MX2008012773A - Composiciones nutricionales para promocion de crecimiento oseo y mantenimiento de la salud osea y metodos relacionados con las mismas. - Google Patents

Abstract

Se presentan composiciones y métodos para el mantenimiento de la salud ósea o la prevención, alivio y/o tratamiento de trastornos óseos. La presente invención también proporciona la elaboración de un producto nutricional, un suplemento o un medicamento para promover el crecimiento óseo o para el mantenimiento de la salud ósea y métodos relacionados con las mismas. En una modalidad, la presente invención proporciona una composición que comprende el ingrediente activo que tiene una cantidad eficaz de una planta o un extracto vegetal que contiene por lo menos una sustancia fitoquímica que tiene la capacidad de inducir expresión de proteína morfogénica ósea.

Description

COMPOSICIONES NUTRICIONALES PARA PROMOCIÓN DEL CRECIMIENTO OSEO Y MANTENIMIENTO DE LA SALUD OSEA Y METODOS CON RELACION A LAS MISMAS ANTECEDENTES La presente invención se relaciona de manera general con composiciones nutricionales que proporcionan beneficios para la salud. De manera más específica, la presente invención se relaciona con composiciones benéficas que se pueden utilizar, por ejemplo, para mejorar la densidad y formación óseas y métodos respecto a las mismas. La masa ósea evoluciona durante la vida y es regulada por mecanismos genéticos, mecánicos y hormonales. La adquisición de mineral en hueso se produce durante la infancia y la masa ósea pico se obtiene aproximadamente a los 20 años de edad. Durante este período la formación ósea excede a la resorción ósea. Posteriormente en la vida, y particularmente aproximadamente en el momento de la menopausia o en población vieja, la masa y calidad óseas disminuyen debido a un recambio óseo mayor con excesiva resorción ósea lo que genera una pérdida gradual de masa ósea, microarquitectura, estructura y resistencia. Para mantener los huesos, es importante restaurar el mecanismo entre la formación ósea y la resorción ósea. Este procedimiento de remodelado óseo se regula a nivel de célula ósea que involucra una interacción estrecha entre las células formadoras de hueso (osteoblastos) y células de resorción ósea (osteoclastos) . Los fitonutrientes, especialmente flavonoides, pueden influir positivamente en el procedimiento de remodelado óseo. La mayor parte de los datos reportados son para isoflavonas de soya las cuales, en algunos estudios, han demostrado que evitan la pérdida ósea y mejoran la densidad mineral ósea (BMD) en mujeres postmenopáusicas a dosis de 50-90 mg/día. No obstante, no todos los estudios con isoflavonas son positivos y existen aún controversias respecto a su eficacia. Además, existe ciertas pruebas epidemiológicas respecto a los beneficios del té dado que un estudio previo ha demostrado que quienes beben té tienen una BMD media superior que quienes no beben té en una población anciana, no obstante no se han realizado estudios de intervención para fundamentar este hallazgo. Actualmente existe un interés fuerte en identificar agentes los cuales puedan estimular la formación de hueso. Se ha demostrado que el suministro de BMP-2 recombinante induce formación ósea y de cartílago. Por ejemplo, la proteína morfogénica ósea 2 (BMP-2) es un miembro de la familia TGFp y es un regulador clave en el crecimiento óseo durante el desarrollo embriónico y el crecimiento y .reparación óseos posteriores. Las estatinas (medicamentos eficaces para disminuir el colesterol mediante la inhibición de la enzima HMG-CoA reductasa) ) mejora la formación ósea, mediada parcialmente por inducción de BMP-2 (G. Mundy, et al., Science 286: 1946-1949 (1999); C. J. Edwards, et al., Lancet, 355:2218-2219 (2000) ) . Statins were also able to reduce hip fracture risk in menopausal women (P.S. ang, et al., JAMA 283:3211-3216 (2000) ) .

DESCRIPCION BREVE DE LA INVENCION La presente invención se relaciona de manera general con composiciones nutricionales para el mantenimiento de la salud ósea o para la prevención, alivio y/o tratamiento de trastornos óseos . La presente invención también proporciona la elaboración de un producto nutricional, un suplemento o un medicamento para promover el crecimiento óseo o para el mantenimiento de la salud ósea así como métodos respecto al mismo. En particular, la presente invención proporciona la elaboración de un producto nutricional, un suplemento o un medicamento para promover la formación ósea lo cual es importante para el crecimiento de los huesos así como para el mantenimiento de la salud ósea mediante un remodelado óseo equilibrado y métodos relacionados con el mismo. En una modalidad, la presente invención proporciona una composición que comprende un ingrediente activo que tiene una cantidad eficaz de una planta o un extracto vegetal que contiene por lo menos una sustancia fitoquímica que tiene la capacidad de inducir expresión de proteína morfogénica ósea. En una modalidad, la planta o el extracto vegetal inhibe además la resorción ósea. En una modalidad, la planta es romero o alcaravea . En una modalidad, la sustancia fitoquímica se selecciona del grupo que consiste de eupafolina, carnosol, escutelareina, genkwanina, kaempferol, acacetina, ácido rosmarínico, rosmanol, cirsimaritina, luteolina, 7-epirosmanol y el compuesto C- 0063 -W- 06 de la figura 7A y combinaciones de los mismos. En una modalidad, la composición puede estar en una forma que se selecciona del grupo que consiste de un alimento nutricionalmente equilibrado, alimento para mascotas, un suplemento de la dieta, un tratamiento, una composición farmacéutica y combinaciones de los mismos. En una modalidad, la composición se puede diseñar para ayudar a la regeneración ósea durante el sanado de fracturas, incrementar la formación ósea y la densidad mineral del hueso durante el crecimiento y optimizar la masa de hueso máxima o para disminuir la pérdida ósea, en particular pérdida ósea asociada con la edad en humanos o mascotas . En una modalidad, la composición se puede diseñar para construir cartílago en humanos o mascotas. En una modalidad, la composición se puede diseñar para evitar osteoartritis en humanos o mascotas. En otra modalidad, la presente invención proporciona una composición que comprende un ingrediente activo que tiene una cantidad eficaz de una planta de romero o un extracto de planta de romero que contiene por lo menos una sustancia fitoquímica que tiene la capacidad para inducir expresión de proteína morfogénica ósea. Por ejemplo, la sustancia fitoquímica se puede seleccionar del grupo que consiste de eupafolina, carnosol, escutelareina, genkwanina, kaempferol, acacetina y combinaciones de los mismos . En una modalidad alternativa, la presente invención proporciona un método para fabricar una composición de alimento para la prevención, el alivio y/o el tratamiento de trastornos óseos o mantenimiento de la salud de los huesos en humanos o mascotas, el método comprende proporcionar una composición de alimento y agregar a la composición de alimento un ingrediente activo que tiene una planta o un extracto vegetal que contiene por lo menos una sustancia fitoquímica que tiene la capacidad de estimular proteína morfogénica ósea y/o inhibir la resorción ósea para preparar la composición. Por ejemplo, la composición puede incluir componentes que se seleccionan del grupo que consiste de achicoria, té, cacao, sustancias bioactivas, antioxidantes, ácidos grasos, fibras prebióticas, glucosamina, sulfato de condroitina y combinaciones de los mismos . En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para el tratamiento, alivio o prevención de trastornos óseos o mantenimiento de la salud de los huesos, el método comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz y una composición que comprende un ingrediente activo que tiene una cantidad eficaz de por lo menos una planta o extracto vegetal que contiene por lo menos una sustancia fitoquímica que tiene la capacidad para inducir expresión de proteína morfogénica ósea a un individuo en necesidad de la misma. En una modalidad alternativa, la presente invención proporciona un método para incrementar la formación ósea, la densidad de mineral ósea durante el crecimiento y optimizar la masa ósea pico en humanos o mascotas, el método comprende alimentar a un individuo con una composición que comprende un ingrediente activo que tiene una cantidad eficaz de por lo menos una planta o extracto vegetal que contiene por lo menos una sustancia fitoquímica con la capacidad para inducir expresión de proteína morfogénica ósea. En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para el tratamiento, alivio y/o profilaxis de osteoartritis en mascotas y humanos, el método comprende alimentar a un individuo que tiene o que se encuentra en riesgo de osteoartritis de una composición que comprende un ingrediente activo que tiene una cantidad eficaz de por lo menos una planta o extracto vegetal que contiene por lo menos una sustancia fitoquímica que tiene la capacidad de inducir expresión de proteína morfogénica ósea en el individuo. En otra modalidad adicional, la presente invención proporciona un método para tratar o evitar osteoporosis , el método comprende administrar a un individuo que tiene o que se encuentra en riesgo de osteoporosis una cantidad terapéuticamente eficaz y una composición que comprende un ingrediente activo que tiene una cantidad eficaz de por lo menos una planta o extracto vegetal que contiene por lo menos una sustancia fitoquímica que tiene la capacidad de inducir expresión de proteína morfogénica ósea en el individuo. En una modalidad alternativa adicional, la presente invención proporciona un método para estimular regeneración ósea durante el sanado de fracturas, el método comprende alimentar a un individuo que tiene una fractura con una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende un ingrediente activo que tiene una cantidad eficaz de por lo menos una planta o extracto vegetal que contiene por lo menos una sustancia fitoquímica con la capacidad para inducir expresión de proteína morfogénica ósea en el individuo. En una modalidad adicional, la presente invención proporciona un método para disminuir pérdida ósea, el método comprende alimentar a un individuo que presente pérdida ósea con una composición que comprende un ingrediente activo que tiene una cantidad eficaz de por lo menos una planta o extracto vegetal que contiene por lo menos una sustancia fitoquímica con la capacidad de inducir expresión de proteína morfogénica ósea en el individuo. Las características y ventajas adicionales se describen en la presente y serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y las figuras.

