CN116712536A - 针对痘病毒的信使核糖核酸疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明提供抗痘病毒疫苗，其含下列抗原和/或融合抗原的mRNA：(a)选自下列的一种以上的猴痘病毒抗原：A35R、M1R、B6R和A29L，和/或(b)选自下列的两种或多种猴痘病毒抗原或抗原的一部分融合而成的融合抗原：A35R、M1R、B6R和A29L。本发明还提供抗痘病毒疫苗制备用试剂盒，其含：(i)DNA，其编码：(a)选自下列的一种以上的猴痘病毒抗原：A35R、M1R、B6R和A29L，和/或(b)选自下列的两种或多种猴痘病毒抗原或抗原的一部分融合而成的融合抗原：A35R、M1R、B6R和A29L，及任选地(ii)用于将(i)的DNA转录成mRNA的试剂。本发明还提供制造上述疫苗和试剂盒的用途。

Description

针对痘病毒的信使核糖核酸疫苗
【技术领域】
本发明涉及抗痘病毒疫苗和抗痘病毒疫苗制备用试剂盒。本发明还涉及制造上述疫苗和试剂盒的用途。
【背景技术】
痘病毒(即痘病毒科(Poxviridae)病毒)是一类大型的致病性双链DNA病毒。
传染病疫苗是一种能够引起机体免疫应答，保护机体避免感染或者严重感染的物质，它可以是病原体本身，比如病毒，细菌，也可以是病原体的一部分，比如某个蛋白，也可以是编码病原体蛋白的遗传信息，比如其核糖核酸序列(RNA)或者脱氧核糖核酸序列(DNA)。
由于痘病毒科(Poxviridae)各病毒的基因及蛋白序列高度相似，因此用于一种痘病毒的疫苗也可以预防另一种痘病毒。目前市售的痘病毒疫苗有两种，均为全病毒疫苗。分别是ACAM2000和JYNNEOS。ACAM2000是一种可复制的牛痘病毒，接种后可能造成明显的副作用，比如全身性感染，湿疹，心肌炎甚至死亡。因此人们对该疫苗的安全性比较担心，接种该疫苗的意愿不高。JYNNEOS是一种复制缺陷型牛痘病毒，即不能在人体复制。但是由于其仍是全病毒，包含几百个蛋白，具体抗原信息不明确，而且有一些蛋白起到免疫调节功能，具体作用仍不清楚。因此，人们对该疫苗也有所担心。目前痘病毒的亚单位疫苗已有动物实验的相关报道，比如蛋白和DNA疫苗。蛋白通常需要借助体外细胞表达，纯化步骤比较复杂，而且由于是体外表达的产物，其三维结构有可能不同于病毒感染时的该蛋白结构，因而免疫原性的好坏存在不确定性。DNA疫苗制备相对简单，但是其递送需要借助基因枪，操作复杂，且有整合到人基因组的风险。因而也不是最佳疫苗选择。
【发明内容】
本发明涉及下列实施方式：
1.抗痘病毒疫苗，其含下列抗原和/或融合抗原的mRNA：
(a)选自下列的一种以上的猴痘病毒抗原：A35R、M1R、B6R和A29L，和/或
(b)选自下列的两种或多种猴痘病毒抗原或抗原的一部分融合而成的融合抗原：A35R、M1R、B6R和A29L。
2.根据实施方式1所述的疫苗，其中所述融合抗原是下列猴痘病毒抗原或抗原的一部分融合而成的融合抗原：A35R和M1R。
3.根据实施方式1或2所述的疫苗，其中所述融合抗原的5'端附加有信号肽。
4.根据实施方式1所述的疫苗，其中所述猴痘病毒抗原和融合抗原的编码DNA选自：
SEQ ID NO：1所示的A35R的编码DNA、
SEQ ID NO：3所示的M1R的编码DNA、
SEQ ID NO：5所示的A35R和M1R的融合抗原的编码DNA、
SEQ ID NO：7所示的A35R和M1R的融合抗原的编码DNA、
SEQ ID NO：9所示的B6R的编码DNA、和
SEQ ID NO：11所示的A29L的编码DNA。
5.根据实施方式4所述的疫苗，其中所述mRNA从5'到3'依次包含：
(1)5'帽，
(2)5'UTR，
(3)选自下列的编码DNA的对应RNA：
SEQ ID NO：1所示的A35R的编码DNA、
SEQ ID NO：3所示的M1R的编码DNA、
SEQ ID NO：5所示的A35R和M1R的融合抗原的编码DNA、
SEQ ID NO：7所示的A35R和M1R的融合抗原的编码DNA、
SEQ ID NO：9所示的B6R的编码DNA、和
SEQ ID NO：11所示的A29L的编码DNA，
(4)3'UTR，和
(5)多聚A尾。
6.根据实施方式5所述的疫苗，其中所述5'帽是m7(3'OMeG)(5')ppp(5')(2'OMeA)pG。
7.根据实施方式5所述的疫苗，其中
所述5'UTR的编码DNA的序列如SEQ ID NO：13所示，和/或
所述3'UTR的编码DNA的序列如SEQ ID NO：14所示。
8.根据实施方式5所述的疫苗，其中所述mRNA中的尿苷三磷酸是N1-甲基假尿苷三磷酸。
9.根据实施方式1所述的疫苗，其中所述mRNA选自：
SEQ ID NO：2所示的A35R的mRNA、
SEQ ID NO：4所示的M1R的mRNA、
SEQ ID NO：6所示的A35R和M1R的融合抗原的mRNA、
SEQ ID NO：8所示的A35R和M1R的融合抗原的mRNA、
SEQ ID NO：10所示的B6R的mRNA、和
SEQ ID NO：12所示的A29L的mRNA。
10.根据实施方式1所述的疫苗，其中，当所述疫苗含两种以上的mRNA的混合物时，
先将所述两种以上的mRNA各自包封后再彼此混合，或
先将所述两种以上的mRNA彼此混合后再一体包封。
11.根据实施方式1所述的疫苗，其中所述mRNA用脂质纳米颗粒包封。
12.下列抗原和/或融合抗原的mRNA在制造抗痘病毒疫苗中的用途：
(a)选自下列的一种以上的猴痘病毒抗原：A35R、M1R、B6R和A29L，和/或
(b)选自下列的两种或多种猴痘病毒抗原或抗原的一部分融合而成的融合抗原：A35R、M1R、B6R和A29L。
13.根据实施方式12所述的用途，其中所述融合抗原是下列猴痘病毒抗原或抗原的一部分融合而成的融合抗原：A35R和M1R。
14.根据实施方式12或13所述的用途，其中所述融合抗原的5'端附加有信号肽。
15.根据实施方式12所述的用途，其中所述猴痘病毒抗原和融合抗原的编码DNA选自：
SEQ ID NO：1所示的A35R的编码DNA、
SEQ ID NO：3所示的M1R的编码DNA、
SEQ ID NO：5所示的A35R和M1R的融合抗原的编码DNA、
SEQ ID NO：7所示的A35R和M1R的融合抗原的编码DNA、
SEQ ID NO：9所示的B6R的编码DNA、和
SEQ ID NO：11所示的A29L的编码DNA。
16.根据实施方式15所述的用途，其中所述mRNA从5'到3'依次包含：
(1)5'帽，
(2)5'UTR，
(3)选自下列的编码DNA的对应RNA：
SEQ ID NO：1所示的A35R的编码DNA、
SEQ ID NO：3所示的M1R的编码DNA、
SEQ ID NO：5所示的A35R和M1R的融合抗原的编码DNA、
SEQ ID NO：7所示的A35R和M1R的融合抗原的编码DNA、
SEQ ID NO：9所示的B6R的编码DNA、和
SEQ ID NO：11所示的A29L的编码DNA，
(4)3'UTR，和
