COMPOSICIÓN REPELENTE DE INSECTOS
Referencia cruzada con solicitudes relacionadas La presente solicitud reclama el beneficio de prioridad bajo el código 35 estadounidense, sección 1 1 9(e) a la solicitud provisional estadounidense número 60/766,388, presentada el 16 de enero del 2006, incorporada aquí mediante referencia en su totalidad . Campo de la invención La presente solicitud se refiere a composiciones repelentes de insectos. Antecedentes de la invención En muchas áreas del mundo, las picaduras de insectos no son solamente una molestia; son una grave amenaza para la salud . De manera mucho más notable, dichas picaduras pueden dar como resultado la trasmisión de enfermedades mortales y debilitantes, tales como la malaria, fiebre de dengue, fiebre amarilla o virus del este del Nilo. Por lo tanto, permanece como una necesidad constante mejorar los insecticidas que se encuentran disponibles actualmente. Los modelos de trabajo recientes, basados en la población y en el riesgo de infección por malaria en el 20021 indican que el 61 % , es decir, cerca de 656 millones de casos, ocurren anualmente en las regiones de América , Sureste de Asia y el Pacífico Occidental de la OMS . En el 2005 , la OMS reportó que 41 % de los casos cl ínicos de malaria ocurren fuera de África2, un aumento en comparación con su estimado del 2001 del 1 3.6%3. Esta conciencia creciente del problema de la malaria más allá de África debe alentar la diversificación de la investigación mundial en el control de vectores de la malaria, un asunto de gran importancia , dado que los vectores mosquito en estas regiones generalmente muestran un comportamiento que los hace menos susceptibles a las medidas de control que han sido efectivas en África sub Sahariana, incluyendo mosquiteros tratados con insecticida (ITN ) y rocío residual interior (I RS). Estos comportamientos incluyen tendencias a 1 ) posarse en la intemperie, por ejemplo, Anopheles darlingi4 y An. dirus5; 2) alimentación al aire libre, por ejemplo, An. minimus5, An. darlingi4, y An. sinensis5; y 3) actividad significativa de alimentación temprano al anochecer, por ejemplo An. albimanus6 , An. nunetzovari6 , An. farauti No. 27, y An. darlingi 8. La introducción de ITN en diversas áreas parece también haber ocasionado cambios de comportamiento entre los vectores de malaria, volviéndose más frecuentes la alimentación al aire libre y la alimentación temprano al anochecer en áreas donde estas herramientas de control se encuentran en su sitio9, 10. Un estudio de factibilidad para implementar los ITN en cuatro países de Latinoamérica mostró que el 25% de An. Albimanus en N icaragua , 28% de An. punctimácula en Ecuador, 57% de An. albimanus en Perú y 30% de An. nunetzovari, también en Perú , se alimentan antes de las 9 p.m. , cuándo las personas aún se encuentran activas y con frecuencia se encuentran aún a la intemperie1 1 . Más recientemente, un estudio de control de casos en Colombia12 mostró que los ITN proporcionaron solamente 50% de reducción de malaria, y los autores atribuyeron esto a que los mosquitos pican cuando la gente no está durmiendo debajo de los mosquiteros. En dichas condiciones de transmisión, los ITN pueden complementarse de forma útil por medio de repelentes de insectos 13,14. Un estudio aleatorio reciente en hogares en Pakistán15 ha confirmado que la provisión generalizada de repelentes, en este caso, un jabón repelente que incorpora DEET y permetrina, puede reducir significativamente el riesgo de malaria en más de un 50%. Más aún, un estudio clínico en la Amazonia boliviana16, con un repelente de 30% de p-mentano-3,8-diol (PMD) mostró un 80% en reducción de de P. vivax entre las personas que utilizaron el repelente e ITN, en comparación con un grupo que utilizó solamente ITN. Muchas de la transmisión de malaria y arbovirus en América se relaciona con prácticas de trabajo, y el movimiento de personas no inmunes hacia áreas endémicas de malaria en busca de trabajo en los bosques (minería, tala de árboles, etc) 7. Los jóvenes trabajadores sufren las condiciones más duras de la enfermedad, las cuales crean presiones económicas severas para toda la familia a través de pérdida de ganancias18, reemplazo de mano de obra y costos de tratamiento19. Para las familias más pobres de Latinoamérica, estos costos indirectos pueden corresponder a entre 12 y 20% del ingreso doméstico anual 19,2°. Con esto en mente, se desarrolló un repelente de bajo costo que contiene ingredientes naturales que son aromáticamente familiares a los usuarios y que eventualmente podrían obtenerse localmente. Se sabe que existen sustancias, incluyendo aislados naturales , que pueden proporcionar un efecto de repelencia de insectos. Se sabe que las sustancias repelentes proporcionan este efecto cuando se aplican a una superficie (por ejemplo , piel humana o superficies duras), generalmente con un veh ículo de suministro adecuado (por ejemplo, aerosol, crema, spray, gel , etc.) y que se denominan comúnmente "repelentes de insectos o bichos". Los ejemplos de materiales repelentes que imparten un efecto de repelencia incluyen , sin limitarse a ellos, materiales tales como ? ,?