MX2008001020A - Un monohidrato de pirrolo[1-2-b]pirazol piridin quinolin substituido como inhibidor de factor de crecimiento de transformacion-beta (tgf-beta). - Google Patents

Abstract

La presente invencion proporciona monohidrato de 2-(6-metil-piridin-2-il)-3-[6-amino-quinolin-4-il-5,6-dihidro-4H- pirrolo[1,2-b]pirazol cristalino (ver formula (I)).

Description

UN MONOHIDRATO DE PIRRÓLO [1-2-B] PIRAZOL PIRIDIN QUINOLIN SUBSTITUIDO COMO INHIBIDOR DE FACTOR DE CRECIMIENTO DE TRANSFORMACIÓN-BETA (TGF-BETA) ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El factor de crecimiento de transformación (TGF-ß) es un prototipo para una gran familia de factores de crecimiento y diferenciación que regulan el desarrollo. Los miembros de la familia de TGF-ß activan las cinasas del receptor de serina/treonina de transmembrana, por lo que inician una cascada de señalización por medio de Smads, una nueva clase de efectores de señalización intracelular que regulan la expresión del gene. TGF-ß es un potente inductor de la interrupción del crecimiento en muchos tipos de células incluyendo las células epiteliales. Esta actividad es la base del papel supresor de tumores del sistema de señalización de TGF-ß en carcinomas. Otras actividades, incluyendo la diferenciación epitelial a mesenquimatosa inducida por TGF-ß, contribuyen a la progresión del cáncer. La señalización de la familia de TGF-ß es de especial relevancia en la diferenciación mesenquimatosa, incluyendo el desarrollo óseo. La expresión desregulada o la activación de los componentes de este sistema de señalización pueden contribuir a las enfermedades esqueléticas, por ejemplo, osteoartritis. Ver akefield, et al. (2002) Current Opinión in Genetics & Development 12:22-29; Siegel, et al. (2003) Nature Reviews (Cáncer) 3:807-820; Dumont, et al. (2003) Cáncer Cell 3:531-536. La solicitud de patente del PCT WO 02/0948332 describe un género de compuestos de dihidropirrolopirazol útiles para el tratamiento de los trastornos asociados con la actividad de señalización mejorada de TGF-ß o la sobreproducción. La solicitud de patente del PCT WO 04/04382 describe una forma anhidra de 2- ( ß-metil-piridin-2-il) -3- [ 6-amido-quinolin-4-il) -5, 6-dihidro-4H-pirrolo [1, 2-b] pirazol . Se ha descubierto que 2- ( 6-metil-piridin-2-il) -3- [ 6-amido-quinolin-4-il) -5, 6-dihidro-4H-pirrolo [1, 2-b] pirazol puede prepararse en una forma cristalina monohidratada que tiene propiedades ventajosas con relación a la forma anhidra de propiedades de manejo sólido superiores a gran escala, facilidad de purificación por cristalización y estabilidad termodinámica bajo condiciones de procesamiento farmacéutico y almacenamiento. También se ha descubierto un proceso de manufacturación para la nueva forma.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona monohidrato de 2- (6-metil-piridin-2-il) -3- [ 6-amido-quinolin-4-il) -5, 6-dihidro-4H-pirrolo [1, 2-b]pirazol, es decir, la Fórmula I.