DESCRIPCION BREVE DE LAS FIGURAS La figura 1 ilustra un protocolo de extracción. La figura 2 ilustra un resumen del procedimiento de extracción y el primer fraccionamiento. La figura 3A ilustra los resultados de BMP-2 para extractos de romero y alcaravea.

La figura 3B ilustra resultados de fosfatasa alcalina para extractos de romero y alcaravea. La figura 3C ilustra formación ósea en cultivo de órganos para extractos de romero y alcaravea. La figura 4 ilustra un procedimiento de extracción para un extracto inicial de NRC en MeOH/agua, y la actividad de BMP-2 de los extractos (a partir de 80 g de hojas secas (hexano = 6 g) ) . La figura 5 ilustra la formación ósea in vivo con extracto de romero. La figura 6A ilustra sustancias fenólicas que resultaron positivas en el análisis BMP-2. La figura 6B ilustra un análisis de fosfatasa alcalina de sustancias fenólicas positivas en BMP-2. La figura 6C ilustra una formación de hueso en cultivo de órgano: ejemplos con eupafolina y carnosol. Las figuras 7A y 7B ilustran compuestos aislados de extracto de romero 2188. La figura 8A proporciona detalles de los efectos del extracto de romero sobre la actividad de los osteoclastos humanos. Las figuras 9A, 9B, y 9C, proporcionan detalles respecto a los efectos del extracto de romero y carnosol en metabolismo de cartílago articular. La figura- 10 muestra inducción de ARNm de osteopontina (OPN) en células de osteoblastos humanos (hPOBtert) por extracto de romero o carnosol . La figura 11 muestra que el carnosol induce la expresión de la enzima en fase II NQOl, un gen/proteína regulado típicamente por Nrf-1.

DESCRIPCION DETALLADA La presente invención se relaciona con composiciones benéficas que se pueden utilizar, por ejemplo para mejorar la densidad y formación ósea así como métodos relacionados con las mismas. Por ejemplo, en una modalidad, la presente invención se relaciona con plantas y extractos vegetales que estimulan la formación ósea y mejoran el mantenimiento de los huesos . En las plantas, muchos isoprenoides (monoterpenos , sesquiterpenos , etc.), son moduladores de HMG-CoA reductasa y prenilación de proteínas, mecanismos probablemente relacionados ya sea con la inhibición de resorción ósea o mejoramiento de la formación de huesos. Por lo tanto, ciertos compuestos vegetales pueden ser inhibidores potenciales de la resorción ósea y/o mej oradores de la formación de los huesos. En . modalidades de la presente invención se preparan extractos a partir de especies vegetales comestibles y/o medicinales los cuales se proponen en base en beneficios potenciales para alivio en los síntomas menopáusicos o su capacidad de afectar la vía de síntesis de colesterol y por lo tanto con potencial médico para estimular BMP-2 y la formación ósea. Como se expone con mayor detalle posteriormente, los extractos generalmente se preparan por un procedimiento de cuatro etapas: (a) hexano, (b) metanol-agua, (c) extractos de metanol-agua hidrolizados con glucosidasas y reextraidos con acetato de etilo, y (d) separación de polifenoles grandes con una columna PVPP. Los extractos de metanol-agua y acetato de etilo se utilizan para cribado in vitro. Los extractos se hidrolizan por glucosidasas a y ß en vez de ácido para asegurar liberación de flavonoide agliconas (forma biológicamente activa) de sus glucósidos. Los siguientes bioanálisis se utilizan para el análisis de formación de hueso. • Análisis de gen indicador BMP-2 (cribado de alto rendimiento) • Fosfatasa alcalina en células de osteoblastos ; • Cultivo de órgano de bóveda craneal in vitro, formación de hueso; • Inyección en bóveda craneal in vivo, formación de hueso. Por ejemplo, los extractos se cribaron para determinar formación ósea por un análisis de gen indicador de alto rendimiento para BMP-2 seguido por análisis con fosfatasa alcalina y modelo de cultivo de órganos y finalmente inyección en la bóveda craneal de ratones in vivo. Las subfracciones de extractos positivos y/o compuestos puros se probaron adicionalmente para determinar su actividad. El análisis de la composición química de un extracto activo se realiza con el fin de determinar los compuestos activos . Se encontró sorprendentemente que los compuestos extraídos de plantas de romero se pueden utilizar como compuestos activos para desarrollo, crecimiento y/o mantenimiento óseos. Por ejemplo, por lo menos tres sustancias fenólicas (por ejemplo eupafolina, carnosol, escutelareina) pueden contribuir al potencial anabólico del extracto de romero. Las sustancias fenólicas adicionales de romero incluyen genkwanina, kaempferol y acacetina. Los extractos vegetales de romero y los compuestos puros se prueban en un sistema de cocultivo de osteoblastos/osteoclastos . El extracto de romero así como las tres sustancias fenólicas se demostró que tienen una actividad para la regulación de las citocinas claves que controlan el remodelado óseo, es decir OPG/RA KL. Además, se encontró que el extracto de romero y el carnosol estimulan la expresión de osteopontina (OPN) en células de osteoblastos humanos, posiblemente por medio de vías de señalización AP-l/Nrf-2. Tres constituyentes del extracto de romero activos son nuevos y nunca han sido descritos en la literatura. Además, dado que varios compuestos pertenecen a la misma clase química, una evaluación biológica cruzada de estos constituyentes pueden llevar una relación interesante de estructura y actividad (por ejemplo carnosol/rosmanol/isorosmanol) lo cual puede proporcionar estrategias adicionales para los extractos de romero pero también para otras especies vegetales que contienen los constituyentes más activos conocidos. En una modalidad de la presente invención, los extractos de MeOH/agua de la planta de romero (25% de la materia seca se las hojas iniciales) obtenida después de la etapa de desengrasado con hexano contienen las moléculas responsables de la actividad y se pueden utilizar en un producto alimenticio. La actividad in vitro se observa solo ligeramente en el extracto inicial de MeOH/agua debido a la dilución de compuestos activos por otros compuestos y también por una parte debido a la presencia de formas unidas . Se observa una actividad elevada en el análisis de BMP-2 después de purificación/concentración a través de extracción con acetato de etilo y/o hidrólisis con glucosidasa y después extracción con acetato de etilo.

