MX2008000199A - Uso de citosina diaminasas para disminuir la transferencia del retroelemento de cerdos a humanos - Google Patents
Uso de citosina diaminasas para disminuir la transferencia del retroelemento de cerdos a humanosInfo
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Abstract
Se describen cerdos transgénicos que expresan una o más deaminasas de citosina no-porcinas asícomo métodos de elaboración y uso de tales cerdos.
Description
USO DE CITOSINA DIAMINASAS PARA DISMINUIR LA TRANSFERENCIA DEL RETROELEMENTO DE CERDOS A
HUMANOS
Campo de la Invención Esta invención se refiere a cerdos transgénicos y células porcinas que han disminuido la capacidad de transmitir retroelementos tales como retrovirus endógenos porcinos a células y tejidos no porcinos, y más particularmente a cerdos transgénicos y células porcinas que contienen citosina deaminasas no porcinas. Antecedentes de la Invención El tratamiento de diabetes sigue siendo un carga sustancial para los pacientes y sus familias, con hasta el 50 % de los pacientes que experimentan complicaciones secundarias devastadoras debido a la exposición de por vida a niveles elevados de glucosa. Actualmente la única manera de restaurar y sostener la insulina sin el riesgo asociado de hiper- o hipoglicemia es sustituir las células de producción de insulina del paciente, islotes de Langerhans: ya sea por trasplante de un páncreas vascularizado o por la infusión de islotes aislados. Sin embargo, los donantes de páncreas humanos convenientes son muy raros. Los cerdos proporcionan una fuente potencialmente ilimitada de islotes para la xenotransplantación a pacientes diabéticos, y pueden desarrollarse al punto de la aplicabilidad clínica, potencialmente bien antes de desarrollar otras tecnologías, tales como células madre.
El potencial para la transmisión de virus del donante al tejido hospedador permanece siendo un impedimento para el uso de la xenotransplantación para el tratamiento de diabetes. Aunque la bioseguridad rigurosa y prueba pueden eliminar la mayoría de agentes de cerdos donadores potenciales, un agente en particular es recalcitrante a este método. La mayoría, tal vez todos, los genomas vertebrados, cerdos y humanos incluidos, albergan secuencias de ácido nucleico móvil por infecciones retrovirales anteriores. Aunque la mayoría de éstos son inactivos funcionalmente, las células del cerdo contienen varios tipos de retroelementos ACTIVOS llamados retrovirus endógenos porcinos (PERVs). Estos agentes son generalmente inocuos al cerdo, pero son de mayor preocupación por la xenotransplantación. Bajo las condiciones de laboratorio en las cuales las células de cerdo y humanas están co-cultivadas, la transmisión de PERVs desde cerdo al tejido humano se ha demostrado (Patience y colaboradores (1997) Nat Med 3, 282-286). Es poco claro que, si cualquiera de las ramificaciones de esta transmisión se tendrían para un paciente, debido a la posibilidad teorizada de que PERVs solo o en combinación con agentes humanos podría causar enfermedad ha surgido como un obstáculo importante a la extensa aplicación de la xenotransplantación.
Breve Descripción de la Invención La invención está basada en la expresión de polipéptidos de cítosina deaminasa no porcina en células y tejidos del cerdo. Según lo descrito en la presente, la expresión de citosina deaminasas no porcinas (por ejemplo, citosina deaminasas humanas) en células porcinas y tejidos pueden facilitar el control de la transmisión de retroelementos tales como PERVs a células humanas. Como un resultado, las células y tejidos de los cerdos que contienen citosina deaminasas no porcinas han reducido la capacidad de transmitir PERVs en células humanas y de esta forma, pueden reducir los riesgos asociados con la xenotransplantación de la transferencia desde la transferencia del gen de especies cruzadas. En un aspecto, la invención ofrece un constructo de ácido nucleico que incluye una unidad transcripcional, la unidad transcripcional incluye una región reguladora porcina ligada operablemente a una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido citosina deaminasa no porcina. Una repetición invertida de un transposón puede flanquear cada lado de la unidad transcripcional. Un elemento aislante puede también flanquear cada lado de la unidad transcripcional. El constructo de ácido nucleico puede además incluir una secuencia de ácido nucleico que codifica una transposasa. El polipéptido citosina deaminasa puede seleccionarse del grupo que consiste de AID, APOBEC1, APOBEC3A, APOBEC3B, APOBEC3C, APOBEC3D, APOBEC3E, APOBEC3F, APOBEC3G, y APOBEC3H. Por ejemplo, el polipéptido citosina deaminasa puede ser un polipéptido APOBEC3F tal como un polipéptido humano AP0BEC3F o puede ser un polipéptido APOBEC3G tal como un polipéptido APOBEC3G humano. En algunas modalidades, la secuencia de ácido nucleico codifica por lo menos dos polipéptidos citosina deaminasa (por ejemplo, un polipéptido APOBEC3F y un polipéptido APOBEC3G). La región reguladora porcina puede ser un promotor constitutivo o un promotor de tejido específico. En otro aspecto, la invención ofrece una célula porcina aislada que incluye un constructo de ácido nucleico, el constructo de ácido nucleico incluye una región reguladora ligada operablemente a una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido citosina deaminasa no porcino. La célula puede ser una célula embrionaria, una célula porcina fetal (por ejemplo, un fibroblasto), una célula porcina adulta (por ejemplo, un fibroblasto dérmico), una célula de germen (por ejemplo, un oocito o un huevo), una célula madre (por ejemplo, una célula madre adulta o una célula madre embriónica), o una célula progenitora. La invención también ofrece una célula porcina aislada que incluye una citosina deaminasa no porcina. La célula además puede incluir un ácido nucleico que codifica la cítosina deaminasa no-porcina. El polipéptido citosina deaminasa puede seleccionarse del grupo que consiste AID, APOBEC1, APOBEC2, APOBEC3A, APOBEC3B, APOBEC3C, APOBEC3D, APOBEC3E, APOBEC3F, APOBEC3G, y APOBEC3H. Por ejemplo, el polipéptido citosina deaminasa puede ser un polipéptido APOBEC3F tal como un polipéptido APOBEC3F humano o puede ser un polipéptido APOBEC3G tal como un polipéptido APOBEC3G humano. En algunas modalidades, la secuencia de ácido nucleico codifica por lo menos dos polipéptidos citosina deaminasa (por ejemplo, un polipéptido de APOBEC3F y un polipéptido de APOBEC3G). La región reguladora puede ser un promotor constitutivo o un promotor de tejido específico. En otro aspecto, la invención ofrece un cerdo transgénico, células derivadas del cerdo transgénico, tejido aislado del cerdo transgénico, y progenie del cerdo transgénico. Las células nucleadas del cerdo incluyen un constructo de ácido nucleico, que incluye una unidad transcripcional que incluye una región reguladora ligada operablemente a una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido citosina deaminasa no porcino. La expresión del polipéptido citosina deaminasa no porcino en por lo menos algunas de las células del cerdo resulta, hasta el co-cultivo con células humanas, en una disminución de capacidad de las células para transmitir retrovirus endógenos porcinos a las células humanas. La región reguladora puede ser un promotor constitutivo o un promotor específico de tejido. Un elemento aislante y una repetición invertida de un transposón pueden flanquear cada lado de la unidad transcripcional. El polipéptido citosina deaminasa puede seleccionarse del grupo que consiste de AID, APOBEC1, APOBEC2, APOBEC3A, APOBEC3B, APOBEC3C, APOBEC3D, APOBEC3E, APOBEC3F, APOBEC3G, y APOBEC3H. Por ejemplo, el polipéptido citosina diaminasa puede ser un polipéptido APOBEC3F tal como un polipéptido APOBEC3F humano o puede ser un polipéptido APOBEC3G tal como un polipéptido APOBEC3G humano. En otro aspecto, la invención ofrece un método para hacer un cerdo transgénico. El método incluye introducir una célula de cerdo transgénico en un oocito de cerdo enueclado para establecer una célula combinada, la célula de cerdo transgénico incluye un constructo de ácido nucleico, el cual incluye una unidad transcripcional que incluye una región reguladora ligada operablemente a una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido citosína diaminasa no porcino; que produce un embrión porcino de la célula combinada; transferir el embrión porcino a una hembra receptora; y permitir que el embrión porcino se desarrolle en la hembra receptora para producir el cerdo transgénico. Un elemento aislante y una repetición invertida de un transposón pueden flanquear cada lado de la unidad transcripcional. La invención también ofrece un método de hacer un cerdo transgénico. El método incluye introducir un constructo de ácido nucleico en un huevo fertilizado para producir un huevo fertilizado inyectado, donde el constructo de ácido nucleico incluye una unidad transcripcional que incluye una región reguladora ligada operablemente a una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido citosina diaminasa no porcino; transferir el huevo fertilizado inyectado a una hembra receptora; y permitir que el huevo fertilizado inyectado se desarrolle en la hembra porcina receptora para producir el cerdo transgéníco. En otro aspecto, la invención ofrece un método para hacer una célula de cerdo transgénico. El método incluye introducir un constructo de ácido nucleico en una célula de cerdo, el constructo de ácido nucleico incluye una región reguladora ligada operablemente a una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido citosina diaminasa no porcino. La invención también ofrece un método para hacer una célula de cerdo transgénico. El método incluye introducir en una célula de cerdo: a) un constructo de ácido nucleico que incluye una unidad transcripcional, la unidad transcripcional incluye una región reguladora ligada operablemente a una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido citosina diaminasa no porcino, en donde un elemento aislante y una repetición invertida de un transposón flanquean en cada lado de la unidad transcripcional; y b) una fuente de una transposasa. La fuente de la transposasa puede incluir un ácido nucleico que codifica la transposasa. El transposón y la fuente de transposasa pueden estar presentes en constructos separadas del mismo ácido nucleico o en el mismo constructo de ácido nucleico.
A menos que estén definidos de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado como es entendido comúnmente por un experto en la técnica para el cual esta invención pertenece. Aunque los métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente pueden utilizarse para practicar la invención, los métodos y materiales convenientes se describen abajo. Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes, y otras referencias mencionadas en la presente están incorporadas por referencia en su totalidad. En caso de conflicto, la presente especificación, incluyendo definiciones, controlarán. Además, los materiales, métodos, y ejemplos, son ilustrativos únicamente y no están deseados para limitarse. Otras características y ventajas de la invención serán aparentes de la siguiente descripción detallada, y de las reivindicaciones. Descripción de los Dibujos La figura 1A y 1B son histogramas que indican que APOBEC3G estimula la mutación en S. cerevisiae por la ruta de la escisión de uracilo. (A) La expresión APOBEC3G causa un aumento en la frecuencia mediana de la mutación a CanR. Cada X representa la frecuencia derivada de un cultivo independiente y el medio es indicado. El eje y describe el número observado de colonias CanR por millón de células de levadura viables. La levadura expresa el vector de control mostrado en una frecuencia de mutación espontánea en CanR similar a la reportada previamente (Huang y colaboradores (2003) Proc Acad Sci USA 100, 11529-34; Rattray y colaboradores (2002) Genetics 162, 1063-77). Los datos son representativos de siete experimentos independientes. La figura 2 reporta el significado de la mediana de los valores para estos experimentos). (B) La co-expresión AP0BEC3G y Ugi dispara un aumento sinérgico en la frecuencia de mutación a Canl. APOBEC3G es marcado con el dominio de la unión de ADN de LexA a menos que esté observado. Los parámetros son idénticos a la figura 1A. La figura 2 es un histograma que resume el fenotipo de mutación CAN1 dependiente de APOBEC3G de siete experimentos independientes, cada uno realizado con 6-8 cultivos de levadura independientes que expresan APOBEC3G o un vector de control. El promedio de las frecuencias medianas de la mutación y los
SEMs correspondientes se muestran. El promedio medio de la frecuencia de la mutación de la expresión de levadura del vector de control fue 1.3 x 10"6; a este número fue asignado un valor de uno para normalizar y para destacar la magnitud del fenotipo de mutación APOBEC3G (33-veces). Los datos de las figuras 1A y
1B, y la figura 3 están incluidos con datos desde tres experimentos adicionales. La variación en valores entre los cultivos individuales para cada experimento y entre los valores medianos de los siete experimentos es esperada del aspecto estocástico de los mutantes de CanR en los cultivos de desarrollo.