(5)多聚A尾。
17.根据实施方式16所述的用途，其中所述5'帽是m7(3'OMeG)(5')ppp(5')(2'OMeA)pG。
18.根据实施方式16所述的用途，其中
所述5'UTR的编码DNA的序列如SEQ ID NO：13所示，和/或
所述3'UTR的编码DNA的序列如SEQ ID NO：14所示。
19.根据实施方式16所述的用途，其中所述mRNA中的尿苷三磷酸是N1-甲基假尿苷三磷酸。
20.根据实施方式12所述的用途，其中所述mRNA选自：
SEQ ID NO：2所示的A35R的mRNA、
SEQ ID NO：4所示的M1R的mRNA、
SEQ ID NO：6所示的A35R和M1R的融合抗原的mRNA、
SEQ ID NO：8所示的A35R和M1R的融合抗原的mRNA、
SEQ ID NO：10所示的B6R的mRNA、和
SEQ ID NO：12所示的A29L的mRNA。
21.根据实施方式12所述的用途，其中，当由两种以上的mRNA的混合物制造疫苗时，
先将所述两种以上的mRNA各自包封后再彼此混合，或
先将所述两种以上的mRNA彼此混合后再一体包封。
22.根据实施方式12所述的用途，其中所述mRNA用脂质纳米颗粒包封。
23.根据实施方式12所述的用途，其中所述疫苗用于抗选自下列的一种以上的属的痘病毒：正痘病毒属(Orthopoxvirus)、羊痘病毒属(Capripoxvirus)、鹿痘病毒属(Cervidpoxvirus)、猪痘病毒属(Suipoxvirus)、兔痘病毒属(Leporipoxvirus)、软疣痘病毒属(Molluscipoxvirus)、亚塔痘病毒属(Yatapoxvirus)、禽痘病毒属(Avipoxvirus)、鳄鱼痘病毒属(Crocodylidpoxvirus)和副痘病毒属(Parapoxvirus)。
24.根据实施方式12所述的用途，其中所述疫苗用于抗选自下列的一种以上的痘病毒：天花病毒(Variola virus/Smallpox virus)、痘苗病毒(Vaccinia virus)、牛痘病毒(Cowpox virus)、骆驼痘病毒(Camelpox virus)、小鼠脱脚病病毒(Ectromelia virus)、猴痘病毒(Monkeypox virus)、瓦辛基苏病病毒(Uasin Gishu disease virus)、非洲大沙鼠痘病毒(Tatera poxvirus)、浣熊痘病毒(Raccoonpox virus)、田鼠痘病毒(Volepoxvirus)、北美臭鼬痘病毒(Skunkpox virus)、绵羊痘病毒(Sheeppox virus)、山羊痘病毒(Goatpox virus)、疙瘩皮肤病病毒(Lumpy skin disease virus)、鹿痘病毒(Deerpoxvirus)、猪痘病毒(Swinepox virus)、粘液瘤病毒(Myxoma virus)、兔纤维瘤病毒(Rabbitfibroma virus)、野兔纤维瘤病毒(Hare fibroma virus)、松鼠纤维瘤病毒(Squirrelfibroma virus)、传染性软疣病毒(Molluscum contagiosum virus)、亚巴痘病毒(Yabapoxvirus)、塔纳痘病毒(Tanapox virus)、鸡痘病毒(Fowlpox virus)、金丝雀痘病毒(Canarypox virus)、乌鸦痘病毒(Crowpox virus)、雪鸡痘病毒(Juncopox virus)、家八哥痘病毒(Mynahpox virus)、鸽痘病毒(Pigeonpox virus)、鹦鹉痘病毒(Psittacinepoxvirus)、鹌鹑痘病毒(Quailpox virus)、麻雀痘病毒(Sparrowpox virus)、燕八哥痘病毒(Starlingpox virus)、火鸡痘病毒(Turkeypox virus)、鳄鱼痘病毒(Crocodilepoxvirus)、羊口疮病毒(Orf virus)、假牛痘病毒(Pseudocowpox virus)、牛丘疹性口炎病毒(Bovine papular stomatitis virus)、海豹痘病毒(Sealpox virus)、新西兰红鹿副痘病毒(Parapoxvirus of red deer in New Zealand)、鲤浮肿病毒(Carp edema virus)、鲑鱼鳃痘病毒(Salmonid gill poxvirus)和松鼠痘病毒(Squirrelpox virus)。
25.抗痘病毒疫苗制备用试剂盒，其含：
(i)DNA，其编码：
(a)选自下列的一种以上的猴痘病毒抗原：A35R、M1R、B6R和A29L，和/或
(b)选自下列的两种或多种猴痘病毒抗原或抗原的一部分融合而成的融合抗原：A35R、M1R、B6R和A29L，及
任选地(ii)用于将(i)的DNA转录成mRNA的试剂。
26.根据实施方式25所述的试剂盒，其中所述融合抗原是下列猴痘病毒抗原或抗原的一部分融合而成的融合抗原：A35R和M1R。
27.根据实施方式25或26所述的试剂盒，其中所述融合抗原的5'端附加有信号肽。
28.根据实施方式25所述的试剂盒，其中所述DNA选自：
SEQ ID NO：1所示的A35R的编码DNA、
SEQ ID NO：3所示的M1R的编码DNA、
SEQ ID NO：5所示的A35R和M1R的融合抗原的编码DNA、
SEQ ID NO：7所示的A35R和M1R的融合抗原的编码DNA、
SEQ ID NO：9所示的B6R的编码DNA、和
SEQ ID NO：11所示的A29L的编码DNA。
29.根据实施方式25所述的试剂盒，其中所述用于将(i)的DNA转录成mRNA的试剂是用于将(i)的DNA体外转录成mRNA的试剂。
30.根据实施方式29所述的试剂盒，其中所述用于将(i)的DNA体外转录成mRNA的试剂包含：
体外转录用核酸载体，其包含从5'到3'连接的启动子、5'UTR的编码DNA和3'UTR的编码DNA，
腺苷三磷酸、胞苷三磷酸、鸟苷三磷酸和尿苷三磷酸，
5'帽，及
RNA聚合酶。
31.根据实施方式30所述的试剂盒，其中
所述5'UTR的编码DNA的序列如SEQ ID NO：13所示，和/或
所述3'UTR的编码DNA的序列如SEQ ID NO：14所示。
32.根据实施方式30所述的试剂盒，其中所述5'帽是m7(3'OMeG)(5')ppp(5')(2'OMeA)pG。
33.根据实施方式30所述的试剂盒，其中所述尿苷三磷酸是N1-甲基假尿苷三磷酸。
34.根据实施方式30所述的试剂盒，其中所述RNA聚合酶是T7 RNA聚合酶。
35.下列物质在制造抗痘病毒疫苗制备用试剂盒中的用途：
(i)DNA，其编码：
(a)选自下列的一种以上的猴痘病毒抗原：A35R、M1R、B6R和A29L，和/或
(b)选自下列的两种或多种猴痘病毒抗原或抗原的一部分融合而成的融合抗原：A35R、M1R、B6R和A29L，及
任选地(ii)用于将(i)的DNA转录成mRNA的试剂。
36.根据实施方式35所述的用途，其中所述融合抗原是下列猴痘病毒抗原或抗原的一部分融合而成的融合抗原：A35R和M1R。