La presente invención proporciona monohidrato de 2- (6-metil-piridin-2-il) -3- [ 6-amido-quinolin-4-il) -5, 6-dihidro-4H-pirrolo [ 1, 2-b] pirazol en una forma cristalina. La presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende monohidrato de 2- ( 6-metil-piridin-2-il) -3- [6-amido-quinolin-4-il) -5, 6-dihidro-4H-pirrolo [ 1, 2-b]pirazol y un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable. La presente invención proporciona un método para inhibir la señalización de TGF-ß en un mamífero, que comprende administrar a un mamífero en necesidad de tal tratamiento una cantidad efectiva de monohidrato de 2- ( 6-metil-piridin-2-il) -3- [6-amido-quinolin-4-il) -5, 6-dihidro-4H-pirrolo [1,2-b] pirazol . La presente invención proporciona además un método para el tratamiento de las condiciones que resultan de la producción excesiva de TGF-ß en un mamífero, que comprende administrar a un mamífero en necesidad de tal tratamiento una cantidad de supresión de la señal de TGF-ß de monohidrato de 2- ( 6-metil-piridin-2-il) -3- [6-amido-quinolin-4-il) -5,6-dihidro-4H-pirrolo [l,2-b]pirazol. Debido a que los compuestos de la presente invención son inhibidores de la señalización de TGF-ß, los compuestos de la presente invención son útiles para el tratamiento de una variedad de trastornos que incluyen el tratamiento de neoplasmas susceptibles. En uno de sus aspectos de método, esta invención se relaciona con un método para tratar los neoplasmas susceptibles, que comprende administrar a un paciente en necesidad del mismo, una cantidad efectiva de monohidrato de 2- ( 6-metil-piridin-2-il) -3- [ 6-amido-quinolin-4-il) -5,6-dihidro-4H-pirrolo[l, 2-b] pirazol. La presente invención proporciona monohidrato de 2- (6-metil-piridin-2-il) -3- [ 6-amido-quinolin-4-il) -5, 6-dihidro-4H-pirrólo [1, 2-b] pirazol para el uso en terapia. La presente invención proporciona el uso de 2- ( 6-metil-piridin-2-il) -3-[6-amido-quinolin-4-il) -5, 6-dihidro-4H-pirrolo [1, 2-b] pirazol para la manufactura de un medicamento para el tratamiento de los trastornos asociados con la actividad de señalización de TGF-ß o la subreproducción. En otra modalidad, esta invención proporciona un proceso para la elaboración de monohidrato de 2- (6-metil-piridin-2-il) -3- [6-amido-quinolin-4-il) -5, 6-dihidro-4H-pirrolo [1, 2-bjpirazol y los nuevos intermediarios útiles para la elaboración de monohidrato de 2- ( 6-metil-piridin-2-il) -3- [6-amido-quinolin-4-il) -5, 6-dihidro-4H-pirrolo [1, 2-b] pirazol cristalino: clorhidrato de 6-ciano-4-metil-quinolina, 2- (6-ciano-quinolin-4-il) -1- ( 6-metil-piridin-2-il) -etanona; 1-amino) -2-pirrolidinona, p-toluensulfonato; l-[(6-metil-piridin-2-il) -2- ( 6-ciano-quinolin-4-il) -etilidenamino] -pirrolidin-2-ona y 3- ( 6-ciano-quinolin-4-il) -2- (6-metil-piridin-2-il)-5, 6-dihidro-4H-pirrolo [l,2-b]pirazol.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Como se usa en la presente, el término "clorhidrato de 6-ciano-4-metil-quinolina" se refiere a: El término "2- ( 6-ciano-quinolin-4-il) -1- ( 6-metil-piridin-2-il) -etanona" se refiere a El término "p-toluensulfonato de l-amino-2-pirrolidinona" se refiere a: El término "1- [ ( 6-metil-piridin-2-il) -2- ( 6-ciano-quinolin-4-il) -etilidenamino] -pirrolidin-2-ona" se refiere a: El término "3- ( 6-ciano-quinolin-4-il) -2- (6-metil-piridin-2-il) -5, 6-dihidro-4H-pirrolo [1, 2-b] pirazol" se refiere a: El término "cantidad efectiva" de un compuesto de la presente invención se refiere a una cantidad, esto es, la dosificación que es efectiva para el tratamiento de los trastornos descritos en la presente. Ona cantidad efectiva puede determinarse fácilmente por el médico de atención, como un experimentado en la técnica, mediante el uso de las técnicas convencionales y observando los resultados obtenidos bajo circunstancias análogas. En la determinación de la cantidad efectiva, la dosificación de un compuesto de la presente invención, se consideran un número de factores por el médico de atención, que incluyen, pero no se limitan a: el compuesto de la presente invención que va a administrarse; la co-administración de otras terapias, si se usan; las especies de mamíferos; su tamaño, edad y la salud general; el trastorno específico involucrado; el grado de complicación o la gravedad del trastorno; la respuesta del paciente individual; el modo de administración; las características de biodisponibilidad de la preparación administrada; el régimen de dosificación seleccionado; el uso de otra medicación concomitante y otras circunstancias relevantes . Una cantidad efectiva de un compuesto de la presente invención se espera que sea liberada QD o BID de 10 mg a 1 g de dosis diaria total, de preferencia de 100-200 mg de dosis completa preferida. Una cantidad efectiva también puede ser una dosificación una vez al día o una vez a la semana con formulaciones de liberación prolongada. Las cantidades más preferidas pueden determinarse por un experimentado en la técnica. Se entiende que TGF-ß incluye TGF-ßl y TGF-ß2. Las condiciones "caracterizadas por la actividad de TGF-ß" incluyen aquellas en donde la síntesis de TGF-ß está presente a niveles aumentados o en donde la proteína latente de TGF-ß se activa indeseablemente o se convierte a la proteína de TGF-ß activa, o en donde los receptores de TGF-ß se sobre-regulan o en donde la proteína de TGF-ß muestra una unión mejorada a las células o la matriz extracelular en la localización de la enfermedad. De esta manera, en cualquier caso, la "actividad mejorada" se refiere a cualquier condición en donde la actividad biológica de TGF-ß es indeseablemente alta, sin importar la causa. Hay varios tipos de cáncer, es decir, neoplasmas susceptibles, en donde el TGF-ßl producido por el tumor puede ser perjudicial. Estos incluyen cáncer de próstata (por ejemplo, Steiner and Barrack (1992) Mol. Endocrinol 6:15-25), cáncer colorrectal (por ejemplo, Neurath et al. (2004) Immunity. 21:491-501), cáncer de mama (por ejemplo, Arteaga, et al. (1993) Cell Growth and Differ. 4:193-201), cáncer de pulmón de células no pequeñas (por ejemplo, Ready et al., (abril de 2005) Semin Oncol. 32 (2 Suppl 3):S35-41, cáncer de ovario (por ejemplo, Dr. Gustavo C. Rodríguez, (marzo 2-7 de 2001) 32nd Annual Meeting of the Society of Gynecologic Oncologists. Nashville, TN) , cáncer endometrial (por ejemplo, Dowdy et al, (Feb 2005) Gynecol Oncol. 96 (2 ): 368-73) , cáncer testicular (por ejemplo, Morera et al., (1992) Endocrinology. 130:831-836), osteosarcoma (e.g., Kloen et al., (Aug 1, 1994) Int J Cáncer. 58(3):440-5) y mieloma múltiple (por ejemplo, Cook et al., (1999) Journal of Leukocyte Biology, Vol 66, Issue 6:981-988). Ver también la solicitud de patente del PCT WO 02/0948332. Otra modalidad de la presente invención es la forma monohidratada cristalina de 2- ( 6-metil-piridin-2-il) -3- [ 6-amido-quinolin-4-il) -5, 6-dihidro-4H-pirrolo [1, 2-b] pirazol.

Este compuesto se ha caracterizado como se describe a continuación.

