MX2008011245A - Metodos y composiciones para la proteina a35r de virus de enfermedades pustulosas. - Google Patents

Abstract

La presente invención provee métodos y composiciones para modular una respuesta inmune en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad de una proteína A35R o fragmento activo de la misma del virus Vaccinia u otros virus de enfermedades purulentas.

Description

METODOS Y COMPOSICIONES PARA PROTEINA A35R DE POXVIRUS ANTECEDENTES DE LA INVENCION CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a proteína A35R de poxvirus, anticuerpos para la misma, y ácidos nucleicos que codifican para la proteína A35R, y su uso en métodos de diagnóstico y terapéuticos.

TECNICA ANTECEDENTE Los poxvirus son grandes virus de ADN de doble cadena con genomas que van de 130 a 379 kpb. Los poxvirus tienen distribución mundial, e infectan a una amplia variedad de animales, que incluyen insectos, aves y mamíferos. Desde la erradicación de la viruela y el cese de los programas de vacunación, varias infecciones por poxvirus han comenzado a volver a emerger clínicamente en todo el mundo. El virus de la viruela continúa siendo en la actualidad una amenaza de bioterrorismo, y varios otros poxvirus infectan a humanos, causando morbilidad y mortalidad: virus del molusco contagioso (MCV), virus de la viruela del mono, virus Tanapox, virus del tumor Yaba del mono, virus de la viruela vacuna y Cantalagovirus (surgido de una cepa de vacuna del virus de la vaccinia (VV). La frecuencia de poxvirus en animales y humanos y su propensión para recombinación y adquisición de genes, sugieren que no sería sabio descontinuarlos como patógenos humanos importantes. Esto es especialmente cierto, puesto que la mayoría de las enfermedades infecciosas emergentes son zoonosis, cruzando de animales a humanos, y se sabe que los poxvirus adquieren mutaciones y llegan a ser altamente patogénicos en una nueva especie animal. El gen de A35R está altamente conservado en poxvirus trópicos de mamíferos. El virus de la vaccinia es el poxvirus modelo para estudiar la proteína A35R (denominada A35R en la cepa Copenhague, 0158 en la cepa WR, y muchas otras designaciones en todos los poxvirus trópicos de mamíferos) y su función en el ciclo de vida del virus. La presente invención provee el descubrimiento de que la proteína A35R tiene actividad inmunorreguladora. De esta manera, la presente invención supera deficiencias previas en la técnica, proveyendo una proteína A35R y fragmentos biológicamente activos de la misma, así como ácidos nucleicos que codifican para esta proteína y sus fragmentos y anticuerpos e inhibidores específicos para los mismos. Estas composiciones se usan, por ejemplo, en métodos para diagnosticar, tratar y prevenir infección por poxvirus, tratar y prevenir otros trastornos, y en la modulación de respuestas inmunes.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención provee un método para modular una respuesta inmune en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad inmunomoduladora de una proteína A35R o fragmento activo de la misma de virus de la vaccinia u otro poxvirus, y/o administrar una cantidad inmunomoduladora de un ácido nucleico que codifica para una proteína A35R o fragmento activo de la misma de virus de la vaccinia u otro poxvirus. Provisto además en la presente, es un método para tratar o prevenir un trastorno autoinmune en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de una proteína A35R o fragmento activo de la misma de virus de la vaccinia u otro poxvirus, y/o administrar una cantidad efectiva de un ácido nucleico que codifica para una proteína A35R o fragmento activo de la misma de virus de la vaccinia u otro poxvirus. Además, la presente invención provee un método para reducir la probabilidad de rechazo de trasplante en un receptor de trasplante, que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de una proteína A35R o fragmento activo de la misma de virus de la vaccinia u otro poxvirus, y/o administrar una cantidad efectiva de un ácido nucleico que codifica para una proteína A35R o fragmento activo de la misma de virus de la vaccinia u otro poxvirus. Incluido también es un método para aumentar una respuesta inmune a una vacuna de poxvirus en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad inmunogena de una vacuna de poxvirus diseñada para necesitar ácido nucleico que codifica para una proteína A35R y/o para necesitar actividad de proteína A35R.

En modalidades adicionales, la presente invención provee un método para aumentar una respuesta inmune en un sujeto a un antígeno heterólogo codificado por un vector de poxvirus, que comprende administrar al sujeto una cantidad inmunógena de un vector de poxvirus que comprende ácido nucleico que codifica para el antígeno, y en donde el vector de poxvirus está diseñado para necesitar ácido nucleico que codifica para una proteína A35R y/o para necesitar actividad de proteína A35R. Además, la presente invención provee un método para tratar o prevenir una respuesta inmune perjudicial en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de una proteína A35R o fragmento activo de la misma de proteína de virus de la vaccinia u otro poxvirus, y/o administrar una cantidad efectiva de un ácido nucleico que codifica para una proteína A35R o fragmento activo de la misma de virus de la vaccinia u otro poxvirus. Se provee también en la presente un método para tratar o prevenir una respuesta inmune perjudicial en un sujeto, en donde la respuesta inmune perjudicial es causada por actividad de proteína A35R, que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de una sustancia que inhiba la actividad de proteína A35R. La presente invención provee además un método para aumentar un efecto inmunomodulador de una sustancia, que comprende combinar la sustancia con una proteína A35R o fragmento activo de la misma de virus de la vaccinia u otro poxvirus, y/o combinar la sustancia con un ácido nucleico que codifica para una proteína A35R o fragmento activo de la misma de virus de la vaccinia u otro poxvirus. Además, provisto en la presente es un método para tratar o prevenir una infección por poxvirus en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de un inhibidor de actividad de proteína A35R. Otras modalidades de esta invención incluyen un método para diagnosticar una infección por poxvirus en un sujeto, que comprende: a) poner en contacto una muestra del sujeto con un anticuerpo que une específicamente la proteína A35R bajo condiciones por las cuales puede formarse un complejo de antígeno/anticuerpo; y b) detectar la formación del complejo de antígeno/anticuerpo, diagnosticando de esta manera infección por poxvirus en un sujeto. También provisto en la presente es un método para diagnosticar infección por poxvirus en un sujeto, que comprende: a) poner en contacto una muestra del sujeto con una proteína A35R o fragmento antigénico de la misma bajo condiciones por las cuales pueda formarse un complejo de antígeno/anticuerpo; y b) detectar la formación del complejo de antígeno/anticuerpo, diagnosticando de esta manera la infección por poxvirus en un sujeto. Se provee también un método para detectar poxvirus en una muestra, que comprende: a) poner en contacto la muestra con un anticuerpo que une específicamente la proteína A35R bajo condiciones por las cuales pueda formarse un complejo de antígeno/anticuerpo; y b) detectar la formación del complejo de antígeno/anticuerpo, detectando de esta manera poxvirus en la muestra. Provisto además en la presente es un método para detectar un anticuerpo para poxvirus en una muestra, que comprende: a) poner en contacto la muestra con una proteína A35R o fragmento antigénico de la misma bajo condiciones por las cuales pueda formarse un complejo de antígeno/anticuerpo; y b) detectar la formación del complejo de antígeno/anticuerpo, detectando de esta manera un anticuerpo para poxvirus en la muestra. Además, la presente invención provee un método para identificar ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica para proteína A35R en una muestra, que comprende: a) poner en contacto la muestra con un oligonucleótido que comprende una secuencia de nucleotidos que es complementaria a la secuencia de nucleotidos que codifica para proteína A35R, bajo condiciones por las cuales pueda ocurrir hibridación del ácido nucleico; y b) detectar la hibridación del ácido nucleico, detectando de esta manera ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleotidos que codifica para proteína A35R en la muestra. Modalidades adicionales incluyen un método para identificar ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica para proteína A35R en una muestra, que comprende: a) poner en contacto la muestra con un par de oligonucleótidos iniciadores que son complementarios a la secuencia de nucleotidos que codifica para proteína A35R, bajo condiciones por las cuales pueda ocurrir amplificación del ácido nucleico; y b) detectar amplificación del ácido nucleico, detectando de esta manera ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleotidos que codifica para proteína A35R en la muestra. La presente invención provee además un método para tratar cáncer en un sujeto, que comprende administrar al sujeto un poxvirus diseñado para necesitar actividad de proteína A35R y, en algunas modalidades, el poxvirus puede comprender además: a) ácido nucleico que codifica para una molécula co-estimuladora (por ejemplo, B7.1 , ICAM-1 , LFA-3); b) ácido nucleico que codifica para un antígeno tumoral; y/o c) ácido nucleico que codifica para una proteína inmunomoduladora, en cualquier combinación. En otras modalidades, la presente invención provee una composición que comprende proteína A35R y un vehículo farmacéuticamente aceptable y una composición que comprende un poxvirus diseñado para necesitar actividad de A35R y un vehículo farmacéuticamente aceptable y una composición que consiste esencialmente de una secuencia de nucleotidos que codifica para una proteína A35R de poxvirus y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Varios otros objetivos y ventajas de la presente invención, llegarán a ser evidentes a partir de la siguiente descripción detallada.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención se basa en el descubrimiento inesperado de que la proteína A35R de poxvirus tiene actividad ¡nmunomoduladora. De esta manera, en una modalidad, la presente invención provee un método para modular una respuesta inmune en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de una proteína A35R o fragmento activo de la misma de virus de la vaccinia u otro poxvirus, y/o administrar al sujeto una cantidad efectiva de un ácido nucleico que codifica para una proteína A35R o fragmento activo de la misma de virus de la vaccinia u otro poxvirus. Provisto además en esta invención es un método para tratar y/o prevenir un trastorno autoinmune en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de una proteína A35R o fragmento activo de la misma de virus de la vaccinia u otro poxvirus, y/o administrar una cantidad efectiva de un ácido nucleico que codifica para una proteína A35R o fragmento activo de la misma de un virus de la vaccinia u otro poxvirus. Ejemplos no limitativos de trastornos autoinmunes que pueden tratarse y/o prevenirse mediante los métodos de esta invención, incluyen artritis (por ejemplo, artritis reumatoide o RA), esclerosis múltiple (MS), diabetes (por ejemplo, diabetes mellitus insulinodependiente o IDDM), lupus eritematoso sistémico (SLE), miastenia grave, enfermedad de Crohn, enteritis regional, vasculitis, colitis ulcerativa, síndrome de Sjógren, espondilitis anquilosante, polimiositis y cualquier otro trastorno autoinmune conocido ahora o identificado después. Los métodos de la presente invención pueden usarse además para tratar alergias, reacciones alérgicas y cualquier otra enfermedad o trastorno asociado con una respuesta inmune o reacción aberrante y/o no deseable. Provisto además es un método para reducir la probabilidad de rechazo de trasplante (o aumentar la probabilidad de trasplante exitoso) en un receptor de trasplante, que comprende administrar al receptor de trasplante una cantidad efectiva de una proteína A35R o fragmento activo de la misma de virus de la vaccinia u otro poxvirus, y/o administrar al receptor de trasplante una cantidad efectiva de un ácido nucleico que codifica para una proteína A35R o fragmento activo de la misma de virus de la vaccinia u otro poxvirus. La reducción en la probabilidad de rechazo de trasplante o incremento en la probabilidad de trasplante exitoso, es en comparación con la probabilidad de rechazo de trasplante o probabilidad de trasplante exitoso en un receptor de trasplante que no recibió una proteína 35R o fragmento activo de la misma, o un ácido nucleico que codifica para una proteína A35R o fragmento activo de la misma, como dichas probabilidades se conocerían y/o determinarían de acuerdo con estándares conocidos en la técnica. Además, la proteína, fragmento activo y/o ácido nucleico de estos métodos, puede administrarse al receptor de trasplante en cualquier momento respecto al trasplante (es decir, antes, después y/o simultáneamente, en cualquier combinación). En modalidades adicionales de esta invención, se provee un método para aumentar una respuesta inmune a una vacuna de poxvirus en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad inmunogena de una vacuna de poxvirus diseñada para necesitar ácido nucleico que codifica para una proteína A35R y/o para necesitar actividad de proteína 35R. Dé esta manera, el poxvirus usado en la vacuna puede tener una deleción completa o parcial de la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína A35R, o el poxvirus de la vacuna puede tener una alteración en la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína A35R (por ejemplo, una deleción, sustitución, inserción, codón de detención, mutación de sentido erróneo, mutación sin sentido, o cualquier otra mutación), el resultado final siendo una falta de actividad de proteína A35R en una célula o sujeto al cual la vacuna de poxvirus ha sido suministrada o introducida. Ejemplos no limitativos de poxvirus que pueden ser alterados de conformidad con los métodos de esta invención para necesitar actividad de proteína A35R, son la vacuna Ankara de la vaccinia modificada (MVA) atenuada, la vacuna DRYVAX, las vacunas Acambis (ACM1000 y ACM2000), así como cualquier otra vacuna de poxvirus conocida ahora o identificada después. Provisto también en la presente, es un método para aumentar una respuesta inmune en un sujeto a un antígeno heterólogo codificado por un vector de poxvirus, que comprende administrar al sujeto una cantidad inmunogena de un vector de poxvirus que comprende ácido nucleico que codifica para el antígeno, y en donde el vector de poxvirus está diseñado para necesitar ácido nucleico que codifica para una proteína A35R y/o para necesitar actividad de proteína A35R. Como se indicó anteriormente, el poxvirus usado en la vacuna puede tener una deleción completa o parcial de la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína A35R, o el poxvirus de la vacuna puede tener una alteración en la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína A35R (por ejemplo, una deleción, sustitución, inserción, codón de detención, mutación de sentido erróneo, mutación sin sentido, o cualquier otra mutación), el resultado final siendo una falta de actividad de proteína A35R en una célula o sujeto al cual la vacuna de poxvirus ha sido suministrada o introducida. El uso de poxvirus como vectores para suministrar antígenos para vacuna se conoce en la técnica. Ejemplos no limitativos de dichos vectores incluyen aquellos descritos para vacunas de la rabia en Rupprecht et al. { Virus Research 1 1 1 : 101 -105 (2005)); vacunas del VIH en Cebere et al. {Vaccine 24: 417-425 (2006)); vacunas de la tuberculosis en Xing et al. {Curr. Gene Ther. 5: 485-482 (2005)); y para inmunoterapias del cáncer en Kaufman et al. (Curr. Gene Ther. 17: 239-244 (2006)). En los métodos provistos en la presente para aumentar una respuesta inmune, dicho aumento se identifica por comparación con una respuesta inmune en un sujeto que no recibió la proteína, fragmento activo y/o el ácido nucleico de esta invención. Dichos estudios comparativos pueden llevarse a cabo de acuerdo con protocolos bien conocidos en la técnica para detectar y/o medir cualquier número de respuestas inmunes. Ejemplos no limitativos de una respuesta inmune que puede aumentarse mediante los métodos de esta invención, incluyen respuesta de anticuerpos (por ejemplo, respuesta de anticuerpos protectores; respuesta de anticuerpos neutralizantes), respuesta de células T citotóxicas, respuesta de células T auxiliares, producción de interleucina-2 (IL-2); y eficacia de vacunas. Provisto además en la presente es un método para tratar o prevenir una respuesta inmune perjudicial en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de una proteína A35R o fragmento activo de la misma de virus de la vaccinia u otra proteína de poxvirus, y/o una cantidad efectiva de un ácido nucleico que codifica para una proteína A35R o fragmento activo de la misma de un virus de la vaccinia u otro poxvirus. Provisto también en la presente es un método para tratar o prevenir una respuesta inmune perjudicial en un sujeto, en donde la respuesta inmune perjudicial es causada por actividad de proteína A35R, que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de una sustancia que inhibe la actividad de proteína A35R. Una sustancia que inhibe la actividad de A35R puede ser, pero no está limitada a, un ligando (por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo) que une específicamente una proteína A35R o fragmento activo de la misma, y/o un ácido nucleico que inhibe la transcripción o traducción de ácido nucleico que codifica para una proteína A35R o fragmento activo de la misma (por ejemplo, un ácido nucleico antisentido que une una secuencia codificante de la proteína A35R, un ARN de interferencia que inhibe o suprime la transcripción y/o traducción de la proteína A35R, una ribozima, etc.). Además, pequeñas moléculas y otros compuestos y sustancias que inhiben la actividad de A35R, podrían usarse en los métodos de esta invención.