37.根据实施方式35或36所述的用途，其中所述融合抗原的5'端附加有信号肽。
38.根据实施方式35所述的用途，其中所述DNA选自：
SEQ ID NO：1所示的A35R的编码DNA、
SEQ ID NO：3所示的M1R的编码DNA、
SEQ ID NO：5所示的A35R和M1R的融合抗原的编码DNA、
SEQ ID NO：7所示的A35R和M1R的融合抗原的编码DNA、
SEQ ID NO：9所示的B6R的编码DNA、和
SEQ ID NO：11所示的A29L的编码DNA。
39.根据实施方式35所述的用途，其中所述用于将(i)的DNA转录成mRNA的试剂是用于将(i)的DNA体外转录成mRNA的试剂。
40.根据实施方式39所述的用途，其中所述用于将(i)的DNA体外转录成mRNA的试剂包含：
体外转录用核酸载体，其包含从5'到3'连接的启动子、5'UTR的编码DNA和3'UTR的编码DNA，
腺苷三磷酸、胞苷三磷酸、鸟苷三磷酸和尿苷三磷酸，
5'帽，及
RNA聚合酶。
41.根据实施方式40所述的用途，其中
所述5'UTR的编码DNA的序列如SEQ ID NO：13所示，和/或
所述3'UTR的编码DNA的序列如SEQ ID NO：14所示。
42.根据实施方式40所述的用途，其中所述5'帽是m7(3'OMeG)(5')ppp(5')(2'OMeA)pG。
43.根据实施方式40所述的用途，其中所述尿苷三磷酸是N1-甲基假尿苷三磷酸。
44.根据实施方式40所述的用途，其中所述RNA聚合酶是T7 RNA聚合酶。
45.根据实施方式35所述的用途，其中所述疫苗用于抗选自下列的一种以上的属的痘病毒：正痘病毒属(Orthopoxvirus)、羊痘病毒属(Capripoxvirus)、鹿痘病毒属(Cervidpoxvirus)、猪痘病毒属(Suipoxvirus)、兔痘病毒属(Leporipoxvirus)、软疣痘病毒属(Molluscipoxvirus)、亚塔痘病毒属(Yatapoxvirus)、禽痘病毒属(Avipoxvirus)、鳄鱼痘病毒属(Crocodylidpoxvirus)和副痘病毒属(Parapoxvirus)。
46.根据实施方式35所述的用途，其中所述疫苗用于抗选自下列的一种以上的痘病毒：天花病毒(Variola virus/Smallpox virus)、痘苗病毒(Vaccinia virus)、牛痘病毒(Cowpox virus)、骆驼痘病毒(Camelpox virus)、小鼠脱脚病病毒(Ectromelia virus)、猴痘病毒(Monkeypox virus)、瓦辛基苏病病毒(Uasin Gishu disease virus)、非洲大沙鼠痘病毒(Tatera poxvirus)、浣熊痘病毒(Raccoonpox virus)、田鼠痘病毒(Volepoxvirus)、北美臭鼬痘病毒(Skunkpox virus)、绵羊痘病毒(Sheeppox virus)、山羊痘病毒(Goatpox virus)、疙瘩皮肤病病毒(Lumpy skin disease virus)、鹿痘病毒(Deerpoxvirus)、猪痘病毒(Swinepox virus)、粘液瘤病毒(Myxoma virus)、兔纤维瘤病毒(Rabbitfibroma virus)、野兔纤维瘤病毒(Hare fibroma virus)、松鼠纤维瘤病毒(Squirrelfibroma virus)、传染性软疣病毒(Molluscum contagiosum virus)、亚巴痘病毒(Yabapoxvirus)、塔纳痘病毒(Tanapox virus)、鸡痘病毒(Fowlpox virus)、金丝雀痘病毒(Canarypox virus)、乌鸦痘病毒(Crowpox virus)、雪鸡痘病毒(Juncopox virus)、家八哥痘病毒(Mynahpox virus)、鸽痘病毒(Pigeonpox virus)、鹦鹉痘病毒(Psittacinepoxvirus)、鹌鹑痘病毒(Quailpox virus)、麻雀痘病毒(Sparrowpox virus)、燕八哥痘病毒(Starlingpox virus)、火鸡痘病毒(Turkeypox virus)、鳄鱼痘病毒(Crocodilepoxvirus)、羊口疮病毒(Orf virus)、假牛痘病毒(Pseudocowpox virus)、牛丘疹性口炎病毒(Bovine papular stomatitis virus)、海豹痘病毒(Sealpox virus)、新西兰红鹿副痘病毒(Parapoxvirus of red deer in New Zealand)、鲤浮肿病毒(Carp edema virus)、鲑鱼鳃痘病毒(Salmonid gill poxvirus)和松鼠痘病毒(Squirrelpox virus)。
【技术效果】
通过上述实施方式，本发明至少达到了如下技术效果：
(1)本发明的mRNA疫苗无需借助于细胞表达，无整合到人基因组的风险，mRNA的制备也简单易行，无需接触具有感染和繁殖能力的痘病毒，即可生产疫苗，规避了生物安全风险。
(2)本发明的mRNA疫苗无明显副作用，安全性高。
(3)得益于优化的序列及与翻译元件的组合，能够高效表达蛋白，产生有效的免疫应答。
【附图简述】
【图1】mRNA结构示意图，从5'到3'依次是：5'帽-5'UTR-编码序列-3'UTR-多聚A尾。编码序列是如下蛋白质(或融合蛋白质)抗原的RNA序列：A35R、M1R、SP-A35R_IECD-M1R、SP-A35R_sECD-M1R、B6R和A29L，其中“SP”表示信号肽(Signal peptide)。
【图2】对小鼠进行免疫处理的示意图。
【图3】对小鼠施用各组mRNA疫苗后第29天采集的血液中的总抗-A35R抗体、总抗-M1R抗体、总抗-B6R抗体和总抗-A29L抗体的水平。
【图4】对小鼠施用各组mRNA疫苗后第29天采集的血清中对牛痘病毒的中和抗体的水平(PFU/孔)。
【图5】施用各组mRNA疫苗的小鼠经牛痘病毒鼻内(intranasal)攻毒后的体重变化。
【图6】施用各组mRNA疫苗的小鼠经牛痘病毒鼻内(intranasal)攻毒后的肺中病毒载量。
【具体实施方式】
【痘病毒】
痘病毒科(Poxviridae)各病毒的基因及蛋白序列高度相似，用于一种痘病毒的疫苗往往也可以预防另一种痘病毒。因此，本发明的mRNA疫苗可用于下表所列的各类痘病毒科(Poxviridae)病毒的免疫。
【5'帽】
真核生物mRNA的5'端通常具有桥接的7-甲基鸟苷(m7G)帽子结构(Cap0)，Cap0结构中m7G后面第一个核苷的2'羟基甲基化后形成Cap1结构(m7GpppmN)。现有研究发现，5'端帽子结构可以调节mRNA的剪切成熟，并帮助RNA转录产物穿过核膜的选择性孔道而进入细胞质。此外，5'帽子结构还可以保护mRNA不被核酸外切酶降解，与翻译起始因子蛋白协同工作，招募核糖体，并协助核糖体与mRNA结合，使翻译从AUG开始。通常情况下，Cap结构可以与真核起始因子4E(eIF4E)在翻译起始阶段相互识别，开启后续翻译过程，同时Cap1结构能够极大降低mRNA在体内的免疫原性。