La figura 3 es un histograma que indica que APOBEC3G estimula la mutación en S. cerevisiae por la rura de la escisión de uracilo II. Inhibición de urasílo ADN glicosilasa por Ugi o su ablación por una eliminación causada por fenotipos virtualmente idénticos. Los parámetros experimentales son idénticos a los descritos por la figura 1A. La figura 4A-4D demuestra que APOBEC3G marca la transición C/G ->T/A de las mutaciones en S. cerevisiae. (A) histogramas que resumen los tipos de mutaciones encontradas en el gen de CANI de S. cerevisiae que expresa un vector de control o un APOBEC3G. Los datos de Lex-APOBEC3G y APOBEC3G no marcado que expresa las células fueron casi idénticos y fueron reunidos para estos análisis. Las mutaciones fueron categorizadas como transiciones (Trs), transversiones (Trv), eliminaciones (Del) o inserciones (Ins). (B) Resumen de la sustitución base de las mutaciones encontradas en el gen CANI de S. cerevisiae expresando un vector de control o APOBEC3G. (C) Histogramas que resumen los tipos de mutaciones encontrados en el gen de CANI de S. cerevisiae que expresa Ugi y un vector de control o APOBEC3G. Etiquetado como en la figura 4A. (D) Resumen de la sustitución base de las mutaciones encontradas en el gen de CANI de S. cervisiae que expresa Ugi y un vector de control o APOBEC3G. La figura 5 es una gráfica que ilustra el porcentaje que cada base fue encontrada en la posición indicada con relación al sitio de la transición C/G -> de T/A de la mutación en APOBEC3G que expresa las células (n = 37). La base encontrada con más frecuencia está indicada abajo. Los sitios de consenso de APOBEC3G observados en modelos de sustratos retrovirales, VIH-GFP o MLV-GFP, son mostrados (Liddament y colaboradores (2004) Curr. Biol. 14, 1385-91). Las bases múltiples tuvieron el mismo porcentaje y están indicadas por un código de letra donde D = A/G/T,R =A/G,S =G/C y Y =C/T. El contenido G/C del gen CANI está indicado por la línea rayada. La figura 6A-6D indica que APOBEC3F y APOBEC3G inhiben la retrotransposición de Ty1. (A) Una descripción esquemática de retrotransposición de Til o TiHRT que rinden histidina a la prototrofía o actividad de luciferasa. GA, PR, IN, RT y LTR representan gag, proteasa, integrasa, transcriptasa inversa y repetición terminal larga, respectivamente. (B, D) Expresión APOBEC3F o -3G que disminuye la retrotransposicíón de Ty1 o TyHRT según lo monitoreado por el número de colonias H¡s0 Para cada condición, por lo menos ocho cultivos independientes fueron analizados y las barras de error representan un error estándar del medio. (C, E) Expresión APOBEC3F o -3G disminuye la retrotransposición de Ty1 o TyHRT según lo monitoreado por la actividad de luciferasa. Las condiciones fueron idénticas a las descritas arriba. La figura 7 es una gráfica de un experimento representativo que muestra el efecto de la expresión APOBEC3F o -3G en la retrotransposición de un elemento cromosómico Ty1-his3AI. La expresión APOBEC3F y -3G disminuyó la frecuencia de la retrotransposición His+ por 94- y 98-veces, respectivamente. Estos efectos fueron iguales probablemente porque varios de los cultivos de la expresión APOBEC3F y -3G no pudieron rendir ninguna de las colonias His+ (aunque las células viables indicaron que habían crecido hasta la saturación). Observe que el nivel del vector de control de la retrotransposicíón de His+ en este experimento es mucho más bajo que la mostrada en la figura 6, debido a que aquí el constructo de Ty1-hís3AI es solo copia y su promotor endógeno está bajo control celular, los constructos utilizados en la figura 6 son expresados de plasmidas multicopia por un promotor GAL altamente eficiente]. Las barras de error indican un SEM y ellas estaban apenas visibles para APOBEC3F y -3G. La figura 8A-8B indica que APOBEC3F y APOBEC3G indujeron las hipermutaciones de cADN Ty1. (A) Un diagrama esquemático representa la retrotransposición His+ dependiente de LTR de Ty1 que hospeda un gen pasajero de GFP. Los eventos de la retrotransposición de His+ fueron reunidos y las variantes de GFP-negativo fueron recuperadas por la secuencia de ADN como es descrita en los Materiales y Métodos. GA, PR, IN, LTR representan gag, proteasa, integrasa, transcriptasa y repetición terminal larga, respectivamente. (B) Un esquema que muestra todas las mutaciones de sustitución a base de cepa genófica (más) que fueron encontradas en el gen pasajero de GFP (y las regiones circundantes) (SEQ ID NO:1) de retrotransposones His+/GFP". Las mutaciones atribuibles a la expresión APOBEC3G o -3F son indicadas arriba y abajo de la secuencia de consenso 1488 bp, respectivamente. El codón de inicio GFP está subrayado. Todas las mutaciones fueron recuperadas de experimentos Ty1, con excepción de tres substituciones A G ->, que fueron de experimentos TyHRT (uno debido a APOBEC3F es mostrado en la posición de consenso 681; un segundo debido a APOBEC3F y uno debido a APOBEC3G no están ilustrados porque ocurrieron en la secuencia VIH RT). Todos estos formatos de secuenciación están resumidos en la figura 9. Cuatro controles negativos GFP fueron observados. Dos no fueron recuperados por PCR y dos produjeron productos PCR más pequeños y no fueron secuenciados (probablemente eliminados). La figura 9 son tablas que indican las preferencias de mutación de APOBEC3G y APOBEC3F en ADNc Ty1. (A, C) Resúmenes de las mutaciones de sustitución a base del gen GFP (y región circundante) mutaciones de sustitución observadas en grupos de retrotransposiciones His+, que han ocurrido en presencia de APOBEC3G o -3F, respectivamente. (B, D) Base de preferencias que rodea el ADNc Til de los sitios de transición C-> atribuible a la expresión APOBEC3G o -3F, respectivamente. APOBEC3G muestra una preferencia clara por 5'-YCC_, mientras que APOBEC3F prefiere 5'-TTC (Y = C o T; la citosina matada está subrayada). La figura 10 es un gráfico que indica la expresión APOBEC3G humana en células de riñon de cerdo (PK-15) que causan tres veces una declinación en la transferencia de PERV a las células humanas 293T en un experimento de co-cultivo a largo plazo. Los dos paneles superiores son inmunotransferencias mostrando la expresión de APOBEC3G humano (HsA3G) en células PK-15 (línea central), pero no en el vector únicamente o células de expresión APOBEC3F (SsA3F) de cerdo (línea izquierdo y derecha, respectivamente). Las bandas no específicas están mostradas como controles de cargamento. La figura 11A es un fotografía de los productos PCR de un ensayo PCR semicuantitativo representativo mostrando que APOBEC3G humano potentemente disminuye la transferencia de PERV del cerdo a células humanas. La figura 11 B es el control específico del cerdo. La figura 12 es un gráfico de una representación cuantitativa, en tiempo real del ensayo de PCR mostrando que el APOBEC3G humano potencialmente disminuye la transferencia de PERV de cerdo a las células humanas. La figura 13 es una alineación de secuencia de la vaca (BtA3F, ID SEC NO:8), ovejas (OaA3F, ID SEC NO:9), y cerdo (SsA3F, ID SEC No: 10)proteínas de APOBEC3F. La figura 14 es una alineación de la secuencia del sitio activo del humano (HsA3F, ID SEC NO:11), vaca (BtA3F, ID SEC NO:12), ovejas (OaA3F, ID SEC NO: 13), y cerdo (SsA3F, ID SEC NO: 14) proteínas de APOBEC3F. Los elementos conservados están embalados. La figura 15A es una gráfica de la infección relativa de VIH-GFP producido en la presencia de un control de vector o de la proteína indicada A3. Para facilitar las comparaciones, todos los datos fueron normalizados a la contagiosidad de VIH-GFP producida en la presencia de un control de vector, al cual le fue asignado arbitrariamente un valor de uno. El medio y el SEM de tres experimentos independientes se muestran. El VIH Vif no está presente en estos experimentos. La figura 15B es una gráfica de la contagiosidad relativa de MLV-GFP producido en presencia de los constructos indicados. Los parámetros son idénticos a las de la figura 15A.
Descripción Detallada de la Invención Según lo descrito en la presente, las citosina deaminasas humanas tales como APOBEC3G y 3f son capaces de desaminar ADN genómico de una célula eucariótíca. La expresión de APOBEC3G o su homólogo APOBEC3F puede inhibir la movilidad del retrotransposón Til en Saccharomyces cerevisiae por un mecanismo que implica la desaminación de citosinas de ADNc. Esto amplía el intervalo de objetivos de citosina diaminasa para incluir ADN nuclear y retroelementos endógenos, que tienen implicaciones patológicas y fisiológicas, respectivamente. Estos datos indican que el mecanismo APOBEC3 dependendiente de la restricción de retroelemento está conservado altamente y que el intervalo de los sustratos APOBEC3 puede ser más amplia que el anticipado originalmente. Debido a que las proteínas APOBEC3 no existen fuera de mamíferos, los resultados descritos en la presente que muestran que APOBEC3F o -3G puede inhibir la retrotransposición de la levadura Ty1 fueron inesperados. Por lo tanto, los datos de Ty1 descritos en la presente no únicamente muestran la conservación notable de este mecanismo sino, importantemente, ellos también muestran que los factores mamíferos (en adición al APOBEC3F o -3G) no son requeridos para la restricción del retroelemento. Además, según lo mostrado en la presente, la expresión de la citosina deaminasa humana en células porcinas reduce la capacidad de las células porcinas para transmitir retroelementos endógenos (por ejemplo, retrovirus y retrotransposones) a las células humanas. Así, la invención proporciona cerdos transgénicos y células de cerdo que expresan un polipéptido citosina diaminasa no porcino. Los órganos y tejidos de tales cerdos transgénicos son útiles para la xenotransplantación debido al riesgo disminuido de transmitir los retrovirus porcinos endógenos a células humanas con relación a órganos y tejidos cerdos que expresan citosina deaminasas endógenas. Citosina deaminasas No Porcinas Según lo utilizado en la presente, " polipéptido citosina diaminasa" se refiere a cualquier cadena de aminoácidos, sin importar la modificación post-translación, que tiene la capacidad de desaminar citosinas a uracilos dentro del ácido nucleico y que contiene el siguiente dominio de citosina diaminasa que une al zinc (aminoácidos proporcionados en terminología de una letra estándar): H/CXE (u otro residuo catalítico, por ejemplo, D) X20- 30PCX2.4C. Ver, Harris and Liddament (2004) Nat. Rev. Immunol. 4:868-877. Las sustituciones, eliminaciones, e inserciones de aminoácido pueden introducirse en un dominio de citoina deaminasa que une al zinc y el polipéptido resultante es una "citosina diaminasa" a condición de que el polipéptido conserve la capacidad de desaminar citosinas a uracilos. Los polipéptidos citosina diamínasa de mamíferos, no porcinos, convenientes incluyen citosina deaminasas de un dominio de ADN y citosina deaminasas de doble dominio de ADN. Por ejemplo, las citosina deaminasas de un dominio de ADN incluyen, por ejemplo, activación inducida por deaminasa (AID), APOBEC1, APOBEC2, APOBEC3A, APOBEC3C, APOBEC3D, APOBEC3E, y polipéptidos APOBEC3H. Las citosina deaminasas de doble dominio de ADN incluyen, por ejemplo, polipéptidos APOBEC3B, APOBEC3F, y APOBEC3G. Los APOBEC3D y APOBEC3E también pueden producirse como citosina deaminasas de doble dominio. Vee, por ejemplo, Harris y Liddament (2004), supra; y Jarmuz y colaboradores Genomics (2002) 79(3):285- 96. APOBEC3G y/o APOBEC3F son particularmente útiles. El APOBEC3G humano (apoliproteína B enzima que edita el ARNm polipéptido catalítico tipo a 3G, también conocidos como CEM15) utiliza citosina para la desaminación de uracilo para inhibir la replicación de una variedad de retrovirus, incluyendo VIH-1. APOBEC3G se localiza predominantemente en el citoplasma de células mamíferas. En una célula infectada de retrovirus, esta localización puede facilitar la incorporación de APOBEC3G en partículas virales, que son liberadas de la membrana del plasma. APOBEC3G también es incorporado específicamente en viriones a través de una asociación con la proteína Gag viral y/o el ARN genómico viral. Una vez que un retrovírus entra en una célula, su ARN genómico es invertido transcrito, y durante este proceso, APOBEC3G es capaz de desaminar citosínas de ADNc de uracilos (C->U). Estas lesiones ocurren con tan alta frecuencia que finalmente inactivan el virus (que causa la hípermutación G->A, mientras se extrae en la cepa genómica del virus). APOBEC3F es un homólogo de APOBEC3G y restringe la infección de VIH-1 por un mecanismo similar. APOBEC3F y -3G desaminan citosinas dentro de diferentes contextos locales, prefiriendo 5' -TC y 5'-CC, respectivamente. La secuencia del ácido nucleico que codifica la citosina diaminasa puede ser un ADNc o puede incluir introns o regiones 5' - ó 3' no traducidas adyacentes (por ejemplo, un ácido nucleico genómico). Por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico puede codificar un polipéptido humano APOBEC3F o APOBEC3G. La GenBank Accession Nos. NM_145298 y NM_021822 proporciona las secuencias de ADNcs de APOBEC3F y APOBEC3G humano, respectivamente. La secuencia de ácido nucleico también puede codificar un polipéptido APOBEC3F de oveja o vaca según lo descrito en la presente. Las proteínas de APOBEC3F de la oveja y vaca tienen un activo del dominio de citosina deaminasa ADN amino terminal, que produce como respuesta una desaminación dinucleotido más amplia preferente, y son completamente resistentes al VIH-I Vif.