Difracción de polvo de rayos X El patrón de difracción de polvo de rayos X (XRD) del monohidrato cristalino se obtuvo en un difractómetro de polvo de rayos X Siemens D5000, equipad con una fuente de CuKa (? = 1.54056 Á) y un detector de estado sólido Si(Li) Kevex, que opera a 50 kV y 40 mA. Cada muestra se rastreó entre 3 y 40 en 2T, con un tamaño de etapa de 0.02° en 2T y una velocidad de rastreo de 9.0 segundos/etapa y con una divergencia de 1 mm y rendijas de recepción y una rendija de detector de 0.1 mm. El polvo seco se empacó en un sujetador de muestra de carga superior con depresión y una superficie lisa se obtuvo usando un portaobjetos de vidrio. El patrón de difracción de la forma cristalina monohidratada, colectada a temperatura y humedad relativa ambiente, se ajustó con base en el pico estándar NIST 675 a 8.85 grados 2-teta.

De esta manera, una muestra preparada de manera apropiada de monohidrato de 2- ( 6-metil-piridin-2-il) -3- [ 6-amido-quinolin-4-il-5, 6-dihidro-4H-pirrolo [1, 2-b] pirazol puede caracterizarse por un patrón de difracción de rayos X usando radiación CuKa teniendo los picos de difracción (valores 2-teta) como se describe en la Tabla 1, y en particular, teniendo los picos a 9.05 en combinación con uno o más de los picos a 11.02, 11.95 y 14.84; y más particularmente teniendo un pico a 9.05; con una tolerancia para los ángulos de difracción de 0.1 grados, más preferentemente 0.01 grados.

Espectroscopia de 13C RMN de estado sólido Los espectros de polarización cruzada 13C/RMN de giro de ángulo mágico (CP/MAS) (RMN o SSNMR de estado sólido) se obtuvieron para el monohidrato cristalino usando un espectrómetro de 400 MHz Varian Unity Inova que opera a una frecuencia de carbono de 100.573 MHz y equipado con accesorios sólidos completos y una sonda T3 de 4.0 mm Chemagnetics . Se usaron polarización cruzada de amplitud ascendente (RAMP-CP) a 62 kHz y desacoplamiento de modulación de fase de dos pulsos (TPPM) a 70 kHz. Los parámetros de adquisición fueron como sigue: pulso de radiofrecuencia protónica de 90° con 4.0 µs, tiempo de contacto 2.0 ms, tiempo de repetición de pulso 60 s, frecuencia MAS 10 kHz, ancho espectral 50 kHz y tiempo de adquisición de 50 ms . Los cambios químicos se relacionaron con el grupo metilo de hexametilbenceno (d = 17.3 ppm) por reemplazamiento de la muestra . Cambios químicos 13C de la forma cristalina monohidratada: 20.5, 22.5, 26.3, 48.7, 108.8, 115.6, 122.6, 127.9, 128.8, 130.5, 136.4, 146.8, 149.0, 151.3, 152.0, 153.2, 157.9 y 171.0 (± 0.2) ppm. De esta manera, monohidrato de 2- ( 6-metil-piridin-2-il) -3- [6-amido-quinolin-4-il) -5, 6-dihidro-4H-pirrolo [1,2-b]pirazol cristalino puede caracterizarse por resonancia magnética nuclear 13C de estado sólido teniendo un cambio químico (ppm) de 108.8, 115.6, 122.6 y 171.0 (± 0.2) ppm. En otra modalidad, esta invención proporciona un proceso para preparar monohidrato de 2- ( 6-metil-piridin-2-il) -3- [ 6-amido-quinolin-4-il) -5, 6-dihidro-4H-pirrolo [1, 2-b] pirazol que comprende cristalizar 2- ( 6-metil-piridin-2-il) -3- [ 6-amido-quinolin-4-il) -5, 6-dihidro-4H-pirrolo [1, 2-b] pirazol de un solvente apropiado que contiene una relación de solvente orgánico a agua de 0-90% bajo condiciones que producen monohidrato de 2- ( 6-metil-piridin-2-il) -3- [ 6-amido-quinolin-4-il) -5, 6-dihidro-4H-pirrolo[l, 2-b] pirazol. El monohidrato de 2- (6-metil-piridin-2-il) -3- [6-amido-quinolin-4-il) -5, 6-dihidro-4H-pirrolo [1, 2-b] pirazol puede prepararse por cristalización bajo condiciones controladas. En particular, el monohidrato de la presente invención puede prepararse por cristalización a partir de un solvente acuoso. Un solvente apropiado es uno que tiene una relación de solvente orgánico a agua de 0-90% de solvente orgánico. Se prefiere una relación de solvente orgánico a agua entre 60:40 a 85:15. Se prefiere más una relación de solvente orgánico a agua de 75:25. Los solventes orgánicos preferidos son acetonitrilo, acetona, tetrahidrafurano (THF) , metil etil cetona, sulfóxido de dimetilo (DMSO), dimetilformamida (DMF), N, N-dimetilacetamida y N-metilpirrolidinona. En la práctica, se ha encontrado que la acetona se prefiere más. Después de suspender el 2- ( 6-metil-piridin-2-il) -3- [ 6-amino-quinolin-4-il-5, 6-dihidro-4H-pirrolo [1, 2-b] pirazol anhidro, monohidratado o parcialmente hidratado en un solvente apropiado, la mezcla se agita de 20 a 100°C, de preferencia 60°C. Para los solventes de punto de ebullición inferior, tales como acetonitrilo, acetona y metil etil cetona, se reduce el volumen de la solución resultante, de preferencia por destilación, a entre 35-70% del volumen inicial, de preferencia 50%. Para los solventes de punto de ebullición superior, una cantidad apropiada de agua adicional puede ser necesaria para adicionarse para precipitar el producto. Durante la reducción, pueden adicionarse cristales sembrados de monohidrato. Enfriar lentamente la solución a 0-5°C, de preferencia en dos etapas, en donde la solución se enfría primero a 20-25°C durante 90 minutos, seguido de enfriamiento a 0-5°C durante 30-40 minutos. Mantener la suspensión a 0-5°C durante 30 minutos adicionales a 25 horas, de preferencia 2-3 horas. Filtrar la suspensión y enjuagar el producto, de preferencia con agua o un solvente orgánico acuoso. Secar el producto, de preferencia a 45°C. En otra modalidad, el monohidrata de 2- ( 6-metil-piridin-2-il) -3- [6-amino-quinolin-4-il-5, 6-dihidro-4H-pirrolo [1,2-b] pirazol puede prepararse re-suspendiendo 2-(6-metil-piridin-2-il) -3- [6-amino-quinolin-4-il-5, 6-dihidro-4H-pirrolo [1, 2-b] pirazol en agua o DMSO acuoso. El monohidrato de 2- ( 6-metil-piridin-2-il) -3- [6-amino-quinolin-4-il-5, 6-dihidro-4H-pirrolo [1, 2-b] pirazol puede prepararse agitando en 10 volúmenes de 0-90% de solvente orgánico en agua a temperatura ambiente durante 1-2 horas, filtrando y secando a 35-45°C, de preferencia 45°C al vacío. En los casos donde se usa un solvente orgánico, la mezcla de reacción puede diluirse con agua (2-5 veces el volumen del solvente orgánico usado) para mejorar la recuperación. El monohidrato de 2- ( 6-metil-piridin-2-il) -3- [6-amino-quinolin-4-il-5, 6-dihidro-4H-pirrolo [1, 2-b] pirazol cristalino puede prepararse mediante una variedad de procedimientos, algunos de los cuales se ilustran en los siguientes ejemplos. Se reconocerá por un experimentado en la técnica que el orden de las etapas individuales en lo siguiente, puede variarse para proporcionar monohidrato de 2- ( 6-metil-piridin-2-il) -3-[6-amino-quinolin-4-il-5, 6-dihidro-4H-pirrolo [1, 2-b] pirazol cristalino.