-dietil m-toluamida (de aquí en adelante llamado DEET), p-mentano-3,8-diol (comúnmente conocido como Coolact® 38D , marca registrada de Takasgo International Corp. ), permetrina , aletrina, butóxido de piperonilo , aceite de pasto limón, aceite de citronela, aceite de eucalipto, alcanfor, aceite de geranio, etil hexanodiol , butilacetilaminopropionato de etilo y hidroxietil-isobutil-piperidina. En una formulación comercial de repelente, los agentes repelentes se agregan típicamente como un solo ingrediente activo para producir el efecto deseado. Deberá hacerse notar que existen al menos dos ejemplos de combinaciones de dos materiales repelentes utilizados en una composición . Por ejemplo, la patente estadounidense número 5,698,209 divulga una composición que contiene un monoterpenodiol seleccionado de entre carano-3,4-diol y p-mentano-3,8-diol (Coolact® 38D) y un compuesto piretroide seleccionado de entre fenotrina y permetrina como ingredientes activos. La composición supuestamente presenta una alta repelencia a los artrópodos durante un largo periodo de tiempo. Además la publicación japonesa número J P 3-1 33906 divulga una combinación de p-mentano-3,8-diol y N ,N-dietil-m-toluamida (DEET). Debe también hacerse notar que existen otros ejemplos en la literatura de patentes en los que se reclama una composición que contiene un aceite esencial que posee propiedades repelentes (por ejemplo , la solicitud publicada estadounidense número 2005/01 1 21 64 A1 ). El ingrediente activo en la mayoría de los repelentes comerciales para insectos es DEET, el cual se ha demostrado que es efectivo contra una amplia variedad de insectos picadores. Sin embargo, el uso de DEET presenta diversas desventajas, incluyendo riesgos potenciales a la salud , y preocupaciones, especialmente en niños, dado que se absorbe a través de la piel humana . Además, el olor del DEET es considerado por muchos como "químico" y desagradable, y puede causar picazón cuando se aplica a la piel . Por estas razones, se requiere de una formulación de repelente que sea amigable con el consumidor. Breve descripción de los dibujos La Figura 1 muestra el porcentaje de protección de formulaciones de la presente invención, en comparación con una formulación de control de DEET al 1 5% . La Figura 2 muestra el porcentaje de protección de una formulación de la presente invención , en comparación con una formulación de control de DEET al 20% . Breve descripción de la invención La presente invención se basa en un sorprendente descubrimiento que alivia las limitaciones de los productos antes mencionados. El descubrimiento incluye el uso de dos materiales repelentes, en combinación , en una formulación única para proporcionar un producto con el beneficio añadido y eficacia superior, que pueda hacerse disponible para individuos en países en desarrollo a un precio costeable. Se ha descubierto que la combinación novedosa de p-mentano-3,8-diol y aceite de pasto limón proporciona un efectivo repelente de insectos con eficacia superior y atributos mejores a los de cualquiera de los dos repelentes individuales o cualquier otro repelente comercial . También se ha descubierto que la inclusión de vainillina o un componente similar a ella además es útil para repeler insectos. Las formulaciones que contienen aceite de pasto limón y p-mentano-3,8-diol han demostrado ser efectivas para repeler a mosquitos Anopheles darlingi y Anopheles albimanus que son vectores de la malaria , el mosquito Aedes aegypti que es vector de la fiebre de dengue y la fiebre amarilla. Descripción detallada de la i nvención Definiciones Como se utiliza aquí, el término "insecticida" o "repelente" se refiere a cualquier sustancia o mezcla de sustancias utilizada para matar o controlar o repeler a cualquier insecto. Aquí, el insecticida o el repelente como se define tiene un uso preferido para matar o controlar o repeler insectos voladores (por ejemplo, mosquitos). Si n embargo, se anticipa que la formulación de insecticida descrita también será efectiva contra ácaros, garrapatas (enfermedad de Lyme), y muchos otros insectos. Como se utiliza aquí, la abreviación "PM D" se refiere a p-mentano-3,8-diol . Como se utiliza aquí, la abreviación "aceite de LG" se refiere a aceite de pasto limón. Como se utiliza aquí , el término "fijador" se refiere a compuestos que extienden la vida de repelentes al detener la evaporación de activos volátiles del repelente (por ejemplo, PM D y aceite de pasto limón). Un ejemplo de un fijador preferido es la vainillina. Aceite de pasto timón El aceite de pasto limón es un destilado de hojas de Cymbopogon citratus. Se encuentra disponible de diversas fuentes, incluyendo The Essential Oil Company Ltd . , Worting House, Church Lañe, Basingstroke, Hants. , United Kingdom , Berje Inc. , Bloomfield , NJ and Polarome, Jersey City, NJ . El aceite de pasto limón puede obtenerse por aproximadamente 1 2 a 25 dólares por kilo. El aceite de pasto limón puede ser menos costoso que la mayoría de los ingredientes activos utilizados en repelentes de insectos. Sorprendentemente, el aceite de pasto limón , cuando se le combina con p-mentano-3,8-diol y/o vainillina, proporciona un repelente de insectos que es tanto o más poderoso que los repelentes de insectos que contienen cantidades mucho mayores de activos más costosos. De acuerdo con esto, la inclusión de aceite de pasto limón en un repelente de insectos de la presente invención proporciona un repelente de insectos con una eficacia mejorada , que es costeable para individuos que viven en áreas con problemas de insectos, incluyendo países en desarrollo en Centro y Sudamérica . p-mentano-3.8-diol El P-mentano-3,8-diol (P D) tiene la siguiente estructura:
El PM D se encuentra comercialmente disponible (como una mezcla de (+ )-cis y (-)-trans p-mentano-3,8-diol bajo la marca registrada Coolact® 38D de Takasago I nt'l Corporation (Estados Unidos), Rockleigh , NJ . El p-mentano-3,8-diol puede también obtenerse por med io de modificación de ácido del aceite de Corymbia citriodora (eucalipto de limón), que se cultiva comercialmente (por ejemplo, se cultiva comercialmente en Brasil y en otros países de Latinoamérica). El Citriodiol , que es un producto del extracto de hojas de Corymbia citriodora, contiene aproximadamente 60% de p-mentano-3,8-diol . Véase Annals of Tropical Medicine & Parasitology (Ann . trop . med .