Las secuencias de ácido nucleico que tienen mutaciones silenciosas que no cambian los aminoácidos codificados o variantes de secuencia que cambian uno o más aminoácidos codificados, pero que no suprimen la función enzimática, también pueden ser utilizados. Por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico del APOBEC3G usado en la presente, difiere de la secuencia de codificación de NM_021822 por una transición C a T en la posición del nucleotido 588. Esta transición es silenciosa y no cambia el aminoácido codificado en la posición 119 (F). En unas modalidades, dos o más polípéptidos citosina deaminasa
(por ejemplo, polipéptidos APOBEC3F y APOBEC3G humanos) son codificados en el constructo del ácido nucleico. Constructos de Ácido Nucleico Los constructos del ácido nucleico de la invención incluyen una secuencia de ácido nucleico que codifica una citosina deaminasa no porcina. Según lo utilizado en la presente, el término "ácido nucleico" incluye el ADN, ARN, y análogos del ácido nucleico, y los ácidos nucleico que son de doble cadena o de una sola cadena (es decir, un sentido o una sola cadena antisentido). Los análogos del ácido nucleico pueden modificarse en la fracción base, fracción de azúcar, o esqueleto de fosfato para mejorar, por ejemplo, la estabilidad, hibridación, o solubilidad del ácido nucleico. Las modificaciones en la fracción base incluyen deoxiuridina para deoxitimidina, y 5-metil-2'-deoxicitídina y 5-bromo-2'-doxicitidina para deoxicitidina. Las modificaciones de la fracción de azúcar incluyen la modificación del 2'hidroxilo del azúcar ribosa para formar azúcares 2'-O-metil o 2'-O-alil. El esqueleto del fosfato de deoxiríbosa puede modificarse para producir ácidos nucleicos de morfolino, en los cuales cada fracción base está ligada a seis miembros, anillo morfolino, o ácidos nucleicos del péptido, en los cuales el esqueleto de deoxifosfato es sustituido por un esqueleto de pseudopéptido y las cuatro bases son conservadas. Ver, Summerton and Weller (1997) Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7(3): 187-195; y Hyrup y colaboradores (1996) Bioorgan. Med.
Chem. 4(l):5-23. En adición, el esqueleto de deoxifosfato puede sustituirse por, un esqueleto de fosforotioato o fosforoditioato, un fosforoamidito, o un esqueleto fosfotriéster de alquilo. La secuencia de ácido nucleico que codifica la citosina diaminasa puede estar ligada operablemente a una región reguladora tal como un promotor. Las regiones reguladoras pueden ser regiones reguladoras porcinas o pueden ser de otras especies. Según lo utilizado en la presente, " operablemente ligado" se refiere a colocar, de una región reguladora con relación a una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido, en tal manera que permita o facilite la expresión del polipéptido codificado. Cualquier tipo de promotor puede estar operablemente ligado a una secuencia de ácido nucleico que codifica una citosina diamínasa. Los ejemplos de promotores incluyen, sin limitación, promotores de tejidos específicos, los promotores constitutivos, y promotores responsivos o no responsivos a un estímulo particular. Los promotores de tejido específicos convenientes pueden resultar en una expresión preferencial de una transcripción de ácido nucleico en células del islote e incluir, por ejemplo, el promotor de insulina humano. Otros promotores del tejido específicos pueden resultar en la expresión preferencial en, por ejemplo, hepatocitos o tejido de corazón y pueden incluir a la albúmina o promotores de cadena pesada alfa-miosina, respectivamente. En otras modalidades, un promotor que facilita la expresión de una molécula de ácido nucleico sin el tejido significante o de especificidad temporal puede utilizarse (es decir, un promotor constitutivo). Por ejemplo, un ß-actina tal como el promotor del gen ß-actina de pollo, promotor de ubiquitina, promotor de dehidrogenasa de gliceraldehido-3-fosfato (GAPDH), o promotor de cinasa 3-fosfoglicerato (PGK) pueden utilizarse, así como promotores virales tales como promotor de timidina cinasa del virus de herpes (TK), promotor de SV40, o un promotor de citomegalovirus (CMV). En algunas modalidades, una fusión del promotor del gen ß-actina del pollo y el potenciador CMV se utiliza como promotor. Ver, por ejemplo, Xu y colaboradores (2001) Hum. Gene Ther. 12(5):563-73; y Kiwaki y colaboradores (1996) Hum. Gene Ther. 7(7):821-30. Un ejemplo de un promotor inducible es la tetraciclina (tet)-en el sistema promotor, el cual puede utilizarse para regular la transcripción del ácido nucleico. En este sistema, un represor Tet mutado (TetR) está fusionado con el dominio de activación del herpes simplex VP 16 (proteína transactivadora) para crear un activador transcripcional controlado de tetraciclina (tTA), que es regulado por el tet o doxiciclina (dox). En ausencia de antibiótico, la transcripción es mínima, mientras que en la presencia de tet o dox, la transcripción es inducida. Los sistemas inducibles alternativos incluyen los sistemas de ecdisona o rapamicina. Ecdisona es una hormona de descamación de insecto cuya producción es controlada por un heterodímero del receptor de ecdisona y el producto del gen ultraporo (USP). La expresión es inducida por el tratamiento con ecdisona o un análogo de ecdisona tal como muristerona A. Las regiones reguladoras adicionales que pueden ser útiles en los constructos de ácido nucleico, incluyen, pero no se limitan a, las secuencias de poliadenilación, secuencias de control de traducción (por ejemplo, un segmento de entrada interna de ribosoma, IRES), potencíadores, elementos inducíbles, o ¡ntrones. Tales regiones reguladoras pueden no ser necesarias, aunque pueden aumentar la expresión afectando la transcripción, estabilidad del ARNm, eficacia de translación, o similares. Tales regiones reguladoras pueden incluirse en un constructo de ácido nucleico según lo deseado para obtener la expresión óptima de los ácidos nucleico en la célula (s). La suficiente expresión, sin embargo, puede obtenerse algunas veces sin tales elementos adicionales. Otros elementos que pueden ser incluidos en un constructo de ácido nucleico que codifica la señal de los péptidos o los marcadores seleccionables. La señal de los péptidos puede ser utilizada de modo que el polipéptido codificado es dirigido a una localización celular particular (por ejemplo, la superficie celular). Los ejemplos no limitantes de marcadores seleccionables incluyen puromicin, deaminasa de adenosina (ADA), fosfotransferasa aminoglicosida (neo, G418, APH), díhidrofolato reductasa (DHFR), higromicin-B-fosftransferasa, timidina cinasa (TK), y xantin-guanina fosforibosiltransferasa (XGPRT). Tales marcadores son útiles para seleccionar transformantes estables en cultivo. En algunas modalidades, una secuencia de ácido nucleico que codifica una citosina diaminasa puede incluir una secuencia que codifica una "etiqueta" diseñada para facilitar la manipulación posterior del polipéptido codificado (por ejemplo, para facilitar la localización o detección). Las secuencias de etiqueta pueden insertarse en la secuencia del ácido nucleico que codifica el polipéptido citosina diaminasa de modo que la etiqueta codificada está situada en ya sea el carboxilo o amino terminal del polipéptido citosina diaminasa. Los ejemplos no limitantes de etiquetas codificadas incluyen la proteína fluorescente verde (GFP), glutationa S-transferasa (GST), y la etiqueta Flag™ (Kodak, New Haven, CT). Los constructos de ácido nucleico pueden introducirse en las células porcinas embrionarias, fetales, o de adulto de cualquier tipo, incluyendo, por ejemplo, las células de germen tales como un oocito o un huevo, célula progenitora, célula madre embrionaria o adulta, célula de riñon tal como una célula PK-15, una célula de islote, una célula ß, una célula de hígado, o un fibroblasto tal como un fibroblasto dérmico, usando una variedad de técnicas. Los ejemplos no limitantes de las técnicas incluyen el uso de los sistemas de transposón, virus recombinantes que pueden infectar a las células, o liposomas u otros métodos no virales tales como electroporación, microinyección, o precipitación del fosfato de calcio, que son capaces de suministrar ácidos nucleicos a las células. En sistemas del transposon, la unidad transcripcional de un constructo de ácido nucleico, es decir, la región reguladora ligada operablemente a una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido citosina diaminasa, es flanqueada por una repetición invertida de un transposón. Varios sistemas de transposón, que inncluyen, por ejemplo, Sleeping Beauty (ver, Patente Norteamericana No. 6.613.752 y Publicación de Patente
Norteamericana No. 20050003542), Frog Prince (Miskey y colaboradores (2003) Nucleic Acids Res. 31 (23):6873-81 ), y Skipper, han sido desarrollados para introducir ácidos nucleico en las células, incluyendo células de ratones, humano, y de cerdo. El transposón de Sleeping Beauty es particularmente útil. Una transposasa puede codificarse en el mismo constructo de ácido nucleico o puede introducirse en un constructo de ácido nucleico separado. Los elementos aislantes también pueden incluirse en un constructo de ácido nucleico para mantener la expresión del polípéptido citosina díaminasa y para inhibir la transcripción indeseada de genes hospedadores. Ver, por ejemplo, Publicación de Patente Norteamericana No. 20040203158. Normalmente, un elemento aislante flanquea cada lado de la unidad transcripcional y es interno a la repetición invertida del transposón. Los ejemplos no limitantes de los elementos aislantes que incluyen los elementos aislantes de la región de unión de la matriz (MAR) y los elementos aislantes tipo frontera. Ver, por ejemplo, Patentes Norteamericanas No. 6.395.549, 5.731.178, 6.100.448, y 5.610.053, y Publicación de Patente Norteamericana No.
