. Los agentes farmacológicos conocidos pueden ser sometidos a las modificaciones químicas dirigidas o aleatorias, tales como acilación, alquilación, esterificación, amidificación para producir análogos estructurales.
En modalidades alternativas, los agentes bioactivos candidatos pueden ser proteínas o fragmentos de proteínas. Por lo tanto, por ejemplo, se pueden utilizar extractos celulares que contienen proteínas, o digeridos de extractos celulares proteináceos aleatorios o dirigidos. De esta manera se pueden hacer librerías de proteínas procarióticas o eucarióticas para la selección en los sistemas aquí descritos. En esta modalidad se encuentran incluidas las librerías de proteínas bacteriales, (nicóticas, vitales y de mamífero, incluyendo proteínas humanas.
En algunas modalidades, los agentes candidatos son péptidos. En esta modalidad, pueden ser útiles las construcciones de péptidos que incluyen una estructura de presentación. El término "estructura de presentación" o los equivalentes gramaticales en esta descripción significan una secuencia, la cual, cuando es fusionada con agentes bioactivos candidatos, ocasiona que los agentes candidatos asuman una forma restringida de conformación. Las proteínas interactúan entre ellas ampliamente a través de los dominios restringidos de conformación. Aunque los péptidos pequeños con terminales amino y carboxilo girando libremente pueden tener funciones potentes como es conocido en la técnica, la conversión de dichas estructuras de péptido en agentes farmacológicos es difícil debido a la falta de capacidad para pronosticar las posiciones de la cadena lateral para la síntesis de la imitación del péptido. Por lo tanto, la presentación de péptidos está en estructuras restringidas es su conformación se beneficiarán de la generación tardía de productos farmacéuticos y también es favorable que conduzcan a interacciones de afinidad más altas del péptido con la proteína objetivo. Este hecho ha sido reconocido en los sistemas de generación de librerías de combinación utilizando péptidos cortos generados biológicamente en sistemas de fagos bacteriales. Un número de trabajadores han construido moléculas de dominio pequeño en las cuales podría estar presente una de las estructuras péptidas aleatorizadas. Las estructuras particulares de presentación maximizan la capacidad de acceso al péptido presentándolo en un circuito exterior. Por consiguiente, las estructuras de presentación adecuadas incluyen, pero no están limitadas a, estructuras de minicuerpo, circuitos en las vueltas beta-hojas y estructuras de tallo-espiral enrollado en el cual los residuos no críticos para la estructura son aleatorizados, los dominios de dedo-zinc las estructuras enlazadas a cisteína (disulfuro) las estructuras enlazadas a transglutaminasa, los péptidos cíclicos, la estructura del B-circuito, barreras helicoidales o manojos, patrones de cierre de leucina, etc. Ver la Patente Norteamericana No. 6,153,380, incorporada a la presente descripción como referencia.
Son de uso particular en los ensayos de selección las bibliotecas de despliegue de fagos; consultar por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Nos. 5,223,409; 5,403,484; 5,571,698; y 5,837,500, todas ellas están expresamente incorporadas en su totalidad a la presente descripción como referencia para los métodos y construcciones del despliegue de fagos. En general, las librerías de despliegue de fagos pueden utilizar insertos de proteína sintética (por ejemplo, péptido), o pueden utilizar el cADN genómico, cADN digeridos, etc.
Dependiendo del ensayo y el resultado deseado, se pueden utilizar una amplia variedad de tipos de células, incluyendo células eucarióticas y procarióticas, con células de mamífero, y células humanas, que encuentran uso particular en la presente invención. En una modalidad, las células pueden ser diseñadas genéticamente, por ejemplo, ellas pueden contener ácidos nucleicos exógenos, tales como aquellos que codifican el IL-17RA y el IL-17RB. En algunos casos, las proteínas IL- 17RA y IL-17RB de la presente invención son diseñadas para incluir etiquetas tales como etiquetas del epítope, tales como pero sin limitarse a aquellas etiquetas para utilizarse en los ensayos de inmunoprecipitación o para otros usos.
Los agentes candidatos son agregados a las células y se permite que se incuben por un período de tiempo adecuado. El paso de exposición de un agente candidato al complejo receptor puede ser antes, durante o después de que el IL-17RA y el IL-17RB formen un complejo receptor heteromérico IL-17RA-IL-17RB. En una modalidad, la asociación del IL-17RA e IL-17RB es evaluada en la presencia y ausencia de los agentes candidatos. Por ejemplo, utilizando construcciones y anticuerpos etiquetados, se pueden hacer experimentos de inmunoprecipitación. Los agentes candidatos que interfieren con la asociación de IL-17RA e IL-17RB entonces son probados por la actividad de señalización del miembro de la familia del ligando IL-17 (tal como IL-17A e IL-17F), tal como probando por la expresión de genes que son activados por el miembro de la familia del ligando IL-17, como se mencionó anteriormente.
En algunas modalidades, las proteínas IL-17RA y/o IL-17RB son proteínas de fusión. Por ejemplo, las proteínas receptoras pueden ser modificadas de modo para formar moléculas quiméricas que comprenden una apoproteína (por ejemplo, una porción de proteína de una molécula o complejo quimérico) fusionada a otra, polipéptidos heterólogos o secuencia de aminoácidos. En una modalidad, dicha molécula quimérica comprende una fusión de uno o más receptores con un polipéptido de etiqueta el cual proporciona un epítope al cual se puede enlazar selectivamente el anticuerpo antietiqueta. La etiqueta del epítope generalmente está colocada en la terminal carboxilo o amino de la proteína receptora. La presencia de dichas formas etiquetadas del epítope del receptor pueden ser detectadas utilizando un anticuerpo contra el polipéptido de etiqueta. También, la provisión de la etiqueta del epítope hace posible que el polipéptido receptor sea purificado fácilmente por purificación de afinidad utilizando un anticuerpo anti-etiqueta y otro tipo de matriz de afinidad que se enlaza a la etiqueta del epítope. Estas etiquetas del epítope pueden ser utilizadas para la inmovilización a un soporte sólido, como aquí se señala.
Varios polipéptidos de etiqueta y sus anticuerpos respectivos son bien conocidos en la técnica. Los ejemplos incluyen las etiquetas de poli-histidina (poli-his) o p o I i -histidina-glicina (poli-his-gli); el polipéptido flu de etiqueta HA y su anticuerpo 12CA5 [Field y asociados, Mol. Cell. Biol., 8: páginas 2159 a 2165 (1988)]; la etiqueta c-myc y sus anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 y 9E10 a los mismos [Evan y asociados, Molecular and Cellular Biology, 5: páginas 3610 a 3616 (1985)]; y la glicoproteína D del virus de Herpes Simple (gD) y su anticuerpo [Paborsky y asociados, Protein Engineering, 3(6):páginas 547 a 553 (1990)]. Otros polipéptidos de etiqueta incluyen el péptido FLAGG™ [Hopp y asociados, BioTechnology, 6: páginas 1204 a 1210 (1988)]; el péptido del epítope KT3 [Martin y asociados, Science, 255: páginas 192 a 194 (1992)]; el péptido del epítope de tubulina [Skinner y asociados, J. Biol. Chem., 266: páginas 15163 a 15166 (1991)]; y la etiqueta del péptido de la proteína 10 del gen T7 [Lutz-Freyermuth y asociados, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 87: páginas 6393 a 6397 (1990)].
Se pueden hacer una variedad de vectores de expresión. Los vectores de expresión pueden ser ya sea vectores extracromosómicos que se auto-duplican o vectores los cuales se integran dentro del genoma huésped. Generalmente, estos vectores de expresión incluyen ácido nucleico regulador de transcripción y traducción enlazado de manera operable con el ácido nucleico que codifica la metaloproteína. El término "secuencias de control" se refiere a una secuencia de ADN necesaria para la expresión de una secuencia enlazada de manera operable a la secuencia de codificación en un organismo huésped particular. Las secuencias de control que son adecuadas para los procariotes, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia de operados y un sitio de enlace del ribosoma. Las células eucarióticas es sabido que utilizan promotores, señales de poliadenilación y aumentadores.
En algunas modalidades, la inhibición del enlace al complejo receptor heteromérico I L-17RA-I L- 17RB son ensayos que se operan in vitro. Por ejemplo, los componentes de la mezcla de ensayo (agente candidato, IL-17RA e IL-17RB) son inmovilizados en una superficie, los otros componentes son agregados (uno de los cuales es etiquetado en algunas modalidades). Por ejemplo, el IL-17RA o el IL-17RB pueden ser enlazados a una superficie, y se agrega un agente candidato y un IL-17RA y/o IL-17RB etiquetado. Después del lavado, la presencia de la etiqueta es evaluada. En esta modalidad, las proteínas IL-17RA e IL-17RB están localizadas tal y como se conoce en la técnica.
En general, el enlace generalmente se hará como es conocido en la técnica, y dependerá de la composición de los dos materiales que van a ser enlazados. En general, los enlazadores de adhesión son utilizados a través del uso de grupos funcionales de cada componente que puede ser utilizado para el enlace. Los grupos funcionales para el enlace son grupos amino, grupos carboxi, grupos oxo, grupos hidroxilo y grupos tiol. Estos grupos funcionales pueden entonces ser enlazados, ya sea directa o indirectamente a través del uso de un enlazador. Los enlazadores son bien conocidos en la técnica; por ejemplo, los enlazadores homo- o hetero-bifuncionales son bien conocidos (ver el catálogo de 1994 de Pierce Chemical Company, sección técnica sobre reticuladores, páginas 155 a 200, incorporada a la presente descripción como referencia). Los enlazadores de enlace incluyen, pero no están limitados a, grupos alquilo (incluyendo grupos alquilo substituidos y grupos alquilo que contienen porciones de heteroátomo), incluyendo grupos alquilo cortos, ásteres, amida, amina, grupos epoxi, y etilénglicol y derivados. Alternativamente, se utilizan asociados de fusión; los asociados de fusión adecuados incluyen otros componentes de inmovilización tales como etiquetas de histidina para el enlace a las superficies con componentes funcionales de níquel, para el enlace de los enlazadores y etiquetas, etc., y las etiquetas proteináceas.
En una modalidad, particularmente cuando los agentes candidatos son inmovilizados en un soporte sólido, un asociado de fusión adecuado es una etiqueta de proteína autofluorescente. Las etiquetas fluorescentes proteináceas adecuadas también incluyen, pero no están limitadas a, proteína fluorescente verde (GFP), incluyendo las especies Renilla, Ptilosarcus, o Aequorea de GFP (Chalfie y asociados, 1994, Science 263: páginas 802 a 805), EGFP (Clontech Laboratories, Inc., Genbank Número de Acceso U55762), proteína fluorescente azul (BFP, Quantum Biotechnologies, Inc. 1801 de Maisonneuve Blvd. West, 8,h Floor, Montreal, Quebec, Canadá H3H 1J9; Stauber, 1998, Biotechniques 24: páginas 462 a 471; Heim y asociados, 1996, Curr. Biol. 6: páginas 178 a 182), proteína fluorescente amarilla mejorada (EYFP, Clontech Laboratories, Inc.), luciferasa (Ichiki y asociados, 1993, J. Immunol. 150: páginas 5408 a 5417), ß galactosidasa (Nolan y asociados, 1988, Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 85: páginas 2603 a 2607) y Renilla (documentos W092/15673, WO95/07463, WO98/14605, W098/26277, WO99/49019, Patentes Norteamericanas Nos. 5292658, 5418155, 5683888, 5741668, 5777079, 5804387, 5874304, 5876995, 5925558). Todas las referencias citadas anteriormente están incorporadas expresamente como referencia en la presente descripción.
Los soportes insolubles se pueden hacer de cualquier composición a la cual pueden ser enlazadas las composiciones, y ser fácilmente separadas del material soluble, y de otra manera compatibles con el método general de selección. Las superficies de dichos soportes pueden ser sólidas o porosas y de cualquier forma conveniente.
Los ejemplos de los soportes incluyen placas de microtitulación, adaptaciones, membranas y cuentas, e incluyen pero no están limitadas a, vidrio y vidrio modificado o funcionalizados, plásticos (incluyendo acrílicos, poliestireno y copolímeros de estireno, y otros materiales, polipropileno, polietileno, polibutileno, poliuretanos, Teflon, etc.), polisacáridos, nylon o nitrocelulosa, resinas, sílice o materiales basados en sílice incluyendo silicón y silicón modificado, carbón, metales, vidrios inorgánicos, plásticos, cerámica, y una variedad de otros polímeros. En algunas modalidades, los soportes sólidos permiten la detección óptica y no fluorecen apreciablemente por ellos mismos. Además, como es conocido en la técnica, el soporte sólido puede ser recubierto con cualquier número de materiales, incluyendo polímeros, tales como dextranos, acrilamidas, gelatinas, agarosa, etc. Los soportes sólidos de ejemplo incluyen silicón, vidrio, poliestireno y otros plásticos y acrílicos. Las placas de microtitulación y las adaptaciones son especialmente convenientes debido a un número grande de ensayos que pueden ser llevados a cabo simultáneamente, utilizando cantidades pequeñas de reactivos y muestras. La manera particular de enlace de la composición no es crucial siempre que sea compatible con los reactivos y los métodos generales de la presente invención, mantenga la actividad de la composición y no se puedan esparcir.
Los agentes candidatos se ponen en contacto con otros componentes del ensayo bajo las condiciones de reacción que favorecen las interacciones agente-objetivo. Generalmente, estas serán las condiciones fisiológicas. Las incubaciones pueden ser llevadas a cabo en cualquier temperatura que facilite la actividad óptima, generalmente entre 4°C y 40°C. Los períodos de incubación son seleccionados para la actividad óptima, pero también pueden ser optimizados para facilitar la selección de producción alta. Generalmente, será suficiente entre 0.1 y 1 hora. El reactivo excedente generalmente es removido y lavado, en el caso de ensayos de fase sólida. Los formatos del ensayo se explican más adelante.
