MX2008006130A

MX2008006130A - Analisis diagnostico de cancer de pulmon

Info

Publication number: MX2008006130A
Application number: MXMX/A/2008/006130A
Authority: MX
Inventors: A Hirschowitz Edward; Zhong Li; H Khattar Nada; J Stromberg Arnold
Original assignee: A Hirschowitz Edward; H Khattar Nada; J Stromberg Arnold; University Of Kentucky; Zhong Li
Priority date: 2005-11-10
Filing date: 2008-05-09
Publication date: 2008-09-26

Abstract

Un análisis diagnóstico para determinar la presencia de cáncer de pulmón en un paciente depende, en parte, de la comprobación de la presencia de un anticuerpo asociado con cáncer de pulmón. El análisis predice el cáncer de pulmón antes de la evidencia de tejido canceroso radiográfico detectable.

Description

ANÁLISIS DIAGNOSTICO DE CÁNCER DE PULMÓN Antecedentes El cáncer de pulmón es la principal causa de muerte por cáncer tanto en hombres como en mujeres en los Estados Unidos y muchas otras naciones. El número de muertes por esta enfermedad se ha incrementado anualmente durante los últimos cinco años a cerca de 164,000 solo en los E.U., sucumbiendo la mayoría a cánceres de célula no pequeña (NSCLC) . Esto excede las tasas de mortalidad por cáncer de mama, próstata y colorectal combinados. Muchos expertos creen que la detección temprana del cáncer de pulmón es la clave para mejorar la supervivencia. Los estudios indican que cuando la enfermedad se detecta en una etapa temprana, localizada y puede retirarse quirúrgicamente, la tasa de supervivencia de cinco años puede alcanzar el 85%. Pero la tasa de supervivencia decrece dramáticamente después de que el cáncer se ha propagado a los otros órganos, especialmente a sitios distantes, después de lo cual tan poco como el 2% de los pacientes sobreviven cinco años. Desafortunadamente, el cáncer de pulmón es una enfermedad heterogénea y es usualmente asintomática hasta que ha alcanzado una etapa avanzada. Así, solo el 15% de los cánceres de pulmón se detectan en una etapa temprana, localizada. Por lo tanto, existe, una necesidad apremiante de herramientas que ayuden en la examinación de personas - - asintomáticas que conduzca a la detección del cáncer de pulmón en sus primeras etapas más tratables. Se ha estudiado la exploración mediante radiografías de tórax y tomografía computarizada (CT) como potenciales herramientas de examen para detectar cáncer de pulmón en etapa temprana. Desafortunadamente, el alto costo y la alta tasa de positivos falsos hacen a estas herramientas radiográficas imprácticas para su uso generalizado. Por ejemplo, un estudio reciente del U.S. National Cáncer Institute concluyó que la detección del cáncer de pulmón con radiografías de tórax puede detectar cáncer de pulmón inicial, pero produce muchos resultados de prueba positivos falsos, que ocasionan pruebas de seguimiento innecesarias, Oken et al, Journal of the Na tional Cáncer Insti tute, 97(24)1832-1839, 2005. De los 67,000 pacientes que recibieron rayos X de línea basal al ingresar a la prueba, cerca de 6,000 (9%) tuvieron resultados anormales que requirieron seguimiento. De estos, únicamente 126 (2% de los 6,000 participantes con rayos X anormales) se diagnosticaron con cáncer de pulmón dentro de los 12 meses a los rayos X de tórax iniciales. Se ha encontrado un problema similar con positivos falsos con pruebas en curso que involucran exploraciones CT . La especificidad de la exploración CT se calcula alrededor de 65% basándose en el número de hallazgos radiográficos indeterminados . Los expertos han suscitado serias preocupaciones acerca del costo en salud por vida salvada cuando se evalúa el número de cánceres detectados por el número de exploraciones de detección CT llevadas a cabo debido a que una gran porción de los costos de cuidado de la salud en que se incurre pueden atribuirse al número de nodulos pulmonares indeterminados encontrados en la detección de prevalencia que requiere investigación adicional, muchos de los cuales finalmente se encuentra ser benignos. Las exploraciones PET son otra opción de diagnóstico, pero la exploración PET es costosa, y generalmente no es susceptible de utilizarse en programas de detección. Actualmente, la edad y un historial de fumador son los únicos dos factores de riesgo que se han utilizado como criterios de selección por los grandes estudios de detección. Una prueba de sangre que puede detectar radiográficamente cánceres aparentes (> 0.5 cm) así como cánceres ocultos y pre-malignos (por debajo del límite de la detección radiográfica) identificaría individuos para los cuales se encuentra más garantizada una detección radiológica y de hecho reduciría el número de hallazgos pulmonares benignos que requieren trabajo adicional. Se encuentra claro, por lo tanto, que existe una necesidad urgente de herramientas de examen y detección de cáncer de pulmón mejoradas que superen las limitaciones antes mencionadas de las técnicas radiográficas. SUMARIO La presente invención se refiere a análisis, métodos, y equipos para la detección temprana de cáncer de pulmón utilizando muestras de fluido corporal. En particular, la invención se refiere a la detección de cáncer de pulmón mediante la evaluación de la presencia de uno o un panel de marcadores, tal como biomarcadores de autoanticuerpo . La presente invención puede emplearse en una estrategia de detección de cáncer de pulmón completa especialmente cuando se utiliza en concierto con formación de imágenes radiográficas y otras modalidades de detección. La presente invención puede utilizarse para enriquecer a la población por análisis radiográficos adicionales para descartar la posible presencia de cáncer de pulmón. En resumen, la invención se dirige a un método para detectar la probable presencia de cáncer de pulmón en un paciente, en una modalidad, al proporcionar una muestra de sangre del paciente y analizar la muestra de sangre del paciente para la presencia de uno o un panel de autoanticuerpos asociados con el cáncer de pulmón. El panel puede identificarse, por ejemplo, al evaluar la probabilidad máxima de cáncer asociada con los miembros del panel. Cualquiera de una variedad de herramientas estadísticas puede utilizarse para evaluar la contribución simultánea de las múltiples variables para un resultado. La presente invención se empleó para analizar muestras obtenidas durante una prueba de detección CT mayor y para distinguir cáncer de pulmón en etapa temprana y tardía así como una enfermedad oculta a partir de controles asociados a riesgo. El presente análisis predijo con casi un 90% de precisión la presencia de cáncer de pulmón tanto como cinco años antes de la detección radiográfica. El presente análisis puede utilizarse como una prueba de detección para pacientes asintomáticos, o pacientes de un grupo de alto riesgo que aún no han sido diagnosticados con cáncer de pulmón utilizando pruebas y protocolos aceptables, es decir, por ejemplo, los que carecen de cáncer de pulmón radiográficamente detectable. La invención proporciona una alternativa al alto costo y la baja especificidad de los métodos actuales de detección de cáncer de pulmón, tales como radiografías de tórax o CT de Baja Dosis. El presente análisis maximiza las tasas de detección de cáncer mientras que limita la detección de nodulos pulmonares benignos que pueden requerir evaluación adicional y por lo tanto, es una herramienta poderosa y de costo efectivo que puede incorporarse fácilmente en una - - estrategia de detección temprana completa. Estas y otras características, aspectos, y ventajas de la presente invención se entenderán mejor con respecto a la siguiente descripción y reivindicaciones adjuntas. DESCRIPCIÓN DETALLADA El diagnóstico temprano de estados patológicos es benéfico. Sin embargo, no todos los estados patológicos tienen señales simples fáciles de detectar. Otros estados patológicos son heterogéneos en etiología o fenotipo, o a través de toda la etapa de desarrollo de los mismos. En tales circunstancias, es poco probable que exista una señal o marcador diagnóstico único, sensible y específico. No obstante, ahora es posible desarrollar un análisis de diagnóstico adecuado utilizando una pluralidad de marcadores, que solos no pueden tener suficiente poder predictivo, pero en cierta combinación, un panel tiene suficiente especificidad y sensibilidad para su uso práctico. Además, las técnicas múltiples y la capacidad de manejo de datos permiten la flexibilidad para desarrollar análisis de diagnóstico particularizados y personalizados con facilidad de uso y mayor capacidad predictiva para poblaciones definidas o para la población en general. La presente invención proporciona un nuevo análisis y método para detectar enfermedades, tales como, cáncer de pulmón, más pronto y con mayor precisión que los medios convencionales. En resumen, se obtiene una muestra del paciente o sujeto, tal como una muestra de sangre, y se analiza para la presencia o ausencia de un panel de biomarcadores de anticuerpo. Para el cáncer de pulmón, se utiliza uno o un panel de marcadores, cada marcador asociado hasta cierto grado con el cáncer de pulmón, y la mayoría de los cuales, cuando se utiliza un panel, produce una medición predecible de la probabilidad de tener cáncer de pulmón en una población heterogénea. Como se establece en mayor detalle más adelante, el análisis y método de acuerdo con la presente invención identifica correctamente a los pacientes con cáncer de pulmón en etapa temprana y tardía. La identificación de pacientes con cáncer de pulmón en etapa temprana es particularmente valiosa debido a que los análisis y modalidades de detección actuales tienen poca capacidad para hacerlo de forma robusta y de costo efectivo. El presente análisis de detección proporciona mayor capacidad para predecir y produce menos positivos falsos que los análisis actualmente utilizados, que además son frecuentemente costosos. El presente análisis es también versátil, mediante el uso de un formato de análisis que permite probar un gran número de muestras de forma simultánea, tal como utilizando una micro-disposición, las muestras de control en relación a cualquier población pueden correrse en paralelo para obtener datos discriminatorios de alta confiabilidad, en donde la pluralidad de controles se comparan con tantos parámetros como sea posible con la población de prueba. Esto permite la corrección de diferencias de población, tales como raza, sexo, edad, polimorfismo y así sucesivamente, que puedan presentarse y confundir los resultados. Definiciones Como se utiliza en la presente, los siguientes términos deben tener los siguientes significados. "Cáncer de pulmón" significa un proceso, estado y tejido maligno en el pulmón. "Proteína" es un péptido, oligopéptido o polipéptido, los términos se utilizan de forma intercambiable en la presente, que es un polímero de aminoácidos. En el contexto de una biblioteca, no 'es necesario que el polipéptido codifique una molécula con actividad biológica. Un anticuerpo de interés se enlaza a un epítope o determinante. Los epítopes son porciones de una molécula funcional intacta, y en el contexto de una proteína, pueden comprender tan pocos como aproximadamente tres a aproximadamente cinco aminoácidos contiguos. "Normalizado" se refiere a un tratamiento estadístico de una métrica o medición para corregir o ajustar contribuciones de respaldo y aleatorias al resultado observado para determinar si la métrica, la estadística o la medida es un reflejo real, respuesta o resultado de una reacción o es no significativa y aleatoria. "Cáncer de Pulmón de Célula No-Pequeña" (NSCLC) es un subtipo de cáncer de pulmón que cuenta para aproximadamente 80% de todos los cánceres de pulmón, comparado con el cáncer de célula pequeña que se caracteriza por células pequeñas, ovoides, también conocido como cáncer de célula de avena. Se encuentran incluidos en el subtipo NSCLC el carcinoma de célula escamosa, adenocarcinoma y carcinoma de célula grande. "Fluido corporal" es cualquier muestra de líquido obtenida o derivada de un cuerpo, tal como sangre, saliva, semen, lágrimas, extractos de tejido, exudados, lavado de cavidad corporal, suero, plasma, fluido de tejido y lo similar que puede utilizarse como una muestra de paciente para pruebas. Preferentemente el fluido puede utilizarse como es, sin embargo, puede utilizarse un tratamiento, tal como clarificación, por ejemplo, mediante centrífuga, antes de la prueba. Una muestra de fluido corporal es una muestra de fluido. "Muestra de sangre" significa una pequeña alícuota, generalmente, de sangre de vena obtenida de un individuo. La sangre puede procesarse, por ejemplo, se inactivan los factores de coagulación, tal como con heparina o EDTA, y las células de glóbulos rojos se retiran para producir una muestra de plasma. Puede permitirse que la sangre coagule, y separar las fases sólida y líquida para producir suero. La totalidad de las muestras de sangre "procesadas" caen dentro del alcance de la definición de "muestra de sangre" como se utiliza en la presente. "Epítope" significa una estructura molecular particular enlazada por un anticuerpo. Un sinónimo es "determinante". Un epítope de polipéptido puede ser tan pequeño como 3-5 aminoácidos. "Biomarcador" denota un factor, indicador, marca, métrica, manipulación matemática y lo similar que se evalúa y se encuentra útil en la predicción de un resultado, tal como el estado actual o un futuro estado de salud en una entidad biológica. Un biomarcador es un sinónimo de marcador. "Panel" significa un conjunto compilado de marcadores que se miden juntos en un análisis. Un panel puede comprender 2 marcadores, 3 marcadores, 4 marcadores, 5 marcadores, 6 marcadores, 7 marcadores, 8 marcadores, 9 marcadores, 10 marcadores, 11 marcadores, 12 marcadores o más. El tratamiento estadístico y los métodos de análisis que se muestran en la presente solicitud y que pueden aplicarse en la práctica de la presente invención se proporcionan para utilizar cualquiera de un número de marcadores informativos en un análisis de interés. "Resultado" es aquello que se predice o detecta.