20040203158. Los vectores virales que pueden utilizarse incluyen el adenovirus, virus adeno asociado (AAV), retrovirus, lentivirus, virus de vacuna, virus de sarampión, virus de herpes, y vectores del virus del papiloma bovino. Ver, Kay y colaboradores (1997)
Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94, 12744-12746 para una revisión de vectores virales y no virales. Los vectores virales están modificados de modo que el tropismo y patogenicidad nativos del virus han sido alterado o retirados. El genoma de un virus también puede modificarse para aumentar su contagiosidad y para acomodar el empaquetamiento del ácido nucleico que codifica el polipéptido de interés. Los vectores Adenovirales pueden manipularse fácilmente en el laboratorio, las células que se dividen y que no se se dividen pueden convertirse eficientemente, e integrase raramente dentro del genoma hospedador. Smith y colaboradores (1993) Nat. Genet. 5, 397-402; y Spector y Samaniego (1995) Meth. Mol. Genet., 7, 31-44. El adenovirus puede modificarse de modo que la región E1 es retirada del genoma de ADN de doble cadena para proporcionar el espacio para el ácido nucleico que codifica el polipéptido y que remueve la proteína E1a transactiva de modo que el virus no puede duplicarse. Los adenovirus se han utilizado para convertir una variedad de tipos de célula, incluyendo, entre otras, ceratinocitos, hepatocitos, y células epiteliales. Los vectores virales Adeno asociados (AAV) demuestran una amplia gama de tropismo y contagiosidad, aunque no exhiben patogenicidad humana y no producen una respuesta inflamatoria. Los vectores AAV exhiben la integración del sitio específico y pueden infectar las células que no se dividen. Los vectores AAV han sido utilizados para suministrar el ácido nucleico al cerebro, músculo esquelético, y al hígado en un período de tiempo largo (por ejemplo, >9 meses en ratones) en animales. Ver, por ejemplo, Patente Norteamericana No. 5.139.941 para una descripción de los vectores AAV. Los retrovirus es el sistema de suministro viral más-caracterizado y se ha utilizado en pruebas clínicas. Los vectores retrovirales median la transferencia de ácido nucleico alto eficientemente y la expresión. El retrovirus entra en una célula por fusión directa a la membrana del plasma y se integra dentro del cromosoma anfitrión durante la división de la célula. Lentivirus también puede utilizarse para suministrar ácidos nucleicos a las células, y en particular, a las células que no se dividen. La replicación deficiente del VIH tipo I basada en vectores se he utilizado para convertir una variedad de tipos de célula, incluyendo las células madre. Ver, Uchidda y colaboradores (1998) Proc. Nati. Acad. Sd. USA 95, 11939-11944.
Los vectores no virales pueden entregarse a las células vía las liposomas, que son vesículas de membrana artificiales. La composición de la liposoma es usualmente una combinación de fosfolipidos, particularmente fosfolipidos de alta temperatura en la fase de transición, generalmente en combinación con esteroides, especialmente colesterol. Otros fosfolipidos u otros lípídos pueden también utilizarse. Las características físicas de los liposomas dependen del pH, fuerza iónica, y la presencia de cationes bivalentes. La eficacia de transducción de liposomas puede aumentarse usando dioleoilfosfatidiletanolamina durante la transducción. Ver, Felgner y colaboradores (1994) J. Biol. Chem. 269, 2550-2561. Los liposomas eficientemente altos están comercialmente disponibles. Vea, por ejemplo, SuperFect® de Qiagen (Valencia, CA). Cerdos Transgénicos Las células nucleadas de los cerdos transgénicos proporcionados en la presente contienen un constructo de ácido nucleico descrito arriba. Según lo utilizado en la presente, el " cerdo transgénico" incluye cerdos transgénicos fundadores así como ia progenie de los fundadores, progenie de la progenie, y así sucesivamente, a condición de que la progenie conserve el constructo del ácido nucleico. Por ejemplo, un animal transgénico fundador puede utilizarse para reproducir animales adicionales que contienen el constructo del ácido nucleico. Los tejidos obtenidos de los cerdos transgénicos y células derivadas de los cerdos transgénicos también son proporcionados en la presente. Según lo utilizado en la presente, "derivado de" indica que las células pueden aislarse directamente del cerdo o pueden ser progenie de tales células. Por ejemplo, cerebro, pulmón, hígado, páncreas, corazón y válvulas del corazón, músculo, riñon, tiroides, córneo, piel, vasos sanguíneos u otro tejido conectivo pueden obtenerse de un cerdo. La sangre y células hematopoiéticas, Islotes de Langerhans, células ß, células del cerebro, hepatocítos, células del riñon, y células de otros órganos y fluidos corporales, por ejemplo, también pueden derivarse de cerdos transgénicos. Los órganos y células de cerdos transgénicos pueden trasplantarse en un paciente humano. Por ejemplo, los islotes de cerdos transgénicos pueden trasplantarse a los pacientes humanos diabéticos. Las varias técnicas conocidas en la técnica pueden utilizarse para introducir constructos de ácido nucleico en animales no humanos para producir las líneas fundadoras, en las cuales el constructo de ácido nucleico es integrado en el genoma. Tales técnicas incluyen, sin limitación, la microinyección pronuclear (Patente Norteamericana No. 4.873.191), el gen mediado por retrovirus se transfiere en las líneas del germen (Van der Putten y colaboradores (1985) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82, 6148-1652), gen objetivo en las células madre embrionarias (Thompson y colaboradores (1989) Cell 56, 313- 321), electroporación de los embriones (Lo (1983) Mol. Cell. Biol. 3, 1803-1814), y transformación in vitro de células somáticas, tales como cúmulo o células mamarias, o adulto, fetal, o células madre embrionarias, seguidas por la trasplantación nuclear (Wilmut y colaboradores (1997) Nature 385, 810-813; y Wakayama y colaboradores (1998) Nature 394, 369-374.). La microinyección pronuclear y transferencia nuclear de la célula somática son particularmente técnicas útiles. Normalmente, en la microinyección pronuclear, un constructo de ácido nucleico descrito arriba es introducido en un huevo fertilizado; 1 o 2 huevos fertilizados de la célula son utilizados como los pronúcleos que contiene el material genético de la cabeza del esperma y el huevo son visibles dentro del protoplasma. Los constructos de ácido nucleico linearizados pueden inyectarse en una de los pronucleos después que los huevos inyectados pueden transferirse a un hembra receptora (por ejemplo, en los oviductos de una hembra receptora) y permitir el desarrollo en la hembra receptora para producir cerdos transgénicos. En la transferencia nuclear de célula somática, una célula de cerdo transgénico tal como un fibroblasto fetal que incluye un constructo de ácido nucleico descrito arriba, puede introducirse en un oocito enucleado para establecer una célula combinada. Los oocitos pueden ser enucleados por la disección parcial de la zona cerca del cuerpo polar y entonces presionar fuera del citoplasma en el área de disección. Normalmente, una pipeta de inyección con una punta biselada aguda es utilizada para inyectar la célula transgénica en un oocito enucleado suspendido en la meiosis 2. En algunas convenciones, los oocitos suspendidos en la meiosis 2 son llamados "huevos". Después de producir un embrión porcino (por ejemplo, fusionando y activando el oocito), el embrión porcino es transferido a los oviductos de una hembra receptora, aproximadamente de 20 a 24 horas después de la activación. Vea, por ejemplo, Cibelli y colaboradores (1998) 280, Science 280, 1256-1258 y Patente Norteamericana No. 6.548:741.
Las hembras receptoras pueden ser checadas para saber si están preñadas aproximadamente 20-21 días después de la transferencia de los embriones. Las técnicas del estándar de crianza pueden utilizarse para crear los animales que son homoziguos para el polipéptido citosina diaminasa de los animales heteroziguos fundadores. La homozigosidad no puede requerirse, sin embargo, observa una capacidad disminuida de transmición de PERV en las células humanas. Una vez que se los cerdos transgénicos han sido generados, la expresión de los polipéptidos citosina diaminasa pueden determinarse usando técnicas estándares. La investigación inicial puede lograrse por el análisis de Southern blot para determinar si o no ha ocurrido la integración del constructo. Para una descripción del análisis Southern, ver las secciones 9.37-9.52 de Sambrook y colaboradores, 1989, Molecular Cloninq, A. Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Press, Painview; NY. Las técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) también pueden utilizarse en la investigación inicial. PCR se refiere a un procedimiento o técnica en los cuales los ácidos nucleicos objetivos son amplificados. Generalmente, la información de secuencia de los extremos de la región de interés o más es usada para diseñar los cebadores oligonucleotidos que son idénticos o similares en secuencia, opuestas de la hebra no codificadora que es amplificada. PCR puede utilizarse para amplificar secuencias específicas del ADN así como ARN, incluyendo secuencias de ADN genómico total o ARN celular total. Los cebadores son normalmente de 14 a 40 nucleotidos en longitud, pero pueden extenderse a partir de 10 nucleotidos a centenares de nucleotidos en longitud. PCR se describe en, por ejemplo Cebador PCR: A Laboratory Manual, ed. Dieffenbach and Dveksler, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995. Los ácidos nucleicos pueden también amplificarse por la reacción en cadena de la ligasa, amplificación del desplazamiento de la cadena, replicación de la secuencia auto-sostenida uno mismo de la secuencia, o ácido nucleico basado en secuencia amplificado. Ver, por ejemplo, Lewis 1992) Genetir Engineering News 12.1; Guatelli y colaboradores (1990) Proc. Nati. Acad. Sci USA 87, 1874-1878; y Weiss (1991) Science 254, 1292-1293. La expresión de una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptído citosina diaminasa (por ejemplo, un polipéptido APOBEC3F y/o APOBEC3G) en los tejidos de cerdos transgénicos puede determinarse usando las técnicas que incluyen, sin limitación, el análisis Northern blot de las muestras del tejido obtenidas del animal, análisis de hibridación in situ, análisis Western, inmunoensayos tales como ensayos inmunosorbentes ligados a la enzima, y transcriptasa inversa PCR (RT-PCR). La expresión de un polipéptido citosina diaminasa no porcino en por lo menos algunas de las células del cerdo puede resultar, hasta el co-cultivo con las células humanas, en una capacidad disminuida de las células para transmitir PERV a las células humanas. La capacidad disminuida para transmitir PERV puede determinarse, por ejemplo, por un análisis de co-cultivo. Las células del cerdo transgénico y las células humanas (por ejemplo, células 293T) pueden separarse físicamente por una membrana fina con los poros clasificados de 1 micrón y co-cultivadas por aproximadamente 50 generaciones o 25 días. Tal membrana permite la difusión libre de moléculas pequeñas que incluyen partículas virales pero no permite la difusión de células. En el final del período de cultivo, las células humanas pueden cosecharse y probarse por la actividad transcriptasa inversa PERV (como medida de contagiosidad) usando un ensayo ELISA (por ejemplo, de Cavidi Tech, Uppsala, Suecia). Se entiende que un fenotipo particular en un animal transgénico es determinado comparando normalmente el fenotipo en el animal transgénico al fenotipo correspondiente exhibido por un animal de control no humano que carece del transgene. Los cerdos transgénicos de la invención pueden ser criados con otros animales de interés (por ejemplo, animales con antecedentes de trasplante-compatibles tales como cerdos con un gen de a-1,3 galactosil transferasa inactivada). Los animales de progenie resultante pueden ser particularmente útiles para la xenotransplantación debido al riesgo disminuido de transmitir retrovirus endógenos en células humanas y el riesgo disminuido de rechazo hiperagudo. Tales animales pueden ser producidos por , por ejemplo, cruzando (a) un cerdo transgénico que expresa un polipéptido citosina diaminasa no porcino con (b) un cerdo transgéníco con un gen de de a-1,3 galactosil transferasa inactivado. Alternativamente, una sola línea de cerdos transgénicos puede ser producida inicialmente preparando a los cerdos usando transgenes apropiados. La invención es además descrita en los ejemplos siguientes, que no limitan el alcance de la invención descrita en las reivindicaciones. EJEMPLOS EJEMPLO 1 Métodos v Materiales para ejemplos 2-7 Cepas de la levadura. Los ensayos de la mutación de levadura fueron hechos en L40 (Mata his 3?200trpl-901 Ieu2-3112 ade2 LYS2:©lexAop)4HIS3 URA3:TlexAop)8-lacZ GAL4(1). Los análisis de retrotransposición fueron hechos en DG1251 (MATa ura3-167 trpl-hisG spt3-101 his3?200) o GRY1990, un derivado de DG1251 en el cual E. coli ß-galactosidasa esta expresado constitutivamente del promotor PGKI de la levadura (Nissley y colaboradores, (1996) Nature 380, 30; Nissley y colaboradores (1998) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95, 13905-10). Los ensayos de retrotransposición endógena fueron llevado a cabo en DGI 141 [MAT a trpl-hisG ura3-167 his3 ?200 Ti l-2y 2h is3 Al ; (Curcio and Garfmkel (1991) Proc. Nati. Acad. Sci USA 88, 936-40). L40 ungí