只要不妨碍本发明的技术效果的实现，可在本发明中使用的5'帽无特别限制。在优选的实施方式中，5'帽是Cap1-GAG(3'OMe)，即m7(3'OMeG)(5')ppp(5')(2'OMeA)pG，其分子式为C33H45N15O24P4，结构式如下；
在体外转录制备mRNA有不同的“加帽”方法，包括酶加帽、共转录加帽等。
酶法加帽是较为传统的加帽方式，该方法需在T7聚合酶参与的IVT反应结束后，先纯化获得未加帽的mRNA，再通过牛痘病毒加帽酶(兼具RNA三磷酸酯酶活性、鸟苷酰基转移酶活性和鸟嘌呤甲基转移酶活性)产生Cap0，再通过2'-O-甲基转移酶和S-腺苷甲硫氨酸转化为Cap1，再次纯化获得最终的mRNA。
一步法共转录加帽，就是在T7聚合酶参与的IVT反应体系中直接加入帽类似物，实现一步法获得含Cap1结构的mRNA，全程只需一次纯化。此法反应减少了制备步骤，进而有效缩短整体处理时间、简化纯化步骤，减少所需酶的数量。因此，化学法共转录加帽在工艺上相对简单，引入杂质少，能够迅速提升mRNA疫苗和药物的产能。目前，一步法共转录加帽正在逐步成为了mRNA制备工艺的主流技术路线。
【尿苷三磷酸(UTP)】
只要不妨碍本发明的技术效果的实现，可在本发明中使用的尿苷三磷酸无特别限制，可为天然的尿苷三磷酸或任何本领域常用的经修饰的尿苷三磷酸。在优选的实施方式中，UTP是N1-甲基假尿苷三磷酸(N1-Me-pUTP，通常表示为“Ψ”)，其分子式为C10H14N2Na3O15P3，结构式如下：
在mRNA疫苗和药物生产过程中掺入N1-甲基假尿苷三磷酸可提高mRNA的翻译效率并降低mRNA在体内的免疫原性。
【5'UTR和3'UTR】
只要不妨碍本发明的技术效果的实现，可在本发明中使用的5'UTR和3'UTR无特别限制。在优选的实施方式中，
5'UTR的编码DNA序列如下(SEQ ID NO：13)：
gcttgttctt tttgcagaag ctcagaataa acgctcaact ttggccgcca cc
3'UTR的编码DNA序列如下(SEQ ID NO：14)：
【抗原和融合抗原】
本发明中使用的痘病毒的免疫原优选为：
(a)选自下列的一种以上的猴痘病毒抗原：A35R、M1R、B6R和A29L，和/或
(b)选自下列的两种或多种猴痘病毒抗原或抗原的一部分融合而成的融合抗原：A35R、M1R、B6R和A29L。
在优选的实施方式中，融合抗原是下列猴痘病毒抗原或抗原的一部分融合而成的融合抗原：A35R和M1R。在进一步优选的实施方式中，A35R的完整细胞外结构域(integralextracellular domain，IECD)与M1R融合成融合抗原(A35R_IECD-M1R)。在另一个进一步优选的实施方式中，A35R的小细胞外结构域(small extracellular domain，sECD)与M1R融合成融合抗原(A35R_sECD-M1R)。在优选的实施方式中，融合抗原的5'端可附加有信号肽(Signal Peptide，SP)。
只要不妨碍本发明的技术效果的实现，可在本发明中使用的上述抗原和融合抗原的DNA序列和mRNA序列无特别限制，可为来源于痘病毒科(Poxviridae)的任何病毒的上述抗原和融合抗原的DNA序列和mRNA序列。在优选的实施方式中，本发明中使用来源于正痘病毒属(Orthopoxvirus)的上述抗原和融合抗原的DNA序列和mRNA序列。在优选的实施方式中，本发明中使用来源于猴痘病毒(Monkeypox virus)的上述抗原和融合抗原的DNA序列和mRNA序列。在进一步优选的实施方式中，上述抗原和融合抗原的DNA序列和mRNA序列如下：
【A35R】
[DNA](SEQ ID NO：1)
[mRNA](SEQ ID NO：2)
【M1R】
[DNA](SEQ ID NO：3)
[mRNA](SEQ ID NO：4)
【SP-A35R_IECD-M1R】
[DNA](SEQ ID NO：5)
[mRNA](SEQ ID NO：6)
【SP-A35R_sECD-M1R】
[DNA](SEQ ID NO：7)
[mRNA](SEQ ID NO：8)
【B6R】
[DNA](SEQ ID NO：9)
[mRNA](SEQ ID NO：10)
【A29L】
[DNA](SEQ ID NO：11)
[mRNA](SEQ ID NO：12)
【mRNA的包封载体及利用该载体的递送方式】
由于裸mRNA无法有效进入机体的细胞内进行蛋白表达，且mRNA的稳定性较差，易降解，所以本发明的mRNA疫苗优选包封在保护性载体中。只要足以保持本发明的mRNA疫苗在足够长的时间不降解，且不妨碍本发明的技术效果的实现，可在本发明中使用的mRNA的包封载体无特别限制。在优选的实施方式中，本发明中使用纳米颗粒型载体包封mRNA。在进一步优选的实施方式中，本发明中使用包含脂质的纳米颗粒(也称为“脂质纳米颗粒(lipidnanopartical,LNP)”)包封mRNA。在进一步优选的实施方式中，LNP可以包括但不限于脂质体和胶束。在具体的实施方式中，所述脂质纳米颗粒可以包括阳离子和/或可离子化的脂质、阴离子脂质、中性脂质、两亲性脂质、聚乙二醇化的脂质和/或结构性脂质。
在一个具体实施方式中，所述LNP可包含一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7或8)阳离子和/或可离子化的脂质。“阳离子脂质”通常指在一定pH(例如，生理pH)下携带任意数目的净正电荷的脂质。所述阳离子脂质可包括但不限于SM102、3-(双十二烷基氨基)-N1,N1,4-三十二烷基-1-哌嗪乙胺(KL10)、N1-[2-(二十二烷基氨基)乙基]-N1,N4,N4-三十二烷基-1,4-哌嗪二乙胺(KL22)、14,25-二十三烷基-15,18,21,24-四氮杂八孔并烷(KL25)、DLin-DMA、DLin-K-DMA、DLin-KC2-DMA、辛基-CLinDMA、辛基-CLinDMA(2S)、DODAC、DOTMA、DDAB、DOTAP、DOTAP.C1、DC-Choi、DOSPA、DOGS、DODAP、DODMA和DMRIE。
在某些实施方式中，所述阳离子脂质在脂质纳米颗粒中的摩尔比例为约40～70％，例如，约40～65％、约40～60％、约45～55％或约48～53％。
在一个具体实施方式中，所述LNP可包含一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7或8)非阳离子脂质。所述非阳离子脂质可以包括阴离子脂质。适用于本申请的脂质纳米颗粒的阴离子脂质可包括磷脂酰甘油、心磷脂、二酰基磷脂酰丝氨酸、二酰基磷脂酸、N-十二烷酰基磷脂酰乙醇胺、N-琥珀酰基磷脂酰乙醇胺、N-戊二酰基磷脂酰磷酸乙醇基，以及其他连接了阴离子基团的中性脂质。