Las plantas o extractos vegetales de acuerdo con las modalidades de la presente invención se pueden utilizar en la preparación de una composición de alimento. La composición puede estar en forma de un alimento nutricionalmente equilibrado o un alimento para mascotas, un suplemento para la dieta, un tratamiento o una composición farmacéutica. La planta o el extracto vegetal se pueden utilizar solos o en asociación con otras plantas tales como achicoria, té, cacao o con otra molécula bioactiva tal como antioxidantes, ácidos grasos, fibras prebióticas, glucosamina, sulfato de condroitina, por ejemplo. En una modalidad de la presente invención se prepara una composición de alimento o fórmula nutricional para consumo humano. La composición puede ser una fórmula nutricional completa, un producto lácteo, una bebida enfriada o estable en anaquel, sopa, un suplemento de la dieta, un sustituto de carne y una barra nutricional o una confitura . Además de la planta de romero o del extracto de planta de romero de acuerdo con la invención, la fórmula nutricional puede comprender una fuente de proteína. Las proteínas en la dieta se utilizan preferiblemente como una fuente de proteína. Las proteínas en la dieta puede ser cualquier proteína de la dieta adecuada; por ejemplo proteínas animales (proteínas por ejemplo de leche, de carne o de huevo) ; proteínas vegetales (por ejemplo proteínas de soya, de trigo, arroz y chícharo) ; mezclas de aminoácidos libres; o combinaciones de los mismos. Se prefieren particularmente proteínas de leche tales como caseína, proteínas de suero y de soya. La composición también puede contener una fuente de carbohidratos de una fuente de grasa . Si la fórmula nutricional incluye una fuente de grasa, la fuente de grasa preferiblemente proporciona aproximadamente 5% a aproximadamente 55% de la energía de la fórmula nutricional; por ejemplo, aproximadamente 20% a aproximadamente 50% de la energía. Los lípidos que constituyen la fuente de grasa pueden ser cualquier grasa o mezcla de grasa adecuadas . Las grasas vegetales son particularmente adecuadas; por ejemplo los aceites de soya, de palma, coco, azafrán, girasol,, maíz, cañóla, lecitinas y similares. También se pueden agregar si se desea grasas animales tales como grasas de leche. Se puede agregar a la fórmula nutricional una fuente de carbohidratos. Preferiblemente proporciona aproximadamente 40% a aproximadamente 80% de la energía de la composición nutricional. Se puede utilizar cualquier carbohidrato adecuado, por ejemplo sacarosa, lactosa, glucosa, fructosa, sólidos de jarabe de maíz y maltodextriñas y mezclas de los mismos. La fibra de la dieta también se puede agregar si se desea. En caso de que se utilice, preferiblemente comprende hasta aproximadamente 5% de la energía de la fórmula nutricional. La fibra de la dieta puede ser de cualquier origen adecuado que incluye, por ejemplo, soya, chícharo, avena, pectina, goma guar, goma arábiga y fructooligosacáridos . Las vitaminas y minerales adecuados se pueden incluir en la fórmula nutricional en una cantidad para satisfacer las recomendaciones apropiadas . Se pueden incorporar en la fórmula nutricional, si se desea, uno o más emulsificantes de grado alimenticio; por ejemplo ésteres de ácido diacetiltartárico de monoglicéridos y diglicéridos , lecitina y monoglicéridos y diglicéridos . De manera similar se pueden incluir sales adecuadas y estabilizantes. También se pueden combinar con el extracto vegetal vitaminas y minerales. La composición nutricional preferiblemente es administrable de manera entérica, por ejemplo en forma de un polvo, comprimido o tableta, cápsula, un concentrado líquido, un producto sólido o una bebida lista para ingerirse. Si se desea producir una fórmula nutricional en polvo la mezcla homogeneizada se transfiere a un aparato de secado adecuado tal como un secador por aspersión o un liofilizador y se convierte en polvo.

En otra modalidad, una composición nutricional comprende un cereal basado en leche junto con una formulación prebiótica. Preferiblemente, el cereal basado en leche es un cereal para lactantes el cual actúa como un portador para la formulación prebiótica. En otra modalidad, un producto alimenticio habitual se puede enriquecer con por lo menos una planta o extracto vegetal de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo la leche fermentada, un yogur, queso fresco, leche cuajada, artículo de confitería, por ejemplo un dulce o una bebida edulcorada, una barra de confitería, hojuelas de cereal de desayuno o barras, bebidas, polvos de leche, productos basados en soya, productos fermentados que no son de leche o suplementos nutricionales para nutrición clínica . La cantidad de la planta o extracto vegetal en la composición puede variar de acuerdo con la fuente vegetal y su utilización. En una modalidad preferida una cantidad de dosis diaria eficaz es de por lo menos aproximadamente 1 mg y de manera más preferible de 1 mg a 200 mg de la molécula activa al día. En una modalidad alternativa, se puede preparar una composición farmacéutica que contiene por lo menos un extracto de romero o una sustancia fitoquímica como se describe en lo anterior en una cantidad suficiente para obtener el efecto deseado en un individuo. Esta composición puede ser un comprimido o tableta, un líquido, cápsulas, cápsulas suaves, pasta o pastillas, gomas o soluciones o emulsiones ingeribles, un suplemento oral seco, un suplemento oral húmedo. La composición farmacéutica puede contener además portadores y excipientes que son adecuados para suministrar la molécula activa respectiva de naturaleza diferente al tejido objetivo. La clase del portador/excipiente y la cantidad del mismo dependerán de la naturaleza de la sustancia y el modo de suministro del medicamento y/o administración contemplada. Se apreciará por las personas expertas en la técnica, en base en su propio conocimiento, seleccionar los componentes apropiados y la forma galénica. El extracto o extracto vegetal de acuerdo con la invención se puede utilizar en la preparación de una composición de alimento para mascotas. Dicha composición se puede administrar a la mascota como un suplemento a su dieta normal o como un componente de alimento para mascotas nutricionalmente completo, y de manera más preferible en un alimento para mascotas hipocalórico . También puede ser una composición farmacéutica. La planta o el extracto vegetal se puede utilizar solo o asociado con otras plantas tales como achicoria, té, cacao o con otra molécula bioactiva tal como antioxidantes, ácidos grasos, fibras prebióticas, glucosamina, sulfato de condroitina, por ejemplo. Preferiblemente, la composición de alimento para mascota contiene aproximadamente 0.01 a 0.15 g de plantas secas por gramo de alimento seco para mascota para un perro de 15 kg; y 0.001 a 0.1 g de plantas secas por gramo de alimento húmedo para mascotas para un perro de 15 kg. La composición de alimento para mascotas nutricionalmente completo de acuerdo con la invención puede estar en forma pulverizada y seca, un tratamiento o en forma húmeda, enfriada o estable en anaquel de producto de alimento para mascotas. Se puede congelar o proporcionar, un producto estable en anaquel. Estos alimentos para mascotas se pueden elaborar de las maneras conocidas en la técnica. Opcionalmente, el alimento para mascotas también puede contener un prebiótico, un microorganismo probiótico u otro agente activo, por ejemplo un ácido graso de cadena larga. La cantidad de prebiótico en el alimento para mascotas preferiblemente es menor de 10% en peso. Por ejemplo, el prebiótico puede comprender aproximadamente 0.1% a aproximadamente 5% en peso del alimento para mascotas. Para alimentos para mascota los . cuales utilizan achicoria como la fuente de prebiótico, la achocoria se puede incluir para comprender aproximadamente .0.5% a aproximadamente 10% en peso de la mezcla de alimento; de manera más preferible aproximadamente 1% a aproximadamente 5% en peso. Si se utiliza un microorganismo probiótico, el alimento para mascotas preferiblemente contiene aproximadamente 104 a aproximadamente 1010 células del microorganismo probiótico por gramo del alimento para mascotas; de manera más preferible, aproximadamente 106 a aproximadamente 106 células del microorganismo probiótico por gramo. El alimento para mascotas puede contener aproximadamente 0.5% a aproximadamente 20% en peso de la mezcla del microorganismo probiótico; de manera preferible aproximadamente 1% a aproximadamente 6% en peso; por ejemplo aproximadamente 3% a aproximadamente 6% en peso. Si es necesario, la lata de alimento para mascotas se puede suplementar con minerales o vitaminas de manera que sea nutricionalmente completa. Además también se pueden incorporar en el alimento para mascotas, según se desee, diversos ingredientes adicionales, por ejemplo azúcar, sal, especias, sazonadores, agentes saborizantes y similares . En otra modalidad, los adyuvantes de la dieta se pueden preparar de manera que mejoren la calidad del alimento para mascotas. Como adyuvantes de las dietas se pueden encapsular y se pueden proporcionar en forma de polvo y se pueden envasar juntos o de manera separada a partir de un alimento principal, el cual puede estar húmedo o seco. A modo de ejemplo, los extractos que contienen el polvo de acuerdo con la invención se pueden empacar en saquitos en forma de polvo o en un gel o lípido u otro portador adecuado. Estas unidades empacadas por separado se pueden proporcionar junto con el alimento principal o en empaques de unidades múltiples para uso con un alimento principal o tratamiento, de acuerdo con las instrucciones del usuario. La cantidad del alimento para mascotas que se va a consumir por la mascota para obtener un beneficio dependerá del tamaño de la mascota, el tipo de mascota y edad de la mascota. No obstante una cantidad del alimento para mascotas para proporcionar una cantidad diaria de aproximadamente 0.5 a 5 g de plantas secas por kg de peso corporal habitualmente será adecuado para perros y gatos. La administración a un humano o animal, el alimento o la composición de alimento para mascotas como se describe en lo anterior puede resultar en una regeneración ósea mejorada durante el sanado de fracturas. Puede ayudar a estimular la formación ósea y la densidad de mineral del hueso durante el crecimiento y optimizar la masa ósea máxima. En particular, puede proporcionar un crecimiento óseo óptimo durante la infancia. Esta composición de alimento puede llegar a evitar pérdidas óseas, en particular pérdidas óseas relacionadas con la edad en mamíferos o pérdidas óseas relacionadas con hospitalización a largo plazo. Puede reducir el riesgo de osteoporosis y mejorar la recuperación después de la fractura. Además, puede ayudar a construir cartílago en mamíferos y evitar osteoartritis en mascotas y humanos, lo que resulta en una mejor actividad o movilidad de individuo (por ejemplo mascotas y/o humanos) .

