MX2009002926A - Combinaciones de inhibidores de histona desacetilasa especificos de clase-i con inhibidores del proteasoma. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a combinaciones de un inhibidor del proteasoma y un inhibidor específico de histona desacetilasa de clase I para la inhibición del crecimiento de las células tumorales, utilizados en el tratamiento del cáncer.

Description

COMBINACIONES DE INHIBIDORES DE HISTONA DESACETILASA ESPECIFICOS DE CLASE-I CON INHIBIDORES DEL PROTEASOMA MEMORIA DESCRIPTIVA La presente invención se refiere a inhibidores de histona desacetilasa (HDAC) en combinaciones con inhibidores del proteasoma. Se refiere un procedimiento para su preparación, hacia composiciones que las comprenden, así como su uso, como una medicina, por ejemplo como una medicina para inhibir tumores hematopoiéticos tales como linfomas y leucemias. La familia de enzimas HDAC se ha nombrado después de su primer sustrato identificado, es decir, las proteínas nucleares histona. Las proteínas histona (H2A, H2B, H3 y H4) a partir de un complejo octámero, alrededor de la cual la hélice de ADN se envuelve con el objeto de establecer una estructura condensada de cromatina. El estado de acetilación de las histonas se encuentra en equilibrio dinámico gobernado por las histona acetil transferasas (HATs), las cuales acetilan y las HDACs las cuales son responsables para la deacetilación de los extremos de la histona. La inhibición de la enzima HDAC promueve la acetilación de los extremos de nucleosoma histona, favoreciendo una estructura de cromatina más transcripcionalmente competente, la cual a su vez lleva a una expresión alterada de genes implicados en los procesos celulares tales como proliferación celular, apoptosis y diferenciación. En años recientes, se ha identificado un número creciente de sustratos adicionales de HDAC no-histona. El reclutamiento desregulado y constante de HDAC en conjunción con factores para la transcripción oncogénica con respecto a la cromatina se ha observado en formas específicas de leucemia y linfoma, tales como la leucemia promielocítica aguda (APL), el linfoma no de Hodgkin y la leucemia mieloide aguda (AML). La sobrerregulación de HDAC1 a nivel de proteína se observó en las células de cáncer de próstata, conforme la enfermedad progresa desde lesiones malignas y adenocarcinoma bien diferenciado de la próstata que responde a andrógeno hasta el cáncer de próstata fenotípicamente de-diferenciado que es insensible a andrógeno. Además, la expresión incrementada de HDAC2 se encontró en la mayoría de los explantes de cáncer de colon de humano la cual es activada por la pérdida del supresor tumoral de adenomatosis poliposis coli (APC). De acuerdo con el equilibrio de actividad de HDAC/HAT en el cáncer, se ha mostrado que los inhibidores de HDAC inducen la detención del ciclo celular, la diferenciación terminal y/o la apoptosis en un amplio espectro de líneas de células tumorales en humano in vitro, para inhibir la angiogénesis y para exhibir la actividad antitumoral in vivo en modelos de xenoinjerto de humano en ratones desnudos. La familia de enzimas de la HDAC comúnmente se divide en 3 clases: es decir, clases I, II y III. Solamente las clases I y II han sido implicadas predominantemente para mediar los efectos de los inhibidores de HDAC actualmente en desarrollo clínico. Se ha mostrado que el grupo clase I de las HDACs, que consiste de los miembros 1 -3 y 8 de la familia HDAC es crucial para la proliferación de la célula tumoral. Entre la amplia variedad de factores de transcripción que utilizan a las HDACs clase-I para silenciar promotores específicos, el ejemplo mejor conocido es la clase de receptores de hormonas nucleares, que solamente se une a HDAC3 en ausencia de su ligando, y por lo tanto mantiene un estado de silenciamiento transcripcional. El complejo se disocia de manera dependiente del ligando, por ejemplo, por retinoides, estrógenos, andrógenos, etcétera, resultando en la expresión y diferenciación del gen. Otro ejemplo clave es el silenciamiento dependiente de HDAC1 del inhibidor de la cinasa dependiente de ciclina p2l wa,1 ciP1 . El papel crucial de la inducción de P21 waf1'cip1 en los efectos antlproliferativos de los inhibidores de HDAC se demostró por estudios que muestran un incremento de 6 veces en la resistencia a la tricostatina A inhibidora de HDAC (TSA) en células deficientes en P2i wa,1 'c¡P1 en comparación con las células parentales HCT-1 16. Además, a diferencia de los genes supresores de tumores genuinos, p2iwaf1 cip se encuentra presente de manera ubicua en las células tumorales, y se induce por los inhibidores de HDAC. Las histonas no son el único sustrato de las HDACs clase-l. Por ejemplo, las HDACs 1 -3 deacetilan el supresor tumoral p53, el cual como una consecuencia se ubiquitina y se degrada. Puesto que p53 es un supresor tumoral potente, incluyendo el paro del ciclo celular y la apoptosis, el mantenimiento de bajos niveles de esta proteína es clave para permitir la supervivencia y la proliferación no controlada de las células tumorales. Las HDACs clase-ll se pueden dividir en 2 subclases: la clase-lia que contiene las HDACs 4, 5, 7, 9 y la variante de procesamiento MITR HDAC 9. La clase-llb comprende HDAC 6 y HDAC 10, ambas con dominios HDAC duplicados. Las HDACs clase-lia no poseen una actividad intrínseca de histona desacetilasa pero regulan la expresión génica al funcionar como los factores de unión puesto que se asocian tanto con los complejos HDAC clase-1 como con los complejos del factor de transcripción/ADN. HDAC6, un miembro de la clase-llb, ha recibido atención debido a su identificación como una desacetilasa de Hsp90. Se ha demostrado que los inhibidores de HDAC LAQ824 y LBH589 inducen la deacetilación de Hsp90 mientras que trapoxina y el butirato de sodio no lo hacen. La Hsp90 desacetilasa resulta en la degradación de Hsp90 asociada con las proteínas cliente pro-supervivencia y pro-proliferativa. Los ejemplos clave incluyen Her-2, Bcr-Abl, receptor glucocorticoide, FLT-3 mutante, c-Raf y Akt. Además de Hsp90, HDAC6 también media la deacetilación de la tubulina que resulta en la desestabilización de los microtúbulos bajo condiciones de estrés. El papel biológico de HDAC6 se confirmó inicialmente por el hecho de que un inhibidor específico de molécula pequeña de HDAC6, tubacina, ocasionó una hiperacetilación de la a-tubulina y disminuyó la motilidad celular sin afectar la progresión del ciclo celular. La tubacina, que inhibe solamente el dominio desacetilasa de la a-tubulina de HDAC6, ocasiona solamente un incremento mínimo en la acetilación de HSP90. De conformidad, se encontró que HDAC6 es clave para la migración celular estimulada por estadio de las células de carcinoma de mamá MCF-7. Finalmente, HDAC6 desempeña un papel crucial en el manejo celular de proteínas mal plegadas y la eliminación de éstas del citoplasma. Debido al gran número de proteínas reguladoras del ciclo celular reguladas por HDACs al nivel ya sea de su expresión o actividad, el efecto antiproliferativo de los inhibidores de HDAC no se pueden asociar con un único mecanismo de acción. La inhibición de HDAC mantiene un compromiso particular en la terapia anticáncer, en donde los efectos concertados en múltiples rutas implicadas en la inhibición del crecimiento, diferenciación y apoptosis pueden probar ser ventajosos en el tratamiento de una patología heterogénea tal como formación y crecimiento tumoral. A lo largo de los años, se ha vuelto evidente que las HDACs no solamente desempeñan un papel clave en la carcinogénesis, sino también en numerosos procesos de diferenciación no malignos. Esto es más evidente para la clase-lia 4, 5, 7 y 9. Por ejemplo, se ha sugerido que HDAC 7 desempeña un papel crítico en la maduración tímica de las células T, mientras que HDAC 4 ha sido implicada en la regulación de la hipertrofia del condrocito y la formación del hueso endocondral. Sin embargo, la mayoría de las preocupaciones se han enfocado en el papel de las HDACs clase-lia en la diferenciación muscular. Las HDACs 4, 5, 7 y 9 suprimen la diferenciación de los miocitos (células musculares) como una consecuencia de ser co-represores transcripcionales del factor potenciador del miocito 2 (MEF2). La toxicidad más común observada con los inhibidores de HDAC es la mielosupresión de grado leve a moderado. Además, las náuseas/vómito, fatiga y diarrea son característicos como efectos adversos en muchos ensayos clínicos. El documento EP 1485365 publicado el 18 de septiembre de 2003 describe la preparación, formulación y propiedades farmacéuticas con la siguiente fórmula de Markush. las formas N-óxido, las sales de adición farmacéuticamente aceptables y las formas estereoquímicamente isoméricas de las mismas, en donde n, m, t, R1, R2, R3, R4, L, Q, X, Y, Z y tienen los significados como se definió en dicha especificación.