Una respuesta inmune perjudicial como se describe en la presente puede ser, por ejemplo, una respuesta inmune perjudicial producida por un agente que comprende la proteína A35R, o ácido nucleico que codifica para la proteína A35R. Ejemplos de una respuesta inmune perjudicial incluyen, pero no están limitados a, reacción alérgica o alergia, inflamación de los órganos (por ejemplo, corazón; sistema nervioso central; riñon; h ígado) mediada por la respuesta inmune, inmunopatología inducida por el patógeno, enfermedades y trastornos autoinmunes (por ejemplo, diabetes, SLE, MS), etc. En otras modalidades de esta invención, la respuesta inmune perjudicial puede ser una respuesta inmune producida por un agente de bioterrorismo (por ejemplo, una respuesta inmune que sea perjudicial para un sujeto que pueda ser modulada, por suministro al sujeto, de la proteína A35R o fragmento activo de la misma, y/o ácido nucleico de esta invención). Ejemplos de dichos agentes de bioterrorismo incluyen, pero no están limitados a, agentes biológicos infecciosos tales como bacterias patógenas (por ejemplo, Yersinia que causa la peste; Bacillus anthracis que causa el ántrax; Francisella tularensis), virus (por ejemplo, influenza; coronavirus del SARS; virus Ebola; virus Marburg); toxinas, etc., así como cualquier otro agente conocido ahora o identificado después que pueda usarse como un agente de bioterrorismo. En otras modalidades, la respuesta inmune perjudicial puede ser producida por la presencia, ya sea en forma natural o no natural, en el agente de bioterrorismo, de la proteína A35R o fragmento activo de la misma, o un ácido nucleico que codifica para la proteína A35R o fragmento activo de la misma. En dichas modalidades, la respuesta inmune perjudicial se trata por suministro al sujeto de una sustancia como se describe en la presente, que inhiba o reduzca la actividad de proteína 35R. Ejemplos de dichos agentes de bioterrorismo pueden incluir viruela, vectores que comprendan actividad de A35R y otros agentes infecciosos y. agentes tóxicos como se describen en la presente que son diseñados para tener actividad de A35R. En otras modalidades de esta invención, se provee un método para aumentar un efecto inmunomodulador de una sustancia, que comprende combinar la sustancia con una proteína A35R o fragmento activo de la misma de virus de la vaccinia u otro poxvirus, y/o combinar la sustancia con un ácido nucleico que codifica para una proteína A35R o fragmento activo de la misma. Dicha sustancia que tiene un efecto inmunomodulador puede ser, pero no está limitada a, esferoides, fármacos inmunosupresores, ¡nterferones, corticosteroides, azatioprina, ciclofosfamida, prednisona, metotrexato, rituximab, etc., así como cualquier otro agente inmunomodulador conocido ahora o identificado después. Un aumento de un efecto inmunomodulador de una sustancia, se identificaría por comparación de un efecto inmunomodulador de la sustancia en un sujeto con y sin la presencia de la proteína A35R o fragmento activo de la misma, o ácido nucleico que codifica para la proteína A35R o fragmento activo de la misma. Como se usa en la presente, un "efecto ¡nmunomodulador" es cualquier acción o actividad de una célula o tejido del sistema inmune. Dicho efecto ¡nmunomodulador puede ser positivo o negativo, un aumento o una inhibición, un incremento o una disminución en una respuesta, actividad y/o reacción. Formas para detectar y/o medir un efecto ¡nmunomodulador se conocen en la técnica, e incluyen protocolos estándar tales como aquellos usados para detectar y/o medir producción o actividad de anticuerpos, proliferación o actividad de linfocitos T, citotoxicidad y/o producción o actividad de citocinas. La presente invención provee además un método para tratar o prevenir una infección por poxvirus en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de un inhibidor de actividad de proteína A35R. Como se indicó anteriormente, una sustancia que inhibe la actividad de A35R puede ser, pero no está limitada a, un ligando, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que une específicamente una proteína A35R o fragmento activo de la misma, un ácido nucleico que inhibe la transcripción o traducción de ácido nucleico que codifica para una proteína A35R o fragmento activo de la misma, y/o un fármaco u otra sustancia que actúa para inhibir la actividad de A35R (por ejemplo, fármacos inmunosupresores, esteroides, interferón, etc.). El método para tratar o prevenir infección causada por poxvirus en un sujeto puede llevarse a cabo, por ejemplo, poniendo en contacto una célula inmune del sujeto con cualquiera de los polipéptidos, fragmentos, ácidos nucleicos, vectores y/o anticuerpos de esta invención. La célula puede ser, por ejemplo, una célula T CD8+ que se pone en contacto con el polipéptido y/o fragmento de esta invención en presencia de una molécula del MHC clase I, que puede ser una molécula soluble o puede estar presente sobre la superficie de una célula que expresa moléculas del MHC clase I. La célula puede ser también cualquier célula que pueda captar y expresar ácido nucleico exógeno y producir los polipéptidos y/o fragmentos de esta invención. En algunas modalidades, los polipéptidos y/o fragmentos de esta invención pueden ser producidos por una célula que los secreta, por lo cual el polipéptido y/o fragmento es producido y secretado, y captado entonces y después procesado por una célula que presenta antígenos u otra célula que expresa MHC clase I, y presentado al sistema inmune para inducción de una respuesta inmune. En otras modalidades, los ácidos nucleicos y/o vectores de esta invención pueden introducirse directamente en una célula que presenta antígenos y/u otra célula que expresa MHC clase I en la cual el polipéptido y/o fragmento es producido y procesado directamente, y presentado al sistema inmune sobre la superficie de la célula. Como se expuso anteriormente, se contempla que en los métodos en donde las composiciones de esta invención se administran a un sujeto o a una célula de un sujeto, dichos métodos pueden comprender además el paso de administrar un adyuvante adecuado al sujeto o a una célula del sujeto. El adyuvante puede estar en la composición de esta invención, o el adyuvante puede estar en una composición separada que comprenda el adyuvante adecuado y un vehículo farmacéuticamente aceptable. El adyuvante puede administrarse antes de, simultáneamente con, y/o después de, la administración de la composición que contiene cualquiera de los polipéptidos, fragmentos, ácidos nucleicos y/o vectores de esta invención. Por ejemplo, QS-21 , similar a alumbre, adyuvante completo de Freund, SAF, etc., pueden administrarse dentro de días/semanas/horas (antes o después) de la administración de la composición de esta invención. La eficacia de un adyuvante puede determinarse midiendo la respuesta inmune dirigida contra el polipéptido y/o fragmento de esta invención, con y sin el adyuvante, usando procedimientos estándar, como se describe en la presente y como es bien sabido en la técnica. El sujeto de esta invención puede ser cualquier sujeto que necesite de la respuesta inmune de esta invención, y/o que necesite de tratamiento para, o prevención de, infección por poxvirus, así como cualquier sujeto en quien sea deseable inducir una respuesta inmune a poxvirus. Dicho sujeto puede ser cualquier tipo de animal que sea susceptible a infección por un poxvirus de esta invención, así como cualquier animal a quien las proteínas, fragmentos activos de las mismas y ácidos nucleicos de esta invención pueden administrarse de conformidad con los métodos de esta invención. Por ejemplo, un animal de esta invención puede ser un mamífero, un ave o un reptil. En ciertas modalidades, el sujeto de esta invención es un humano. Los síntomas de infección por poxvirus pueden incluir fiebre, dolor de cabeza, dolores musculares y/o de articulaciones, fiebre, erupción cutánea (rash), inflamación, etc. El tratamiento adecuado puede llevar a una reducción en la severidad de, y/o la eliminación de, uno o más de estos síntomas. Las composiciones de esta invención pueden administrarse a una célula de un sujeto o a un sujeto ¡n vivo o ex vivo. Para administración a una célula del sujeto in vivo, así como para administración al sujeto, las composiciones de esta invención pueden administrarse oralmente, parenteralmente (por ejemplo, intravenosamente), por inyección intramuscular, por inyección intraperitoneal, inyección subcutánea, transdérmicamente, extracorpóreamente, tópicamente, o similares. Asimismo, las composiciones de esta invención pueden ser pulsadas en células dendríticas, las cuales se aislan o se desarrollan de las células de un sujeto, de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica, o en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) globales, o varias subfracciones de células de las mismas de un sujeto. La cantidad exacta de la composición requerida variará de sujeto a sujeto, dependiendo de la especie, edad, peso y condición general del sujeto, la composición particular usada, su modo de administración, y similares. De esta manera, no es posible especificar una cantidad exacta para cualquier composición de esta invención. Sin embargo, la cantidad efectiva puede ser determinada por los expertos en la técnica usando sólo experimentación de rutina dadas las enseñanzas de la presente. Como un ejemplo, a un sujeto diagnosticado con infección por poxvirus, o que se sabe está en riesgo de ser infectado con poxvirus, o en quien sea deseable inducir una respuesta inmune a poxvirus, pueden administrarse subcutáneamente entre aproximadamente 0.1 pg/kg y aproximadamente 10 g/kg de un polipéptido y/o fragmento biológicamente activo de esta invención, y pueden estar en un adyuvante, a intervalos cada hora, diariamente y/o semanalmente, hasta que una evaluación de los parámetros químicos del sujeto indiquen que el sujeto está recuperado de la infección por poxvirus, y/o el sujeto demuestre la respuesta inmunológica deseada. En forma alternativa, un polipéptido y/o fragmento de esta invención puede ser pulsado en células dendríticas a una concentración entre aproximadamente 0.1 ng y aproximadamente 500 mg, y las células dendríticas pueden administrarse al sujeto intravenosamente a los mismos intervalos de tiempo. El tratamiento puede continuarse o reanudarse si los parámetros clínicos del sujeto indican que la infección por poxvirus está presente, y puede mantenerse hasta que la infección deje de ser detectada por estos parámetros, y/o hasta que se logre la respuesta inmunológica deseada. Si se usan métodos ex vivo, pueden removerse y mantenerse células o tejidos fuera del cuerpo del sujeto de acuerdo con protocolos estándar bien conocidos en la técnica. Los polipéptidos y/o fragmentos biológicamente activos de esta invención pueden introducirse en las células por medio de mecanismos conocidos para la captación de polipéptidos en células (por ejemplo, fagocitosis, pulsación en células que expresan MHC clase I, liposomas, etc.). Las células pueden ser infundidas entonces (por ejemplo, en un vehículo farmacéuticamente aceptable) o trasplantadas de nuevo en el sujeto por medio de métodos estándar para el tipo de célula o tejido. Se conocen métodos estándar para trasplante o infusión de varias células en un sujeto. Las composiciones farmacéuticas de esta invención incluyen aquellas adecuadas para administración oral, rectal, tópica, por inhalación (por ejemplo, por medio de un aerosol), bucal (por ejemplo, sub-lingual), vaginal, parenteral (por ejemplo, subcutánea, intramuscular, intradérmica, intraarticular, intrapleural, intraperitoneal, intracerebral, intraarterial o intravenosa), tópica (es decir, piel y superficies de mucosas, incluyendo superficies de vías respiratorias) y transdérmica, aunque la vía más adecuada en cualquier caso dado dependerá, como es bien sabido en la técnica, de factores tales como la especie, edad, género y condición general del sujeto, la naturaleza y severidad de la condición que está siendo tratada, y de la naturaleza de la composición particular (es decir, dosificación, formulación) que está siendo administrada. Composiciones farmacéuticas adecuadas para administración oral pueden presentarse en unidades discretas, tales como cápsulas, obleas, pastillas o tabletas, cada una conteniendo una cantidad predeterminada de la composición de esta invención; como un polvo o gránulos; como una solución o una suspensión en un líquido acuoso o no acuoso; o como una emulsión de aceite en agua o agua en aceite. Puede realizarse suministro oral combinando una composición de la presente invención con un vehículo capaz de soportar la degradación por enzimas digestivas en el intestino de un animal. Ejemplos de dichos vehículos incluyen tabletas o cápsulas de plástico, como es sabido en la técnica. Dichas formulaciones se preparan por medio de cualquier método adecuado de farmacia, que incluye el paso de poner en asociación la composición y un vehículo adecuado (que puede contener uno o más ingredientes accesorios como se indicó anteriormente). En general, la composición farmacéutica de conformidad con las modalidades de la presente invención se prepara mezclando uniformemente e íntimamente la composición con un líquido o vehículo sólido finamente dividido, o ambos, y entonces, si es necesario, conformando la mezcla resultante. Por ejemplo, puede prepararse una tableta comprimiendo o moldeando un polvo o gránulos que contengan la composición, opcionalmente con uno o más ingredientes accesorios. Tabletas comprimidas se preparan comprimiendo, en una máquina adecuada, la composición en una forma de flujo libre, tal como un polvo o gránulos, opcionalmente mezclados con un aglutinante, lubricante, diluyente inerte y/o agentes de dispersión/tensoactivos. Tabletas moldeadas se obtienen moldeando, en una máquina adecuada, el compuesto pulverizado humedecido con un aglutinante líquido inerte. Composiciones farmacéuticas adecuadas para administración bucal (sublingual), incluyen grageas que comprenden la composición de esta invención en una base saborizada, usualmente sacarosa y acacia o tragacanto; y pastillas que comprenden la composición en una base inerte tal como gelatina y glicerina o sacarosa y acacia. Composiciones farmacéuticas de esta invención adecuadas para administración parenteral pueden comprender soluciones acuosas y no acuosas para inyección de la composición de esta invención, cuyas preparaciones sean de preferencia isotónicas con la sangre del receptor deseado. Estas preparaciones pueden contener antioxidantes, reguladores de pH, bacterióstatos y solutos, que hacen que la composición sea isotónica con la sangre del receptor deseado. Suspensiones estériles acuosas y no acuosas, soluciones y emulsiones pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes. Ejemplos de solventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Vehículos acuosos incluyen agua, soluciones alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, que incluyen solución salina y medios regulados en su pH. Vehículos parenterales incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, solución de Ringer lactada o aceites fijados. Vehículos intravenosos incluyen regeneradores de fluidos y nutrientes, regeneradores de electrólitos (tales como aquellos basados en dextrosa de Ringer), y similares. Conservadores y otros aditivos pueden estar también presentes tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes, y similares. Las composiciones pueden presentarse en contenedores de dosis unitaria o de dosis múltiples, por ejemplo, en viales y ampolletas sellados, y pueden almacenarse en una condición deshidratada por congelación (liofiiizada), que requiere sólo la adición del vehículo líquido estéril, por ejemplo, solución salina o agua para inyección inmediatamente antes del uso. Pueden prepararse suspensiones y soluciones para inyección extemporánea a partir de polvos estériles, gránulos y tabletas del tipo descrito previamente. Por ejemplo, puede proveerse una composición estéril, estable e inyectable de esta invención en una forma de dosificación unitaria en un contenedor sellado. La composición puede proveerse en la forma de un liofilizado, el cual puede reconstituirse con un vehículo farmacéuticamente aceptable adecuado para formar una composición líquida adecuada para inyección en un sujeto. La forma de dosificación unitaria puede ser de aproximadamente 1 g a aproximadamente 10 gramos de la composición de esta invención. Cuando la composición es sustancialmente insoluble en agua, puede incluirse una cantidad suficiente de agente emulsionante, que sea fisiológicamente aceptable, en cantidad suficiente para emulsionar la composición en un vehículo acuoso. Uno de dichos agentes emulsionantes útiles, es fosfatidilcolina. Composiciones farmacéuticas adecuadas para administración rectal se presentan de preferencia como supositorios de dosis unitaria. Estos pueden prepararse mezclando la composición con uno o más vehículos sólidos convencionales tales como, por ejemplo, manteca de cacao, y conformando entonces la mezcla resultante. Composiciones farmacéuticas de esta invención adecuadas para aplicación tópica a la piel toman de preferencia la forma de un ungüento, crema, loción, pasta, gel, rocío, aerosol o aceite. Vehículos que pueden usarse incluyen, pero no están limitados a, jalea de petróleo, lanolina, polietilenglicoles, alcoholes, intensificadores transdérmicos, y combinaciones de dos o más de los mismos. En algunas modalidades, por ejemplo, puede realizarse el suministro tópico mezclando una composición farmacéutica de la presente invención con un reactivo lipofílico (por ejemplo, DMSO) que sea capaz de pasar en la piel. Composiciones farmacéuticas adecuadas para administración transdérmica pueden estar en la forma de parches discretos adaptados para mantenerse en contacto íntimo con la epidermis del sujeto por un período prolongado. Composiciones adecuadas para administración transdérmica pueden suministrarse también por iontoforesis (véase, por ejemplo, Pharmaceutical Research 3: 318 (1986)), y típicamente toman la forma de una solución acuosa opcionalmente regulada en su pH de la composición de esta invención. Formulaciones adecuadas pueden comprender regulador de pH de citrato o bis/tris (pH 6) o etanol/agua, y pueden contener de 0.1 a 0.2 M de ingrediente activo. La presente invención provee además un medicamento y la preparación del mismo para su uso en el tratamiento y/o prevención de la enfermedad y los trastornos descritos en la presente, usando los mismos pasos como se describieron en los métodos descritos en la presente. También provisto en la presente, es un medicamento y la preparación del mismo para su uso en la modulación (aumento, tratamiento o prevención de una respuesta inmune perjudicial, inhibición, etc.) de una respuesta inmune de acuerdo con los pasos de los métodos descritos en la presente. Se contempla además que los métodos, composiciones y medicamentos de esta invención puedan usarse para aplicación veterinaria, así como en aplicaciones que impliquen humanos. Además, los ácidos nucleicos y vectores de esta invención pueden administrarse oralmente, intranasalmente, parenteralmente (por ejemplo, intravenosamente), por inyección intramuscular, por inyección intraperitoneal, transdérmicamente, extracorpóreamente, tópicamente, o similares. En los métodos descritos en la presente que incluyen la administración y captación de ADN exógeno en las células de un sujeto (es decir, transduccion o transfeccion de genes), los ácidos nucleicos de la presente invención pueden estar en la forma de ADN desnudo, o los ácidos nucleicos pueden estar en un vector para el suministro de los ácidos nucleicos a las células para expresión de los polipéptidos y/o fragmentos de esta invención. El vector puede ser una preparación disponible comercialmente, o puede construirse en el laboratorio de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica. El suministro del ácido nucleico o vector a las células puede ser por medio de una variedad de mecanismos. Como un ejemplo, el suministro puede ser por medio de un liposoma, usando preparaciones de liposomas disponibles comercialmente, tales como LIPOFECTIN, LIPOFECTAMINE (GIBCO-BRL, Inc., Gaithersburg, MD), SUPERFECT (Qiagen, Inc. Hilden, Alemania) y TRANSFECTAM (Promega Biotec, Inc., Madison, WT), así como otros liposomas desarrollados de acuerdo con procedimientos estándar en la técnica. Además, el ácido nucleico o vector de esta invención puede suministrarse in vivo por electroporación, cuya tecnología está disponible de Genetronics, Inc. (San Diego, CA), así como por medio de una máquina SONOPORATION (ImaRx Pharmaceutical Corp., Tucson, AZ). Como un ejemplo, el suministro del vector puede ser por medio de un sistema viral, tal como un sistema de vector retroviral, el cual puede empacar un genoma retroviral recombinante. El retrovirus recombinante puede usarse entonces para infectar y suministrar de esta manera a las células infectadas ácido nucleico que codifique para el polipéptido y/o fragmento de esta invención. El método exacto para introducir el ácido nucleico exógeno en células de mamífero no se limita, de hecho, al uso de vectores retrovirales. Otras técnicas están ampliamente disponibles para este procedimiento, incluyendo el uso de vectores adenovirales, vectores alfavirales, vectores virales adenoasociados (AAV), vectores lentivirales, vectores retrovirales pseudotipificados y vectores virales de la vaccinia, así como cualquier otro vector viral conocido ahora o desarrollado en el futuro. Pueden usarse también técnicas de transducción física, tales como suministro de liposomas y mecanismos mediados por receptores y otros mecanismos de endocitosis. Esta invención puede usarse en conjunto con cualquiera de estos y otros métodos de transferencia de genes usados comúnmente. Como un ejemplo, el ácido nucleico de esta invención es suministrado a las células de un sujeto en un vector de virus de la vaccinia, y la dosificación para la administración del virus de la vaccinia a humanos puede variar típicamente de aproximadamente 104 a 109 pfu por inyección, pero en algunas modalidades puede ser tan alta como 1012, 1015 y/o 1020 pfu por inyección. Como otro ejemplo, si el ácido nucleico de esta invención es suministrado a las células de un sujeto en un vector de adenovirus, la dosificación para la administración de adenovirus a humanos puede variar de aproximadamente 104 a 109 unidades formadoras de placa (pfu) por inyección, pero puede ser tan alta como 1012, 1015 y/o 1020 pfu por inyección. En algunas modalidades, un sujeto recibirá una inyección individual de un vector viral que comprenda un ácido nucleico de esta invención. Si son necesarias inyecciones adicionales, pueden repetirse a intervalos cada día/semanalmente/mensualmente por un período indefinido, y/o hasta que se haya establecido la eficacia del tratamiento. Como se expone en la presente, la eficacia del tratamiento puede determinarse evaluando los síntomas y los parámetros clínicos descritos en la presente, y/o detectando una respuesta inmunológica deseada. La cantidad exacta del ácido nucleico o vector requerido variará de sujeto a sujeto, dependiendo de la especie, edad, peso y condición general del sujeto, el ácido nucleico o vector particular usado, su modo de administración, y similares. De esta manera, no es posible especificar una cantidad exacta para cada ácido nucleico o vector. Sin embargo, el experto en la técnica puede determinar una cantidad adecuada usando sólo experimentación de rutina dadas las enseñanzas de la presente. La presente invención provee además un método para diagnosticar una infección por poxvirus en un sujeto, que comprende: a) poner en contacto una muestra del sujeto con un anticuerpo que une específicamente la proteína A35R bajo condiciones por las cuales puede formarse un complejo de antígeno/anticuerpo; y b) detectar la formación del complejo de antígeno-anticuerpo, diagnosticando de esta manera infección por poxvirus en un sujeto. Provisto también en la presente es un método para diagnosticar infección por poxvirus en un sujeto, que comprende: a) poner en contacto una muestra del sujeto con una proteína A35R o fragmento antigénico de la misma bajo condiciones por las cuales pueda formarse un complejo de antígeno/anticuerpo; y b) detectar la formación del complejo de antígeno/anticuerpo, diagnosticando de esta manera la infección por poxvirus en un sujeto. En otras modalidades, se provee un método para detectar poxvirus en una muestra, que comprende: a) poner en contacto la muestra con un anticuerpo que une específicamente la proteína A35R bajo condiciones por las cuales pueda formarse un complejo de antígeno/anticuerpo; y b) detectar la formación del complejo de antígeno/anticuerpo, detectando de esta manera poxvirus en la muestra.