parasitol.) 2005, vol. 99, no. 7, pp.695-715, el cual se incorpora aquí mediante referencia. El Coolact® 38D es una fuente preferida de p-mentano-3,8-d¡ol, dado que es una forma más pura, en comparación con el PMD derivado de Corymbia citriodora. Vainillina y compuestos relacionados Las composiciones repelentes de insectos de la presente invención también pueden contener vainillina o un componente similar a esta, representado por la fórmula:
en donde A es un hidrógeno, hidroxi, o un grupo carboxi alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, no sustituido, de cadena recta o ramificada, B es un hidroxi o un grupo alquiloxi de 1 a 4 átomos de carbono, no sustituido, de cadena recta o ramificada, D es un enlace o un grupo alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, no sustituido, de cadena recta o ramificada, opcionalmente interrumpido por un oxígeno, E es un hidrógeno o un grupo alquilo de 1 a 4 átomos de carbono no sustituido, de cadena recta o ramificada, y F es hidrógeno o hidroxi. Los componentes similares a la vainillina que pueden utilizarse en composiciones repelentes de la presente invención incluyen, sin limitarse a ellos, acetato de vainillina, isobuti rato de vainillina y ortovainillina. En una modalidad preferida, los repelentes de insectos de la presente invención contienen vainillina , la cual se encuentra comercialmente disponible en Rhodia Inc. (Cranbury, NJ ) y tiene la siguiente estructura :
Sin atarse a ninguna teoría, se cree que la vainillina o los componentes similares a esta reaccionan con el aceite de pasto limón , PMD , alquilen glicoles o etanol que' se encuentra en los repelentes de insectos para formar compuestos acétales para aumentar la efectividad del repelente de insectos. Se piensa que los acétales, con el tiempo, se hidrolizan de regreso al material inicial (por ejemplo, PM D). Los esquemas ejemplares de reacción se muestran a continuación.
Vainilli na p-mentano-3,8-diol acetal de vainillina y PMD Vainillina etanol dietil acetal de vainillina
propi|en gji co| * La transconfiguración de p-mentano-3,8-diol se muestra arriba. Generalmente, el p-mentano-3,8-diol puede encontrarse presente tanto en forma cis como en forma trans. Componentes adicionales Es posible agregar a los repelentes para insectos de la presente invención, componentes adicionales tales como fragancias, solventes, diluyentes y fijadores. Los ejemplos no limitantes de dichos materiales se describen en la patente estadounidense número 6,660,288, la cual se incorpora aqu í mediante referencia , e incluyen : Aldehido C1 1 (Aldehido Undecilénico); Aldehido iso C1 1 (G IV); Aceite de pimienta de jamaica; propionato de alil ciclohexilo; salicilato de amilo; aldehido amilcinámico; anetol ; alcohol an ísico; aldeh ido anísico, Applinal (Q); malagueta; acetato de bencilo;
benzoato de bencilo; cinamato de bencilo; propionato de bencilo; salicilato de bencilo; bourgeonal (Q); Brahmanol ; polvo de alcanfor sintético ; aceite esencial de cedro Virginiano; cedrenol ; acetato de cedrilo; celestolida ( I FF); cineola ; alcohol cinámico; aldeh ido cinámico; aceite de hoja de canela; acetato de cinamilo; cis-3-hexenol ; citral ; aceite de citronela; citronelal; citronelol ; acetato de citronelil; oxiacetaldehído de citronelil; aceite de clavo; aceite de cilantro; cumarina; aldehido cumínico; aldehido ciclamén ; decanal ; 9-decenol; éter dibencílico; ftalato de dibutilo; ftalato de dietilo; dihidromircenol ; antranilato de dimetilo; ftalato de dimetilo; dimicretol (I FF); difenilmetano; óxido de difenilo; acetato de dimetil bencil carbinilo; dodecanol; dodecanal ; aceite de elemí; glicidato de etil metil fenilo; cinamato de etilo; safranato de etilo (Q); etil vainillina ; eugenol ; aceites de hoja perenne (aceites de pino, etc. ); nonalactona gamma; undecalactona gamma; geraniol ; geranio bourbon ; acetato de geranilo; formato de geranilo; goma de benzoína; heliotropina; Hercolina D (HER); Benzoato de hexilo; aldeh ido hexilcinámico; acetal de dimetil aldehido hidratrópico; hidroxicitronelal ; acetal de dimetil hidroxicitronelal; Indol ; acetato de iso bomilo; miristato de isopropilo; iso-ciclocitral (G IV, I FF); jasmacicleno; aceite de jazmín; lavandina abrialis; aceite de lavanda; lilial (GIV); linalol ; acetato de linalilo; mentol laevo; antranilato de metilo; metil cedril cetona ; dihidrojasmonato de metilo; ionona de metilo; miristato de metilo; metil naftil cetona; salicilato de metilo; musgo, musgo de árbol ; cetona de almizcle; nerol ; bromelia nerol ín ; acetato de berilo;
nonanal ; absoluto de musgo de roble; resinoides de octanol de incienso; fenilacetato de para-cresilo; para-metoxiacetofenona; aceite de pachul í; aceite de menta; aceite de petitgrain ; 2-fenoxietanol ; isobutirato de fenoxietilo; feniletilacetato ; alcohol feniletílico; butirato de feniletilo; fenilacetato de feniletilo ; aceite de pimiento; alfa-pineno; acetato de para-tert butilciciohexilo ; resinoides de benzoína Siam ; aceite de rosa; aceite de romero; aceite de sándalo; terpineol ; tetrahidrolinalol ; tetrahidromuguol ( I FF); tomillo rojo; undecanal; vainillina; aceite de verbena; vetiver bourbon ; Yara e Ylang Ylang; mucopolisacáridos ácidos y sus sales; Aesculus hipocastanum ; aloe barbadenisis mil (Aloe Vera Linne); ácidos hidroxicarboxílicos alfa; ácidos cetocarboxílicos alfa ; derivados de amida; aminoácidos; derivados anfifílicos de ciclodextrina; sitoesterol beta , sales solubles en agua de pol ímero de carboxi vinilo; carboximetilcelulosa; carragenina; quitina; chitosán; colesterol ; éster colesterílico de ácido graso; colágeno; ásteres monoestarílicos de ácido dicarboxílico; ásteres glicerílicos de ácido di-graso, digalactosil diglicerida; esterol; etanol ; extracto de Swertia japónica makino; ácidos grasos; esteres de citrato de ácido graso; alcoholes grasos; extracto de gingseng , ásteres de glucosa de ácidos grasos superiores, goma guar, goma arábica, Hamamelidacea (Hamamelis Virginiana, Avellana de Bruja), ácido hialurónico; hidrocolesterol ; ácidos hidroxibenzóicos; isomaltosa; alcohol isopropílico; lactosa; lanoesterol; lípidos extraídos de la biomasa de microorganismos, levaduras, mohos y bacterias, liposomas, goma garrofín;