Una variedad de otros reactivos puede ser incluida en los ensayos. Estos incluyen, sales similares a reactivos, proteínas neutrales, por ejemplo, albúmina, detergentes, etc., que pueden ser utilizados para facilitar el enlace de apoproteína-agente y/o reducir las interacciones no específicas o de fondo. También los reactivos que mejoran de otra manera la eficiencia del ensayo, tales como inhibidores de proteasa, inhibidores de nucleasa, agentes anti-microbiales, etc., pueden ser utilizados. La mezcla de componentes puede ser agregada en cualquier orden que proporcione el enlace requerido.
En una modalidad, cualquiera de los ensayos aquí señalados puede utilizar sistemas robóticos para la selección de alta producción. Muchos sistemas están generalmente dirigidos al uso de placas de microtitulacion de 96 depósitos (o más), pero como podrá ser apreciado por aquellos expertos en la técnica, puede ser utilizado cualquier número de placas o configuraciones diferentes. Además, cualquiera o todos los pasos aquí señalados pueden ser automatizados; por lo tanto, por ejemplo, los sistemas pueden ser completamente o parcialmente automatizados.
Como lo podrán apreciar los expertos en la técnica, existe una variedad amplia de componentes que pueden ser utilizados, incluyendo, pero sin limitarse a, uno o más brazos robóticos; manejadores de placas para la colocación de microplacas; manejadores de etapas automatizados para remover o reemplazar las tapas para los depósitos en placas que no tienen contaminación cruzada; ensambles de puntas para la distribución del ensamble con puntas desechables; ensambles de punta que se pueden lavar para la distribución de muestras; bloques de carga de 96 depósitos; rejillas de reactivo enfriadas; posiciones de la pipeta de la placa de microtitulación (opcionalmente enfriada); torres de apilado para placas y puntas; y sistemas de cómputo.
Los sistemas completamente robóticos o microfluídicos incluyen el manejo de células y organismos, partículas, y líquidos automatizados incluyendo el envase en pipetas de alta producción para realizar todos los pasos de las aplicaciones de selección. Este incluye manipulaciones de líquidos, partículas, células y organismos tales como la espiración, abastecimiento, mezcla, dilución, lavado, transferencia volumétrica exacta, recuperación y descarte de las puntas de pipetas; el envase en pipetas repetitivo de volúmenes idénticos para administraciones múltiples de una sola aspiración de la muestra. Estas manipulaciones son de líquido libre de contaminación cruzada, partículas, células, y transferencias de organismos. Este instrumento realiza una duplicación automatizada de las muestras de microplacas para los filtros, membranas, y/o placas hijas, transferencias de alta densidad, diluciones en serie de placa completa, y operación de alta capacidad.
En una modalidad, se utilizan partículas, placas, tubos, partículas magnéticas, u otra matriz de fase sólida derivadas químicamente con especificidad para los componentes del ensayo. Las superficies de enlace de las microplacas, tubos y cualesquiera matrices de fase sólida incluyen superficies no polares, superficies altamente polares, recubrimiento de dextrano modificado para promover el enlace covalente, recubrimiento de anticuerpos, medios de afinidad para el enlace de proteínas de fusión o péptidos, proteínas fijadas a la superficie tales como proteínas recombinantes A o G, resinas o recubrimientos de nucleótidos, y otras matrices de afinidad son útiles en la presente invención.
En una modalidad, las plataformas para las placas de depósitos múltiples, tubos múltiples, minitubos, placas de depósitos profundos, tubos de microfuga, criofrasos, placas de depósito cuadradas, filtros, hojuelas, fibras ópticas, cuentas y otras matrices de fase sólida o plataformas con varios volúmenes son acomodadas en una plataforma modular que se puede activar para capacidad adicional. Esta plataforma modular incluye un agitador orbital de velocidad variable, un electroporador, y mesas de trabajo de posiciones múltiples para las muestras de fuentes, dilución de muestras y reactivos, placas de ensayo, depósitos de muestras y reactivos, puntas de pipetas y una estación de lavado activa.
En una modalidad, se utilizan sistemas termocicladores y termo-reguladores para estabilizar la temperatura de los intercambiadores de calor tales como los bloques o plataformas controlados para producir el control de temperatura exacto de las muestras de incubación de 4°C a 100°C.
En algunas modalidades, la instrumentación incluirá un detector, el cual puede se una amplia variedad de detectores diferentes, dependiendo de las etiquetas y el ensayo. En una modalidad, los detectores útiles incluyen un microscopio con canales múltiples de fluorescencia; lectores de placa para producir la detección electrofotométrica fluorescente y visible con puntos finales de una sola longitud de onda o longitud de onda doble y capacidades de cinética, transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET), sistemas SPR, luminiscencia, extinción, excitación de dos fotones, y redistribución de intensidad; cámaras CCD para capturar y transformar los datos e imágenes en formatos que se pueden cuantificar; y una estación de trabajo de computadora. Estos harán posible el monitoreo del tamaño, el crecimiento y expresión fenotípica de los marcadores específicos en células, tejidos y organismos; la validación objetivo; optimización conducida; análisis de datos, mineralización, organización e integración de selecciones de alta producción con bases de datos públicas y de propiedad privada.
El complejo receptor heteromérico 17RA-IL-17RB es una forma biológicamente activa del receptor y ha mostrado en el presente experimento que responde a la activación específica del ligando mediante la liberación de portadores pro-inflamatorios. Es sabido en la técnica que varias condiciones de enfermedad, como aquí se ejemplifica, están asociadas con los niveles fisiológicos aumentados de los miembros de la familia del ligando IL-17. En una modalidad, las proteínas de enlace del antígeno IL-17RA-IL-17RB son útiles para detectar los complejos del receptor heteromérico IL-17RA-IL-17RB en muestras biológicas e identificación de células o tejidos que expresan dicho complejo. Esto sería de un valor considerable para la comunidad investigadora.
Las proteínas de enlace del antígeno de la presente invención pueden ser utilizadas con propósitos de diagnóstico, para detectar, diagnosticar, o monitorear enfermedades y/o padecimientos asociados con el receptor IL-17 o el IL-17RA o IL-17RB. La presente invención proporciona la detección de la presencia del receptor IL-17 en una muestra utilizando métodos inmunohistológicos clásicos conocidos para los expertos en la técnica (por ejemplo, Tijssen, 1993, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, vol. 15 (Eds R. H. Burdon y P. H. van Knippenberg, Elsevier, Amsterdam); Zola, 1987, "Anticuerpos Monoclonales: Un Manual de Técnicas" (Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques), páginas 147 a 158 (CRC Press, Inc.); Jalkanen y asociados, 1985, J. Cell. Biol. 101: páginas 976 a 985; Jalkanen y asociados, 1987, J. Cell Biol. 105: páginas 3087 a 3096). La detección del receptor IL-17 puede llevarse a cabo in vivo o in vitro.
Las aplicaciones de diagnóstico aquí proporcionadas incluyen el uso de proteínas de enlace del antígeno para detectar la expresión de las proteínas IL-17, IL-17RA e IL-17RB y el enlace de los ligandos al receptor IL-17. Los ejemplos de los métodos útiles en la detección de la presencia del receptor IL-17 incluyen inmuno-ensayos, tales como el ensayo inmuno-absorbente enlazado a la enzima (ELISA) y el radio-inmunoensayo (RIA). Como se señaló anteriormente, el uso de co-inmunoprecipitación es muy útil para detectar el complejo receptor heteromérico IL-17RA-IL-17RB. Para aplicaciones de diagnóstico, la proteína de enlace del antígeno generalmente puede ser etiquetada con un grupo de etiquetación que se puede detectar tal como aquí se ha definido.
Un aspecto de la presente invención proporciona la identificación de una célula o células que expresan el complejo receptor heteromérico IL-17RA-IL-17RB. En una modalidad específica, la proteína de enlace del antígeno es etiquetada con un grupo de etiquetación y el enlace de la proteína de enlace del antígeno etiquetada al receptor de IL-17 es detectada. En una modalidad específica adicional, el enlace de la proteína de enlace del antígeno al receptor de IL-17 es detectada in vivo.
En una modalidad específica adicional, el receptor IL-17 de proteína de enlace del antígeno es aislado y medido utilizando las técnicas conocidas en el arte. Consultar, por ejemplo, Harlow y Lañe, 1988, "Anticuerpos: Un Manual de Laboratorio" (Antibodies: A Laboratory Manual), New York: Cold Spring Harbor (ed. 1991 y suplementos periódicos); John E. Coligan, ed., 1993, Current Protocols In Immunology, New York: John Wiley & Sons. 5.0 Elaboración de antagonistas IL-17RA-IL-17RB Las células huésped adecuadas para la expresión de los antagonistas de IL-17RA-IL-17RB incluyen células procarióticas, levadura, o eucarióticas más altas. Se describen la clonación y los vectores de expresión apropiados para utilizarse con células huésped, bacteriales, micóticas, de levadura y de mamífero, por ejemplo, revisar el libro de Pouwels y asociados, "Vectores de Clonación: Un Manual de Laboratorio" (Cloning Vectors: A Laboratory Manual), Elsevier, New York, (1985). Los sistemas de producción de célula libre también podrían ser empleados para producir los polipéptidos LDCAM utilizando los ARNs derivados de las construcciones de ADN aquí descritas.
Los procariotes incluyen, organismos gram negativos y positivos, por ejemplo, E. coli o Bacilli. Las células huésped procarióticas adecuadas para la transformación incluyen, por ejemplo, E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium , y varias otras especies dentro de los géneros Pseudomonas, Streptomyces, y Staphylococcus. En una célula huésped procariótica, tal como E coli, un antagonista de IL-17RA-IL-17RB puede incluir un residuo de metionina de la terminal N para facilitar la expresión del polipéptido recombinante en la célula huésped procariótica. El Met de la terminal N puede ser disociado del antagonista de IL-17RA- IL-17RB recombinante expresado.
Los antagonistas de IL-17RA-IL-17RB pueden ser expresados en células huésped de levadura, preferentemente del género Saccharomyces (por ejemplo, S. cerevisiae). También se pueden emplear otros géneros de levadura, tales como Pichia, K. lactis o Kluyveromyces. Los vectores de levadura con frecuencia contendrán una secuencia de origen de duplicación del plásmido de levadura 2µ, una secuencia de duplicación autónoma (ARS), una región promotora, secuencias para la poli-adenilación, secuencias para la terminación de transcripción, y gen marcador que se puede seleccionar. Las secuencias del promotor adecuado para los vectores de levadura incluyen, entre otros, promotores para metalotioneina, 3-fosfogliceratp cinasa (Hitzeman y asociados, J. Biol. Chem. 255: página 2073, 1980) u otras enzimas glicolíticas (Hess y asociados, J. Adv. Enzyme Reg. 7: página 149, 1968; y Holland y asociados, Biochem. 17: página 4900, 1978), tales como enolasa, deshidrogenasa de gliceraldehído-3-fosfato, hexocinase, descroboxilasa de piruvato, fosfofructocinasa, ¡somerasa de glucosa-6-fosfato, mutasa de 3-fosfoglicerato, cinasa de piruvato, ¡somerasa de triosefosfato, ¡somerasa de fosfoglucosa, y glucocinasa. Otros vectores y promotores adecuados para utilizarse en la expresión de levaduras se describen adicionalmente en Hitzeman, la Patente Europea EPA-73,657 o en la publicación de Fleer y asociados, en Gene, 107: páginas 285 a 295 (1991); y van den Berg y asociados, Bio/Technology, 8: páginas 135 a 139 (1990). Otra alternativa es el promotor de ADH2 que se puede reprimir con glucosa descrito por Russell y asociados (J. Biol. Chem. 258: página 2674, 1982) y Beier y asociados (Nature 300: página 724, 1982). Los vectores de puente que se pueden duplicar en ambos como la levadura y E. coli pueden ser construidos insertando secuencias de ADN del pBR322 para la selección y duplicación de E. coli (el gen Ampr y origen de duplicación) dentro de los vectores de levadura anteriormente descritos.
La secuencia líder del factor-a de levadura puede ser empleada para dirigir la secreción del antagonista de IL-17RA-IL-17RB. La secuencia líder del factor-a con frecuencia es insertada entre la secuencia promotora y la secuencia del gen estructural. Ver por ejemplo, Kurjan y asociados, Cell 30: página 933, 1982; Bitter y asociados, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 81: página 5330, 1984; la Patente Norteamericana No. 4,546,082; y la Patente Europea EP 324,274. Otras secuencias líder adecuadas para facilitar la secreción de los polipéptidos recombinantes de los huéspedes de levadura son conocidas para los expertos en la técnica. Una secuencia líder puede ser modificada cerca de su extremo 3' para que contenga uno o más sitios de restricción. Esto facilitará la fusión de la secuencia líder al gen estructural.
Los protocolos de transformación de levadura son bien conocidos para los expertos en la técnica. Uno de dichos protocolos se describen Hinnen y asociados, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 75: página 1929, 1978. El protocolo de Hinnen y asociados, selecciona los transformantes Trp+ en un medio selectivo, en donde el medio selectivo consiste de 0.67% de levadura de nitrógeno básico, ácidos casamino al 0.5%, glucosa al 2%, 10 pg/ml de adenina y 20 pg/ml de uracilo. Las células huésped de levadura transformadas por los vectores que contienen la secuencia promotora ADH2 pueden ser cultivados para inducir la expresión de un medio "rico". Un ejemplo de un medio rico es uno que consiste de extracto de levadura al 1%, peptona al 2% y glucosa al 1% suplementada con 80 g/ml de adenina y 80 g/ml de uracilo. La des-represión del promotor ADH2 ocurre cuando la glucosa es agotada del medio.
Los sistemas de cultivo de células huésped en mamífero o insecto también podrían ser empleadas para expresar los antagonistas de IL-17RA-IL-17RB recombinantes. Los sistemas de baculovirus para la producción de proteínas heterologas en células de insectos los revisan Luckow y Summers, Bio/Technology 6: página 47 (1988). También se pueden emplear las líneas celulares establecidas de origen de mamífero. Los ejemplos de las líneas celulares huésped de mamífero adecuadas incluyen la línea COS-7 de las células de riñon de mono (ATCC CRL 1651) (Gluzman y asociados, Cell 23: página 175, 1981), Las células L, células C127, células 3T3 (ATCC CCL 163), células de ovario de hámster Chino (CHO), células HeLa, y las líneas de células BHK (ATCC CRL 10), y las líneas de células CV-1/EBNA-1 derivadas de las líneas celulares de riñon del mono verde Africano CVI (ATCC CCL 70) como lo describen McMahan y asociados., en (EMBO J. 10: página 2821 , 1991 ).