El documento WO 2006/010750 publicado el 2 de febrero del 2006 describe entre otros al inhibidor de HDAC JNJ26481585 Sin embargo, el potencial para la terapia con inhibidor de HDAC va más allá del uso de un agente único. Las rutas moleculares afectadas por los inhibidores de HDAC lo hacen un candidato prometedor para estudios combinatoriales. Existe una necesidad para inhibidores específicos de HDAC clase-l que puedan ofrecer ventajas clínicas considerando la eficiencia y/o toxicidad, ya sea solos o en combinaciones con otros agentes terapéuticos, También la inhibición del proteasoma representa una estrategia importante recientemente desarrollada en la terapia del cáncer. El proteasoma es un complejo multi-enzimático presente en todas las células que desempeñan un papel en la degradación de proteínas implicadas en la regulación del ciclo celular. Numerosas proteínas reguladoras clave, incluyendo p53, ciclinas y la cinasa dependiente de ciclina p2iwa,1'cip1 son temporalmente degradadas durante el ciclo celular por la ruta de ubiquitina- proteasoma. La degradación ordenada de estas proteínas se requiere para que la célula progrese a lo largo del ciclo celular y lleve a cabo la mitosis.

Además, la ruta ubiquitina-proteasoma se requiere para la regulación transcripcional. Los documentos EP788360, EP1312609, EP1627880, US 6066730 y US 6083903 describen compuestos de éster y ácido péptido borónico útiles como inhibidores del proteasoma. Uno de los compuestos de ácido N-pirazincarbonil-L-fenilalanina-L-leucina borónico (PS-341 , actualmente conocido como bortezomib o Velcade (Millenium)) tiene actividad antitumoral en modelos de xenoinjerto de tumor de humano y recientemente se ha probado para el tratamiento de pacientes que tienen recaída de mieloma múltiple refractario, y actualmente se llevan a cabo ensayos clínicos en indicaciones adicionales, incluyendo cánceres hematológicos adicionales así como tumores sólidos. Bortezomib induce la muerte celular al ocasionar una acumulación de proteínas mal plegadas y de otra manera dañadas, activando así la ruta mitocondrial de la apoptosis, por ejemplo vía mecanismos dependientes de Bax- o de especies de oxígeno reactivas. Bortezomib ocasiona el secuestro de proteínas conjugadas a ubiquitina dentro de estructuras denominados agresomas. Los agresomas parecen participar en una respuesta citoprotectora que se activa en respuesta a la inhibición del proteasoma tal vez mediante envío de las proteínas ubiquitiladas hacia los lisosomas para su degradación. La formación del agresoma inducida por Bortezomib se podría alterar utilizando el inhibidor de HDAC SAHA (ácido suberoilanilida hidroxámico). SAHA también demuestra efectos sinergísticos sobre la apoptosis in vitro y en un modelo de xenoinjerto orthotópico de cáncer pancreático in vivo (Cáncer Research 2006; 66: (7) 3773-3781 ). Otro inhibidor de HDAC LAQ824 también demuestra niveles sinergísticos de muerte celular con bortezomib (Journal of Biological Chemistry 2005; 280: (29) 26729-26734). El efecto sinergístico de SAHA y LAQ824 con bortezomib ha sido relacionado con su actividad inhibidora de HDAC6. Existe una necesidad adicional para incrementar la eficiencia inhibidora de inhibidores del proteasoma en contra del crecimiento tumoral y también para proveer menores dosis de dichos agentes para reducir el potencial de efectos laterales tóxicos adversos al paciente. Hasta el momento no están disponibles datos fiables de la correlación de grado de acetilación con respecto a la respuesta tumoral. Los métodos rápidos, simples y fácilmente reproducibles para la cuantificación del grado de acetilación de los sustratos de histona y de no histona ocasionado por los inhibidores de HDAC específicos de clase I descritos a continuación o combinaciones que comprenden dichos inhibidores de HDAC serán cruciales para su futuro. Es un objetivo de la invención proveer inhibidores de HDAC específicos de clase I y combinaciones terapéuticas de un inhibidor del proteasoma e inhibidores de HDAC del tipo descrito a continuación que pueden tener efectos potentes y característicos de la acetilación, efectos de inhibición de HDAC específicos de clase I, efecto inhibidor ventajoso en contra del crecimiento de la célula tumoral, y menos efectos laterales no deseables. Por lo tanto, de conformidad con la invención proveemos una combinación de un inhibidor del proteasoma y un inhibidor de HDAC de fórmula (I) las sales de adición ácidas o básicas farmacéuticamente aceptables y las formas estereoquímicamente isoméricas de las mismas, en donde radical seleccionado a partir de R5 se selecciona a partir de hidrógeno; tienilo; tienilo sustituido con di(alquilo de Ci-6)aminoalquilo de C-i-6, o alquilo de Ci-6piperazinilalquilo de Ci-6¡ furanilo; fenilo; o fenilo sustituido con un sustituyente independientemente seleccionado a partir de di(alquilo de C-i-^aminoalquiloxi de Ci-4, di(alquilo de Ci-4)amino, di(alquilo de Ci-4)aminoalquilo de C1-4, di(alqu¡lo de Ci-4)aminoalquilo de Ci-4(alquilo de Ci-4)am¡noalqu¡lo de C1-4, pirrolidinilalquilo de C .4l pirrolidinilalquiloxi de Ci-4 o alquilo de Ci-4piperazinilalquilo de Ci-4. Las líneas dibujadas en los sistemas de anillo bicíclico a partir de los sustituyentes indica que los enlaces pueden estar unidos a cualquiera de los átomos del anillo adecuado del sistema de anillo bicíclico. Como se utilizó en las definiciones precedentes y en adelante alquilo de Ci-4 define radicales hidrocarburos saturados de cadena recta y ramificada que tienen de 1 a 4 átomos de carbono tales como, por ejemplo metilo, etilo, propilo, butilo, 1 -metiletilo, 2-metilpropilo y los similares; alquilo de Ci -6 incluye alquilo de Ci-4 y los homólogos superiores de los mismos que tienen de 5 a 6 átomos de carbono tales como, por ejemplo, pentilo, 2-metil-butilo, hexilo, 2-metilpentilo y los similares. Los compuestos interesantes de fórmula (I) son aquellos compuestos de fórmula (I) en donde es (a-2) También los compuestos interesantes son aquellos compuestos de fórmula (I) en donde R5 es hidrógeno. Incluso los compuestos interesantes son aquellos compuestos de fórmula (I) en donde R5 se encuentra en la posición para.

Los compuestos preferidos de fórmula (I) son los compuestos No. 6, No. 100, No. 104, No. 128, No. 144, No. 124, No. 154, No. 125, No. 157, No. 156, No. 159, No. 163, No. 164, No. 168, No. 169, No. 127, No. 171 , No. 170, No. 172 y No. 173 que corresponden a la numeración como se indica en el cuadro en las páginas 21-23 en el documento EP 1485365.