monopolisacáridos ácidos de bajo peso molecular y sus sales, componentes humectantes de bajo peso molecular, maltosa , aceites minerales, polvos minerales, ácido mono cis alquenoico , mucopolisacáridos, micoesterol , N-acil lisina, N-isostearil Usina , N-lauroil lisina, N-miristil lisina, N-palmitoil lisina, N-estearoil lisina , bentoita tipo natrio, aminoácido natural o sintético con enlace de proteína o péptido, ingredientes NM F , silicones no volátiles, agentes de aceite, materia de aceite, oligosacáridos, ácidos orgánicos, ácido pantoténico y sus derivados, vaselina, fosfatidil etanolamina, fosfatidilcolina, fosfol ípidos, polisacáridos, alcohol polivin ílico, polipéptidos, proteínas, rafinosa , saponinas , hialuronato de sodio , fuentes de ácido linoleico , esteróles, ésteres de esterol , estigmaesterol , sacarosa, ésteres de azúcar de ácidos grasos superiores, sulfatida, bloqueadores solares, tensoactivos, talco, timoesterol , mono, di o triglicéridos, vitaminas y análogos, vitamina E y/o sus compuestos éster, fluidos volátiles de silicón , agentes conservadores de humedad solubles en agua, pol ímeros solubles en agua y ceras. Com posiciones repelentes para insectos El uso de la composición repelente, es decir, la cantidad de la composición que contiene aceite de pasto limón y p-mentano-3,8-diol y, cuando se encuentra presente en una composición repelente para insectos, vainillina, puede variar desde aproximadamente 1 .0% por peso a aproximadamente 1 00.0% por peso del producto terminado, dependiendo del producto específico y de la aplicación. En una modalidad preferida, el nivel de uso de la composición repelente varía desde aproximadamente 5% hasta aproximadamente 50% , más preferiblemente desde aproximadamente 1 0% hasta aproximadamente 35% . En una modalidad , el nivel de uso de la composición de repelente es de aproximadamente 20 a 30% . La proporción de peso de p-mentano-3,8-diol (por ejemplo, Coolact®38D) con respecto a aceite de pasto limón (PM D: Aceite LG ) en la combinación de repelente puede variar desde aproximadamente 1 :99 hasta aproximadamente 99: 1 , más preferiblemente desde aproximadamente 1 0: 1 o 7.5: 1 hasta aproximadamente 5: 1 ó 2: 1 . Es posible que las diversas combinaciones de materiales repelentes puedan dar como resultado niveles más altos o más bajos de uso dependiendo de la aplicación. La proporción de peso de vainillina (o un compuesto tipo vainillina relacionado) con respecto a aceite de pasto limón (vainillina:aceite LG) varía desde aproximadamente 3: 1 hasta aproximadamente 0.25: 1 , más preferiblemente desde aproximadamente 2: 1 hasta 0.5: 1 (por ejemplo, 1 : 1 ). En una modalidad preferida, la vainillina se encuentra presente en la composición repelente de insectos en una cantidad desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 1 0% por peso. En una modalidad , el porcentaje de peso de p-mentano-3,8-dioles es menor que aproximadamente 30% por peso en base al peso total de la composición repelente de insectos. En otras modalidades, el porcentaje de peso de p-mentano-3,8-diol es menor que aproximadamente 25% por peso, o 24% por peso, o 23% por peso, o 22% por peso, o 21 % por peso , o 20% por peso, o 1 9% por peso, o 1 8% por peso, o 1 7% por peso , o 1 6% por peso, o 1 5% por peso, o 1 4% por peso, o 1 3% por peso , o 1 2% por peso, o 1 % por peso , o 1 0% por peso, en base al peso total de la composición repelente de insectos. Ejemplos Los siguientes ejemplos ilustran la invención sin limitaciones. Ejemplo 1 - Formulación de dos fases Loción repelente de insectos INGREDIENTES Porcentaje (% por peso) Aceite Mineral 39.0% Etanol 26.0% P-mentano-3,8-diol 16.0% Dipropilen glicol 8.5% Aceite de pasto limón 5.0% Vainillina 5.5% El nivel de uso de la combinación repelente en la formulación de crema para el siguiente ejemplo fue de 26.5% por peso . Se agregó vainillina al final a la formulación. Antes de agregar la vainillina, se aplicó calor al PMD para que tenga una viscosidad adecuada para introducirse a la mezcla. La composición resultante tiene una sensación no grasosa , y tiene la viscosidad de un aceite ligero. Un volumen adecuado de la formulación paraa aplicar a la piel del usuario es de aproximadamente 2 mi por cada 1 ,000 cm2 de piel . La formulación deberá ser una formulación clara en dos fases, y podrá entonces envasarse en recipientes de plástico (preferiblemente de PET), y deberá agitarse vigorosamente antes de aplicarse al usuario. Ejemplo 2 - Formulación de una fase Los siguientes ingredientes se combinaron como se describe a continuación: Ingrediente Proveedor Porcentaje (% por peso) Aceite mineral ISP 30.00 Hidrocarburo isoparaf ínico ExxonMobilA 8.00 p-mentano-3,8-diol Takasago 16.00 Acetato de isononilo IFF 35.50 Aceite de pasto limón Berje Guatamala 5.00 Vainillina Rhodia 5.50 ADisponible bajo la marca registrada Isopar L Procedimiento 1 . En un recipiente adecuado, mezclar acerté mineral , I sopar L y el p-mentano-3,8-diol . Podría ser necesario calentar ligeramente el PM D (aproximadamente a 37.78° C ( 100° F)) a fin de que se encuentre en estado l íquido . La solución deberá ser clara . 2. En un recipiente aparte , mezclar acetato de isononilo, aceite de pasto limón y vainillina hasta que la vainillina esté completamente disuelta y la solución sea clara. Un calor muy ligero apresurará el proceso (37.78° C (1 00° F).