"Autoanticuerpos" significa inmunoglobulinas o anticuerpos (los términos se utilizan de forma intercambiable en la presente) dirigidos a (auto) proteínas "autologas" que incluyen células patológicas, tales como células infectadas y células de tumor. En este caso, los anticuerpos contra tumores se derivan de un tumor propio del individuo, el cual es una aberración genética de sus propias células. "Suma ponderada" significa una recopilación de marcas de marcadores individuales, cada una con un valor predictivo. Los marcadores con mayor valor predictivo contribuyen más a la suma. El valor relativo de los marcadores individuales se deriva estadísticamente para maximizar el valor de una expresión multivariable, utilizando paradigmas estadísticos conocidos, tales como regresión logística. Puede utilizarse un número de paquetes estadísticos comercialmente disponibles. En una fórmula, tal como una ecuación de regresión, de factores aditivos, el "peso" de cada factor (marcador) se revela como el coeficiente de ese factor. "Estadísticamente significativo" significa diferencias poco probables para relacionarse únicamente con la probabilidad. "Marcador" es un factor, indicador, métrica, marca, manipulación matemática y lo similar evaluable y utilizable en un diagnóstico. Un marcador puede ser, por ejemplo, un polipéptido o un antígeno, o puede ser un anticuerpo que se enlaza a un antígeno. Un marcador puede ser también cualquier par de enlace o socios de enlace, siendo el par de enlace o los socios de enlace entidades con una especificidad entre sí, tal como un anticuerpo y antígeno, hormona y receptor, un ligando y la molécula a la que se enlaza el ligando para formar un complejo, una enzima y co-enzima, una enzima y sustrato etcétera. "Marcador de pronóstico" es un marcador que se encuentra presente antes de la detección del cáncer de pulmón utilizando técnicas conocidas. Por lo tanto, el presente análisis detecta los autoanticuerpos específicos del cáncer de pulmón antes de encontrar un cáncer radiográficamente detectable en un paciente, por ejemplo, hasta cinco ' años antes de que se note un cáncer detectable radiográficamente. Tales autoanticuerpos son marcadores de pronóstico. "Población objetivo" significa cualquier subgrupo de una población tipificada por un marcador, estado, condición, enfermedad etcétera, particular. Por lo tanto, la población objetivo puede ser pacientes particulares con una forma o etapa particular de cáncer de pulmón, o una población de fumadores, por ejemplo. Una población objetivo puede comprender personas con uno o más factores de riesgo. Una población objetivo puede comprender personas con un resultado de prueba sospechoso, tal como la presencia de una anormalidad en el pulmón que merece un monitoreo adicional y más cronometrado. "Radiográfico" se refiere a cualquier método de visualización, tal como CAT, PET, rayos X etcétera. "Cáncer radiográficamente detectable" se refiere al diagnóstico o detección del cáncer mediante medios radiográficos. La presencia del cáncer se confirma generalmente mediante histología. "Muestra de tejido" se refiere a una muestra de un tejido en particular. Para una muestra de tejido que se encuentra en forma de líquido, la muestra puede ser un fluido corporal o puede provenir de un tejido líquido, tal como sangre, o una alícuota de sangre procesada. La frase se refiere también a un fluido obtenido a partir de un tejido sólido, tal como, por ejemplo, un exudado, fluido de cultivo de tejido gastado, los lavados de un tejido sólido molido etcétera. Selección de Biomarcador La selección e identificación de los marcadores asociados con el cáncer de pulmón, tales como, autoanticuerpos, y las proteínas que tienen afinidad específica a estos o que se enlazan por los mismos, puede ser mediante cualquier medio utilizando los métodos disponibles para el técnico. En el caso de biomarcadores de anticuerpos, puede practicarse cualquiera de una variedad de métodos basados en inmunología. Como se conoce en la técnica, los aptámeros, spiegelmeros y lo similar que tienen una especificidad de enlace pueden utilizarse también en lugar del anticuerpo. Muchos métodos de alto rendimiento conocidos que dependen de una reacción de anticuerpo-antígeno pueden practicarse en la presente invención. Las moléculas de individuos en la población objetivo pueden compararse con aquellas de una población de control para identificar cualquiera que sea específica del cáncer de pulmón, utilizando, por ejemplo, sustracción selección etcétera. Alternativamente, las muestras de la población objetivo y de la población normal (control) pueden utilizarse para identificar moléculas que son específicas para la población objetivo a partir de una biblioteca de moléculas. Puede practicarse una forma se selección por afinidad con bibliotecas, utilizando un anticuerpo como sonda para explorar una biblioteca de moléculas candidato. El uso de un anticuerpo para explorar a los candidatos se conoce como "biopanorámica" . Después queda validar las moléculas específicas de la población objetivo y el uso de las mismas, y después determinar la capacidad de los marcadores individuales para predecir miembros de la población objetivo. Un medio adecuado es obtener bibliotecas de moléculas, ya sean específicas para cáncer de pulmón o no, y explorar esas bibliotecas por moléculas que se enlazan a anticuerpos en miembros de la población objetivo. Debido a que los epítopes de proteína o de polipéptido pueden ser tan pequeños como 3 aminoácidos, pero pueden ser de menos de 10 aminoácidos de longitud, de menos de 20 aminoácidos en longitud etcétera, el tamaño promedio de los miembros individuales de la biblioteca es una selección de diseño. Por lo tanto, los miembros más pequeños de la biblioteca pueden ser de aproximadamente 3-5 aminoácidos para imitar un determinante único, mientras que los miembros de 20 o más aminoácidos pueden imitar o contener 2 o más determinantes. La biblioteca tampoco necesita restringirse a polipéptidos debido a que otras moléculas, tales como carbohidratos, lípidos, ácidos nucleicos o combinaciones de los mismos, pueden ser epítopes y por lo tanto utilizarse como o para identificar marcadores de cáncer de pulmón. Debido a que el proceso de identificación del biomarcador busca identificar epítopes más que proteínas intactas u otras moléculas, las bibliotecas exploradas o visualizadas no son necesariamente específicas de cáncer de pulmón sino que pueden obtenerse a partir de moléculas de individuos normales, o pueden obtenerse a partir de poblaciones de moléculas aleatorias, aunque el uso de muestras de pacientes con cáncer de pulmón puede mejorar la probabilidad de identificar biomarcadores de cáncer de pulmón - - adecuados. Las epítopes, o moléculas de reacción cruzada, no obstante, se encuentran presentes y son inmunogénicas en pacientes con cáncer de pulmón, sin tener en cuenta la función de las moléculas que contienen los epítopes. Las ejemplificaciones de esos métodos se describen en los ejemplos utilizando bibliotecas de fago de ADNc específico de cáncer de pulmón T7 y una biblioteca de péptido aleatorio M13. Ambas se cargaron en bibliotecas de visualización de fago, como se conoce en la técnica. Una de las bibliotecas de ADNc NSCLC fago T7 utilizadas se encuentra comercialmente disponible (Novagen, Madison, I, USA), y la otra biblioteca T7 se construyó a partir de la línea celular de adenocarcinoma, NCI-1650 (donación de H. Oie, NCI, National Institute of Health, Bethesda, MD, USA) . Por lo tanto, una biblioteca de fago puede construirse como se conoce en la técnica. El ARN total del tejido o células objetivo se extrae y se selecciona. Se conduce la síntesis de primera cadena de ADNc, asegurando la representación de secuencias de aminoácidos tanto de terminal N como de terminal C. El producto de ADNc se liga en un vector fago compatible para generar la biblioteca. La biblioteca se amplifica en un huésped bacteriano adecuado y para fago lítico, tal como T7, las células se lisan para obtener una preparación de fago. Los usados se titulan bajo condiciones estándar y se almacenan después de la - purificación. Para otro fago, el virus puede verterse en el medio, tal como con M13, en cuyo caso el virus se recolecta del sobrenadante y se ajusta. La biblioteca fago se sometió a biopanorámica o se exploró con una muestra de tejido, preferentemente una muestra de fluido, tal como plasma o suero, de pacientes con cáncer de pulmón, y con una muestra de tejido análogo, tal como plasma o suero de donantes sanos normales, para identificar las moléculas potenciales desplegadas reconocidas por ligandos, tales como anticuerpos de circulación, en pacientes con cáncer de pulmón. En una modalidad, la muestra de tejido es una muestra de sangre, tal como plasma o suero, y el objetivo es identificar marcadores reconocidos mediante anticuerpos encontrados en el plasma o suero de la población objetivo, tal como, pacientes con cáncer de pulmón de célula no pequeña. Para retirar los fagos que se reconocen por los anticuerpos de la población no objetivo de la biblioteca, la biblioteca de desplegado de fago, por ejemplo, se expone a suero normal o suero depositado. Los fagos no reactivados se separan de aquellos reactivados con las muestras de la población no objetivo. Los fagos no reactivados se exponen después a suero de NSCLC para aislar los fagos reconocidos por los anticuerpos en el suero de pacientes con NSCLC. Los fagos reactivos se recolectan, se amplifican en una bacteria - - huésped adecuada, los usados se recolectan, se almacenan, y se identifican como "muestra 1" o como "biopanorámica 1". La biopanorámica y los procesos de amplificación pueden repetirse múltiples veces, utilizando generalmente las mismas muestras de control y objetivo para mejorar el proceso de purificación. Los fagos de las biopanorámicas representan una población enriquecida que es más probable que contenga moléculas expresadas reconocidas específicamente por los anticuerpos en muestras de pacientes con NSCLC. Debido a que muchas bibliotecas fago expresan polipéptidos, puede decirse que los fagos seleccionados expresan y representan "péptidos de captura" para anticuerpos asociados con NSCLC. Para seleccionar adicionalmente los clones de fago que expresen moléculas que se encuentran enlazadas por anticuerpos específicos de NSCL, los usados de fago individuales seleccionados en las biopanorámicas pueden localizarse de forma robótica, por ejemplo, portaobjetos (Schleicher y Schuell, Keene, NH) utilizando un Seleccionador (Affymetrix, Santa Clara, CA) para producir una micro-disposición con una pluralidad de moléculas candidato expresadas mediante fago que se enlazaron mediante los anticuerpos en el suero de pacientes con NSCLC. Para identificar cuáles moléculas de visualización fago son posibles moléculas de captura específicas de NSCLC (capaces de enlazar anticuerpos Específicos de NSCLC) , el portaobjetos de exploración se incuba con, por ejemplo, muestras individuales de suero de paciente de NSCLC, de forma ideal, no los que se utilizaron en las biopanorámicas, y explorados adicionalmente utilizando una metodología de inmunoanálisis estándar. Los anticuerpos que se enlazan a fagos pueden identificarse, por ejemplo, mediante marcado de color doble con reactivos inmunes adecuados, como se conoce en la técnica, en donde el producto de expresión del vector de fago se marca con una primera molécula informante coloreada o detectable, para responder a la cantidad del producto de expresión en cada sitio, y el anticuerpo que se enlaza al polipéptido expresado por el fago se marca con una segunda molécula informante coloreada o detectable, que puede distinguirse de la primera molécula informante. Una forma conveniente de interpretar los datos para identificar las moléculas de captura asociadas o específicas para NSCLC enlazadas mediante anticuerpos en muestras de NSCLC, es mediante el análisis de regresión asistido por computadora de múltiples variables que indican la señal media y la desviación estándar de todos los polipéptidos en el portaobjetos. El tratamiento estadístico se dirige a un fago individual para determinar la especificidad, y también se dirige a una pluralidad de fagos para determinar si un subconjunto de fagos puede proporcionar mayor capacidad de predicción para determinar si una muestra es de un paciente con o que posiblemente tiene NSCLC. El tratamiento estadístico de monitoreo de muestras plurales permite determinar el nivel de variabilidad dentro de un análisis. A medida que el muestreo de las poblaciones aumenta, la variabilidad puede utilizarse evaluar entre la variabilidad de análisis y proporcionar parámetros de población confiables. Por lo tanto, los fagos que se enlazan a anticuerpos en muestras de paciente a un grado mayor que otro fago en el portaobjetos, chip, etcétera, se consideran candidatos, cuando, por ejemplo, la señal es > 1, > 2, > 3 o más desviaciones estándar a partir de la norma (la señal media en el chip) . En algunos de los experimentos descritos en la presente, los candidatos representaron aproximadamente 1/100 de los polipéptidos visualización de fago en el chip de exploración construido con una biblioteca T7 en biopanorámica cuatro veces. Los clones de fago candidatos se recopilan en un "chip de diagnóstico" y se evalúan adicionalmente por su valor predictivo independiente para discriminación de las muestras de pacientes de NSCLC a partir de muestras de una población no NSCLC. Los marcadores de diagnóstico se seleccionan por la capacidad para señalar/detectar/identificar la presencia o futura presencia de cáncer de pulmón radiológicamente detectable en un sujeto. Debido a que algunas condiciones tienen múltiples etiologías, múltiples orígenes celulares etcétera, y con cualquier enfermedad se presenta en entorno heterogéneo, un panel o pluralidad de marcadores pueden predecir mejor o diagnosticar esa condición particular. El cáncer de pulmón es una condición tal. Como se conoce en la técnica de la bioestadística, existe un número de esquemas estadísticos diferentes que pueden implementarse para averiguar la capacidad de predicción colectiva de múltiples variables relacionadas, tales como un panel de marcadores o. reactividad con un panel de marcadores. Por lo tanto, por ejemplo, puede utilizarse un modelo estadístico dinámico para interpretar datos de una pluralidad de factores para desarrollar una prueba de' pronóstico basada en el uso de dos o más de tales factores. Otros métodos incluyen el modelo Bayesiano que utiliza las probabilidades condicionales, análisis de cuadrado mínimo, análisis de cuadrado mínimo parcial, regresión logística múltiple, redes neuronales, análisis discriminatorio, análisis en base a la posición de libre distribución, combinaciones de los mismos, variaciones de los mismos y etcétera para seleccionar un panel de marcadores adecuados para su inclusión en un análisis de diagnóstico. El objetivo es el manejo de múltiples variables, y después procesar los - - datos para maximizar la métrica deseada, ver por ejemplo, Pepe & Thompson, Biosta tistics 1, 123-140, 2000; Mclntosh & Pepe, Biometrics 58, 657-664, 2002; Baker, Biometrics 56, 1082-1087, 200; DeLong et al., Biometrics 44, 837-845, 1988; y Kendziorski et al., Biometrics 62, 19-27, 2006, por ejemplo. De aquí que, en ciertas circunstancias, el tratamiento estadístico busca maximizar una métrica de predicción, tal como el área debajo de la curva (AUC) de las curvas de característica de recepción operación (ROC) . Los tratamientos producen un procedimiento de formulación o algoritmo para maximizar los resultados que se basan en un juego de variables seleccionado, revelando la influencia relativa de cualquiera o todas las variables para el resultado maximizado. La influencia relativa de un marcador puede observarse en una fórmula derivada que describe la relación como un coeficiente de una variable. Por lo tanto, por ejemplo, los dos paneles de cinco marcadores identificados en los estudios ejemplificados descritos en la presente más adelante, se seleccionaron a partir de tal análisis, y la AUC máxima, una marca, se describe mediante una fórmula que incluye los cinco marcadores, con el peso relativo de cualquiera de los marcadores en la fórmula para obtener máxima capacidad de predicción representada como un coeficiente de aquella variable. El coeficiente representa una ponderación, y la fórmula derivada puede verse como la suma de las variables ponderadas que producen una suma ponderada. El objetivo es encontrar un balance en la maximización, por ejemplo, de la especificidad y sensibilidad, o el valor predictivo positivo, sobre una pluralidad de variables seleccionadas, y preferentemente mínimas (los marcadores) para permitir un análisis de diagnóstico robusto a la luz de esos parámetros. El peso o la influencia de una variable para el resultado maximizado se deriva de los datos hasta ahora averiguados y analizados, y recalculados a medida que se incremente el número de pacientes analizados. A medida que el número de pacientes aumenta, puede aumentar también la confianza de que una métrica representa un valor medio de población con un rango de valores de fiabilidad límite alrededor de la media. Como se notará en los ejemplos en la presente más adelante, los cinco paneles de marcador ejemplificados contienen marcadores que tienen una especificidad individual que excede la especificidad observada de la exploración CT. Por lo tanto, cualquiera de los marcadores que tiene una especificidad mayor a 65% puede utilizarse con ventaja como un análisis de diagnóstico para cáncer de pulmón debido a que el presente análisis será tan eficiente en el diagnóstico de cáncer de pulmón como el estándar actual, y suministrado a un menor costo y de forma menos invasiva. También, se nota que los cinco marcadores juntos proporcionan mayor capacidad de predicción, sin importar la métrica, que cualquier otro marcador. Los marcadores pueden predecir en diferentes subpoblaciones o la expresión de dos o más de los marcadores puede coordinarse, por ejemplo, pueden compartir una presencia o función biológica común. El valor predictivo agregado no es necesariamente aditivo y las diferentes combinaciones de marcadores pueden proporcionar diferentes grados de precisión de predicción. El tratamiento estadístico utilizó una capacidad de predicción maximizada y la combinación de cinco marcadores fue el resultado basado en las poblaciones de referencia estudiadas. Por lo tanto, una muestra de paciente se prueba con los cinco marcadores y el diagnóstico, en principio, se calcula en base a los cinco marcadores, dada la presencia coordinada de dos o más de los marcadores y la métrica de diagnóstico en base a la pluralidad de marcadores, tal como uno de los cinco paneles de marcadores mostrados en la presente más adelante. Como se trata en la presente, debido al tratamiento estadístico, tal como la regresión logística, cualquiera de las variables que contribuyen a la métrica multivariable puede tener mayor o menor contribución al total maximizado. Si un paciente tiene una marca, una suma y lo similar que es al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60% o mayor de la métrica agregada de los cinco marcadores, incluso en circunstancias en donde el paciente puede ser negativo para uno o más de los marcadores, debido a ser positivo a alguno o más de los marcadores fuertemente ponderados, ese paciente se considera más propenso a ser positivo para cáncer de pulmón. El umbral de marca, suma y lo similar, que puede ser un valor de referencia o estándar, que puede ser un valor medio de población, y el valor aceptable de similitud de muestra de paciente/experimental a esa marca, suma y lo similar para producir un resultado de prueba positivo, indicativo de la posibilidad de la presencia de cáncer de pulmón, es una selección de diseño y puede determinarse mediante un análisis estadístico que proporciona un límite de fiabilidad o nivel de detección de una muestra positiva o puede desarrollarse empíricamente, a riesgo de un positivo falso. Como se mostró en la presente anteriormente, ese nivel puede ser al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60% o mayor, que la métrica agregada de los cinco marcadores o de la suma de población, el valor de referencia, etcétera. El umbral o "tolerancia", es decir, el grado de similitud aceptable de la marca del paciente, suma y lo similar a partir de la marca de población, suma y lo similar puede incrementarse, es decir, la marca de paciente, debe encontrarse muy cerca de la marca de población, para aumentar la sensibilidad. La capacidad de predicción de un marcador o un - - panel puede medirse utilizando cualquiera de una variedad de estadísticas, tales como, especificidad, sensibilidad, valor predictivo positivo, valor predictivo negativo, precisión de diagnóstico, AUC, de, por ejemplo, curvas ROC que son una relación entre la especificidad y la sensibilidad, aunque se sabe que la forma de la curva ROC es una consideración relevante del valor predictivo, y etcétera, como se conoce en la técnica. El uso de marcadores múltiples permite una prueba de diagnóstico que es más robusta y hace más probable diagnosticar en una mayor población dada la mayor capacidad de predicción agregada de la pluralidad de marcadores considerados juntos en comparación con el uso de cualquier marcador por si solo. Como se tratará en mayor detalle en la presente más adelante, la presente invención contempla el uso de diferentes formatos de análisis. Las micro-disposiciones permiten probar múltiples muestras de forma simultánea. Por lo tanto, un número de muestras de control, positivas y negativas, pueden incluirse en la micro-disposición. La selección puede entonces llevarse a cabo con un tratamiento simultáneo de muestras plurales, tales como una muestra de una o más muestras de paciente que se sabe afectado, y una o más muestras de normales, conjuntamente con una o más muestras que van a probarse y compararse, las experimentales, la muestra de paciente, la muestra que se probará etcétera. La inclusión de controles internos en el análisis permite la normalización, calibración y estandarización de la fuerza de señal dentro del análisis. Por ejemplo, cada uno de los controles positivos, controles negativos y experimentales puede llevarse a cabo en plural, y las muestras plurales pueden ser una dilución serial. Los sitios de control y experimentales pueden seleccionarse también de forma aleatoria dispuestos en el dispositivo de micro-disposición para minimizar la variación debida a la ubicación del sitio de muestra en el dispositivo de prueba. Por lo tanto, la micro-disposición o chip con controles internos permite el diagnóstico de experimentales (pacientes) probados simultáneamente en la micro-disposición o chip. Tal método múltiple de prueba y de adquisición de datos de forma controlada permite el diagnóstico de pacientes dentro de un dispositivo de análisis dado que se cuenta con los controles adecuados y si el panel de marcadores son aquellos que de forma individual tienen una capacidad de predicción razonablemente alta, tales como, por ejemplo, un AUC para una curva ROC de >.85, y un AUC total a través de los cinco marcadores de >.95, entonces puede obtenerse un resultado de diagnóstico inmediato. El análisis puede operarse de forma cualitativa cuando se encuentra que cada uno de los marcadores de un - - panel tiene características relativamente comparables, tales como aquellas de los ejemplos más adelante. Por lo tanto, una muestra de paciente con cáncer de pulmón posiblemente será positiva para los cinco marcadores, y tal muestra, es muy probable que sea positiva de cáncer de pulmón. Esto se validará determinando las probabilidades en base a los cinco marcadores como un todo como se describe en la presente, obteniendo la suma o marca de una métrica de los cinco marcadores para el paciente y después comparando esa figura con la capacidad de predicción de los marcadores, derivada utilizando una herramienta estadística como se trató en la presente anteriormente. Un paciente positivo para cuatro de los marcadores, debido a que la capacidad de los cuatro marcadores posiblemente permanece sustancial, también debe considerarse en riesgo, puede diagnosticarse con cáncer de pulmón y/o debe examinarse en mayor detalle. Un paciente positivo únicamente para tres marcadores puede desencadenar la necesidad de repetir la prueba, una prueba utilizando otros marcadores, una prueba radiografía u otra, o puede llamarse para otra prueba con el presente análisis dentro de otro intervalo de tiempo dado. De aquí que, para un panel de n marcadores, existe una fórmula derivada de capacidad de predicción, tal como una fórmula de regresión, que define la gráfica de máxima probabilidad que define la relación de los cinco marcadores con el resultado. El paciente puede ser positivo para menos de n marcadores en cuyo caso el paciente puede considerarse positivo o probablemente positivo para consideración adicional cuando una mayoría, digamos 50% o más de la mitad, de los marcadores se encuentran presentes en ese paciente. También, si el paciente presenta signos abiertos potencialmente sintomáticos de un trastorno pulmonar, dado que algunos paneles pueden ser específicos para una enfermedad en particular, tal como NSCLC, puede ser que el paciente necesite un análisis adicional para descartar otros trastornos pulmonares. Por lo tanto, en cualquier análisis que utiliza n marcadores, puede obtenerse un resultado preliminar, cualitativo en base al número bruto de señales positivas del número total de marcadores probados. Un umbral razonable puede ser positivo para el 50% o más de los marcadores. Por lo tanto, si se prueban cuatro marcadores, puede considerarse presuntamente que una muestra positiva para 2, 3 o 4 de los marcadores tiene posiblemente cáncer de pulmón. Si se prueban cinco marcadores, una muestra positiva para 3, 4 o 5 marcadores puede considerarse presuntamente positiva. El umbral puede variar como una selección de diseño. En base a la adquisición y tratamiento estadístico de datos, desde el punto de vista de una población, un panel de marcadores optimizado puede ser dinámico y puede variar al paso del tiempo, puede variar con el desarrollo de nuevos marcadores, puede varias a medida que cambia la población, se incrementa y etcétera. También, a medida que la población probada incrementa su tamaño, la fiabilidad del subconjunto de marcador, los coeficientes ponderados y la posibilidad de probabilidad precisa del diagnóstico pueden ser más certeras si los marcadores se relacionan biológica o mecánicamente, y por lo tanto las desviaciones, límites de fiabilidad o límites de error disminuirán. Por lo tanto, la invención contempla también el uso de un subconjunto de marcadores que son útiles en la población general. Alternativamente, un dispositivo de análisis de interés puede contener únicamente un subconjunto de marcadores, tal como el panel de cinco marcadores que se utilizaron en los ejemplos mostrados en la presente más adelante, que se encuentran optimizados para cierta población. Los insertos de clon de fago que codifican para polipéptidos pueden analizarse para determinar la secuencia de aminoácidos del polipéptido expresado. Por ejemplo, los insertos de fago pueden amplificarse con PCR utilizando iniciadores de vector de fago comercialmente disponibles. Los clones únicos se identifican en base a las diferencias en tamaño y en el patrón de digestión de enzimas de los productos de PCR y después los productos de PCR únicos se purifican y se secuencian. Los polipéptidos codificados se identifican mediante comparación con secuencias conocidas, tales como, la base de datos GenBank utilizando el programa de búsqueda BLAST. Por lo tanto, por ejemplo, las Tablas 1 y 2 a continuación resumen los clones de fago T7 de ADNc de cáncer de pulmón que se enlazan a un autoanticuerpo en pacientes con cáncer de pulmón.