Provisto además es un método para detectar un anticuerpo para poxvirus en una muestra, que comprende: a) poner en contacto la muestra con una proteína A35R o fragmento antigénico de la misma bajo condiciones por las cuales pueda formarse un complejo de antígeno/anticuerpo; y b) detectar la formación del complejo de antígeno/anticuerpo, detectando de esta manera un anticuerpo para poxvirus en la muestra. La presente invención provee un método para detectar ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica para proteína A35R en una muestra, que comprende: a) poner en contacto la muestra con un oligonucleótido que comprende una secuencia de nucleotidos que es complementaria a la secuencia de nucleotidos que codifica para proteína A35R, bajo condiciones por las cuales pueda ocurrir hibridación del ácido nucleico; y b) detectar la hibridación del ácido nucleico, detectando de esta manera ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleotidos que codifica para proteína A35R en la muestra. Provisto además es un método para detectar ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica para proteína A35R en una muestra, que comprende: a) poner en contacto la muestra con un par de oligonucleotidos iniciadores que son complementarios a la secuencia de nucleotidos que codifica para proteína A35R, bajo condiciones por las cuales pueda ocurrir amplificación del ácido nucleico; y b) detectar amplificación del ácido nucleico, detectando de esta manera ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleotidos que codifica para proteína A35R en la muestra.

Una muestra de esta invención puede ser cualquier muestra en la cual puedan estar presentes proteínas y/o ácidos nucleicos de poxvirus. Por ejemplo, la muestra puede ser un fluido corporal, células o tejidos incluyendo, pero no limitados a, sangre, suero, plasma, saliva, esputo, lavado broncoalveolar, orina, semen, fluido de articulaciones, células y fluido cerebroespinal, fluidos y/o tejido de todos los órganos a los cuales puedan diseminarse antígenos de poxvirus, incluyendo pulmón, hígado, corazón, cerebro, riñon, bazo, músculo, etc. Una muestra de esta invención puede incluir también una sustancia no obtenida del cuerpo de un sujeto de esta invención. Ejemplos de dicha muestra incluyen, pero no están limitados a, una muestra de agua, una muestra de alimento o producto alimenticio, una muestra de planta o materia vegetal, una muestra de suelo o polvo, una muestra de efluente, etc. En otras modalidades, las composiciones de esta invención pueden usarse también para tratar o prevenir cáncer en un sujeto. De esta manera, en modalidades adicionales, la presente invención provee un método para tratar cáncer en un sujeto, que comprende administrar al sujeto un poxvirus diseñado para necesitar de actividad de proteína A35R. Un poxvirus usado en estos métodos, sería un poxvirus que sea específico para células cancerosas. En otras modalidades, la presente invención provee un método para tratar cáncer en un sujeto, que comprende administrar al sujeto un poxvirus diseñado para necesitar actividad de proteína A35R, y en donde el poxvirus puede comprender además a) ácido nucleico que codifica para una molécula co-estimuladora (por ejemplo, B7.1 , ICAM-1 , LFA-3, etc. como es sabido en la técnica); b) ácido nucleico que codifica para un antígeno tumoral; y c) ácido nucleico que codifica para una molécula o proteína inmunomoduladora. Estos ácidos nucleicos pueden estar presentes por separado y/o en cualquier combinación en el genoma del poxvirus. La presente invención provee además composiciones. De esta manera, en una modalidad, provista en la presente es una composición que comprende proteína A35R y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otras modalidades, se provee un poxvirus diseñado para necesitar actividad de proteína A35R. Provista además es una composición que comprende un poxvirus diseñado para necesitar actividad de proteína A35R y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Provisto también en la presente es un ácido nucleico aislado que codifica para una proteína A35R o fragmento activo de la misma de un virus de la vaccinia u otro poxvirus. Provisto además en la presente, es una composición que comprende un ácido nucleico aislado que codifica para una proteína A35R o fragmento activo de la misma de un virus de la vaccinia y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otras modalidades, la presente invención provee una composición que comprende un anticuerpo que une específicamente una proteína A35R o fragmento activo de la misma y un vehículo farmacéuticamente aceptable, así como un anticuerpo que une específicamente una proteína A35R o fragmento activo de la misma.

Como se indica en la presente, la presente invención provee fragmentos biológicamente activos de las proteínas de esta invención, así como anticuerpos que unen específicamente las proteínas y/o fragmentos de las proteínas de esta invención. Provistos además son ácidos nucleicos aislados que comprenden, que consisten esencialmente de, y/o que consisten de, secuencias de nucleotidos que codifican para las proteínas y fragmentos de esta invención. En particular, la presente invención provee un ácido nucleico aislado que comprende, que consiste esencialmente de, y/o que consiste de, la secuencia de nucleotidos de SEQ ID NO: 1 (secuencia de la cepa Copenhague del virus de la vaccinia: atgg cgccgcgm ttattartcc^^ -teatg acntataggaccamcattatíiggtaacataaaaa aaatgctectitagctaiaagggtaaaatagttcctc^^ cagatcaaaaaataccatcatcatagcatgcgactatgatat^ tctattgatgttmaacgctacaatcatagaagcgtó^ tctgaaaatgaaattgtcgíUaattcttcattctgcatalra^ ttttatca).

Provista además en la presente, es la secuencia de nucleotidos de la proteína A35R de todos los poxvirus identificados en el cuadro 1 por nombre del virus, nombre del gen para el ortólogo de A35R, el número de acceso del GenBank, el número de aminoácidos y la ubicación de los sitios de inicio y de detención del marco de lectura abierto (ORF) para A35R. Cada una de estas secuencias de nucleotidos se incorpora en su totalidad en la presente como referencia.