El compuesto más preferido de fórmula (I) es el compuesto en donde (comPuesto No- 6 (R306465) en EP 1485365) o una sal de adición farmacéuticamente aceptable del mismo. Como se utiliza en la presente invención, se pretende que los términos "histona desacetilasa" y "HDAC" se refieran a cualquiera de una familia de enzimas que remueven grupos acetilo a partir de los grupos e-amino de residuos de lisina en el extremo N-terminal de una histona. A menos que se indique de otra manera por el contexto, se pretende que el término "histona" se refiera a cualquier proteína histona, incluyendo H1 , H2A, H2B, H3, H4, y H5, a partir de cualquier especie. Las proteínas HDAC de humano o los productos génicos, incluyen, pero no se limitan a, HDAC-1 , HDAC-2, HDAC-3, HDAC-4, HDAC-5, HDAC-6, HDAC-7, HDAC-8, HDAC-9, HDAC-10 y HDAC-11. La histona desacetilasa también se puede derivar a partir de una fuente de protozoo o fungal. El término "inhibidor de histona desacetilasa" o "inhibidor de histona desacetilasa" se utiliza para identificar un compuesto, que es capaz de interactuar con una histona desacetilasa e inhibir su actividad, más particularmente su actividad enzimática. La inhibición de la actividad enzimática de la histona desacetilasa significa una reducción de la capacidad de una histona desacetilasa para remover un grupo acetilo a partir de un sustrato de histona u otra proteína. Preferiblemente, dicha inhibición es específica, es decir el inhibidor de la histona desacetilasa reduce la capacidad de una histona desacetilasa para remover un grupo acetilo a partir de un sustrato de histona u otra proteína a una concentración que es menor que la concentración del inhibidor que se requiere para producir algún otro efecto biológico no relacionado. El término "inhibición de HDAC específica de clase I" o "inhibidor de HDAC específico de clase I" se utiliza para identificar compuestos que reducen la actividad enzimática de un miembro de la familia HDAC clase I (HDAC 1 -3 u 8) a una concentración que es menor que la concentración del inhibidor que se requiere para producir la inhibición de otras clases de enzimas HDAC tales como por ejemplo HDACs clase Ha o clase llb. Como se utiliza en la presente invención, los términos "proteasoma" y "sistema de ubiquitina-proteasoma (UPS)" se pretende que se refieran a cualquiera de las estructuras y funciones de todos los componentes en el UPS que incluyen, pero no se limitan a: a) la ubiquitina (Ub) y proteínas semejantes a ubiquitina (U1p); por ejemplo SUMO, NEDD8, ISG15 y los similares, b) monómeros de ubiquitina, cadenas de poliubiquitina asociadas a K48, cadenas de poliubiquitina asociadas a K63 y los similares, c) las enzimas que activan E1 ubiquitina; por ejemplo E1Ub, E 1 SUMO E 1 NEDD8I E1 'SG15 y los similares, d) subunidades de las enzimas que activan E1 ubiquitina; por ejemplo APPBP1 , UBA3, SAE1 , SAE2 y los similares, e) las enzimas que se conjugan con E2 ubiquitina; por ejemplo UBC9, UBC12, UBC8 y las similares, f) las E3 ubiquitina ligasas; por ejemplo RING-finger E3s, RING-finger E3s simple, RING-finger E3s basadas en culina, E3s dependientes de RBX1 -/RBX2, E3s dominio HECT, E3s U-box, y los similares, g) el complejo SCF (SKP1 -Culina1 -F-box) E3 ubiquitina ligasa, por ejemplo SCFSKP2, SCFB TRCP, SCFFBW7 y los similares, h) las culinas, por ejemplo CUL1 , CUL2, CUL3, CUL4, CUL5 y las similares, i) las proteínas F-box por ejemplo SKP2, proteínas B-TRCP, proteínas FBW y las similares, j) otros adaptadores específicos del sustrato, por ejemplo proteínas BTB, proteínas SOCS-box, DDB1/2, VHL y las similares, k) el proteasoma, sus componentes y los similares, I) la metaloisopeptidasa RPN1 1 , una subunidad de la tapa del proteasoma, que desubiquitila los blancos de UPS antes de su destrucción, y las similares, m) la metaloisopeptidasa CSN5, una subunidad del complejo COP9-signalosoma, que es responsable de la remoción de NEDD8 a partir de las culinas, y las similares, n) el paso de activación, por una enzima que activa la E1 ubiquitina, en la cual la Ub/Ulp inicialmente se adenila en su residuo glicina C-terminal y luego se carga como un tiol éster, en contra de su extremo C-terminal, o) la transferencia de la Ub/Ulp a partir de una enzima que activa E1 ubiquitina hacia una enzima que se conjuga con E2 ubiquitina, p) reconocimiento del conjugado de ubiquitina, q) transferencia y unión del complejo de sustrato-ubiquitina con el proteasoma, r) remoción de la ubiquitina, o s) degradación del sustrato. El término "inhibidor del proteasoma" e "inhibidor del sistema de ubiquitina-proteasoma" se utiliza para identificar un compuesto, que es capaz de ¡nteractuar con uno de los componentes normales, alterados, hiper-activos o sobre-expresados en el UPS e inhibe su actividad, más particularmente su actividad enzimática. La inhibición de la actividad enzimática del UPS significa la reducción de la capacidad de un componente de UPS para llevar a cabo su actividad. Preferiblemente, dicha inhibición es específica, es decir el inhibidor del proteasoma reduce la actividad de un componente del UPS a una concentración que es menor que la concentración del inhibidor que se requiere para producir algún otro efecto biológico no relacionado. Los inhibidores de la actividad de un componente de UPS incluyen, pero no se limitan a: a) inhibidores de adenilación de Ub o Ulp al bloquear el acceso de Ub/Ulp al sitio de adenilato o al bloquear el acceso del ATP; por ejemplo imatinib (Gleevec; Novartis) y los similares, b) alteradores de la interacción del E3 o complejo E3 con E2, c) interruptores de la interacción entre el sustrato y el dominio de interacción con el sustrato en el E3 o complejo E3, tales como el bloqueo de la interacción entre p53 (el sustrato) y MDM2 (el RING-finger E3) por ejemplo nutlinas (mediante la unión a MDM2), RITA (mediante la unión al N terminal de p53) y los similares, d) interruptores del complejo E3 ligasa, e) reclutadores artificiales de sustratos hacia las ubiquitina ligasas, por ejemplo protacs y los similares, f) inhibidores del proteasoma y sus componentes por ejemplo bortezomib, carfilzomib, NPI-0052, Bsc21 18 y los similares, g) inhibidores de la remoción de ubiquitina/Ulp tales como inhibidores de las metaloisopeptidasas RPN1 1 y CSN5, o h) modificado la cadena de poliubiquitina por ejemplo ubistatinas y las similares. Se pretende que las sales de adición ácida farmacéuticamente aceptables como se mencionó anteriormente comprendan las sales de adición ácida no tóxicas terapéuticamente activas que son capaces de formar los compuestos de fórmula (I). Los compuestos de fórmula (I) que tienen propiedades básicas se pueden convertir hacia sus sales de adición ácida farmacéuticamente aceptables mediante tratamiento de dicha forma básica con un ácido apropiado. Los ácidos apropiados comprenden, por ejemplo, ácidos inorgánicos tales como ácidos hidrastáticos (haluros ácidos en solución acuosa), por ejemplo ácido clorhídrico o bromhídrico; sulfúrico; nítrico; fosfórico y los ácidos similares; o ácidos orgánicos tales como, por ejemplo, ácidos acético, trifluoroacético, propanóico, hidroxiacético, láctico, pirúvico, oxálico, malónico, succínico (es decir ácido butanedióico), maléico, fumárico, málico, tartárico, cítrico, metansulfónico, etansulfónico, bencensulfónico; p-toluensulfónico, ciclámico, salicílico, p-amino-salicílico, pamóico y los similares.

Los compuestos de fórmula (I) que tienen propiedades ácidas se pueden convertir hacia sus sales de adición básicas farmacéuticamente aceptables mediante el tratamiento de dicha forma ácida con una base orgánica o inorgánica adecuada. Las formas de sales básicas apropiadas comprenden, por ejemplo, las sales de amonio, las sales de metal álcali y metal alcalino térreo, por ejemplo las sales de litio, sodio, potasio, magnesio, calcio y los similares, sales con bases orgánicas, por ejemplo las sales de benzatina, N-metil-D-glucamina, hidrabamina, y sales con aminoácidos tales como, por ejemplo, arginina, lisina y las similares. Los términos sal de adición ácida o básica también comprenden los hidratos y se pueden formar las formas de adición disolventes con los compuestos de fórmula (I). Los ejemplos de dichas formas son por ejemplo hidratos, alcoholatos y los similares. El término formas estereoquímicamente isoméricas de los compuestos de fórmula (I) como se utiliza anteriormente en la presente invención, define todos los posibles compuestos elaborados a partir de los mismos átomos unidos por la misma secuencia de enlaces pero que tienen diferentes estructuras tridimensionales que no son intercambiables, que pueden poseer los compuestos de fórmula (I). A menos que se mencione o se indique de otra manera, la designación química de un compuesto abarca la mezcla de todas las formas estereoquímicamente isoméricas posibles que puede poseer dicho compuesto. Dicha mezcla puede contener todos diestereomeros y/o enantiomeros de la estructura molecular básica de dicho compuesto. Se pretende que todas las formas estereoquímicamente isoméricas de los compuestos de fórmula (I) tanto en forma pura o en mezcla entre sí se incluyan dentro del alcance de la presente Invención. Algunos de los compuestos de fórmula (I) también pueden existir en sus formas tautoméricas. Aunque dichas formas no se indican explícitamente en la fórmula anteriormente mencionada, se pretende que se incluyan dentro del alcance de la presente invención. Siempre que se utilice a continuación, se pretende que el término "compuestos de fórmula (I) también incluya las sales de adición ácida o básica farmacéuticamente aceptables y todas las formas estereoisoméricas. Un inhibidor del proteasoma particularmente preferido para uso de conformidad con la invención es bortezomib. Bortezomib está comercialmente disponible a partir de Millennium bajo el nombre registrado de Velcade y se puede preparar por ejemplo como se describe en los documentos EP788360, EP1312609, EP1627880, US 6066730 y US 6083903 o mediante procedimientos análogos a éstos. La presente invención también se refiere a combinaciones de conformidad con la invención para uso en terapia médica, por ejemplo para inhibir el crecimiento de las células tumorales. La presente invención también se refiere al uso de combinaciones de conformidad con la invención para la preparación de una composición farmacéutica para inhibir el crecimiento de células tumorales.