Tabla 1 - - * La porción alfabética del nombre del clon de fago en esta y las siguientes tablas se fija como una designación de laboratorio. Como se utiliza en la presente, la porción numérica del nombre del clon de fago es una identificación no ambigua de un clon. ** Clones redundantes. La Tabla 2 proporciona otros clones identificados como asociados con NSCLC que no parecen codificar para un polipéptido conocido. Tabla 2 GGATGTGGGGTAGAAGAAGAAAA CTTCGAAGGCTTAATCTCTTTCAG CTCTGAAAC TCAC CATCT AGA TTCGAGAGTTTGCCGACCTAACT CGGGTTGAAACTTTTGGCTTTCA GGGGAAAGCTCTGAGCTCACTTT GTGCACTGAGTGATGTCACCATT TCTACCTGCCACGTATCGGCGAA GGTTGGGACTCGACTGGTGTTTG 10 ATCACGATGGGAAAATCATCCAG AAAACCCCCTACCCCCACCCCAG AGGGACCACAGTCAGCGTGAAG - CAGTTATTTTCTACGCTACCTGTG CGCCATAAGGAATTTCAAAGGAA 15 TATTAAGAAGTACAGAACCTGCTA AGGCCATCAAACCTATTGATCGG AAGTCAGTCCATCANATTTGCTCT GGGCCGGTGGTACTGAGTCTAA GCACTGCGGTGAAGAAGATAGTA 20 GGAAACAGTCTGGATGCTGGTGC CACTAATATTGATCTAAAGCTTG (SEQ ID NO:26) L1747 EEFIA GGGACGATTAGCTAGCATTTGTG CCAATTTCTGGTTGGAATGGTGA 25 - - CAACATGCTGGAGCCAAGTGCTA ACATGCCTTGGTTCAAGGGATGG AAAGTCACCCGTAAGGATGGCAA TGCCAGTGGAACCACGCTGCTTG AGGCTCTGGACTGCATCCTACCA CCAACTCGTCCAACTGACAAGCC CTTGCGCCTGCCTCTCCAGGATG TCTACAAAATTGGTGGTATTGGTA CTGTTCCTGTTGGCCGAGTGGAG 10 ACTGGTGTTCTCAAACCCGGTAT GGTGGTCACCTTTGCTCCAGTCA ACGTTACAACGGAAGTAAAATCT GTCGAAATGCACCATGAAGCTTG CGGCCGCACTCGAGTAACTAGTT 15 AACCCCTTGGGGCCTCTAAACGG GTCTTGGAGGGGTTAACNAGTTG CTCGAGTGGGGCGGCNGGCTNC TTGGTGGTTTATTTCAGA (SEQ ID NO:27) 20 G1954 MALATI CTCGGGGATCCGAATTTCAAGCG GCAAGAAGTTTCAG ATAAG AA ATGAAAAACAAGCTAAGACAAGT ATTGGAGAAGTATAGAAGATAGA AAAATATAAAGCCAAAAATTGGAT 25 AAAATAGCACTGAAAAAATGAGG - - AAATTATTGGTAACCAATTTATTTT AAAAGCCCATCAATTTAATTTCTG GTGGTGCAGAAGTTAGAAGGTAA AGCTTGAGAAGATGAGGGTGTTT ACGTAGACCAGAACCAATTTAGA AGAATACTTGAAGCTAGAAGGGG AAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA ACTAGTTAACCCCTTGGGGCCTC 10 TAAACGGGTCTTGAGGGGTTAAC TCGAGTTACTCGTGGGCGCAGCT CTTTGCTTAGTATTTTTAATGGTT GGTTGTAACCTTTCGTTTCTCATC GCCGAATTATGATGGTTTTAAATA ATGATCATAATTCTTTCTTTTTACT TGGTTTTTTTTTTTCACTTTTACTT TCTGTTTATGAAGCACGCCCGCC CCACAA (SEQ ID NO: 28) G1689 XRCC5 ATGCTCGGGGATCCGAATTCAGC TTGGGAACGCGGCCATTTCAAAG GGGAAGCCAAAATCTCAAGAAAT TCCCAGCAGGTTACCTGGAGGC GGATCATCTAATTCTCTGTGGAAT G AT C CAC T T TATTACAAG GGATAAGCTTGCGGCCGCACTC 10 GGAAAGCATGATATGTATATTGCT GAGTTGTTAGCCTTTTAAGCTTGC GGCCGCACTCGAGTAACTAGTTA ACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGG TCTTGAGGGGTTA (SEQ ID NO: 30) L1829 L1841 BMI-1 GGTACGAATTAGCCAGANATCGG L1676 L1916 GGCGAGTACAATGGGGATGTGG GCGCGGGAGCCCCGCTCCCCTT TTTTAGCAGCACCTCCCAGCCCC GCAGAATAAAACCGATCGCNNCC CCTCCGCGCGCGCCCTCCCCCG AGATGCGGAGCGGGAGGAGGCG GCGGCGGCCGAGGAGGAGGAG GAGGAGGCCCCGGAGGAGGAGG CGTTGGAGGTCGAGGCGGAGGC GGAGGAGGAGGAGGCCGAGGC GCCGGANGAGGCCNAGGCGCCG GAGCAGGAGGAGGCCGGCCGGA GGCGGCATGAGACGAGCGTGGC GGCCGCGGCTGCTCGGGGCCGC GCTGGTTGCCCATTGACAGCGGC GTCTGCAGCTCGCTTCAAGATGG CCGCTTGGCTCGCATTCATTTTCT GCTGAACGACTTTTAACTTTCNTT GTCTTTTCCGCCCGCTTCNATCG CCTCNCGCCGGCTGCTCTTTCCG GGATTTTTTATCAAGCAGAAATGC ATCG (SEQ ID NO: 31) También pueden utilizarse bibliotecas de péptido aleatorias para identificar polipéptidos candidato que se enlazan a anticuerpos circulantes en pacientes de NSCLC pero no en normales. Por lo tanto, por ejemplo, una biblioteca de péptido de visualización fago que comprende 109 péptidos aleatorios fusionados a una proteína de recubrimiento de virus menor puede explorarse para capturar proteínas que se enlazan al anticuerpo del paciente con cáncer de pulmón utilizando técnicas similares a las descritas anteriormente, tal como utilizando micro-disposiciones, y como se conoce en la técnica. Una biblioteca M13 que se utilizó (New England Biolabs) expresa un inserto de polipéptido de aminoácidos 7 como una estructura de bucle en la superficie de fago. Como se describe en la presente, la biblioteca es biopanorámica para enriquecer las proteínas de expresión fago que se reconocen específicamente por los anticuerpos circulantes en el suero del paciente de NSCLC. Los usados de fago de clones seleccionados se pueden localizar de forma robótica (Affymetrix, Santa Clara, CA) en duplicado sobre - portaobjetos (Schleicher and Schuell, Keene, NH) . Los fagos dispuestos se incuban con una muestra de suero de un paciente con NSCLC para identificar las proteínas que expresan fago enlazadas por anticuerpos circulantes asociados con tumor pulmonar. Utilizando un inmunoanálisis, con moléculas informantes adecuadas, las líneas de regresión generadas por computadora que indican la señal media y la desviación estándar de todos los polipéptidos en el portaobjetos, se utilizan para identificar péptidos que se enlazaron por anticuerpos en el plasma del paciente de NSCLC. Las cantidades significativas de enlace fago del anticuerpo de una muestra de plasma NSCLC (por ejemplo, >3 desviaciones estándar a partir de la norma) se consideran candidatos para evaluación adicional. TABLA 3 M13 Clones - - MC2998 ATGCCGGCTACTACGCCTCAG Met Pro Ala Thr Thr Pro (SEQ ID NO:48) Gln MC3000 AAGGCGTGGTTTGGGCAGATT Lys Ala Trp Phe Gly Gln (SEQ ID NO:49) He MC3018 AAGAATTGGTTTGGTCATACG Lys Asn Trp Phe Gly His (SEQ ID NO:50) Thr MC3023 CATACTCATCATGATAAGCAT His Thr His His Asp Lys (SEQ ID NO:51) His MC3046 ATTACGAATAAGTGGGGGTAT He Thr Asn Lys Trp Gly (SEQ ID NO:52) Tyr MC3050 CTGAATACGCATTCGTCTCAG Leu Asn Thr His Ser Ser (SEQ ID NO:53) Gln MC3143 GGGCCTGCGTGGGAGGATCCG Gly Pro Ala Trp Glu Asp (SEQIDNO:54) Pro MC3146 AGTCAGTCTTATCATAAGCGTAC Ser Gln Ser Tyr His Lys TAGC (SEQ ID NO: 55) Arg Thr Ser Los clones específicos de cáncer de pulmón adicionales aún no secuenciados, se proporcionan en la Tabla 4 a continuación. TABLA 4 Clones M13 El objetivo de la exploración de alto rendimiento de bibliotecas no es identificar todas las proteínas específicas de cáncer, sino por el contrario, identificar un cohorte de marcadores de predicción que como panel puede utilizarse para predecir la inclusión de un sujeto dentro de un cohorte de cáncer de pulmón o no con un grado máximo de especificidad y sensibilidad. Como tal, no es el objetivo del procedimiento generar un perfil proteómico comprensivo, o identificar per se, proteínas de la enfermedad, tales como proteínas de cáncer de pulmón, sino identificar un número de marcadores que predicen enfermedad y cuando se agregan como un panel, permiten un análisis de predicción robusto para una enfermedad heterogénea en una población heterogénea. Cualquier marcador puede tener o puede no tener un papel directo en la oncogénesis pulmonar, o como un péptido, el papel real de la molécula de la cual se origina el péptido puede ser desconocido en el presente.