EJEMPLOS A manera de ejemplo y no como limitación los siguientes ejemplos son ilustrativos de diversas modalidades de la presente invención e ilustran adicionalmente las pruebas experimentales llevadas a cabo de acuerdo con las modalidades de la presente invención.

EJEMPLO 1 Plantas seleccionadas y compuestos puros Se seleccionaron plantas en base en el conocimiento de sus sustancias fenólicas. (i) Se seleccionaron 25 plantas además de soya de una base de datos de plantas que contienen sustancias estrogénicas (Tabla 1A) (ii) 9 plantas + sustancias que contienen soya que afectan la vía de síntesis de colesterol y por lo cual tienen el potencial de estimular indirectamente BMP-2 y la formación de hueso (Tabla IB) (iii) Compuestos puros: estradiol-17 , genisteína, daidzeína, 20 flavonoides, compuestos de achicoria (sesquiterpeno lactonas) .

TABLA 1A: Lista de especies de plantas seleccionadas a partir de la base de datos de plantas estrogénicas NOMBRE GENERO ESPECIE ORGANO Soya Glycine max semillas sweet acoro Acorus calamus rizomas valla de Amelanchier ovalis frutos giyomo ajenjo de Artemisia vulgaris parte áerea artemisia pegajosa Cnidium monnieri semillas chufa Cyperus rotundus rizoma lúpulo de Dodonaeae viscosa red hoj as/frutas semilla de maleza húmeda lúpulo de Dodonaeae viscosa hojas/frutas semilla de yellow maleza húmeda Yin Yang Huo Epimedium brevicornum partes aéreas Alforfón Eriogonu giganteum tallo/hoja/raíz Lirio Iris pal1ida rizomas Lirio Iris pal1ida cultivo celular Lirio Iris pseudacorus hojas/semillas Enebro Juniperus cowmunis fruto/hoj a/madera Lecaniodiscus cupianoides hojas/semillas arbusto de Lindera benzoin hojas/frutos especia género de Ocimum gratissim m hoj as/semillas albahaca Madera Oxydendrum arboreum hojas amarga plátano Plantago major hoj as grande Durazno Prunus pérsica semillas Sumaque liso Rhus glabra hojas/frutos casquete Scutellaria costaricaria planta casquete Scutellaria baicalinensis planta Tanaceto Tanacetum vulgare hojas común Diente de Taraxacum officinalis raíces león común maleza de Vernonia cinérea hoj as hierro TABLA IB: Lista de especies de plantas seleccionadas efecto potencial sobre el colesterol BMP-2 NOMBRE GENERO ESPECIES ORGANO Soya Glycine max semillas Achicoria Cichorium intybus raíces romero Rosmarinus officinalis hojas Tomillo Thyme leaves Uva Vitis vinifera frutos Alcaravea Carvm carvi semillas Rocou, annatto Bixa orellana semillas Aneth Anethum graveolens hojas Mentapiperita Mentha spicata hojas Comino Cuminum cyminum semillas TABLA 1C: Lista de compuestos puros Fuente de planta Compuestos puros Estradiol Soya Genistein Soya Daidzeina Soya Equol romero Carnosol Lignanos Enterolactona Lignanos Enterodiol romero ácido carnósico romero Eupafolina romero Genkwanina romero Luteolina romero Escutelareina romero ácido rosmarínico Acacetina Kaempferol Semilla, manzana Quercetina Té Catecina Té Epicatecina Apigenina Naranj a Hesperetina Toronja Naringenina Uva Resveratrol Floretina Diosmetina Diosmina Cirsimaritina Hispidulina Achicoria Lactucina Lactucopicrina 3 -desoxilactucina Geraniol Carvone Procedimiento de Extracción de Plantas Con referencia a la figura 1, el procedimiento de extracción generalmente incluye las siguientes etapas: • Hexano, desengrasado (extractos no cribados) • " MeOH/H20 (la) • MeOH/H20, hidrolizado con glucosidasas a, ß, extraído con acetato de etilo (Ib) • la purificado en columna PVPP para eliminar polifenoles con un peso molecular alto (2a) • Ib purificado en columna PVPP para eliminar polifenoles con peso molecular alto (2b) Los extractos 2a y 2b proporcionan resultados similares a los extractos la y Ib y por lo tanto la etapa de purificación con polifenol se suspende subsecuentemente. El procedimiento de extracción incluye tratamiento con glucosidasa (en vez de hidrólisis ácida) para asegurar conversión de glucósidos de flavonoide a agliconas. Subfraccionamiento - Se preparan cuatro subfracciones por fraccionamiento en un cartucho de gel de sílice con elusión por solventes de polaridad variable: acetato de etilo después acetato de etilo/metanol (95/5) seguido por acetato de etilo/metanol (50/50) y finalmente metanol (figura 2) . Etapas de cribado y bioanálisis El cribado para formación de huesos se lleva a cabo en varias etapas : (i) Análisis del gen indicador de alto rendimiento de BMP-2 de extractos de MeOH/H20 no hidrolizado (la) y extracto hidrolizado de glucosidasa correspondiente en acetato de etilo (Ib) . Los extractos se prueban dos veces en concentraciones de 1 a 100 µ9/G?1, se diluyen en medio de cultivo a partir de concentrados de extractos vegetales preparados como 50 mg/ml en DMSO. (ii) Extractos positivos en el cribado BMP- 2 se preparan de novo y se criba nuevamente con dosis/respuesta para conformar como "aciertos". (iii) prueba de BMP- 2 de subfraccionamiento de positivos/aciertos y compuestos puros candidatos (iv) Los extractos muestran resultados positivos en el análisis BMP- 2 se prueban adicionalmente para diferenciación de osteoblastos utilizando el análisis de fosfatasa alcalina en un modelo organotípico de formación de hueso utilizando cultivo de huesos de la bóveda craneal e histomorfometría para demostración de formación de huesos como se describe por Traianedes et al. (1998) . (v) Inyección final in vivo del extracto "acierto" en huesos de bóveda craneal de ratón y monitoreo de área y espesor de los huesos . Los extractos se determinan en un análisis de bóveda craneal de ratón neonatal in vitro de 4 días. Los huesos se incuban con los extractos durante los 4 días completos . (vi) Actividad de resorción monitoreada al medir la cantidad de colágeno tipo I liberado en el medio como hueso digerido por osteoclastos (vii) Efectos de la degradación de colágeno tipo II inducido por citocina, degradación de agrecano mediada por MMP y degradación mediada por agrecanasa en explantas de cartílago articular bovino. Resultados: Cribado de extracto de plantas en gen indicador de BMP-2 y cultivo de órganos Las tablas 2 y 3 proporcionan detalles de los resultados del cribado BMP-2 como sigue: 15 extractos se encontraron positivos en BMP-2. De estos, 5 confirmaron aciertos y se identificaron subfracciones activas (Rosmarinus, officinalis; Taraxacum officinalis, Lindera benzoin, Cyperus Rotundus, Iris pallida) y 5 positivos interesantes adicionales {Rosmarinus offinalis, Carum carvi, Thymus vulgaris, Mentha spicata y Vitis vinifera) de 2 rondas de cribado con BMP-2. Aciertos confirmados y subfracciones activas (Rosmarinus officinalis; Taraxacum officinalis, Lindera benzoin, Cyperus Rotundus, Iris pallida) y 5 positivos interesantes adicionales {Rosmarinus offinalis, Carum carvi, Thymus vulgaris, Mentha spicata y Vitis vinifera) de 2 rondas de cribado con BMP-2 también se identificaron como activos en el modelo de cultivo de órgano de bóveda craneal de ratón.