Las secuencias de control de transcripción y traducción para los vectores de expresión de las células huésped de mamífero pueden ser cortadas de genomas virales. Las secuencias promotoras generalmente utilizadas y las secuencias mejoradoras son derivadas del virus Polyoma, Adenovirus 2, Virus de Simio 40 (SV40), y citomegalovirus humano. Las secuencias de ADN derivadas del genoma viral SV40, por ejemplo, origen SV40, promotor temprano o tardío, mejorador, mejoradores, de empalme, sitios de poliadenilación pueden ser utilizados para producir otros elementos genéticos para la expresión de la secuencia de gen estructural en una célula de mamífero. Los promotores virales tempranos o tardíos son particularmente útiles debido a que ambos son obtenidos fácilmente de un genoma viral como un fragmento el cual puede también contener un origen de duplicación viral (Fiers y asociados, Nature 273: página 113, 1978). También están incluidos los fragmentos más pequeños o más grandes de SV40 que pueden ser utilizados, siempre que la secuencia sea de aproximadamente 250 bp que se extiende desde el sitio Hind III hacia el sitio Bg/1 localizado en el origen de duplicación viral SV40.
Los vectores de expresión de ejemplo para utilizarse en células huésped de mamífero pueden ser construidos como lo describen Okayama y Berg (Mol. Cell. Biol. 3: página 280, 1983). Un sistema útil para la expresión de alto nivel estable de los cADNs de mamífero en las células del epitelio mamario múrido C127 pueden ser construidos substancialmente como lo describen Cosman y asociados, en (Mol. Immunol. 23: página 935, 1986). Un vector de expresión altamente útil, el PMLSV N1/N4, descrito por Cosman y asociados, Nature 312: página 768, 1984 ha sido depositado con el número de depósito ATCC 39890. Los vectores de expresión de mamífero útiles adicionales se describen en la Patente Europea EP-A-0367566, y en la Solicitud de Patente Norteamericana Serie No. 07/701,415, presentada en Mayo 16, 1991, incorporadas a la presente descripción como referencia. Los vectores pueden ser derivados de retrovirus. En lugar de una secuencia de señal natural, o además de una metionina iniciadora, puede ser agregada la secuencia de señal heteróloga tal como la secuencia de señal para el IL-7 descrito en la Patente Norteamericana No. 4,965,195; la secuencia de señal para el receptor IL-2 descrita en la publicación de Cosman y asociados, en Nature 312: página 768 (1984); el péptido de señal IL-4 descrito en la Patente Europea EP 367,566; el receptor IL-1 tipo I de señal de péptidos descritos en la Patente Norteamericana No. 4,968,607; y el péptido de señal receptor IL-1 tipo II descrito en la Patente Europea EP 460,846.
Los antagonistas de IL-17RA-IL-17RB como una proteína aislada, purificada u homogénea de acuerdo con la presente invención, pueden ser producidos mediante sistemas de expresión recombinante como se describieron anteriormente o purificados de células que ocurren de manera natural.
Un proceso para la producción de antagonistas de IL- 17RA-IL-17RB comprende el cultivo de una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende la secuencia de ADN que codifica por lo menos un antagonista de IL-17RA-IL-17RB bajo condiciones suficientes para promover la expresión de dicho antagonista de IL-17RA-IL- 7RB. El antagonista de IL-17RA-IL-17RB entonces es recuperado del medio de cultivo o extractos celulares, dependiendo del sistema de expresión empleado. Como es conocido para los expertos en la técnica, los procedimientos para purificar una proteína recombinante variarán de acuerdo con factores tales como el tipo de célula huésped empleado y si la proteína recombinante es secretada o no dentro del medio de cultivo. Por ejemplo, cuando se emplean los sistemas de expresión que secretan la proteína recombinante, el medio de cultivo primero puede ser concentrado utilizando un filtro de concentración de proteína disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Después del paso de concentración, el concentrado puede ser aplicado a una matriz de purificación tal como un medio de filtración de gel. Alternativamente, se puede emplear una resina de intercambio de aniones, por ejemplo, una matriz o substrato que tiene grupos dietilaminoetilo (DEAE) pendientes. Las matrices pueden ser acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa u otros tipos empleados generalmente en la purificación de proteínas. Alternativamente, puede ser empleado el paso de intercambio de cationes. Los intercambiadores de cationes adecuados incluyen varias matrices insolubles que comprenden grupos sulfopropilo y carboximetilo. Finalmente, uno o más pasos de cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa (RP-HPLC) que emplean medios RP-HPLC hidrofóbicos, (por ejemplo, gel de sílice que tiene grupos metilo pendientes u otros grupos alifáticos) pueden ser empleados para purificar adicionalmente los antagonistas de IL-17RA-IL-17RB. Alguno o todos los pasos de purificación anteriores, en diferentes combinaciones son bien conocidos y pueden ser empleados para producir una proteína recombinante substancialmente homogénea.
Es posible utilizar la columna de afinidad que comprende las proteínas del complejo receptor heteromérico de IL-17RA, o IL-17RB, o ambas el IL-17RA y el IL- 17RB, o una IL-17RA-IL-17RB para los antagonistas de IL-17RA-IL-17RB expresados por pureza-afinidad. Los antagonistas de IL-17RA-IL-17RB pueden ser removidos de una columna de afinidad utilizando técnicas convencionales, por ejemplo, en un regulador de elución de alta sal y luego dializado en un regulador de menos sal para utilizarse o cambiar el pH u otros componentes dependiendo de la matriz de afinidad utilizada. Alternativamente, la columna de afinidad puede comprender un anticuerpo que enlaza los antagonistas de IL-17RA-IL-17RB.
La proteína recombinante producida en el cultivo bacterial puede ser aislada mediante la interrupción inicial de la célula huésped, la centrifugación, extracción gránulos de células y un péptido insoluble, o de un fluido sobrenadante si un péptido soluble, seguido por uno o más pasos de concentración, des-salado, intercambio de iones, purificación de afinidad o cromatografía de exclusión por tamaño. Finalmente, se puede emplear la RP-HPLC para los pasos finales de purificación. Las células microbiales pueden ser interrumpidas por cualquier método convencional, incluyendo la congelación-descongelado, ciclado, sonicación, interrupción mecánica, o el uso de agentes de Usado de células.
Las células huésped de levadura transformadas pueden ser empleadas para expresar los antagonistas de IL-17RA-IL-17RB como un polipéptido secretado con el objeto de simplificar la purificación. El polipéptido recombinante secretado de una fermentación de célula huésped de levadura puede ser purificada mediante métodos análogos a los descritos por Urdal y asociados. 1984, en J. Chromatog. 296: página 171. Urdal y asociados, describen dos pasos consecutivos de HPLC de fase inversa para la purificación del IL-2 humano recombinante en una columna de HPLC preparatoria.
Todas las referencias citadas dentro del cuerpo de la presente invención están incorporadas expresamente a la misma como referencia en su totalidad. Los ejemplos siguientes, tanto reales como proféticos, se proporcionan con el propósito de ilustrar las modalidades específicas o características de la presente invención y no limitan su alcance.
EJEMPLOS El anticuerpo policlonal humano IL-17RD.HIS, y el anti-hlL-17RA de cabra, el anticuerpo policlonal anti-hlL-17RB de cabra, el anticuerpo policlonal anti-hlL-17RC de cabra, y todos los equipos del análisis de ELISA fueron obtenidos en R & D Systems (Minneapolis, MN) y utilizados de acuerdo con las especificaciones del fabricante. El IL-13 múrido fue obtenido en Invitrogen Biosource (Carlsbad, CA). La albúmina de suero múrida (MSA) fue obtenida en Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Los anticuerpos monoclonales contra los IL-25, IL-17RA e IL-17RB humano y de ratón fueron generados substancialmente como lo describen Yao y asociados. (Yao, y asociados, 1995, de Immunity 3: páginas 811 a 821; Yao, y asociados, 1995, J. Immunol. 155: páginas 5483 a 5486; Yao, 1997, Cytokine 9: páginas 794 a 800). Los cADNs que codifican el IL-17RA humano y de ratón han sido descritos anteriormente (consultar las tres referencias Yao, mencionadas anteriormente). El IL-17RB humano y de ratón codifica los cuadros de lectura abierta idénticos a los descritos anteriormente (Tian, y asociados, 2000, Oncogene 19(17): páginas 2098 a 2109). Los cADNs que codifican el IL-25 múrido han sido descritos anteriormente (Hurst, y asociados, 2002, J Immunol. 169(1): páginas 443 a 453.). El IL-25 múrido fue expresado en E.coli y purificado como lo describieron (Hurst y asociados, mencionado anteriormente). La región extracelular del IL-17RA humano fue fusionada a cualquiera de poli HIS o el IgGI de Fe humano (IL-17RA:HIS o IL-17RA:Fc, respectivamente); la región extracelular del IL-17RB humano fue fusionada a cualquier poli HIS (IL-17RB.HIS) o IgGI del Fe humano (IL-17RB.Fc) substancialmente como lo describen Yao, y asociados, 1995, Immunity (mencionado anteriormente). En algunos experimentos, se utilizaron IL-25, IL-17RA Fe, y IL-17RB Fe múridos y humanos que se consiguen comercialmente (R & D Systems).
Ejemplo 1 Este ejemplo demuestra el requerimiento de IL-17RB para una respuesta in vivo del IL-25. El anticuerpo IL-17RB-/-ratón fue generado utilizando métodos que son conocidos en la técnica. Brevemente, el vector de objetivo del gen fue construido reemplazando la secuencia genómica que contiene el exon 3 del IL-17RB múrido por un cassette PGKneo. Un cassette de cinasa de timidina (MC-TK) fue insertado dentro del extremo 5' del vector. 129 células madre embrionarias derivadas (ES) fueron electroporadas con el vector objetivo y seleccionadas en la presencia de G418 y ganciclovir como lo describen (Kolls, J, y asociados. 1994. en Proc. Nati. Acad. Sci. EUA. 91: páginas 215 a 219). Los clones ES portadores de la mutación del objetivo en IL-17RB fueron identificadas por una combinación de análisis de PCR y Southern blot genómico y fueron inyectados en blastoquistes Negros Suizos. Las quimeras macho fueron cruzadas con las hembras Negras Suizas para generar heterozigos de ratón para la mutación IL-17RB las cuales fueron entrecruzadas posteriormente para generar los ratones deficientes de IL-17RB. Estos ratones fueron movidos a un fondo C57BL/6 mediante 5 cruces de retroceso a los ratones C57BL/6, utilizando la tecnología de Cruces Posteriores Acelerados Ayudados por Marcador (MAX-BAXSM) (Charles River Laboratories, Wilmington, MA). Los ratones que fueron identificados que eran C57BL/6 de 99.5% fueron utilizados para establecer una colonia de crianza para producir ratones para uso experimental.
A los ratones C57BL/6 de control (WT) o IL-17RB-/-ratones (KO) se les dieron 50 microL de MSA (Sigma-Aldrich, St. Louis MO; 10 microgramos/mL) IL-25 de ratón (Amgen; 10 microgramos/mL) intranasalmente (IN), una vez por día durante cuatro días, substancialmente como lo describieron Hurst, y asociados (J. Immunol. 169: página 443, 2002). En el día 5, el fluido del lavado bronquioalveolar (BALF) y el tejido del pulmón fueron recolectados de los ratones y analizados.
El lavado bronquioalveolar (BAL) fue realizado entubando los ratones anestesiados con 300 microL de inyección IP de Avertina al 2.5% (2-2-2-tribromoetanol, Sigma) y nivelando los pulmones con dos volúmenes de 600 microL de PBC de Dulbecco de baño helado (Gibco). Las células del fluido BAL fueron granuladas mediante centrifugación a 1000 rpm durante 10 minutos, y se volvieron a suspender con suero fetal bovino al 5% + PBS (FBS; HyClone; Logan, UT) para el conteo y análisis de la celularidad de leucocitos totales así como los cambios en los números de varios tipos de células utilizando la máquina de hematología ADVIA® 120 (un analizador de mesa para procesar y analizar muestras de hematología; Siemens Diagnostics, Tarrytown, NY). El BALF también fue probado para las concentraciones de proteína IL-5 e IL-13 mediante el análisis de ELISA (R&D Systems; límite de detección: IL-5, 31 pg/mL; IL-13, 62 pg/mL).
Los niveles de mARNs para los diferentes portadores inflamatorios en los tejidos del pulmón fueron determinados mediante la expresión TaqMan® (un método de reacción de cadena de polimerasa de tiempo real rápido, basado en fluoroforo que utiliza los cebadores TaqMan® de ensayos a petición (Applied Biosystems, Foster City, CA), substancialmente como se describieron anteriormente (Hartel, C, y asociados, 1999 Scand.J. Immunol. 49(6): páginas 649 a 654). El análisis TaqMan® fue realizado en el sistema ABI Prism 7900HT Rápido RT-PCR (Applied Biosystems). La expresión relativa de cada gen a beta-actina, la expresión del gen HPRT, o GAPDH en cada grupo del tratamiento fue determinada mediante el Sistema de Detección de Secuencia 2.2.3 (Applied Biosystems). Los resultados de dos experimentos separados se muestran en las Tablas de la 1 a la 4 siguientes.
Tabla 1: Análisis de la celularidad BALF, las concentraciones de IL-5, y las concentraciones de IL-13 y en el IL-17RB de los ratones KO y WT que se dosificaron intranasalmente con el IL-25 N= 5/grupo; los valores mostrados son (promedio±DE); las muestras debajo del rango de detección en el análisis de ELISA de IL-5 se les asignó un valor de 31 pg/mL.