La presente invención también se refiere a un método para inhibir el crecimiento de células tumorales en un sujeto humano que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de una combinación de conformidad con la invención. Esta invención provee adicionalmente un método para inhibir el crecimiento anormal de las células, incluyendo células transformadas, mediante la administración de una cantidad efectiva de una combinación de conformidad con la invención. El crecimiento anormal de las células se refiere al crecimiento celular independiente de los mecanismos regulatorios normales (por ejemplo pérdida de inhibición por contacto). Esto incluye la inhibición del crecimiento tumoral tanto directamente al ocasionar la detención del crecimiento, la diferenciación terminal y/o la apoptosis de las células cancerosas, como indirectamente, mediante la inhibición de la migración, invasión y supervivencia de las células tumorales o la neovascularización de los tumores. Esta invención también provee un método para inhibir el crecimiento tumoral mediante la administración de una cantidad efectiva de una combinación de conformidad con la presente invención, a un sujeto, por ejemplo un mamífero (y más particularmente un humano) que necesita de dicho tratamiento. En particular, esta invención provee un método para inhibir el crecimiento de los tumores mediante la administración de una cantidad efectiva de la combinación de conformidad con la presente invención. La presente invención es particularmente aplicable al tratamiento del cáncer pancreático, tumores hematopoiéticos de linaje linfoide por ejemplo leucemia linfoblástica aguda, leucemia mielógena aguda, leucemia promielocítica aguda, leucemia mieloide aguda, leucemia monocítica aguda, linfoma, leucemia crónica de célula B, leucemia mieloide crónica, leucemia mieloide crónica en crisis blástica, linfoma de Burkitt y mieloma múltiple, cáncer pulmonar no de célula pequeña, cáncer pulmonar de célula pequeña, linfoma no de Hodgkin, melanoma, cáncer de próstata, cáncer de mama y cáncer de colon. Los ejemplos de otros tumores que se pueden inhibir incluyen, pero no se limitan a, cáncer folicular tiroideo, síndrome mielodisplástico (MDS), tumores de origen mesenquimal (por ejemplo fibrosarcomas y rabdomiosarcomas), teratocarcinomas, neuroblastomas, gliomas, tumor benigno de la piel (por ejemplo queratoacantomas), carcinoma de riñon, carcinoma de ovario, carcinoma de vejiga y carcinoma epidermal. Esta invención también provee un método para el tratamiento de leucemia linfoblástica aguda, leucemia mielógena aguda, leucemia promielocítica aguda, leucemia mieloide aguda, leucemia monocítica aguda, linfoma, leucemia crónica de célula B, leucemia mieloide crónica, leucemia mieloide crónica en crisis blástica, linfoma de Burkitt y mieloma múltiple mediante la administración de una cantidad efectiva de un inhibidor de la histona desacetilasa de fórmula (I), a un sujeto, por ejemplo un mamífero (y más particularmente un humano) que necesita de dicho tratamiento. Esta invención también provee un método para el tratamiento de tumores resistentes a fármacos, tales como pero no limitados a tumores hematopoiéticos de linaje linfoide por ejemplo leucemia linfoblástica aguda resistente a fármacos, leucemia mielógena aguda resistente a fármacos, leucemia promielocítica aguda resistente a fármacos, leucemia mieloide aguda resistente a fármacos, leucemia monocítica aguda resistente a fármacos, linfoma resistente a fármacos, leucemia crónica de célula B resistente a fármacos, leucemia mieloide crónica resistente a fármacos, leucemia mieloide crónica resistente a fármacos en crisis blástica, linfoma de Burkitt resistente a fármacos y mieloma múltiple resistente a fármacos, mediante la administración de una cantidad efectiva de un inhibidor de la histona desacetilasa de fórmula (I), ya sea solo o en combinación con un inhibidor del proteasoma, a un sujeto, por ejemplo un mamífero (y más particularmente un humano) que necesita de dicho tratamiento. La presente invención es particularmente aplicable al tratamiento de mieloma múltiple resistente a fármacos, más particularmente a mieloma múltiple resistente a inhibidores del proteasoma, incluso más particularmente al tratamiento de mieloma múltiple resistente a bortezomib. El término "mieloma múltiple resistente a fármacos" incluye pero no se limita a mieloma múltiple resistente a uno o más fármacos seleccionados a partir del grupo de talidomida, dexametasona, revlimida, doxorubicina, vincristina, ciclofosfamida, pamidronato, melfalan, defibrotida, prednisona, darinaparsina, belinostat, vorinostat, PD 0332991 , LBH589, LAQ824, MGCD0103, HuLuc63, AZD 6244, Pazopanib, P276-00, plitidepsina, bendamustina, tanespimicina.enzastaurina, perifosina, ABT-737 o RAD001 . El término "mieloma múltiple resistente a fármacos" también incluye recaída de mieloma múltiple o mieloma múltiple refractario. Con el término "resistente a fármacos" se entiende una condición que demuestra resistencia intrínseca o resistencia adquirida. Con "resistencia intrínseca" se entiende el perfil de expresión característico de genes clave en células cancerosas en rutas relevantes, incluyendo pero no limitadas a apoptosis, progresión celular y reparación del ADN, que contribuyen a la capacidad de crecimiento más rápida de las células cancerosas cuando se compara con sus contrapartes normales. Con "resistencia adquirida" se entiende un fenómeno multifactorial que se presenta durante la formación y progresión tumoral que puede influir la sensibilidad de las células cancerosas a un fármaco. La resistencia adquirida se puede deber a varios mecanismos tales como, pero no limitados a; alteraciones en los blancos de los fármacos, acumulación disminuida del fármaco, alteración de la distribución intracelular del fármaco, interacción fármaco-blanco reducida, respuesta incrementada de detoxificación, desregulación del ciclo celular, reparación incrementada del ADN dañado, y respuesta apoptótica reducida. Varios de dichos mecanismos se pueden presentar de manera simultánea y/o pueden interactuar entre sí. Su activación y/o inactivación se puede deber a eventos genéticos o epigenéticos o a la presencia de proteínas oncovirales. La resistencia adquirida se puede presentar con respecto a fármacos individuales pero también puede ocurrir de manera más amplia con respecto a muchos fármacos diferentes con diferentes estructuras químicas y diferentes mecanismos de acción. Esta forma de resistencia se denomina resistencia a múltiples fármacos. La combinación de conformidad con la invención se puede utilizar para otros propósitos terapéuticos, por ejemplo: a) la sensibilización de los tumores a la radioterapia mediante la administración del compuesto de conformidad con la invención antes, durante o después de la irradiación del tumor para el tratamiento del cáncer; b) el tratamiento de la artropatía y condiciones osteopatológicas tales como artritis reumatoide, osteoartritis, artritis juvenil, gota, poliartritis, artritis psoriática, espondilitis anquilosante y lupus eritematoso sistémico; c) inhibición de la proliferación de la célula del músculo liso incluyendo trastornos vasculares proliferativos, aterosclerosis y restenosis; d) tratamiento de las condiciones de inflamación y condiciones dermales tales como colitis ulcerativa, enfermedad de Crohn, rinitis alérgica, enfermedad de injerto contra hospedero, conjuntivitis, asma, ARDS, enfermedad de Behcet, rechazo al transplante, urticaria, dermatitis alérgica, alopecia areata, escleroderma, exantema, eczema, dermatomiositis, acné, diabetes, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Kawasaki, esclerosis múltiple, enfisema, fibrosis quística y bronquitis crónica; e) tratamiento de la endometriosis, fibroides uterinos, sangrado uterino disfuncional y hiperplasia endometrial; f) tratamiento de la vascularización ocular incluyendo vasculopatía que afecta los vasos sanguíneos retínales y coroídales; g) tratamiento de una disfunción cardiaca; h) inhibición de las condiciones inmunosupresoras tales como el tratamiento de infecciones por VIH; i) tratamiento de la disolución renal; j) supresión de los trastornos endocrinos; k) inhibición de la disfunción de la gluconeogénesis; I) tratamiento de una neuropatología por ejemplo enfermedad de Parkinson o una neuropatología que resulta en un trastorno cognitivo, por ejemplo, enfermedad de Alzheimer o enfermedades neuronales relacionadas con la poliglutamina; m) tratamiento de trastornos psiquiátricos por ejemplo esquizofrenia, trastorno bipolar, depresión, ansiedad y psicosis; n) inhibición de una patología neuromuscular, por ejemplo, esclerosis lateral amiotrófica; o) tratamiento de la atrofia muscular espinal; p) tratamiento de otras condiciones patológicas susceptibles al tratamiento mediante la expresión potenciadora de un gen; q) mejoría de la terapia génica; r) inhibición de la adipogénesis; s) tratamiento de la parasitosis tal como malaria. Por lo tanto, la presente invención revela las combinaciones anteriormente descritas para uso como una medicina, así como el uso de un inhibidor de HDAC específico de clase I de fórmula (I), ya sea solo o en combinación con un inhibidor del proteasoma, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de una o más de las condiciones anteriormente mencionadas. Por lo tanto, la presente invención revela el uso de un inhibidor de HDAC específico de clase I de fórmula (I), ya sea solo o en combinación, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de leucemia linfoblástica aguda, leucemia mielógena aguda, leucemia promielocítica aguda, leucemia mieloide aguda, leucemia monocítica aguda, linfoma, leucemia crónica de célula B, leucemia mieloide crónica, leucemia mieloide crónica en crisis blástica, linfoma de Burkitt y mieloma múltiple. La presente invención también revela el uso de un HDAC inhibidor específico de clase I de fórmula (I), ya sea solo o en combinación, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de tumores resistentes a fármacos, tales como pero no limitados a, tumores hematopoiéticos de linaje linfoide por ejemplo leucemia linfoblástica aguda resistente a fármacos, leucemia mielógena aguda resistente a fármacos, leucemia promielocítica aguda resistente a fármacos, leucemia mieloide aguda resistente a fármacos, leucemia monocítica aguda resistente a fármacos, linfoma resistente a fármacos, leucemia crónica de célula B resistente a fármacos, leucemia mieloide crónica resistente a fármacos, leucemia mieloide crónica resistente a fármacos en crisis blástica, linfoma de Burkitt resistente a fármacos y mieloma múltiple resistente a fármacos.