Medición del enlace de anticuerpo a proteínas de captura individuales La captura de proteínas recopiladas en un chip de diagnóstico puede utilizarse para medir la cantidad relativa de anticuerpos específicos de cáncer de pulmón en una muestra de sangre. Esto puede lograrse utilizando una variedad de plataformas, diferentes formulaciones del polipéptido (e.g., expresados en fago, derivados de ADNc, biblioteca de péptido o proteína purificada) , y diferentes permutaciones estadísticas que permiten la comparación entre y conjuntamente con las muestras. La comparación requerirá que las mediciones se estandaricen, ya sea mediante calibración externa o normalización interna. Por lo tanto, en la disposición de portaobjetos de vidrio ejemplificada comprendida de múltiples proteínas de captura de expresión de fago (por ejemplo, fago M13 y T7) y múltiples proteínas de control externo negativas (fagos no enlazados mediante anticuerpos en plasmas de paciente y fagos M13 o T7 que carecen de insertos - llamados fagos "vacíos") utilizando un inmunoanálisis como medio de exploración, los datos se normalizaron mediante etiquetado fluorescente de dos colores de cápsidas de fago y enlace de anticuerpo de muestra de plasma utilizando dos procedimientos estadísticos no limitados : 1) Relación de señal anticuerpo/de cápsida fago Las proteínas de captura identificadas en la exploración, múltiples fagos no reactivos, más fagos "vacíos" en chips de diagnóstico únicos se incuban con muestra (s) utilizando técnicas inmunoquímicas estándar y tintado de doble color. La señal media (o media) del enlace de anticuerpo a la proteína de captura se divide entre la señal media (o media) de un anticuerpo comercial contra la proteína de cápsida de fago para justificar la cantidad total de proteína en el punto. Por lo tanto, la relación de señal de plasma/cápsida de fago (por ejemplo, relación de señal Cy5/Cy3) proporciona una medición normalizada de los anticuerpos humanos contra una única proteína de expresión de fago. Las mediciones pueden después normalizarse adicionalmente sustrayendo la reactividad de fondo contra el fago vacío y dividiéndola entre la señal media de fago (o media), [ (Cy5/Cy3 de fago) - (Cy5/Cy3 de fago vacío) / (Cy5/Cy3 de fago vacío)]. Esta metodología es cuantitativa, reproducible, y compensa la variabilidad de chip-a-chip, permitiendo la comparación de muestras . 2) Residual estandarizado Las proteínas de captura identificadas en la exploración, los fagos múltiples no reactivos, más los fago "vacíos" en chips de diagnóstico únicos se incuban con muestra (s) utilizando técnicas inmunoquímicas estándar y tintado de doble color. La distancia desde una línea de regresión estadísticamente determinada se mide, después se estandariza dividiendo esa medida entre la desviación residual estándar. Este procedimiento produce además una medida fiable de la cantidad del enlace de anticuerpo a cada proteína única de expresión de fago sobre la cantidad de proteína en cada punto, es cuantitativa, reproducible, y compensa la variabilidad de chip-a-chip, permitiendo la comparación de muestras. Tal normalización de señal puede utilizarse con los desconocidos que serán probados en un análisis de diagnóstico para determinar si un pacientes es positivo o no para un marcador. El análisis puede basarse en una determinación cualitativa de la presencia de anticuerpo, por ejemplo, cualquier valor normalizado por encima del fondo se considera una evidencia de ese anticuerpo. Alternativamente, el análisis puede cuantificarse determinando la resistencia de la señal para un marcador, como un reflejo del vigor de la respuesta del anticuerpo. Por lo tanto, el valor numérico real normalizado de una reacción a un marcador puede utilizarse en la determinación de fórmula de diagnóstico de cáncer como se describe en la presente. Identificación de marcadores de predicción Las mediciones normalizadas para todas las proteínas candidato de expresión de fago puede analizarse independientemente por las diferencias estadísticas significativas entre un grupo de paciente y un grupo normal, por ejemplo, mediante prueba t utilizando software estadístico JMP (SAS, Inc., Cary, NC) . Varias combinaciones de marcadores con diferentes niveles de discriminación independiente para las muestras probadas pueden combinarse estadísticamente en una variedad de formas. El tratamiento estadístico es aquel que compara, de forma analítica multivariable, todos los marcadores en varias combinaciones para obtener un panel de marcadores con máxima probabilidad de ser asociados con la presencia de enfermedad. Como en cualquier población estadística, la selección de marcadores se dicta por el nombre y tipo de muestras utilizadas. Como tal, una "combinación de marcadores óptima" puede variar de población a población o basarse en la etapa de la anomalía, por ejemplo. Una combinación de marcadores óptima puede alterarse cuando se prueba en un conjunto de muestras grande (>1000) en base a la variabilidad que puede no ser aparente en dimensiones de muestra más pequeñas (<100) o puede demostrar desviación reducida debida a la validación predominante en la población del marcador. La regresión logística ponderada es un procedimiento lógico para combinar marcadores con un valor predictivo independiente mayor y menor. Una combinación de marcadores óptima para discriminar muestras probadas puede definirse organizando y analizando los datos utilizando curvas ROC, por ejemplo. Predicción de clase Las respuestas estandarizadas para todas las proteínas candidato de expresión de fago se analizan independientemente para diferencias estadísticamente significativas entre un grupo de paciente y un grupo normal, por ejemplo, mediante prueba t. El tratamiento estadístico es aquel que compara, de forma analítica multivariable, todos los marcadores en varias combinaciones para obtener un panel de marcadores con máxima probabilidad de asociarse con la presencia de cáncer. Los paneles (la medidas combinadas de dos o más marcadores) ejemplificados en la presente para cáncer de pulmón tienen un alto valor predictivo combinado y demuestran una excelente discriminación (cáncer si vs . cáncer no). Aunque la presente invención incluye paneles de péptido particulares que se seleccionaron por la capacidad para discriminar entre muestras disponibles de cáncer y normales, se apreciará que la invención se ha desarrollado utilizando algunos, pero no todos los marcadores identificados, y no todos los marcadores potencialmente identificables, o combinaciones de los mismos. Por lo tanto, un panel puede comprender al menos dos marcadores; al menos tres marcadores; al menos cuatro marcadores; al menos cinco marcadores; al menos seis marcadores; al menos siete marcadores; al menos ocho marcadores; al menos nueve marcadores; al menos diez marcadores y así sucesivamente, el número de marcadores se - - rige por el análisis estadístico para obtener la máxima capacidad de predicción de los resultados. Por lo tanto, por ejemplo, los ejemplos y paneles descritos en la presente son únicamente ejemplos. Desde un punto de vista estadístico, la inclusión de marcadores adicionales finalmente llevará a una prueba que identificará todos los individuos afectados en una muestra. Sin embargo, una modalidad comercial puede no requerir o necesitar o desear un gran número de marcadores debido a consideraciones de costo, los tratamientos estadísticos que pueden requerirse debido a que un gran número de variables se consideran, quizá la necesidad de un mayor número de controles reduciendo por consiguiente el número de experimentales que pueden probarse al mismo tiempo etcétera. La comercialidad tiene diferentes puntos finales desde la certeza científica. Sin embargo, la observación de que un mayor número de marcadores o un panel de marcadores diferentes pueden mejorar la sensibilidad y/o la especificidad, conduce a la modalidad en donde los estudios de seguimiento subsecuentes para un análisis positivo con un número menor de marcadores, probará la muestra de paciente con un número menor o mayor de marcadores, o un panel de marcadores diferente para descartar la posibilidad de un positivo falso. Tales estudios de seguimiento utilizando un análisis de interés con un panel de biomarcadores reconfigurado es una alternativa atractiva a técnicas más costosas y potencialmente invasivas, tales como CT que expone al paciente a niveles altos de radiación, o una biopsia. Por lo tanto, por ejemplo, un paciente positivo para tres o menos de un panel de cinco marcadores, puede probarse con un panel de marcadores más grande como una prueba confirmatoria. El presente análisis puede servir también como confirmación de otro formato de análisis, tal como una exploración de rayos X o CT, particularmente si la exploración de rayos X o CT es aquella que no proporciona un diagnóstico definitivo, lo cual conducirá a la necesidad de repetir la prueba, para un seguimiento rápido de un periodo prolongado o acortado hasta la próxima prueba y así sucesivamente. Por lo tanto, el presente análisis puede utilizarse como un seguimiento en tales pacientes. Una prueba positiva confirmará la probabilidad de cáncer de pulmón, y una prueba negativa indicará ya sea un cáncer benigno o ningún tipo de cáncer, y la exploración no-diagnóstica de rayos X o CT reveló una variación del tejido normal . Debido a que la predicción de tipo precisa en un análisis "comercialmente disponible" se basará en mediciones de un gran número de muestras de una demografía amplia, toda la prueba de muestra retrospectiva durante el desarrollo puede finalmente incorporarse como clasificadores, y la capacidad del análisis, tal como el valor predictivo, se mejorará continuamente. Además de este aspecto dinámico del desarrollo del análisis, la naturaleza de un análisis múltiple (marcador múltiple) permite agregar marcadores de predicción en cualquier punto en el desarrollo o la implementación . En contexto, validar marcadores para su uso en diagnóstico servirá al propósito secundario de generar un conjunto altamente estable de clasificadores que mejoren la precisión de predicción definiendo un "rango normal". La desviación desde ese rango normal proporcionará una probabilidad estadística de enfermedad (por ejemplo >2 desviaciones estándar a partir de la norma) aunque los valores límite que son más apropiados para el diagnóstico clínico tendrán que determinarse por la variabilidad en una población objetivo dada. Análisis de marcador múltiple y aplicación Como se trata en mayor detalle en la presente, la presente invención contempla el uso de diferentes formatos de análisis. Las micro-disposiciones permiten la prueba simultánea de múltiples muestras. Por lo tanto, puede incluirse un número de muestras de control, positivas y negativas, en la micro-disposición. De aquí que, el análisis puede llevarse a cabo con el tratamiento simultáneo de muestras plurales, tales como una muestra de un paciente que se conoce afectado y una muestra con un normal, conjuntamente con una muestra que se probará. Llevar a cabo controles internos permitirá la normalización, calibración y estandarización de la resistencia de la señal dentro del análisis . Por lo tanto, la micro-disposición, dispositivo MEMS, dispositivo NEMS o chip con controles internos permite un diagnóstico inmediato para experimentales (pacientes) probados simultáneamente en el dispositivo. Los dispositivos MEMS y NEMS pueden ser aquellos utilizados para análisis de micro-disposición, o pueden encontrarse en un formato de "laboratorio en un chip", tal como incorporando microfluídicos etcétera que permitirán formatos e informantes de análisis adicionales. Para mejorar la capacidad y el valor predictivo, y la capacidad de aplicación a través de poblaciones en general, y reducir costos, el formato del presente análisis puede variar desde inmunoanálisis estándar, tal como el inmunoanálisis de tira reactiva y de flujo lateral, que generalmente detectan uno o un número reducido de objetivos de forma simultánea a un bajo costo de fabricación, hasta formatos de tipo ELISA que frecuentemente se configuran para operar en un plato de cultivo de pozo múltiple que puede procesar, por ejemplo, 96, 384 o más muestras de forma simultánea y son comunes en entornos de laboratorios clínicos y son dóciles para automatización, para formatos de disposición y micro-disposición cuando se prueban muchas más muestras simultáneamente en forma de alto rendimiento. El análisis también puede configurarse para producir una discriminación simple, cualitativa (cáncer si vs . cáncer no). Sin embargo son posibles múltiples aplicaciones diferentes en el manejo de enfermedades y pueden producirse marcadores únicos para cualquier aplicación como se muestra en la presente. Se obtienen diferentes conjuntos de marcadores para distinguir el cáncer de pulmón de otros tipos de cáncer, distinguir el cáncer en etapa temprana del tardío, distinguir subconjuntos específicos de cáncer y para seguir el progreso de la enfermedad después de la intervención terapéutica. Por lo tanto, un régimen de tratamiento puede evaluarse y manipularse como sea necesario mediante pruebas seriales repetidas con el presente análisis para monitorear el progreso del tratamiento o la remisión. Una versión cuantitativa del análisis, por ejemplo, conteniendo una dilución serial de moléculas de captura, puede discriminar la disminución del tamaño del cáncer con el tratamiento. Una vez que los epítopes particulares, tales como péptidos, se identifican para detectar autoanticuerpos circulantes, los epítopes particulares pueden utilizarse en análisis de diagnóstico, en formatos conocidos en la técnica.