Tabla 2: Análisis de los mARNs de IL-5, IL-13, e IL- 17RA, en IL-17RB de los pulmones de los ratones KO y WT en respuesta al desafío de IN IL-25 IL-17RB KO, 0.000419010.0003338 0.006084±0.007098 0.02895±0.009634 MSA WT, IL-25 0.001011±0.0002767 0.02066±0.005046 N/A IL-17RB KO, 2.310e-005±1.173e-005 3.146e-005±2.068e-005 N/A IL-25 N= 5/grupo; los valores mostrados son (promedio±DE); los valores de IL-5 e IL-13 mostrados son la expresión de gen en relación con la ß-actina (2E-ACt) (promedio ± DE). Los valores de IL-17RA mostrados son expresiones del gen en relación con HPRT (2E-ACt) (promedio ± DE). N/A = No analizado Los ratones IL-17RB KO con un experimento de desafío de IL-25 intranasal fueron repetidos y substancialmente de la misma manera, con la adición de un brazo de desafío de interleucina-13 de rata (IL-13; Invitrogen Biosource™, Carlsbad, CA; dosificado una vez al día durante 4 días, con 50 microL en 10 microgramos/mL); los resultados se muestran en las Tablas 3 y 4 siguientes.
Tabla 3: Análisis de celularidad del BALF en el IL-17RB ratones KO y WT en respuesta a un desafío IN con IL-13 o IL-25 N= 5/grupo; los valores mostrados son (promedio±DE) Tabla 4: Análisis de los mARNs de IL-5, IL-13, eotaxina, MCP-1, IL-9, IL-10, IL-17A, e IL-17RA en el IL-17RB de pulmones de ratón KO y WT en respuesta con el dasafío IN de IL-25 N= 4 pulmones de ratones individuales; los valores mostrados son expresión del gen en relación con el HPRT (2E-ACt) (promedio±DE) Para los experimentos de histopatología del pulmón, los ratones fueron eutanizados con asfixia por C02. Los pulmones fueron recolectados, fijados en formalina regulada neutral al 10% (NBF), procesadas, seccionadas en tamaños de 6 mieras y teñidas con hematoxilina y eosina (H&E) o una tinción Schiff de ácido periódico (PAS) substancialmente como los describen (Harkema, J. R., y J. A. Hotchkiss, Am. J. Pathol. 141: página 307; 1992); la escala de calificación utilizada para analizar las secciones del tejido se muestra más adelante para cuatro categorías diferentes. La calificación promedio de inflamación total para cada grupo se reporta en la Tabla 5.
Tabla 5: Análisis histológico de la inflamación del tejido del pulmón e hiperplasia de la célula goblet en el IL-17RB de ratones KO y WT desafiados con IL-25 IN Calificación promedio reportada±DE.
Hiperplasia de célula Goblet (tinción PAS) 0 = normal 1 = mínima, hiperplasia célula goblet en bronquiolos grandes 2 = ligera, hiperplasia célula goblet en bronquiolos grandes y medios 3 = moderada, hiperplasia célula goblet en bronquiolos grandes, medios, y algunos pequeños 4 = Marcada, hiperplasia célula goblet en todas las vías respiratorias Inflamación Peribronquial 0 = normal 1 = mínimo golpes de eosinófilos/macrófagos/linfocitos (discontinuos a una sola capa), sin edema 2 = suave golpes de eosinófilos/macrófagos/linfocitos (de 2 a 5 células); edema mínimo, fibroplasia 3 = moderado golpes de eosinófilos/macrófagos/linfocitos (de 5 a 10 células), edema y fibroplasia presentes 4 = marcado golpes de eosinóf ilos/macrófagos/linfocitos (>10 células), edema y fibroplasia marcados Broncopneumonía 0 = normal 1 = mínima, acumulación focal de macrófagos/neutrófilos/eosinófilos/MINGCs 2 = ligera, acumulación focal de macrófagos/neutrófilos/eosinófilos/MINGCs 3 = moderada, acumulación multifocal de macrófagos/neutrófilos/eosinófilos/ INGCs 4 = marcado, acumulación multifocal de macrófagos/neutrófilos/eosinófilos/MINGCs Perivasculitis/vasculitis pulmonar 0 = normal 1 = mínima, golpes de eosinófilos/linfocitos/macrófagos (discontinuos a una sola capa), sin infiltración/hiperplasia íntimal 2 = ligeros golpes de eosinófilos/linfocitos/macrófagos (de 2 a 5 células); infiltración intimal de eosinófilos focales e hiperplasia del endotelio 3 = moderado golpes de eosinófilos/linfocitos/macrófagos (de 5 a 10 células), infiltración de eosinófilos intimal extensiva focalmente e hiperplasia del endotelio con focos MNGCs 4 = marcado golpes de eosinófilos/linfocitos/macrófagos (>10 células); pared de los vasos algunas veces efaciadas y prominentes MNGCs; vsculitis discreta presente En los ratones C57BL/6 de tipo natural, los efectos de la administración intranasal del IL-25 incluyeron (1) el aumento de números totales de leucocitos BALF, incluyendo los números aumentados de eosinófilos, neutrófilos, linfocitos y macrófagos BALF, y las concentraciones aumentadas de IL-5 e IL-13 BALF (Tablas 1 y 3), (2) los niveles aumentados en el mARN del pulmón de IL-5, IL-13, eotaxina, y MCP-1 (Tablas 2 y 4), y (3) hiperplasia de la célula goblet en las vías aéreas respiratorias grandes y medianas, y la inflamación perivascular/vascular robusta que comprende tanto arterias como venas, pero no capilares alveolares (Tabla 5). Ninguno de estos efectos se observaron al momento de la administración intranasal de los IL-25 a IL-17RB a los ratones KO (Tablas 1 a 5). El mARN del IL-17RA está presente en el IL-17RB de ratones KO (Tablas 2 y 4). Estos datos demuestran que el IL-17RB es requerido para todas las actividades del IL- 25 en el pulmón que han sido medidas hasta la fecha.
Ejemplo 2 Este ejemplo demuestra el requerimiento de IL-17RA para una respuesta al IL-25 in vivo. La generación de C57BL/6 IL-17RA-/-ratón ha sido descrita anteriormente (Ye, P., y asociados, 2001 J. Exp. Med. 194:páginas 519 a 527). Los ratones C57BL/6 de control (WT) o IL-17RA-/-ratones (KO) fueron tratados substancialmente como se describió en el Ejemplo 1 para los IL-17RB-/-ratones; los resultados se muestran en las Tablas 6 y 7 siguientes.
Tabla 6: Análisis de BALF en el IL-17RA de ratones C57BL/6 WT: Celularidad y Proteína N= 5; los valores mostrados son (promedio ± DE). N/A = No probado. Muestras debajo del rango de detección del análisis de ELISA IL-5 se les asignó el valor del límite inferior de detección el cual fue de 31 pg/mL.
Tabla 7: Análisis del Tejido del Pulmón en el IL-17RA de ratones KO vs. C57BL/6 WT: Niveles de mARN N= 4; los valores mostrados son expresión del gen en relación con la ß-actina (2E-ACt) (promedio ± DE). El tejido del pulmón de ratones tratados con IL-13 no fue analizado en este experimento.
Los tejidos de pulmón fueron seccionados, preparados para el análisis histológico, teñidos y analizados substancialmente como se describió en el Ejemplo 1. La calificación de inflamación total promedio para cada grupo se reporta en la Tabla 8.
Tabla 8: Análisis histológico del Tejido del Pulmón en el IL-17 RA de ratones KO vs. WT N = 5 para todos los grupos excepto para el IL-17RA de ratones KO tratados con MSA, para los cuales N = 4. Calificación promedio reportada±DE.
El experimento se repitió substancialmente de la misma manera; los resultados se muestran en las Tablas 9 y 10 siguientes. El análisis histológico de los pulmones no se realizó en este experimento.
Tabla 9: Análisis de BALF en ratones KO vs. WT WT, 136900±6504 327600±144145 129100±63800 18400±8828 43200±16799 IL-25 0 KO, 65800±80169 1300±1789 30100±58729 4700±4894 29700±17946 IL-25 N = 5; los valores son mostrados (promedio±DE) Tabla 10: Análisis del Tejido del Pulmón en ratones KO vs. WT: Niveles de mARN N= 4; los valores mostrados son la expresión del gen en relación con GAPDH (2E-ACt) (promedio ± DE).
En los ratones C57BL/6 de tipo natural, los efectos de la administración intranasal del IL-25 incluyeron: (1) números aumentados de leucocitos BALF totales, números aumentados de eosinófilos, neutrófilos, linfocitos y macrófagos BALF, y concentraciones aumentadas de IL-5 y IL-13 BALF (Tablas 1 y 4), hiperplasia de las células goblet en las vías aéreas respiratorias grandes y medianas, y la inflamación perivascular/vascular robusta que comprende tantas arterias como venas, pero no capilares alveolares (Tabla 3), y (3) niveles aumentados de mARN en el pulmón de IL-5, IL-13, eotaxina, MCP-1, y IL-17RB (Tablas 2 y 5). Ninguno de estos efectos fueron observados al momento de la administración intranasal del IL-25 a IL-17RA en los ratones KO (Tablas 1 a 5), aunque el mARN del IL-17RB mARN está presente en el IL-17RA de los ratones KO. Estos datos demuestran que el IL-17RA es requerido para las actividades del IL-25 en el pulmón. Ejemplo 3 Este ejemplo demuestra el requerimiento del IL-17RA e IL-17RB para la respuesta in vitro del IL-25. La generación de esplenocitos ha sido descrita anteriormente (Hamilton, y asociados, 1978, J Clin Invest. 62(6): páginas 1303 a 1312). Brevemente, los bazos individuales de C57BL/6 WT, C57BL/6 IL-17RB KO, y C57BL/6 IL-17RA de los ratones KO fueron removidos asépticamente y tratados con 0.4 mg/mL de colagenasa D (Roche Applied Science, I ndianapolis, IN) y ADNse-l al 0.1% (Roche Applied Science) en RPMI 1640 (Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA) para generar suspensiones de una sola célula. Los esplenocitos fueron cultivados en 2.0 X 107 células/ml en el medio DMEM completo (Gibco-lnvitrogen) solo o con la adición de 1 microgramo/mL de Concanavalina A (Con A; Sigma-Aldrich), o IL-25 (Amgen) en las concentraciones finales indicadas. Las células fueron cultivadas durante 72 horas a una temperatura de 37°C en un incubador humidificado de C02 al 5%. Los sobrenadantes fueron examinados para las concentraciones de IL-5 e IL-13 por medio de ELISA (R&D Systems). Los ensayos de esplenocitos fueron repetidos dos veces para cada genotipo utilizando diferentes títulos de IL-17RA KO, IL-17RB KO y animales WT; los datos de dos experimentos separados se muestran abajo (Tablas 11 a 14).
Tabla 11: Producción de IL-5 e IL-13 por IL-17RA estimulada por IL-25, en esplenocitos KO y WT N= 2 bazos individuales; los valores mostrados son (promedio ± DE). Las muestras debajo del rango de detección del análisis de ELISA del IL-5 se les asignó el valor de 31 pg/mL. Las muestras debajo del rango de detección del análisis de ELISA del IL-13 se les asignó el valor de 62 pg/ml.
Tabla 12: Producción de IL-5 e IL-13 mediante el IL-25 estimulado por los esplenocitos WT e IL-17RA KO.
Tabla 13: Producción de IL-5 e IL-13 mediante el IL17RB estimulado por el IL-25 en los esplenocitos KO y WT N= 3 bazos individuales; valores mostrados son (promedio ± DE); Las muestras debajo del rango de detección del análisis de ELISA del IL-5 se les asignó el valor de 31 pg/mL. Las muestras debajo del rango de detección del análisis de ELISA del IL-13 se les asignó el vaor de 62 pg/ml.
Tabla 14: Producción de IL-5 e IL-13 mediante el IL-17RB estimulado por el IL-25 de esplenocitos KO y WT N= 3 bazos individuales; los valores mostrados son (promedio ± DE); Las muestras debajo del rango de detección del análisis de ELISA del IL-5 se les asignó el valor de 31 pg/mL. Las muestras debajo del rango de detección del análisis de ELISA del IL-13 se les asignó el vaor de 62 pg/ml.
El estímulo del IL-25 indujo la producción de IL-5 e IL-13 por los esplenocitos C57BL/6 de tipo natural cultivados. Esta producción de citocina no fue inducida por el estímulo de IL-25 de cualquiera de los esplenocitos IL-17RB KO o IL-17RA KO (Tablas 11 a 14). Con A, un control positivo para la activación de esplenocitos, indujo el IL-17RB de los esplenocitos KO para producir esplenocitos IL-13 e IL-17RA KO para producir IL-5 e IL-13. El estímulo de Con A no indujo esplenocitos IL-17RB KO para producir IL-5 en un experimento, pero indujo la producción de IL-5 de esplenocitos IL-17RB KO en un segundo experimento. Estos datos de cultivo en células in vitro producen un soporte adicional de que ambos IL-17RB e IL-17RA son necesarios para la señalización del IL-25.
Ejemplo 4 Este ejemplo caracteriza la capacidad de los anticuerpos anti-IL-17RB-M735 y anti-l L-25-M819 para inhibir una respuesta del IL-25 in vitro. Las suspensiones de una sola célula de los esplenocitos fueron preparadas utilizando bazos de ratones BALB/C naive y diluidas a 4 x 107 células/mL en medios DMEM completos (Gibco-lnvitrogen , Carlsbad, CA). Las células (100 microL) se agregaron a placas de 96 depósitos para una concentración final de 4 x 106 células/depósito en las siguientes condiciones: Solamente medio 10 ng/mL mulL-25 (control de estímulo) 10 ng/mL mulL-25 + 100 ng/mL mulL-17RB.muFc (control de bloqueo) 10 ng/mL mulL-25 + 463, 154, 51, 17, 5.7, 1.9, 0.64, 0.21, 0.07, 0.023, 0.007, 0.003 ng/ml anti mulL-17RB M735 10 ng/mL mull_-25 + 1000, 100, 10, 1.0 ó 0.1 ng/mL anti mulL-25 M819.