Preparación 1: Preparación de cristales de sembrado de monohidrato de 2- (6-metil-piridin-2-il) -3- [ 6-amido-quinolin-4-il) -5, 6-dihidro-4H-pirrolo [1, 2-b] pirazol A un matraz equipado con agitador mecánico adicionar 3- (6-ciano-quinolin-4-il) -2- ( 6-metil-piridin-2-il) -5, 6-dihidro- 4H-pirrolo [1, 2-b]pirazol (500.2 g) , carbonato de potasio (39.4 g) y DMSO (3,000 mL) para formar una suspensión. En un matraz separado, combinar peróxido de hidrógeno a 35% (154 mL) y agua desionizada (250 mL) . Adicionar la solución de peróxido de hidrógeno diluida a la suspensión anterior durante 30 a 45 minutos, de tal manera que la temperatura de reacción esté en el intervalo de 22 a 34°C. Después de completar la adición, agitar la mezcla de reacción hasta que la reacción se complete juzgado por HPLC. Preparar una solución de sulfito de sodio (107.6 g) en agua desionizada (4,500 mL) . Adicionar la mezcla de reacción lentamente a la solución de sulfito de sodio para apagar la solución de reacción mientras se mantiene la temperatura de 22 a 40°C. Agitar la mezcla de reacción durante 40-60 minutos y adicionar ácido HCl concentrado (37.5%) (450 mL) . A la solución resultante adicionar carbón natural activado (56.4 g) y agitar durante 10-15 minutos. Filtrar la solución a través de tierra diatomácea para remover el carbón natural activado. Adicionar metanol (525 mL) al filtrado y después adicionar hidróxido de sodio (1,700 mL) durante 35 minutos.

Agitar la suspensión resultante durante la noche y filtrar. Suspender la torta húmeda en acetonitrilo al 66.75% en solución acuosa (10,000 mL) . Calentar la mezcla resultante a reflujo (~77 a 81°C) y agitar durante 20 minutos. Enfriar la mezcla a 40°C y adicionar agua desionizada (2,500 mL) y después enfriar a 0-5°C y agitar durante 2 a 3 horas. Filtrar la suspensión, lavar la torta con agua desionizada (500 mL) . Secar la torta durante la noche a 40°C en un horno al vacío para proporcionar 404.2 g del producto.

Preparación 2: Preparación de cristales de sembrado de 2- ( 6-ciano-quinolin-4-il) -1- ( 6-metil-piridin-2-il) -etanona A un matraz equipado con una purga de N2 y agitación de salida de vapor, cargar clorhidrato de 6-ciano-6-metil quinolina (10 g, 1 equivalente) y THF (100 mL, 10 volúmenes), después enfriar la mezcla a 20-25°C. Adicionar NaOt-bu (15.497 g, 3.3 equivalentes) en porciones durante 30 minutos para controlar la exoterma, mantener la temperatura =25°C. Después adicionar una solución de piridin-2-carboxilato de metil-6-metilo (11.08 g, 1.5 equivalentes) en THF (20 mL, 2 volúmenes) gota a gota hasta mantener la temperatura entre 20°C y 25°C. Monitorear el término de la reacción por análisis de HPLC (~2 h) . Una vez que se completa, enfriar la mezcla por debajo de 15°C y adicionar HCl ÍN (70 mL) . Ajustar el pH a 8.0-9.0 con NaOH 5N (pH final a 8.8). Adicionar EtOAc (70 mL) y separar la capa acuosa y lavar la capa orgánica con cloruro de sodio acuoso saturado (35 mL) y bicarbonato saturado (35 mL) . Concentrar la capa orgánica al vacío a ~5 en volumen y adicionar lentamente MeOH (10 en volumen), después destilar 10 en volumen y adicionar nuevamente MeOH (10 en volumen). Enfriar la mezcla a 5°C, filtrar y enjuagar la torta con MeOH (5 en volumen) , después secar la torta al vacío a 40°C para proporcionar 11.5 g del producto.