La presente invención describe adicionalmente el uso de un inhibidor de HDAC específico de clase I de fórmula (I), ya sea solo o en combinación, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de mieloma múltiple resistente a fármacos, más en particular de mieloma múltiple resistente a inhibidores del proteasoma, incluso más en particular de mieloma múltiple resistente a bortezomib. El inhibidor del proteasoma y el inhibidor de HDAC de fórmula (I) se pueden administrar simultáneamente (por ejemplo en composiciones separadas o unitarias) o secuencialmente en cualquier orden. En el último caso, los dos compuestos serán administrados dentro de un periodo y en una cantidad y manera que es adecuada para asegurar que se alcance un efecto ventajoso o sinergístico. Se apreciará que el método preferido y el orden de administración y las cantidades de dosis respectivas y regímenes para cada componente de la combinación dependerán del inhibidor particular del proteasoma y del inhibidor de HDAC a ser administrado, la ruta de administración de la combinación, el tumor particular a ser tratado y el hospedero particular a ser tratado. El método óptimo y el orden de administración y las cantidades de dosis y el régimen se pueden determinar fácilmente por aquellos expertos en la técnica utilizando métodos convencionales y en vista de la información expuesta en la presente invención. La presente invención se refiere adicionalmente a un producto que contiene como un primer ingrediente activo un inhibidor de HDAC de fórmula (I) y como un segundo ingrediente activo un inhibidor del proteasoma, como una preparación combinada para uso simultáneo, separado o secuencial en el tratamiento de pacientes que padecen de cáncer. Aquellos expertos en la técnica podrían determinar fácilmente la cantidad efectiva a partir de los resultados de prueba presentados a continuación en la presente invención. En general se contempla que una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de fórmula (I) y del inhibidor del proteasoma podría ser de 0.005 mg/kg a 100 mg/kg de peso corporal, y en particular de 0.005 mg/kg a 10 mg/kg de peso corporal. Podría ser apropiado administrar la dosis requerida como dos, tres, cuatro o más sub-dosis a intervalos apropiados a lo largo del día. Dichas sub-dosis se pueden formular como formas de dosis unitarias, por ejemplo, que contienen de 0.5 a 500 mg, y en particular de 10 mg a 500 mg del ingrediente activo por forma de dosis unitaria. En vista de sus propiedades farmacológicas útiles, los componentes de las combinaciones de conformidad con la invención, es decir el inhibidor del proteasoma y el inhibidor de HDAC se pueden formular hacia varias formas farmacéuticas para propósitos de administración. Los componentes se pueden formular separadamente en composiciones farmacéuticas individuales o en una composición farmacéutica unitaria que contiene ambos componentes. Los inhibidores de HDAC se pueden preparar y formular hacia composiciones farmacéuticas mediante métodos conocidos en la técnica y en particular de conformidad con los métodos descritos en la especificación de patente publicada mencionada en la presente invención e incorporada como referencia. Por lo tanto, la presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende un inhibidor del proteasoma y un inhibidor de HDAC de fórmula (I) junto con uno o más vehículos farmacéuticos. Para preparar composiciones farmacéuticas para uso de conformidad con la invención, una cantidad efectiva de un compuesto particular, en forma de sal de adición básica o ácida, como el ingrediente activo se combina en mezcla íntima con un vehículo farmacéuticamente aceptable, dicho vehículo puede tomar una amplia variedad de formas dependiendo de la forma de preparación deseada para administración. Estas composiciones farmacéuticas se encuentran deseablemente en una forma de dosis unitaria adecuada, preferiblemente, para administración oral, rectal, percutánea, o mediante inyección parenteral. Por ejemplo, para la preparación de composiciones en forma de dosis oral, se puede emplear cualquiera de los medios farmacéuticos usuales, tales como, por ejemplo, agua, glicoles, aceites, alcoholes y los similares en el caso de preparaciones líquidas orales tales como suspensiones, jarabes, elixires y soluciones; o vehículos sólidos tales como almidones, azúcares, caolina, lubricantes, aglutinantes, agentes desintegrantes y los similares en el caso de polvos, pildoras, cápsulas y tabletas. Debido a su facilidad para la administración, las tabletas y cápsulas representan la forma de dosis oral unitaria más ventajosa, en cuyo caso obviamente se emplean vehículos farmacéuticos sólidos. Para las composiciones parenterales, el vehículo usualmente comprenderá agua estéril, al menos en gran parte, aunque se pueden incluir otros ingredientes, por ejemplo para ayudar en la solubilidad. Se pueden preparar las soluciones inyectables, por ejemplo, en las cuales el vehículo comprende solución salina, solución de glucosa o una mezcla de solución salina y solución de glucosa. Las suspensiones inyectables también se pueden preparar en cuyo caso se pueden emplear vehículos líquidos apropiados, agentes para suspensión y los similares. En las composiciones adecuadas para administración percutánea, el vehículo comprende opcionalmente un agente mejorador de la penetración y/o un agente humectante adecuado, opcionalmente combinado con aditivos adecuados de cualquier naturaleza en menores proporciones, dichos aditivos no ocasionan un efecto deletéreo significativo a la piel. Dichos aditivos pueden facilitar la administración a la piel y/o pueden ser útiles para la preparación de las composiciones deseadas. Estas composiciones se pueden administrar en diversas formas, por ejemplo, como un parche transdermal, como un medicamento en pipeta (spot-on), como un ungüento. Es especialmente ventajoso formular las composiciones farmacéuticas anteriormente mencionadas en forma de dosis unitaria para facilidad de la administración y uniformidad de la dosis. La forma de dosis unitaria como se utiliza en la especificación y en las reivindicaciones en la presente invención se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias, cada unidad contiene una cantidad predeterminada del ingrediente activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. Los ejemplos de dichas formas de dosis unitaria son tabletas (incluyendo tabletas ranuradas o recubiertas), cápsulas, pildoras, paquetes en polvo, obleas, soluciones inyectables o suspensiones, en cucharaditas, en cucharadas y los similares, y segregados múltiples de los mismos. Puede ser apropiado administrar la dosis requerida de cada componente de la combinación como dos, tres, cuatro o más sub-dosis a intervalos apropiados a lo largo del curso del tratamiento. Las sub-dosis se pueden formular como formas de dosis unitarias, por ejemplo, en cada caso conteniendo independientemente de 0.01 a 500 mg, por ejemplo de 0.1 a 200 mg y en particular de 1 a 100 mg de cada ingrediente activo por forma de dosis unitaria. El término "la inducción de acetilación de histonas u otras proteínas" significa la inducción del estado de la acetilación de los sustratos de HDAC tales como pero no limitados a histonas, por ejemplo histona 3, histona 4 y las similares; tubulina, por ejemplo alfa-tubulina y las similares; proteínas de choque térmico, por ejemplo Hsp 90 y las similares. El término "la inducción de proteínas funcionalmente reguladas por dicha acetilación" significa efectos secundarios tales como pero no limitados a inducción de Hsp70, inducción de p21 y las similares. La invención también se refiere a un método para la caracterización de un inhibidor de HDAC de fórmula (I) ya sea solo o en combinación con un inhibidor del proteasoma que comprende la determinación en una muestra, de la cantidad de inducción de acetilación de histonas u otras proteínas, o de la inducción de proteínas funcionalmente reguladas por dicha acetilación. Más en particular, la invención se refiere a un método para la caracterización de un inhibidor de HDAC de fórmula (I) ya sea solo o en combinación con un inhibidor del proteasoma, que comprende la determinación en una muestra de la cantidad de a) inducción de acetilación de la histona 3, inducción de acetilación de la histona 4, o inducción de p21 y b) inducción de acetilación de alfa-tubulina, inducción de acetilación de Hsp 90, o inducción de Hsp 70. Más particularmente la invención se refiere al método anteriormente mencionado, en donde la concentración necesaria para obtener la inducción según a) es menor que la concentración necesaria para obtener la inducción según b). La determinación en una muestra de la cantidad de inducción de acetilación de histonas u otras proteínas o de la inducción de proteínas funcionalmente reguladas por dicha acetilación puede incluir la identificación de pacientes que responden a un tratamiento y por lo tanto puede tener un efecto benéfico para el tratamiento del cáncer de humano. La determinación en una muestra de la cantidad de inducción de acetilación de histonas u otras proteínas o de la inducción de proteínas funcionalmente reguladas por dicha acetilación puede incluir el monitoreo de la eficiencia de un tratamiento en pacientes y por lo tanto puede tener un efecto benéfico para el tratamiento del cáncer de humano. La determinación en una muestra de la cantidad de inducción de acetilación de histonas u otras proteínas o de la inducción de proteínas funcionalmente reguladas por dicha acetilación puede incluir el pronóstico de las respuestas terapéuticas a un tratamiento y por lo tanto puede tener un efecto benéfico para el tratamiento del cáncer de humano. La determinación en una muestra de la cantidad de inducción de acetilación de histonas u otras proteínas o de la inducción de proteínas funcionalmente reguladas por dicha acetilación puede incluir la identificación de pacientes que responden a un tratamiento, el monitoreo de la eficiencia de un tratamiento en pacientes y el pronóstico de las respuestas terapéuticas a un tratamiento y por lo tanto puede tener un efecto benéfico para el tratamiento del cáncer de humano. Por lo tanto, la presente invención también se refiere al uso de un inhibidor de HDAC específico de clase I de fórmula (I), ya sea solo o en combinación con un inhibidor del proteasoma, en donde I inducción de la hiperacetilación de las histonas u otras proteínas o la inducción de proteínas funcionalmente reguladas por dicha acetilación tiene un efecto benéfico para el tratamiento del cáncer de humano. La muestra se puede derivar a partir de células que han sido tratadas con dicho inhibidor de HDAC o dicha combinación. La muestra también se puede derivar a partir de tejido afectado por un trastorno y/o a partir de individuos tratados con un inhibidor de HDAC de fórmula (I) o una combinación de un inhibidor del proteasoma y un inhibidor de HDAC de fórmula (I) Las células pueden ser células cultivadas que se han puesto en contacto con dicho inhibidor de HDAC o dicha combinación. Dicho inhibidor o dicha combinación se puede añadir al medio de crecimiento de las células. Las células también se pueden derivar a partir de un tejido y/o a partir de un individuo que fue tratado con dicho inhibidor o dicha combinación. Preferiblemente, el método de caracterización solamente comprende pasos que se llevan a cabo in vitro. Por lo tanto, de conformidad con esta modalidad el paso de obtención del material de tejido a partir del cuerpo humano o animal no se incluye por la presente invención. Las células usualmente son procesadas para que se encuentren en una condición que es adecuada para el método empleado, para la determinación de la inducción de acetilación de histonas u otras proteínas o la inducción de proteínas funcionalmente reguladas por dicha acetilación. El procesamiento puede incluir la homogenización, extracción, fijación, lavado y/o permeabilización. La forma de procesamiento depende en gran medida del método utilizado para la determinación de la inducción de acetilación de histonas u otras proteínas o la inducción de proteínas funcionalmente reguladas por dicha acetilación. La muestra se puede derivar a partir de una biopsia del paciente. La biopsia se puede tratar adicionalmente para producir una muestra que se encuentra en una condición adecuada para el método utilizado para la determinación de la inducción de acetilación de histonas u otras proteínas o la inducción de proteínas funcionalmente reguladas por dicha acetilación. La cantidad de acetilación de las proteínas o la cantidad de proteína inducida se puede determinar mediante el uso de un anticuerpo. Como se utiliza en la presente invención, el término "anticuerpo" designa una inmunoglobulina o un derivado de la misma que tiene la misma especificidad de unión. El anticuerpo utilizado de conformidad con la invención puede ser un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo derivado a partir de o que se encuentra comprendido en un antisuero policlonal. El término "anticuerpo" significa adicionalmente derivados tales como fragmentos Fab, F(ab')2, Fv o scFv. El anticuerpo o el derivado del mismo puede ser de origen natural o se puede producir de manera (semi)sintética. Se puede utilizar el Western blot que generalmente se conoce en la técnica. El material celular o el tejido se pueden homogeneizar y se puede tratar con agentes desnaturalizantes y/o reductores para obtener las muestras. La muestra se puede cargar sobre un gel de poliacrilamida para separar las proteínas, seguido por una transferencia a una membrana o directamente puede ser aplicada sobre una fase sólida. El anticuerpo se pone en contacto entonces con la muestra. Después de uno o más pasos de lavado se detecta el anticuerpo unido utilizando técnicas que se conocen en la técnica.