3. Mediante agitación , agregar ia parte 2 a la parte 1 y mezclar hasta que la mezcla sea uniforme. La formulación deberá ser una formulación clara , y pod rá entonces envasarse en recipientes de plástico (preferiblemente de PET). Ejemplo 3 - Formulación en gel Los siguientes ingredientes se agregaron secuencialmente: 1) AGUA 42.95% 2) ACEITE MINERAL 30.00% 3) PMD 16.0% 4) GOMA XANTANA 0.55% 5) VANILLINA 5.5% 6) ACEITE 5.0% La mezcla se mezcló hasta que se formó un gel viscoso. La viscosidad del gel puede ajustarse en base a la cantidad del agente gelificante (goma xantana). Ejemplo 4 - eval uación de la eficacia de la formulación del ejemplo 1 Estudio A - Estud io en Guatemala. Se utilizaron las siguientes formulaciones repelentes (% por peso): (1 ) C 1 5 : repelente que contiene las cantidades de ingredientes descritos en el Ejemplo 1 - el PMD obtenido por modificación de ácido de aceite de Corymbia citriodora, CAS: 42822-86-6, adquirido con Chemain Technology Ltd bajo el nombre de marca Citriodiol®; (2) T1 5: repelente que contiene las cantidades de ingredientes descritas en el Ejemplo 1 - el PMD obtenido de Coolact®38D; (3) T20: que contiene 20% por peso de PM D en vez de 1 5% obtenido de Coolact®38D: (4) control positivo: DEET al 1 5% (N , N-dietil-meta-toluamida , CAS 1 34-62-3; Sigma Aldrich Co. ) en etanol ; (5) control negativo: mezcla de 20% de aceite mineral y etanol . Estudio B - Estud io en Perú . Se utilizaron formulaciones repelentes (porcentaje por peso): ( 1 ) "PMD+LG" que contenían aproximadamente 1 6% de PMD como lo indica el Ejemplo 1 - PM D obtenido de Coolact®38D; (2) control positivo: DEET al 20% (Sigma Aldridge) en etanol (Sigma-Aldrich Co. ); (3) control negativo: 20% de aceite mineral (ExxonMobil Corporation) en etanol . Estudio A y B. Ambos estudios fueron controlados por doble ciego, con diseño de atrapado al posarse en humanos. Todas las soluciones se colocaron en recipientes no marcados, etiquetados con código . En una noche cualquiera, los voluntarios humanos trataron la parte inferior de ambas piernas con cualquiera de los dos repelentes candidatos de PM D/LG o un control positivo o negativo en una proporción de 0.002 ml/cm2 entre el tobillo y la rodilla. Se midió el largo y circunferencia de la pierna de los voluntarios para calcular el área de superficie y la dosis correcta de tratamiento se midió utilizando una micropipeta , y se aplicó utilizando un guante de látex para minimizar la absorción de material por la mano del voluntario. Durante las pruebas de posado en humanos, los voluntarios vistieron pantalones cortos hasta la rodilla, botas de trabajo y una chamarra suelta contra insectos (ProBuy) para garantizar que los mosquitos hematófagos tuvieran acceso solamente a las piernas del voluntario . Además, con el fin de minimizar la variación en sus kairomonas27 , 28 de espacio superior, después de medio día los voluntarios no fumaron, no consumieron alcohol ni se lavaron utilizando jabón . Las ubicaciones designadas dentro del sitio de campo fueron con separación de 1 0 metros y un mínimo de 20 metros a fuentes alternas de kairomonas tales como casas y ganado. Dado que los repelentes de insectos actúan en una distancia de menos de un metro, y la distancia máxima de atracción del huésped de un solo ser humano para los mosquitos es de 1 0 m29, el diseño elimina cualquier "efecto de relatividad" donde los insectos eligen entre dos huéspedes simultáneamente. Los mosquitos se recolectaron de las piernas de los voluntarios una vez que se habían establecido, sin necesidad de esperar a que picaran, utilizando un aspirador bucal , una linterna y un recipiente de recolección . Los recipientes de recolección se cambiaron cada hora para proporcionar medidas por hora de repelencia. Se proporcionaron además paraguas, con el fin de proteger a los voluntarios de cualquier lluvia que pudiera lavar los repelentes. Todos los voluntarios fueron entrenados para realizar las atrapadas al posarse el insecto. Se le proporcionó a los voluntarios un formato que describía el procedimiento para garantizar que tuvieran una comprensión total de los riesgos potenciales de un estudio de este tipo. Además, cada uno recibió profilaxis de cloroquina (Guatemala) o mefloquina (Perú) de acuerdo con los lineamientos de la OMS30. Se obtuvo autorización ética total de la Universidad del Valle (Guatemala) (Estudio A); y de la London School of Hygiene and Tropical Medicine Ethics Board y del Instituto Nacional de Salud , Perú (Estudio B). Estudio A. Los tres repelentes y dos controles se aplicaron a cinco voluntarios a las 14:30 horas, y las atrapadas al posarse se llevaron a cabo en el sitio de campo durante una hora antes y después del atardecer ( 1 7:30 a 1 9:30 horas), cuando las picaduras de mosquito llegan a su máximo, como lo muestran las atrapadas al posarse preliminares. Los tiempos elegidos permitieron una evaluación de la protección proporcionada por el repelente durante 5 horas mientras se expuso a los voluntarios a picaduras durante solamente 2 horas. Esto ayudó a minimizar el riesgo de exposición para los recolectores. El estudio fue un diseño de cuadrado latino equilibrado de 5X5 que requirió que cada voluntario probara cada tratamiento en 5 ocasiones a lo largo del estudio durante un periodo de tiempo de 25 noches. Cada noche, cada individuo