- - Debido a que la interacción es una reacción inmune, puede presentarse un diagnóstico adecuado en cualquiera de una variedad de formatos de inmunoanálisis conocidos. Por lo tanto, un epítope puede fijarse a una fase sólida, por ejemplo, utilizando química conocida. También, los epítopes pueden conjugarse a otra molécula, frecuentemente más grande que el epítope para formar una molécula conjugada sintética o puede fabricarse con una molécula compuesta utilizando métodos recombinantes, como se conoce en la técnica. Muchos polipéptidos se enlazan de forma natural a superficies plásticas, tales como superficies de polietileno, que pueden encontrarse en dispositivos de cultivo de tejido, tales como placas de pozo múltiple. A menudo, tales superficies plásticas se tratan para mejorar el enlace de moléculas biológicamente compatibles a ellas. Por lo tanto, los polipéptidos forman un elemento de captura, se expone un líquido sospechoso de portar un autoanticuerpo que se enlaza específicamente a ese epítope, al elemento de captura, el anticuerpo se fija e inmoviliza al elemento de captura, y entonces, después de un lavado, el anticuerpo enlazado se detecta utilizando una molécula informante etiquetada detectable adecuada, tal como un anticuerpo anti-humano etiquetado con un metal coloidal, tal como oro coloidal, un fluorocromo, tal como fluoresceína, y etcétera. Ese mecanismo se representa, por ejemplo, mediante un ELISA, RÍA, inmunoanálisis Western etcétera. El formato particular del inmunoanálisis para detectar autoanticuerpo es una selección de diseño. Alternativamente, debido a que el fago particular expresa un epítope enlazado específicamente mediante los autoanticuerpos encontrados en pacientes con cáncer de pulmón (cuyos clones se nombran específicamente y se almacenan como reservas, y se encontrarán disponibles bajo petición cuando madure una patente a partir de la presente solicitud) , el elemento de captura de un análisis puede ser el fago individual, tal como se obtuvo a partir de un lisado celular, cada uno en un sitio de captura en una fase sólida. También puede utilizarse un vehículo reactivamente inerte, tal como una proteína, tal como albúmina y hemocianina de lapa californiana, o un vehículo sintético, tal como un polímero sintético, al cual se enlaza el epítope expresado, similar a un hapteno en un vehículo, o cualquier otro medio para presentar un epítope de interés en la fase sólida para un inmunoanálisis . Alternativamente, un formato puede tomar la configuración en donde un elemento de captura fijado a una fase sólida es aquel que se enlaza a las porciones de no enlace de antígeno de inmunoglobulina, tal como la porción Fc del anticuerpo. Por consiguiente, un elemento de captura adecuado puede ser Proteína A, Proteína G o un anticuerpo a-Fc. El plasma de paciente se expone al reactivo de captura y después se detecta la presencia del anticuerpo específico del cáncer de pulmón utilizando, por ejemplo, un marcador etiquetado en un formato directo o de competición, como se conoce en la técnica. De forma similar, el elemento de captura puede ser un anticuerpo que se enlaza al fago visualizando el epítope para proporcionar otros medios para producir un reactivo de captura específico, como se trató anteriormente. Como se conoce en la técnica del inmunoanálisis, el elemento de captura es un determinante al que se enlaza un anticuerpo. Como se muestra en la presente, el determinante puede ser cualquier molécula, tal como una molécula biológica, o porción de la misma, tal como un polipéptido, polinucleótido, lípido, polisacárido, etcétera, y combinaciones de los mismos, tales como glicoproteína o una lipoproteína, cuya presencia se correlaciona con la presencia de un anticuerpo encontrado en pacientes con cáncer de pulmón. El determinante puede ser de origen natural, y purificado, por ejemplo. Alternativamente, el determinante puede producirse mediante medios recombinantes o producirse de forma sintética, lo cual puede minimizar la reactividad cruzada. El determinante puede no tener una función biológica aparente o no necesariamente asociarse con un estado particular, sin embargo, esto no resta valor a su uso en un análisis de diagnóstico de interés. La fase sólida de un inmunoanálisis puede ser cualquiera de las conocidas en la técnica, y en formas conocidas en la técnica. Por lo tanto, la fase sólida puede ser un plástico, tal como poliestireno o polipropileno, un vidrio, una estructura a base de sílice, tal como un chip de silicona, una membrana, tal como nilón, un papel etcétera. La fase sólida puede presentarse en un número de formatos diferentes y conocidos, tales como en formato de papel, una microesfera, como parte de una tira reactiva o dispositivo de flujo lateral, que generalmente emplea membranas, una placa de microtitulación, un portaobjetos, un chip etcétera. La fase sólida puede presentarse como una superficie plana rígida, como la que se encuentra en un portaobjetos de vidrio o un chip. Algunos dispositivos de detección automatizada han dedicado desechables asociados con un medio para leer la señal detectable, por ejemplo, un espectrofotómetro, un contador de escintilación líquido, un colorímetro, un fluorómetro y lo similar para detectar y leer una señal a base de fotones. Otros reactivos inmunes para detectar el enlace del anticuerpo se conocen en la técnica. Por ejemplo, un anticuerpo Ig anti-humano sería adecuado para formar un intercalado que comprende el determinante de captura, el autoanticuerpo y el anticuerpo Ig anti-humano. El anticuerpo Ig anti-humano, el elemento detector, puede etiquetarse directamente con una molécula informante, tal como una enzima, un metal coloidal, radionuclido, un tinte etcétera, o puede enlazarse por si mismo mediante una molécula secundaria que sirve la función de informante. Esencialmente, puede utilizarse cualquier medio para detectar un anticuerpo enlazado, y tales medios pueden contener cualquier medio para una función de informante para producir una señal discernible por el operador. El etiquetado de moléculas para formar un informante se conoce en la técnica. En el contexto de un dispositivo que permite el análisis simultáneo de una multitud de muestras, un número de elementos de control, pueden incluirse controles tanto positivos como negativos en el dispositivo de análisis para permitir controlar el desempeño del análisis, el desempeño de reactivo, la especificidad y la sensibilidad. A menudo, como se mencionó, la mayoría, si no todas las etapas para producir el dispositivo de interés y muchas de las etapas del análisis pueden conducirse mediante medios mecánicos, tales como un robot, para disminuir el error técnico. También, los datos de tales dispositivos pueden digitalizarse mediante medios de escaneo, la información digital se comunica a medios de almacenamiento de datos y los datos se comunican también a un medio de procesamiento de datos, en donde el tipo de análisis estadístico tratado en la presente, o como se conoce en la técnica, puede efectuarse sobre los datos para producir una medida del resultado, que puede compararse después con una referencia estándar o compararse internamente con el presente con un resultado de análisis mediante medios de presentación de datos, tales como una pantalla o lector de información, para proporcionar la información de diagnóstico. Para dispositivos que analizan un número reducido de muestras o en donde se encuentran disponibles suficientes datos de población, puede proporcionarse una métrica derivada para lo que constituye un resultado positivo y un resultado negativo, con mediciones de error apropiadas. En esos casos, un único control positivo y un único control negativo pueden ser todo lo necesario para la validación interna, como se conoce en la técnica. El dispositivo de análisis puede configurarse para producir un resultado más cualitativo, ya sea incluido o no en una agrupación de cáncer de pulmón, por ejemplo . Otros formatos de inmunoanálisis de alto rendimiento y/o automatizados pueden utilizarse como se conoce y se encuentra disponible en la técnica. Por lo tanto, por ejemplo, puede utilizarse un análisis en base a microesferas, enterrado, por ejemplo, en señales colorimétricas, fluorescentes o luminiscentes, tal como la tecnología Luminex (Austin TX) que se basa en microesféras rellenas de tinte y el sistema BD (Franklin Lakes, NJ) - - Cytometric Bead Array. En cualquier caso, los epítopes de interés se fijan a una microesfera. Otro análisis múltiple es el método de disposición en capas de Gannot et al., J. Mol . Diagnostics 7, 427-436, 2005. El método se basa en el uso de múltiples membranas, cada una portando un par de enlace diferente, tal como una molécula objetivo, tal como un antígeno o un marcador, las membranas configuradas en registro para aceptar una muestra que se sospecha que contiene el otro del par de enlace, para transferencia cromatográfica en registro. Se permite que la muestra se absorba o se transporte a través de un número de membranas alineadas para proporcionar una matriz tridimensional. Por lo tanto, por ejemplo, puede apilarse un número de membranas sobre un gel de separación y se permite que salgan los contenidos del gel del gel de separación y que pasen a través de las membranas apiladas. Cualquier asociación de moléculas entre aquellas fijas a cualquier membrana y aquellas transportadas a través de la pila de membranas, tal como un antígeno enlazado con un anticuerpo, puede visualizarse utilizando materiales y métodos conocidos informantes y de detección, ver por ejemplo, Patentes de E.U. Nos. 6,602,661 y 6,969,615; así como las Publicaciones de E.U. Nos 20050255473 y 20040081987. En otras modalidades, puede utilizarse una composición o dispositivo de interés para detectar diferentes clases de moléculas asociadas o correlacionadas con el cáncer de pulmón. Por lo tanto, un análisis puede detectar el autoanticuerpo circulante y las moléculas de no-anticuerpo asociadas o correlacionadas con el cáncer de pulmón, tales como un antígeno de cáncer de pulmón, ver, por ejemplo, Weynants et al., Eur. Respir. J., 10:1703-1719, 1997 y Hirsch et al., Eur. Respir. J., 19:1151-1158, 2002. Por consiguiente, un dispositivo puede contener como elementos de captura, epítopes para autoanticuerpos y moléculas de enlace para moléculas de cáncer de pulmón, tales como anticuerpos específicos, aptámeros, ligandos etcétera. Ejemplif icación de Muestreo y Prueba Las muestras dóciles para la prueba, particularmente en análisis de detección, generalmente, son aquellas fáciles de obtener de un paciente, y quizá, de forma no intrusiva o mínimamente invasiva. La muestra también es aquella que se sabe que contiene un anticuerpo. Una muestra de sangre es una muestra adecuada tal, y se encuentra fácilmente disponible en la mayoría de los formatos de inmunoanálisis. En el contexto de una muestra de sangre, existen varios tubos de recolección de sangre conocidos, muchos recolectan 5 o 10 ml de fluido. De forma similar a la mayoría de las pruebas de diagnóstico de sangre comúnmente ordenadas, se recolectan 5 ml de sangre, pero el presente - - análisis que opera como una micro-disposición posiblemente puede requerir menos de 1 ml de sangre. El recipiente de recolección de sangre puede contener un anticoagulante, tal como heparina, citrato o EDTA. Los elementos celulares se separan, generalmente mediante centrifugación, por ejemplo, a 1000 x g (RFC) durante 10 minutos a 4°C (produciendo -40% de plasma por análisis) y pueden almacenarse, generalmente a temperatura refrigerante o a 4°C hasta su uso. Las muestras de plasma preferentemente se analizan dentro de los 3 días de recolección o se almacenan congeladas, por ejemplo a -20°C. El exceso de muestra se almacena a -20°C (en un refrigerador sin escarcha para evitar el congelamiento descongelamiento de la muestra) durante hasta dos semanas para análisis repetido según se necesite. El almacenamiento durante periodos de más de dos semanas debe ser a -80°C. Los métodos de manejo y almacenamiento para preservar la estructura y función del anticuerpo se practican como se conoce en la técnica. Las muestras de fluido se aplican entonces a una composición de prueba, tal como una micro-disposición que contiene sitios cargados con, por ejemplo, muestras de polipéptidos purificados de uno de los cinco paneles de marcadores tratados en la presente, conjuntamente con muestras positivas y negativas adecuadas. Las muestras pueden proporcionarse en cantidades graduadas, tal como una dilución serial, para permitir la cuantificación. Las muestras pueden situarse de forma aleatoria en la micro-disposición para dirigir cualquier efecto de ubicación. Después de la incubación, la micro-disposición se lava y después se expone a un detector, tal como un anticuerpo anti-humano que se encuentra etiquetado con un marcador en particular. Para permitir la normalización de señal, puede agregarse un segundo detector a la micro-disposición por ejemplo, para proporcionar una medición de la muestra en cada sitio. Esto puede ser un anticuerpo dirigido a otro sitio en las muestras de polipéptido aisladas, el polipéptido puede modificarse para contener secuencias adicionales o una molécula que es inerte a la reacción específica, o los polipéptidos pueden modificarse para contener un informante antes de agregarse a la micro-disposición. La micro-disposición se lava otra vez, y después si es necesario, se expone a un reactivo para permitir la detección del informante. Por lo tanto, si el informante comprende partículas coloreadas, tales como solenoides metálicos, no son necesarios medios de detección particulares. Si se utilizan moléculas fluorescentes, se utiliza la luz incidente apropiada. Si se utilizan enzimas, la micro-disposición se expone a sustratos adecuados. Después la micro-disposición se evalúa por el producto de reacción enlazado a los sitos. Aunque puede ser una evaluación visual, existen dispositivos que detectarán y, si es necesario, cuantificarán la - - resistencia de la señal. Después se interpretan los datos para proporcionar información sobre la validez de la reacción, por ejemplo, observando las muestras de control positivas y negativas, y, si son válidas, se evalúan las muestras experimentales. Esta información se interpreta después para la presencia de cáncer. Por ejemplo, si el paciente es positivo para tres o más de los anticuerpos, el paciente se diagnostica como positivo para cáncer de pulmón. Alternativamente, la información en los marcadores puede aplicarse a la fórmula que describe la relación de máxima probabilidad de los cinco marcadores conjuntamente con el resultado, la presencia de cáncer de pulmón, y si el indicio de una marca del paciente es mayor que 50% del valor de esa misma marca del panel, el paciente se diagnostica como positivo para cáncer. Una marca adecuada pueden ser los valores AUC calculados. Uso de Equipo y Análisis La prueba de sangre de acuerdo con la presente invención tiene múltiples usos y aplicaciones, aunque el diagnóstico temprano o advertencia temprana para el seguimiento subsecuente es altamente convincente por su impacto potencial en resultados de enfermedad. La invención puede emplearse como una herramienta para complementar la exploración radiográfica para cáncer de pulmón. La exploración serial CT es generalmente sensible para cáncer de pulmón, pero tiende a ser bastante costosa y no específica (64% de especificidad reportada) . Por lo tanto, la CT da como resultado -un alto número de positivos falsos, cerca de cuatro en diez. La identificación rutinaria de nodulos pulmonares indeterminados durante la formación de imágenes radiográficas conduce frecuentemente a un trabajo costoso y a una intervención potencialmente dañina, incluyendo cirugía mayor. Actualmente, la edad y el historial de fumador son los únicos dos factores de riesgo que se han utilizado como criterio de selección por los grandes estudios de detección para cáncer de pulmón. El uso de la prueba de sangre de acuerdo con la presente invención para detectar cánceres radiográficamente aparentes (>0.5 cm) y/o cáncer oculto o pre-maligno (por debajo del límite de detección radiográfica convencional) definirá individuos para los cuales se garantiza más una exploración adicional. Por lo tanto, el presente análisis puede servir como una prueba de detección primaria, en donde un resultado positivo indica un examen adicional, como es convencional y conocido en la técnica, tal como análisis radiográfico, tal como un CT, PET, rayos X y lo similar. Adicionalmente, la repetición periódica de la prueba puede identificar un NSCLC emergente. Un ejemplo de cómo se puede incorporar la prueba sujeto en la práctica médica sería en donde los fumadores de - - alto riesgo (por ejemplo, personas que fuman el equivalente a un paquete por día durante veinte años o más) pueden recibir la prueba de sangre sujeto como parte de un examen físico anual. Un resultado negativo sin ningún síntoma abierto adicional puede indicar una prueba adicional al menos anualmente. Si el resultado de la prueba es positivo, el paciente recibirá una prueba adicional, tal como la repetición del presente análisis y/o una exploración CT o rayos X para identificar posibles tumores. Si no es aparente ningún tumor en la examinación CT o en rayos X, quizá el presente análisis, se repetirá una o dos veces dentro del año, y múltiples veces en los siguientes años hasta que el tumor tenga un diámetro de al menos 0.5 mm y pueda detectarse y retirarse quirúrgicamente. Como se expone en los siguientes Ejemplos, el -90% de la sensibilidad de un perfil de autoanticuerpo para NSCLC utilizando los paneles de cinco marcadores ejemplificados se compara bastante favorablemente al de la exploración CT sola, y mediante la comparación puede llevarse a cabo especialmente bien para tumores pequeños, y representa un avance sin paralelo en la detección de enfermedades ocultas. Además, la especificidad mayor de 80% del presente análisis excede la de la exploración CT, que se vuelve mucho más importante a medida que el porcentaje de nodulos pulmonares benignos aumenta en la población en riesgo, aumentando a niveles de aproximadamente 70% de participantes en el Mayo Clinic Screening Trial, por ejemplo. Además del uso en la exploración, el análisis y el método de la presente invención pueden también ser útiles para los problemas clínicos estrechamente relacionados de distinción de nodulos benignos de malignos identificados en la examinación CT. El nodulo pulmonar solitario (SPN) se define como una única lesión esférica de un diámetro menor a 3 cm que se encuentra completamente rodeada por tejido pulmonar normal. Aunque la predominancia de malignidad reportada en SPNs ha oscilado de aproximadamente 10% a aproximadamente 70%, los estudios más recientes que utilizan la definición moderna de SPN revelan que la predominancia de malignidad es de aproximadamente 40% a aproximadamente 60%. La mayoría de las lesiones benignas son el resultado de granulomas mientras que la mayoría de las lesiones malignas son cáncer de pulmón primario. La evaluación inicial de diagnóstico de un SPN se basa en la evaluación de factores de riesgo para malignidad tales como la edad, la historia de fumador, historia de malignidad previa y características de radiografía de tórax del nodulo tales como el tamaño, la calcificación, el borde (especulado, o suave) y el patrón de crecimiento basado en la evaluación de antiguas radiografías de tórax. Estos factores se utilizan después para determinar la probabilidad de malignidad y para guiar el manejo - - adicional del paciente. Después de una evaluación inicial, muchos nodulos se clasificarán como poseedores de una probabilidad intermedia de malignidad (25-75%). Los pacientes en este grupo pueden beneficiarse de la prueba adicional con el presente análisis antes de proceder a la biopsia o a la cirugía. La exploración serial que evalúa el crecimiento o la visualización metabólica (e.g., exploración PET) es la única opción no invasiva actualmente disponible y se encuentran lejos del ideal. El análisis radiográfico serial se basa en las mediciones de crecimiento, que requieren que una lesión no muestre crecimiento durante un periodo de tiempo de dos años; no se ha determinado un intervalo ideal entre las exploraciones aunque las exploraciones CT cada 3 meses durante dos años es una evaluación longitudinal convencional. La exploración PET tiene un 90-95% de especificidad para el cáncer de pulmón y un 80-85% de sensibilidad. Estos valores de predicción pueden variar en base a la predominancia regional de enfermedades granulomatosas benignas (e.g., histoplasmosis) . Actualmente las exploraciones PET cuestan entre $2000 y $4000 por prueba. Los rendimientos del diagnóstico de los procedimientos no quirúrgicos tales como broncoscopía o biopsia de aguja transtorácica (TTNB) oscilan de 40% a 95%. El manejo subsecuente en el entorno de un procedimiento no diagnóstico puede ser problemático. Frecuentemente se busca la intervención quirúrgica como la opción más viable con o sin llevar a cabo otro diagnóstico. La elección dependerá de si el riego de malignidad antes de la prueba es alto o bajo, de la disponibilidad de prueba en una institución particular, las características del nodulo (e.g., tamaño y ubicación), el riego quirúrgico del paciente, y las preferencias del paciente. La historia previa de otras malignidades extratorácicas sugiere de inmediato la posibilidad de cáncer metastásico al pulmón, y la relevancia de la prueba no invasiva se vuelve insignificante. En el escenario clínico confuso de SPN con sospecha clínica indeterminada para cáncer de pulmón, los marcadores de tumor circulantes pueden ayudar a evitar llevar a cabo un diagnóstico invasivo potencialmente dañino y por el contrario apoyan el fundamento de intervención quirúrgica agresiva. La invención descrita, por lo tanto, mejora la comodidad clínica de elegir visualizar serialmente un nodulo en lugar de un diagnóstico invasivo. La invención también tendrá una influencia en el intervalo para exploración por rayos X o CT, reduciendo por consiguiente los costos clínicos del cuidado de la salud. La invención descrita complementará o suplantará la exploración PET como un método efectivo en costo para incrementar adicionalmente la probabilidad de presencia o ausencia del cáncer de pulmón.

- - La invención será útil en la evaluación de recurrencia de la enfermedad después de la intervención terapéutica. Las pruebas de sangre para cáncer de colon y próstata se emplean comúnmente en esta capacidad, en donde los niveles del marcador se siguen como un indicador de éxito o fracaso del tratamiento y en donde los niveles de marcador elevados indican la necesidad de evaluación de diagnóstico adicional por recurrencia que conduce a la intervención terapéutica . La invención proporcionará información importante acerca de las características del tumor; determinar los subtipos del tumor con bajo pronóstico puede tener un impacto significativo en una decisión clínica para recomendar terapias adicionales con toxicidad potencial debido a que el análisis se basa en múltiples marcadores, de los cuales cualquiera puede ser característico de un cáncer en particular o de un parámetro único del mismo. El desarrollo de más novedosos tratamientos utilizados para la consolidación a largo plazo de la cirugía convencional o la quimioterapia puede requerir análisis cuidadosos en costo/beneficio y la selección de paciente. De aquí que, el presente análisis será una herramienta valiosa para la búsqueda, selección del tratamiento y para su uso continuo durante el tratamiento para monitorear el curso del tratamiento, el éxito del tratamiento, la recaída, la cura etcétera. Los reactivos del presente análisis, el panel de marcadores particulares pueden manipularse para ajustarse al propósito en particular. Por ejemplo, en un análisis de detección, se utiliza un panel de marcadores más grande o un panel de marcadores muy predominante para maximizar la capacidad de predicción para un mayor número de individuos. Sin embargo, en el contexto de un individuo, que experimenta el tratamiento, por ejemplo, puede obtenerse la huella del anticuerpo en particular del tumor del paciente, que puede requerir o no todos los marcadores utilizados para la exploración, y ese subconjunto de marcadores particularizado puede utilizarse para monitorear la presencia del tumor en ese paciente, y la intervención terapéutica subsecuente. Los componentes de un análisis de interés pueden configurarse en un número de formatos para distribución diferentes y lo similar. Por lo tanto, uno o más epítopes pueden alicuotarse y almacenarse en uno o más recipientes, tales como viales de vidrio, tubos de centrífuga y lo similar. La solución de epítope puede contener amortiguadores adecuados y lo similar, incluyendo preservativos, agentes antimicrobianos, estabilizadores y lo similar, como se conoce en la técnica. El epítope puede encontrarse en forma preservada, tal como desecado, secado - por congelación etcétera. Los epítopes pueden situarse en una fase sólida adecuada para su uso en un análisis particular. Por lo tanto, los epítopes pueden situarse, y secarse, en los pozos de una placa de cultivo, localizados sobre una membrana en una disposición en capas o en un dispositivo de inmunoanálisis de flujo lateral, localizados en un portaobjetos u otro soporte para micro-disposición, etcétera. Los artículos pueden empaquetarse como se conoce en la técnica para asegurar una máxima vida en anaquel, tal como con una envoltura de película plástica o una envoltura opaca, y en una caja. El contenedor del análisis puede contener también, muestras de control positivas y negativas, cada una en un recipiente, que incluyen, cuando la muestra es un líquido, un recipiente con un gotero o que tiene una tapa que permite el suministro de gotas, dispositivos de recolección de muestra, otros dispositivos de transferencia de líquidos, reactivos de detección, reactivos de revelado, tales como reactivos de tintura de plata y sustratos de enzima, solución de ácido/base, agua etcétera. Pueden incluirse instrucciones de uso adecuadas. En otros formatos, tales como el uso de análisis en base a microesferas, los epítopes plurales pueden fijarse a diferentes poblaciones de microesferas, que pueden combinarse después en un único reactivo, listo para exponerse a una muestra de paciente.