La inmunohistoquímica se puede utilizar después de la fijación y la permeabilización del material de tejido, por ejemplo rebanadas de los tumores sólidos, luego se incuba el anticuerpo con la muestra, y después de uno o más pasos de lavado se detecta el anticuerpo unido. La cantidad de inducción de acetilación de histonas u otras proteínas o la inducción de proteínas funcionalmente reguladas por dicha acetilación se pueden determinar mediante ELISA. Se puede prever una variedad de formatos del ELISA. En un formato, el anticuerpo se inmoviliza sobre una fase sólida tal como una placa para microtitulación, seguido por el bloqueo de sitios de unión específica y se lleva a cabo la incubación con la muestra. En otro formato, la muestra se pone en contacto inicialmente con la fase sólida para inmovilizar las proteínas acetiladas y/o inducidas contenidas en la muestra. Después del bloqueo y del lavado opcional, el anticuerpo se pone en contacto con la muestra inmovilizada. La cantidad de la inducción de acetilación de las histonas u otras proteínas o la inducción de proteínas funcionalmente reguladas por dicha acetilación se pueden determinar mediante citometría de flujo. Las células, por ejemplo las células en cultivo celular o células sanguíneas o células a partir de la médula ósea, se fijan y permeabilizan para permitir que el anticuerpo alcance las proteínas acetiladas y/o inducidas. Después de los pasos opcionales de lavado y bloqueo el anticuerpo se pone en contacto con las células. La citometría de flujo se lleva a cabo entonces de conformidad con los procedimientos conocidos en la técnica con el objeto de determinar las células que tienen anticuerpo unido a las proteínas acetiladas y/o inducidas. Para determinar si un inhibidor de HDAC o una combinación de un inhibidor del proteasoma y un inhibidor de HDAC de fórmula (I) tiene esta actividad, uno puede determinar la cantidad de acetilación de una proteína o inducción de una proteína con referencia a una muestra en donde la muestra de referencia se deriva a partir de células que no han sido tratadas con dicho inhibidor de HDAC o dicha combinación. La determinación de la cantidad de acetilación de las proteínas y/o la cantidad de proteína inducida en la muestra y la muestra de referencia se pueden llevar a cabo en paralelo. En el caso de las células de cultivo celular, se proveen dos composiciones celulares, una de las cuales ha sido tratada con dicho inhibidor de HDAC o dicha combinación mientras que la otra ha permanecido sin tratamiento. Subsecuentemente ambas composiciones se procesan adicionalmente y se determinan las cantidades respectivas de acetilación de las proteínas y/o la cantidad de proteína inducida. Alternativamente, para determinar si un inhibidor de HDAC o una combinación de un inhibidor del proteasoma y un inhibidor de HDAC de fórmula (I) tienen esta actividad, uno puede determinar la inhibición de la proliferación celular. En el caso de los pacientes, la muestra se deriva a partir de un paciente que ha sido tratado con el inhibidor de HDAC de fórmula (I) o la combinación de un inhibidor del proteasoma y un inhibidor de HDAC de fórmula (I). La muestra de referencia se deriva a partir de otro paciente que padece del mismo trastorno el cual no ha sido tratado con dicho inhibidor de HDAC o dicha combinación o a partir de un individuo sano. El tejido a partir del cual se deriva la muestra de referencia corresponde al tejido a partir del cual se deriva la muestra. Por ejemplo, si la muestra se deriva a partir de tejido tumoral de un paciente con cáncer de mama la muestra de referencia también se deriva de tejido tumoral de un paciente con cáncer de mama o a partir de tejido de mama de un individuo sano. También se ha previsto que la muestra y la muestra de referencia se derivan a partir del mismo individuo. En este caso, el tejido, a partir del cual se deriva la muestra de referencia se obtiene a partir del individuo antes de o después del tratamiento del individuo con dicho inhibidor de HDAC o dicha combinación. Preferiblemente, el tejido se obtiene antes de tratamiento para excluir los posibles efectos posteriores del tratamiento con el inhibidor después de la discontinuación del tratamiento.