Provisto además es un ácido nucleico que comprende, que consiste esencialmente de, y/o que consiste de, una secuencia de nucleótidos que codifica para una secuencia de aminoácidos que comprende, que consiste esencialmente de, y/o que consiste de, la secuencia de aminoácidos o un fragmento biológicamente activo de cualquiera de las siguientes secuencias de aminoácidos: A35R de la cepa Copenhague del virus de la vaccinia (SEQ ID NO: 2): MDAA TTPMGVLTITD^ CYI YKGIHVPQDS DIAR]^^ FPSIDVI^ATIIEAYÍ^ CNSNRLS Gen/proteína A39R de la cepa García del virus de la viruela: MDTTTATTPMGMLTITDTLYDDLDISIMDH YSDMQ CYFS A38R de la cepa India del virus de la viruela: MDTT rrPMGMLTITDT^^ YSDMQKCYFS Provisto además en la presente, es un ácido nucleico que es el complemento de cada uno y cualquiera de los ácidos nucleicos de esta invención. La presente invención provee también una proteína A35R aislada, que puede ser una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Provista también en la presente, es la secuencia de aminoácidos para la proteína A35R de los poxvirus identificados en el cuadro 1 , también disponible en la base de datos del GenBank. Estas secuencias de aminoácidos se incorporan en su totalidad en la presente como referencia. Ejemplos específicos de secuencias de nucleótidos y secuencias de aminoácidos de poxvirus de esta invención se proveen en las figuras 1 y 2, respectivamente. Provistos también en la presente, son sondas e iniciadores para la detección de los ácidos nucleicos de esta invención, y dichos iniciadores y/o sondas pueden usarse solos y/o en cualquier combinación. Sondas e iniciadores de esta invención pueden prepararse de acuerdo con métodos conocidos en la técnica para identificar pares de iniciadores y sondas, usando procedimientos conocidos en la técnica y/o software disponible comercialmente para identificar regiones que sean óptimas para protocolos de iniciación y sondeo. Como sería sabido por los expertos en la técnica, cualquier parte de la secuencia de nucleótidos de A35R de esta invención (o su complemento) podrá usarse como un iniciador y/o sonda. Un ejemplo no limitativo de un par de iniciadores es: 5'atggacgccgcgtttgttatta 3' y 5'tgataaaaaattactatt 3', que podría usarse para amplificar una secuencia de A35R por PCR. Un ejemplo de una sonda para detectar ácido nucleico de A35R podría ser 5'tgataaaaaattactattgc 3'. En ciertas modalidades, los fragmentos y/o polipéptidos de esta invención pueden ser fusionados con una proteína o péptido "portador" para producir una proteína de fusión. Dicha fusión puede llevarse a cabo, por ejemplo, enlazando un ácido nucleico de esta invención en el marco de lectura con un ácido nucleico que codifique para una proteína portadora o fragmento de la misma de esta invención, y que exprese la secuencia de nucleótidos enlazada para producir la proteína de fusión. Por ejemplo, la proteína o el péptido portador puede ser fusionado con un polipéptido y/o fragmento de esta invención para incrementar la estabilidad del mismo (por ejemplo, disminuir la velocidad de cambio) en la célula y/o el sujeto. Ejemplos de proteínas portadoras incluyen, pero no están limitados a, glutatión-S-transferasa o proteína de unión a maltosa. La proteína o el péptido portador puede ser en forma alternativa una proteína reportera. Por ejemplo, la proteína de fusión puede comprender un polipéptido y/o fragmento de esta invención y una proteína o péptido reportero (por ejemplo, proteína fluorescente verde (GFP), ß-glucuronidasa, ß-galactosidasa, luciferasa, y similares) para fácil detección de células transformadas y expresión de transgenes. Cualquier proteína portadora y/o ácido nucleico adecuado que codifique para la proteína portadora, como es bien sabido en la técnica, puede usarse para producir una proteína de fusión de esta invención. Se conoce en la técnica una variedad de protocolos para detectar la presencia y/o medir la cantidad de polipéptidos, fragmentos y/o péptidos de esta invención en una muestra, usando anticuerpos policlonales y/o monoclonales específicos para el polipéptido, fragmento y/o péptido. Ejemplos de dichos protocolos incluyen, pero no están limitados a, inmunoensayos de enzimas (EIA), pruebas de aglutinación, immunoblots (Western blot; dot/slot blot, etc.), radioinmunoensayos (RIA), pruebas de inmunodifusión, pruebas de quimioluminiscencia, identificaciones de colecciones de anticuerpos, pruebas de expresión, pruebas de inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA), inmunoprecipitación, Western blotting, pruebas de unión competitiva, inmunofluorescencia, tinción inmunohistoquímica, pruebas de precipitación/floculación, y distribución de células activada por fluorescencia (FACS). Estas y otras pruebas se describen, entre otros sitios, en Hampton et al. {Serological Methods, a Laboratory Manual, APS Press, St Paul, Minn (1990), y en Maddox et al. (J. Exp. Meó. 158: 1211 -1216 (1993)). Además, muchas pruebas para la identificación, detección y/o amplificación de secuencias de ácido nucleico son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, pueden usarse varios protocolos en los métodos de esta invención para amplificar ácidos nucleicos. Como se usa en la presente, el término "procedimiento de amplificación dirigido por oligonucleotidos" se refiere a procedimientos dependientes del molde que resultan en un incremento en la concentración de una molécula de ácido nucleico específica respecto a su concentración inicial, o en un incremento en la concentración de una señal detectable, tal como amplificación. Como se usa en la presente, se pretende que el término "procedimiento de mutagénesis dirigida por oligonucleotidos" se refiera a un procedimiento que implique la extensión de una molécula de iniciador dependiente del molde. El término "procedimiento dependiente del molde" se refiere a la síntesis de ácido nucleico de una molécula de ARN o una molécula de ADN, en donde la secuencia de la cadena de ácido nucleico recién sintetizada es dictada por las reglas bien conocidas de apareamiento de bases complementarias. Típicamente, las metodologías mediadas por vectores implican la introducción del fragmento de ácido nucleico en un vector de ADN o ARN, la amplificación clonal del vector, y la recuperación del fragmento de ácido nucleico amplificado. Ejemplos de dichas metodologías se proveen en la patente de E.U.A. No. 4,237,224 (incorporada en su totalidad en la presente como referencia). Acidos nucleicos, usados como un molde en métodos de amplificación, pueden aislarse de células de acuerdo con metodologías estándar (véase, Sambrook et al., 1989). El ácido nucleico puede ser ADN genómico o ARN de células fraccionadas o enteras. En donde se use ARN, puede desearse convertir el ARN a un ADN complementario. En una modalidad, el ARN puede ser ARN de células enteras, y se usa directamente como el molde para la amplificación. Pares de iniciadores que hibridan selectivamente con ácidos nucleicos que corresponden al gen o secuencia codificante de A35R, se ponen en contacto con el ácido nucleico bajo condiciones que permitan la hibridación selectiva. Se pretende que el término "iniciador", como se define en la presente, abarque cualquier ácido nucleico que sea capaz de iniciar la síntesis de un ácido nucleico naciente en un procedimiento dependiente del molde. Típicamente, los iniciadores son oligonucleótidos de 10 a 20 bases de longitud, pero pueden usarse secuencias más cortas (por ejemplo, de 6, 7, 8 ó 9 bases) o más largas (por ejemplo, de 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45 o 50 bases). Los iniciadores pueden estar en forma de doble cadena o de cadena sencilla, aunque se usa comúnmente la forma de cadena sencilla. Una vez hibridado, el complejo de hibridación de ácido nucleico: iniciador se pone en contacto con una o más enzimas que facilitan la síntesis de ácido nucleico dependiente del molde. Rondas múltiples de amplificación, referidas también como "ciclos", se llevan a cabo hasta que se produzca una cantidad suficiente de producto de amplificación. Después, el producto de amplificación es detectado. En algunas modalidades, la detección puede realizarse por medios visuales. En forma alternativa, la detección puede implicar identificación indirecta del producto por medio de quimioluminiscencia, escintigrafía radiactiva de marca radiactiva incorporada o marca de fluorescencia o quimioluminiscencia, o incluso por medio de un sistema que use señales de impulso eléctrico o térmico (por ejemplo, la tecnología Affymax). Muchos procedimientos dependientes del molde están disponibles para amplificar las secuencias presentes en una muestra de molde determinada. Uno de los métodos de amplificación mejor conocidos es la reacción en cadena de polimerasa (referida como PCR), que se describe en detalle en las patentes de E.U.A. Nos. 4,683,195, 4,683,202 y 4,800,159, cada una de las cuales se incorpora en su totalidad en la presente como referencia. En resumen, en la PCR, se preparan dos secuencias de iniciadores que sean complementarias a regiones en cadenas complementarias opuestas de la secuencia objetivo. Se añade un exceso de trifosfatos de desoxinucleósido a una mezcla de reacción junto con una ADN polimerasa, por ejemplo, una Taq polimerasa (ADN polimerasa de Thermus aquaticus). Si la secuencia objetivo particular está presente en una muestra, los iniciadores se unirán a la secuencia objetivo, y la polimerasa hará que los iniciadores sean extendidos a lo largo de la secuencia añadiendo nucleótidos. Mediante el aumento y la disminución de la temperatura de la mezcla de reacción, los iniciadores extendidos se disociarán de la secuencia objetivo para formar productos de reacción, el exceso de iniciadores se unirá a la secuencia objetivo y a los productos de reacción, y el procedimiento se repite. Puede realizarse un procedimiento de amplificación por PCR-transcriptasa inversa, para cuantificar la cantidad de ARN mensajero amplificado. Métodos para transcribir en forma inversa ARN en ADNc, son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook et al. 1989). Métodos alternativos para transcripción inversa usan ADN polimerasas termoestables dependientes de ARN. Estos métodos se describen, por ejemplo, en la publicación del PCT No. WO 90/07641 , presentada en diciembre 21 de 1990, incorporada en su totalidad en la presente como referencia. Metodologías de reacción en cadena de polimerasa son bien conocidas en la técnica. Otro método para la amplificación de ácidos nucleicos es la reacción en cadena de ligasa ("LCR"), descrita en la solicitud de patente europea No. 320308, incorporada en su totalidad en la presente como referencia. En la LCR, se preparan dos pares de sondas complementarias y en presencia de la secuencia objetivo, cada par se unirá a cadenas complementarias opuestas del objetivo, de modo que colinden. En presencia de una ligasa, los dos pares de sondas se unirán para formar una sola unidad. Por ciclización de temperatura, como en la PCR, las unidades ligadas unidas se disocian del objetivo, y sirven entonces como "secuencias objetivo" para la ligación del exceso de pares de sondas. La patente de E.U.A. 4,883,750 (incorporada en su totalidad en la presente como referencia) describe un método similar a la LCR para la unión de pares de sondas a una secuencia objetivo. Puede usarse también Qbeta replicasa (QpR), descrita en la solicitud del PCT No. PCT/US87/00880 (incorporada en la presente como referencia), como un método de amplificación en la presente invención. En este método, una secuencia replicativa de ARN que tiene una región complementaria a la de un objetivo, se añade a una muestra en presencia de una ARN polimerasa. La polimerasa copiará la secuencia replicativa que puede detectarse entonces. Un método de amplificación isotérmica, en el cual endonucleasas de restricción y ligasas se usan para lograr la amplificación de moléculas objetivo que contienen 5'-[alfa-tio]trifosfatos de nucleótido en una cadena de un sitio de restricción, puede ser también útil en la amplificación de ácidos nucleicos en la presente invención. La amplificación por desplazamiento de cadena (SDA), descrita en las patentes de E.U.A. Nos. 5,455,166, 5,648,21 1 , 5,712,124 y 5,744,311 , cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia, es otro método para llevar a cabo amplificación isotérmica de ácidos nucleicos, que implica rondas múltiples de desplazamiento de cadena y síntesis, es decir, traducción de muesca. Un método similar, denominado reacción en cadena de reparación (RCR), implica unir varias sondas por toda una región elegida como objetivo para amplificación, seguida de una reacción de reparación en la cual están presentes sólo dos de las cuatro bases. Las otras dos bases pueden añadirse como derivados biotinilados para fácil detección. Un procedimiento similar se usa en la SDA. Secuencias específicas objetivo pueden detectarse entonces usando una reacción de sonda cíclica (CPR). En la CPR, una sonda que tiene secuencias 3' y 5' de ADN no específico y una secuencia intermedia de ARN específica, es hibridada con ADN que está presente en una muestra. Después de la hibridación, la reacción se trata con ribonucleasa H, y los productos de la sonda se identifican como productos distintivos que son liberados después de la digestión. El molde original es unido con otra sonda de ciclización, y la reacción se repite. Otro método de amplificación, como se describe en la solicitud de patente internacional No. PCT/US89/01025, la cual se incorpora en su totalidad en la presente como referencia, puede usarse de conformidad con la presente invención. En una modalidad, se usan iniciadores "modificados" en una síntesis dependiente de enzimas y del molde, como la PCR. Los iniciadores pueden modificarse por marcación con una porción de captura (por ejemplo, biotina) y/o porción detectable (por ejemplo, enzima). En otra modalidad, un exceso de sondas marcadas se añade a una muestra. En presencia de la secuencia objetivo, la sonda se une y es digerida catalíticamente. Después de la digestión, la secuencia objetivo es liberada intacta, disponible para ser unida por el exceso de sonda. La digestión de la sonda marcada señala la presencia de la secuencia objetivo. Otros procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos incluyen sistemas de amplificación basados en transcripción (TAS), que incluyen amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico (NASBA) y 3SR (publicación del PCT No. WO 88/10315, incorporada en la presente como referencia). En la NASBA, los ácidos nucleicos pueden prepararse para amplificación por extracción estándar con fenol/cloroformo, desnaturalización de una muestra clínica usando calor, tratamiento con regulador de pH de lisis y columnas minispin para el aislamiento de ADN y ARN, o extracción de ARN con cloruro de guanidinio. Estas técnicas de amplificación implican unir un iniciador que tiene secuencias objetivo específicas. Después de polimerización, los híbridos de ADN/ARN son digeridos con ribonucleasa H, mientras que moléculas de ADN de doble cadena son de nuevo desnaturalizadas con calor. En cualquier caso, el ADN de cadena sencilla es convertido completamente a ADN de doble cadena por la adición del segundo iniciador específico del objetivo, seguida de polimerización. Las moléculas de ADN de doble cadena son entonces transcritas múltiples veces por una ARN polimerasa tal como T7, T3 o SP6. En una reacción cíclica isotérmica, las moléculas de ARN son transcritas en forma inversa en ADN de cadena sencilla, el cual es convertido entonces a ADN de doble cadena, y transcrito entonces una vez de nuevo con una ARN polimerasa tal como T7, T3 o SP6. Los productos resultantes, sean truncados o completos, indican secuencias específicas objetivo. La solicitud de patente europea No. 329822 (incorporada en su totalidad en la presente como referencia) describe un procedimiento de amplificación de ácidos nucleicos que implica sintetizar cíclicamente ARN de cadena sencilla (ARNss), ADNss y ADN de doble cadena (ADNds), que pueden usarse de conformidad con la presente invención. El ARNss es un molde para un primer oligonucleótido iniciador, el cual es extendido por la transcriptasa inversa (ADN polimerasa dependiente de ARN). El ARN es removido entonces del dúplex de ADN: ARN resultante por la acción de ribonucleasa H (ribonucleasa H, una ribonucleasa específica para ARN en dúplex con ADN o ARN). El ADNss resultante es un molde para un segundo iniciador, el cual incluye también las secuencias de un promotor de ARN polimerasa (ejemplificado por la ARN polimerasa T7) 5' hacia su homología con el molde. Este iniciador es extendido entonces por ADN polimerasa (ejemplificada por el gran fragmento Klenow de la ADN polimerasa I de E. coli), resultando en una molécula de ADN de doble cadena (ADNds), que tiene una secuencia idéntica a la del ARN original entre los iniciadores y que tiene además, en un extremo, una secuencia de promotor. Esta secuencia de promotor puede ser usada por la ARN polimerasa adecuada para obtener muchas copias de ARN del ADN. Estas copias pueden volver a entrar entonces en el ciclo, llevando a amplificación muy rápida. Con una selección adecuada de enzimas, esta amplificación puede hacerse isotérmicamente sin la adición de enzimas en cada ciclo. Debido a la naturaleza cíclica de este proceso, la secuencia de partida puede seleccionarse para que esté en la forma de ADN o ARN. La solicitud del PCT WO 98/06700 (incorporada en su totalidad en la presente como referencia) describe un esquema de amplificación de secuencias de ácido nucleico basado en la hibridación de una secuencia de promotor/iniciador con un ADN de cadena sencilla (ADNss) objetivo, seguida de transcripción de muchas copias de ARN de la secuencia. Este esquema no es cíclico, es decir, no se producen nuevos moldes de los transcritos de ARN resultantes. Otros métodos de amplificación incluyen "RACE" y "PCR unilateral" (véase Frohman 1990, cita incorporada en la presente como referencia). Métodos basados en la ligación de dos (o más) oligonucleótidos en presencia de ácido nucleico que tenga la secuencia del "di-oligonucleótido" resultante, amplificando de esta manera el di-oligonucleótido, pueden usarse también en el paso de amplificación de la presente invención. Después de cualquier amplificación, es deseable separar el producto de amplificación del molde y el exceso de iniciador con el propósito de determinar si ha ocurrido amplificación específica. En una modalidad, pueden separarse productos de amplificación por electroforesis en gel de agarosa, agarosa-acrilamida o poliacrilamida, usando métodos estándar (véase, por ejemplo, Sambrook er a/. 1989). En forma alternativa, pueden usarse técnicas cromatográficas para efectuar la separación. Existen muchos tipos de cromatografía que pueden usarse en la presente invención tales como, por ejemplo, cromatografía de adsorción, partición, intercambio iónico y tamiz molecular, así como muchas técnicas especializadas para usarlas, incluyendo cromatografía en columna, en papel, en capa delgada y de gases. Deben visualizarse productos de amplificación que confirmen la amplificación de las secuencias objetivo. Un método de visualización típico implica teñir un gel con bromuro de etidio y visualización bajo luz UV. En forma alternativa, si los productos de amplificación son marcados integralmente con nucleótidos radiométricamente o fluorométricamente marcados, los productos de amplificación pueden ser expuestos entonces a película de rayos X, o pueden visualizarse bajo los espectros de estimulación adecuados, después de la separación. En algunas modalidades, la visualización se logra indirectamente. Después de la separación de los productos de amplificación, una sonda de ácido nucleico marcada es puesta en contacto con la secuencia objetivo amplificada. La sonda es conjugada de preferencia con un cromóforo, pero puede ser radiomarcada. En otra modalidad, la sonda es conjugada con un miembro de unión, tal como un anticuerpo o biotina, y el otro miembro del par de unión lleva una porción detectable. En otras modalidades, la detección puede ser por Southern blotting e hibridación con una sonda marcada. Las técnicas implicadas en Southern blotting son bien conocidas por los expertos en la técnica, y pueden encontrarse en muchos libros estándar sobre protocolos moleculares (véase, por ejemplo, Sambrook et al. 1989). En resumen, los productos de amplificación se separan por electroforesis en gel. El gel es entonces puesto en contacto con una membrana, tal como nitrocelulosa, permitiendo la transferencia del ácido nucleico y unión no covalente. Después, la membrana es incubada con una sonda conjugada con cromóforo que es capaz de hibridar con un producto de amplificación objetivo. La detección es por exposición de la membrana a película de rayos X o dispositivos de detección emisores de iones. Un ejemplo de lo anterior se describe en la patente de E.U.A. 5,279,721 , incorporada en la presente como referencia, que describe un aparato y método para la electroforesis automatizada y transferencia de ácidos nucleicos. El aparato permite la electroforesis y blotting (transferencia) sin manipulación externa del gel. Además, se conoce en la técnica una amplia variedad de técnicas de marcación y conjugación que pueden usarse en varias pruebas de detección y amplificación de ácidos nucleicos. Métodos para producir sondas de hibridación marcadas y/o PCR u otros iniciadores de ligación para detectar y/o amplificar secuencias de ácido nucleico pueden incluir, por ejemplo, marcación de oligonucleótidos, traducción de muesca y marcación de extremo, así como otros métodos bien conocidos. En forma alternativa, secuencias de ácido nucleico que codifican para los polipéptidos de esta invención, y/o cualquier fragmento funcional de los mismos, pueden ser clonadas en un plásmido o vector para detección y amplificación. Dichos plásmidos y vectores son bien conocidos en la técnica, y están disponibles comercialmente. Se contempla también que los métodos de esta invención puedan llevarse a cabo usando una variedad de equipos disponibles comercialmente (por ejemplo, Pharmacia y Upjohn; Promega; U.S. Biochemical Corp.). Marcas o moléculas de reportero adecuadas, que pueden usarse para facilidad de detección incluyen, por ejemplo, radionúclidos, enzimas, agentes de fluorescencia, agentes de quimioluminiscencia y agentes cromógenos, así como substratos, cofactores, inhibidores, partículas magnéticas, y similares, como son bien conocidos en la técnica. La presente invención incluye además polipéptidos, péptidos, proteínas, fragmentos, dominios y/o moléculas de ácido nucleico aislados, que son sustancialmente equivalentes a los descritos para esta invención. Como se usa en la presente, el término "sustancialmente equivalente" puede referirse a secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos, por ejemplo, una secuencia muíante, que varía de una secuencia de referencia por una o más sustituciones, deleciones o adiciones, cuyo efecto neto no resulta en una disimilitud funcional adversa indeseable entre las secuencias de referencia y sujeto. En algunas modalidades, esta invención puede incluir secuencias sustancialmente equivalentes que tienen una disimilitud funcional adversa.