::kanMX4 fue construido amplificando el ungí: cásete de la cepa de eliminación de levadura 36067 (R. Wright, Univerisity of Minnesota), transformando L40 con el producto PCR resultante y seleccionando colonias resistentes a G418 (Wach y colaboradores (1994) Yeast 10, 1793-1808)) la eliminación de ungí fue confirmada por PCR y la investigación para un fenotipo modesto de C4N/mutador. Plasmidas. Los constructos estuvieron basados en pHybLex-Zeo o pJG4-5 (Invitrogen, Carlsbad, CA). La proteína de la fusión LexAAPOBEC3G fue construida subclonación de
APOBEC3G de pAPOBEC3G-IRES-bleo (Harris y colaboradores (2003) Cell 113, 803-809) usando Notl y Pstl. APOBEC3G sin etiquetar en pHybLex- Zeo contiene una inserción de 5 pb entre los marcos de lectura abierta LexA y APOBEC3G. Ugi fue subclonado de pEF-Ugi (Di Noia y Neuberger (2002)
Nature 419, 43-48) como un anEcoRI y fragmento Notl en ADNpc 3.1 (Invitrogen). Éste fue subclonado en pYES-CT usando Hindlll y Notl (Invitrogen). La expresión Ugi fue confirmada usando el ensayo de mutación CAN1. Las secuencias de tipo salvaje VIH-1 Vif fueron amplificadas por PCR de las plasmidas provirales VIH-1 YU-2 y IIIB (M. Malim, Kings College Londres), digirieron con Notl y BamHl y fueron primero clonadas en el corte pTrc99A similarmente (AP Biotech). Vif fue subclonado posteriormente en pHybLex-Zeo usando un extracto de Ncol y Psil y finalmente en pJG4-5 usando EcoRI y, Sphl. APOBEC3F fue subclonado de pTrc99A-APOBEC3F (Liddament y colaboradores (2004) Curr. Biol. 14, 1385-1391) en pHybLex-Zeo y pJG4-5 usando EcoRI y Salí. Las versiones marcadas his3AI inducibles por Galactosa (GAL) de Ty1 (pGALTyl) y TyHRT (pHART21) fueron descritos previamente (Nissley y colaboradores, 1996, supra; Nissley y coalboradores, 1998, supra). Ensayos de Mutación de Levadura. pHybLex-Zeo, pJG4-5, pYES3-CT y sus derivados fueron transformados en L40 y seleccionados usando una zeocina que contiene un medio completo sintético (300 µg/mL) y triptofan insuficiente (SC + ZEO-TRP) (Ausubel y colaboradores (2002) (John Wiley and Sons, Inc.). Varios miles de células viables de colonias independientes fueron utilizadas para inocular 2.5 ml SC + GAL+RAF + ZEO-TRP (galactosa 2 %, rafinosa 1 %, zeocina 300 µg/mL). Los cultivos fueron desarrollados a 30°C por 3-4 días, concentrado zinco veces y una fracción fue colocada en placa de SC + CAN-ARG (30 µg/ml CAN) para obtener mutantes resistentes de canavanina (CanR). Las cuentas de células viables fueron obtenidas poniéndolas en placas de una dilución al medio rico. Las células viables fueron contadas después de 2 días y las colonias Can fueron contadas después de 3-4 días de incubación a 30°C. El gen CAN1 de las colonias CanR fue amplificado por PCR y secuenciado como descrito previamente (Marsischky y colaboradores (1996) Gene Dev. 10, 407-420). Los valores exactos para las frecuencias de la mutación fueron obtenidos usando los cultivos independientes múltiples (6-8) por cada cepa en cada experimento y repitiendo cada experimento por lo menos dos veces y tanto como siete veces. Sequencher (Genes Codes Corp) fue utilizado para los análisis de mutación. Inmunotransferencia. Los granulos de la célula una fase de registro de cultivo de 10 mL fueron lavados con 1 mL 20% de ácido tricloroacético (TCA), resuspendido en 50 µL 20 % TCA %, y después lisados por vórtice con un volumen igual de granos de cristal a 4°C. El supernadante fue centrifugado para granular las proteínas. Las proteínas granuladas fueron resuspendidas en 100 µL de amortiguador de carga en gel-SDL, separadas por SDS-PAGE, transferido a una membrana PVDF y probado con los anticuerpos de APOBEC3G (Newman y colaboradores (2005) Curr. Biol. 15, 166-170), LexA (Invitrogen), o Vif (Fouchier y colaboradores (1996) J. Virol. 70, 8263-8269; Simón y colaboradores(1997) J. Virol. 69, 4166-4172; Simón y colaboradores (1997) J Virol. 71, 5259- 5267). Ensayo de la retrotransposición Ty1. Las plasmidas Ty-his3A1, TyHRT-his3A1, Ty-lucAl o TyHRT-/lucAI fueron transformadas con pJG4-5, pJG4-5-APOBEC3G o pJG4-5-APOBEC3F en DG1251 o GRYI 990 (Gietz y colaboradores (1995), Levadura 11, 355-360) y seleccionadas usando SC-URA-TRP + GLC. Los transformantes His3A1 fueron desarrollados en SC-URA- TRP + GLC en saturación. Aproximadamente 106 células estuvieron en subcultivo en 1 ml de SC-URA-TRP + GAL por 12 horas y una alícuota fue puesta en placa plateada de SC-HIS. La viabilidad de la célula fue determinada puesta en la placa de una dilución al medio rico. La retrotransposición fue cuantifícada determinando la frecuencia de las colonias His + . Los transformantes lucA1 fueron desarrollados 1 día en SC-URA-TRP + GLC. Las células fueron transferidas a SC-URA-TRP+GAL y desarrolladas por 2 días adicionales a 30°C para inducir la expresión del retroelemento y la transcripción inversa.
La retrotransposición fue cuantificada midiendo los niveles activos relativos de luciferasa a ß-galactosidasa. Todas las incubaciones para los ensayos Ty1 basados en plasmida estuvieron a 30°C. Para los ensayos de retrotransposición endógena, DGI 141 fue transformado con pjG4-5, pJG4-5-APOBEC3G, o pJG4-5-APOBEC3F. Las colonias solas fueron resuspendidas en agua y 10-50,000 células fueron transferidas en 2 mL SC-TRP + GAL y se desarrollaron a 20°C por 7-10 días hasta que los cultivos alcanzaron la saturación. Las diluciones de los cultivos finales y de inicio fueron puestos en placas en medios ricos para determinar el número de células viables y el equivalente de 1 mL del cultivo saturado fue puesto en placa de SC-HIS para anotar los acontecimientos de la retrotransposición. Secuencia de ADN Ty1. Ty1 retrotranspuesto y ADNcs
TyHRT fueron aislados desarrollando colonias His+ durante la noche en 10 ml SC-HIS a 30°C y preparando el ADN con un método de extracción perlas de vidrio/fenol estándar. El resultado del ADN fue utilizado para amplificar una región 1,026 (Ty) o 971 (TyHRT)bp atravesaba el gen RT y HIS3 usando 5'-TTC
ATG TGG GAC ACT AGA GAT (TyRT, ID SEC NO:1) ó 5'- CCT GAG TGG GAG TTG TTA (TyHRT, ID SEC NO:2) y 5'-TAT GAT ACÁ TGC TCT GGC CAÁ (HIS3, ID SEC NO:3). Los productos PCR fueron purificados (Qiagen) y secuenciados con 5'-GT CTG CGA GGC AAG AAT GAT (ID SEC NO:4). Los acontecimientos di retrotransposición negativa de GFP fueron obtenidos de grupos de colonias de ADN genóico His+ por la transformación en E. coli. Las colonias negativas de GFP fueron identificadas usando luz fluorescente y el ADN de plásmido residente fue amplificado (como arriba con excepción de el producto fue 2,1 KB por TyRT) y secuenciado usando 5'-C GTT ATC CGG ATC ATA TGA (ID SEC NO:5) y 5'-G TAG TTC CCG TCA TCT TGA (ID SEC NO:6). EJEMPLO 2 APOBEC3G Estimula la Mutación en el Saccharomyces cerevisiae vía la Ruta de la Escisión de Uracilo Para probar si el APOBEC3G humano podría provocar su actividad de mutación en levadura, una proteína de la fusión de LexA-APOBEC3G fue expresada en la cepa haploid L40 y la acumulación de mutaciones que confirieron resistencia al aminoácido de canavanina tóxico fue supervisada. Cultivos líquidos fueron desarrollados en colonias individuales que expresan APOBEC3G o un control de vector y después colocados en placas en un medio sólido que contiene canavanina. Los números de colonias resistentes a la canavanina (CanR) fueron determinados después de 3-4 días de crecimiento. En contraste con las células que expresan . un vector de control, las que expresan LexAAPOBEC3G mostraron un aumento multiplicado por 20 en la frecuencia media de mutación de CanR, sugiriendo que APOBEC3G fué capaz de desaminar citosinas dentro del ADN genómico de la levadura (figura 1A; figura 2). Para comenzar a determinar si el fenotipo de mutación inducida de LexA-APOBEC3G ocurrió por un mecanismo de deaminación C -> U, se cuestionó si una deficiencia de glicosilasa de uracilo de ADN exacerbaría este fenotipo. Puesto que la mayoría de los organismos basados en ADN utilizan glicosilasa de uracilo de ADN para eliminar sus genomas de uracilo (Barnes y Lindahl (2004) Annu. Rev. Genet. 38, 445-476), era probable que si éste fuera el mecanismo, entonces muchas de las lesiones de APOBEC3G inducidas con uracilo serían reparadas y que la frecuencia de mutación observada sería una subestimación de la actividad de APOBEC3G. De hecho, la levadura que expresa APOBEC3G y una proteína inhibidora de la glicosilasa de uracilo de ADN (Ugi) mostró un aumento multiplicado por 320 en la frecuencia media de mutación para CanR (figura 1B). Este estímulo era aproximadamente multiplicado por 6 y multiplicado por 26 más arriba que lo observado en la expresión LexA-APOBEC3G y en la expresión Ugi de las células de levadura, respectivamente, indicando que muchos de los APOBEC3G dependientes de uracilo fueron reparados por un mecanismo de escisión de uracilo. En la levadura, la principal glicosilasa de uracilo de ADN es Unglp (proteína N-glicosilasa de uracilo de ADN 1). Unglp y la mayoría de las otras proteínas Ung desde bacterias a humanas son inhibidas fuertemente por Ugi (Mol y colaboradores, (1995) Cell 82, 701-708). Sin embargo, las actividades de escisión de las Ugi resistentes al uracilo ocurren en las células de mamíferos, tales como las provocadas por las proteínas SMUG1 y TDG1 (Barnes y Lindahl (2004) supra). Para eliminar la posibilidad que algunos de los uracilos de APOBEC3G inducidos pudieran repararse por sistemas auxiliares en la levadura, la recombinación homologa fue utilizada para construir una cepa de deleción de Unglp, L40 ungí ::kanMX4. Esta cepa mostró niveles de mutación de CanR virtualmente indistinguibles de las células de expresión Ugi en la presencia o ausencia de APOBEC3G (figura 3). Así, la mayoría de las lesiones de APOBEC3G inducidas en levadura fueron reparadas por un mecanismo Unglp dependiente. Junto con la especificidad exquisita que Unglp tiene para el uracilo, estos datos indicaron que el fenotipo de mutación de APOBEC3G dependiente era atribuible a un mecanismo del desaminación de citosina en el ADN. APOBEC3G se localiza predominante en el citoplasma de células de mamíferos. Por lo tanto, fue sorprendente que su expresión en levadura causara altas frecuencias de mutación. Para asegurarse de que las altas frecuencias de mutación no fueran atribuibles a las propiedades de unión de ADN de la etiqueta LexA, la frecuencia de mutación de CAN1 fue monitoreada de células que expresaban ya sea LexA-APOBEC3G o APOBEC3G sin etiqueta. Poca diferencia en las frecuencias de mutación medías totales de CanR fue observada demostrando que el dominio de unión de ADN de LexA no era responsable del fenotipo de mutación de APOBEC3G dependiente (figura 1B). EJEMPLO 3 Disparadores APOBEC3G predominantemente mutaciones de transición C/G->T/A en levadura CAN1 codifica un transportador de arginina con membrana de expansión que debe estar inactivo para que el crecimiento ocurra en la presencia de arginina tóxica análogo de canavanina.