Parte experimental A. Ejemplo farmacológico Para la actividad celular de los compuestos de fórmula (I) que se determinó en células tumorales A2780 utilizando un ensayo colorimétrico para toxicidad o supervivencia celular (Mosmann Tim, Journal of Immunological Methods 65: 55-63, 1983), se hace referencia a la parte experimental del documento EP 1485365 Los efectos antiproliferativos de los inhibidores de HDAC se han asociado con la inhibición de las HDACs clase 1 , que consisten de los miembros de la familia HDAC 1 -3 y 8. La actividad de R306465 sobre HDAC 1 inmuno-precipitada a partir de las células A2780 y su potencia cuando se compara con JNJ 26481585, SAHA, LBH-589 y LAQ-824 se pueden encontrar en el ejemplo A.1 . La actividad de R306465 sobre la enzima HDAC 8 recombinante de humano y su potencia cuando se compara con JNJ 26481585, SAHA, LBH-589 y LAQ-824 se pueden encontrar en el ejemplo A.2. Se investigó adicionalmente si R306465 modula el estado de acetilación de los sustratos de HDAC 1 histona 3 (H3) e histona 4 (H4). También se investigó la inducción del inhibidor de cinasa dependiente de ciclina P2lwaf cip1 en células de carcinoma de ovario A2780. P2i waf1 c¡P1 se reprime como una consecuencia de la acetilación de la histona, y desempeña un papel clave en la inducción de la detención del ciclo celular en respuesta a los inhibidores de HDAC (véase el ejemplo A.3.). Con el objeto de evaluar la inhibición de HDAC 6, y la potencia relativa de los compuestos para HDAC 1 contra HDAC 6, se monitoreó la acetilación de su sustrato tubulina, y la inducción de Hsp 70, que es la consecuencia de la acetilación de Hsp 90 (véase el ejemplo A.3.)- EJEMPLO A Efectos de la especificidad clase I y de la acetilación de los compuestos de fórmula (I) EJEMPLO A.1 Inhibición de la enzima inmuno-precipitada HDAC 1 a partir de las células A2780 Para los ensayos de actividad de HDAC1 , HDAC1 se inmunoprecipito a partir de los lisados de célula A2780 y se incubó con una curva de concentración del inhibidor de HDAC indicado, y con un fragmento marcado con [3H]acetilo del péptido H4 (50,000 cpm) [biotina-(6- aminohexanóico)Gly-Ala-(acetilo[3H]Lys-Arg-His-Arg-Lys-Val-NH2](Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). La actividad de HDAC se evaluó midiendo la liberación de los grupos acetilo libres. Los resultados se expresan como valores IC5o promedio ± DE (desviación estándar) para tres experimentos independientes.

Inhibición por HDAC 1 IC50 en nM R306465 3.31 ± 0.78 JNJ 26481585 0.16 ± 0.02 SAHA 73 ± 26 LAQ-824 0.29 ± 0.05 LBH-589 0.23 ± 0.06 EJEMPLO A.2 Inhibición de la enzima recombinante de humano HDAC 8 Para la inhibición de HDAC 8 recombinante de humano, se utilizó el equipo HDAC 8 colorimétrico/ensayo de actividad fluorimétrica/descubrimiento de fármaco (Colorimetric/Fluorimetric Activity Assay/ Drug Discovery) (Biomol; Cat. no. AK- 508). Los resultados se expresan como valores IC50 promedio (nM) ± DE para tres experimentos independientes. Los ensayos se llevaron a cabo por duplicado y se calculó el error estándar de la IC5o utilizando Graphpad Prism (Graphpad Software).

EJEMPLO A.3 Acetilación de sustratos de HDAC 1 celular e inducción de p21waf1 'cip1 Las células de carcinoma de ovario de humano A2780 se incubaron con 0, 1 , 3, 10, 30, 100, 300, 1000 y 3000 nM de los compuestos por 24 horas. Los lisados celulares totales se prepararon y analizaron mediante SDS-PAGE. Se detectaron los niveles de histonas H3 y H4 acetiladas, el nivel total de proteínas H3 y los niveles de la proteína p2i wan cip1 utilizando diluciones apropiadas de anticuerpos policlonales de conejo y monoclonales de ratón, seguido por una detección por quimioluminiscencia mejorada (ECL). Se detectaron los niveles de H3 y H4 acetiladas con anticuerpos a partir de Upstate Biotechnology (Cat. no. 06-299 y 06-866), se detectó el nivel total de proteínas H3 con anticuerpos a partir de Abeam (Cat. no. ab1791 ) y se detectó el nivel de la proteína p2i wa,1 cip1 con anticuerpos a partir de Transduction Laboratories (Cat. no. C24420). Los anticuerpos se incubaron ya sea por 1 -2 horas a temperatura ambiente o durante toda la noche a 4°C. Con el objeto de controlar las cargas iguales, los blots fueron lavados y re-ensayados con anti-actina IgM monoclonal de ratón (Ab-1 , Oncogene Research Products), con el objeto de control la eficiencia en la extracción de las proteínas nucleares los blots fueron lavados y re-ensayados con y con anti-lámina B1 (Zymed; Cat. no. 33,2000). Posteriormente se visualizaron los complejos proteína-anticuerpo mediante quimioluminiscencia (Pierce Chemical Co) o fluorescencia (Odyssey) de conformidad con las instrucciones del fabricante. Los experimentos se llevaron a cabo tres veces.

Concentración (nM) cuando se observa inducción de la acetilación de la histona H3 y H4 e inducción de P2l waf1 'c¡Pí R306465 100 JNJ 26481585 10 SAHA 3000 LAQ-824 10 LBH-589 10 EJEMPLO A.4 Acetilación de tubulina y la inducción de Hsp 70 Las células de carcinoma de ovario de humano A2780 se incubaron con 0, 1 , 3, 10, 30, 100, 300, 1000 y 3000 nM de los compuestos por 24 horas. Los lisados celulares totales fueron preparados y analizados mediante SDS-PAGE. Se detectaron los niveles de tubulina total y acetilada utilizando anticuerpos a partir de Sigma clona DM1 A (Cat. no. T9026) y clona 6-1 1 1 B (Cat. no. T6793). Se detectó la proteína Hsp 70 con un anticuerpo a partir del Stressgen (Cat. no. SPA-810), seguido por detección con ECL. Las diluciones apropiadas de los anticuerpos se incubaron ya sea por 1 -2 horas a temperatura ambiente o durante toda la noche a 4°C. Con el objeto de controlar la carga igual, los blots se lavaron y re-ensayaron con anti-actina IgM monoclonal de ratón (Ab-1 , Oncogene Research Products). Con el objeto de controlar la eficiencia de la extracción de las proteínas nucleares los blots se lavaron y re-ensayaron con y con antilámina B1 (Zymed, Cat. no. 33.2000). Posteriormente se visualizan los complejos proteína-anticuerpo mediante quimioluminiscencia (Pierce Chemical Co) o fluorescencia (Odyssey) de conformidad con las instrucciones del fabricante. Los experimentos se llevaron a cabo tres veces.

Concentración (nM) cuando se observa el inicio de la inducción de la acetilación de tubulina y la inducción de Hsp 70 R306465 1000 JNJ 26481585 30 SAHA 100 LAQ-824 30 LBH-589 30 EJEMPLO B Inhibición de la proliferación de la célula tumor hematolóqica de humano La evaluación de la actividad anti-proliferativa de R306465 en un panel de líneas celulares tumorales hematológicas de humano se subcontrató en Oncodesign (Dijon, Francia). Las células tumorales se crecieron como suspensiones celulares en el medio de cultivo apropiado correspondiente a 37°C en una incubadora humidificada con 5% de C02. Las células tumorales libres de micoplasma fueron sembradas en placas para microtitulación de fondo plano de 96 pozos y se incubaron a 37°C por 24 horas en medio de cultivo que contenía 10% de FCS. Las células tumorales que se expusieron entonces al vehículo (control) o a concentraciones en incremento de R306465 (5 concentraciones diferentes*), Bortezomib (5 concentraciones diferentes*), o a una combinación de ambos fármacos a diversas proporciones. Las células se incubaron entonces por 72 horas adicionales. La actividad citotóxica del compuesto(s) se reveló mediante el ensayo MTS estándar al medir la absorbancia a 490 nm. Las interacciones del compuesto (sinergia, aditividad o antagonismo) se calcularon mediante análisis de efecto con múltiples fármacos y se llevaron a cabo mediante el principio de la ecuación de la mediana de conformidad con la metodología descrita por Chou & Talalay [CHOU et al. (1984) Adv. Enzyme Regul. 22: 27-55; CHOU et al. (1991 ) en Encyclopaedia of human Biology. Academic Press. 2: 371 -379; CHOU et al. (1991 ) en Synergism and antagonism in chemotherapy. Academic Press: 61 -102; CHOU et al. (1994) J. Nati. Cáncer Inst. 86: 1517-1524] *: Basándose en la pre-determinación de actividad anti-proliferativa de cada fármaco utilizado como un agente único, se eligió que las concentraciones no excedieran el 50% de inhibición en cada una de las líneas celulares seleccionadas.

EJEMPLO B.1 Inhibición de la proliferación de la célula tumoral hematológica de humano mediante R306465 CUADRO F.1 Los resultados se expresan como el valor IC 0 medio (es decir, concentración, expresada en nM, requerida para alcanzar el 40% de inhibición de la proliferación celular) ± DE, determinado a partir de 3 experimentos fidedignos independientes Línea celular Tipo Media D.E.