Para los propósitos de la presente invención, secuencias que tengan actividad biológica equivalente y características de expresión equivalentes, se consideran como sustancialmente equivalentes. La invención provee además homólogos, así como métodos para obtener homólogos, de los péptidos y/o fragmentos de esta invención de otros poxvirus. Como se usa en la presente, una secuencia de aminoácidos o proteína se define como un homólogo de un polipéptido o fragmento de la presente invención, si comparte homología significativa con uno de los polipéptidos y/o fragmentos de la presente invención. Homología significativa significa por lo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 65%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% y/o 100% de homología con otra secuencia de aminoácidos. Específicamente, mediante el uso de los ácidos nucleicos descritos en la presente como una sonda o como iniciadores, y técnicas tales como amplificación por PCR e hibridación de placas/colonias, el experto en la técnica puede identificar homólogos de los polipéptidos y/o fragmentos de esta invención en cualquier poxvirus trópico de mamíferos. Se contempla además que la presente invención provee equipos para la detección de los polipéptidos y/o fragmentos y/o anticuerpos de esta invención en una muestra. En una modalidad, el equipo puede comprender uno o más anticuerpos de esta invención, junto con reguladores de pH, soluciones de lavado y/u otros reactivos adecuados, para la detección de la formación de complejos de antígeno/anticuerpo. En una modalidad alternativa, un equipo de esta invención puede comprender un polipéptido, un péptido antigénico del polipéptido de esta invención, un fragmento de esta invención y/o un péptido antigénico o un fragmento de esta invención, junto con reguladores de pH, soluciones de lavado y/u otros reactivos adecuados, para la detección de la formación de complejos de antígeno/anticuerpo. La presente invención provee además un equipo para la detección de ácido nucleico que codifique para los polipéptidos y/o fragmentos de esta invención. Por ejemplo, en una modalidad, el equipo puede comprender uno o más ácidos nucleicos de esta invención, junto con reguladores de pH soluciones de lavado y/u otros reactivos adecuados, para la detección de la formación de complejos de hibridación y/o la formación de productos de amplificación. Sería bien entendido por los expertos en la técnica, que los equipos de esta invención pueden comprender uno o más contenedores y/o receptáculos para contener los reactivos (por ejemplo, anticuerpos, antígenos, ácidos nucleicos) del equipo, junto con reguladores de pH y/o soluciones de lavado e instrucciones adecuados para el uso del equipo, como sería bien sabido en la técnica. Dichos equipos pueden comprender además adyuvantes y/u otros agentes inmunoestimuladores o inmunomoduladores, como es bien sabido en la técnica. En otras modalidades, los ácidos nucleicos que codifican para los polipéptidos y/o fragmentos de esta invención pueden ser parte de una construcción de ácido nucleico recombinante que comprenda cualquier combinación de sitios de restricción y/o elementos funcionales, como es bien sabido en la técnica, que facilite la clonación molecular y otras manipulaciones del ADN recombinante. De esta manera, la presente invención provee además una construcción de ácido nucleico recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica para un polipéptido y/o fragmento biológicamente activo de esta invención. La presente invención provee además un vector que comprende un ácido nucleico que codifica para un polipéptido y/o fragmento de esta invención. El vector puede ser un vector de expresión que contenga todos los componentes genéticos requeridos para la expresión del ácido nucleico en células en las cuales el vector ha sido introducido, como es bien sabido en la técnica. El vector de expresión puede ser un vector de expresión comercial, o puede construirse en el laboratorio de acuerdo con protocolos estándar de biología molecular. El vector de expresión puede comprender ácido nucleico viral que incluye, pero no está limitado a, poxvirus, virus de la vaccinia, adenovirus, retrovirus y/o ácido nucleico de virus adenoasociados. El ácido nucleico o vector de esta invención puede estar también en un liposoma o un vehículo de suministro, el cual puede ser captado por una célula por medio de endocitosis mediada por el receptor u otro tipo de endocitosis. El ácido nucleico de esta invención puede estar en una célula, la cual puede ser una célula que exprese el ácido nucleico, por el cual un polipéptido y/o fragmento biológicamente activo de esta invención se produce en la célula. Además, el vector de esta invención puede estar en una célula, la cual puede ser una célula que exprese el ácido nucleico del vector, por el cual un polipéptido y/o fragmento biológicamente activo de esta invención se produce en la célula. Se contempla también que los ácidos nucleicos y/o vectores de esta invención puedan estar presentes en un animal hospedero (por ejemplo, un animal transgénico) que exprese los ácidos nucleicos de esta invención, y produzca los polipéptidos y/o fragmentos de esta invención. El ácido nucleico que codifica para el polipéptido y/o fragmento de esta invención, puede ser cualquier ácido nucleico que codifique funcionalmente para los polipéptidos y/o fragmentos de esta invención. Para codificar funcionalmente los polipéptidos y/o fragmentos (es decir, permitir que los ácidos nucleicos sean expresados), el ácido nucleico de esta invención puede incluir, por ejemplo, secuencias de control de la expresión, tales como un origen de replicación, un promotor, un intensificador y sitios de procesamiento de información necesarios, tales como sitios de unión del ribosoma, sitios empalme de ARN, sitios de poliadenilación y secuencias de terminador de transcripción. Ejemplos no limitativos de secuencias de control de la expresión que pueden estar presentes en un ácido nucleico de esta invención, incluyen promotores derivados de genes de metalotioneína, genes de actina, genes de inmunoglobulina, CMV, SV40, adenovirus, virus del papiloma bovino, etc. Un ácido nucleico que codifique para un polipéptido y/o fragmento seleccionado, puede determinarse fácilmente con base en el código genético para la secuencia de aminoácidos del polipéptido y/o fragmento seleccionado, y muchos ácidos nucleicos codificarán para cualquier polipéptido y/o fragmento seleccionado. Se contemplan también modificaciones en la secuencia de ácido nucleico que codifica para el polipéptido y/o fragmento. Modificaciones que pueden ser útiles, son modificaciones a las secuencias que controlan la expresión del polipéptido y/o fragmento que hacen que la producción del polipéptido y/o fragmento sea inducible o reprimible, controlada por el inductor o represor adecuado. Dichos métodos son estándar en la técnica. El ácido nucleico de esta invención puede generarse por medios estándar en la técnica, tal como por técnicas de ácido nucleico recombinante y/o por síntesis de ácidos nucleicos sintéticos o síntesis enzimática in vitro. Los ácidos nucleicos y/o vectores de esta invención pueden ser transferidos en una célula hospedera (por ejemplo, una célula procariótica o eucariótica) por métodos bien conocidos, los cuales varían dependiendo del tipo de célula hospedera. Por ejemplo, se usa comúnmente transfección con cloruro de calcio para células procarióticas, mientras que puede usarse tratamiento con fosfato de calcio, transducción y/o electroporación para otras células hospederas. La presente invención provee también varias pruebas de identificación que permiten identificar sustancias que aumentan o inhiben la actividad de A35R, ya sea al nivel de proteína o de ácido nucleico. En una modalidad, provisto en la presente es un método para identificar una sustancia que tenga la capacidad para inhibir o aumentar la actividad de unión de un polipéptido y/o fragmento biológicamente activo de esta invención, que comprende poner en contacto la sustancia con la proteína A35R o un fragmento biológicamente activo de la misma, bajo condiciones por las cuales pueda ocurrir unión, y detectar una disminución o incremento en la cantidad de unión en presencia de la sustancia, en comparación con una cantidad de unión control en ausencia de la sustancia, identificando de esta manera una sustancia que tenga la capacidad de inhibir o aumentar la actividad de unión de la proteína A35R. La inhibición o el aumento de la actividad de unión, puede detectarse por cualquiera de una variedad de métodos reconocidos en la técnica para evaluar la actividad de unión. Como un ejemplo, la sustancia que se va a poner a prueba y el polipéptido A35R y/o fragmento biológicamente activo de la misma, pueden ponerse en contacto en presencia de células objetivo o un substrato objetivo que se sabe se une al polipéptido A35R o fragmento del mismo. Se determina la cantidad de unión del polipéptido o fragmento a las células o el substrato en presencia de la sustancia, y la cantidad de unión del polipéptido o fragmento a las células o el substrato en ausencia de la sustancia, y una disminución o incremento en la cantidad de unión en presencia de la sustancia, identifica la sustancia que tiene la capacidad de inhibir o aumentar la unión. Ejemplos no limitativos de objetivos de unión para la proteína A35R, incluyen anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, ligandos, proteínas celulares, proteínas virales, pequeñas moléculas y/o fármacos que unen específicamente la proteína A35R, o un fragmento activo de la misma. En algunas modalidades, la unión del polipéptido A35R y/o fragmento del mismo a células objetivo o un substrato objetivo, puede medirse uniendo una porción detectable al polipéptido o fragmento (por ejemplo, una porción de fluorescencia, porción histoquímicamente detectable, porción radiactiva, etc.)- La cantidad de porción detectable puede medirse en presencia y ausencia de la sustancia que se va a poner a prueba, y las cantidades pueden compararse para determinar inhibición o aumento. Además, la presente invención provee un método para identificar una sustancia que tiene la capacidad para inhibir o aumentar la actividad inmunomoduladora de un polipéptido A35R y/o un fragmento biológicamente activo de esta invención, que comprende poner en contacto la sustancia con el polipéptido A35R de esta invención, y/o un fragmento biológicamente activo del mismo, bajo condiciones por las cuales pueda ocurrir actividad inmunomoduladora, y detectar una disminución o un incremento en la cantidad de actividad inmunomoduladora en presencia de la sustancia, en comparación con una cantidad de actividad inmunomoduladora control en ausencia de la sustancia, identificando de esta manera una sustancia que tiene la capacidad para inhibir o aumentar la actividad inmunomoduladora de la proteína A35R. La inhibición o el aumento de la actividad inmunomoduladora de la proteína A35R, puede detectarse por cualquiera de una variedad de métodos reconocidos en la técnica para evaluar la actividad inmunomoduladora, incluyendo las pruebas para la producción de óxido nítrico y la secreción de interleucina-2 (IL-2), como se describe en la sección de ejemplos de la presente. Provisto además es un método para identificar una sustancia que tenga la capacidad de aumentar o inhibir la actividad inmunógena de la proteína A35R de esta invención y/o un fragmento biológicamente activo de la misma, que comprende poner en contacto la sustancia con la proteína A35R o un fragmento inmunógeno de la misma bajo condiciones por las cuales pueda inducirse una respuesta inmune mensurable, y detectar un incremento o una disminución en la cantidad de respuesta inmune en presencia de la sustancia, en comparación con una cantidad de respuesta inmune control en ausencia de la sustancia, identificando de esta manera una secuencia que tenga la capacidad de aumentar o inhibir la actividad inmunógena de la proteína A35R. Pruebas para detectar y medir respuestas inmunes son bien conocidas en la técnica, y pueden usarse para detectar las respuestas inmunes humoral o celular. Se contempla también que la presente invención incluye métodos para identificar poxvirus para mutantes defectuosos en una o más de las actividades biológicas de la proteína A35R para su uso, por ejemplo, en la preparación de una vacuna. Puede identificarse que dichos mutantes tienen un defecto en algunas de las actividades biológicas de la proteína A35R, de acuerdo con los protocolos descritos en la presente y como es sabido en la técnica. Dichos mutantes pueden ponerse a prueba además para que sean atenuados en la capacidad para producir una infección clínica en un sujeto (es decir, para potencial de virulencia), y puedan evaluarse entonces para su uso como una vacuna de acuerdo con protocolos conocidos. Por ejemplo, en una modalidad, pueden generarse poxvirus que contengan una mutación en la secuencia codificante de A35R o que carezcan de la secuencia codificante de A35R, a través de técnicas conocidas en la materia tales como disolución de genes, y puede determinarse su potencial de virulencia por medio de estudios de desafío en animales y por evaluaciones de actividad inmunomoduladora como se describe en la presente. Además, pueden realizarse estudios de complementación que restauren la actividad defectuosa de la proteína A35R, para caracterizar al muíante.

Definiciones Como se usa en la presente, los términos "un" o "una" o "la" pueden significar uno o más de uno. Por ejemplo, "una" célula puede significar una célula o una pluralidad de células. También como se usa en la presente, el término "y/o" se refiere a, y abarca, cualquiera y todas las combinaciones posibles de uno o más de los ítems enlistados asociados, así como la falta de combinaciones cuando se interpreta en la alternativa ("o"). Además, el término "aproximadamente", como se usa en la presente cuando se hace referencia a un valor mensurable tal como una cantidad de un compuesto o agente de esta invención, dosis, tiempo, temperatura, y similares, significa que abarca variaciones de ±20%, ±10%, ±5%, ±1 %, ±0.5% o incluso ± 0.1 %, de la cantidad especificada.