Los extractos activos o subfracciones se confirmaron adicionalmente para estimular formación de hueso en el modelo de cultivo de órgano de bóveda craneal: Iris pallida, Cyperus Rotundus, Rosmarinus officinalis (romero) , Thymus vulgaris (tomillo) , Carum carvi (alcaravea) .

TABLA 2: Resumen de extractos positivos en el cribado BMP- 2 y confirmado en cultivo de órgano Planta Extracto Número de Concentración Formación Ext activa de hueso en ^g/ml) cultivo de órgano : resultados y comentarios Glycine max EtOAc 2001 10, 50 Formación (soya) ligera de hueso Rosmarinus MeOH/agua 2004 10, 50 Buena officinalis formación de hueso en cultivo de bóveda craneal Rosmarinus EtOAc 2005 10 (50, Formación officinalis tóxico) ligera de hueso Cyperus Subfraceión 2012 10, 50 Formación rotundus ligera de hueso Iris Subfracción 2022 10 Cierta pallida de MeOH C18 subfracción de formación de hueso Tomillo EtOAc 2067 10 Cierta formación de hueso Cervi EtOAc 2074 10 Ligera formación de hueso 3 : Resumen general de resultados de extracto de planta hasta la identificación de aciertos Nombre en latín Parte Extracto Extraet Subfrace Cultivo Nombre en os iones de órgano inglés positiv positiva os BMP- s BMP- 2 2 Glycine max cultivos acetato 768 2001 soya de células de etilo vegetales Acorus calamus Tubérculos MeOH/H20 731 nd Acoro Amelanchier Fruta MeOH/H20 219 nd ovalis Vaya de servicio Artemisia Partes acetato 225 nd vulgaris ajenjo aéreas de etilo de Artemisia pegaj osa/aj enj o Cyperys Tubérculos acetato 205, 2012, 2012 rotundus chufa de etilo 2011 2013 Taraxacum Hojas acetato 750, 2035 2035 officinalis de etilo 2034 diente de león Lindera benzoin partes acetato 740, 2060 2059 arbusto de aéreas de etilo 2059 especia Prunus pérsica semilla acetato 772 nd durazno de etilo Iris pallida Tubérculos MeOH/H20 239, 760, 762 2022 Lirio dulce 760 2021, 2022 Rosmarinus Hojas MeOH/H20 2004, 2004 officinalis acetato 2127, 2005 romero de etilo 2005, 2089 Carura carvi Semilllas acetato 2074 2074 alcaravea de etilo Thymus vulgaris Hojas acetato 2067 2067 (tomillo) de etilo Mentha spicata Hojas acetato 2072 2072 Menta piperita de etilo Vitis vinifera Fruto acetato 2069 2069 uva de etilo Cichorium Ho as/ MeOH/agua 2002 intybus raíces EtOAc 2003 (achicoria) Anethum graveolens (dill) Cu minu cyminum aún no probado bixa orellana.