La invención se ejemplificará ahora en los siguientes ejemplos no limitantes, cuyos datos se han reportado en Zhong et.al., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 172:1308-1314, 2005 y Zhong et . Al., J. Thoracic Oncol . , 1:513-519, 2006, cuyos contenidos se incorporan mediante la referencia en la presente, en su totalidad. EJEMPLOS Ejemplo I-Análisis Diagnóstico de NSCLC En este ejemplo, se emprendió la identificación de los marcadores para diagnosticar NSCLC en etapa tardía (II, II y IV) . Dos bibliotecas de NSCLC fago T7 se sometieron a biopanorámica con plasma de paciente de NSCLC y normal para enriquecer una población de clones inmunológicos que expresan polipéptidos reconocidos por el anticuerpo circulante en pacientes de NSCLC. Se adquirió una biblioteca ADNc de NSCLC fago T7 (Novagen, Madison, WI, USA) y se construyó una segunda • biblioteca a partir de la línea celular de adenocarcinoma NCI-1650 utilizando los sistemas Novagen OrientExpress ADNc Synthesis and Cloning. Las bibliotecas se sometieron a biopanorámica con plasma depositado a partir de 5 pacientes de NSCLC (etapas 2-4; diagnóstico confirmado mediante histología) y de donantes normales sanos, para enriquecer la población de proteínas de expresión fago reconocidas por los anticuerpos asociados al tumor. Brevemente, la biblioteca de - - fago visualizada se seleccionó por afinidad incubando con microesferas de agarosa de proteína G recubiertas con anticuerpos de suero normal depositado (250 µl de suero normal depositado, diluido 1:20, a 4°C o/n) para retirar proteínas no específicas de tumor. Los fagos no enlazados se separaron del fago enlazado a anticuerpos en plasma normal mediante centrifugación. El sobrenadante se sometió después a biopanorámica contra microesferas de agarosa de proteína G recubiertas con plasma de paciente depositado (4°C o/n) y se separó del fago no enlazado mediante centrifugación. Los fagos enlazados/reactivos se eluyeron con 1% SDS y después se recolectaron mediante centrifugación. Los fagos se amplificaron en E coli NLY5615 (Gibco BRL Grand Island, NY) en presencia de 1 mM IPTG y 50 µg/ml de carbenicilina hasta la lisis. Los usados que contienen fago amplificado se recolectaron y se sometieron a tres rondas secuenciales adicionales de enriquecimiento biopanorámico. Los usados que contienen fago a partir del cuarto biopanorámico se amplificaron, los clones de fago individuales se aislaron y después se incorporaron en disposiciones de proteína como se describe a continuación. Construcción de Disposición y exploración de alto rendimiento Los lisados de fago a partir de la cuarta ronda de biopanorámica se amplificaron y cultivaron en placas de LB-agar cubiertas con 6% agarosa para aislar el fago individual.

Se utilizó un robot de selección de colonia (Genetic QPix 2, Hampshire, UK) para aislar 4000 colonias individuales (2000/biblioteca) . Los fagos seleccionados se amplificaron en placas de 96 pozos, después 5 ni del lisado limpio de cada pozo se localizaron en duplicado de forma robótica sobre portaobjetos FAST (Schleicher and Schuell, Keene, NH) utilizando un Posicionador Affymetrix 417 (Affymetrix, Santa Clara, CA) . Los 4000 fagos de exploraron después con cinco plasmas de paciente de NSCLC individuales no utilizados en la biopanorámica para identificar al fago inmunogénico. Se utilizó anticuerpo primario de conejo anti-T7 (Jackson Immuno-Research, West Grove, PA) para detectar proteínas de cápsida como control para la cantidad del fago. Tanto las muestras de plasma pre absorbido (plasma: lisado bacterial, 1:30) como los anticuerpos anti-T7 se disolvieron 1:3000 con 1 X TBS más 0.1% Tween 20 (TBST) y se incubaron con los portaobjetos de exploración durante 1 hora a temperatura ambiente. Los portaobjetos de lavaron y sondearon con anticuerpos secundarios anti-humano etiquetados Cy5 y anticonejo etiquetados Cy3 (Jackson ImmunoResearch; 1:4000 cada anticuerpo en 1 X TBST) juntos durante 1 hora a temperatura ambiente. Los portaobjetos se lavaron otra vez y después se escanearon utilizando un escáner Affymetrix 428. Las imágenes se analizaron utilizando el software GenePix 5.0 (Axon Instruments, Union City, CA) . Los fagos que contienen una relación de señal Cy5/Cy3 mayor a 2 desviaciones estándar desde una regresión lineal se seleccionaron como candidatos para su uso en un "chip de diagnóstico". Diseño del chip de diagnóstico y medición del anticuerpo Doscientos doce fagos inmunorreactivos identificados en la examinación de alto rendimiento descrita anteriormente, más 120 fagos T7 "vacíos", se combinaron se re-amplificaron y se situaron en duplicado sobre los portaobjetos FAST como chips de diagnóstico único. Los chips duplicados se utilizaron para analizar 40 muestras de NSCLC en etapa tardía utilizando el protocolo para exploración descrito anteriormente. La media de la señal Cy5 se normalizó a la media de la señal Cy3 (relación de señal Cy5/Cy3) como la medición del anticuerpo humano contra una proteína única de expresión de fago. Para compensar la variabilidad de chip a chip, las mediciones se normalizaron adicionalmente sustrayendo la reactividad de fondo del plasma contra las proteínas del fago T7 vacío y dividiendo la media de la señal T7 [ (Cy5/Cy3 del fago) - (Cy5/Cy3 de T7)/(Cy5/Cy3 de T7) ] . La prueba t de estudiante de la señal normalizada de 40 pacientes (etapa II-IV) y 41 normales permitió un límite estadístico (p<0.01) que sugirió un valor predictivo relativo de cada marcador candidato. De los 212 candidatos, 17 cumplieron ese criterio de límite (p=0.00003 a p=0.01). La redundancia dentro del grupo se evaluó mediante PCR y análisis de secuencia revelando varios clones duplicados y triplicados. Cuando se eliminaron los clones redundantes, se identificó un conjunto de 7 proteínas de expresión del fago. Análisis estadístico El análisis de regresión logística se llevó a cabo para predecir la probabilidad de que una muestra proviniera de un paciente de NSCLC. Se dividieron un total de 81 muestras de pacientes y normales en 2 grupos. Los pacientes se diagnosticaron en las Etapas II-IV de NSCLC. El primer grupo consistió de 21 muestras de plasma normales seleccionadas de forma aleatoria y 20 de pacientes que se utilizaron como un conjunto de adiestramiento para identificar marcadores que se distinguieron entre las muestras de paciente y las muestras normales utilizando marcadores individuales o una combinación. El segundo grupo consistió de 20 muestras de paciente y 20 normales que se utilizaron para validar la tasa de predicción de los marcadores identificados utilizando el grupo de adiestramiento. Se generaron curvas de características de operación del receptor (ROC) para comparar la sensibilidad y la especificidad de predicción con diferentes marcadores, y se determinó el área bajo la curva (AUC) . Los clasificadores se examinaron adicionalmente utilizando validación cruzada de exclusión. También se analizaron y se compararon las historias de fumador y la etapa de la enfermedad. Después se intercambiaron los dos grupos, y el grupo de 40 se convirtió en el grupo de adiestramiento para identificar marcadores que indicaron la presencia de NSCLC. Los marcadores así identificados como proveedores de la máxima capacidad de predicción se utilizaron después para diagnosticar NSCLC en el otro grupo de 41 muestras.

Tabla 5 Áreas bajo las curvas ROC y exactitud predictiva Conjunto de Adiestramiento* Conjunto de Validaciónf Clon de A AUUC1 § % Especificidad % Sensibilidad Fago % Especificidad % Sensibilidad 1864 .857 75 81 65 85 1896 .857 70 86 70 75 1919 .824 75 81 70 90 1761 .798 70 81 70 85 1747 .864 70 86 70 80 5 .983 92 95 90 95 Combinado * El conj unto de adiestramiento consistió de 21 muestras normales y 20 de pacientes de NSCLC . f El conj unto de validación consistió de 20 muestras normales y 20 de pacientes de NSCLC .

- AUC: área bajo la curva ROC Tabla 6 Validación de exclusión* % Exactitud Clon de Fago % Especificidad % Sensibilidad Diagnóstica! 1864 70 82.9 76.5 82.9 1896 70 75.3 82.9 1919 70 76.5 82.9 1761 60 71.6 82.9 1747 72.5 77.8 5 Combinado 87.5 90.2 88.9 * Validación de exclusión: una muestra se retiró del conjunto de prueba conteniendo un total de 81 muestras, se generó una clasificador para predecir el estado (normal o de paciente) de la muestra retirada utilizando el resto de las muestras. Este procedimiento se repitió para todas las muestras. t Precisión del diagnóstico = (número de positivos verdaderos + número de negativos verdaderos) /número total de muestras Análisis de secuencia de proteínas de expresión de fago Los 17 fagos que se seleccionaron para el valor predictivo putativo utilizando la prueba t y el valor p <0.01 se secuenciaron para identificar la redundancia, que reveló 7 secuencias únicas. Aunque la identidad de las proteínas de expresión de fago no es crítica para su uso en un análisis diagnóstico de interés, las secuencias se compararon con aquellas obtenidas en estudios previos que utilizaron metodología de exploración diferente (independiente) y se compararon también con la base de datos del GenBank para obtener una posible identidad. Las secuencias de nucleótidos obtenidas a partir de los 7 clones mostraron homología con GAGE 7, NOPP140, EEFIA, PMS2L15, paxillina y clon BAC RP11-499F19. De las 7 proteínas, EEF1A (factor 1 de alargamiento de translación eucariótica) , un componente de núcleo de la maquinaria de la síntesis de proteína, y GAGE7, un antígeno de cáncer de testículo, se sobre expresan en algunos cánceres de pulmón. La paxillina es una proteína de adhesión focal que regula la adhesión y la migración de la célula. La expresión aberrante y actividad anómala de la paxillina se ha asociado con un fenotipo metastásico agresivo en algunas enfermedades incluido el cáncer de pulmón. PMS2L es una proteína de ADN que no forma pares relacionada a la reparación pero hasta ahora no se ha detectado ninguna mutación en cáncer. De forma similar, SEC15L2, una proteína de tráfico intracelular, y NOPP140, una proteína nucleolar involucrada en la regulación de la actividad transcripcional, no tienen asociación maligna conocida. La función fisiológica de esas tres proteínas, sin embargo, sugiere que cada una puede tener un papel en el fenotipo maligno.

Modelo estadístico y precisión de predicción del análisis Para desarrollar clasificadores utilizando las proteínas únicas de expresión fago 7 para tasas de predicción más altas, las 81 muestras se dividieron de forma aleatoria en dos grupos, uno fue utilizado para propósitos de adiestramiento y el otro para validación. La regresión logística se utilizó para calcular la sensibilidad y la especificidad de la precisión de predicción utilizando proteínas individuales de expresión de fago así como una combinación de múltiples marcadores de expresión de fago. Los resultados muestran que 5 marcadores de fago tienen una capacidad significativa para distinguir muestras de paciente de controles normales en el conjunto de tratamiento. La AUC de ROC para cada individuo varió de 0.79 a 0.86. Una combinación de 5 marcadores logró una tasa de predicción prometedora (AUC=0.98), con 95% de sensibilidad y 85% de especificidad (Tabla 5) . Utilizando este modelo estadístico para probar al grupo de validación que consiste de 20 muestras de control normales y 20 NSCLC, el análisis proporcionó una sensibilidad de 90% y una especificidad de 95% (Tabla 5) . Para examinar adicionalmente la asociación de los clasificadores con sensibilidad y especificidad de diagnóstico, se llevó a cabo una predicción de clase utilizando validación cruzada de exclusión en los todos los 81 chips. La sensibilidad y especificidad fueron de 90% y 87%, respectivamente, con las 81 muestras, y la precisión de diagnóstico total fue de 89% (Tabla 6) . También utilizando todas las 81 muestras, la ID del clon correspondiente, el nombre del gen y el valor p fueron los siguientes: 1864, GAGE7, p=9.1 x 10"9; 1896, BAC clon RP11-499F19, p=3.5 x 10"8; 1919, SEC15L2, p=1.2 x 10"6; 1761, PMS2L15, p=5.2 x 10"7; y 1747, EEFIA, p=5.9 x 10"7. Todos los 5 marcadores pasaron una corrección Bonferroni de 0.001/262 = 3.8 x 10~6 haciendo la probabilidad de que uno o más de ellos sea un positivo falso menor que 0.001. Por lo tanto, sobretodo, el panel de cinco marcadores se utilizó para segregar las muestras de 40 pacientes de NSCLC y 41 normales con una tasa de 85% de identificación exitosa cuando una muestra contenía los cinco marcadores . Ejemplo 2 - Detección de cáncer de pulmón en etapa temprana En este ejemplo, se investigó la capacidad del análisis y el método de acuerdo con la presente invención para identificar marcadores capaces de distinguir cáncer de pulmón en etapa I y enfermedades ocultas a partir de muestras de control comparadas con riesgo. Sujetos humanos Después del consentimiento informado, se obtuvieron muestras de plasma de individuos con histología confirmada de NSCLC en la Universidad de Kentucky y el Lexington Veterans Administration Medical Center. Se seleccionaron los controles no cancerígenos de forma aleatoria a partir de 1520 sujetos que participaron en el Mayo Clinic Lung screening Trial. Brevemente, los individuos fueron elegibles para la prueba de detección CT con un historial de fumador de un mínimo de 20 paquetes al año, edad entre 50-75, y ninguna otra enfermedad dentro de los 5 años de la entrada al estudio. Además de las muestras no cancerígenas del Mayo Lung Screening Trial, se encontraron disponibles seis muestras de NSCLC en etapa I, y 40 muestras pre diagnóstico para el análisis. Se extrajeron muestras pre diagnóstico a la entrada al estudio de sujetos diagnosticados con cánceres de incidencia de NSCLC en exploración CT de uno a cinco años después de la donación de la muestra. Biblioteca de fago Las bibliotecas de fago, el paneo y la exploración fueron como se describió anteriormente. Diseño de chip de diagnóstico y medición de anticuerpo Doscientos doce fagos inmunorreactivos identificados en la examinación de alto rendimiento anterior, mas 120 fago T7 "vacíos", se combinaron, se re amplificaron y se situaron en duplicado sobre portaobjetos FAST como chips de diagnóstico único. Los chips replicados se utilizaron para analizar 23 muestras de plasma de NSCLC en etapa I, y 23 de combinación de riesgo utilizando el protocolo para exploración descrito anteriormente. Análisis estadístico La relación Cy5/Cy3 normalizada para cada una de las 212 proteínas de expresión de fago se analizó independientemente por diferencias estadísticamente significativas entre 23 muestras de pacientes y 23 de control mediante la prueba t utilizando software estadístico JMP (SAS, Inc., Cary, NC) como se describió en el ejemplo previo. Todas las 46 muestras se utilizaron para construir clasificadores que fueron capaces de distinguir las muestras de paciente de las normales utilizando marcadores individuales o en combinación. Las curvas de ROC se generaron para comparar la sensibilidad y la especificidad de predicción y se determinó la AUC. Después se examinaron los clasificadores utilizando validación cruzada de exclusión para todas las 46 muestras. Después el conjunto de clasificadores se utilizó para predecir la probabilidad de enfermedad en un conjunto independiente de 102 casos y controles de combinación de riesgo del Mayo Clinic Lung Screening Trial. Los efectos relativos de la enfermedad pulmonar de fumador y otras no malignas también se evaluaron. La AUC de ROC para cada marcador individual, lograda analizando todas las 46 muestras para estimar la capacidad de predicción, fluctuaron de .74 a .95; y la combinación de los cinco marcadores indicó una capacidad significativa para distinguir las muestras de paciente en etapa temprana de los controles de combinación de riesgo (AYC=0.99). La sensibilidad y la especificidad computarizada utilizando validación cruzada de exclusión fueron de 91.3% y 91.3% respectivamente (Tabla 7). Un cohorte de muestra del prueba de detección CT de la Clínica Mayo que incluyó 46 muestras extraídas 0-5 años antes del diagnóstico (6 muestras de cánceres predominantes y 40 de pre cáncer) y 56 muestras de combinación de riesgo de la población explorada se analizaron después como un conjunto de datos independiente. Los resultados indicaron una clasificación precisa de las muestras no cancerígenas 49/56, 6/6 muestras de cáncer extraídas en el momento de la detección radiográfica en una exploración CT, 9/12 muestras extraídas un año antes del diagnóstico, 8/11 extraídas dos años antes, 10/11 extraídas 3 años antes, 4/4 extraídas 4 años antes del diagnóstico, 1/2 extraídas cinco años antes del diagnóstico, que corresponden a 87.5% de especificidad y 82.6% de sensibilidad. Tres de las ocho muestras pre cáncer se clasificaron de forma incorrecta por medio el análisis tuvieron una histología de célula broncoalveolar . En los conjuntos de prueba, 6/6 controles no cancerígenos se identificaron apropiadamente con un diagnóstico clínico de enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) , un individuo con sarcoidosis y un individuo con un intervalo de diagnóstico de cáncer de mama. En el último conjunto de prueba independiente, dos individuos con cáncer de próstata localizado se clasificaron también correctamente como normales. Un individuo con un diagnóstico previo de cáncer de mama (>5 años antes) se clasificó como no cancerígeno, pero un segundo fue clasificado como cáncer. Treinta y cuatro de setenta y nueve sujetos no cancerígenos tuvieron nodulos benignos detectados en las exploraciones CT. La historia de los fumadores activos contra los antiguos no pareció afectar la precisión de predicción de la prueba. Tampoco existió ninguna asociación de sensibilidad del análisis con el tiempo para el diagnóstico. Análisis de secuencia de proteínas de expresión de fago Las secuencias de nucleótidos de las cinco proteínas de expresión de fago de predicción se compararon con la base de datos del GenBank. Las secuencias de nucleótidos obtenidas a partir de los cinco clones utilizados en el modelo final de predicción mostraron gran homología a paxillina, SEC15L2, BAC clon RP11-499F19, XRCC5 y MALAT1. Los primeros tres se identificaron como inmunorreactivos con plasma de los pacientes con cáncer de pulmón de etapa avanzada descrito en el ejemplo anterior. XRCC5 es un gen de reparación de ADN sobre expresado en algunos cánceres de pulmón. La actividad anómala y la expresión aberrante de paxillina, una proteína de adhesión focal, se ha asociado con un fenotipo metastásico agresivo en cáncer de pulmón y otras enfermedades. MALAT1 es un ARN regulatorio conocido por ser expresado de manera anómala en cáncer de pulmón. El potencial del presente análisis para complementar la exploración radiográfica para cáncer de pulmón puede reconocerse en la validación subsecuente en donde las mediciones combinadas de estos cinco marcadores de anticuerpo predijeron correctamente 49/56 muestras no cancerígenas del Mayo Clinic Lung Screening Trial, así como 6/6 cánceres predominantes y 32/40 cánceres de incidencia a partir de la sangre extraída 1-5 años antes de la defección radiográfica, que corresponden a 87.5% de especificidad y 82.6% de sensibilidad. El reporte inicial del Mayo Clinic Lung Screening Trial describió 35 NSCLC diagnosticados mediante CT únicamente, un NSCLC detectado mediante examinación citológica de esputo únicamente, y un NSCLC en etapa IV clínicamente detectado entre las exploraciones anuales, que corresponden a 94.5% de sensibilidad de la exploración CT únicamente. Además, la revisión retrospectiva después de la primera exploración de incidencia anual reveló que pequeños nodulos pulmonares se perdieron en el 26% de las exploraciones predominantes, concordando con las tasas significativas de negativos falsos reportadas en otras pruebas de exploración CT. El diámetro de los nodulos retrospectivamente identificados fue menor a 4 mm en 231 participantes (62% de los 375 participantes), 4-7 mm en 137 (37%), y 8-20 mm en 6 (2%). Como tal, el 82.6% de sensibilidad del perfil del autoanticuerpo para NSCLC se compara de forma bastante favorable al de la exploración CT únicamente, mediante la comparación puede llevarse a cabo especialmente bien para tumores pequeños, y representa un avance sin paralelo en la detección de enfermedades ocultas. Además, el 87.5% de especificidad del presente análisis excede el de la exploración CT, que se hace más importante a medida que el porcentaje de nodulos pulmonares benignos se incrementa en la población en riesgo, que se eleva a niveles de 69% de los participantes en el Mayo Clinic Screening Trial (Prueba de Detección de la Clínica Mayo) .