Un poxvirus de esta invención incluye, pero no está limitado a, virus de la vaccinia, virus del molusco contagioso, virus de la viruela del camello, virus de la viruela vacuna, virus de la ectromelia (virus de la viruela del ratón), virus de la viruela del conejo, virus de la viruela del mono, virus de la viruela del mapache, virus de la viruela tatera, virus de la viruela del búfalo, virus mayor de la viruela, virus menor de la viruela, virus de la enfermedad de la piel abultada, virus de la viruela porcina, virus del tumor Yaba del mono, virus de la viruela ovina, mixomavirus, virus de la viruela del ratón de campo, y cualquier otro poxvirus que tenga una proteína A35R, ya sea conocido ahora o identificado después. Poxvirus adicionales se indican en el cuadro 1. El gen de A35R y la proteína A35R de esta invención, son un gen de A35R o proteína A35R o su ortólogo de un poxvirus de esta invención. El gen de A35R codifica para una proteína de 176 aminoácidos en la cepa Copenhague de VV, cepa Ankara modificada de la vaccinia y cepa Tian Tan (AF095689 del GenBank). Los ortólogos de A35R de VV están conservados en todos los poxvirus con un rango de hospederos de mamífero, variando en tamaño de 176 a 192 aminoácidos en todos los virus secuenciados, salvo por un gran ortólogo de 233 aminoácidos en el virus del molusco contagioso. El gen está fragmentado en marcos de lectura abiertos (ORFs) de 60 aminoácidos y 50 aminoácidos en secuencias del virus de la viruela (cepas India, Bangladesh y García). Como se usa en la presente, los términos "modular", "modula" o "modulación" se refieren a aumento (por ejemplo, un incremento) o inhibición (por ejemplo, disminución, reducción o supresión), de la actividad especificada. Los términos "aumento", "aumentar", "aumenta" o "que aumenta", se refieren a un incremento en el parámetro especificado (por ejemplo, por lo menos aproximadamente 1.1 veces 1 -2.5 veces, 1.5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 8 veces, 10 veces, doce veces, o incluso quince veces o más incremento), y/o un incremento en la actividad especificada de por lo menos 5%, 10%, 25%, 35%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% o 100%. Los términos "inhibe" "disminuye", "reduce" o "suprime" se refieren a una disminución en el parámetro especificado (por ejemplo, por lo menos aproximadamente .1 veces, .25 veces, .5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 8 veces, 10 veces, doce veces, o incluso quince veces o más incremento), y/o una disminución o reducción en la actividad especificada de por lo menos aproximadamente 5%, 10%, 25%, 35%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% o 100%. En modalidades particulares, la inhibición o reducción resulta en poca o esencialmente ninguna actividad detectable (cuando mucho, una cantidad insignificante, por ejemplo, menos de aproximadamente 0% o aproximadamente 5%). Como se usa en la presente, se interpretará que la frase de transición "que consiste esencialmente de" significa que el alcance de una reivindicación abarca los materiales o pasos especificados citados en la reivindicación, "y aquellos que no afectan materialmente las características básicas y novedosas de la invención reclamada. Véase, In re Herz, 537 F.2d 549, 551 -52, 190 USPQ 461 , 463 (CCPA 1976) (énfasis en el original); véase también MPEP § 21 1 1 .03. De esta manera, no se pretende que el término "que consiste esencialmente de", cuando se use en una reivindicación de esta invención, se interprete como equivalente de "que comprende". El término "aislado", como se usa en la presente, significa que el ácido nucleico o proteína o fragmento de proteína de esta invención está sustancialmente libre de contaminantes o componentes celulares con los cuales los ácidos nucleicos o proteínas ocurren naturalmente. El término "aislado" no significa que la preparación sea técnicamente pura (homogénea), sino que es suficientemente pura para proveer el ácido nucleico o proteína o fragmento de proteína en una forma en la cual pueda usarse terapéuticamente. El término "epítope" o "epítope antigénico" o "péptido antigénico", como se usa en la presente, significa una secuencia de aminoácidos específica que, cuando está presente en la conformación adecuada, provee un sitio reactivo para un anticuerpo o receptor de células T. La identificación de epítopes en antígenos puede llevarse a cabo por protocolos de inmunología que son bien conocidos en la técnica. Típicamente, un epítope o péptido antigénico puede tener 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ó 50 aminoácidos de longitud. Como se usa en la presente, el término "polipéptido" o "proteína" se usa para describir una cadena de aminoácidos que corresponde a aquellos codificados por un ácido nucleico. Un polipéptido de esta invención puede ser un péptido, que describe usualmente una cadena de aminoácidos de 2 a aproximadamente 30 aminoácidos. El término polipéptido, como se usa en la presente, describe también una cadena de aminoácidos que tiene más de 30 aminoácidos, y puede ser un fragmento o dominio de una proteína o una proteína de longitud completa. Además, como se usa en la presente, el término polipéptido puede referirse a una cadena lineal de aminoácidos, o puede referirse a una cadena de aminoácidos que ha sido procesada y plegada en una proteína funcional. Sin embargo, se entiende que 30 es un número arbitrario con respecto a distinguir péptidos y polipéptidos, y los términos pueden usarse recíprocamente para una cadena de aminoácidos. Los polipéptidos de la presente invención se obtienen por aislamiento y purificación de los polipéptidos de células en donde se producen en forma natural, por digestión enzimática (por ejemplo, proteolítica), y/o en forma recombinante por expresión de ácido nucleico que codifique para los polipéptidos o fragmentos de esta invención. Los polipéptidos y/o fragmentos de esta invención pueden obtenerse también por síntesis química u otros protocolos conocidos para producir polipéptidos y fragmentos. Las secuencias de aminoácidos descritas en la presente se presentan en la dirección amino a carboxi, de izquierda a derecha. Las secuencias de nucleótidos se presentan en la presente en la dirección 5' a 3', de izquierda a derecha. Se pretende que los ácidos nucleicos de esta invención puedan ser de cadena sencilla o de doble cadena (es decir, incluyendo el ácido nucleico complementario). Un ácido nucleico de esta invención puede ser el complemento de un ácido nucleico descrito en la presente. Un "fragmento biológicamente activo" o "fragmento activo", como se usa en la presente, incluye un polipéptido de esta invención que comprenda un número suficiente de aminoácidos para tener una o más de las actividades biológicas de los polipéptidos de esta invención. Dichas actividades biológicas pueden incluir, pero no están limitadas a, en cualquier combinación, actividad de unión, actividad inmunomoduladora, actividad de virulencia y/o actividad inmunógena, así como cualquier otra actividad conocida ahora o identificada después para los polipéptidos y/o fragmentos de esta invención. Un fragmento de un polipéptido de esta invención puede producirse por métodos bien conocidos y de rutina en la técnica. Pueden producirse fragmentos de esta invención, por ejemplo, por digestión enzimática u otro tipo de digestión de péptidos o polipéptidos de ocurrencia natural, o por protocolos de síntesis que son bien conocidos. Dichos fragmentos pueden ponerse a prueba para una o más de las actividades biológicas de esta invención de acuerdo con los métodos descritos en la presente, que son métodos de rutina para poner a prueba actividades de polipéptidos, y/o de acuerdo con cualquier método conocido y de rutina para identificar dichas actividades. Dicha producción y prueba para identificar fragmentos biológicamente activos de los polipéptidos descritos en la presente, estarían bien dentro del alcance de los expertos en la técnica, y serían de rutina. Los fragmentos de los polipéptidos de esta invención tienen de preferencia por lo menos aproximadamente diez aminoácidos de longitud, y retienen una o más de las actividades biológicas (por ejemplo, inmunomodulación; actividades de virulencia) y/o las actividades inmunológicas de la proteína A35R. Ejemplos de los fragmentos de esta invención incluyen, pero no se pretende que estén limitados a, los siguientes fragmentos identificados por el número de aminoácidos como se muestra en el listado de secuencias para SEQ ID NO:2: aminoácidos 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 110-120, 120-130, 130-140, 140-150, 150-160, 160-170, 170-180, 180-190, 190-200, 200-210, 210-220, 220-230, 230-240, 240-250, 1 -25, 1-50, 1 -67, 1 -75, 1 -100, 1-125, 1 -135, 1 -145, 1 -150, 1 -160, 1 -170, 1 -180, 1 -190, 1 -200, 1 -250, 68-180, 183-223, 50-100, 100-200, 200-250, etc. Se entiende que esta lista sirve sólo de ejemplo, y que un fragmento de esta invención puede ser cualquier secuencia de aminoácidos que contenga cualquier combinación de aminoácidos contiguos que sean enumerados en el listado de secuencias como aminoácidos 1 a 250, incluso si esa combinación no se cita específicamente como un ejemplo en la presente. Se entiende también que estos fragmentos pueden combinarse en cualquier orden o cantidad. Por ejemplo, el fragmento 1 a 10 puede combinarse con el fragmento 10 a 20 para producir un fragmento de aminoácidos 1 a 20. Como otro ejemplo, el fragmento 1 a 20 puede combinarse con el fragmento 50 a 60 para producir un sólo fragmento de esta invención que tenga 31 aminoácidos (aminoácidos 10 a 20 y aminoácidos 50 a 60). También pueden estar presentes fragmentos en números múltiples y en cualquier combinación en un fragmento de esta invención. De esta manera, por ejemplo, puede combinarse el fragmento 1 a 150 con un segundo fragmento 1 a 150, y/o puede combinarse con el fragmento 225 a 230, para producir un fragmento de esta invención. Otros ejemplos de fragmentos de esta invención incluyen los aminoácidos 1 a 60 del virus de la viruela; y la secuencia de aminoácidos: YDDLDISIMDFIGPY. Los términos "homología", "identidad" y "complementariedad", como se usan en la presente, se refieren a un grado de similitud entre dos o más secuencias. Puede haber homología parcial u homología completa (es decir, identidad). Una secuencia parcialmente complementaria que por lo menos inhiba parcialmente que una secuencia idéntica hibride con un ácido nucleico objetivo, es referida como "sustancialmente homologa". La inhibición de la hibridación de la secuencia completamente complementaria con la secuencia objetivo, puede examinarse usando una prueba de hibridación (Southern o Northern blot, hibridación en solución, y similares), bajo condiciones de baja severidad. Una sonda de hibridación o secuencia sustancialmente homologa competirá por, e inhibirá, la unión de una secuencia completamente homologa con la secuencia objetivo bajo condiciones de baja severidad, como este término se conoce en la técnica. Esto no quiere decir que las condiciones de baja severidad son tales que no se permita la unión no específica; las condiciones de baja severidad requieren que la unión de dos secuencias con alguna otra sea una interacción específica (es decir, selectiva). La ausencia de unión no específica puede ponerse a prueba por el uso de una segunda secuencia objetivo que carezca incluso de un grado parcial de complementariedad (por ejemplo, menos de aproximadamente 30% de identidad). En ausencia de unión no específica, la sonda no hibridará con la segunda secuencia objetivo no complementaria. El término "hibridación", como se usa en la presente, se refiere a cualquier procedimiento por el cual una primera cadena de ácido nucleico se une con una segunda cadena de ácido nucleico a través de apareamiento de bases. Los ácidos nucleicos que codifican para los polipéptidos y/o fragmentos de esta invención pueden detectarse por hibridación de ADN-ADN o ADN-ARN y/o amplificación usando sondas, iniciadores y/o fragmentos de polinucleótidos que codifiquen para los polipéptidos y/o fragmentos de esta invención, y/o pueden diseñarse para detectar y/o amplificar los ácidos nucleicos de esta invención. El término "complejo de hibridación", como se usa en la presente invención, se refiere a un complejo formado entre dos secuencias de ácido nucleico en virtud de la formación de enlaces de hidrógeno entre bases de G y C complementarias y entre bases de A y T complementarias; estos enlaces de hidrógeno pueden ser estabilizados además por interacciones de apilamiento de bases. Las dos secuencias de ácido nucleico complementarias forman enlaces de hidrógeno en una configuración antiparalela. Puede formarse un complejo de hibridación en solución (por ejemplo, análisis Cot o R0t), o entre una secuencia de ácido nucleico presente en solución, y otra secuencia de ácido nucleico inmovilizada sobre un soporte sólido (por ejemplo, papel, membranas, filtros, chips, pasadores o portaobjetos de vidrio, o cualquier otro substrato adecuado al cual células y/o ácidos nucleicos hayan sido fijados). El término "secuencia de nucleotidos" se refiere a un heteropolímero de nucleotidos o la secuencia de estos nucleotidos. Los términos "ácido nucleico", "oligonucleótido" y "polinucleótido" se usan también recíprocamente en la presente, para referirse a un heteropolímero de nucleotidos. En general, pueden ensamblarse segmentos de ácido nucleico provistos por esta invención a partir de fragmentos del genoma y enlazadores de oligonucleótidos cortos, o a partir de una serie de oligonucleótidos, o de nucleotidos individuales, para proveer un ácido nucleico sintético que sea capaz de ser expresado en una unidad de transcripción recombinante que comprenda elementos reguladores derivados de un operón microbiano o viral, o un gen eucariótico. Los ácidos nucleicos de esta invención pueden comprender una secuencia de nucleotidos que puede ser idéntica en secuencia a la secuencia que está ocurriendo en forma natural o, debido a la degeneración bien caracterizada del código del ácido nucleico, pueden incluir codones alternativos que codifican para el mismo aminoácido como el que se encuentra en la secuencia de ocurrencia natural. Además, los ácidos nucleicos de esta invención pueden comprender secuencias de nucleotidos que pueden incluir codones que representan sustituciones conservativas de aminoácidos, como es bien sabido en la técnica, de modo que la actividad biológica del polipéptido y/o fragmento resultante sea retenida. El término "sonda" o "iniciador" incluye ácidos nucleicos de cadena sencilla y/o de doble cadena de ocurrencia natural y/o recombinantes y/o sintetizados químicamente. Pueden ser marcados para detección por traducción de muesca, reacción de reemplazo de Klenow, PCR y/u otros métodos bien conocidos en la técnica. Sondas e iniciadores de la presente invención, su preparación y/o marcación, se describen en Sambrook et al. 1989. Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, y en Ausubel et al. 1989. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York N.Y., citas que se incorporan en su totalidad en la presente como referencia, para estas enseñanzas. El término "severidad", como se usa en la presente, se refiere a condiciones de hibridación que se entienden comúnmente en la técnica para definir las condiciones del procedimiento de hibridación. Las condiciones de severidad pueden ser de baja severidad, alta severidad o severidad media, como dichos términos se conocen comúnmente en la técnica, y son bien reconocidas por los expertos en la técnica. En varias modalidades, las condiciones de severidad pueden incluir, por ejemplo, condiciones altamente severas (es decir, alta severidad) (por ejemplo, hibridación en NaHP04 0.5 M, dodecil sulfato de sodio (SDS) a 7%, EDTA 1 mM a 65°C, y lavado en 0.1 SSC/SDS a 0.1 % a 68°C), y/o condiciones moderadamente severas (es decir, severidad media) (por ejemplo, lavado en 0.2xSSC/SDS a 0.1 % a 42°C). El término "amplificación", como se usa en la presente, incluye la producción de copias múltiples de una molécula de ácido nucleico, y se lleva a cabo generalmente usando reacción en cadena de polimerasa (PCR) y/o cualquier otra tecnología de amplificación como es bien sabido en la técnica (véase Dieffenbach y Dveksler, 1995. PCR Primer, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y.). El término "muestra", como se usa en la presente, se usa en su sentido más amplio. Una muestra biológica que se sospecha contiene un polipéptido, fragmento, anticuerpo y/o ácido nucleico de esta invención puede ser cualquier fluido biológico, un extracto de una célula, una matriz extracelular aislada de una célula, una célula (en solución o unida a un soporte sólido), un tejido, una impresión de tejido, y similares. Una muestra de esta invención puede incluir también una sustancia no obtenida del cuerpo de un sujeto de esta invención. Ejemplos de dicha muestra incluyen, pero no están limitados a, una muestra de agua o fluido, una muestra de alimento o producto alimenticio, una muestra de planta o materia vegetal, una muestra de suelo o roca, una muestra de animal o materia animal, una muestra de cama de paja de animal, una muestra de jaula de animal, una muestra de aire, una muestra de suelo o polvo, un paño, papel u otro material usado para limpiar con un hisopo, limpiar con un paño, espolvorear o limpiar una superficie, una muestra de efluente, etc. El término "cantidad efectiva", como se usa en la presente, se refiere a una cantidad de un compuesto, agente, sustancia o composición de esta invención que es suficiente para producir un efecto deseado, el cual puede ser un efecto terapéutico. La cantidad efectiva variará con la edad, condición general del sujeto, la severidad de la condición que está siendo tratada, el compuesto, agente, sustancia o composición particular administrado, la duración del tratamiento, la naturaleza de cualquier tratamiento concurrente, el vehículo farmacéuticamente aceptable usado, si lo hay, y factores similares dentro del conocimiento y la experiencia de los expertos en la técnica. Según sea adecuado, una "cantidad efectiva", en cualquier caso individual, puede ser determinada por el experto en la técnica o por referencia a los textos y literatura pertinentes, y/o usando experimentación de rutina (véase, Remington, The Science And Practice of Pharmacy (vigésima edición, 2000)). Un componente "farmacéuticamente aceptable" tal como una sal, vehículo, excipiente o diluyente de una composición de conformidad con la presente invención, es un componente que (i) es compatible con los otros ingredientes de la composición porque puede combinarse con las composiciones de la presente invención sin que haga que la composición sea inconveniente para su propósito deseado, y (¡i) es adecuado para su uso con sujetos como se provee en la presente, sin efectos secundarios adversos indebidos (tales como toxicidad, irritación y respuesta alérgica). Los efectos secundarios son "indebidos", cuando su riesgo excede el beneficio provisto por la composición. Ejemplos no limitativos de componentes farmacéuticamente aceptables (por ejemplo, vehículos farmacéuticamente aceptables) incluyen, sin limitación, cualquiera de los vehículos farmacéuticos estándar, tales como soluciones salinas reguladas en su pH con fosfato, agua, emulsiones tales como emulsión de aceite/agua, microemulsiones y varios tipos de agentes mojantes. En particular, se pretende que un vehículo farmacéuticamente aceptable sea un vehículo estéril que se formule para administración a, o suministro en, un sujeto de esta invención. Además, cualquiera de las composiciones de esta invención puede comprender un vehículo farmacéuticamente aceptable y un adyuvante adecuado. Como se usa en la presente, el término "adyuvante adecuado" describe un adyuvante capaz de ser combinado con el polipéptido y/o fragmento y/o ácido nucleico de esta invención para aumentar más una respuesta inmune sin efecto deletéreo sobre el sujeto o las células del sujeto. Un adyuvante puede ser, pero no está limitado a, MONTANIDE ISA51 (Seppic, Inc., Fairfield, NJ), formulación 1 de adyuvante de SYNTEX (SAF-1 ) compuesta de escualeno a 5% (p/v) (DASF, Parsippany, NJ.), Pluronic a 2.5%, polímero L121 (Aldrich Chemical, Milwaukee), y polisorbato a 0.2% (Tween 80, Sigma) en solución salina regulada en su pH con fosfato. Otros adyuvantes adecuados son bien conocidos en la técnica, e incluyen QS-21 , adyuvante de Freund (completo e incompleto), alumbre, fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-nor-muramil-L-alanil-D-isoglutamina (CGP 11637, referida como nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanin-2-(1 '-2'-dipalmitoil-sn- gl¡cero-3-hidroxifosforilox¡)-et¡lamina (CGP 19835A, referida como MTP-PE) y RBI, que contiene tres componentes extraídos de bacterias, monofosforil lípido A, dimicolato de trehalosa y esqueleto de pared celular (MPL+TDM+CWS) en emulsión de escualeno a 2%/Tween 80. Las composiciones de la presente invención pueden incluir también otros agentes medicinales, agentes farmacéuticos, vehículos, diluyentes, citocinas inmunoestimuladoras, etc. Métodos reales para preparar dichas formas de dosificación son conocidas, o serán evidentes, para los expertos en esta técnica. Un "antígeno tumoral" de esta invención (es decir, un antígeno asociado específicamente con células tumorales) puede incluir, por ejemplo, antígenos HER2/neu y ? ?? para cáncer de mama, MART-1/MelanA, gp 00, tirosinasa, TRP-1 , TRP-2, NY-ESO-1 , CDK-4, ß-catenina, MUM-1 , caspasa-8, KIAA0205, HPVE7, SART-1 , PRAME, y antígenos p15, miembros de la familia de MAGE, la familia de BAGE (tal como BAGE-1), la familia de DAGE/PRAME (tal como DAGE-1 ), la familia de GAGE, la familia de RAGE (tal como RAGE-1 ), la familia de SMAGE, NAG, TAG-72, CA125, protooncogenes mutados tales como p21 ras, genes supresores de tumores mutados tales como p53, antígenos virales asociados con tumores (por ejemplo, HPV16 E7), la familia de SSX, HOM-MEL-55, NY-COL-2, HOM-HD-397, HOM-RCC-1 .14, HOM-HD-21 , HOM-NSCLC-1 1 , HOM-MEL-2.4, HOM-TES-1 1 , RCC-3.1 .3, NY-ESO-1 , y la familia de SCP. Los miembros de la familia de MAGE incluyen, pero no están limitados a, MAGE-1 , MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4 y MAGE-1 1 . Los miembros de la familia de GAGE incluyen, pero no están limitados a, GAGE-1 , GAGE-6. Véase, por ejemplo, la revisión por Van den Eynde y van der Bruggen (1997) en Curr. Opin. Immunol. 9: 684-693, Sahin et al. (1997) en Curr. Opin. Immunol. 9: 709-716, y Shawler et al. (1997), cuyo contenido entero se incorpora en la presente como referencia para sus enseñanzas sobre antígenos cancerosos. El antígeno tumoral puede ser también, pero no está limitado a, mucina de células epiteliales humanas (Muc-1 ; una repetición del núcleo de 20 aminoácidos para glucoproteína Muc-1 , presente en células de cáncer de mama y células de cáncer de páncreas), MUC-2, MUC-3, MUC-18, el producto del oncogen Ha-ras, antígeno carcinoembrionario (CEA), el producto del oncogen raf, CA-125, GD2, GD3, GM2, TF, sTn, gp75, EBV-LMP 1 y 2, HPV-F4, 6, 7, antígeno prostático del suero (PSA), antígeno de membrana específico de próstata (PSMA), alfa-fetoproteína (AFP), CO17-1 A, GA733, gp72, p53, el producto del oncogen ras, ß-HCG, gp43, HSP-70, p17 mel, HSP-70, gp43, HMW, HOJ-1 , gangliósidos de melanoma, TAG-72, proto-oncogenes mutados tales como p21 ras, genes supresores de tumores mutados tales como p53, receptor de estrógeno, globulina de grasa de la leche, telomerasas, proteínas de la matriz nuclear, fosfatasa ácida prostática, proteína MZ2-E, mucina epitelial polimorfica (PEM), proteína LK26 de unión a folato, receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) truncado, antígeno de Thomsen-Friedenreich (T), gangliósidos GM-2 y GD-2, mucina epitelial polimorfica, gonadotropina coriónica humana (HCG), antígeno oncofetal pancreático, antígenos cancerosos 15-3, 19-9, 549, 195, antígeno de carcinoma escamocelular (SCCA), antígeno de cáncer ovárico (OCA), antígeno asociado con cáncer de páncreas (PaA), proteínas K-ras mutantes, muíante p53 y proteína quimérica P210BCR-ABL y tumor asociado con antígenos virales (por ejemplo, HPV16 E7). El antígeno tumoral de esta invención puede ser también un anticuerpo producido por un tumor de células B (por ejemplo, linfoma de células B; leucemia de células B; mieloma; leucemia de células pilosas), un fragmento de dicho anticuerpo, que contenga un epítope del idiotipo del anticuerpo, un receptor de antígenos de células B malignas, un idiotipo de inmunoglobulina de células B malignas, una región variable de una inmunoglobulina, una región hipervariable o región determinante de complementariedad (CDR) de una región variable de una inmunoglobulina, un receptor de células T malignas (TCR), una región variable de un TCR y/o una región hipervariable de un TCR. En una modalidad, el antígeno canceroso de esta invención puede ser un anticuerpo de cadena sencilla (scFv), que comprenda dominios VH y VL enlazados, que retenga la conformación y la actividad de unión específica del idiotipo nativo del anticuerpo. La presente invención de ninguna manera se limita a los antígenos tumorales enlistados en la presente. Otros antígenos tumorales son identificados, aislados y clonados por medio de métodos conocidos en la técnica, tales como aquellos descritos en la patente de E.U.A. No. 4,514,506, cuyo contenido entero se incorpora en su totalidad en la presente como referencia. El cáncer que se va a tratar mediante los métodos de esta invención puede ser, pero no está limitado a, linfoma de células B, linforna de células T, mieloma, leucemia, neoplasias hematopoyéticas, timoma, linfoma, sarcoma, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, linfoma no de Hodgkin, linfoma de Hodgkin, cáncer uterino, adenocarcinoma, cáncer de mama, cáncer pancreático, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer renal, cáncer de vejiga, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer ovárico, melanoma primario o metastásico, carcinoma escamocelular, carcinoma de células básales, cáncer de cerebro, angiosarcoma, hemangiosarcoma, carcinoma de cabeza y cuello, carcinoma de tiroides, sarcoma de tejido blando, sarcoma óseo, cáncer testicular, cáncer uterino, cáncer cervical, cáncer gastrointestinal, y cualquier otro cáncer conocido ahora o identificado después (véase, por ejemplo, Rosenberg (1996) Ann. Rev. Meó. 47: 481 -491 , cuyo contenido entero se incorpora en la presente como referencia). Agentes infecciosos y/o patogénicos de esta invención pueden incluir, pero no están limitados a, Hepadnaviridae, que incluye hepatitis A, B, C, D, E, F, G, etc. (por ejemplo, HBsAg, HBcAg, HBeAg); Flaviviridae, que incluye virus de la hepatitis C (HCV) humana, virus de la fiebre amarilla y virus del dengue; Retroviridae, que incluye virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y virus linfotrópicos T humanos (HTLV1 y HTLV2); Herpesviridae, que incluye virus del herpes simple (HSV-1 y HSV-2), virus de Epstein-Barr (EBV), citomegalovirus, virus de la varicela zoster (VZV), virus 6 del herpes humano (HHV-6), virus 8 del herpes humano (HHV-8) y virus del herpes B; Papovaviridae, que incluye virus del papiloma humano; Rhabdoviridae, que incluye virus de la rabia; Paramyxoviridae, que incluye virus sincicial respiratorio; Reoviridae, que incluye rotavirus; Bunyaviridae, que incluye hantavirus; Filoviridae, que incluye virus Ebola; Adenoviridae; Parvoviridae, que incluye parvovirus B-19; Arenaviridae, que incluye virus Lassa; Orthomyxoviridae, que incluye virus de la influenza; Poxviridae, que incluye virus del ectima contagioso ovino, virus del molusco contagioso, virus de la viruela y virus de la viruela del mono; Togaviridae, que incluye virus de la encefalitis equina venezolana; Coronaviridae, que incluye coronavirus tales como el virus del síndrome respiratorio agudo severo (SARS); Picornaviridae, que incluye poliovirus; rinovirus; orbivirus; picodnavirus; virus de la encefalomiocarditis (EMV); virus de la parainfluenza; adenovirus, virus Coxsackie, ecovirus, virus de la rubéola, virus del papiloma humano, virus del moquillo canino, virus de la hepatitis contagiosa canina, calicivirus felino, virus de la rinotraqueítis felina, virus TGE (virus de la gastroenteritis transmisible porcina), virus de la glosopeda (fiebre aftosa), virus 5 simiano, virus de la parainfluenza humana tipo 2, metaneumovirus humano, enterovirus, y cualquier otro virus patógeno conocido ahora o identificado después (véase, por ejemplo, Fundamental Virology, Fields et al., eds., 3a. ed., Lippincott-Raven, New York, 1996, cuyo contenido entero se incorpora en la presente como referencia para las enseñanzas sobre virus patógenos). Un microorganismo patógeno de esta invención puede incluir, pero no está limitado a, Rickettsia, Chlamydia, Mycobacterium, Clostridium, Corynebacterium, Mycoplasma, Ureaplasma, Legionella, Shigella, Salmonella, la especie Escherichia coli patógena, Bordetella, Neisseria, Treponema, Bacillus, Haemophilus, Moraxella, Vibrio, Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Campylobacter spp., Borrelia spp., Leptospira spp., Ehrlichia spp., Klebsiella spp., Pseudomonas spp., Helicobacter spp., y cualquier otro microorganismo patógeno conocido ahora o identificado después (véase, por ejemplo, Microbiology, Davis et al., eds., 4a. ed., Lippincott, New York, 1990, cuyo contenido entero se incorpora en la presente como referencia para las enseñanzas sobre microorganismos patógenos). Ejemplos específicos de microorganismos incluyen, pero no están limitados a, Helicobacter pylori, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma pneumoniae, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus viridans, Enterococcus faecalis, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum, Bacillus anthracis, Salmonella typhi, Vibrio cholera, Pasteurella pestis, Pseudomonas aeruginosa, Campylobacter jejuni, Clostridium difficile, Clostridium botulinum, Mycobacterium tuberculosis, Borrelia burgdorferi, Haemophilus ducreyi, Corynebacterium diphtheria, Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis, Bordetella bronchiseptica, Haemophilus influenzae y Escherichia coli enterotóxica. Protozoarios patógenos pueden incluir, pero no están limitados a, especies de Plasmodium (por ejemplo, antígenos de la malaria), especies de Babeosis, especies de Schistosoma, especies de Trypanosoma, especies de Pneumocystis carinii, especies de Toxoplasma, especies de Leishmania, y cualquier otro protozoario patógeno conocido ahora o identificado después. Incluidos también son levaduras y hongos patógenos, cuyos ejemplos pueden ser, pero no están limitados a, especies de Aspergillus, especies de Candida, especies de Cryptococcus, especies de Histoplasma, especies de Coccidioides, y cualquier otro hongo patógeno conocido ahora o identificado después. Antígenos de trasplante de esta invención incluyen, pero no están limitados a, diferentes especificidades antigénicas de proteínas clase I de HLA-A, B y C. Pueden usarse también diferentes especificidades antigénicas de proteínas clase II de HLA-DR, HLA-DQ, HLA-DP y HLA-DW (WHO Nomenclature Committee, Immunogenetics 16: 135 (1992); Hensen et al., en Fundamental Immunology, Paul, ed., pp. 577-628, Raven Press, New York, 1993; NIH GenBank y bases de datos de EMBL). La presente invención contempla también el tratamiento o la prevención de alergias y/o reacción alérgica, causadas por varios alérgenos que pueden incluir, pero no están limitados a, alérgenos ambientales tales como alérgenos de ácaros del polvo; alérgenos de plantas tales como polen, incluyendo polen de ambrosia; alérgenos de insectos tales como el veneno de abejas y hormigas; y alérgenos de animales tales como caspa de gatos, caspa de perros y alérgenos de la saliva de animales.