Conclusión del privado de extracto vegetal Los aciertos de BMP-2 confirmados en el análisis de formación de hueso en cultivo de órgano son extractos de semillas de soya, hojas de romero, hojas de tomillo y hojas de alcaravea. Ejemplo de aciertos de romero y alcaravea para actividad BMP-2, confirmado en el análisis de fosfatasa alcalina y cultivo de órganos Las figuras 3A-C ilustran resultados de análisis de formación de hueso para aciertos de extractos de romero y alcaravea. Efecto del procedimiento de extracción sobre la actividad de BMP-2 Después de una primera extracción de romero con metanol/agua en hojas previamente desengrasadas (ext. 2127) , la inducción de la expresión del gen para BMP-2 fue -1.5X a 10 µg/ml (figura 4). Una extracción específica de. este extracto con acetato de etilo (2188) generó un incremento en la expresión de BMP-2 (inducción de 8X) . Esto sugiere que el procedimiento de extracción de EtOAc resulta en la concentración de compuestos activos a partir del extracto original de MeOH/agua. Después de hidrólisis con glucosidasas , el extracto de acetato de etilo resultante (2189) también es activo, lo que muestra que las moléculas activas adicionales se han extraído. El extracto 2189 es incluso ligeramente más activo que el no hidrolizado. Estos resultados muestran de manera inequívoca una actividad de ambos extractos (no hidrolizado: 2188 e hidrolizado: 2189) lo que sugiere la existencia de moléculas activas bajo dos formas: libre y/o unido (glucosilado) en el extracto original. Formación de Hueso en Bóveda Craneal después de Inyección In Vivo La planta Rosmarinus officinalis extracto de romero) muestra actividad de formación ósea en tres análisis in vitro de formación ósea independientes (BMP-2, fosfatasa alcalina y cultivo de órgano óseo) así como en un análisis de bóveda craneal in vivo (véase la figura 5) . El extracto de romero (aquí, las hojas se extrajeron primero con agua y el extracto acuoso se hidrolizó y después se extrajo con acetato de etilo) se inyecta en la bóveda craneal cefálica de ratones, seguido por análisis de formación ósea ex vivo: Cribado de compuestos puros Las sustancias fenólicas se probaron en concentraciones de 1-10 µp? Las sustancias fenólicas activas en el análisis B P-2 se incluyen en la tabla 4. Las figuras 6A-C muestran algunas sustancias fenólicas positivas en los análisis de formación de hueso. TABLA 4: sustancias fenólicas activas en análisis BMP-2, ALP y cultivo de órgano : Flavonoide inducción inducción de formación de hueso de BMP-2 actividad de en cultivo de ALP órgano Eupafolina 3 - 8 X 2X, 4X Buena formación 2.5 - 10 µ? 5, 10 µ? para 2.5, 5.0, 10 µ? Carnosol 4.5-7X 2X ligero BF para 2.5-10 µ? 2.5-10 µ? 2.5 µ? (no responde Buen BF para 5 y en base en la 10 µ? dosis) Escutelareina 3-4X 2X nada a 2.5 µ? 5, 10 µ? 10 µ? un poco a 5 y 10 µ? Genkwanina 4X 1.5X ninguno 5 µ? 10 µ Kaempferol 2.5X 2-4X ligero a 10µ? 1-10 µ? 2.5-10 µ? Acacetina 3-5X 2? ninguna 5-10 µ? 5-10 µ? (no responde en base a la dosis) Análisis de Composición de Romero La tabla 5 muestra compuestos puros que se encuentran en extractos de romero. TABLA 5 : Componentes de Romero Nombre Clase Compuesto Genkwanina Flavona apigenin-7-metilada Genkwanina-4 ' - Flavona apigenin-7-metilada-4 ' -glucósido glucósido Salvigenina Flavona apigenina polimetilada Apigenina Flavona Luteolin-3 ' -0- Flavona Luteolin-3' -O-glucoronido glucoronido Diosmetina Flavona Luteolin-3' -O-metilado Luteolina Flavona Hesperidina Flavanona hesperetina glucosilada ácido cafeíco ácido fenólico Carnosol diterpeno fenólico ácido carnosíco diterpeno fenólico ácido rosmarínico ácido fenólico Análisis de Extractos de Romero Activos para BMP-2 El extracto para análisis se selecciona siguiendo resultados previos que muestran que la actividad de formación de huesos se concentra en extractos de acetato de etilo preparados a partir de un extracto de metanol/agua con (2189) o sin hidrólisis enzimática (2188) , (véase la figura 4) . El extracto de acetato de etilo 2188 se selecciona para un estudio fotoquímico de sus constituyentes principales que incluyen la identificación y la purificación de los compuestos por HPLC/ELSD/UV/MS. Esta experiencia se realizó por Analyticon Discovery GmbH, Postdam. Se completó después una evaluación fitoquímica profunda en el extracto de romero, activo en el análisis BMP-2. Los resultados preliminares llevaron al aislamiento de 13 compuestos. Se identificaron nueve compuestos. Otros cuatro requirieron investigaciones adicionales . Los estudios adicionales describen la dilucidación estructural de estos 4 compuestos llevada a cabo a través de RMN-H y RMN-2D (H, H-COSY, HMBC, HMQC) por Analyticon Discovery GmbH (Postdam) . Analyticon proporcionó trece moléculas identificadas puras con el fin de llevar a cabo la evaluación de su actividad biológica sobre la salud del hueso. Estos compuestos se incluyen en la tabla 6 y sus estructuras ilustradas en las figuras 7A-B. Entre estas, tres son compuestos nuevos, nunca descritos en la literatura (XI, XII y XIII) . Una relación entre estructura química y actividad biológica de estos trece constituyentes puede proporcionar una herramienta interesante y pertinente para el desarrollo adicional en la investigación de la salud del hueso. TABLA 6: 14 compuestos aislados de extracto de romero 2188 Número Nombre Cantidad Pureza actividad (mg) (%) BMP I ácido rosmarínico 318 99.8 NO II isorosmanol 73 99.7 No probado III rosmanol 14 mezcla de no probado III + IV IV Cirsimaritina NO V Genk anina 7.9 94.1 SI VI 7-metil rosmanol 4.8 99.7 No probado VII Carnosol 230 45 SI VIII Luteolina IX Escutelareina no presente en el SI extracto X 7-epirostnanol 26 81 No probado XI ácido desriidroxi 8.7 38 No probado rosmarinico XII 6" - 19.9 99.9 No probado feruloilnepitrina XIII 6' ' - 13 94 No probado coumaroilnepitrina XIV meti1epirosmano1 7 94 No probado Trece constituyentes de un extracto de romero (2188) para los cuales la dilucidación estructural se ha obtenido y validado están ahora disponibles para la evaluación de su actividad biológica en análisis de la salud de los huesos . Extracto de romero y sus actividad anti-resorción ósea La osteoporosis es una enfermedad crónica caracterizada por una pérdida ósea lenta. El hueso no es un tejido muerto. Por el contrario, se remodela constantemente con tejido óseo viejo que es sustituido por uno nuevo. Este remodelado es controlado por los osteoblastos , células que depositan hueso y por osteoclastos , células que lo disuelven. Habitualmente, existe un acoplamiento estrecho entre la formación de hueso y su resorción de manera que no se produce pérdida de hueso. En la osteoporosis esta coincidencia no es perfecta y la pérdida de hueso es más prominente que la formación de hueso. Para tratar la osteoporosis, uno puede tener como objetivo incrementar la formación de hueso, disminuyendo la pérdida de hueso o ambas. En este ejemplo, se demuestra que el extracto de romero puede disminuir la pérdida de hueso. Los osteoclastos, diferenciados de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humana se cultivan en corte de huesos bovinos. Se monitorea la actividad de resorción al medir la cantidad de colágeno tipo I liberado en el medio conforme digieren el hueso. El colágeno tipo I es la molécula orgánica principal del hueso. Conforme se digiere el hueso, la fase mineral del hueso se disuelve exponiendo las fibras de colágeno a la actividad proteolítica de metaloproteinasas de matriz. Una vez digeridas, las fibras de colágeno se vuelven solubles y se liberan al medio de cultivo en donde su presencia se puede cuantificar por análisis de ELISA-análisis CTX-I. La figura 8 proporciona detalles de los efectos del extracto de romero sobre la actividad de los osteoclastos humanos, como sigue: extracto de romero 1 (extracto P31 disponible comercialmente de Robertet) a una concentración de 10 µg/ml disminuye la cantidad de colágeno tipo I liberado de cortes dé hueso en comparación con medio de cultivo solo (control (CTL) ) (figura 8A) . Extracto de Romero y Osteoartritis La osteoartritis es una enfermedad caracterizada por una destrucción lenta del cartílago articular. Esta destrucción de cartílagos se debe a un desequilibrio entre las actividades anabólica y catabólica de los condrocitos. El condrocito es el único tipo de célula presente en un cartílago y es la responsable del mantenimiento de la matriz extracelular del cartílago. En la osteoartritis se incrementa el catabolismo y es el responsable de las pérdidas de cartílago. La matriz extracelular del cartílago está constituida de 2 moléculas principales: colágeno tipo II y agrecano. Aunque el colágeno es digerido principalmente por metaloproteinasas de matriz (MMP) , el agrecano se puede degradar tanto por los MMP como por otras clases de enzimas denominadas agrecanasas . "* Investigamos aquí si 2 extractos de romero diferentes y carnosol, uno de los componentes principales de este extracto, puede inhibir la degradación de colágeno y agrecano en explantes cultivados de cartílago articular. Se colocan en cultivo explantes de cartílago articular bovino sano. No obstante, dichos explantes muestran de manera natural una actividad catabólica muy baja lo cual no es ideal para probar la actividad anticatabólica de sustancias bioactivas potenciales. Para mejorar la sensibilidad del análisis se cultivaron los explantes en presencia de 2 citocinas pro-inflamatorias , TNF-ct y oncostatina que se sabe actúan juntas como inductores potentes de MMP y actividades de agrecanasa. Efectos de los extractos de romero y carnosol sobre el catabolismo de cartílago articular Las figuras 9A, 9B y 9C proporcionan detalles respecto a los efectos del extracto de romero y carnosol sobre el metabolismo de cartílago articular como sigue: extracto de romero 1 (extracto P31 disponible comercialmente de Robertet) en una concentración de 10 µg/ml suprime por completo la degradación de colágeno inducida por las citocinas pro-inflamatorias TNF-a y oncostatina (control (CTL) ) (figura 9A) . El extracto de romero 1 (extracto P31 disponible comercialmente de Robertet) en una concentración de 10 µg/ml suprime por completo la degradación de agrecano mediada por MMP inducida por las citocinas pro-inflamatorias TNF-a y oncostatina (control (CTL) ) (figura 9B) . El extracto de romero 1 (extracto P31 disponible comercialmente de Robertet) en una concentración de 10 µg/ml también inhibe la degradación de agrecano mediada por agrecanasa inducida por las citocinas pro-inflamatorias TNF-a y oncostatina (control (CTL) ) . De manera similar, otro extracto de romero, el extracto de romero 2 (de Nestec R&D Center in Tours, obtenido como se describe en lo anterior) en una concentración de 1 a 5 µg/ml y carnosol en una concentración de 1 a 5 µ? también inhiben la degradación de colágeno inducida por citocina (Figura 9C) . Inducción de ARNm para OPN Cultivo celular - se siembran osteoblastos HPOBTert sobre placas recubiertas con colágeno y se hacen crecer en medio MEM Eagle modificación a suplementado con suero bovino fetal 10%, L-glutamina 1% y penicilina/estreptomicina, ß-glicerolfosfato 1 mM y 50 µg/ml de ácido ascórbico en una atmósfera humidificada de COa 5% y aire 95% a 37°C. Cuando se agregan carnosol e inhibidores, se utiliza una cantidad equivalente de Me2SO como un vehículo control. El análisis de las concentraciones de ARNm por PCR en tiempo real - ARN celular total, se extraen utilizando el equipo NucleoSpin ARN II (Macherey-Nagel , Suiza) . Cantidades iguales (1 µg) de ARN de tres tratamientos diferentes se someten a transcripción inversa utilizando el equipo de síntesis de ADNc de la primera cadena para RT-PCR (Roche, Mannheim, Alemania) . Para cada muestra se agregan a la muestra 2 µ? de amortiguador de reacción 10x, 4 µ? de MgCl2 25 mM, 2 µ? de mezcla nucleotídica, 2 µ? de cebadores aleatorios, 1 µ? de inhibidor ribonucleasa y 0.4 µ? de transcriptasa inversa AMV del equipo. La transcriptasa inversa se realiza en las siguientes condiciones de ciclos térmicos (25°C durante 10 min, 42°C durante 60 min, y 75°C durante 5 min) utilizando el equipo PTC- 100 TM Concept, Suiza) . La PCR cuantitativa en tiempo real - PCR cuantitativa se realiza en 25 µ? en triplicados. Esto consiste de 12.5 µ? de mezcla maestra PCR universal Taqman 2x, cebadores de análisis en base en la demanda de 1.25 µ? y sondas (Applied Biosystems, USA) y 6.25 µ? de agua libre de ribonucleasa. La amplificación se lleva a cabo en un equipo ABI 7000 (Applied Biosystems) con el siguiente perfil térmico: 50°C durante 2 min, 10 min a 95°C seguido por 40 ciclos de 95°C durante 15 segundos y 60°C durante 1 minuto. Los niveles de expresión de genes se normalizan a los niveles de expresión de ß-actina. La figura 10 muestra que el extracto de romero o carnosol inducen expresión de OPN independiente de la dosis por determinación de PCR en tiempo real de los niveles de ARNm para OPN: Células HPOBtert se mantienen durante 48 h en extracto de romero o carnosol a las dosis indicadas. Inducción de NQ01 Preparación de extractos citoplásmicos - se lavan células hPOBtert dos veces con solución salina amortiguada con fosfato fría y se cosechan con amortiguador de lisis (Tritón X-100 1%, Tris/HCl 20 mM, pH 8, NaCl 137 mM, glicerol 10%, EDTA 2 mM, pH 8 e inhibidores de proteinasa recién agregados: fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM, aprotinina 0.15 U/ml, leupeptide 10 µg/ml y pepstatina 10 µg/ml) . Las muestra se centrifugan a 1300 rpm, 4°C durante 5 min y el sobrenadante se transfiere a un tubo fresco. La concentración de proteína se determina utilizando el análisis dé proteína BioRad. Aproximadamente 50 µg de cada muestra se mezclan con un volumen adecuado de amortiguador de muestra, se desnaturalizan durante 5 min a 95°C junto con 5 µ? de proteína estándar, se enfría en hielo y se carga en un gel listo 10% y se envía a análisis de inmunotranferencia utilizando anticuerpos anti-NQOl. Inmutransferencia - 50 µg del lisado de células de proteína se resuelve o separa por SDS-PAGE. Después de electroforesis las proteínas se transfieren a una membrana PVDF (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las membranas sondeadas para OPN y NQOl se bloquean y sondean en leche 5% en solución salina amortiguada con Tris/Tween (20 mM de base Tris, pH 7.6, 137 mM, Tween 20 0.1%) . Las manchas se visualizan por desarrollo de quimioluminisciencia y un sistema de detección de manchas Western (Amersham Biosciences) . Anticuerpos - Los anticuerpos específicos para NQOl (SC-16464) se adquieren de Santa Cruz Biotechnologies Inc (Santa Cruz, CA) . El anticuerpo ß-actina (A-5441) se adquiere de Sigma. Los anticuerpos secundarios se adquieren de Sigma. La figura 11 muestra que carnosol induce la expresión de la fase II de la enzima NQOl, un gen/proteína típicamente regulado por Nrf-1. Estado de Seguridad Prueba de tolerancia Se realiza una prueba de tolerancia en ratas Sprague-Dawley macho jóvenes. A las ratas se les suministra oralmente "por sonda" durante 5 días con administración diaria de 1 g (extracto 2127, MeOH/agua) por kg de peso corporal del animal. No se observaron comportamiento anormal, mortalidad o signos de toxicidad durante el tratamiento de los 10 días subsecuentes al período de observación. Por lo tanto, se considera que Rosmarinus officinalis es segura bajo estas condiciones.