/ Tabla 7. Regresión logística y validación de exclusión en grupo de adiestramiento Adiestramiento * Validación f Clon de AUC§ % Especificidad % Sensibilidad % Especificidad % Sensibilidad Fago L1919 0.85 82.6 78.3 82.6 60.9 L1896 0.95 87 87 87 87 G2004 0.80 82.6 65.2 82.6 65.2 G1954 0.74 82.6 87 73.9 69.6 G1689 0.82 82.6 65.2 82.6 65.2 5 0.99 100 95.7 91.3 91.3 Combinado El conjunto de adiestramiento consistió de 2~3 muestras normales de alto riesgo y 23 de paciente de NSCLC en etapa uno. Validación de Exclusión: La predicción de una muestra única basada en 45 casos y controles. § AUC: área bajo la curva de ROC Los cinco marcadores diagnosticaron con precisión cáncer de pulmón oculto y en Fase I. La presencia de los cinco marcadores en un sujeto puede y predice el cáncer antes del diagnóstico utilizando metodologías estándar. Los anticuerpos circulantes que se enlazan a células NSCLC se presentan en pacientes que actualmente se diagnostican como negativos utilizando las metodologías disponibles.

Todas las referencias citadas en la presente se incorporan en la presente mediante la referencia en su totalidad. Será evidente que pueden efectuarse varias modificaciones a las enseñanzas de la presente sin alejarse de la esencia y el alcance de la presente invención.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un método para seleccionar a un paciente para experimentar una prueba radiográfica para cáncer de pulmón que comprende: (a) proporcionar una muestra de fluido de dicho paciente; (b) determinar la presencia de un marcador asociado con cáncer de pulmón en dicha muestra; y (c) seleccionar pacientes para pruebas radiográficas que tengan dicho marcador en dicha muestra.
2. El método de la reivindicación 1, en donde dicho marcador es un autoanticuerpo.
3. El método de la reivindicación 1, en donde dicho paciente es asintomático . .
El método de la reivindicación 1, en donde dicho paciente es un paciente de alto riesgo sin cáncer de pulmón radiográficamente detectable.
5. El método de la reivindicación 1, en donde dicho marcador se expresa hasta cinco años antes que el cáncer de pulmón radiográficamente detectable se presente en dicho paciente.
6. Una composición que comprende un marcador de cáncer de pulmón, en donde dicho marcador es un socio de enlace de una molécula presente en una muestra de fluido de un paciente hasta cinco años antes de que el cáncer de pulmón - - radiográficamente detectable se presente en dicho paciente.
7. La composición de la reivindicación 6, en donde dicha molécula en dicha muestra es un autoanticuerpo.
8. La composición de la reivindicación 6 que comprende una microesfera.
9. La composición de la reivindicación 6 que comprende una membrana.
10. La composición de la reivindicación 6 que comprende una superficie plana.
11. Un dispositivo de análisis que comprende la composición de la reivindicación 6.
12. El dispositivo de análisis de la reivindicación 11 que comprende una micro-disposición.
13. Un método para detectar la probable presencia de cáncer de pulmón en un sujeto que comprende las etapas de: (1) proporcionar una muestra del sujeto; y (2) analizar dicha muestra para la presencia de al menos dos marcadores asociados con cáncer de pulmón; en donde (a) el cáncer de pulmón puede encontrarse presente en dicho sujeto si al menos la mitad de dichos marcadores se encuentran presentes en dicha muestra; o (b) el cáncer de pulmón puede encontrarse presente en dicho sujeto si (i) se obtiene un valor normalizado correlacionado con la presencia de cada uno de dichos al menos dos marcadores en dicha muestra, (ii) se agregan dichos valores normalizados para producir una suma; y (iii) se compara dicha suma con un valor de referencia que es el valor predictivo máximo del cáncer de pulmón de dichos al menos dos marcadores, dicha suma es al menos 30% de dicho valor de referencia.
14. El método de la reivindicación 13, en donde dichos al menos dos marcadores son autoanticuerpos.
15. El método de la reivindicación 13, que comprende al menos tres marcadores.
16. El método de la reivindicación 13, que comprende al menos cuatro marcadores.
17. El método de la reivindicación 13, que comprende al menos cinco marcadores.
18. El método de la reivindicación 13, que comprende al menos seis marcadores.
19. Un dispositivo de diagnóstico que comprende al menos dos marcadores de cáncer de pulmón y una fase sólida.
20. El dispositivo de la reivindicación 19, en donde dichos marcadores son epítopes de autoanticuerpos.
21. El dispositivo de la reivindicación 19, en donde dicha fase sólida comprende una microesfera.
22. El dispositivo de la reivindicación 19, en donde dicha fase sólida comprende una membrana.
23. El dispositivo de la reivindicación 19, que comprende una disposición. RESUMEN Un análisis diagnóstico para determinar la presencia de cáncer de pulmón en un paciente depende, en parte, de la comprobación de la presencia de un anticuerpo asociado con cáncer de pulmón. El análisis predice el cáncer de pulmón antes de la evidencia de tejido canceroso radiográficamente detectable. 1/23 LISTADO DE SECUENCIAS <110> University of Kentucky 20/20 Gene Systems Hirschowitz, E ard A. Zhong, Li Stromberg, Arnold J. Khattar, Nada H. <120> ANÁLISIS DIAGNÓSTICO DE CÁNCER DE PULMÓN <130> 0712.0006C <150> PCT/ US 06/060796 <151> 2006-11-10 <150> 60/806,778 <151> 2006-07-08 <150> 60/735,418 <151> 2005-11-10 <150> 60/735,555 <151> 2005-11-10 <160> 55 <170> Patentln versión 3.4 <210> 1 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Thr Leu Glu Arg Asn His Val Asn Val Asn Ser Val Val Asn Pro Leu 1 5 10 15 Val lie Leu Leu Pro lie Glu Tyr lie Lys Glu Leu Thr Leu Glu Lys 20 25 30 Ser Leu Met Asn lie Arg Asn Val Gly Lys His Phe lie Val Pro Asp 35 f 40 45 Pro lie Val Asp Met Lys Gly Phe Thr Trp Glu Lys Arg Leu lie Asn 50 55 60 Val Arg Asn Val Glu Lys His Ser Arg Val Pro Val Met Phe Val Tyr 65 70 75 80 2/23 Met Lys Gly Pro Thr Leu Gly Lys lie Ser Met Asn Val Ser Ser Val 85 90 95 Gly Lys His Tyr Pro Leu Leu Gln Val Phe Lys His Thr 100 105 <210> 2 <211> 56 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gly Lys Val Asp Val Thr Ser Thr Gln Lys Glu Ala Glu Asn Gln Arg 1 5 10 15 Arg Val Val Thr Gly Ser Val Ser Ser Ser Arg Ser Ser Glu Met Ser 20 25 30 Ser Ser Lys Asp Arg Pro Leu Ser Ala Arg Glu Arg Arg Arg Gln Ala 35 40 45 Cys Gly Arg Thr Arg Val Thr Ser 50 55 <210> 3 <211> 67 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ser Arg Arg Asn Gln Asn Cys Ala Thr Glu lie Pro Gln lie Val Glu 1 5 10 15 lie Ser lie Glu Lys Asp Asn Asp Ser Cys Val Thr Pro Gly Thr Arg 20 25 30 Leu Ala "Arg Arg Asp Ser Tyr Ser Arg His Ala Pro Trp Gly Gly Lys 35 40 45 Lys Lys His Ser Cys Ser Thr Lys Thr Gln Ser Ser Leu Asp Ala Asp 50 55 60 3/23 Lys Lys Phe 65 <210> 4 <211> 56 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Arg Asn Thr lie Leu Arg Gln Ala Arg Asn His Lys Leu Arg Val Asp 1 5 10 15 Lys Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu Gln Ala Lys Ser Asp Glu Lys 20 25 30 Ala Ala Val Ala Gly Lys Lys Pro Val Val Gly Lys Lys Gly Lys Ala 35 40 45 Cys Gly Arg Thr Arg Val Thr Ser 50 55 <210> 5 <211> 86 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> Tyr Trp Val Gly Glu Asp Ser Thr Tyr Lys Phe Phe Glu Val He Leu 1 5 10 15 He Asp Pro Phe His Lys Ala He Arg Arg Asn Pro Asp Thr Gln Trp 20 25 30 He Thr Lys Pro Val His Lys His Arg Glu Met Arg Gly Leu Thr Ser 35 40 45 Ala Gly Arg Lys Ser Arg Gly Leu Gly Lys Gly His Lys Phe His His 50 55 60 Thr He Gly Gly Ser Arg Arg Ala Ala Trp Arg Arg Arg Asn Thr Leu 65 70 75 80 4/23 Gln Leu His Arg Tyr Arg 85 <210> 6 <211> 70 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Lys Leu Leu Ser He Ser Gly Lys Arg Ser Ala Pro Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Lys Val Pro Gln Lys Lys Val Lys Leu Ala Ala Asp Glu Asp Asp Asp 20 25 30 Asp Asp Asp Glu Glu Asp Asp Asp Glu Asp Asp Asp Asp Asp Asp Phe 35 40 45 Asp Asp Glu Glu Ala Glu Glu Lys Ala Pro Val Lys Lys Ser He Arg 50 55 60 Asp Thr Pro Ala Lys Asn 65 70 <210> 7 <211> 141 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> modalidad_misc <222> (116) .. (116) <223> X puede ser cualquier aminoácido naturalmente ocurrente <400> 7 Asn Lys Pro Ala Val Thr Thr Lys Ser Pro Ala Val Lys Pro Ala Ala 1 5 10 15 Ala Pro Lys Gln Pro Val Gly Gly Gly Gln Lys Leu Leu Thr Arg Lys 20 25 30 5/23 Ala Asp Ser Ser Ser Ser Glu Glu Glu Ser Ser Ser Ser Glu Glu Glu 35 40 45 Lys Thr Lys Lys Met Val Ala Thr Thr Lys Pro Lys Ala Thr Ala Lys 50 55 60 Ala Ala Leu Ser Leu Pro Ala Lys Gln Ala Pro Gln Gly Ser Arg Asp 65 70 75 80 Ser Ser Ser Asp Ser Asp Ser Ser Ser Ser Glu Glu Glu Glu Glu Lys 85 90 95 Thr Ser Lys Ser Ala Val Lys Lys Lys Pro Gln Lys Val Ala Gly Gly 100 105 110 Ala Ala Pro Xaa Lys Pro Ala Ser Ala Lys Lys Gly Lys Ala Glu Ser 115 120 125 Ser Asn Ser Ser Ser Ser Asp Asp Ser Ser Glu Glu Glu 130 135 140 <210> 8 <211> 84 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Ala Ser Phe Pro Gln His His His Pro Gly He Pro Gly Val Ala His 1 5 10 15 Ser Val He Ser Thr Arg Thr Pro Pro Pro Pro Ser Pro Leu Pro Phe 20 25 30 Pro Thr Gln Ala He Leu Pro Pro Ala Pro Ser Ser Tyr Phe Ser His 35 40 45 Pro Thr He Arg Tyr Pro Pro His Leu Asn Pro Gln Asp Thr Leu Lys 50 55 60 Asn Tyr Val Pro Ser Tyr Asp Pro Ser Ser Pro Gln Thr Ser Gln Ser 65 70 75 80 6/23 Trp Tyr Leu Gly <210> 9 <211> 84 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> Pro Lys Arg Arg Ser Ala Arg Leu Ser Ala Lys Pro Pro Ala Lys Val 1 5 10 15 Glu Ala Lys Pro Lys Lys Ala Ala Ala Lys Asp Lys Ser Ser Asp Lys 20 25 30 Lys Val Gln Thr Lys Gly Lys Arg Gly Ala Lys Gly Lys Gln Ala Glu 35 40 45 Val Ala Asn Gln Glu Thr Lys Glu Asp Leu Pro Ala Glu Asn Gly Glu 50 55 60 Thr Lys Thr Glu Glu Ser Pro Ala Ser Asp Glu Ala Gly Glu Lys Glu 65 70 75 80 Ala Lys Ser Asp <210> 10 <211> 63 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Ala Met Phe Phe He Gly Phe Thr Ala Leu Val He Met Trp Gln Lys 1 5 10 15 His Tyr Val Tyr Gly Pro Leu Pro Gln Ser Phe Asp Lys Glu Trp Val 20 25 30 Ala Lys Gln Thr Lys Arg Met Leu Asp Met Lys Val Asn Pro He Gln 35 40 45 7/23 Gly Leu Ala Ser Lys Trp Asp Tyr Glu Lys Asn Glu Trp Lys Lys 50 55 60 <210> 11 <211> 68 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Ala Thr Lys Lys Lys Ser Lys Asp Lys Glu Lys Asp Arg Glu Arg Lys 1 5 10 15 Ser Glu Ser Asp Lys Asp Val Lys Val Thr Arg Asp Tyr Asp Glu Glu 20 25 30 Glu Gln Gly Tyr Asp Ser Glu Lys Glu Lys Lys Glu Glu Lys Lys Pro 35 40 45 He Glu Thr Gly Ser Pro Lys Thr Lys Glu Cys Ser Val Glu Lys Gly 50 55 60 Thr Gly Asp Ser 65- <210> 12 <211> 106 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Glu Ser Phe Lys Arg Leu Val Thr Pro Arg Lys Lys Ser Lys Ser Lys 1 5 10 15 Leu Glu Glu Lys Ser Glu Asp Ser He Ala Gly Ser Gly Val Glu His 20 25 30 Ser Thr Pro Asp Thr Glu Pro Gly Lys Glu Glu Ser Trp Val Ser He 35 40 45 Lys Lys Phe He Pro Gly Arg Arg Lys Lys Arg Pro Asp Gly Lys Gln 50 55 60 8/23 Glu Gln Ala Pro Val Glu Asp Ala Gly Pro Thr Gly Ala Asn Glu Asp 65 70 75 80 Asp Ser Asp Val Pro Ala Val Val Pro Leu Ser Glu Tyr Asp Ala Val 85 90 95 Glu Arg Glu Lys Leu Ala Ala Ala Leu Glu 100 105 <210> 13 <211> 85 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Met Leu Gly Asp Pro Asn Ser Ser Arg Pro Ser Ser Ser Val Met Lys 1 5 10 15 Trp Asn Gln Gln His Leu Lys Lys Gly Asn Gln Gln Leu Asn Val Arg 20 25 30 He Leu Gln Leu Leu Arg Arg Glu Arg Met Arg Glu His Leu Gln Val 35 40 45 Lys Gly Arg Ser Leu Lys Leu He Val Arg Asn Arg Val Thr His Arg 50 55 60 Leu Gly Val Ser Val Lys Met Val Leu Met Gly Arg Arg Trp Thr Arg 65 70 75 80 Gln He Gln Arg Arg 85 <210> 14 <211> 97 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Ala Arg Gly Ser Glu Phe Lys Ser Pro Glu Gln Phe Ser Asp Glu Val 1 5 10 15 9/23 Glu Pro Ala Thr Pro Glu Glu Gly Glu Pro Ala Thr Gln Arg Gln Asp 20 25 30 Pro Ala Ala Ala Gln Glu Gly Glu Asp Glu Gly Ala Ser Ala Gly Gln 35 40 45 Gly Pro Lys Pro Glu Ala His Ser Gln Glu Gln Gly His Pro Gln Thr 50 55 60 Gly Cys Glu Cys Glu Asp Gly Pro Asp Gly Gln Glu Met Asp Pro Pro 65 70 75 80 Asn Pro Glu Glu Val Lys Thr Pro Glu Glu Gly Glu Lys Gln Ser Gln 85 90 95 Cys <210> 15 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Ala Arg Gly Ser Glu Phe Lys His Gly Thr Val Glu Leu Gln Gly Ser 1 5 10 15 Gln Thr Ala Leu Tyr Arg Thr Gly Ser Val Gly He Gly Asn Leu Gln 20 25 30 Arg Thr Ser Ser