Una "molécula inmunomoduladora" de esta invención puede ser, pero no está limitada a, una citocina inmunoestimuladora que puede ser, pero no está limitada a, GM/CSF, interleucina-2, interleucina-12, interferón-gamma, interleucina-4, factor de necrosis tumoral-alfa, interleucina-1 , factor hematopoyético flt3L, CD40L, moléculas co-estimuladoras B7.1 y moléculas co-estimuladores B7.2. Ejemplos adicionales de una molécula inmunomoduladora de esta invención incluyen los adyuvantes de esta invención que incluyen, por ejemplo, formulación 1 de adyuvante de SYNTEX (SAF-1 ) compuesta de escualeno a 5% (p/v) (DASF, Parsippany, N.J.), Pluronic a 2.5%, polímero L121 (Aldrich Chemical, Milwaukee) y polisorbato a 0.2% (Tween 80, Sigma) en solución salina regulada en su pH con fosfato. Adyuvantes adecuados incluyen también una sal de aluminio tal como gel de hidróxido de aluminio (alumbre), fosfato de aluminio o alganmulina, pero pueden ser también una sal de calcio, hierro o zinc, o pueden ser una suspensión insoluble de tirosina acilada, o azúcares acilados, polisacáridos derivatizados cationicamente o aniónicamente, o polifosfazenos. Otros adyuvantes son bien conocidos en la técnica, e incluyen QS-21 , adyuvante de Freund (completo e incompleto), hidróxido de aluminio, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (CGP 11637, referida como nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanin-2-(1 '-2'-dipalmito¡l-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (CGP 19835A, referida como MTP-PE) y RBI, que contiene tres componentes extraídos de bacterias, monofosforil lípido A, dimicolato de trehalosa y esqueleto de pared celular (MPL+TDM+CWS) en emulsión de escualeno a 2%/Tween 80. Adyuvantes adicionales pueden incluir, por ejemplo, una combinación de monofosforil lípido A, de preferencia monofosforil lípido A 3-de-O-acilado (3D-MPL), junto con una sal de aluminio. Un sistema de adyuvante mejorado incluye la combinación de un monofosforil lípido A y un derivado de saponina, en particular la combinación de QS21 y 3D-MPL como se describe en la publicación del PCT número WO 94/00153 (cuyo contenido entero se incorpora en la presente como referencia), o una composición menos reactogénica, en donde QS21 es extinguido con colesterol como se describe en la publicación del PCT número WO 96/33739 (cuyo contenido entero se incorpora en la presente como referencia). Una formulación de adyuvante particularmente potente que incluye QS21 , 3D-MPL y tocoferol en una emulsión de aceite en agua, se describe en la publicación del PCT número WO 95/17210 (cuyo contenido entero se incorpora en la presente como referencia). Además, el ácido nucleico de esta invención puede incluir un adyuvante que comprenda una secuencia de nucleótidos que codifique para una proteína A35R o fragmento activo de la misma de esta invención, y una secuencia de nucleótidos que provea una función adyuvante, tal como secuencias de CpG. Dichas secuencias de CpG, o motivos, son bien conocidos en la técnica. Los términos "tratar", "para tratar" o "tratamiento", incluyen cualquier tipo de acción que imparta un efecto modulador que, por ejemplo, puede ser un efecto benéfico, a un sujeto afectado con un trastorno, enfermedad, condición o malestar, incluyendo mejora en el trastorno, enfermedad, condición o malestar del sujeto (por ejemplo, en uno o más síntomas), demora en la progresión del trastorno, enfermedad, condición o malestar, prevención o demora del inicio del trastorno, enfermedad, condición o malestar, y/o cambio en parámetros clínicos del trastorno, enfermedad, condición o estado de malestar, etc., como sería bien sabido en la técnica. Como se usa en la presente, el término "anticuerpo" incluye moléculas de inmunoglobulina intactas, así como fragmentos de las mismas que son capaces de unir el determinante epitópico de un antígeno (es decir, determinante antigénico). Anticuerpos que unen los polipéptidos de esta invención se preparan usando polipéptidos o fragmentos intactos como el antígeno inmunizante. El polipéptido o fragmento usado para inmunizar a un animal puede derivarse de digestión enzimática, expresión recombinante, aislamiento de materiales biológicos, síntesis, etc., y puede conjugarse con una proteína portadora, si se desea. Vehículos usados comúnmente que son acoplados químicamente a péptidos y proteínas para la producción de anticuerpos incluyen, pero no están limitados a, albúmina de suero de bovino, tiroglobulina y hemocianina de la lapa Fissurella. La proteína o el péptido acoplado se usan entonces para inmunizar al animal (por ejemplo, un ratón, rata o conejo). Los antígenos del polipéptido o péptido pueden administrarse también con un adyuvante, como se describe en la presente y como es sabido de otra manera en la técnica. Un anticuerpo de esta invención puede ser cualquier tipo de inmunoglobulina, incluyendo IgG, IgM, IgA, IgD y/o IgE. El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal, y puede ser de cualquier especie de origen incluyendo, por ejemplo, ratón, rata, conejo, caballo, cabra, oveja o humano, o puede ser un anticuerpo quimérico o humanizado (véase, por ejemplo, Waiker et al., Molec. Immunol. 26: 403-1 1 (1989)). Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monoclonales recombinantes producidos de acuerdo con los métodos descritos en la patente de E.U.A. No. 4,474,893 o la patente de E.U.A. No. 4,816,567. Los anticuerpos pueden ser también construidos químicamente de acuerdo con los métodos descritos en la patente de E.U.A. No. 4,676,980. El anticuerpo puede ser además un anticuerpo de cadena sencilla (por ejemplo, scFv) o anticuerpo biespecífico. Los fragmentos de anticuerpo incluidos dentro del alcance de la presente invención incluyen, por ejemplo, Fab, F(ab')2, y fragmentos Fe, y los fragmentos correspondientes obtenidos de anticuerpos diferentes de IgG. Dichos fragmentos pueden producirse mediante técnicas conocidas. Por ejemplo, pueden producirse fragmentos F(ab')2 por digestión de la molécula de anticuerpo con pepsina, y pueden generarse fragmentos Fab reduciendo los puentes disulfuro de los fragmentos F(ab')2. En forma alternativa, pueden construirse colecciones de expresión de Fab que permitan la identificación rápida y fácil de fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada (véase Huse et al. (1989) Science 254: 1275-1281 ). Pueden obtenerse también anticuerpos por técnicas de exhibición de fagos conocidas en la materia, o inmunizando a un hospedero heterólogo con una célula que contenga un epítope de interés. El polipéptido, fragmento o epítope antigénico que se usa como un inmunógeno puede ser modificado o administrado en un adyuvante para incrementar la antigenicidad. Métodos para incrementar la antigenicidad de una proteína o péptido son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero no están limitados a, acoplamiento del antígeno con una proteína heteróloga (tal como globulina o ß-galactosidasa), o a través de la inclusión de un adyuvante durante la inmunización. Por ejemplo, para la producción de anticuerpos, puede inmunizarse a varios hospederos que incluyen cabras, conejos, ratas, ratones, humanos y otros, por inyección con los polipéptidos y/o fragmentos de esta invención, con o sin una proteína portadora. Además, pueden usarse varios adyuvantes para incrementar la respuesta inmunologica. Dichos adyuvantes incluyen, pero no están limitados a, adyuvantes completo e incompleto de Freund, geles minerales tales como hidróxido de aluminio y sustancias tensoactivas tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, hemocianina de la lapa Fissurella, y dinitrofenol. Entre los adyuvantes usados en humanos, son especialmente preferibles BCG (bacilos de Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum. Pueden producirse anticuerpos monoclonales en una línea de células de hibridoma de acuerdo con las técnicas de Kohier y Milstein (Nature 265: 495-97 (1975)). Otras técnicas para la producción de anticuerpos monoclonales incluyen, pero no están limitadas a, la técnica de hibridomas de células B humanas, y la técnica de hibridomas-EBV (Kozbor et al., 1985. J. Immunol. Methods 81 : 31 -42; Cote et al., 1983. Proc. Nati. Acad. Sci. 80: 2026-2030; Colé et al., 1984. Mol. Cell Biol. 62: 109-120). Por ejemplo, para producir anticuerpos monoclonales, puede inyectarse una solución que contenga al antígeno adecuado en un ratón y, después de un tiempo suficiente, se sacrifica al ratón y se obtienen células del bazo. Las células del bazo son inmortalizadas entonces fusionándolas con células de mieloma o con células de linfoma, típicamente en presencia de polietilenglicol, para producir células de hibridoma. Las células de hibridoma son desarrolladas entonces en un medio adecuado, y el sobrenadante identificado para anticuerpos monoclonales que tengan la especificidad deseada. Pueden producirse fragmentos Fab monoclonales en una célula bacteriana tal como E. coli por técnicas recombinantes conocidas por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Huse. Science 246: 1275-81 (1989)). Cualquiera de muchos métodos bien conocidos en la técnica puede usarse para identificar la célula de hibridoma, que produce un anticuerpo con las características deseadas. Estos incluyen identificación de los hibridomas por prueba de ELISA, análisis Western blot o radioinmunoensayo. Hibridomas que secreten los anticuerpos deseado son clonados, y la clase y subclase se identifican usando procedimientos estándar conocidos en la técnica. Para anticuerpos policlonales, se aisla suero que contenga anticuerpos del animal inmunizado, y se identifica para la presencia de anticuerpos con la especificidad deseada, usando cualquiera de los procedimientos bien conocidos como se describen en la presente. La presente invención provee además anticuerpos de esta invención en forma detectablemente marcada. Pueden marcarse detectablemente anticuerpos a través del uso de radioisótopos, marcas de afinidad (tales como biotina, avidina, etc.), marcas enzimáticas (tales como peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, etc.), marcas de fluorescencia (tales como FITC o rodamina, etc.), átomos paramagnéticos, perlas de oro, etc. Dichos procedimientos de marcación son bien conocidos en la técnica. Los anticuerpos marcados de la presente invención pueden usarse para pruebas in vitro, in vivo e in situ para identificar un polipéptido y/o fragmento de esta invención en una muestra. En algunas modalidades, la presente invención provee además los anticuerpos descritos anteriormente inmovilizados sobre un soporte sólido (por ejemplo, perlas, placas, portaobjetos o cavidades formados de materiales tales como látex o poliestireno). Ejemplos de dichos soportes sólidos incluyen plásticos tales como policarbonato, carbohidratos complejos tales como agarosa y sefarosa, resinas acrílicas tales como poliacrilamida y perlas de látex. Técnicas para el acoplamiento de anticuerpos a dichos soportes sólidos son bien conocidas en la técnica (véase Weir et al., Handbook of Experimental Immunology 4a. ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford, Inglaterra, capítulo 10 (1986)). Asimismo, los anticuerpos pueden ser conjugados con grupos detectables tales como marcas radiactivas (por ejemplo, 35S, 125l, 1311), marcas de enzimas (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina) y marcas de fluorescencia (por ejemplo, fluoresceína), de acuerdo con técnicas conocidas. La determinación de la formación de un complejo de antígeno/anticuerpo en los métodos de esta invención puede ser por detección de, por ejemplo, precipitación, aglutinación, floculación, radiactividad, desarrollo o cambio de color, fluorescencia, luminiscencia, etc., como es bien sabido en la técnica. Además, pueden usarse técnicas desarrolladas para la producción de anticuerpos quiméricos o anticuerpos humanizados, empalmando genes de anticuerpo de ratón con genes de anticuerpo de humano para obtener una molécula con actividad biológica y especificidad por el antígeno adecuada (Morrison et al. 1984. Proc. Nati. Acad. Sci. 81 : 6851 -6855; Neuberger et al. 1984. Nature 312: 604-608; Takeda et al. 1985. Nature 314: 452-454). En forma alternativa, pueden adaptarse técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla usando métodos conocidos en la técnica, para producir anticuerpos de cadena sencilla específicos para los polipéptidos y fragmentos de esta invención. Pueden generarse anticuerpos con especificidad relacionada, pero de composición idiotípica distinta, por entremezclado de cadenas de colecciones de inmunoglobulina combinatorias aleatorias (Burton 1991. Proc. Nati. Acad. Sci. 88: 1 1 120-3). Pueden usarse varios inmunoensayos para identificar anticuerpos que tengan la especificidad deseada para las proteínas y los péptidos de esta invención. Numerosos protocolos para pruebas inmunorradiométricas o de unión competitiva usando anticuerpos monoclonales o policlonales con especificidad establecida, son bien conocidos en la técnica. Dichos inmunoensayos implican típicamente la medición de la formación de complejos entre un antígeno y su anticuerpo específico (por ejemplo, formación de complejos de antígeno/anticuerpo). Por ejemplo, puede usarse un inmunoensayo de base monoclonal de dos sitios usando anticuerpos monoclonales reactivos de dos epítopes no interferentes sobre las proteínas o los péptidos de esta invención, así como una prueba de unión competitiva. La presente invención se describe más particularmente en los siguientes ejemplos, los cuales se pretende que sean sólo ilustrativos, puesto que numerosas modificaciones y variaciones en la misma serán evidentes para los expertos en la técnica.

EJEMPLOS I. Actividad inmunorreguladora de la proteína A35R de poxyirus Tropismo celular. Varios tipos de células se dividieron en dos grupos de igual número para infección. Se infectó a un grupo con el virus de la vaccinia de tipo silvestre (Western Reserve o WR), y al otro con el mutante de deleción de A35R (virus de la vaccinia que no contiene la proteína A35R). Se infectó a las células a una multiplicidad de infección (MOI) de 1. Las células se incubaron entonces por aproximadamente 20 horas. Se realizaron tres ciclos de congelación/descongelación para liberar partículas virales recién formadas. Se hizo la medición de la replicación, titulando los lisados de células en una monocapa de células BS-C-1 y contando las placas que se formaron 40 horas después.