Conclusiones A partir de las 32 especies vegetales, se cribaron 120 extractos en el análisis BMP-2, y 15 se identificaron como aciertos positivos. Los más promisorios fueron los de Rosmarinus officinalis (romero) junto con aquellos de Cyperus rotundus, Iris pallida, thymus vulgaris (tomillo) y Carum carvi (alcaravea) , en los cuales también se encontraron activos en el modelo de cultivo de órgano de bóveda craneal de ratón. Los aciertos de los análisis para BMP-2 se confirmaron en la fosfatasa alcalina y los análisis funcionales de cultivos de órgano para formación de hueso in vitro. Rosmarinus officinalis (extracto de romero) es el acierto más promisorio, mostrando actividad de formación de hueso en 3 análisis independientes de formación de hueso in vitro (BMP-2, fosfatasa alcalina, cultivo de órganos de hueso) así como en el análisis in vivo de bóveda craneal. Por ejemplo, los extractos de romero estimularon la formación ósea después de la inyección en bóveda craneal murina in vivo . Seis sustancias fenólicas que son componentes de romero (eupafolina, carnosol, escutelareina, genkwaina, kaempferol, acacetina) son activos entre los 3 análisis de formación de hueso. Los más activos son eupafolina y carnosol. Las. trece moléculas identificadas puras se aislaron del extracto de romero activo. Entre estas, 3 son compuestos nuevos (XI, XII y XIII) nunca descritos previamente en la literatura. Los datos presentados demuestran además que los extractos de romero y carnosol son capaces de frenar la destrucción de cartílago. Esta propiedad los vuelve candidatos interesantes para evitar osteoartritis o para frenar su progreso en humanos o mascotas. Los datos presentados también muestran que el extracto de romero es capaz de incrementar la formación ósea pero también disminuye la resorción ósea. No es común encontrar un compuesto/extracto único que muestre ambas propiedades . Esto vuelve al extracto de romero un candidato altamente interesante para evitar osteoporosis o para frenar su progreso en humanos o mascotas . Debe entenderse que diversos cambios o modificaciones a las modalidades preferidas actualmente descritas en la presente serán evidentes para aquellos expertos en la técnica. Dichos cambios y modificaciones se pueden realizar sin apartarse del espíritu y alcance de la presente materia objeto y sin disminuir sus ventajas propuestas. Por lo tanto, se pretende que dichos cambios y modificaciones estén cubiertos por las reivindicaciones anexas .