Tres muestras biológicas separadas, consistiendo cada muestra de esplenocitos de dos bazos de ratón BALB/c naive, fueron probadas para cada condición de la lista anterior, y esto se repitió tres veces en tres experimentos separados. Los cultivos fueron incubados durante 72 horas a una temperatura de 37°C y C02 al 10%, cada vez los sobrenadantes fueron recolectados y ensayados para las concentraciones de IL-5 por medio del análisis de ELISA. Ambos 735 y M819 inhibieron la secreción del IL-5 inducida por el IL-25 por medio de los esplenocitos de ratón; los valores IC50 calculados para la inhibición de IL-25 indujeron una producción de IL-5 por los esplenocitos BALB/c cultivados para cada anticuerpo en tres experimentos separados de esplenocitos como se muestra más adelante en las Tablas 15 y 16.
Tabla 15: Valores IC50 para Tabla 16: Valores IC50 para anti-IL-17RB M735 anti-IL-25 M819 El IL-25 indujo la producción de IL-5 la cual fue inhibida por ambos anti-IL-17RB M735 y anti-l L-25-M819. Estos datos proporcionan un soporte adicional de que el IL-17RB es necesario para la señalización del IL-25 en los esplenocitos. Ejemplo 5 Este ejemplo caracteriza la capacidad de varios anticuerpos anti-IL-17RA para inhibir una respuesta in vitro del IL-25. Se prepararon suspensiones de una sola célula de esplenocitos substancialmente como se describieron anteriormente para el Ejemplo 4. Las células (100 microL) fueron agregadas a placas de 96 depósitos para una concentración final de 4 x 106 células/depósito con las siguientes condiciones: Solamente medio 10 ng/mL mulL-25 (control de estímulo) 10 ng/mL mulL-25 + 100 ng/mL mulL-17RB.muFc (control de bloqueo) anticuerpos monoclonales 10 ng/mL mulL-25 + ya sea 1000, 100, 10, 1.0 ó 0.1 ng/mL anti mulL-17RA Tres muestras biológicas separadas, consistiendo cada muestra de esplenocitos de dos ratones, fueron probadas para cada condición. Los cultivos fueron incubados durante 72 horas a una temperatura de 37°C y C02 al 10%, en cada vez se recolectaron sobrenadantes y se ensayaron para las concentraciones de IL-5 por medio del análisis de ELISA. Se probó un pánel de ocho anticuerpos monoclonales IL-17RA antiratón rata diferentes. Ninguno de estos inhibió la secreción del IL-5 inducida por el IL-25 por los esplenocitos de ratón.
Además de estos anticuerpos anti-ratón rata, un anticuerpo monoclonal IL-17RA anti-ratón ratón, M751, fue evaluado dos veces en este ensayo de esplenocitos. Los M751 inhibieron la secreción inducida de IL-25 del IL-5 por los esplenocitos de ratón. El IC50 calculado para el anti-mlL-17RA M751 en 2 experimentos separados de esplenocitos se muestran abajo en la Tabla 17. Por lo tanto, el anti-IL-17RA-M751 el major inhibidor anti-IL-17RA del IL-25 indujo la producción de IL-5 en este ensayo de esplenocitos, pero no fue un inhibidor tan potente comparado con el anti-IL-17RB-M735 (Tabla 15).
Tabla 17: Valores IC50 del anti-IL-17RA-M751 Ejemplo 6 Este ejemplo demuestra la inhibición de la respuesta in vivo del IL-25 con un anticuerpo contra IL-17RA, M751, el cual inhibió la actividad del IL-25 en un bio-ensayo in vitro (descrito anteriormente). A los ratones BALB/c se les administró albúmina de suero múrida (MSA; Sigma, 10 pg/mL) o IL-25 de ratón (Amgen, TO; 10 pg/mL) intranasalmente, una vez por día durante cuatro días. Los días del 1 al 4, cuatro horas antes de la instilación intranasal de MSA o IL-25, los ratones fueron inyectados intraperitonealmente con ya sea 200 microgramos de un anticuerpo anti-IL-17RA neutralizante (M751), un anticuerpo anti-IL-17A neutralizante (M210), o un anticuerpo de control del isotipo (Fe Múrido; Amgen). En el día 5, el fluido del lavado bronquioalveolar (BALF) y el tejido del pulmón fueron recolectados y analizados como se describió anteriormente. Los resultados de dos experimentos separados se muestran en las Tablas de la 18 a la 21 siguientes.
Tabla 18: Análisis de la celularidad BALF, concentraciones de IL-5, e IL-13 en los ratones BALB/c tratados con el IN de IL-25 en la presencia o ausencia de un anticuerpo de bloqueo para el IL-17RA M751 de ratón - Experimento 1 N= 5; los valores mostrados son (promedio ± SD) A las muestras debajo del rango de detección del análisis de ELISA del IL-5 se les asignó un valor de 31 pg/mL. Las muestras debajo del rango de detección del análisis de ELISA del IL-13 se les asignó un valor de 62 pg/mlL.
Tabla 19: Análisis de celularidad BALF, concentraciones de IL-5 e IL-13 en los ratones BALB/c tratados con IN de IL-25 en la presencia o ausencia de un anticuerpo de bloqueo para el IL-17-RA M751 de ratón - Experimento 2 N= 5; los valores mostrados son (promedio ± SD) Tabla 20: Análisis de IL-13, IL-5, IL-17RB, eotaxina, y mARNs de MCP-1 en el Tejido de Pulmón de los ratones desafiados con IN de IL-25 en ausencia o presencia de un anticuerpo de bloqueo para el IL-17RA M751 de ratón -Experimento 1 IL-13 IL-5 IL-17RB Exotaxina MCP-1 muFc, 1.518e-04± 2.893e-04± 9.885e-04± 9.488e-03± 5.430e-03± MSA, 2.387e-05 4.011e-05 6.524e-05 1.219e-03 1.798e-03 M751, 1.478e-02± 2.286e-03± 4.241 e-03± 3.937e-02± 8.210e-03± MSA, 2.354e-02 3.47e-03 5.528e-03 5.416e-02 7.656e-03 M210, 1.320e-04± 2.895e-04± 1.109e-03± 8.155e-03± 3.178e-03± MSA, 2.501T-05 1.507e-05 1.209e-04 1.668e-04 5.785e-04 muFc, 3.845e-02± 6.348e-03± 1.570e-02± 1.638e-01± 1.534e-02± IL-25, 1.147e-02 1.959e-03 3.551 e-03 1.281e-02 4.643e-03 M751, 7.518e-05± 2.165e-04± 1.330e-03± 6.430e-03± 2.983e-03± IL-25, 1.225e-05 2.145e-05 1.869e-04 2.422e-03 3.795e-04 M210, 1.100e-01± 1.123e-02± 2.063e-02± 2.108e-01± 1.468e-02± IL-25, 2.483e-02 3.066e-03 8.663e-03 1.601e-02 1.734e-03 N= 4; los valores mostrados son la expresión del gen en relación con el GAPDH (2E-ACt) (promedio ± DE); Tabla 21: Análisis de IL-13, IL-5, IL-17RB, eotaxina, y mARNs de MCP-1 en el Tejido de Pulmón de los ratones desafiados con IN de IL-25 en ausencia o presencia de un anticuerpo de bloqueo para el IL-17RA M751 de ratón -Experimento 2 IL-13 IL-5 IL-17RB Eotaxina MCP-1 muFc, 1.420e-04± 2.173e-04± 6.673e-03± 1.715e-03± N/D MSA, 5.510e-05 3.291e-05 7.293e-05 2.458e-04 M751, 2.205e-04± 2.465e-04± 7.040e-03± 1.703e-03± N/D MSA, 1.286e-04 5.150e-05 7.584e-04 4.502e-04 M210, 1.073e-04± 2.583e-04± 8.983e-03± 2.185e-03± N/D MSA, 1.891e-05 4.472e-05 8.737e-04 4.961e-04 MuFc, 1.749e-01± 90993e-03± 1.953e-01± 1.509e-02± N/D IL-25, 7.166e-02 3.952e-03 7.327e-03 5.096e-03 M751, 4.120e-04± 3.755e-04± 7.440e-03± 2.130e-03± N/D IL-25, 1.738e-04 1.04e-04 7.159e-04 2.238e-04 M210, 1.412e-01± 7.845e-03± 2.348e-01± 6.760e-03± N/D IL-25, 4.586e-02 1.617e-03 5.629e-02 6.823e-04 N= 4; los valores mostrados son la expresión del gen en relación con el GAPDH (2E-ACt) (promedio ± DE); N/D = no determinado El tratamiento con el mab M751 de anti-IL-17RA inhibió la celularidad de BALF inducida por el IL-25, así como el IL-25 indujo las concentraciones de IL-5 e IL-13 de BALF y la inducción de transcrito de pulmón. En contraste, el tratamiento con el mab M210 del anti-IL-17A no afectó de manera importante la celularidad de BALF inducida por IL-25 (aunque los datos sugieren posibles efectos de este anticuerpo en los niveles de neutrófilo en el BALF inducidos por el IL-25). Estos datos, junto con los descritos anteriormente en el IL-17RA de los ratones KO, indican que se requiere el IL-17RA para la celularidad de BALF inducida por IL-25 y el aumento en las concentraciones de IL-5 e IL-13. Los efectos in vivo del IL-25 no parecen ser portados a través del IL-17A, con la excepción del reclutamiento de neutrófilos inducidos por el IL-25, como se muestra en el tratamiento anti-l L-17A que reduce de manera importante el influjo de neutrófilos inducidos por el IL-25 en el BALF.
Ejemplo 7 Este ejemplo ilustra la inducción de la capacidad de hiper-respuesta de las vías aéreas (AHR) del IL-25 y los efectos en los mismos de los anti-l L-17RA-M751 y anti-IL-17A-M210. A los ratones BALB/c se les administró MSA o el IL-25 de ratón de manera intranasal diariamente, por un período de 4 días, substancialmente como se describió anteriormente. En el día 5, la capacidad de respuesta de las vías aéreas (AHR) al desafío de metacolina (MCh) fue medido primero de una manera no invasiva en ratones consientes y no restringidos con una pletismografía de cuerpo completo (Buxco Electronics, Troy, NY). La pausa mejorada (PENH) fue medida basada en la forma de onda de presión en el cuadro de pletismografía en respuesta al aumento en las concentraciones del desafío de MCh, y es reportado como el cambio de porcentaje en relación con las lecturas de la línea de base realizadas antes a la exposición de MChS. La PC200 es la concentración requerida de MCh para inducir un PENH 200% arriba de la línea de base, y se reporta aquí en las Tablas 22 y 23 siguientes.
Tabla 22: Desafío de AHR a MCh de los ratones BALB/c tratados con IN del IL-25 en la presencia o ausencia de un anticuerpo de bloqueo para el IL-17RA o IL-17RA o IL-17A de ratón N= 5/grupo; los valores mostrados son (promedio ± DE) Tabla 23: Desafío de AHR para la metacolina de I ratones BALB/c tratados con IN de IL-25 en la presencia ausencia del anticuerpo de bloqueo para el IL-17RA M751 ratón 4/grupo; los valores mostrados son (promedio ± DE) La capacidad de hi per-respuesta de las vías aéreas también fue medida en ratones anestesiados y ventilados mecánicamente de manera intranasal dosificados con IL-25 y tratados con anti-IL-17RA-M75 . A los ratones BALB/c se les administró MSA o IL-25 de ratón intranasalmente diario, por un período de 4 días, substancialmente tal y como se describió anteriormente. En el día 5, los ratones fueron sedados con clorhidrato de xilazina (20 mg/kg intraperitonealmente), y anestesiados con pentobarbital sódico (100 mg/kg intraperitonealmente). La tráquea fue canulada con una aguja de metal, y los ratones fueron conectados a un pequeño ventilador de animales (flexiVent, SCIREQ: Scientific Respiratory Equipment, Montreal, Canadá). Cada ratón fue ventilado con inspiración del sinusoide y expiración pasiva con un índice de 150 respiraciones/minuto y una amplitud de 10 ml/kg por peso del ratón. Una presión positiva expiratoria total (PEEP) de 3.0 cmH20 fue establecida por la conexión de los ratones a la columna de agua.
Después de que los ratones fueron ventilados durante un minuto, los pulmones fueron expandidos dos veces para una capacidad total del pulmón (TLC, presión de amplitud de 30 cmH20). Un aerosol de solución salina o concentraciones crecientes de acetil-beta-metilcolina (MCh, Sigma-Aldrich) fueron administradas al pulmón durante 15 segundos seguidas por una ventilación de 15 segundos. Después del aerosol y la ventilación, una oscilación operada en un volumen (VD) de 2.5 Hz fue aplicada a la apertura de las vías aéreas. Cada una de las oscilaciones de VD de 10 a 2.5 Hz tenía una amplitud de 0.20 ml_ y duró por 1.25 segundos. Antes de la siguiente dosis de MCh, los pulmones fueron expandidos dos veces para el TLC. Las mediciones de presión y volumen con el paso del tiempo en el sistema respiratorio fueron registrados por un ventilador de animales pequeños, y la resistencia del sistema respiratorio (R) fue calculada adaptando los datos a un modelo de un solo compartimento del sistema respiratorio en donde Ptr = RV+ EV+ P0 (Ptr = presión de la tráquea, V = volumen/tiempo, E = elastancia = presión/volumen , V = volumen, P0 = presión de línea de base). La resistencia del pulmón medida en diferentes concentraciones de MCh se muestra en la figura 2.
Estos resultados demostraron que, además de inhibir la actividad de IL-25 ¡n vitro así como la celularidad de BALF inducida por IL-25 y las concentraciones aumentadas de IL-5 e IL-13 in vivo, el M751 inhibió el AHR inducido por IL-25, indicando que un anticuerpo que se enlaza al IL-17RA e inhibe una actividad del IL-25 será útil en el tratamiento o alivio de los padecimientos portados por el IL-25 que comprenden el AHR. Ejemplo 8 Este ejemplo demuestra la inhibición de una respuesta del IL-25 in vivo con un anticuerpo contra el IL-17RB (M735) o un anticuerpo contra el IL-25 (M819), ambos de los cuales inhibieron la actividad del IL-25 en un bio-ensayo in vitro (descrito anteriormente). A los ratones BALB/c se les administró PBS o IL-25 de ratón intranasalmente, y fueron inyectados intraperitonealmente con 250 microgramos de cualquiera de un anticuerpo anti-ratón IL-17RB ratón (M735), un anticuerpo antiratón IL-25 rata neutralizante (M819), un anticuerpo IgGI múrido de control irrelevante (mulgGI; Amgen), una proteína Fe múrida (muFc; Amgen), o un IgG completo de rata (Pierce, Rockford IL). En el día 5, el fluido del lavado bronquioalveolar (BALF) fue recolectado y analizado como se describió anteriormente. Se realizaron experimentos repetidos separados; en el segundo, no fueron determinadas las concentraciones de la proteína IL-5 e IL-13 de BALF. Los resultados se muestran en las Tablas de la 24 a la 26 siguientes.