在更具体的实施方式中，所述非阳离子脂质可以包括中性脂质，所述中性脂质可例如包括磷脂，例如二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰基油酰基-磷脂酰乙醇胺(POPE)、二油酰基-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰基磷脂酰基乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰基-磷脂酰基-乙醇胺(DSPE)、16-O-单甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺(SOPE)，或其混合物。另外，可以使用具有饱和和不饱和脂肪酸链的混合物的脂质。例如，本申请所述的中性脂质可以选自DOPE、DSPC、DPPC、POPC或任何相关的磷脂酰胆碱。
在某些实施方式中，所述磷脂在脂质纳米颗粒中的摩尔比例为约5～20％。
在某些实施方式中，所述LNP可包含脂质缀合物，例如，聚乙二醇(PEG)修饰的脂质和衍生的脂质。PEG修饰的脂质可包括但不限于与具有C6～C20长度的烷基链的脂质共价连接的长度至多为5kDa的聚乙二醇链。这些组分的加入可防止脂质聚集，也可增加循环持续时间，易于脂质-核酸组合物递送至靶细胞，或快速释放出核酸。例如，所述聚乙二醇(PEG)修饰的脂分子可以是具有较短的酰基链(例如，C14或C18)的PEG-神经酰胺。在某些实施方式中，所述聚乙二醇(PEG)修饰的脂分子在脂质纳米颗粒中的摩尔比例为约0.5～2％，例如，约1～2％、约1.2～1.8％或约1.4～1.6％。在某些实施方式中，所述聚乙二醇(PEG)修饰的脂分子可以为PEG2000-DMG。
在某些实施方式中，所述LNP还可包含胆固醇。在某些实施方式中，所述胆固醇在脂质纳米颗粒中的摩尔比例为约30～50％，例如，约35～45％、或约38～42％。
在某些实施方式中，所述LNP可包括阳离子脂质、胆固醇、磷脂以及聚乙二醇修饰的脂分子。在某些实施方式中，所述阳离子脂质、胆固醇、磷脂以及聚乙二醇修饰的脂分子的摩尔比可以为45～55：35～45：5～15：0.5～2。
利用上述包封载体的递送方式无特别限制，可采用任何本领域常规使用的递送方式，例如可采用US20160376224A1或WO2015199952A1中提到的递送方式。
【实施例】
【实施例1：mRNA疫苗的制备】
得到下表1中所列的来源于猴痘病毒的几种蛋白质(或融合蛋白质)抗原的编码DNA的序列。
【表1：来源于猴痘病毒的几种蛋白质(或融合蛋白质)抗原及其编码DNA的序列】
蛋白质(或融合蛋白质)抗原 编码DNA的序列
A35R SEQ ID NO：1
M1R SEQ ID NO：3
SP-A35R_IECD-M1R SEQ ID NO：5
SP-A35R_sECD-M1R SEQ ID NO：7
B6R SEQ ID NO：9
A29L SEQ ID NO：11
向上表1中所列的编码DNA的序列插入到基于T7 RNA聚合酶的体外转录(in vitrotranscription，IVT)用载体中的T7启动子的下游的5'非翻译区(UTR)(SEQ ID NO：13)和3'UTR(SEQ ID NO：14)之间，作为IVT模板使用。
根据下表2制备20μL的IVT反应体系。
【表2：20μL的IVT反应体系】
组分 量
10×反应缓冲液(诺唯赞，DD4101R-02) 2μL
100mM ATP溶液(诺唯赞，DD4106-PA-01) 2μL
100mM CTP溶液(诺唯赞，DD4107-PA-01) 2μL
100mM GTP溶液(诺唯赞，DD4108-PA-01) 2μL
100mM N1-Me-pUTP溶液(诺唯赞，DD4114-PA-01) 2μL
IVT模板 1μg
Cap1-GAG(3'OMe)(诺唯赞,DD4119-PC-01) 2μL
T7 RNA聚合酶(250U/μL)(诺唯赞，DD4101-02) 1μL
无机焦磷酸酶(诺唯赞，D4103-PC-02) 0.04U
无RNA酶的ddH2O(碧云天，R0022) 至20μL
进行IVT，并将转录产物纯化而得到下表3所示的mRNA(图1)。
【表3：mRNA】
蛋白质(或融合蛋白质)抗原 mRNA的序列
A35R SEQ ID NO：2
M1R SEQ ID NO：4
SP-A35R_IECD-M1R SEQ ID NO：6
SP-A35R_sECD-M1R SEQ ID NO：8
B6R SEQ ID NO：10
A29L SEQ ID NO：12
将上表3中所列的mRNA或其组合用脂质纳米颗粒(lipid nanopartical,LNP)包封，制备下表4所示的各组mRNA疫苗(LNP-mRNA)。
【表4：各组mRNA疫苗】
【实施例2：mRNA疫苗的施用及功效】
(1)mRNA疫苗的施用
如图2所示，将实施例1中制备的各组mRNA疫苗(LNP-mRNA)在第0天通过肌肉注射初始(Prime)施用给小鼠，并在第14天通过肌肉注射追加(Boost)施用给该小鼠。对照组施用Dulbecco氏磷酸缓冲盐水(DPBS，赛默飞，14190136)。
在对小鼠施用各组mRNA疫苗后第7、13、29和35天采血。在对小鼠施用各组mRNA疫苗后第30天采集脾脏。在对小鼠施用各组mRNA疫苗后第36天用牛痘病毒通过鼻内(intranasal)途径攻毒。
(2)总抗体浓度的测定
对于在对小鼠施用各组mRNA疫苗后第29天采集的血液，通过测定450nm处的吸光度(OD450)来检测其中总抗-A35R抗体、总抗-M1R抗体、总抗-B6R抗体和总抗-A29L抗体的浓度(图3)。
如图3所示，在对小鼠施用各组mRNA疫苗后，
·各试验组的血液中的总抗-A35R抗体水平均显著升高，A-B组2、A+B组1、A+B组2、A+B+C+D组1和A+B+C+D组2的血液中的总抗-A35R抗体水平升高更为显著，其中也以A-B组2、A+B组1、A+B组2的血液中的总抗-A35R抗体水平升高最为显著；
·各试验组的血液中的总抗-M1R抗体水平均有升高，A-B组1、A-B组2、A+B组2和A+B+C+D组2的血液中的总抗-M1R抗体水平升高更为显著，其中也以A-B组1、A-B组2和A+B组2的血液中的总抗-M1R抗体水平升高最为显著；
·A+B+C+D组1和A+B+C+D组2的血液中的总抗-B6R抗体水平显著升高；
·A+B+C+D组1和A+B+C+D组2的血液中的总抗-A29L抗体水平显著升高。
(3)血清中和试验
从在对小鼠施用各组mRNA疫苗后第29天采集的血液中分离血清，将其以1:2n(n＝正整数)稀释而制成稀释系列。
取牛痘病毒原液，将其稀释成400～500个PFU(空斑形成单位)/ml。
将上述血清稀释系列与上述病毒稀释液在96孔板中等体积混合，并于37℃温育1小时。随后测定各混合液的PFU。将相比未添加血清的对照组而使PFU减少50％的血清稀释度设为该血清的中和抗体价。
如4中显示了对小鼠施用各组mRNA疫苗后第29天采集的血清中对牛痘病毒的中和抗体水平(PFU/孔)。