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES V 1. Composición que comprende un ingrediente activo que tiene una cantidad eficaz de una planta o extracto vegetal que contiene por lo menos una sustancia fitoquímica que tiene la capacidad de inducir expresión de proteína morfogénica ósea. 2. Composición como se describe en la reivindicación 1, en donde la planta o el extracto vegetal 10 inhiben además la resorción ósea. 3. Composición como se describe en la reivindicación 1, en donde la planta es romero. 4. Composición como se describe en la reivindicación 1, en donde la sustancia fitoquímica se 15 selecciona del grupo que consiste de eupafolina, carnosol, escutelareina, genkwanina, kaempferol, acacetina y combinaciones de los mismos. 5. Composición como se describe en la reivindicación 1, la cual está en una forma que se 20 selecciona del grupo que consiste de un alimento nutricionalmente equilibrado, alimento para mascotas, un suplemento de la dieta, un tratamiento, una composición farmacéutica y combinaciones de los mismos. 6. Composición como se describe en la 5 reivindicación 1, la cual se diseña para ayudar a la regeneración ósea durante el sanado de fracturas, incrementar la formación de hueso y la densidad mineral ósea durante el crecimiento y optimizar la masa ósea pico o disminuir la pérdida ósea, en particular pérdida ósea relacionada con la edad en humanos o mascotas . 7. Composición como se describe en la reivindicación 1, la cual está diseñada para construir cartílago y/o evitar pérdida de cartílago en humanos o mascotas . 8. Composición como se describe en la reivindicación 1, la cual está diseñada para evitar osteoartritis en humanos o mascotas . 9. Composición que comprende un ingrediente activo que tiene una cantidad eficaz de una planta de romero o extracto de planta de romero que contiene por lo menos una sustancia fitoquímica que tiene la capacidad de inducir expresión de proteína morfogénica ósea. 10. Composición como se describe en la reivindicación 9, en donde la sustancia fitoquímica se selecciona del grupo que consiste de eupafolina, carnosol, escutelareina, genkwanina, kaempferol, acacetina y combinaciones de los mismos. 11. Método para fabricar una composición de alimento para la prevención, el alivio y/o tratamiento de trastornos óseos o mantenimiento de la salud ósea en humanos o mascotas, el método comprende: suministrar una composición de alimento; agregar a la composición de alimento un ingrediente activo que tiene una planta o un extracto vegetal que contiene por lo menos una sustancia fitoquímica con la capacidad de estimular la proteína morfogénica ósea y/o inhibir la resorción ósea para preparar la composición. 12. Método como se describe en la reivindicación 11, en donde la planta es romero. 13. Método como se describe en la reivindicación 11, en donde la sustancia fitoquímica se selecciona del grupo que consiste de eupafolina, carnosol, escutelareina, genkwamina, kaempferol, acacetina y combinaciones de los mismos . 14. Método como se describe en la reivindicación 11, en donde la composición incluye componentes que se seleccionan del grupo que consiste de achicoria, té, cacao, sustancias bioactivas, antioxidantes, ácidos grasos, fibras prebióticas, glucosamina, sulfato de condroitina y combinaciones de los mismos. 15. Método para el tratamiento, alivio o prevención de trastornos óseos o mantenimiento de la salud de los huesos, el método comprende: administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende un ingrediente activo que tiene una cantidad eficaz de por lo menos una planta o extracto vegetal que contiene por lo menos una sustancia fitoquimica que tiene la capacidad para inducir expresión de proteína morfogénica ósea a un individuo en necesidad de la misma. 16. Método como se describe en la reivindicación 15, en donde la planta o el extracto vegetal inhiben además la resorción ósea. 17. Método como se describe en la reivindicación 15, en donde la plata es romero. 18. Método como se describe en la reivindicación 15, en donde la sustancia fitoquimica se selecciona del grupo que consiste de eupafolina, carnosol, escutelareina, genkwamina, kaempferol, acacetina y combinaciones de los mismos . 19. Método para incrementar la formación ósea, la densidad de mineral en huesos durante el crecimiento y optimizar la masa ósea pico en humanos o mascotas, el método comprende: suministrar a un individuo una composición que comprende un ingrediente activo que tiene una cantidad eficaz de por lo menos una planta o extracto vegetal que contiene por lo menos una sustancia fitoquimica que tiene la capacidad de inducir expresión de proteína morfogénica ósea. 20. Método como se describe en la reivindicación 19, en donde la planta o el extracto vegetal inhiben además la resorción ósea. 21. Método como se describe en la reivindicación 19, en donde la planta es romero. 22. Método como se describe en la reivindicación 19, en donde la sustancia fitoquímica se selecciona del grupo que consiste de eupafolina, carnosol, escutelareina, genkwamina, kaempferol, acacetina y combinaciones de los mismos . 23. Método para el tratamiento, alivio y/o profilaxis de osteoartritis en mascotas y humanos, el método comprende: suministrar a un individuo que tiene o que se encuentra en riesgo de osteoartritis una composición que comprende él ingrediente activo que tiene una cantidad eficaz de por lo menos una planta o extracto vegetal que contiene por lo menos una sustancia fitoquímica que tiene la capacidad de inducir expresión de proteína morfogénica ósea en el individuo. 24. Método como se describe en la reivindicación 23, en donde la planta o el extracto vegetal inhiben además la resorción ósea. 25. Método como se describe en la reivindicación 23, en donde la planta es romero. 26. Método como se describe en la reivindicación 23, en donde la sustancia fitoquímica se selecciona del grupo, que consiste de eupafolina, carnosol, escutelareina, genkwamina, kaempferol, acacetina y combinaciones de los mismos . 27. Método para tratar o evitar osteoporosis, el método comprende: administrar a un individuo que tiene o que se encuentra en riesgo de osteoporosis una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende un ingrediente activo que tiene una cantidad eficaz de por lo menos una planta o extracto vegetal que contiene por lo menos una sustancia fitoquímica que tiene la capacidad de inducir expresión de proteína morfogénica ósea en el individuo. 28. Método para estimular la regeneración ósea durante el sanado de fracturas, el método comprende: alimentar a un individuo que tiene una fractura con una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende un ingrediente activo que tiene una cantidad eficaz de por lo menos una planta o extracto vegetal que contiene por lo menos una sustancia fitoquímica que tiene la capacidad de inducir expresión de proteína morfogénica ósea en el individuo. 29. Método para disminuir la pérdida ósea, el método comprende: alimentar a un individuo que presenta pérdida ósea con una composición que comprende un ingrediente activo que tiene una cantidad eficaz de por lo menos una planta o extracto vegetal que contiene por lo menos una sustancia fitoquímica que tiene la capacidad de inducir expresión de proteína morfogénica ósea en el individuo.