Una amplia variedad de sustitución base, inserción, deleción y mutaciones más complejas puede conferir CanR [por ejemplo,
(Huang y colaboradores, (2003) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 100,11529-11534; Rattray y colaboradores (2002) Genetics 162, 1063-1077]. Para investigar más el mecanismo del fenotipo de mutación de APOBEC3G inducido, el gene CAN1 de una gran cantidad de colonias de CanR fue secuenciado. De conformidad con estudios anteriores, las células que contenían un control de vectorexhibieron un amplio intervalo de mutaciones de CAN1 incluyendo transiciones (26 %), transversiones (43 %), inserciones (3 %) y deleciones (28 %) (figura 4A-4B). En contraste, la extensa mayoría (90 %) de las mutaciones de CAN1 en APOBEC3G que expresaban las células eran de transiciones C/G->T/A. Las transiciones de APOBEC3G inducido ocurrieron a expensas de otros tipos de mutaciones, contabilizando para la elevada frecuencia de mutación de CanR (figura 4A-4B). La levadura que carece de Unglp debido a la expresión Ugi también exhibió un nivel creciente de mutaciones de transición C/G-T/A (64 %), como se esperaría de las células que carecen de reparación de la escisión de uracilo (figura 4C-4D). Sin embargo, 5/7 de estas transiciones ocurrieron en posiciones que no fueron mutadas en las células que expresan APOBEC3G. La coexpresión de Ugi y APOBEC3G dio lugar a un sesgo de transición C/G ->T/A incluso más fuerte (95%), y 19/21 de estas mutaciones ocurrieron en los sitios que fueron también mutados en las células de levadura que expresan APOBEC3G (Ugi negativo) (figura 4C-4D). Estos datos además demostraron que APOBEC3G es capaz de disparar la hipermutación genómica en la levadura por un mecanismo de desaminación C->U. Ejemplo 4 La Preferencia de la Mutación de APOBEC3G Local en
Levadura es casi Idéntica a la Observada en los Sustratos Retrovirales Modelo. Un análisis más detallado de las transiciones C/G->T/A disparadas por la expresión APOBEC3G revelaron que 37/37 ocurrieron dentro del dinucleótido 5'-CC, que podría encontrarse en cualquier cadena de ADN doble (figuras 4 y 5). La expresión APOBEC3G por si sola disparó las mutaciones de transición C/G- >T/A en 14 sitios distintos dentro del gene CAN1. la Coexpresión APOBEC3G y Ugi causaron mutaciones de transición C/G->T/A en 6 sitios idénticos y 2 adicionales. Los tres sitios más frecuentemente mutados con APOBEC3G del dinucleótido 5'-CC, C356, C656, y C1195, contabilizaron para el 48 % del total de las mutaciones APOBEC3G- y las mutaciones por sustitución base de APOBEC3G-plus-Ugi-dependiente combinadas. La preferencia de secuencia extendida de APOBEC3G en el sistema de la levadura fue comparado al definido previamente en sistemas retrovirales VIH y MLV modelo, como 5'-YCCA [Y = C o T]. Interesantemente,
APOBEC3G exhibió una preferencia 5'-CCCA llamativamente similar en la levadura (figura 5), indicando que su preferencia como se ha observado en otros sistemas estaba intacta. Es además notable adicionalmente de una gran cantidad de mutaciones de transición C/G->T/A, cuatro deleciones y una sola inserción fueron detectadas en el gene CAN1 de las células de la levadura que expresan APOBEC3G (figura 4; datos combinados incluyendo los experimentos Ugi). Tres de zinco de estas alteraciones ocurrieron ya sea en o inmediatamente adyacentes a una zona de concentración de APOBEC3G preferida o potencial, 5'-CCC_. En contraste, solamente 1/12 de las deleciones y las inserciones encontradas en las células que contenían control de vectorocurrieron en sitios similares. El resto (11/12) fueron distribuidas a través del gene de CAN1 y fueron causadas probablemente por una variedad de mecanismos. La presencia de deleciones y de inserciones asociadas a las zonas de concentración de APOBEC3G sugirió que los eventos de deaminación C->U pueden precipitar inestabilidad genómica total. Esto es adicionalmente apoyado por nuestra observación que una pequeña (aproximadamente 5 %) proporción de mutantes de CanR no pudo generar un el producto PCR de gene específico CAN1, potencialmente representando lesiones a gran escala.
EJEMPLO 5 Efecto del VIH-1 Vif en la Hipermutación de Levadura con APOBE3G Inducido En primates tales como humanos y chimpancés, el Vif contrarresta la actividad anti-retroviral de APOBEC3G focalizándolo en la degradación proteasomal. El Vif logra esto uniéndose al APOBEC3G. Algunos datos sugieren que esta asociación por si sola pueda deteriorar directamente la función de APOBEC3G (Stopak y colaboradores. (2003) Mol. Cell. 12, 591-601). Por lo tanto, fue determinada si la interacción entre Vif y APOBEC3G podría detectarse usando este sistema de ensayo de la levadura. VIH-1 Vif, derivado del YU2 o del provirus IIIB, fue expresado junto a APOBEC3G usando cebo dos-híbrido de levadura o vectores presa. Todas las combinaciones en parejas posibles fueron probadas para la capacidad de conducir los genes marcadores dos-híbrido de la levadura lacZ o HIS3. Ninguna actividad ß-galactosidasa significativa o prototrofia de histidina fue observada a pesar de repetidos intentos (datos no mostrados). Este resultado no fue atribuible a una falta de la expresión puesto que ambas proteínas podrían detectarse en lisados de célula por immunotransferencia. Sin embargo, debido a que algunas interacciones débiles o transitorias pueden escapar la detección por el análisis del dos-híbrido de la levadura, fue razonado que el análisis sensitivo de la mutación CAN1 pudo proporcionar un método más robusto para monitorear esta interacción. Para examinar si el VIH-1 Vif podría afectar la hipermutación mediada de APOBEC3G en levadura, las frecuencias de mutación de CanR de las células que co-expresan Vif y APOBEC3G fueron comparadas con las de las células que expresan cualquier proteína por si sola. La robusta hipermutabilidad de APOBEC3G no fue afectada significativamente por la co-expresión HIV-1 Vif. Por lo tanto, una interacción Vif-APOBEC3G en la levadura no fue detectada.
EJEMPLO 6 APOBEC3F y APOBEC3G Inhiben la Retrotransposición de Ty1
Para explorar la posibilidad de que las proteínas APOBEC3 funcionan para impedir la movilidad de los retroelementos endógenos que replican usando secuencias LTR, la capacidad del retrotransposón Ty1 de la levadura de replicar fue analizada en presencia de APOBEC3G o de su APOBEC3F homólogo. La actividad Ty1 fue monitoreada usando un gene indicador de retrotransposición de ¡ntron-alterado (figura 6A). La expresión Ty1 ARN, la separación, la transcripción inversa y la integración rinden copias funcionales del gene marcador DCNcA, codificando ya sea la prototrofia de histidina o la actividad luciferasa. La capacidad de Ty1-his3AI de retrotransponer fue supervisada en la presencia de APOBEC3F o -3G humano (figura 6B). En la comparación a las células que contenían un vector de control, un promedio de 51 % o 70 % de menos colonias His+ fue detectado en la presencia de APOBEC3F o -3G, respectivamente.
Fueron observadas declinaciones de APOBEC3 dependiente levemente más grandes en la retrotransposición de Ty1-lucAI, mientras se monitoreaba por los niveles relativos de luciferasa presentes en los cultivos líquidos (figura 6C). Sin embargo, una inhibición casi total (94-98 %) fue observada cuando la retrotransposición de un elemento Ty1-his3AI genómico fue analizada en la presencia de APOBEC3F o -3G, sugiriendo que la relación de la proteína APOBEC3 a retrotransposición intermedia (y/o factores de anfitrión de Ty) es un clave determinante de este mecanismo inhibitorio (figura 7). Juntos, estos datos demostraron claramente que APOBEC3F o -3G pueden inhibir la retrotransposiciónn de Ty1. Para evaluar si la inhibición de APOBEC3 -dependiente de la retrotransposición en levadura podría influenciarse por la transcriptasa inversa o el recorrido de integración, análisis similares fueron realizados con constructos de Ty1 en los cuales la transcriptasa inversa normal fue substituida por la de VIH-1 [TyHRT]. La integración de TyHRT ocurre predominante por la recombinación homologa, mientras que la integración de Ty1 mayormente utiliza su propia integrasa. La retrotransposición de ambos TyHRT-hisAI y TyHRT-lucAl (es decir, la acumulación de los productos de transcriptasa inversa de VIH-1) también fue inhibida por la expresión de APOBEC3F o de APOBEC3G (figura 6D, E). Los niveles de inhibición fueron casi similares a los observados con la transcriptasa inversa de Ty1, indicando que ni la transcriptasa inversa ni el recorrido de integración eran ejecutadores clave del bloque de retrotransposición de APOBEC3 impuesto. Estos datos además resaltan la utilidad del sistema de levadura Ty1 para estudiar aspectos de la biología de ambas APOBEC3 y VIH-1.