如图4所示，在对小鼠施用各组mRNA疫苗后，A-B组1、A-B组2和A+B组2的血清实现了对牛痘病毒的完全中和，说明其中对牛痘病毒的中和抗体水平最充裕。
(4)病毒攻击后的体重变化
在对小鼠施用各组mRNA疫苗后第36天，用牛痘病毒通过鼻内(intranasal)施用攻击该经处理小鼠，此后连续多天对该经处理小鼠进行称重。
如图5所示，与施用DPBS的对照组形成鲜明对比，施用各组mRNA疫苗的小鼠未因牛痘病毒的攻击而发生明显的体重变化。
(5)病毒攻击后肺中病毒载量的变化
将上述(4)的小鼠处死，采集肺组织，测定其中的病毒载量(viral load)(PFU/g)。
如图6所示，与施用DPBS的对照组形成鲜明对比，施用各组mRNA疫苗的小鼠肺中的病毒载量均趋近于0。这表明，各组mRNA疫苗均呈现显著的抗牛痘病毒免疫功效。

Claims (46)

1.抗痘病毒疫苗，其含下列抗原和/或融合抗原的mRNA：
(a)选自下列的一种以上的猴痘病毒抗原：A35R、M1R、B6R和A29L，和/或
(b)选自下列的两种或多种猴痘病毒抗原或抗原的一部分融合而成的融合抗原：A35R、M1R、B6R和A29L。
2.根据权利要求1所述的疫苗，其中所述融合抗原是下列猴痘病毒抗原或抗原的一部分融合而成的融合抗原：A35R和M1R。
3.根据权利要求1或2所述的疫苗，其中所述融合抗原的5'端附加有信号肽。
4.根据权利要求1所述的疫苗，其中所述猴痘病毒抗原和融合抗原的编码DNA选自：
SEQ ID NO：1所示的A35R的编码DNA、
SEQ ID NO：3所示的M1R的编码DNA、
SEQ ID NO：5所示的A35R和M1R的融合抗原的编码DNA、
SEQ ID NO：7所示的A35R和M1R的融合抗原的编码DNA、
SEQ ID NO：9所示的B6R的编码DNA、和
SEQ ID NO：11所示的A29L的编码DNA。
5.根据权利要求4所述的疫苗，其中所述mRNA从5'到3'依次包含：
(1)5'帽，
(2)5'UTR，
(3)选自下列的编码DNA的对应RNA：
SEQ ID NO：1所示的A35R的编码DNA、
SEQ ID NO：3所示的M1R的编码DNA、
SEQ ID NO：5所示的A35R和M1R的融合抗原的编码DNA、
SEQ ID NO：7所示的A35R和M1R的融合抗原的编码DNA、
SEQ ID NO：9所示的B6R的编码DNA、和
SEQ ID NO：11所示的A29L的编码DNA，
(4)3'UTR，和
(5)多聚A尾。
6.根据权利要求5所述的疫苗，其中所述5'帽是m7(3'OMeG)(5')ppp(5')(2'OMeA)pG。
7.根据权利要求5所述的疫苗，其中
所述5'UTR的编码DNA的序列如SEQ ID NO：13所示，和/或
所述3'UTR的编码DNA的序列如SEQ ID NO：14所示。
8.根据权利要求5所述的疫苗，其中所述mRNA中的尿苷三磷酸是N1-甲基假尿苷三磷酸。
9.根据权利要求1所述的疫苗，其中所述mRNA选自：
SEQ ID NO：2所示的A35R的mRNA、
SEQ ID NO：4所示的M1R的mRNA、
SEQ ID NO：6所示的A35R和M1R的融合抗原的mRNA、
SEQ ID NO：8所示的A35R和M1R的融合抗原的mRNA、
SEQ ID NO：10所示的B6R的mRNA、和
SEQ ID NO：12所示的A29L的mRNA。
10.根据权利要求1所述的疫苗，其中，当所述疫苗含两种以上的mRNA的混合物时，
先将所述两种以上的mRNA各自包封后再彼此混合，或
先将所述两种以上的mRNA彼此混合后再一体包封。
11.根据权利要求1所述的疫苗，其中所述mRNA用脂质纳米颗粒包封。
12.下列抗原和/或融合抗原的mRNA在制造抗痘病毒疫苗中的用途：
(a)选自下列的一种以上的猴痘病毒抗原：A35R、M1R、B6R和A29L，和/或
(b)选自下列的两种或多种猴痘病毒抗原或抗原的一部分融合而成的融合抗原：A35R、M1R、B6R和A29L。
13.根据权利要求12所述的用途，其中所述融合抗原是下列猴痘病毒抗原或抗原的一部分融合而成的融合抗原：A35R和M1R。
14.根据权利要求12或13所述的用途，其中所述融合抗原的5'端附加有信号肽。
15.根据权利要求12所述的用途，其中所述猴痘病毒抗原和融合抗原的编码DNA选自：
SEQ ID NO：1所示的A35R的编码DNA、
SEQ ID NO：3所示的M1R的编码DNA、
SEQ ID NO：5所示的A35R和M1R的融合抗原的编码DNA、
SEQ ID NO：7所示的A35R和M1R的融合抗原的编码DNA、
SEQ ID NO：9所示的B6R的编码DNA、和
SEQ ID NO：11所示的A29L的编码DNA。
16.根据权利要求15所述的用途，其中所述mRNA从5'到3'依次包含：
(1)5'帽，
(2)5'UTR，
(3)选自下列的编码DNA的对应RNA：
SEQ ID NO：1所示的A35R的编码DNA、
SEQ ID NO：3所示的M1R的编码DNA、
SEQ ID NO：5所示的A35R和M1R的融合抗原的编码DNA、
SEQ ID NO：7所示的A35R和M1R的融合抗原的编码DNA、
SEQ ID NO：9所示的B6R的编码DNA、和
SEQ ID NO：11所示的A29L的编码DNA，
(4)3'UTR，和
(5)多聚A尾。
17.根据权利要求16所述的用途，其中所述5'帽是m7(3'OMeG)(5')ppp(5')(2'OMeA)pG。
18.根据权利要求16所述的用途，其中
所述5'UTR的编码DNA的序列如SEQ ID NO：13所示，和/或
所述3'UTR的编码DNA的序列如SEQ ID NO：14所示。
19.根据权利要求16所述的用途，其中所述mRNA中的尿苷三磷酸是N1-甲基假尿苷三磷酸。
20.根据权利要求12所述的用途，其中所述mRNA选自：
SEQ ID NO：2所示的A35R的mRNA、
SEQ ID NO：4所示的M1R的mRNA、
SEQ ID NO：6所示的A35R和M1R的融合抗原的mRNA、
SEQ ID NO：8所示的A35R和M1R的融合抗原的mRNA、
SEQ ID NO：10所示的B6R的mRNA、和
SEQ ID NO：12所示的A29L的mRNA。
21.根据权利要求12所述的用途，其中，当由两种以上的mRNA的混合物制造疫苗时，
先将所述两种以上的mRNA各自包封后再彼此混合，或
先将所述两种以上的mRNA彼此混合后再一体包封。
22.根据权利要求12所述的用途，其中所述mRNA用脂质纳米颗粒包封。
23.根据权利要求12所述的用途，其中所述疫苗用于抗选自下列的一种以上的属的痘病毒：正痘病毒属(Orthopoxvirus)、羊痘病毒属(Capripoxvirus)、鹿痘病毒属(Cervidpoxvirus)、猪痘病毒属(Suipoxvirus)、兔痘病毒属(Leporipoxvirus)、软疣痘病毒属(Molluscipoxvirus)、亚塔痘病毒属(Yatapoxvirus)、禽痘病毒属(Avipoxvirus)、鳄鱼痘病毒属(Crocodylidpoxvirus)和副痘病毒属(Parapoxvirus)。