Ejemplo 1: Preparación de monohidrato de 2- ( 6-metil-piridin-2-il) -3- [ 6-amido-quinolin-4-il-5, 6-dihidro-4H-pirrolo [1, 2-b] pirazol eno/DMF: Etapa 1: Preparación de clorhidrato de 6-ciano-4-metil-quinolina.

Adicionar etanol al 95% (EtOH) (270 L, 9 volúmenes), 4-aminobenzonitrilo (30.0 kg, 1 equivalente) y 2,3,5,6-tetracloro-2, 5-ciclohexadien-l, 4-diona, (66.81 kg 1.07 equivalentes) a un recipiente de reacción de 200 galones equipado con purga de nitrógeno, condensador, termopar y agitación superior. Agitar durante 2-5 minuto, después adicionar ácido clorhídrico concentrado (HCl) (62.56 L, 3.0 equivalentes), después calentar a 75°C. Diluir con metil vinilcetona (33.06 L, 1.5 equivalentes) en EtOH al 95% (30 L, 1 volumen) después adicionar lentamente a la mezcla de reacción durante 30 min. Monitorear el término de reacción por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC, por sus siglas en inglés). Adicionar tetrahidrofurano (THF) (11 vol., 330 L) , a 75°C, después agitar durante 1 hora a 60°C. Enfriar a temperatura ambiente y agitar durante 1 hora adicional. Filtrar en un filtro/secador agitado, después enjuagar con THF (240 L, 8 volúmenes) . Secar durante la noche al vacío a 70°C para dar el compuesto del título (42.9 kg, 82.55%). *H RMN (DMSO d6) : d = 9.047 ppm (d, 4.4 Hz, 1H) ; 8.865 ppm (d, 1.6 Hz, 1H) ; 8.262 ppm (d, 8.8 Hz, 1H) ; 8.170 ppm (dd, 2.2 Hz, 8.8 Hz, 1H) ; 7.716 ppm (d, 4.4 Hz, 1H) ; 2.824 ppm (s, 3H) . MS ES+: 169.1; Exacto: 168.07.

Etapa 2: Preparación de 2- ( 6-ciano-quinolin-4-il) -1- (6-metil-piridin-2-il) -etanona.

Combinar la 6-ciano-4-metil-quinolina (28 kg) y THF (9.5 vol J y enfriar a 5°C. Adicionar t-butóxido de sodio sólido (3.3 equivalentes) en porciones de la suspensión enfriada para mantener la temperatura del lote <25°C. Agitar la mezcla resultante a 20°C durante 30 min. A un recipiente separado, cargar con metil éster del ácido 6-metil-2-piridincarboxílico líquido, (1.5 equivalente) y diluir con THF (2.0 volúmenes). La solución del metil éster del ácido 6-metil-2-piridincarboxílico se adiciona lentamente (20-40 minutos) mientras se mantiene una temperatura de < 25°C. Agitar la mezcla de reacción durante 2 horas a 20°C y monitorear por HPLC/TLC (cromatografía de capa fina en gel de sílice) para confirmar el término de la reacción. En un recipiente separado, diluir 1.03 kg de HCl concentrado por kg de 2- (6-ciano-quinolin-4-il) -1- (6-metil-piridin-2-il) -etanona con 7.7 en volumen de agua. Enfriar la mezcla de reacción y la solución de HCl a 5°C. Realizar un ajuste del pH en la mezcla de reacción por la adición lenta de la solución acida, mantener la temperatura <15°C. La solución acida se adiciona hasta que el pH de la mezcla es de 8.0-9.0. Después de que se obtiene el punto final del pH, extraer la mezcla con acetato de etilo (7 vol.). Lavar la capa orgánica con una solución de cloruro de sodio acuoso/bicarbonato de sodio [0.78 kg de cloruro de sodio por kg de 2- ( 6-ciano-quinolin-4-il) -1- ( 6-metil-piridin-2-il) -etanona y 0.20 kg de bicarbonato de sodio (NaHC03) por kg de 2- ( 6-ciano-quinolin-4-il) -1- ( 6-metil-piridin-2-il) -etanona en 6.6 vol.]. Destilar la capa orgánica a una atmósfera para remover el THF y el acetato de etilo (EA) hasta que permanezcan 5 volúmenes de solución concentrada. Usando metanol (10 volúmenes) realizar un intercambio de solvente a metanol usando una operación de adición/destilación constante mientras se mantienen 5 volúmenes. Adicionar metanol (MeOH) caliente (10 volúmenes @ 60°C) . Enfriar la solución a 50°C, después adicionar cristales sembrados obtenidos por la preparación 2. Enfriar la mezcla gradualmente a 5°C, agitar durante 1 hora y filtrar. Lavar la torta del producto con metanol frío (5 vols. @ 5°C) y secar al vacío a 40°C hasta que se satisfaga una pérdida en la especificación de secado (LOD) de <1%. Esto da el compuesto de título (31.6 kg, 81%). XH RMN (CDC13) : d = 8.978 ppm (d, 4.4 Hz, 1H) ; 8.627 ppm (d, 1.6 Hz, 1H); 8.199 ppm (d, 8.8 Hz, 1H) ; 7.874 ppm (d, 7.7 Hz, 1H) ; 7.837 ppm (dd, 2.2 Hz, 8.8 Hz, 1H) ; 7.759 ppm (t, 7.7 Hz, 1H) ; 7.546 ppm (d, 4.4 Hz, 1H) ; 7.416 ppm (d, 7.7 Hz, 1H) ; 5.036 ppm (s, 2H) ; 2.720 ppm (s, 3H) . MS ES+: 288.1; Exacto: 287.11.