EJEMPLO 7 La Restricción de Ty1 por APOBEC3F y APOBEC3G Involucra un Mecanismo de desaminación de Citosina DCNcA Como la desaminación DCNcA C->U es una característica distintiva de la actividad anti-retroviral de APOBEC3F y -3G, se cuestionó si esto podría contabilizar para el bloque de retrotransposición de Ty1 observado. Si es así, se esperaba que un número excesivo de retrotransposón menos la cadena C->T las mutaciones de transición serían encontradas entre los integrantes de His+ (equivalentes de las transiciones G->A plus). Más de 26 y 47 kbp fue secuenciada en molde TyRT-HIS3 generada en la presencia de APOBEC3F y -3G, respectivamente, y solamente dos transiciones C->T fueron encontradas entre los moldes de APOBEC3G expuesto. Uno ocurrió dentro de un consenso dinucleótido 5'-GC_ que es preferido raramente por esta proteína, y él por lo tanto probablemente representa una transcripción inversa o error PCR. El segundo ocurrió dentro del trinucleótido 5'-CCC_, que es el sitio más común de APOBEC3G preferido. Sin embargo, este escaso número de sustituciones base pudo haber sido en parte debido al hecho de que los integrantes funcionales de His+ (y no His") fueron analizados. Es además posible que los residuos de uracilo dentro del retrotransposón DCNcA dispararon su degradación, como lo hipotesizado originalmente para los retroviruses (Harris y colaboradores (2003) Cell 113, 803-809). Por lo tanto, para tratar la posibilidad anterior y para enriquecerla para mutaciones, una versión modificada del sistema Ty-his3AI fue utilizada en la cual un cásete GFP fue colocado corriente arriba de his3AI (figura 8A). Esto permitió la selección de integrantes de His+ y de un filtrado subsecuente para las variantes GFP negativo no seleccionadas. Veinte mutantes GFP independientes fueron recuperados de los experimentos de retrotransposición en los cuales APOBEC3G fue expresado. Cada secuencia contuvo por lo menos una mutación y tantas como 15 mutaciones. En total, 57 mutaciones por substitución base fueron identificadas y 47 de éstas eran transiciones de negativa (figura
8B, figura 9A). Casi todas las transiciones de APOBEC3G dependiente ocurrieron dentro del consenso 5'-YCC_, idéntico al sitio de consenso de desaminación de citosina preferido en el gene CAN1 y en una variedad de otros sistemas (por ejemplo, comparar la figura 9B y la figura 5). Además, muchas de las transiciones C->T ocurrieron en las posiciones que eran idénticas a las observadas previamente en GFP que codifica VIH o MLV. Un sesgo de transición de cadena específica similar y secuencias con transiciones múltiples fueron encontradas en los moldes de GFP negativo producidas en la presencia de APOBEC3F (figura
9C; figura 8B). Sin embargo, en contraste con APOBEC3G, las mutaciones de APOBEC3F dependiente ocurrieron dentro de un consenso 5'-TTC_ distinto [figura 9D; observadas previamente con un sustrato de VIH]. Así, la retrotransposición Ty1 puede ser inhibida por APOBEC3F y -3G y mucho (y posiblemente todo) de este efecto puede atribuirse a un mecanismo de desaminación de citosina DCNcA. EJEMPLO 8 La expresión de APOBEC3G humano en células de cerdo reduce la transferencia del retrovirus endógeno porcino (PERV) a las células humanas 293T. Un constructo para la expresión de APOBEC3G humano fue producido usando el promotor de citomegalovirus (CMV) para conducir la expresión y el gene de neomicina como marcador seleccíonable. Para evaluar si la proteína de APOBEC3G puede inhibir la transmisión de PERV a las células humanas, el constructo fue introducido establemente en las células PK-15 de riñon de cerdo (ATCC # CCL-33) usando el reactivo Fugene® 6 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) y las células fueron seleccionadas para la resistencia a neomicina. Las células PK-15 fueron elegidas para estos experimentos porque los PERVs que residen en estas células podían infectar las células 293T humanas en experimentos de mezclado de sobrenadante simples (Patience y colaboradores, (1997) Nat Med 3, 282-286). (notar que el PERVs puede transmitirse como partículas sin células solución-solubles y/o a través de contacto célula-célula). La expresión APOBEC3G en células de PK-15 fue confirmada usando anticuerpos específicos (Newman y colaboradores 2004) Curr Biol. 15(2): 166-70). Las células PK-15 que expresan un control de vector, APOBEC3G humano (hA3G), o APOBEC3F (SsA3F) de cerdo fueron co-cultivadas con células 293T humanas por 25 días (aproximadamente 50 generaciones de células); los dos tipos de células fueron separados físicamente por una membrana fina con poros de 1 micrón de tamaño, que permitieron la difusión libre de moléculas pequeñas incluyendo partículas virales pero no permitió la difusión de células. Después de 25 días, los extractos de proteína de la célula enteros fueron preparados de las células 293 T usando procedimientos estándares. Lisados de células (10 µg) fueron probados para la actividad de transcriptasa inversa de
PERV (RT) (como una medida de la transferencia de PERV a las células humanas) usando el análisis de ELISA de actividad del retrovirus RT™ del tipo C; realizado según lo recomendado por el fabricante, Cavidi Tech, Uppsala, Sweden. Poca actividad fue detectada en las células 293T crecidas en la presencia de las células PK-15 que expresan APOBEC3G humano, en contraste con los controles donde los niveles significativos de infección fueron detectados (figura 10). Los resultados en la figura 10 se muestran como inhibición relativa de veces de la actividad RT normalizada a la actividad RT en las células 293T cultivadas con las células PK-15 que expresan un vector vacío. Este experimento indica que la expresión de A3G humano (pero no la expresión APOBEC3F de cerdo adicional) en células PK-15 inhibe la transferencia de PERV de las células PK-15 a las células 293T. Los análisis PCR, en tiempo real, semi-cuantitativos y cuantitativos fueron realizados para monitorear la presencia de ADN PERV integrado en células 293T humanas. PCR semi-cuantitativo fue realizado usando 75 ng de molde de ADN genómico de células 293T humanas y cebadores (hacia adelante 5'-AA CCC TTT ACC CTT TAT GTG GAT-3J ID SEC NO:2; inversa
'-AA AGT CAÁ TTT GTC AGC GTC CTT-3J ID SEC NO:3) hecha al gene pol PERV (tamaño del producto: 196 bp). Como se indica en la figura 11 A, muy poco ADN PERV fue detectado en las células 293T crecidas en la presencia de células PK-15 que expresan APOBEC3G humano, en contraste con otras muestras donde niveles significativos fueron detectados. Para asegurarse de que el compartimiento co-cultivo de la célula humana no fuera contaminado por las células de cerdo (es decir, micro-quimerismo), PCR también fue realizado usando los cebadores específicos para ADN de cerdo (hacia adelante 5'-GG AAC CTG
CAÁ CCT ATG GAA-3J ID SEC NO:4; inversa 5'-GG TGT GGC CCT AAA AAG ACA-3J ID SEC NO:5) (producto de 351 bp). El panel izquierdo de la figura 11B muestra que no se detectaron productos PCR de cerdo en las muestras 293T del experimento de co-cultivo. El panel derecho contiene controles positivos y negativos. Micro-quimerismo no fue detectado. Análisis de PCR cuantitativos, en tiempo real, fueron realizados en reacciones de 25 µL que contienen 10 ng del ADN genómico 293T, cebadores de 100 nM, y de la súper mezcla 2x iQ SYBR Green (BioRad, Hercules, CA) y corridos en un iCycler iQ Multicolor real-Time PCR Detection System (BioRad, Hercules, CA). Las condiciones del termociclador fueron 95°C por 5 minutos seguidos por 50 ciclos de 95°C para 15 segundos y 60°C por 30 segundos. Un análisis de la curva de fusión siguió directamente el ciclo para verificar la amplificación del producto de PCR del gene pol de PERV (amplificado según lo discutido arriba). El gene de beta-actinia humano (gene de mantenimiento) fue amplificado como control interno usando los cebadores siguientes: Hacia adelante, 5'-AT CAT GTT TGA GAC CTT CAA-3'
(ID SEC NO:6) e inversa, 5'-A GAT GGG CAC AGT GTG GGT-3' (ID SEC NO:7) (tamaño del producto: ca. 100 bp). Todos los datos fueron normalizados y las copias del gene de PERV se presentan por 100.000 copias de beta-actinia (figura 12). La transferencia de PERV fue evidente después de 20 días de co-cultivo continuo en las células de control de vector, mientras que poca transferencia ocurrió en la presencia de APOBEC3G humano. Así, la expresión APOBEC3G humano en células PK-15 de cerdo inhibió la transferencia de PERV de las células PK-15 de cerdo a las células 293T humanas. EJEMPLO 9 Proteínas APOBEC3F de Doble Dominio de Deaminasa de Artiodáctilo Búsquedas de NCBI BLAST fueron realizadas usando los dominios de deamínasa A3 de humano y ratón como polipéptidos de consulta. Varios ESTs de artiodáctilos (ungulados de pezuña hendida) fueron identificados, que sugirieron la presencia de por lo menos de una proteína A3 en ganado (Bos taurus . (Bt), GenBank Accession No. BE684372, Smith y colaboradores, Gen. Res. 11(4): 626-630, 2001) y cerdos (Sus scrofa (Ss), GenBank Accession No. BI346898, Fahrenkrug y colaboradores, 2002, Mamm Genome, 13, 475-478). Clones de DCNcA correspondientes fue obtenido, secuenciados y mostrados para codificar las proteínas A3 con dos dominios de citosina diaminasa que unen zinc supuestos. La secuencia de doble dominio A3 DCNcA de las ovejas ortólogas (Ovis aries, Oa) fue obtenida usando una combinación de PCR degradado y RACE de cebar 3' anidado. Los tres de estas proteínas A3 fueron similares de tamaño a la proteína HsA3F del aminoácido 373, excepto la proteína A3 de cerdo, la cual era levemente más larga debido a una C-terminal única, extensión rica en serina. Las proteínas A3 de la vaca, ovejas y del cerdo son referidas en la presente como BtA3F (ID SEC NO:8), OaA3F (ID SEC NO:9) y SsA3F (ID SEC NO:10), respectivamente. Una alineación de las secuencias del aminoácido de BtA3F, OaA3F, y SsA3F se muestra en el figura 13. Las alineaciones del aminoácido de los dominios de deaminasa activa (más zinco residuos en cada lado) fueron hechas usando el software de Clustal W (Higgins y colaboradores. 1994, Methods Mol Biol. 25:307-18). Los sitios activos A3 de la vaca y de las ovejas fueron idénticos al 78 %. Ambas proteínas de la vaca y de las ovejas compartieron un nivel más bajo de identidad con la proteína del cerdo (56 %). Los sitios activos de estas proteínas A3 de artiodáctilos fueron 56-62 % idénticos a HsA3F (figura 14). Para probar si las proteínas A3F de artiodáctilo tienen la capacidad para diaminar citosinas dentro de una sola cadena de ADN, la actividad intrínseca de la mutación de estas proteínas fue monítoreada usando un ensayo de mutación basado en E. coli. La resistencia de Rifampicina (RifR) es atribuible a las mutaciones de sustitución base en el gen (rpoB) de polimerasa B ARN de E. coli, y esto ocurre en aproximadamente uno de cada zinco millones de células bacterianas. Este ensayo por lo tanto proporciona una medida robusta de la actividad intrínseca de la citosina diaminasa de ADN. Ver, por ejemplo, Haché y colaboradores (2005) J Biol Chem, 280, 10920-10924 J; Harris y colaboradores (2002) Molecular Cell, 10, 1247- 1253. La expresión de cada una de las proteínas A3 de artiodáctilo aumentó la frecuencia de mutación de RifR en E. coli de 3 a siete veces, los niveles que fueron más altos que los atribuibles a
HsA3F pero levemente más bajos que los causados por HsA3G. La expresión BtA3F y SsA3F disparada como un HsAID aumento en la frecuencia de la mutación de RifR. Las preferencias de deaminación de citosina ADN ARF de artiodáctilo fueron examinadas secuenciando el gen rpoB de por lo menos 100 mutantes independientes de RifR. En contraste a HsA3F y HsA3G, los cuales preferencialmente deaminaron citosinas en las posiciones del nucleótido rpoB 1721 y 1691, 5'-TC y 5'-CC, respectivamente, las proteínas A3F de artiodáctilo mostraron menos sesgada la mutación espectro rpoB. OaA3F deaminó a la citosina 1576 preferencialmente, que es parte de un dinucleótido 5'-GC. SsA3F, también prefirió la citosina 1576. Sin embargo, SsA3F también deaminó a la citosina 1586 claramente, que es parte de un dinucleótido 5'-AC. La conclusión principal de los ensayos de la mutación de RifR fue, que las tres proteínas
A3F de los artiodáctilos fueron capaces de deaminar las citosinas de ADN y disparar una cambio en el patrón correspondiente de las mutaciones de la transición CIG-> T/A de T/A dentro del sustrato de la mutación de rpoB. Ya que las preferencias de la desaminación intrínseca de la citosina de ADN de HsA3F y de
HsA3G son aparentes en retrovirus como VIH-1, estos datos sugieren que los sustratos dinucleótidos fisiológicos de OaA3F y SsA3F serán 5' -GC, y 5'-RC, respectivamente (R = A o G). Como una etapa inicial hacia el entendimiento de los objetivos del retroelemento potencial de las proteínas A3F de artiodáctilo, la distribución subcelular de estas proteínas fue determinada por la microscopia de fluorescencia viva de la célula. Aproximadamente 7,500 células HeLa fueron sembradas en una cámara cubreobjetos (Nunc) de LabTek. Después de 24 horas de incubación, las células fueron transfectadas con 200 ng de los constructos de ADN basados en pEGFP-A3. Después de 24 horas adicionales de la incubación, las imágenes de las células vivas fueron recogidas usando un microscopio de Zeiss Axiovert 200 en ampliación total en 40Ox. En contraste con HsA3B y un control eGFP, que están localizados en el núcleo y la célula completa, respectivamente, las proteínas A3F y MmA3 de artiodáctilo (ratón) fueron citoplásmicas predominantemente, con los cuerpos con puntos aparentes en algunas células. Este patrón de localización es idéntico al considerado por HsA3F y HsA3G, indicando que las proteínas A3F de artiodáctilo pudieron funcionar similarmente para inhibir la réplica de los retroviruses dependientes de LTR tales como VIH o MLV. EJEMPLO 10 Restricción del retrovirus por las proteínas A3F de aritodactilo Fue probado si las proteínas A3F de artiodáctilo podrían inhibir la contagiosidad de los retroviruses basados en MLV y VIH. En estos sistemas, un gen de GFP empalmado en el ADN proviral proporciona una medida de eficacia de transfección (que se correlaciona directamente con los niveles de producción del virus) y de contagiosidad viral. Las células 293T fueron desarrolladas en el medio Eagle modificado de Dulbecco (Invitrogen) que contiene 10 % de suero bovino fetal (Gemini Bioproducts), penicilina, y estreptomicina (Invitrogen). HIV-GFP [ también llamado CS-CG] fue producido por FuGENE® 6 (Roche Applied Sciences) mediante transfección de 50-70 % de células 293T confluentes con una mezcla de plasmida que contiene 0.22 µg de CS-CG, 0.14 µg de pRK5/Packl (Gag-Pol), 0.07 µg de pRK5/Rev, 0.07 µg de pMDG (VSV-G Env), y 0.5 µg de una expresión APOBEC o de una plasmida de control del vector vacío según descrito previamente (Liddament y colaboradores (2004) CurrBiol 14:1385-1391). Después de un período de incubación de 48 horas, los supernadantes que contienen virus fueron clarificados por la centrifugación a baja velocidad, filtrada (0.45 µm), y cuantificado usando una actividad transcriptas inversa basada en ELISA (Cavidi Tech). Los supernadantes normalizados de transcriptasa inversa fueron aplicados a las células frescas 293T, y la infección fue dejada para proceder por 96 horas. La contagiosidad (fluorescencia GFP) fue después medida por el flujo de citometría (FACSCalibur, BD Biosciences).