24.根据权利要求12所述的用途，其中所述疫苗用于抗选自下列的一种以上的痘病毒：天花病毒(Variola virus/Smallpox virus)、痘苗病毒(Vaccinia virus)、牛痘病毒(Cowpox virus)、骆驼痘病毒(Camelpox virus)、小鼠脱脚病病毒(Ectromelia virus)、猴痘病毒(Monkeypox virus)、瓦辛基苏病病毒(Uasin Gishu disease virus)、非洲大沙鼠痘病毒(Tatera poxvirus)、浣熊痘病毒(Raccoonpox virus)、田鼠痘病毒(Volepoxvirus)、北美臭鼬痘病毒(Skunkpox virus)、绵羊痘病毒(Sheeppox virus)、山羊痘病毒(Goatpox virus)、疙瘩皮肤病病毒(Lumpy skin disease virus)、鹿痘病毒(Deerpoxvirus)、猪痘病毒(Swinepox virus)、粘液瘤病毒(Myxoma virus)、兔纤维瘤病毒(Rabbitfibroma virus)、野兔纤维瘤病毒(Hare fibroma virus)、松鼠纤维瘤病毒(Squirrelfibroma virus)、传染性软疣病毒(Molluscum contagiosum virus)、亚巴痘病毒(Yabapox virus)、塔纳痘病毒(Tanapox virus)、鸡痘病毒(Fowlpox virus)、金丝雀痘病毒(Canarypox virus)、乌鸦痘病毒(Crowpox virus)、雪鸡痘病毒(Juncopox virus)、家八哥痘病毒(Mynahpox virus)、鸽痘病毒(Pigeonpox virus)、鹦鹉痘病毒(Psittacinepoxvirus)、鹌鹑痘病毒(Quailpox virus)、麻雀痘病毒(Sparrowpox virus)、燕八哥痘病毒(Starlingpox virus)、火鸡痘病毒(Turkeypox virus)、鳄鱼痘病毒(Crocodilepoxvirus)、羊口疮病毒(Orf virus)、假牛痘病毒(Pseudocowpox virus)、牛丘疹性口炎病毒(Bovine papular stomatitis virus)、海豹痘病毒(Sealpox virus)、新西兰红鹿副痘病毒(Parapoxvirus of red deer in New Zealand)、鲤浮肿病毒(Carp edema virus)、鲑鱼鳃痘病毒(Salmonid gillpoxvirus)和松鼠痘病毒(Squirrelpox virus)。
25.抗痘病毒疫苗制备用试剂盒，其含：
(i)DNA，其编码：
(a)选自下列的一种以上的猴痘病毒抗原：A35R、M1R、B6R和A29L，和/或
(b)选自下列的两种或多种猴痘病毒抗原或抗原的一部分融合而成的融合抗原：A35R、M1R、B6R和A29L，及
任选地(ii)用于将(i)的DNA转录成mRNA的试剂。
26.根据权利要求25所述的试剂盒，其中所述融合抗原是下列猴痘病毒抗原或抗原的一部分融合而成的融合抗原：A35R和M1R。
27.根据权利要求25或26所述的试剂盒，其中所述融合抗原的5'端附加有信号肽。
28.根据权利要求25所述的试剂盒，其中所述DNA选自：
SEQ ID NO：1所示的A35R的编码DNA、
SEQ ID NO：3所示的M1R的编码DNA、
SEQ ID NO：5所示的A35R和M1R的融合抗原的编码DNA、
SEQ ID NO：7所示的A35R和M1R的融合抗原的编码DNA、
SEQ ID NO：9所示的B6R的编码DNA、和
SEQ ID NO：11所示的A29L的编码DNA。
29.根据权利要求25所述的试剂盒，其中所述用于将(i)的DNA转录成mRNA的试剂是用于将(i)的DNA体外转录成mRNA的试剂。
30.根据权利要求29所述的试剂盒，其中所述用于将(i)的DNA体外转录成mRNA的试剂包含：
体外转录用核酸载体，其包含从5'到3'连接的启动子、5'UTR的编码DNA和3'UTR的编码DNA，
腺苷三磷酸、胞苷三磷酸、鸟苷三磷酸和尿苷三磷酸，
5'帽，及
RNA聚合酶。
31.根据权利要求30所述的试剂盒，其中
所述5'UTR的编码DNA的序列如SEQ ID NO：13所示，和/或
所述3'UTR的编码DNA的序列如SEQ ID NO：14所示。
32.根据权利要求30所述的试剂盒，其中所述5'帽是m7(3'OMeG)(5')ppp(5')(2'OMeA)pG。
33.根据权利要求30所述的试剂盒，其中所述尿苷三磷酸是N1-甲基假尿苷三磷酸。
34.根据权利要求30所述的试剂盒，其中所述RNA聚合酶是T7 RNA聚合酶。
35.下列物质在制造抗痘病毒疫苗制备用试剂盒中的用途：
(i)DNA，其编码：
(a)选自下列的一种以上的猴痘病毒抗原：A35R、M1R、B6R和A29L，和/或
(b)选自下列的两种或多种猴痘病毒抗原或抗原的一部分融合而成的融合抗原：A35R、M1R、B6R和A29L，及
任选地(ii)用于将(i)的DNA转录成mRNA的试剂。
36.根据权利要求35所述的用途，其中所述融合抗原是下列猴痘病毒抗原或抗原的一部分融合而成的融合抗原：A35R和M1R。
37.根据权利要求35或36所述的用途，其中所述融合抗原的5'端附加有信号肽。
38.根据权利要求35所述的用途，其中所述DNA选自：
SEQ ID NO：1所示的A35R的编码DNA、
SEQ ID NO：3所示的M1R的编码DNA、
SEQ ID NO：5所示的A35R和M1R的融合抗原的编码DNA、
SEQ ID NO：7所示的A35R和M1R的融合抗原的编码DNA、
SEQ ID NO：9所示的B6R的编码DNA、和
SEQ ID NO：11所示的A29L的编码DNA。
39.根据权利要求35所述的用途，其中所述用于将(i)的DNA转录成mRNA的试剂是用于将(i)的DNA体外转录成mRNA的试剂。
40.根据权利要求39所述的用途，其中所述用于将(i)的DNA体外转录成mRNA的试剂包含：
体外转录用核酸载体，其包含从5'到3'连接的启动子、5'UTR的编码DNA和3'UTR的编码DNA，
腺苷三磷酸、胞苷三磷酸、鸟苷三磷酸和尿苷三磷酸，
5'帽，及
RNA聚合酶。
41.根据权利要求40所述的用途，其中
所述5'UTR的编码DNA的序列如SEQ ID NO：13所示，和/或
所述3'UTR的编码DNA的序列如SEQ ID NO：14所示。
42.根据权利要求40所述的用途，其中所述5'帽是m7(3'OMeG)(5')ppp(5')(2'OMeA)pG。
43.根据权利要求40所述的用途，其中所述尿苷三磷酸是N1-甲基假尿苷三磷酸。
44.根据权利要求40所述的用途，其中所述RNA聚合酶是T7 RNA聚合酶。