Cosecha/infección para la realización de pruebas. Se inyectó intraperitonealmente a una rata de 5 a 9 meses (cepa: Lewis X de DCM) con 20 ig de C. parvum en 5 mi de HBSS. Tres días después, se sacrificó a la rata, y se cosecharon los macrófagos (células de exudados perifonéales). Los macrófagos se contaron, y se distribuyeron en alícuotas en tres tubos cónicos de 15 mi antes de una incubación para infección por cinco horas a una MOI de 2. Cada grupo de tratamiento se lavó entonces y se sembró en un formato de 96 cavidades. Se realizaron seis diluciones de 1 :2 antes de la incubación con GPMBP 500 nM por 30 minutos. 25,000 clones RSL-1 1 CD4+ de ratas Lewis específicos para proteína básica de mielina, se añadieron a cada cavidad en volúmenes de 80 µ?. Las placas se incubaron por 24 horas a 37°C, C02 a 5%. Después de incubación, se trasf ¡rieron 150 µ? de sobrenadante a una placa de 96 cavidades vacía, y se congelaron para análisis posterior.

Prueba de óxido nítrico. Se transfirieron cincuenta microlitros del sobrenadante cosechado en otra placa de 96 cavidades, seguida de la adición de reactivo de Griess (sulfanilamida a 1 %-N-[1 -naftil]etilendiamina a 0.1 % en ácido fosfórico a 2.5%), en cada cavidad. Se leyó la absorbancia a 540 nm a intervalos de tiempo comenzando después de una incubación por cinco minutos a temperatura ambiente. Se lograron lecturas máximas después de una incubación por 1.5 a 2 horas.

Bioensavo de IL-2. Se transfirieron cincuenta microlitros de los sobrenadantes cosechados en otra placa de 96 cavidades. Se lavó un total de 50,000 clones CTLL (TIB-214 de ATCC), se resuspendieron en RPMIc, y se añadieron a las cavidades. Después de 48 horas de incubación a 37°C, CO2 a 5.0%, se añadieron 10 µ? de MTS/PMS a cada muestra. Se leyó la absorbancia a 492 nm, usando 690 nm como la longitud de onda de referencia.

Virus mutante VA35A. Para construir el virus muíante VA35A, se transfectaron células infectadas de tipo silvestre (WR) con un producto de PCR recombinante que contenía secuencias flanqueantes A34R y A36R con el gen de A35R intermedio reemplazado por el gen gpt de E. coli. El ?/?35? recombinante se seleccionó en medio que contenía ácido micofenólico (véase Roper 2006. "Characterization of the vaccinia virus A35R protein and its role in virulence" J. Virol. 80: 306-313; cuyo contenido entero se incorpora en la presente como referencia para estudios que sirven para caracterizar la proteína A35R de poxvirus).

Tropismo celular. Se estudió el crecimiento del virus mutante de deleción A35R y de tipo silvestre, en 18 tipos de células de seis animales diferentes (ratas, conejos, ratones, monos, hámsteres y humanos). En un estudio, se pusieron a prueba las siguientes líneas de células: células BS-C-1 (células de mono verde africano), esplenocitos de rata maduros, esplenocitos de rata jóvenes, timocitos de rata, células PC-12 diferenciadas, células PC-12 indiferenciadas, células RSL-11 activadas, células RSL-1 1 en reposo, PEC, CTLL, células de cerebro (Heldtilt), células HFF y células R1 -T. Se estableció una relación de replicación de A35 ipo silvestre. Estos estudios demostraron que PECs, CTLLs y R1 -Ts pueden tener tropismo, en donde el mutante de deleción tuvo por lo menos un éxito de replicación dos veces mayor que el tipo silvestre. La replicación igual fue consistente en células BS-C-1 , que se usaron como control.

Atenuación en ratones. Se anestesió a cuatro grupos de tratamiento (seis ratones cada uno) de ratones BALB/c hembras de 5 semanas de 14 a 17 g, y se desafió intranasalmente a los mismos con 04 unidades formadoras de partículas (pfu) de tipo silvestre (WR), 35Res (un virus de rescate producido diseñando un gen de A35R de tipo silvestre de nuevo en el genoma de ??35?) o 35Del (el virus mutante ??35?), o con PBS. El peso de los ratones en cada grupo se midió durante un período de días. Durante un período de 12 días, el grupo de tratamiento de deleción de A35R casi igualó al grupo control de PBS, porque ocurrió ganancia de peso gradual de 10 a 11%. Los grupos A35-Res y WR mostraron una pérdida de peso promedio de 16 a 26%, respectivamente, alrededor del día 12.

Oxido nítrico y bioensavo de IL-2. Volúmenes iguales de reactivo de Griess se añadieron a sobrenadantes para poner a prueba óxido nítrico en solución. Se usó un lector de placa de ELISA para leer la absorbancia. Los macrófagos infectados secretaron menos óxido nítrico que los macrófagos no infectados. Sin embargo, mayores niveles de óxido nítrico producidos por el tratamiento del mutante ?35?, sugieren que la presencia de la proteína A35R inhibe la secreción de óxido nítrico en macrófagos infectados. De esta manera, la presencia de A35R en macrófagos se asocia con inhibición de la secreción de óxido nítrico. Se pusieron a prueba sobrenadantes usando una línea de linfocitos T citotóxicos (CTLL-2), que prolifera con base en la concentración de IL-2 en solución. Se añadió MTS/PMS para medir la respiración dependiente de la cantidad de proliferación. Se obtuvo la absorbancia usando un lector de placa de ELISA. Estos estudios demostraron que los macrófagos infectados con el mutante ?35? estimularon a las células T para que secretaran más IL-2 en solución, que las células infectadas de tipo silvestre (WR) no infectadas. Esto indica que la proteína A35R restringe la capacidad de los macrófagos para estimular a las células T. Estudios adicionales no han demostrado efecto alguno de A35R, en 1 ) destrucción de linfocitos citotóxicos (CTL); 2) expresión de la clase I inducida por interferón-beta (IFN-ß) en timocitos; y 3) moléculas co-estimuladoras (moléculas B7.1) inducidas por interferón-gamma (IFN-?) en macrófagos.

II. Actividad de virulencia de la proteína A35R de poxyirus Determinación de virulencia en ratones. Se anestesió a grupos de 6 ratones BALB/c hembras de 6 semanas, y se desafió a los mismos intranasalmente con 104 a 106 pfu de virus ??35?, WR, vA35-Res, o PBS en 20 µ? de Tris-HCI 10 mM (pH 9.0). Se determinaron los títulos del virus en el día del desafío, para confirmar la dosis de virus. Se pesó a cada uno de los ratones cada dos días para monitorear su salud, y se sacrificó a los mismos si perdían 30% de su peso corporal. En un segundo experimento, se desafió a los ratones con 105 y 106 pfu, y se pesaron según se describió.

El virus mutante vA35A es atenuado en ratones. Durante el curso del experimento (14 días), los ratones desafiados con PBS o ??35? ganaron entre 10 a 11% en peso corporal, mientras que los ratones desafiados con 104 pfu de la cepa WR de vA35-Res o VV perdieron, en promedio, 16% y 26% de su peso corporal, respectivamente, alrededor del día 0. Dos ratones desafiados con WR (y no otros) murieron entre los días 9 y 1 1. Este experimento se repitió y se observó también atenuación de ??35? a mayores dosis de desafío. A 105 pfu, un ratón desafiado con ??35? murió, en comparación con cuatro con WR y seis con vA35-Res. Cuando se desafío a los mismos con 106 pfu, todos los ratones murieron, pero la supervivencia se incrementó en uno a dos días en los ratones ??35?. Con WR, dos ratones murieron en el día 6, y cuatro ratones murieron en el día 7. Cuando se desafío a los mismos con vA35-Res, los seis ratones murieron en el día 6; pero con ??35?, cuatro ratones murieron en el día 7, y dos sobrevivieron hasta el día 8. Estos datos indican que la proteína ??35? es importante para la virulencia en ratones. Aunque el presente procedimiento se ha descrito con relación a detalles específicos de ciertas modalidades del mismo, no se pretende que dichos detalles deban considerarse como limitaciones sobre el alcance de la invención, salvo en cuanto al grado que se incluyen en las reivindicaciones acompañantes. A lo largo de esta solicitud, se hace referencia a varias patentes y publicaciones no de patente. Las descripciones de estas patentes y publicaciones se incorporan de esta manera en su totalidad como referencia en esta solicitud, para describir más completamente el estado de la técnica a la cual esta invención pertenece.

CUADRO 1 Grupos ortólogos virales V2.0 (VOCS) Datos del virus CUADRO 1 (CONTINUACION) CUADRO 1 (CONTINUACION) CUADRO 1 (CONTINUACION) Grupos ortólogos virales V2.0 (VOCS) Genes en la familia "desconocida (Cop-A35RV Nombre ID del Nombre Inicio Detención Número de del gen GenBank del virus del ORF del ORF aminoácidos MOCV-1- I 45R 9629077 MOCV-1 163178 163879 233 YXV-Lau- 9633759 MYXV- 116937 117476 179 nil23R Laus SFV-Kas-sI23R 6578652 SFV-Kas 116088 116627 179 VARV-G-ar-A39R 5830703 VARV-Gar 136286 136468 60 VARV-Ind-A38R 9627663 VARV-kd 135262 135444 60 VACV-MVA- 2772791 VACV- 135418 135948 176 146R MVA VACV-COP-A35R 335511 VACV-Cop 143448 143978 176 VACV-Tan- 6969831 VACV-Tan 144144 · 144674 176 TA45R YLDV- 324R 12085107 Y3JDV 115059 115598 179 LSDV-Nce-124 15150563 LSDV- 114604 115179 191 Neeth PXV-Zre-A37R 17975060 MPXV-Zre 144036 144566 176 SWPV-Neb-121 18640207 SWPY-Neb 112809 113366 185 C LV- 96-154 18640388 CMLV-M96 146790 147320 176 ECTV-Mos-137 22164743 ECTV-Mos 152897 153427 176 RPXV-Utr-143 44971506 RPXV-Utr 149272 149805 177 SPPV-Tü-119 21492576 SPPV-TU 114222 114797 191 CPXV-BR-17! 20178533 CPXV-BR 161528 162058 176 CMLV-CMS- 19718123 CMLV- 144907 145437 176 152R CMS LSDV- 1959- 124 22595817 LSDV-1959 114440 115015 191 LSDV-NVarni-124 22595659 LSDV- 114610 115185 191 Warm ECTV- av-157 0 ECTV- av 150677 151207 176 VACV-WR-158 66275955 VACV-WR 144462 144992 176 CPXV-GR.T-A36R 30519528 CPXV-GRI 160934 161464 176 YMTV-124R 38229287 YMTV 109364 109942 192 ORFV- 32167505 ORFV- 111949 112488 179 NZ2JPatcnt-U 3 NZ2J?atent BPSV-AR02-1 10 410Í8863 BPSV- 112527 113081 184 AR02 ORFV- I82-108 41018598 ORFV-IA82 111489 112085 198 ORFV-SA00-108 4101S731 ORFV- 112723 113262 179 SA00 CUADRO 1 (CONTINUACION)

Claims (29)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1.- El uso de una proteína A35R o fragmento activo de la misma de virus de la vaccinia u otro poxvirus en la elaboración de un medicamento útil para modular una respuesta inmune en un sujeto.

2. - El uso de una proteína A35R o fragmento activo de la misma de virus de la vaccinia u otro poxvirus en la elaboración de un medicamento útil para tratar o prevenir un trastorno autoinmune en un sujeto.

3. - El uso de una proteína A35R o fragmento activo de la misma de virus de la vaccinia u otro poxvirus en la elaboración de un medicamento útil para reducir la probabilidad de rechazo de trasplante en un receptor de trasplante.

4.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 3, en donde el medicamento está adaptado para ser administrable al sujeto antes y/o después de que recibe el trasplante.

5. - El uso de un poxvirus diseñado para necesitar ácido nucleico que codifica para una proteína A35R, y/o para necesitar actividad de proteína A35R en la elaboración de una vacuna útil para aumentar una respuesta inmune en un sujeto.

6. - El uso de un vector de poxvirus que comprende ácido nucleico que codifica un antígeno heterólogo, y en donde el vector de poxvirus está diseñado para necesitar ácido nucleico que codifica para una proteína A35R y/o para necesitar actividad de proteína A35R en la elaboración de un medicamento útil para aumentar una respuesta inmune en un sujeto al antígeno heterólogo codificado por un vector de poxvirus.

7.- El uso de una proteína A35R o fragmento activo de la misma de proteína de virus de la vaccinia u otro poxvirus en la elaboración de un medicamento útil para tratar o prevenir una respuesta inmune perjudicial en un sujeto.

8. - El uso de una sustancia que inhiba la actividad de proteína A35R en la elaboración de un medicamento útil para tratar o prevenir una respuesta inmune perjudicial en un sujeto, en donde la respuesta inmune perjudicial es causada por actividad de proteína A35R.

9. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 8, en donde la respuesta inmune perjudicial es producida por un agente que comprende la proteína A35R o ácido nucleico que codifica para la proteína A35R.

10. - El uso de una sustancia con una proteína A35R o fragmento activo de la misma de virus de la vaccinia u otro poxvirus en la elaboración de un medicamento útil para aumentar un efecto inmunomodulador de la sustancia.

11. - El uso de un inhibidor de actividad de proteína A35R en la elaboración de un medicamento útil para tratar o prevenir una infección por poxvirus en un sujeto.

12. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 11 , en donde el inhibidor es un anticuerpo que une específicamente A35R.

13. - Un método para diagnosticar una infección por poxvirus en un sujeto, que comprende: a) poner en contacto una muestra del sujeto con un anticuerpo que une específicamente la proteína A35R bajo condiciones por las cuales puede formarse un complejo de antígeno/anticuerpo; y b) detectar la formación del complejo de antígeno-anticuerpo, diagnosticando de esta manera infección por poxvirus en un sujeto.

14. - Un método para diagnosticar infección por poxvirus en un sujeto, que comprende: a) poner en contacto una muestra del sujeto con una proteína A35R o fragmento antigénico de la misma bajo condiciones por las cuales pueda formarse un complejo de antígeno/anticuerpo; y b) detectar la formación del complejo de antígeno/anticuerpo, diagnosticando de esta manera la infección por poxvirus en un sujeto.

15.- Un método para detectar poxvirus en una muestra, que comprende: a) poner en contacto la muestra con un anticuerpo que une específicamente la proteína A35R bajo condiciones por las cuales pueda formarse un complejo de antígeno/anticuerpo; y b) detectar la formación del complejo de antígeno/anticuerpo, detectando de esta manera poxvirus en la muestra.

16.- Un método para detectar un anticuerpo para poxvirus en una muestra, que comprende: a) poner en contacto la muestra con una proteína A35R o fragmento antigénico de la misma bajo condiciones por las cuales pueda formarse un complejo de antígeno/anticuerpo; y b) detectar la formación del complejo de antígeno/anticuerpo, detectando de esta manera un anticuerpo para poxvirus en la muestra.

17. - Un método para identificar ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para proteína A35R en una muestra, que comprende: a) poner en contacto la muestra con un oligonucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos que codifica para proteína A35R, bajo condiciones por las cuales pueda ocurrir hibridación del ácido nucleico; y b) detectar la hibridación del ácido nucleico, detectando de esta manera ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para proteína A35R en la muestra.

18. - Un método para identificar ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para proteína A35R en una muestra, que comprende: a) poner en contacto la muestra con un par de oligonucleótidos iniciadores que son complementarios a la secuencia de nucleótidos que codifica para proteína A35R, bajo condiciones por las cuales pueda ocurrir amplificación del ácido nucleico; y b) detectar amplificación del ácido nucleico, detectando de esta manera ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para proteína A35R en la muestra.

19. - El uso de un poxvirus diseñado para necesitar actividad de proteína A35R en la elaboración de un medicamento útil para tratar cáncer en un sujeto.

20. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 19, en donde el medicamento comprende además ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste de: a) ácido nucleico que codifica para una molécula co-estimuladora (por ejemplo, B7.1 , ICAM-1 , LFA-3); b) ácido nucleico que codifica para un antígeno tumoral; y c) ácido nucleico que codifica para una proteína inmunomoduladora.

21. - Una composición que comprende proteína A35R y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

22. - Una composición que comprende un poxvirus diseñado para necesitar actividad de A35R y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

23. - El uso de un ácido nucleico que codifica para una proteína A35R o fragmento activo de la misma de virus de la vaccinia u otro poxvirus en la elaboración de un medicamento útil para modular una respuesta inmune en un sujeto.

24.- El uso de un ácido nucleico que codifica para una proteína A35R o fragmento activo de la misma de virus de la vaccinia u otro poxvirus en la elaboración de un medicamento útil para tratar o prevenir un trastorno autoinmune en un sujeto.

25.- El uso de un ácido nucleico que codifica para una proteína A35R o fragmento activo de la misma de virus de la vaccinia u otro poxvirus en la elaboración de un medicamento útil para reducir la probabilidad de rechazo de trasplante en un receptor de trasplante.

26. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 25, en donde el medicamento está adaptado para ser administrable al sujeto antes y/o después de que recibe el trasplante.

27. - El uso de un ácido nucleico que codifica para una proteína A35R o fragmento activo de la misma de virus de la vaccinia u otra proteína de poxvirus en la elaboración de un medicamento útil para tratar o prevenir una respuesta inmune perjudicial en un sujeto.

28. - El uso de una sustancia con un ácido nucleico que codifica para una proteína A35R o fragmento activo de la misma de virus de la vaccinia u otro poxvirus en la elaboración de un medicamento útil para aumentar un efecto inmunomodulador de la sustancia.

29. - Una composición que consiste esencialmente de una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína A35R de poxvirus y un vehículo farmacéuticamente aceptable.