fue colocado en uno de los cinco tratamientos, y se colocó en una de las posiciones asignadas. Por consiguiente, los voluntarios cambiaron de posición cada cinco d ías. Estud io B El repelente y dos controles se aplicaron a las 1 6:00 horas y las recolecciones al posarse se llevaron a cabo en el campo, entre las 18 y 22 horas, dado que esta es la hora de mayor actividad del An. darlingi en el área (Chan, A. datos no publicados). El tiempo elegido permitió una evaluación de la protección proporcionad a por el repelente para hacer las muestras de protección relativa durante un periodo de 6 horas mientras que se expone a los voluntarios a picaduras durante solamente 4 horas. Esto ayudó a minimizar la exposición al riesgo a los recolectores. Los voluntarios tomaron un descanso de 1 5 minutos entre las 20:00 y las 20: 1 5 horas. El estudio fue un diseño de cuadrado latino equilibrado de 3X3, llevado a cabo utilizando tres voluntarios durante nueve noches, con voluntarios que cambian de posiciones cada tercera noche. Debido a circunstancias no previstas, uno de los voluntarios fue reemplazado después de 4 noches, y esto se factorizó en el análisis estadístico. Los mosquitos se mantuvieron durante la noche y se mataron mediante enfriamiento antes de identificarse a la mañana siguiente. Los datos se normalizaron utilizando un logaritmo natural (x+1 ) y se analizaron con el Modelo Lineal General (GLM) utilizando Minitab 1 1 .0 para Windows. Las pruebas posteriores de variables individuales se llevaron a cabo utilizando Kruskal Wallis, dado que los datos no pudieron normalizarse suficientemente como para utilizar una análisis de varianza (ANOVA) en un solo sentido debido a las bajas cantidades de recolección en individuos tratados con repelente. Resultados Estud io A - Estudio en Guatemala.
En 25 noches, se capturó a 6, 1 40 mosquitos que incluyen 55.6% de Psorophora varipes (Coquillet) y 24.8% Aedes Ochlerotatus taeniorhynchus (Say). El número promedio de posamientos de mosquitos en el control negativo fue de 1 08 por persona/hora y no existió diferencia significativa en números por hora de posamientos en este tratamiento (H = 1 .22, d.f.=3p=0.637). No existió diferencia significativa en cantidades de posamientos por hora cuando los datos para repelentes se analizaron por separado (H=0.84, d .f. = 1 ,p=0.360), lo que indica que la protección del repelente no dsminuyó significativamente en el transcurso de la prueba . Cada uno de los cuatro repelentes proporcionó excelente protección contra mosquitos buscadores de huéspedes, y los repelentes PMD/LG proporcionaron más del 96% por hasta 5 horas después de la aplicación, con T1 5 y T20 proporcionando protección del 995. El DEET ( 1 5%) proporcionó 91 % (Tabla 1 ). El análisis GLM mostró que existía una diferencia significativa entre los cuatro repelentes y el control negativo, y entre el DEET y los tres repelentes con base de PMD, aunque no existió diferencia significativa entre los tres repelentes PMD/LG (d .f.=4, F=1 1 0.02. p<0.0001 ) (Tabla 1 ). Las fuentes de error en el diseño del experimento se investigaron también . No existió diferencia significativa entre la posición de recolección dentro del sitio de campo (d .f.=4, F= .95,p=0.1 5), aunque los individuos variaron en que tan atractivos eran para los mosquitos o su habilidad de recolección en el GLM (d .f.=4, F=6.1 7, p<0.0001 ), pero la variación individual ya no fue significativa cuando se analizó por separado (H=6.99, d .f.=4, p=0.1 37). Existió una interacción significativa entre el individuo y el tratamiento (d .f. = 1 6, F=3.08 , p=0.001 ), pero cuando los datos para cada tratamiento individual se analizaron por separado, la única interacción significativa que quedó fue la entre el individuo y el DEET al 1 5% (d .f.=4, F=4.82, p=0.007) y los repelentes con base de PMD se desempeñaron igualmente bien en los 5 voluntarios. Estudio B - Estudio en Perú En nueve noches, se capturó a 2,358 mosquitos, de los cuales
86% fueron Anopheles darlingi. El número promedio de posamientos de estos en el control negativo fue de 46.27 por persona/hora . No existió diferencia significativa en el número por hora de mosquitos capturados en comparación con el control (d .f.=3, F= 1 .1 8, p=0.333), o individuos tratados con repelentes (H= 1 .90, d .f.=3, p=0.594), el cual indica que la eficacia de los repelentes no se redujo significativamente durante las cuatro horas de la prueba. El repelente PMD/LG ("PMD+LG") tuvo un desempeño mucho mejor que el del DEET, proporcionando un promedio de 95% de protección a seis horas de la aplicación (d .f.=2, F= 1 56.65 , p<0.0001 ) (Tabla 2). En contraste, el DEET al 20% proporcionó un promedio de 62% de protección por toda la duración del estudio. Las fuentes de desviación fueron investigadas y no existió diferencia en el número de mosquitos capturados en las tres posiciones dentro del campo (p=0.972). Sin embargo, existió una interacción significativa entre el probador y el repelente (d .f. =6, F=4.85, p=0.0001 ). Cuando los datos se analizaron por separado, existió una diferencia significativa entre individuos cuando estos utilizaron el control negativo (d .f. = 3, F=4.51 , p=0.01 0) y que utilizaron repelente "PM D+LG" (H = 1 7.94, 5 d .f. = 3,p<0.0001 ), aunque el DEET protegió a cada individuo de la misma forma (H=6.85, d .f. =3, p=0.077). Tabla 1 . Eficacia de cuatro formulaciones de repelentes probados cuatro o cinco horas después de la aplicación d urante el estudio A en Guatemala. Las cifras representan cantidades de 10 mosquitos que se posan sobre las partes bajas de las piernas de los voluntarios. Horas después de la aplicación Tratamiento 4 5 Media C.l . 95% AM 1 15.52 100.48 108.00 15 Mezcla de agente de carga de 39.64- WM 79.83 66.64 56.82a control 82.27 %P - - - AM 1.28 5.73 3.36 C15 WM 0.64 1 .40 1.05b 0.59-1.89