Tabla 24: Análisis de la celularidad de BALF, concentraciones de IL-5, y concentraciones de IL-13 de ratones desafiados con IN del IL-25 en la presencia o ausencia de un anticuerpo de bloqueo para el IL-17RB (M735) N= 5; los valores mostrados son (promedio ± DE) Tabla 25: Análisis de la celularidad de BALF, concentraciones de IL-5, y concentraciones de IL-13 de ratones desafiados con IN del IL-25 en la presencia o ausencia de un anticuerpo de bloqueo para el IL-17RB (M735) o el anticuerpo de bloqueo para el IL-25 (M819) N= 5; los valores mostrados son (promedio ± DE) Tabla 26: Análisis de la celularidad de BALF, concentraciones de IL-5, y concentraciones de IL-13 de ratones desafiados con IN del IL-25 en la presencia o ausencia de un anticuerpo de bloqueo para el IL-17RB (M735) o el anticuerpo de bloqueo para el IL-25 (M819) 101300± 84001 859001 2001 68001 68 901 PBS 30899 1145 13106 200 3887 24 28 mulgGI, 7694001 6163001 502001 658001 371001 2301 5981 IL-25 258902 237391 10755 25649 10105 33 68 M735, 29800± 233001 9001 38001 941 3031 180011114 IL-25 3774 2931 458 1007 16 125 HgG, 5757001 4282001 489001 613001 373001 2301 5981 IL-25 180123 143432 10656 18219 13338 33 68 M819, 3214001 2318001 309001 314001 273001 1211 4761 IL-25 14445 109952 11884 15182 10100 50 220 N= 5; los valores mostrados son (promedio ± DE) Ejemplo 9 Este ejemplo ilustra la inducción de la reacción de hiper-sensibilidad de las vías aéreas respiratorias (AHR) por el IL-25 y los efectos en las mismas de un anticuerpo contra IL-17RB (M735) o un anticuerpo contra IL-25 (M819). Se realizaron series de experimentos substancialmente como los descritos anteriormente; el AHR fue medido de manera no invasiva en ratones no restringidos concientes, con una pletismograf ía de cuerpo total. Los resultados de los tres experimentos separados se muestran en las tablas de la 27 a la 29 siguientes.
Tabla 27: Los valores AHR de los ratones desafiados con IN del IL-25 en la ausencia o presencia del anticuerpo de bloqueo para el anti-IL-17RB (M735) Tratamiento PC200, MCh, mg/mL PBS 37.6±15 mulgGI, IL-25 5.5±3.2 M735, IL-25, 16.5±5.7 N= 5; los valores mostrados son (promedio ± DE) Tabla 28: Los valores AHR de los ratones desafiados con IN del IL-25 en la ausencia o presencia del anticuerpo de bloqueo para el anti-IL-17RB (M735) o un anticuerpo de bloqueo para el IL-25 (M819) N= 5; los valores mostrados son (promedio ± DE) Tabla 29: Los valores AHR de los ratones desafiados con IN del IL-25 en la ausencia o presencia del anticuerpo de bloqueo para el anti-IL-17RB (M735) o un anticuerpo de bloqueo para el IL-25 (M819) Tratamiento PC200, MCh, mg/mL PBS 29.9±3.3 mulgd, IL-25 6.38±1.2 M735, IL-25 16.8±1.6 rlgG. IL-25 10.9±1.2 M819, IL-25 15.6±1.9 Estos resultados indican que el IL-25 aumenta el AHR, cuyo efecto puede ser moderado por anti-IL-17RB o anti-IL-25. Ejemplo 10 Este ejemplo proporciona la confirmación histológica de que las respuestas del IL-25 in vivo son bloqueadas por el tratamiento con un anticuerpo contra IL-17RB (M735), un anticuerpo contra IL-25 (M819), o un anticuerpo contra IL-17RA (M751 ). A los ratones BALB/c se les administró PBS o IL-25 de ratón intranasalmente, y fueron inyectados intraperitonealmente con ya sea 200 microgramos de un anticuerpo anti-IL-17RB neutralizante (M735), 200 microgramos de un anticuerpo anti-IL-25 neutralizante (M819), 200 microgramos de un anticuerpo anti-IL-17RA neutralizante (M751 ), 200 microgramos de un anticuerpo anti-IL17A neutralizante (M210), o un isotipo de anticuerpo de control substancialmente como se describió anteriormente. Los ratones fueron eutanizados en el día 5 del estudio mediante asfixia con C02 Los pulmones fueron recolectados, fijados, procesados, seccionados, teñidos y evaluados como se ha descrito anteriormente. Un resumen de los resultados de la histopatología se muestra en la Tabla 30 siguiente.
Tabla 30: Análisis histológico de la inflamación del tejido del pulmón o hiperplasia de la célula goblet en los ratones desafiados con el IN del IL-25 y tratados con anti-IL-17RA, anti-IL-17A, anti-IL-25, anti-IL-17RB o control N = 5/grupo; Calificación promedio reportada! DE.
Los ratones desafiados con IL-25 y tratados con el control del isotipo tuvieron las lesiones más profundas y una calificación promedio de 7.6 ± 2.2 contra los ratones desafiados con MSA y tratados con el control de isotipo, los cuales tuvieron una calificación promedio de 1.8 ± 0.8. el tratamiento de los ratones con un anticuerpo contra IL-17A no tuvieron esencialmente efecto en las lesiones pulmonares indicadas con una calificación promedio de 6.8 ± 1.3. En contraste, los tratamientos con ya sea anti-IL-17RA (calificación 1.0 ± 0.7), anti-IL-25 (calificación 1.4 ± 1.1) o anti-IL- 17RB (calificación 1.8 ± 1.5) todos fueron efectivos para inhibir la inflamación inducida por IL-25 a nivel del fondo, sugiriendo que el bloqueo del IL-25 o cualquiera de las proteínas comprendidas en el complejo receptor fueron tratamientos igualmente efectivos.
Ejemplo 11 Este ejemplo demuestra una asociación entre IL-17RA e IL-17RB. Una serie de inmuno-precipitaciones fueron realizadas utilizando los dominios extracelulares del IL-17RA humano y el IL-17RB humano fusionados a la región Fe del IgG humano (R&D Systems, Minneapolis, MN) o a una etiqueta de polihistidina (Amgen). Se agregaron 50 microL de una pasta de Proteína G a un tubo Eppendorf, que fue lavado con solución salina regulada por fosfato (PBS), e incubada con 2 microgramos de proteína IL-17RA.Fc o IL-17RB.FC durante 1 hora a una temperatura de 4°C con rotación. Al final de esta incubación, se agregaron 2 microgramos de la proteína receptora soluble conversa (por ejemplo, IL-17RA-HIS al IL-17RB:Fc e IL-17RB-HIS el cual fue agregado al IL-17RA:Fc) agregado a esta combinación final que fue incubada durante la noche a una temperatura de 4°C con rotación.
La mañana siguiente, los tubos fueron centrifugados a una velocidad de 12,000 rpm durante 1 minuto, y las cuentas de proteína G fueron lavadas con PBS, y luego un Regulador RIPA (Sigma-Aldrich, St. Louis MO). Las cuentas fueron suspendidas nuevamente en 60 microL de regulador de muestra de SDS 2x Tris-Glicina (Invitrogen, Carlsbad CA) con beta-mercaptoetanol al 10% (Invitrogen, Carlsbad, CA) y almacenadas en hielo o a una temperatura de -20°C. Las muestras fueron analizadas en un gel de acrilamida de 10 mini depósitos de Tris-Glicina del 4% al 20% (Novex®-lnvitrogen, Carlsbad CA) y transferidas a una membrana de nitrocelulosa (Invitrogen, Carlsbad CA). Las membranas fueron bloqueadas utilizando el Regulador de Bloqueo Odyssey®, un regulador de bloqueo del análisis Western Blot optimizado para ensayos infrarrojos (Li-cor® Biosciences, Lincoln, NE) ya sea a temperatura ambiente durante 1 hora o durante la noche a una temperatura de 4°C con balanceo suave. Las membranas entonces fueron incubadas con los anticuerpos primarios diluidos 1:1000 a 1:5000 en el Regulador de Bloqueo Odyssey® con un contenido de Tween-20 al 0.1% durante 60 minutos a una temperatura de 4°C con agitación suave. Las membranas fueron lavadas 4 veces en PBS + Tween-20 al 0.1%, y luego incubadas en un anticuerpo secundario diluido 1:10,000 en el regulador de bloqueo Odyssey® con un contenido de Tween-20 al 0.1% durante 60 minutos a una temperatura de 4°C con agitación suave. Las membranas fueron lavadas 4 veces en PBS + Tween-20 al 0.1% y las proteínas fueron visualizadas utilizando un sistema de elaboración de imagen infrarroja L¡-Cor® Odyssey®. Los siguientes anticuerpos fueron utilizados: Anticuerpos Primarios: Anticuerpo policlonal purificado por afinidad Anti-hlL-17RA de cabra (R&D Systems, Minneapolis, MN) Anticuerpo policlonal purificado por afinidad Anti-hlL-17RB de cabra (R&D Systems, Minneapolis, MN) Anticuerpo policlonal purificado por afinidad Anti-hlL-17RC de cabra (R&D Systems, Minneapolis, MN) IgG Conejo anti-Ratón Alexa Fluor® 680 (H + L) (Invitrogen, Carlsbad, CA; Alexa Flúor680: Berlier JE y asociados, J Histochem Cytochem 51, páginas 1699 a 1712 (2003)) Anticuerpos Secundarios: IgG anti-Cabra de Burro IRDye® 800CW (H + L) adsorbido altamente (Li-Cor® Biosciences, Lincoln, NE; IRDye® tintes infrarrojos: Patente Norteamericana No. US06027709) Anticuerpo monoclonal His«Tag® (anticuerpo monoclonal de ratón (IgG-i ) dirigido contra la secuencia His»Tag; Novagen, EMD Chemicals, Inc., San Diego, CA) Una mancha representativa se muestra en la figura 2. Durante el curso de varios experimentos, el IL-17RB.Fc pudo inmunoprecipitar el IL-17RA.HIS. En este sistema experimental, el IL-17RA.FC también pudo inmunoprecipitar el IL-17RC.HIS, demostrando que este sistema puede reproducir interacciones bioquímicas entre las proteínas que han sido demostradas antes en otros sistemas (Toy, D. y asociados, Jl, 2006, 177: página 36). Ni el IL-17RA.Fc ni el IL-17RB.Fc pudieron inmunoprecipitar el IL-17RD.HIS (R&D Systems, Minneapolis, MN), sugiriendo que la interacción de IL-17RA e IL-17RB es única para estas proteínas y no inherente a todos los miembros de la familia IL-17R. Esta es la primera descripción de una interacción bioquímica entre el IL-17RA y el IL-17RB.
Ejemplo 12 El desarrollo de anticuerpos monoclonales completamente humanos dirigidos contra el IL-17RA humano fue llevado a cabo utilizando la tecnología Abgenix (Amgen Fremont Inc.) XenoMouse® (Patentes Norteamericanas Nos. 6,114,598; 6,162,963; 6,833,268; 7,049,426; 7,064,244, las cuales están incorporadas a la presente descripción en su totalidad como referencia; Green y asociados, 1994, Nature Genetics 7: páginas 13 a 21; Méndez y asociados, 1997, Nature Genetics 15: páginas 146 a 156; Green y Jakobovitis, 1998, J. Ex. Med. 188: páginas 483 a 495)), como se describieron en la Patente Norteamericana Serie No. 11/906,094 (incorporada a la presente descripción como referencia). Como ahí se describe, los anticuerpos anti-IL-17RA humanos fueron seleccionados por su capacidad para inhibir el enlace de IL-17A humano al IL-17RA humano (y para el cinomolgo IL-17RA). Un pánel de anticuerpos fue identificado y seleccionado para la propagación y análisis adicional; las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera variables se muestran en la lista de secuencias, y una tabla resume las diferentes secuencias que se muestran más adelante. Un anticuerpo, 3.454.1, evidencia de dos versiones de una cadena ligera variable.
Tabla 31: Sumario de Anticuerpos Anti-hulL-17A Los anticuerpos fueron caracterizados además con respecto a su capacidad para inhibir la actividad biológica del IL-17A y/o IL-17F, en cuyos dominios del IL-17RA era importante para el enlace del anticuerpo.
Ensayo de secreción de citocina/quimiocina inducido por IL-17A/IL-17F Estos ensayos utilizan una línea celular de fibroblasto del prepucio humano (HFF). Los anticuerpos anti-IL-17RA son incubados con células HFF (5000 células/depósito en placas de 96 depósitos) durante 30 minutos a una temperatura de 36°C; los cultivos son entonces estimulados durante la noche ya sea con IL-17A (5 ng/ml), solo o IL-17F (20 ng/ml) y TNF-alfa (5 ng/ml). Los sobrenadantes del cultivo de fibroblastos son analizados mediante el análisis de ELISA para la presencia de cualquiera de IL-6 o GRO-alfa. Los anticuerpos pudieron inhibir la actividad biológica de IL-17A y IL-17F, como lo muestra una reducción en la cantidad de IL-6 y/o GRO-alfa producidos en este ensayo.