Gln Arg Ser Thr Leu Thr Tyr Gln Arg Asn Asn Tyr 35 40 45 Ala Leu Asn Thr Thr Ala Thr Tyr Ala Glu Pro Tyr Arg Pro He Gln 50 55 60 Tyr Arg Val Gln Glu Cys Asn Tyr Asn Arg Leu Gln His Ala Val Pro 65 70 75 80 Ala Asp Asp Gly Thr Thr Arg Ser Pro Ser He Asp Ser He Gln Asp 85 90 95 10/23 His Ala Arg Gln Thr Pro Trp Gly Pro Ser Glu Ala Cys Gly Arg Thr 100 105 110 Arg Val Thr Ser 115 <210> 16 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Leu Ala Phe Val Pro He Ser Gly Trp Asn Gly Asp Asn Met Leu Glu 1 5 10 15 Pro Ser Ala Asn Met Pro Trp Phe Lys Gly Trp Lys Val Thr Arg Lys 20 25 30 Asp Gly Asn Ala Ser Gly Thr Thr Leu Leu Glu Ala Leu Asp Cys He 35 40 45 Leu Pro Pro Thr Arg Pro Thr Asp Lys Pro Leu Arg Leu Pro Leu Gln 50 55 60 Asp Val Tyr Lys He Gly Gly He Gly Thr Val Pro Val Gly Arg Val 65 70 75 80 Glu Thr Gly Val Leu Lys Pro Gly Met Val Val Thr Phe Ala Pro Val 85 90 95 Asn Val Thr Thr Glu Val Lys Ser Val Glu Met His His Glu Ala 100 105 110 <210> 17 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Met Leu Gly Asp Pro Asn Ser Ser He Ser Leu Lys Phe Gln Ala Met 1 5 10 15 11/23 Asp Val Gly <210> 18 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> Ala Arg Gly Ser Glu Phe Lys His Leu He Glu Val Ser Gly Asn Gly 1 5 10 15 Cys Gly Val Glu Glu Glu Asn Phe Glu Gly Leu He Ser Phe Ser Ser 20 25 30 Glu Thr Ser His He 35 <210> 19 <211> 58 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Leu Gly Asp Arg Thr Leu Gly Pro Lys Val His Thr Leu His Ser Leu 1 5 10 15 Val Lys Thr Arg Arg Pro Gly Asn Lys Lys Gly Ser Pro Asn Thr Ala 20 25 30 Val Tyr Lys Thr Val Leu Val Ser Tyr Glu Val Lys Glu Gly Glu Ser 35 40 45 Gln Ser Cys Ser Gln Phe Thr Cys Leu Cys 50 55 <210> 20 <211> 143 <212> PRT <213> Homo sapiens 12/23 <220> <221> modalidad_misc <222> ( 51 ) . . ( 51 ) <223> X puede ser cualquier aminoácido naturalmente ocurrente <400> 20 Ala Arg Gly Ser Glu Phe Lys Leu Leu Leu Lys Val He He Leu Gly 1 5 10 15 Asp Ser Gly Val Gly Lys Thr Ser Leu Met Asn Gln Tyr Val Asn Lys 20 25 30 Lys Phe Ser Asn Gln Tyr Lys Ala Thr He Gly Ala Asp Phe Leu Thr 35 40 45 Lys Glu Xaa Met Val Asp Asp Arg Leu Val Thr Met Gln He Trp Asp 50 55 60 Thr Ala Gly Gln Glu Arg Phe Gln Ser Leu Gly Val Ala Phe Tyr Arg 65 70 75 80 Gly Ala Asp Cys Cys Val Leu Val Phe Asp Val Thr Ala Pro Asn Thr 85 90 95 Phe Lys Thr Leu Asp Ser Trp Arg Asp Glu Phe Leu He Gln Ala Ser 100 105 110 Pro Arg Asp Pro Glu Asn Phe Pro Leu Val Cys Phe Arg Gly Gln Ser 115 120 125 Cys Phe Pro Thr Gln Gln Ala Cys Gly Arg Thr Arg Val Thr Ser 130 135 140 <210> 21 <211> 77 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> modalidad_misc <222> (5) .. (5) <223> X puede ser cualquier aminoácido naturalmente ocurrente 13 /23 <220> <221> modalidad_misc <222> ( 27 ) . . ( 27 ) <223> X puede ser cualquier aminoácido naturalmente ocurrente <220> <221> modalidad_misc <222> (39).. (40) <223> XX pueden ser cualquier aminoácidos ocurrentes <400> 21 Cys Ser Gly Thr Xaa Thr He Ser Asp He Ala Gly Gln Pro Gly Pro 1 5 10 15 Leu Met Pro Cys Met His Leu Arg Pro Phe Xaa Gly Gln Leu Val Lys 20 25 30 Gln Met Leu Asp Asp Phe Xaa Xaa His Arg Tyr He Ala Asn Leu Gly 35 40 45 His Gly Leu Tyr Pro Asp Met Asp Pro Glu His Val Gly Ala Phe Val 50 55 60 Asp Ala Val His Lys His Ser Arg Leu Leu Arg Gln Asn 65 70 75 <210> 22 <211> 85 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Met Leu Gly Asp Pro Asn Ser Ser Arg Pro Ser Ser Ser Val Met Lys 1 5 10 15 Trp Asn Gln Gln His Leu Lys Lys Gly Asn Gln Gln Leu Asn Val Arg 20 25 30 He Leu Gln Leu Leu Arg Arg Glu Arg Met Arg Glu His Leu Gln Val 35 40 45 Lys Gly Arg Ser Leu Lys Leu He Val Arg Asn Arg Val Thr His Arg 50 55 60 14/23 Leu Gly Val Ser Val Lys Met Val Leu Met Gly Arg Arg Trp Thr Arg 65 70 75 80 Gln He Gln Arg Arg 85 <210> 23 <211> 97 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Ala Arg Gly Ser Glu Phe Lys Ser Pro Glu Gln Phe Ser Asp Glu Val 1 5 10 15 Glu Pro Ala Thr Pro Glu Glu Gly Glu Pro Ala Thr Gln Arg Gln Asp 20 25 30 Pro Ala Ala Ala Gln Glu Gly Glu Asp Glu Gly Ala Ser Ala Gly Gln 35 40 45 Gly Pro Lys Pro Glu Ala His Ser Gln Glu Gln Gly His Pro Gln Thr 50 55 60 Gly Cys Glu Cys Glu Asp Gly Pro Asp Gly Gln Glu Met Asp Pro Pro 65 70 75 80 Asn Pro Glu Glu Val Lys Thr Pro Glu Glu Gly Glu Lys Gln Ser Gln 85 90 95 Cys <210> 24 <211> 301 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> modalidad_misc <222> (70).. (70) <223> n is a, c, g, or 15/23 <400> 24 tccggggacg aattcctggt agcctcattc agccgatgga aggtagaagg gactcagaac 60 ttcaggcctn attctgcgtt tttgtatgcc ccaagaatga aagggctctt tgtgaatttg 120 catgtagatt tatttaacat tcaaccggca gaaaacggaa ggtagtgcat gacactgggg 180 ggaaccaggc ccccgcccac ctcacatcgt catggcatta gctgtttact ggctcccgtg 240 gaaacattgg aaggggattt gttttgtggt tgggtttcct tttttttttt tttttaacca 300 g 301 <210> 25 <211> 354 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> modalidad_misc <222> (332).. (332) <223> n is a, c, g, or t <400> 25 gattcttcct acctttgtca gctactgagt tgcttctggg gagggaagta cttccttgcc 60 cctccccaac ccccctacct caccatatcc tatcatatct tgatagtcat ggggaagagg 120 atgtgcacac agacatacaa atttcctcaa agctggagag accaggctac atgtgagctc 180 atagatgctg ctgaggctca tcctgagggc tggatggttg gccagggttt cagaatgagg 240 gtaagggatg agcactgcca cccaagcttg cggccgcact cgagtaacta gttaacccct 300 tggggcctct aaacgggtct tgaggggtta antagtgact cgagtgcggc cgca 354 <210> 26 <211> 533 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> modal?dad_misc <222> (433).. (433) <223> n is a, c, g, or t <400> 26 atgctcgggg atccgaattc aagcatctca ttgaagtttc aggcaatgga tgtggggtag 60 16/23 aagaagaaaa cttcgaaggc ttaatctctt tcagctctga aacatcacac atctaagatt 120 cgagagtttg ccgacctaac tcgggttgaa acttttggct ttcaggggaa agctctgagc 180 tcactttgtg cactgagtga tgtcaccatt tctacctgcc acgtatcggc gaaggttggg 240 actcgactgg tgtttgatca cgatgggaaa atcatccaga aaacccccta cccccacccc 300 agagggacca cagtcagcgt gaagcagtta ttttctacgc tacctgtgcg ccataaggaa 360 tttcaaagga atattaagaa gtacagaacc tgctaaggcc atcaaaccta ttgatcggaa 420 gtcagtccat canatttgct ctgggccggt ggtactgagt ctaagcactg cggtgaagaa 480 gatagtagga aacagtctgg atgctggtgc cactaatatt gatctaaagc ttg 533 <210> 27 <211> 455 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> modalidad_misc <222> (410) .. (410) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> modalidad_misc <222> (431) .. (431) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> modalidad_misc <222> (436) .. (436) <223> n is a, c, g, or t <400> 27 gggacgatta gctagcattt gtgccaattt ctggttggaa tggtgacaac atgctggagc 60 caagtgctaa catgccttgg ttcaagggat ggaaagtcac ccgtaaggat ggcaatgcca 120 gtggaaccac gctgcttgag gctctggact gcatcctacc accaactcgt ccaactgaca 180 agcccttgcg cctgcctctc caggatgtct acaaaattgg tggtattggt actgttcctg 240 ttggccgagt ggagactggt gttctcaaac ccggtatggt ggtcaccttt gctccagtca 300 acgttacaac ggaagtaaaa tctgtcgaaa tgcaccatga agcttgcggc cgcactcgag 360 taactagtta accccttggg gcctctaaac gggtcttgga ggggttaacn agttgctcga 420 gtggggcggc nggctncttg gtggtttatt tcaga 455 17/23 <210> 28 <211> 523 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 28 ctcggggatc cgaatttcaa gcggcaagaa gtttcagaat aagaaaatga aaaacaagct 60 aagacaagta ttggagaagt atagaagata gaaaaatata aagccaaaaa ttggataaaa 120 tagcactgaa aaaatgagga aattattggt aaccaattta ttttaaaagc ccatcaattt 180 aatttctggt ggtgcagaag ttagaaggta aagcttgaga agatgagggt gtttacgtag 240 accagaacca atttagaaga atacttgaag ctagaagggg aagcttgcgg ccgcactcga 300 gtaactagtt aaccccttgg ggcctctaaa cgggtcttga ggggttaact cgagttactc 360 gtgggcgcag ctctttgctt agtattttta atggttggtt gtaacctttc gtttctcatc 420 gccgaattat gatggtttta aataatgatc ataattcttt ctttttactt ggtttttttt 480 tttcactttt actttctgtt tatgaagcac gcccgcccca caá 523 <210> 29 <211> 418 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 29 atgctcgggg atccgaattc agcttgggaa cgcggccatt tcaaagggga agccaaaatc 60 tcaagaaatt cccagcaggt tacctggagg cggatcatct aattctctgt ggaatgaata 120 cacacatata tattacaagg gataagcttg cggccgcact cgagtaacta gttaacccct 180 tggggcctct aaacgggact tgaggggtaa gctagttact cgagggcgag cttatgggaa 240 atatatattg cggtatttaa ggaattagtt acccgctcgc tggcctttga actgttgttt 300 gaggccttaa attgatgatc gtggtgggaa acaagaggtg gggtgggaga tttgtttttt 360 gttctgaagc ggggagggga ctagacccta aaagcattta aatataagac aacccaat 418 <210> 30 <211> 416 <212> ADN <213> Homo sapiens 18/23 <220> <221> modalidad_misc <222> (233).. (233) <223> n is a, c, g, or t <400> 30 gggacgatca gcattgaatg aatgttggct acaaaatcaa ttcttggtgt tgtatcagag 60 gagtaggaga gaggaaacat ttgacttatc tggaaaagca aaatgtactt aagaataaga 120 ataacatggt ccattcacct ttatgttata gatatgtctt tgtgtaaatc atttgttttg 180 agttttcaaa gaatagccca ttgttcattc ttgtgctgta caatgaccac tgnttattgt 240 tactttgact tttcagagca cacccttcct ctggtttttg tatatttatt gatggatcaa 300 taataatgag gaaagcatga tatgtatatt gctgagttgt tagcctttta agcttgcggc 360 cgcactcgag taactagtta accccttggg gcctctaaac gggtcttgag gggtta 416 <210> 31 <211> 499 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> modalidad_misc <222> (18) .. (18) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> modalidad_misc <222> (110) .. (111) <223> nn is a, c, g, or t <220> <221> modalidad_misc <222> (250) .. (250) <223> nn is a, c, g, or t <220> <221> modalidad_misc <222> (257) .. (257) <223> nn is a, c, g, or t <220> <221> modalidad_misc <222> (423) .. (423) <223> nn is a, c, g, or t <220> <221> modalidad mise 19/23 <222> (444) .. (444) <223> nn is a, c, g, or t <220> <221> modalidad_misc <222> (453).. (453) <223> nn is a, c, g, or t <400> 31 ggtacgaatt agccaganat cggggcgagt acaatgggga tgtgggcgcg ggagccccgc 60 tccccttttt tagcagcacc tcccagcccc gcagaataaa accgatcgcn ncccctccgc 120 gcgcgccctc ccccgagatg cggagcggga ggaggcggcg gcggccgagg aggaggagga 180 ggaggccccg gaggaggagg cgttggaggt cgaggcggag gcggaggagg aggaggccga 240 ggcgccggan gaggccnagg cgccggagca ggaggaggcc ggccggaggc ggcatgagac 300 gagcgtggcg gccgcggctg ctcggggccg cgctggttgc ccattgacag cggcgtctgc 360 agctcgcttc aagatggccg cttggctcgc attcattttc tgctgaacga cttttaactt 420 tcnttgtctt ttccgcccgc ttcnatcgcc tcncgccggc tgctctttcc gggatttttt 480 atcaagcaga aatgcatcg 499 <210> 32 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 32 attgtgaata agcataaggt t 21 <210> 33 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 33 gagcggtctc tgagtccgat t 21 <210> 34 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 34 ttgagtcaga atccgcataa g 21 20/23 <210> 35 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 35 aatgcgagtc ataagtgttc t 21 <210> 36 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 36 aatgcgctgg ctaatccttc g 21 <210> 37 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 37 gcgaagccgc cgaagctgtc t 21 <210> 38 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 38 agggctctgg atccggattc g 21 <210> 39 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 39 atactactgg gtcgcctctg t 21 <210> 40 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 40 aaggttaata ctcatcatac t 21 21/23 <210> 41 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 41 ctgtttctga cggcgcaggc g 21 <210> 42 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 42 tttaattggt ataattcgtc g 21 <210> 43 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 43 cttccgcatc agctgcggtg g 21 <210> 44 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 44 cttgcgtggt atgcgaagag t 21 <210> 45 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 45 aagattggga cggcgtggct t 21 <210> 46 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 46 acgcctactc atggtgggaa g 21 22/23 <210> 47 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 47 actcctactt atgcggggta t 21 <210> 48 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 48 atgccggcta ctacgcctca g 21 <210> 49 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 49 aaggcgtggt ttgggcagat t 21 <210> 50 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 50 aagaattggt ttggtcatac g 21 <210> 51 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 51 catactcatc atgataagca t 21 <210> 52 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 52 attacgaata agtgggggta t 21 23/23 <210> 53 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 53 ctgaatacgc attcgtctca g 21 <210> 54 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 54 gggcctgcgt gggaggatcc g 21 <210> 55 <211> 27 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 55 agtcagtctt atcataagcg tactagc 27