CCRF-CEM Leucemia linfoblástica aguda 78.79 42.19 Clona E6-1 Jurkat Leucemia linfoblástica aguda 56.19 26.36 KG-1 Leucemia mielógena aguda 170.59 61.64 MOLT-4 Leucemia linfoblástica aguda 155.83 140.81 SUP-B15 Leucemia linfoblástica aguda 15.67 HL-60 Leucemia promielocítica aguda 86.76 25.11 OCI-AML2 Leucemia mieloide aguda 267.92 321.41 THP-1 Leucemia monocítica aguda 446.29 226.25 EHEB Leucemia crónica de célula B 486.62 318.18 BV-173 Leucemia crónica de célula B 26.33 13.03 K-562 Leucemia mieloide crónica 80.76 50.47 KCL-22 Leucemia mieloide crónica 89.88 56.58 LAMA-84 Leucemia mieloide crónica en 165.89 75.19 crisis blástica U-937 Linfoma 154.68 30.07 Daudi Linfoma de Burkitt 454.11 368.54 Namalwa Linfoma de Burkitt 49.25 23.17 Raji Linfoma de Burkitt 221.09 88.12 Ramos Linfoma de Burkitt 66.08 34.68 ARH-77 Mieloma 207.27 117.10 RPMI 8226 Mieloma 37.57 22.94 EJEMPLO B.2 Inhibición de la proliferación de la célula tumor hematologica de humano por Bortezomib CUADRO F.2 Los resultados se expresan como el valor IC40 medio (es decir, concentración, expresada en nM, requerida para alcanzar el 40% de la inhibición de la proliferación celular) ± DE, determinado a partir de 3 experimentos fidedignos independientes Línea celular Tipo Media D.E.

CCRF-CEM Leucemia linfoblástica aguda 4.40 0.84 Clona E6-1 Jurkat Leucemia linfoblástica aguda 5.63 2.68 KG-1 Leucemia mielógena aguda 3.36 0.83 MOLT-4 Leucemia linfoblástica aguda 12.14 12.91 SUP-B15 Leucemia linfoblástica aguda 2.40 HL-60 Leucemia promielocítica 13.38 1 .99 aguda OCI-AML2 Leucemia mieloide aguda 1 1 .64 1 1 .61 THP-1 Leucemia monocítica aguda 5.83 0.94 EHEB Leucemia crónica de célula B 6.02 0.34 BV-173 Leucemia crónica de célula B 2.77 0.20 K-562 Leucemia mieloide crónica 12.83 4.1 1 KCL-22 Leucemia mieloide crónica 1 .74 1 .56 LAMA-84 Leucemia mieloide crónica en 2.61 0.46 crisis blástica U-937 Linfoma 5.68 1 .07 Daudi Linfoma de Burkitt 2.68 0.54 Namalwa Linfoma de Burkitt 4.48 1 .00 Raji Linfoma de Burkitt 5.20 88.12 Ramos Linfoma de Burkitt 1 .83 0.10 ARH-77 Mieloma 7.21 2.22 RPMI 8226 Mieloma 4.23 0.99 EJEMPLO B.3 Inhibición de la proliferación de la célula tumoral hematológica de humano por R306465 en combinación con Bortezomib CUADRO 3 Los resultados se expresan como el índice de combinación medio (Cl +-SD) de los valores Cl medios en cada estudio individual (3 experimentos fidedignos independientes) y se calcularon a partir de cada proporción de combinación individual. Cl menor gue 0.9 indica "Sinergia" (gris claro), Cl entre 0.91 y 1.09 indica "Aditividad" (blanco); y Cl mayor que 1.1 indica "Antagonismo" (gris oscuro)

Claims (4)

1. NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1.- Una combinación de un inhibidor del proteasoma y hibidor de histona desacetilasa de fórmula (I) las sales de adición ácidas o básicas farmacéuticamente aceptables y las formas estereoquímicamente isoméricas de las mismas, en donde es un radical seleccionado a partir de (a-1) (a-2) R5 se selecciona a partir de hidrógeno; tienilo; tienilo sustituido con di(alquilo de Ci-6)aminoalquilo de C-i-6, o alquilo de Ci-6piperazinilalquilo de Ci-6; furanilo; fenilo; fenilo sustituido con un sustituyente independientemente seleccionado a partir de di(alquilo de Ci^aminoalquiloxi de C- , di(alquilo de C-i-4)amino, di(alquilo de Ci^aminoalquilo de C- , di(alquilo de Ci-4)aminoalquilo de Ci. 4(alquilo de Ci-4)aminoalquilo de Ci-4, pirrolidinilalquilo de Ci-4, pirrolidinilalquiloxi de C- O alquilo de C- piperazinilalquilo de Ci-4. 2.- La combinación de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el inhibidor de histona desacetilasa de fórmula (I) se selecciona a partir de los compuestos No. 6 (R306465), No. 100, No. 104, No. 128, No. 144, No. 124, No. 154, No. 125, No. 157, No. 156, No. 159, No. 163, No. 164, No. 168, No. 169, No. 127, No. 171 , No. 170, No. 172 y No. 173. 0.065 H20. C2HF302; Co. No. 144 C2HF302; Co. No. 124 0.2 H2O.C2HF3O2; Co. No. 125 0.5 H20.1.2 C2HF302; Co. No. 157 0.3 H20.1.2 C2HF302; Co. No. 156 0.3 H20.1.5 C2HF302; Co. No. 159 0.6 H20.C2HF302; Co. No. 163 1.1 C2HF302; Co. No. 169 1.16 C2HF302; Co. No. 127 1 .18 C2HF3O2; Co. No. 172 1.17 C2HF302; Co. No. 173 3.- La combinación de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizada además porque el inhibidor de histona desacetilasa de fórmula (I) es R306465 (Compuesto No. 6) 4. - La combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada además porque el inhibidor del proteasoma es bortezomib. 5. - La combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada además porque se encuentra en la forma de una composición farmacéutica que comprende un inhibidor del proteasoma y un inhibidor de histona desacetilasa de fórmula (I) junto con uno o más vehículos farmacéuticos. 6. - La combinación de conformidad con la reivindicación 5, para uso simultáneo, separado o secuencial. 7. - La combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para uso como un medicamento. 8.- El uso de una combinación como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para preparar un medicamento útil para inhibir el crecimiento de las células tumorales. 9.- El uso de un inhibidor de histona desacetilasa para preparar un medicamento útil para el tratamiento de leucemia linfoblástica aguda, leucemia mielógena aguda, leucemia promielocítica aguda, leucemia mieloide aguda, leucemia monocítica aguda, linfoma, leucemia crónica de célula B, leucemia mieloide crónica, leucemia mieloide crónica en crisis blástica, linfoma de Burkitt y mieloma múltiple, en donde dicho inhibidor de histona desacetilasa es un compuesto de fórmula (I) las sales de adición ácidas o básicas farmacéuticamente aceptables y las formas estereoquímicamente isoméricas de las mismas, en donde es un radical seleccionado a (a- 1) (a-2) R5 se selecciona a partir de hidrógeno; tienilo; tienilo sustituido con di(alquilo de Ci-6)aminoalquilo de C-i-6, o alquilo de Ci-6piperazinilalquilo de C1-6; furanilo; fenilo; fenilo sustituido con un sustituyante independientemente seleccionado a partir de di(alquilo de C^aminoalquiloxi de Ci-4, di(alquilo de Ci-4)amino, di(alquilo de Ci-4)aminoalquilo de Ci-4, di(alquilo de Ci-4)aminoalquilo de Ci- (alquilo de Ci.4)aminoalquilo de C<, .4, pirrolidinilalquilo de Ci-4, pirrolidinilalquiloxi de Ci-4 o alquilo de Ci-4piperazinilalquilo de Ci-4. 10.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 9, en donde dicho medicamento es útil para el tratamiento de leucemia linfoblástica aguda resistente a fármacos, leucemia mielógena aguda resistente a fármacos, leucemia promielocítica aguda resistente a fármacos, leucemia mieloide aguda resistente a fármacos, leucemia monocítica aguda resistente a fármacos, linfoma resistente a fármacos, leucemia crónica de la célula B resistente a fármacos, leucemia mieloide crónica resistente a fármacos, leucemia mieloide crónica resistente a fármacos en crisis blástica, linfoma de Burkitt resistente a fármacos y mieloma múltiple resistente a fármacos. 1 1. - El uso como el que se reclama en las reivindicaciones 9 y 10, en donde dicho medicamento es útil para el tratamiento del mieloma múltiple resistente a bortezomib. 12. - El uso como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 8 a 1 1 , en donde la inducción de la hiperacetilación de las histonas u otras proteínas o la inducción de proteínas funcionalmente reguladas por dicha acetilación tiene un efecto benéfico para el tratamiento del cáncer en humano. 13. - Un método para la caracterización de un inhibidor de histona desacetilasa de fórmula (I) como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, ya sea solo o en combinación con un inhibidor del proteasoma, que comprende la determinación en una muestra, de la cantidad de inducción de acetilación de histonas u otras proteínas, o de la inducción de proteínas funcionalmente reguladas por dicha acetilación. 14.- Un método para la caracterización de un inhibidor de histona desacetilasa de fórmula (I) como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, ya sea solo o en combinación con un inhibidor del proteasoma, que comprende la determinación en una muestra de la cantidad de a) inducción de acetilación de la histona 3, inducción de acetilación de la histona 4, o inducción de p21 y b) inducción de acetilación de alfa-tubulina, inducción de acetilación de Hsp 90, o inducción de Hsp 70.