Ensayo de competencia cruzada Los estudios de competencia cruzada se realizaron para determinar las características de enlace del IL-17RA de ciertos anticuerpos, como se describe en la Patente Norteamericana Serie No. 11/906,094. Se utilizó una modificación al método de depósito multiplexado descrito por Jia, y asociados (ver por ejemplo, Jia, y asociados, J. Immun. Meth., 2004, 288: páginas 91 a 98), empleando una estación del trabajo Bio-Plex y un software (BioRad, Hercules, CA), así como reactivos de Luminex® Corp. (Austin, TX). Los protocolos básicos del fabricante generalmente son seguidos. Los anticuerpos fueron probados en combinaciones de pares; si dos anticuerpos competían de manera cruzada entre ellos, fueron agrupados o "depositados" juntos. Hablando generalmente, los anticuerpos asignados a diferentes depósitos enlazan diferentes partes del IL-17RA y los anticuerpos asignados al mismo depósito se enlazan a partes similares del IL-17RA.
Evaluación de los Determinantes de Neutralización: quimeras Hu/Mu Los estudios fueron realizados para determinar en donde los diferentes antagonistas de IL-17RA (en la forma de anticuerpos humanos) se enlazaron al IL-17RA humano, utilizando un número de IL-17RA humano/ratón quimérico. Este método aprovecha la reactividad no cruzada de los diferentes anticuerpos IL-17RA con el IL-17RA de ratón. Para cada quimera, una o dos regiones de dominio extracelular del IL-17RA humano es/son reemplazadas por la región correspondiente del anticuerpo IL-17RA de ratón. Seis quimeras de región simple y 8 de región doble fueron construidas; el análisis de multiplexado utilizando la estación de trabajo y el software Bio-Plex (BioRad, Hercules, CA) se realizaron para determinar las determinantes de neutralización en el IL-17RA humano analizando el enlace diferencial mAbs del IL-17RA humano del IL-17RA humano a las proteínas quiméricas contra las proteínas IL-17RA de tipo natural.
Evaluación de los Determinantes de Neutralización: Exploración de Arginina Se realizaron estudios adicionales utilizando un número de proteínas IL-17RA mutantes que tienen substituciones de arginina en los residuos de aminoácidos seleccionados del IL-17RA humano. La exploración de arginina es un método reconocido en la técnica de evaluación en donde los anticuerpos, que no son proteínas, se enlazan a otras proteínas, ver, por ejemplo Nanevicz, T., y asociados, 1995, J. Biol. Chem., 270:37, páginas 21619 a 21625 y Zupnick, A., y asociados, 2006, J. Biol. Chem., 281: 29, páginas 20464 a 20473. En general, la cadena lateral de arginina es cargada positivamente y relativamente voluminosa comparada con otros aminoácidos, los cuales pueden interrumpir el enlace del anticuerpo a una región de un antígeno en donde es introducida la mutación. La exploración de arginina es un método que determina si un residuo es parte de la determinante neutralizante y/o un epítope. Noventa y cinco aminoácidos distribuidos en el dominio extracelular IL-17RA humano fueron seleccionados por mutación a la arginina. La selección fue inclinada hacia los aminoácidos cargados o polares para maximizar la posibilidad de que el residuo estuviera en la superficie y redujera la probabilidad de la mutación resultante de una proteína duplicada de manera equivocada.
Utilizando técnicas estándar conocidas en el arte, los oligonucleótidos sentido y antisentido contienen residuos mutados fueron diseñados basados en los criterios proporcionados por el equipo del protocolo Stratagene QuickChange® II (Stratagene/Agilent, Santa Clara, CA). La mutagénesis del (WT) Hull-17RA-Flag-pHis del tipo natural fue realizada utilizando el equipo QuickChange® II (Stratagene). Todas las construcciones quiméricas fueron construidos para codificar la etiqueta FLAG-histidina (seis histidinas) en la terminal carboxi del dominio extracelular para facilitar la purificación por medio de la etiqueta poli-His, el análisis de multiplexión utilizando la estación de trabajo y el software Bio-Plex (BioRad, Hercules, CA) fueron realizados para determinar las determinantes de neutralización en el IL-17RA humano analizando ciertos enlaces diferenciales de mAbs al IL-17RA humano para los mutantes de arginina contra las proteínas IL-17RA del tipo natural.
Estos estudios se resumen en la Tabla 32 siguiente.
Tabla 32: Sumario de las propiedades de ciertos anticuerpos IIL-17RA Ejemplo 13 Este ejemplo describe un ensayo de nuevo estímulo de IL-25 que es útil para evaluar los efectos de los antagonistas de IL-17RA-IL-17RB en una actividad biológica del IL-25. Las células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) son aisladas de los donantes normales y estimuladas durante 24 horas en una cantidad de 5 x 106 células/ml en la presencia de Infopoyetina estromal tímica (TSLP (Quentmeier y asociados, Leukemia. 2001 Ago; 15(8): página 1286), 100 nanogramos/ml, que se consiguen en R&D Systems, Minneapolis, MN). Los PBMC son recolectados entonces y reparados para cultivos de nuevo estímulo en la presencia de IL-2 (10 nanogramos/ml, R&D Systems, Minneapolis, MN) e IL-25 (10 nanogramos/ml; R&D Systems, Minneapolis, MN), en presencia o ausencia de agentes que van a ser probados por su actividad inhibitoria. Los cultivos de nuevo estímulo son preparados como una suspensión de una sola célula y diluidos a 4 x 107 células/ml, se les agregan 100 microL de células a las placas de 48 depósitos para una concentración final de 4 x 106 células/depósito. Después de tres días, los fluidos sobrenadantes son recolectados y probados por IL-5 mediante el análisis de ELISA (R & D Systems, Minneapolis, MN). Los agentes probados incluyen las formas solubles de IL-17RB (descritas anteriormente) y un panel de anticuerpos policlonales y monoclonales que son resumidos más adelante: • MAB1771: anti-HulL-17RA MulgG2b (R&D Systems) • MAB1207: anti-Hull-17RB MulgG2b (R&D Systems) · IgG Policlonal de Cabra AF177: anti-HulL-17RA (R&D Systems) • Varios anti-HulL-17RA HulgG2 completamente humanos (descritos en el Ejemplo 12) Los resultados son de varios agentes de prueba en varios ensayos de nuevo estímulo diferentes utilizando PBMC de donantes diferentes como se muestran en la Tabla 33 siguiente.
Tabla 33: Producción de IL-5 del PBMC humano tratado con TSLP y estimulado con IL-2 + IL-25 en la presencia o ausencia de varios inhibidores de IL-17RB e IL-17RA.
Una parte de los anticuerpos humanos que se enlazan al IL-17RA fueron probados en tres ensayos de nuevo estímulo separados con diferentes donantes de PBMC, en días diferentes y con preparaciones diferentes de anticuerpos. Los resultados se muestran en la Tabla 34 siguiente.
Tabla 34: Producción de IL-5 del PBMC humano tratado con TSLP y estimulado con IL-2 + IL-25 en la presencia o ausencia de varios anticuerpos IL-17RA.
*Los resultados del análisis de depósito para estos anticuerpos fueron equivocados.
Se obtuvieron resultados substancialmente similares con las preparaciones adicionales de estos anticuerpos. Los resultados indican que ciertos anticuerpos que se enlazan al IL-17RA e inhiben el IL-17A también exhiben el IL-25.
Ejemplo 14 Este ejemplo describe un modelo de asma de ratón. Los ratones (por ejemplo, BALB/c) son sintetizados con antígeno (por ejemplo, albúmina de huevo [OVA]) mediante la inyección peritoneal del antígeno en un adyuvante alum u otro adyuvante. Varios esquemas de sensibilización conocidos en la técnica; un esquema, se le inyectan 10 microgramos de OVA en alum tres veces en intervalos de una semana (por ejemplo, en el día -21, día -14 y día -7). Entonces los ratones son desafiados con el antígeno, ya sea mediante la exposición al aerosol (OVA al 5%) o por la administración intranasal (0.1 mg OVA). El programa de desafío podrá ser seleccionado entre los términos más cortos (por ejemplo, desafío diario en los días 1, 2 y 3) o términos más largos (por ejemplo, desafío semanal de dos a tres semanas). Los puntos finales que son medidos pueden incluir AHR, el número de células de fluido BAL y la composición, el drenaje in vitro de los niveles de citocina del nodo linfático del pulmón, niveles de IgE en el suero y evaluación histopatológica del tejido del pulmón. Otros modelos de animal de asma son conocidos, e incluyen el uso de otros animales (por ejemplo, ratones C57BL/6), esquemas de sensibilización (por ejemplo, inoculación intranasal, el uso de otros adyuvantes o sin adyuvantes, etc.) y/o antígenos (incluyendo péptidos, tales como los derivados de OVA u otros antígenos proteináceos, extractos de cucarachas, extractos de ambrosía u otros extractos tales como aquellos utilizados en los regímenes de des-sensibilización, etc.). Los efectos de los anticuerpos IL-17RA, IL-17RB, IL-17 e IL-25 fueron evaluados en este modelo, utilizando grupos de ratones, como se muestra más adelante.
Los ratones BALB/c hembra fueron inmunizados IP con OVA en alum en los días -21, -14 y -7 y fueron expuestos a un desafío de aerosol con OVA en PBS en los días del 1 al 3. Los ratones fueron inyectados IV con anticuerpo el día antes del desafío de aerosol de OVA (día -1) en los Experimentos 1 y 2, o IP con anticuerpo el día del primer desafío de aerosol de OVA (día 1), 30 minutos antes del desafío de OVA en el Experimento 3, o fueron inyectados IP con Dexametasona (Dex), un control positivo, o solución salina regulada por fosfato (PBS), un control negativo, 30 minutos antes de cada exposición al aerosol de OVA (días del 1 al 3) en los Experimentos 1 y 3. Fueron cotejados por su edad, el grupo al que solamente se preparó con OVA fue incluido para la comparación. La capacidad de hiper-respuesta de las vías aéreas (AHR) al desafío de MCh fue medido 48 horas después del desafío final de OVA. Los ratones fueron sacrificados 72 horas después del desafío final de OVA y el suero, el fluido BAL, drenando los nodos linfáticos del pulmón y los pulmones fueron recolectados para el análisis. Se realizó una serie de tres experimentos.
El Experimento 1 contenía los siguientes grupos de tratamiento: • Grupo 1, ratones preparados no desafiados, n = 10 • Grupo 2, PBS, IP, n = 10 • Grupo 3, 1 mg/kg DEX, IP, n = 10 • Grupo 4, 500 microgramos del control de isotipo mlgG1, ab, IV, n = 10 • Grupo 5, 500 microgramos de anti-IL-17RB M735 mAb, IV, n = 10 • Grupo 6, 500 microgramos de anti-mlL- 7RA mAb M751 quimérico, IV, n = 10 · Grupo 7, 500 microgramos de ab de control IgG de rata, IV, n = 10 • Grupo 8, 500 microgramos de anti-mlL-25 M819, IV, n = 10 • Grupo 9, 500 microgramos de anti-mlL-17 mAb M210, IV, n = 10 El Experimento 2 contenía los siguientes grupos de tratamiento: • Grupo 1, ratones preparados pero no desafiados, n = 10 • Grupo 2, 500 microgramos del isotipo del ab de control del isotipo mlgG1, IV, n = 10 • Grupo 3, 500 microgramos de anti-mlL-17RA-M751 quimérico, IV, n = 10 El Experimento 3 contenía los siguientes grupos de tratamiento: • Grupo 1, ratones preparados no desafiados, n = 10 • Grupo 2, PBS, IP, n = 10 • Grupo 3, 1 mg/kg DEX, IP, n = 10 • Grupo 4, 500 microgramos del ab de control de isotipo, mlgG1 , IP, n = 10 • Grupo 5, 500 microgramos de anti-IL-17RB M735 mAb, IP, n = 10 • Grupo 6, 500 microgramos de anti-mlL-17RA mAb M751 quimérico, IP, n = 10 • Grupo 7, 500 microgramos de ab de control de IgG de rata, I P, n = 0 • Grupo 8, 500 microgramos de anti-mlL-25 M819-25, IP, n = 10 • Grupo 9, 500 microgramos de anti-mlL-17 mAb M210, IP, n = 10 • Grupo 10, 500 microgramos de anti-mlL-17F mAb M850, IP, n = 10 Los anticuerpos de neutralización para el IL-17RB, IL-17RA, o IL-25, pero para el IL-17A redujeron el AHR en un modelo de asma OVA de ratón; los resultados se muestran en las figuras de la 1 a la 3. El cambio porcentual promedio en el PENH en relación con la línea de base se reporta para cada grupo de tratamiento ± DE del Experimento 1 (figura 1). La capacidad de h i per-respuesta vías aéreas fue medida substancialmente como se describió con anterioridad en el ejemplo 7. El grado de bronco-constricción fue expresado como el cambio de porcentaje en el PENH en relación con la línea de base.
El tratamiento con anticuerpos neutralizantes para IL-17RB, IL-17RA, o IL-25, pero no para IL-17A, la AHR reducida en respuesta a desafío con MCh comparado con ratones tratados con PBS o anticuerpos de control (figura 3).
La resistencia pulmonar (RL) en respuesta con el desafío de metacolina fue medida en los Experimentos 2 y 3 en ratones ventilados mecánicamente. Las mediciones de presión y volumen con el paso del tiempo el sistema respiratorio fueron registradas por el ventilador pequeño de animales, y la resistencia del sistema respiratorio (R = cmH20/mL) fue calculada adaptando los datos a un modelo de un solo compartimento del sistema respiratorio en donde Ptr = RV + EV + Po (Ptr = presión de la tráquea, V = volumen/tiempo, E = elastancia = presión/volumen, V = volumen, PQ = presión de línea de base). El área de resistencia de las vías aéreas (R) bajo la curva (AUC) es calculada tomando la suma de todas las mediciones R para cada concentración de metacolina para cada ratón. En el experimento 2, el tratamiento con un anticuerpo neutralizante para el IL-17RA redujo la resistencia pulmonar en respuesta con el desafío de metacolina comparado con los ratones tratados con el anticuerpo de control (figura 4a). En el Experimento 3, el tratamiento con anticuerpos neutralizantes al IL-17RB, IL-17RA, o IL-25, pero no al IL-17A redujeron la resistencia pulmonar al desafío de metacolina comparado con los ratones tratados con el anticuerpo de control (figura 4b). Los efectos de los anticuerpos en el número de células BALF y la composición también fueron determinados; los resultados se muestran en las figuras de la 5 a la 7. En el experimento 1, los anticuerpos neutralizantes a los antagonistas de IL-17RB, IL-17RA, o IL-25, pero no al IL-17A redujeron de manera importante los leucocitos totales del BALF (figura 5a), eosinófilos (figura 5b), y linfocitos (figura 5d), comparados con los tratamientos de anticuerpo de control apropiados en este modelo de asma OVA de ratón. Los anticuerpos neutralizantes para los IL-17RB o IL-17RA pero no para el IL-17A redujeron de manera importante los neutrófilos totales del BALF (figura 5c). El anticuerpo neutralizante al IL-25 redujo los neutrófilos totales del BALF, pero esto no fue importante (figura 5c).