Etapa 3a: Preparación de p-toluensulfonato de 1- (amino) -2-pirrolidinona Combinar 1- [ (difenilmetilen) amino] -2-pirrolidinona (35.36 g, 134 mmoles) con 15 volúmenes de tolueno (530 mL) en un matraz de reacción de 1 L, adicionar 1 equivalente de agua (2.43 g, 134.9 mmoles) y calentar a 40°C. Adicionar 1 equivalente de ácido p-toluensulfónico monohidratado (25.978 g, 133.8 mmoles) . Monitorear la reacción por TLC, después enfriar a 20-25°C. Filtrar la suspensión y enjuagar la torta de filtrado con 3 volúmenes de tolueno (105 mL) . Secar a un peso constante en un secador al vacío a 50°C para dar el compuesto del título (36.14 g, 99.2%). XH RMN (DMSO): d = 7.472 ppm (dt, 8.2 Hz, 1.9 Hz, 2H) ; 7.112 ppm (m, 2H) ; 3.472 ppm (t, 7.0 Hz, 2H) ; 2.303 ppm (m, 5H) ; 2.012 ppm (m, 2H) . MS : ES+ = 179; 157. ES" = 171. Exacto: 272.08.

Etapa 3b y 3c: Preparación de los intermediarios l-[(6-metil-piridin-2-il) -2- ( 6-ciano-quinolin-4-il) -etilidenamino] -pirrolidin-2-ona y 3- ( 6-ciano-quinolin-4-il) -2- ( 6-metil-piridin-2-il) -5, 6-dihidro-4H-pirrolo [1, 2-b] pirazol. En un matraz de 3 cuellos, de 1 L equipado con agitación mecánica, un condensador Dean-Stark, termopar y purga de N2, cargar 2- (6-ciano-quinolin-4-il) -1- ( 6-metil-piridin-2-il) -etanona (25 g, 1 equivalente) , p-toluensulfonato de 1-(amino) -2-pirrolidinona (27.3 g, 1 equivalente), dimetilformamida (DMF) (150 mL, 6 volúmenes), tolueno (250 mL, 10 volúmenes) y 2,6-lutidina (26 mL, 1 volumen). Calentar la mezcla a reflujo y remover periódicamente el agua de la trampa. Monitorear la reacción por análisis de HPLC o TLC (5% de MeOH/cloruro de metileno, sílice) . Después de 4 horas, la mayoría de la cetona se convierte en 1- [ ( 6-metil-piridin-2-il) -2- (6-ciano-quinolin-4-il) -etilidenamino] -pirrolidin-2-ona como se indica por TLC. Enfriar la mezcla de reacción de 50 a 55°C y cargar carbonato de potasio (K2C03) (20.42 g, 1.66 equivalentes) en la mezcla de reacción durante un par de minutos y calentar la mezcla de reacción nuevamente hasta reflujo. Continuar removiendo el agua colectada en la trampa y monitorear la reacción por HPLC para la desaparición de hidrazona. Después de completar la reacción, destilar la mayoría del tolueno (el destilado total es de 350 mL) hasta que la mezcla de reacción alcance una temperatura de 145°C. Enfriar la mezcla de reacción a ~30°C y diluir con agua (450 mL) y agitar durante 1.5 horas a temperatura ambiente (RT, por sus siglas en inglés) . Filtrar el producto formado por filtración y enjuagar la torta con agua 200 mL. Después 1 hora al vacío, y después secarse en un horno al vacío a 70°C a peso constante. El sólido seco pesó 28.5 g, 93.2% de rendimiento y la pureza por HPLC es de 97%. El producto se usa como está en la siguiente etapa. XH RMN (CDC13) : d = 9.018 ppm (d, 4.5 Hz, 1H) ; 8.233 ppm (d, 8.7 Hz, 1H); 8.198 ppm (dd, 0.5 Hz, 1.8 Hz, 1H) ; 7.808 ppm (dd, 1.8 Hz, 8.8 Hz, 1H) ; 7.483-7.444 ppm (m, 2H) ; 7.380 ppm (d, 7.9 Hz, 1H) ; 6.936 ppm (d, 7.6 Hz, 1H) ; 4.422 ppm (t, 7.2 Hz, 2H) ; 2.970-2897 ppm (m, 2H) ; 2.776 ppm (p, 7.2 Hz, 2H) ; 2.065 ppm (s, 3H) . MS ES+: 352.4 Exacto: 351.15.