20 %P 94.52 94.30 96.88 AM 1.36 1 .44 1.40 T15 WM 0.79 0.73 0.93" 0.64-1.36 %P 98.82 98.57 98.75 AM 0.84 1.84 1.34 T20 WM 0.43 0.77 0.74b 0.49-1.12 %P 99.27 98.17 98.75 AM 6.33 12.21 9.27 DEET al 15% WM 3.63 4.87 3.60c 2.08-6.29 %P 94.52 87.85 91.42
AM= media aritmética de posamientos de mosquito por hora WM= media de Williams de posamientos de mosquito por hora. Las medias seguidas por la misma última no son significativamente diferentes. %P = porcentaje de protección, es decir 100 - ((Posamientos de mosquito durante el tratamiento / posamientos de mosquitos en control) X 100) El % de Protección de las formulaciones probadas en el
Estudio A se muestra también en la Figura 1. El % de Protección contra Anopheles darlingi para las formulaciones probadas en el Estudio B se muestra también en la Figura 2. Tabla 2. Eficacia de dos repelentes probados de 3 a 6 horas después de la aplicación durante el estudio B en Perú. Todos los mosquitos Anopheles darlingi Horas después de la aplicación Horas después déla aplicación I.C. I.C.
Tratan ¡ente 3 4 5 6 3 4 5 6 95% 95%
AM= media aritmética de posamientos de mosquito por hora WM= media de Williams de posamientos de mosquito por hora . Las medias seguidas por la misma última no son significativamente diferentes. % P = porcentaje de protección , es decir 1 00 - ((Posamientos de mosquito durante el tratamiento / posamientos de mosquitos en control) X 100) Discusión En ambas pruebas de campo, los repelentes PM D/LG con fijadores mostraron una excelente eficacia contra una amplia gama de especies de mosquitos, con una longevidad mayor a la esperada para una formulación con PM D al 1 5% . Además, en estas pruebas los repelentes con base de PM D mostraron una mayor eficacia que la de las dosis correspondientes de DEET, donde muchos estudios de campo revisados por colegas habían mostrado que las formulaciones de solo PMD tienen una longevidad similar21, o más baja31 en comparación con DEET en dosis correspondiente. Durante una prueba de campo en Bolivia en el 2001 contra An. darlingi, donde la presión de picaduras fue de 75 posamientos de mosquito por persona por hora, un repelente que contenía PMD al 30% proporcionó protección del 97% y con DEET al 15% proporcionó 85% de protección durante 4 horas después de la aplicación22. Sin embargo, en el estudio actual A, el repelente que contenía la mitad de esa concentración de PMD (T15) proporcionó 99% de protección durante 5 horas después de la aplicación con una presión de picaduras de 108 mosquitos por persona por hora en comparación con 91% para DEET al 15%. En el estudio B, un repelente con 16% de PMD ("PMD+LG") proporcionó 95% de protección durante 6 horas después de la aplicación en comparación con 62% para DEET al 20%. A partir de esto puede inferirse que el agregar fijadores a los repelentes probados en Guatemala y Perú se redujo la velocidad de liberación de volátiles del repelente, extendiendo así la duración de los repelentes. Debe enfatizarse que el PMD es el ingrediente más costoso en el repelente, y que los ahorros realizados por una reducción en el contenido de PMD de 30% a 15% son sustanciales. Los datos de Population Services International (PSI) calcularon el costo diario para un repelente con base de PMD al 30% en USD$ 0.16 por persona por día32 (en dólares del 2001). Dado que la mayoría de los otros ingredientes en el repelente PM D/LG es de costo relativamente bajo cuando se compran en volumen , la oportunidad para proporcionar una herramienta costeable de prevención de enfermedades ha sido mejorada sign ifi cativamente . Existe sól ida evidencia de q ue las personas con u n estatus socioeconómico bajo presente una probabilidad más baja para adquirir estas formas de protección personal que son relativamente caras pero efectivas, como pueden ser los ITN y repelentes, y más probablemente confiar en métodos trad icionales menos efectivos de protección personal , tales como el humo33. Claramente , hacer el repelente disponi ble al costo más bajo posi ble mejorará la adaptabilidad del usuario34. La importancia potencial de esta herramienta para campañas contra la malaria en América puede ilustrarse por las circunstancias enfrentadas por las cl ínicas del Ministerio de Salud del Perú (M I NSA) en el departamento de Loreto. Se ha estimado que el costo total para tratar la malaria en Loreto en 1 998 fue de $ 1 90 por caso individual por año (en dólares de 1 998). El costo incluyó transporte del paciente a cl ínicas estatales , tratamiento , medicamentos, ingreso perdido y el costo al estado por el subsidio para tratam iento gratuito35. Ajustado a dólares del 2006 , se trata del equivalente a $235'. Sin embargo, el costo anual esti mado para la intervención del repelente (cobertura para un hombre adulto durante la temporada de transmisión de 7 meses a %0.047 por día) es