En el experimento 2, los anticuerpos neutralizantes para el IL-25, IL-17RB, e IL-17RA redujeron de manera importante los leucocitos totales del BALF (figura 6a), eosinófilos (figura 6b), y linfocitos (figura 6d), comparados con los tratamientos de anticuerpo de control apropiados en este modelo de asma OVA de ratón. Estos anticuerpos no tuvieron un efecto importante en los neutrófilos BALF totales (figura 6c) o números de macrófagos (figura 6e).
En el experimento 3, los anticuerpos neutralizantes para el IL-17RB, IL-17RA, o IL-25 pero no para el IL-17A o IL-17F redujeron de manera importante los leucocitos totales del BALF (figura 7a), eosinófilos (figura 7b), y linfocitos (figura 7d ) en este modelo de asma OVA de ratón. Los anticuerpos neutralizantes para el IL-17RB, IL-17RA, o IL-25 pero no para el IL-17A o IL-17F redujeron los neutrófilos BALF totales (figura 7c), pero solamente el 17RB y el IL-25 tuvieron un efecto importante. Los anticuerpos neutralizantes para el IL-17RA o IL-17RB pero no para el IL-25, IL-17A o IL-17F redujeron los macrófagos BALF totales (figura 7e), pero solamente el anticuerpo IL-17RA tuvo un efecto importante.
Los anticuerpos neutralizantes para el IL-17RB, IL-17RA, o IL-25, pero no para el IL-17A o IL-17F, redujeron de manera importante las concentraciones del IL-13 del BALF como se muestra en la figura 8 (Experimento 1) y la figura 8c (Experimento 3) . Las concentraciones de IL-13 de BALF fueron inferiores en los ratones tratados con anticuerpos neutralizantes para el IL-17RB, IL-17RA, o IL-25 pero no de manera importante en el Experimento 2, posiblemente debido al nivel más bajo de inducción general de IL-13 comparada con la observada generalmente en este modelo de ratón (figura 8b).
Los anticuerpos neutralizantes del IL-17RB, IL-17RA, o IL-25 pero no los IL-17A o IL-17F, también se redujeron las concentraciones de IL-5 en BALF en este modelo de asma OVA de ratón, pero en el Experimento 1, solamente el grupo tratado con mAb anti-IL-25 fue significativamente más bajo comparado con los ratones tratados con el anticuerpo de control del isotipo (figura 9a), mientras que en el Experimento 3, los grupos tratados con mAb anti-IL-17RB, anti-l L-17RA, y anti-IL-25 todos fueron reducidos de manera importante (figura 9c). Además, las concentraciones de IL-5 del BALF fueron reducidas de manera importante mediante al anticuerpo con anticuerpos neutralizantes para IL-17RB, IL-17RA, e IL-25 en el Experimento 2 (figura 9b).
De un modo similar, la neutralización de los anticuerpos para IL-17RB, IL-17RA, o IL-25, pero no para IL-17A o IL-17F, redujo las concentraciones de IgE totales en el suero en este modelo de asma OVA de ratón. En el Experimento 1, la neutralización de anticuerpos para IL-17RB, IL-17RA, o IL-25 redujo las concentraciones de IgE totales en el suero, pero solamente el grupo tratado con el anticuerpo neutralizante para el IL-25 redujo de manera importante las concentraciones de IgE totales en el suero comparadas con el grupo tratado con el anticuerpo de control del isotipo apropiado (figura 10a). En el experimento 2, la neutralización de los anticuerpos para IL-25, IL-17RB o IL-17RA redujeron las concentraciones de IgE totales en el suero, pero no comparadas de manera importante con el grupo tratado con el anticuerpo de control (figura 10b). En el Experimento 3, la neutralización de los anticuerpos para IL-17RB, IL-17RA, o IL-25, pero no para IL-17A o IL-17F redujo de manera importante las concentraciones de IgE totales en el suero comparadas con sus grupos tratados con el anticuerpo de control apropiado (figura 10c).
Los pulmones de 8 ratones de cada grupo de tratamiento en el Experimento 3 fueron analizados histológicamente. Las secciones de tejido del pulmón fueron teñidas con H&E o PAS, y luego marcadas por un patólogo como se describió anteriormente en el Ejemplo 1. El tratamiento con anticuerpos neutralizantes para IL-17RB, IL-17RA, o IL-25 pero no para IL-17A o IL-17F redujeron de manera importante las calificaciones de inflamación en este modelo de asma OVA de ratón (figura 11 ).
Estos resultados demostraron que el tratamiento con mAb M735 anti-IL-17RB, mAb M751 anti-IL-17RA, o mAb M819 anti-IL-25 disminuyeron de manera importante parámetros múltiples de inflamación en este modelo de asma de ratón inducida por OVA, el cual es considerado un modelo del padecimiento de inflamación pulmonar tal como asma en los humanos. En contraste, el tratamiento con el mAb anti-IL-17A o el mAb anti-IL-17F no disminuyó de manera importante la inflamación en este modelo. Por lo tanto, el IL-25 y sus receptores IL-17RB e IL-17RA juegan un rol importante en la aportación de la inflamación del modelo de asma de ratón OVA.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un método para inhibir la activación del complejo receptor heteromérico IL-17RA-IL-17RB, el cual comprende exponer una célula que expresa por lo menos un antagonista de IL-17RA e IL-17RB o uno de IL-17RA-IL-17RB de modo que la activación de un complejo receptor heteromérico IL-17RA-IL-17RB por el IL-25 es inhibida parcial o completamente.
2. El método tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el antagonista de IL-17RA-IL-17RB es una proteína de enlace del antígeno.
3. El método tal y como se describe en la reivindicación 2, caracterizado porque la proteína de enlace del antígeno se enlaza al complejo receptor heteromérico IL-17RA-IL-17RB o a una subunidad del mismo.
4. El método tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 3, caracterizado porque la formación de un complejo receptor heteromérico de IL-17RA-IL-17RB es parcialmente o completamente inhibida.
5. El método tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 4, caracterizado porque la liberación de por lo menos un portador pro-inflamatorio es parcial o completamente inhibida.
6. El método tal y como se describe en la reivindicación 5, caracterizado porque el portador pro-inflamatorio es seleccionado del grupo consistente de: IL-5, IL-6, IL-8, IL-13 , CXCL1, CXCL2, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, I L-1 ß. TNFa, RANK-L, LIF, PGE2, IL-12, MMP3, MMP9, GROa, y NO.
7. Un método para inhibir la activación del complejo receptor heteromérico IL-17RA-IL-17RB in vivo, que comprende exponer una célula que expresa por lo menos el IL-17RA y el IL-17RB a un antagonista de IL-17RA-IL-17RB de modo que la activación del complejo receptor heteromérico IL-17RA-IL-17RB por el IL-25 es parcial o completamente inhibida.
8. El método tal y como se describe en la reivindicación 7, caracterizado porque el antagonista de IL-17RA-IL-17RB es una proteína de enlace del antígeno.
9. El método tal y como se describe en la reivindicación 8, caracterizado porque la proteína de enlace del antígeno enlaza el complejo receptor heteromérico IL-17RA-IL-17RB o una subunidad del mismo.
10. El método tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 7 a la 9, caracterizado porque la formación de un complejo receptor heteromérico IL-17RA-IL-17RB es inhibida parcial o completamente.
11. El método tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 7 a la 10, caracterizado porque la liberación de por lo menos un portador pro-inflamatorio es inhibida parcial o completamente.
12. El método tal y como se describe en la reivindicación 11, caracterizado porque el portador pro-inflamatorio es seleccionado del grupo consistente de: IL-5, IL-6, IL-8, IL-13, CXCL1, CXCL2, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, IL-1 p, TNFa, RANK-L, LIF, PGE2, I L-12, MMP3, MMP9, GROa, y NO.
13. El método tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 7 a la 12, caracterizado porque el antagonista de IL-17RA-IL-17RB es administrado a un individuo afligido por una enfermedad auto-inmune o inflamatoria.
14. El método tal y como se describe en la reivindicación 13, caracterizado porque la enfermedad autoinmune o inflamatoria es seleccionada del grupo consistente de Síndrome de Enfermedad Respiratoria Aguda (ARDS), síndrome de agotamiento respiratorio, bronquitis, y la capacidad de hiper-respuesta de las vías aéreas asociada con las condiciones inducidas por virus tales como el virus sincitial respiratorio (RSV), virus de parainfluenza (PIV), rinovirus ( V) y adenovirus.
15. El método tal y como se describe en las reivindicaciones 13 ó 14, caracterizado porque el antagonista de I L-17RA-I L-17RB reduce o alivia parcial o completamente los signos y/o síntomas de la enfermedad autoinmune o inflamatoria.
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Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7767206B2 (en) 2006-10-02 2010-08-03 Amgen Inc. Neutralizing determinants of IL-17 Receptor A and antibodies that bind thereto
GB0905972D0 (en) * 2009-04-06 2009-05-20 Medical Res Council Antibodies against IL-17BR
PT3295957T (pt) 2010-01-15 2019-11-12 Kirin Amgen Inc Formulação de anticorpo anti il-17ra e regimes terapêuticos para o tratamento de psoríase
PL2552961T3 (pl) 2010-03-30 2018-04-30 Janssen Biotech, Inc. Humanizowane przeciwciała il-25
EP2725034B1 (en) * 2010-09-22 2019-04-03 Amgen Inc. Carrier immunoglobulins with no specificity for human tissues and uses thereof
CN102188707B (zh) * 2011-02-25 2015-08-05 中国医学科学院基础医学研究所 Il-17抑制剂在制备治疗流感的药物中的用途
US20140234330A1 (en) * 2011-07-22 2014-08-21 Amgen Inc. Il-17 receptor a is required for il-17c biology
DK2858670T3 (en) * 2012-06-12 2018-10-22 Orega Biotech Antagonists of IL-17 isoforms and their applications
US9757395B2 (en) 2012-12-20 2017-09-12 Otitopic Inc. Dry powder inhaler and methods of use
US9757529B2 (en) 2012-12-20 2017-09-12 Otitopic Inc. Dry powder inhaler and methods of use
WO2014178891A1 (en) 2013-04-30 2014-11-06 Otitopic Inc. Dry powder formulations and methods of use
US9858304B2 (en) * 2014-04-15 2018-01-02 Raytheon Company Computing cross-correlations for sparse data
WO2016070062A2 (en) * 2014-10-31 2016-05-06 Genentech, Inc. Anti-il-17a and il-17f cross reactive antibody variants and compositions comprising and methods of making and using same
WO2018018082A1 (en) 2016-07-26 2018-02-01 The Australian National University Immunostimulatory compositions and uses therefor
CN106729634A (zh) * 2017-01-05 2017-05-31 中国科学院微生物研究所 白介素17在抵御流感病毒侵染中的应用
WO2019059953A2 (en) 2017-09-22 2019-03-28 Otitopic Inc. DRY POWDER COMPOSITIONS CONTAINING MAGNESIUM STEARATE
US10786456B2 (en) 2017-09-22 2020-09-29 Otitopic Inc. Inhaled aspirin and magnesium to treat inflammation
TW202241489A (zh) * 2020-12-14 2022-11-01 中央研究院 細胞激素-17b受體（il-17rb）之拮抗劑及其用途
TWI811957B (zh) * 2021-01-14 2023-08-11 中央研究院 重組多肽，包含該重組多肽的複合物，以及其用途

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ306653A (en) * 1995-03-23 1999-03-29 Immunex Corp Isolated dna il-17 receptors
US6680057B1 (en) * 1995-03-23 2004-01-20 Immunex Corporation Methods of treating autoimmune disease by administering interleukin-17 receptor
US6849719B2 (en) * 1997-09-17 2005-02-01 Human Genome Sciences, Inc. Antibody to an IL-17 receptor like protein
US6482923B1 (en) * 1997-09-17 2002-11-19 Human Genome Sciences, Inc. Interleukin 17-like receptor protein
US6635443B1 (en) * 1997-09-17 2003-10-21 Human Genome Sciences, Inc. Polynucleotides encoding a novel interleukin receptor termed interleukin-17 receptor-like protein
US20030180255A1 (en) * 2000-08-24 2003-09-25 Genentech, Inc. IL-17 homologous polypeptides and therapeutic uses thereof
MXPA03003407A (es) * 2000-10-18 2004-05-04 Immunex Corp Metodos para el tratamiento de artritis reumatoide usando antagonistas il-17.
AU2006214384A1 (en) * 2005-02-14 2006-08-24 University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education Use of IL-17F in diagnosis and therapy of airway inflammation
JP2009507023A (ja) * 2005-09-01 2009-02-19 シェーリング コーポレイション 自己免疫性眼炎症性疾患を処置するためのｉｌ−２３およびｉｌ−１７のアンタゴニストの使用
US7767206B2 (en) * 2006-10-02 2010-08-03 Amgen Inc. Neutralizing determinants of IL-17 Receptor A and antibodies that bind thereto
CA2687720A1 (en) * 2007-06-13 2008-12-24 Amgen Inc. Il-17 heteromeric receptor complex
JP5561689B2 (ja) * 2007-11-28 2014-07-30 独立行政法人理化学研究所 Ｉｌ−１７ｒｂ陽性ｎｋｔ細胞を用いたアレルギー性気道炎症及び／又は気道過敏症の治療薬のスクリーニング方法

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