Etapa 4: Preparación de 2- (6-metil-piridin-2-il) -3- (6-amido-quinolin-4-il) -5, 6-dihidro- H-pirrolo [1, 2-b] pirazol, monohidrato. Suspender 3- ( 6-ciano-quinolin-4-il) -2- ( 6-metil-piridin-2-il)-5, 6-dihidro-4H-pirrolo[l,2-b]pirazol (25.515 kg) y carbonato de potasio (0.2 equivalentes) en 6 volúmenes de sulfóxido de dimetilo (DMSO). Adicionar solución de peróxido de hidrógeno diluido [35% de peróxido de hidrógeno (1.25 equivalentes) a 0.5 volúmenes de agua purificada] a la suspensión durante 2-3.3 horas mientras se mantiene la temperatura entre 20-38°C. Monitorear la reacción por HPLC (1 hora). Adicionar sulfito de sodio (0.6 equivalentes) a 9.1 volúmenes de agua purificada. Adicionar la suspensión de producto para diluir la solución de sulfito de sodio [sulfito de sodio (0.6 equivalentes) en 9.1 volúmenes de agua purificada] mientras se mantiene una temperatura de 20-39°C, agitar esta suspensión durante 1-2 horas para asegurar que todo el peróxido de hidrógeno restante se neutraliza completamente. Verificar el peróxido. Adicionar 1.08 volúmenes de HCl Grado Alimenticio al 32.1% a esta suspensión y agitar durante 20-30 min. Adicionar carbón natural activado (10% en peso) a la solución y agitar durante 20-40 minutos. Filtrar el producto crudo (principalmente monohidratado) , enjuagando la torta con agua purificada. Adicionar 1.05 volúmenes de metanol al filtrado. Adicionar 5.5 volúmenes de hidróxido de sodio 2N al filtrado mientras se mantiene una temperatura de 20-30°C. Agitar la suspensión durante 20-30 min. Asegurar que el pH es > 8. Filtrar la suspensión, y enjuagar la torta con agua purificada. Suspender la torta húmeda en 28 volúmenes de una solución de acetona/agua purificada 75%/25%. Calentar esta suspensión a reflujo (60°C) y agitar durante 30-45 minutos después de que el producto se disuelva. Filtrar la solución de producto. Iniciar la destilación, y adicionar semilla molida cuando la temperatura del recipiente alcance 63°C. Continuar la destilación hasta que el volumen de destilado sea de 50% del volumen inicial. Enfriar la suspensión a 20-25°C durante 90 minutos. Después enfriar la suspensión a 0-5°C durante 30-40 minutos. Agitar durante 2-3 horas a 0-5°C. Filtrar la suspensión y enjuagar la torta de producto en el filtro con agua purificada. Secar el producto al vacío a 45°C para proporcionar el compuesto del título (25.4 kg, 90%). Contenido de agua por Karl Fischer de 4.6% en monohidrato. Teoría: 4.65%. XH RMN (CDC13) : d = 9.0 ppm (d, 4.4 Hz, 1H) ; 8.23-8.19 ppm (m, 2H) ; 8.315 ppm (dd, 1.9 Hz, 8.9 Hz, 1H) ; 7.455 ppm (d, 4.4 Hz, 1H); 7.364 ppm (t, 7.7 Hz, 1H) ; 7.086 ppm (d, 8.0 Hz, 1H); 6.969 ppm (d, 7.7 Hz, 1H) ; 6.022 ppm (m, 1H) ; 5.497 ppm (m, 1H); 4.419 ppm (t, 7.3 Hz, 2H) ; 2.999 ppm (m, 2H) ; 2.770 ppm (p, 7.2 Hz, 7.4 Hz, 2H) ; 2.306 ppm (s, 3H) ; 1.817 ppm (m, 2H) . MS ES+: 370.2; Exacto: 369.16. Alternativamente, el monohidrato de la presente invención puede prepararse por recristalización de 2- (6-metil-piridin-2-il) -3- [6-amido-quinolin-4-il) -5, 6-dihidro-4H-pirrólo [1, 2-b]pirazol .

Ejemplo 2: Monohidrato de 2- ( 6-metil-piridin-2-il) -3- [ 6-amido-quinolin-4-il) -5, 6-dihidro-4H-pirrolo[l, 2-b] pirazol Suspender 2- ( 6-metil-piridin-2-il) -3- [6-amido-quinolin-4-il) -5, 6-dihidro-4H-pirrolo[l, 2-b]pirazol en 28 volúmenes de una solución de acetona/agua purificada 75%/25%. Calentar esta suspensión a reflujo (60°C) y agitar durante 30-45 minutos después de que el producto se disuelva. Filtrar la solución del producto. Iniciar la destilación, y adicionar semillas molidas cuando la temperatura alcance 63°C. Continuar la destilación hasta que el volumen de destilado sea de 50% del volumen inicial. Enfriar la suspensión a 20-25°C durante 90 minutos. Después enfriar suspensión a 0-5 °C durante 30-40 minutos. Agitar durante 2-3 horas a 0-5°C.

Filtrar la suspensión y enjuagar la torta de producto en el filtro con agua purificada. Secar el producto al vacío a 45°C para proporcionar el compuesto del título. El rendimiento de la reacción es >80%. La pureza del producto es >98% con pocas sustancias relacionadas totales. De manera alternativa, el monohidrato de la presente invención puede prepararse resuspendiendo 2- ( 6-metil-piridin-2-il) -3- [6-amido-quinolin-4-il) -5, 6-dihidro-4H-pirrolo [1, 2-b]pirazol .

Ejemplo 3: Monohidrato de 2- ( 6-metil-piridin-2-il) -3- [ 6-amido-quinolin- 4-il) -5, 6-dihidro-4H-pirrolo [1, 2-b] pirazol . Preparar monohidrato de 2- ( 6-metil-piridin-2-il) -3- [6-amido-quinolin-4-il-5, 6-dihidro-4H-pirrolo [1, 2-b]pirazol al agitar el compuesto o el ingrediente farmacéutico activo (API, por sus siglas en inglés) en 10 volúmenes de agua a temperatura ambiente durante 1-2 horas, filtrar y secar a 45°C al vacío.

Purificación del receptor i de tgf-ßl y reacciones de cinasa in vitro Para los receptores de TGF-ßl de tipo I (RIT204D) : El dominio de cinasa citoplásmico marcado con 6X-HIS de cada receptor se expresó y se purificó de lisados de células de insectos Sf9 como se describe brevemente a continuación: Los lisados celulares se clarificaron por centrifugación y se filtraron 0.45 uM antes de la purificación por cromatografía de afinidad Ni/NTA (Qiagen) .