45.根据权利要求35所述的用途，其中所述疫苗用于抗选自下列的一种以上的属的痘病毒：正痘病毒属(Orthopoxvirus)、羊痘病毒属(Capripoxvirus)、鹿痘病毒属(Cervidpoxvirus)、猪痘病毒属(Suipoxvirus)、兔痘病毒属(Leporipoxvirus)、软疣痘病毒属(Molluscipoxvirus)、亚塔痘病毒属(Yatapoxvirus)、禽痘病毒属(Avipoxvirus)、鳄鱼痘病毒属(Crocodylidpoxvirus)和副痘病毒属(Parapoxvirus)。
46.根据权利要求35所述的用途，其中所述疫苗用于抗选自下列的一种以上的痘病毒：天花病毒(Variola virus/Smallpox virus)、痘苗病毒(Vaccinia virus)、牛痘病毒(Cowpox virus)、骆驼痘病毒(Camelpox virus)、小鼠脱脚病病毒(Ectromelia virus)、猴痘病毒(Monkeypox virus)、瓦辛基苏病病毒(Uasin Gishu disease virus)、非洲大沙鼠痘病毒(Tatera poxvirus)、浣熊痘病毒(Raccoonpox virus)、田鼠痘病毒(Volepoxvirus)、北美臭鼬痘病毒(Skunkpox virus)、绵羊痘病毒(Sheeppox virus)、山羊痘病毒(Goatpox virus)、疙瘩皮肤病病毒(Lumpy skin disease virus)、鹿痘病毒(Deerpoxvirus)、猪痘病毒(Swinepox virus)、粘液瘤病毒(Myxoma virus)、兔纤维瘤病毒(Rabbitfibroma virus)、野兔纤维瘤病毒(Hare fibroma virus)、松鼠纤维瘤病毒(Squirrelfibroma virus)、传染性软疣病毒(Molluscum contagiosum virus)、亚巴痘病毒(Yabapox virus)、塔纳痘病毒(Tanapox virus)、鸡痘病毒(Fowlpox virus)、金丝雀痘病毒(Canarypox virus)、乌鸦痘病毒(Crowpox virus)、雪鸡痘病毒(Juncopox virus)、家八哥痘病毒(Mynahpox virus)、鸽痘病毒(Pigeonpox virus)、鹦鹉痘病毒(Psittacinepoxvirus)、鹌鹑痘病毒(Quailpox virus)、麻雀痘病毒(Sparrowpox virus)、燕八哥痘病毒(Starlingpox virus)、火鸡痘病毒(Turkeypox virus)、鳄鱼痘病毒(Crocodilepoxvirus)、羊口疮病毒(Orf virus)、假牛痘病毒(Pseudocowpox virus)、牛丘疹性口炎病毒(Bovine papular stomatitis virus)、海豹痘病毒(Sealpox virus)、新西兰红鹿副痘病毒(Parapoxvirus of red deer in New Zealand)、鲤浮肿病毒(Carp edema virus)、鲑鱼鳃痘病毒(Salmonid gillpoxvirus)和松鼠痘病毒(Squirrelpox virus)。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024041612A1 (zh) * 2022-08-24 2024-02-29 康希诺(上海)生物研发有限公司 一种正痘病毒属mRNA疫苗及其制备方法和用途

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090155244A1 (en) * 2006-03-01 2009-06-18 Rachel Roper Methods and compositions for poxvirus a35r protein
WO2017025782A1 (en) * 2014-09-17 2017-02-16 Glaxosmithkline Biologicals Sa Improved poxviral vaccines
CN115043948A (zh) * 2022-06-24 2022-09-13 青岛硕景生物科技有限公司 一种猴痘病毒特异性融合蛋白抗原及其制备方法和应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090155244A1 (en) * 2006-03-01 2009-06-18 Rachel Roper Methods and compositions for poxvirus a35r protein
WO2017025782A1 (en) * 2014-09-17 2017-02-16 Glaxosmithkline Biologicals Sa Improved poxviral vaccines
CN115043948A (zh) * 2022-06-24 2022-09-13 青岛硕景生物科技有限公司 一种猴痘病毒特异性融合蛋白抗原及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DIMITRI PAPUKASHVILI ET AL.: "Strategy of developing nucleic acid-based universal monkeypox vaccine candidates", FRONTIERS IN IMMUNOLOGY, 27 October 2022 (2022-10-27), pages 7 - 8 *
FUJUN HOU ET AL.: "Novel mRNA vaccines encoding Monkeypox virus M1R and A35R protect mice from a lethal virus challenge", BIORXIV, 22 November 2022 (2022-11-22) *
S. N. SHCHELKUNOV ET AL.: "Analysis of the Monkeypox Virus Genome", VIROLOGY, 5 June 2002 (2002-06-05) *
VALENTINA FRANCESCHI ET AL.: "BoHV-4-Based Vector Single Heterologous Antigen Delivery Protects STAT1 (-/-) Mice from Monkeypoxvirus Lethal Challenge", PLOS NEGL TROP DIS ., 18 June 2015 (2015-06-18) *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024041612A1 (zh) * 2022-08-24 2024-02-29 康希诺(上海)生物研发有限公司 一种正痘病毒属mRNA疫苗及其制备方法和用途

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