de $ 1 0.00. Esto es , 42% del costo de tratamiento (utilizando clínicas M INSA) hoy, así que podría ser un excelente candidato para incorporarse a las estrategias existentes de control de vectores. Si dichas economías pudieran lograrse en Perú , al tiempo que se reducen sustancialmente las cargas de enfermedades como la malaria, este modelo podría aplicarse a otras regiones donde las picaduras al atardecer resultan problemáticas. Esencialmente, el modelo de Repelencia de Malaria propone: ( 1 ) que siempre que el comportamiento de alimentación crepuscular de los vectores más importantes de la malaria está ya establecido, o donde podría estar cambiando hacia temprano en la noche (de uso de IRS y/o ITN36 que reduce la disponibilidad de huéspedes más tarde por la noche; o de una creciente diversidad de anoflinas, incluyendo especies crepusculares que pueden dar como resultado de cambios de uso de suelo)37, cuando (2) en áreas remotas en que la reserva humana de enfermedad es migratoria38; podría ser posible lograr en un año una reducción tal vez del 30 a 60% en malaria, y este logro podría realizarse distribuyendo en estas áreas una crema cutánea altamente repelente (con eficacia de 6 horas > a 95%) que es costeable y aromáticamente atractivo para los indígenas pobres. Es de importancia que, bajo este modelo, en las poblaciones más grandes y más estables de pueblos y pequeñas ciudades donde el API es generalmente más bajo y donde el acceso a repelentes es facilitado a clínicas, farmacias y mercados, hay un mayor potencial de reducir aún más la malaria.
Un estudio de Fase 3 de cinco meses (con un repelente de PM D/LG) que se encuentra actualmente bien organizado en la Amazonia Peruana , pronto proveerá una oportunidad para medir los parámetros del modelo propuesto, con 3,759 sujetos divididos en 3 categorías (Solo repelente, repelente + ITN y Sin intervención). Este estudio comunitario marcará la primera ocasión en que el efecto de la intervención de solo repelente sobre parásitos haya sido medido en un grupo de población discreta. Si la capacidad demostrada de los repelentes para repeler efectivamente a los vectores de la malaria conduce a una reducción medible en el índice de infección , entonces Puerta , del Cielo, la fundación no lucrativa que está financiando y dirigiendo el estudio de Fase 3, iniciará la distribución del repelente al costo para comunidades pobres con malaria endémica a lo largo de la Amazonia Peruana. Ejemplo 4 - Evaluación de la eficacia de la formulación del ejemplo 2 La eficacia de la formulación de una fase del Ejemplo 2 se evaluó contra un control positivo (repelente de insectos marca Walgreen's que contiene 23% de DEET) en un cubo de un metro cúbico que contenía mosquitos. El cubo de mosquitos contenía aproximadamente 1 86 mosquitos, con una media de edad de aproximadamente 2 d ías después del surgimiento. Extrapolando de un tamaño de muestra de 1 1 mosquitos, se estima que el cubo contenía aproximadamente 1 10 hembras. La "zona de prueba" consistió de una banda de 4x25 cm ( 1 00 cm cuadrados) de antebrazo justo encima de la muñeca. Cada banda fue medida y marcada utilizando una plantilla de papel . Esta área fue delimitada con bandas de cinta porosa para pri meros auxilios Transpore de 3M . Esta área se aisló además mediante la utilización de un par de guantes de látex con mangas que se superponían a la cinta. La "zona de control" consistió de un área de piel no tratada sobre el antebrazo inferior y muñeca , creado al enrollar parcialmente hacia arriba la manga del guante. Se aplicaron 200 microlitros de cada repelente con el lado de una pipeta pipetman hacia la zona de prueba para extender el repelente de forma uniforme encima de la totalidad del área marcada . La formulación del ejemplo 2 se aplicó al brazo izquierdo, y la marca Walgreen con 23% de DEET se aplicó al brazo derecho. Después de la aplicación, se permitieron 1 0 minutos para secado antes de introducir los brazos dentro del cubo de mosquitos. Se utilizaron guantes de látex en cada mano, con mangas que se superponen a la parte más baja de banda de cinta. Se evaluó un control negativo (piel no tratada) antes de cada exposición de repelente al enrollar hacia abajo la manga para exponer aproximadamente 40 cm de piel no tratada debajo de la banda de cinta . El número de posamientos y sondeos en esta área se contó durante un periodo de 2 minutos. (Nota: muchos más posamientos y sondeos ocurrieron sobre los guantes de látex y la manga de algodón de la jaula sobre la piel expuesta, pero estas no se contaron). Se definió a un posamiento como un cese completo de movimiento de las alas después de contacto tarsal con la piel . Un sondeo se definió como un contacto continuado con la piel , acompañado del toque de las partes de la boca en la piel . Los mosquitos fueron sacudidos después de que se realizó un conteo y las observaciones se repitieron durante un periodo de 2 minutos. Algunos posamientos fueron accidentales y parecieron involucrar a mosquitos que se enredaron en los vellos del brazo. Las sondas son un indicador más consistente de no repelencia, pero los posamientos son útiles porque tienden a aumentar en frecuencia cuando el repelente empieza a fallar con el tiempo. Los resultados se muestran a continuación :
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