Protocolo de cromatografía: Equilibrar con 10 CV de LB, cargar la muestra, lavar con el amortiguador RIPA 10 CV (Tris 50 mM, pH 7.5, NaCl 150 mM, 1% de NP40, EDTA 1 mM, 0.25% de desoxicolato de sodio, ß-mercaptoetanol 20 mM adicionado fresco, PMSF 1 mM) , lavar con LB 10 CV, lavar con KB 10 CV IX (Tris 50 mM, pH 7.5, NaCl 150 mM, MgCl2 4 mM, NaF 1 mM, ß-mercaptoetanol 2 mM) , levigar con un gradiente lineal de KB IX gue contiene imidazol 200 mM. Ambas enzimas fueron aproximadamente 90% puras y tuvieron una actividad de autofosforilación. Reacciones: enzima 170-200 nM en KB IX, series de dilución del compuesto en KB 1X/16% de DMSO (concentración final de 20 µM a 1 nM con una concentración final de 4% de DMSO) , las reacciones se inician adicionando una mezcla de ATP (ATP 4 µM/concentraciones finales de 33P-a-ATP 1 µCi) en KB IX. Las reacciones se incuban a 30°C durante 1 hora. Las reacciones se interrumpen y se cuantifican usando precipitación de TCA/BSA estándar en placas de filtrado de fibra de vidrio Millipore FB y por conteo de centelleo líquido en una MicroBeta JET. El compuesto descrito en la presente inhibe el dominio de cinasa del receptor TGF-ßl de Tipo I (RIT204D) con un valor IC5o de 56 nM. Los compuestos de la presente invención se formulan de preferencia como composiciones farmacéuticas administradas por una variedad de rutas. Más preferentemente, tales composiciones son para la administración oral. Tales composiciones farmacéuticas y los procesos para prepararlas son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY (A. Gennaro, et al., ed., 19th ed., Mack Publishing Co., 1995). Los compuestos de la presente invención en general son efectivos sobre una amplia gama de dosificación. Por ejemplo, las dosificaciones por día normalmente caen dentro del intervalo de aproximadamente 0.0001 a aproximadamente 30 mg/kg de peso corporal. En algunos casos los niveles de dosificación debajo del límite inferior del intervalo mencionado anteriormente pueden ser más adecuados, mientras que en otros casos pueden emplearse dosis aún mayores sin causar ningún efecto secundario dañino, y por lo tanto, el intervalo de dosificación anterior no se pretende que limite el alcance de la invención de ninguna manera. Se entenderá que la cantidad del compuesto en realidad administrado será determinada por un médico, considerando las circunstancias relevantes, que incluyen la condición que es tratada, la ruta de administración elegida, el compuesto o compuestos reales administrados, la edad, peso y la respuesta del paciente individual y la gravedad de los síntomas del paciente.

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Monohidrato de 2- (6-metil-piridin-2-il) -3- [ 6-amino-quinolin-4-il-5, 6-dihidro-4H-pirrolo [l,2-b]pirazol.

2. Un monohidrato de 2- ( 6-metil-piridin-2-il) -3- [6-amino-quinolin-4-il-5, 6-dihidro-4H-pirrolo [1, 2-b] pirazol cristalino de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además el patrón de difracción de polvo de rayos X (radiación de Cu, ? = 1.54056 A) comprende un pico a 9.05 y uno o más picos del grupo que comprende 11.02, 11.95 y 14.84 (2T ± 0.1°) .

3. Un monohidrato de 2- ( 6-metil-piridin-2-il) -3- [ 6-amino-quinolin-4-il-5, 6-dihidro-4H-pirrolo [1, 2-b] pirazol cristalino que comprende monohidrato de 2- ( 6-metil-piridin-2-il) -3- [6-amido-quinolin-4-il) -5, 6-dihidro-4H-pirrolo [1,2-b] pirazol de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además el patrón de difracción pulverizado de rayos X (radiación de Cu, ? = 1.54056 A) comprende un pico a 9.05 (2T ± 0.1°) .

4. Un monohidrato de 2- ( 6-metil-piridin-2-il) -3- [6-amino-quinolin-4-il-5, 6-dihidro-4H-pirrolo [1, 2-b] pirazol cristalino de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además la resonancia magnética nuclear 13C de estado sólido tiene un cambio químico (ppm) de 108.8, 115.6, 122.6 y 171.0 (± 0.2) ppm.

5. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende cualquiera de los compuestos de conformidad con las reivindicaciones 1-4 y un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

6. Un método para inhibir la señalización de TGF-ß en un mamífero, caracterizado porque comprende administrar a un mamífero en necesidad de tal tratamiento una cantidad efectiva de cualquiera de los compuestos de conformidad con las reivindicaciones 1-5.

7. Un método para el tratamiento de las condiciones que resultan de la producción excesiva de TGF-ß en un mamífero, caracterizado porque comprende administrar a un mamífero en necesidad de tal tratamiento una cantidad de supresión de la señal de TGF-ß de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

8. Un proceso para elaborar monohidrato de 2-(6-metil-piridin-2-il) -3- [6-amino-quinolin-4-il-5, 6-dihidro-4H-pirrolofl, 2-b]pirazol cristalino, caracterizado porque comprende las etapas de cristalizar la base libre anhidra o re-cristalizar el monohidrato de (6-metil-piridin-2-il) -3- [6-amino-quinolin-4-il-5, 6-dihidro-4H-pirrolo [1, 2-b] pirazol de una relación de aproximadamente 0-90% de solvente orgánico a agua.

9. Un proceso para elaborar monohidrato de 2-(6-metil-piridin-2-il) -3- [6-amino-quinolin-4-il-5, 6-dihidro-4H-pirrólo [1, 2-b]pirazol cristalino, caracterizado porque comprende las etapas de resuspender 2- ( 6-metil-piridin-2-il) -3- [6-amino-quinolin-4-il-5, 6-dihidro-4H-pirrolo [ 1, 2-b] pirazol en 0-90% de solvente orgánico a agua.

10. 3- (6-ciano-quinolin-4-il) -2- ( 6-metil-piridin-2-il) -5, 6-dihidro-4H-pirrolo [1, 2-b] pirazol.