Para los experimentos que requieren la recuperación de ADN retroviral para análisis de hipermutación, los supernadantes virales fueron tratados con 50 unidades/ml ADNse (Sigma) antes de la infección de la célula 293T. La expresión de HsA3F y de HsA3G causó las reducciones
4- y 24-veces en la contagiosidad de HIV-GFP. MmA3 también fue capaz de inhibir fuertemente HIV-GFP. En comparación, la expresión de BtA3F5 OaA3F o SsA3F causó la disminución de 30-, 8- y 29-veces de contagiosidad de HIV-GFP, respectivamente (Figura 15A). Estas actividades potentes de anti-VIH demostraron que las proteínas A3F de artiodáctilo tienen por lo menos una actividad de restricción de retrovirus. Estos resultados además implican que las proteínas A3F de artiodáctilo son capaces de asociarse específicamente con el complejo ARN genómico/VIH gag y de tal modo ganar acceso al montaje de las partículas del virus. La contagiosidad de HIV-GFP también fue monitoreada en presencia o ausencia del VIH1 Vif y humano, proteínas A3 de ratón o artiodáctilo. La expresión de VIH-1 Vif neutralizó HsA3G y HsA3F (aunque el último en un grado posterior a inferior) y causó una recuperación proporcional de la contagiosidad de HIV-GFP. La expresión de VIH-1 Vif hizo poco para mejorar la contagiosidad de HIV-GFP producido en la presencia de MmA3 o cualquiera de las proteínas A3F de artiodáctilo. Así, las proteínas A3F de artiodáctilo fueron completamente resistentes a
VIH-1 Vif. La expresión de MmA3 tiene poco efecto en la contagiosidad de MLV, probablemente debido a que MLV excluye (o evita simplemente) esta proteína A3 (Figura 15B). En contraste, HsA3F y HsA3G inhiben la contagiosidad de los retroviruses basados en
MLV, pero en un grado inferior que los virus basados en HIV (Figura 15B). Por lo tanto, para iniciar la tarea si las proteínas A3F de artíodáctilo poseen un potencial de restricción de retrovirus tipo MmA3. Angosto, o tipo HsA3G o HsA3F, angosto, la contagiosidad de MLV-GFP producida en la presencia de estas proteínas A3 fue monitoreada. Interesantemente, como las proteínas HsA3F y HsA3G, expresión de las proteínas A3F de artiodáctilo redujo la contagiosidad de MLV-GFP por 2- a 4- veces (Figura 15B). Así, los datos de contagiosidad combinados de HTV-GFP y MLV-GFP sugieren que las proteínas A3F de artiodáctilo tienen un potencial de restricción de retrovirus relativamente amplio. EJEMPLO 11 Dominio deaminasa, de unión de zinc N-terminal de la proteínas A3F de artiodáctilo que catalizan la desaminación C->U Para trabajar el mecanismo de la restricción de retrovirus por las proteínas A3F de artiodáctilo y probar si el dominio de unión de zinc N- o terminal-C (o ambos) de estas proteínas que catalizan la desaminación de citosina de ADN, el glutamato conservado (E) de cada sitio activo fue cambiado a glutamina (Q) usando mutagénesis dirigida al sitio y los mutantes resultantes fueron probados por la actividad de restricción de HTV-GFP. Según lo descrito previamente, el glutamato del dominio de unión de zinc N- y la terminal-C de HsA3G contribuye a inhibir la contagiosidad de VIH, pero el glutamato catalítico de terminal-C parece más importante. El dominio de unión de zinc BtA3F terminal-C y N- dominan a los mutantes E?Q que aparecen para conservar niveles completos de la actividad anti-VIH. En contraste la terminal-N OaA3F y la unión de zinc SsA3F dominan a los mutantes E-?Q que fueron menos capaces que los mutantes de dominio terminal-C para inhibir la contagiosidad de HTV-GFP. Este resultado fue particularmente claro para SsA3F. Estos datos fueron esencialmente al contrario de los estudios mutantes de HsA3F y Hs A3G E?Q, y por lo tanto sugirieron que el dominio de unión de zinc, terminal-N de estas proteínas cataliza la desaminación C?U de ADNc retroviral. MmA3 era claramente distinto, ya que los glutamatos de dominio de unión de zinc terminal-C y N- fueron requeridos para la restricción de HTV-GFP.
Aunque los mutantes E?Q de dominio terminal-C y N de humanos y las proteínas A3 de artiodáctilo aún mostró los niveles significativos de la actividad anti-retroviral, fue resumido que los mutantes de sitio catalítico bonafide deberán ser capaces de catalizar la desaminación C?U de ADNc retroviral [aunque pueden podrán aún inhibir la contagiosidad retroviral]. Bajo el molde de la cadena de uracilos la incorporación de más cadenas de adeninas, que se manifiestan en última instancia como hipermutaciones G?A de más cadenas retrovirales. Por lo tanto, para probar directamente donde el dominio (s) de unión de zinc cataliza la desaminación de citosina de ADN y ganar entendimiento en el mecanismo de restricción del retrovirus A3F de artiodáctilo, el gen GFP de los experimentos de contagiosidad de HTV-GFP ya mencionados fue amplificado por la alta fidelidad de PCR, clonado y sometido a los análisis de secuencia de ADN. HTV-GFP producido en la presencia de un vector de control mostró una frecuencia de mutación de baja sustitución base, 0.00014 mutaciones por base, que es atríbuible a los errores en la transcripción inversa y PCR. En contraste, los virus producidos en la presencia de HsA3F, HsA3G, todos las tres proteínas A3F de artiodáctilo o de MmA3 mostraron entre 30- y 80-veces más mutaciones de sustitución base, que fueron casi exclusivamente mutaciones de transición G?A retroviral. HsA3G con una mutación E— >Q de dominio terminal-C no causa la hipermutación retroviral, aunque esta variante todavía inhibió perceptiblemente la contagiosidad de HIV-GFP. El mutante de dominio de unión de zinc C-terminal de HsA3F fue aún capaz de inhibir modestamente la contagiosidad de HIV-GFP, sin muestras obvias de hipermutación retroviral. Las sustituciones E?Q en el dominio terminal-N (pero no terminal-C) de todas las tres proteínas A3F de artiodáctilo suprimieron la acumulación de las hipermutaciones retrovirales. Así, estos datos combinados para demostrar que el dominio deaminasa de unión de zinc terminal-N, de las proteínas A3F de artiodáctilo es catalítico y ambas, actividades dependientes e independientes de deaminasa son requeridas para los niveles completos de la restricción del retrovirus. EJEMPLO 12 Propiedades de la hipermutación retroviral de las proteínas A3F de artiodáctilo Según lo descrito arriba, los espectros de la mutación rpoB de BtA3F, OaA3F y SsA3F sugirieron que estas proteínas dispararían los patrones de hipermutación predispuestos hacia 5'-YC, 5' -GC, y 5'-RC, respectivamente (R=A o G). Para probar esta predicción, los tipos de mutaciones de sustitución base y las preferencias de desaminación de ADNc retroviral atribuibles a la expresión de las proteínas A3F de artiodáctilo fueron examinados. En términos de las preferencias de mutación dinucleótido, la base inmediata 51 de la citosina objetivo es un objetivo crucial del sitio determinante. HsA3F y HsA3G prefirieron predominantemente 5'-CC (84 %) y 5'-TC (84 %), respectivamente, mientras que MmA3 prefirió 5'-TC (61 %) y 5'-CC (29 %). Tipo A3 del ratón, las proteínas A3F de la vaca y oveja parecieron preferir una pirimidina (Y) 5' de la citosina deaminada (93 % y 79 %, respectivamente). Sin embargo, paralelamente a grandes rasgos los datos de la mutación del E. coli rpoB, la proteína A3F del cerdo A3F prefirió 5'-GC (47 %). Esto es notable porque esto constituye el único ejemplo de una proteína A3 que prefiere 5'- C-purina (AID deaminasa del gen de ¡nmunoglobulina también tiene esta preferencia). En adición, todas las proteínas A3 caracterizadas en estos análisis prefirieron una pirimidina en posición -2 (que fue invariablemente un T, a excepción de HsA3G que prefirió C>T). EJEMPLO 13 Cerdos creados para la expresión APOBEC3F y/o de APOBEC3G Los fibroblastos de la piel de de un jabalí de primera de ocho años fueron transfectados con los constructos de la expresión que codifican el APOBEC3F humano, APOBEC3G humano, o ambos, y colocado bajo la selección G418. Las colonias resistentes fueron recogidas y expandidas. Las colonias de la expresión APOBEC3F, APOBEC3G, o ambas fueron identificadas por RT-PCR. Enucleación y Transferencia de Célula Donante. El ova madurado in vivo fue recuperado quirúrgicamente de los animales donadores entre 46 y 50 horas después de la administración de HCG. Inmediatamente antes de la enucleación, el cúmulo se expandió y las células corona fueron retiradas de ambos tipos de ova por la disección rotunda y la medición con una pipeta se repitió del ova en HEPES amortiguado North Carolina State University 23 (NCSU-23, Petters and Wells (1993) J Reprod Fértil Suppl. 48:61-73) medio suplementado con 0.1 % de hialuronidasa. Los grupos de ova fueron transferidos en 5 µl gotas de HEPES de NCSU-23 mortiguado que contiene 10 % de suero fetal de becerro, 2.5 µl de citocalasina B (CB) y 5 µl/ml Hoechst 33343, que fueron arreglados en una columna en la tapa de una placa de Petri de 9 mm x 50 mm. La enucleación fue alcanzada físicamente retirando el cuerpo polar y citoplasma adyacente, que contiene la placa de la metafase II, usando una pipeta de transferencia de célula ES. La transferencia de la célula completa fue lograda usando una pipeta de transferencia de célula ES (Eppendorf, Westbury, New York) con una extremidad aguda, biselada (diámetro interno 10-25 µm que depende en el tipo de célula). Las células donadoras (es decir, de fibroblastos de piel transfectados) fueron sincronizadas en un G0/G1 asumido por el suero de inanición (0.5 %) por 24 h. Las microgotas que contienen oocitos fueron ajustadas con un volumen pequeño de células donadoras que habían sido tripsinizadas no más de 3 h antes de la enucleación. Los pareados fueron fusionados dentro de 2h después de la enucleación. Los grupos de pareados 5-10 fueron alineados manualmente entre los electrodos de un hueco de 1 mm de la cámara de fusión (BTX, San Diego, USA.) recububiertos con el medio de fusión de manitol (0.28 M manitol, 0.2 mM MgSO4 x 7H2O, 0.01% PVA). Los pareados fueron fusionados por la exposición a un solo pulso de 150 V/mm por 60 us. Después de la fusión, los pareados fueron cultivados en HEPES amortiguados NCSU + 10 % de suero fetal de becerro de 0.5 a 1.5 h antes de la activación. Los pareados fueron activados colocándolos en el hueco de 1 mm de la cámara de fusión recubiertos con un medio de mannitol suplementado con 0.1 mM CaCI2X2H2O y exponiéndolos a dos pulsos de 60 microsegundos de 150V/mm. Cultivo in vitro de embriones clonados. Después de los tratamientos de activación, los embriones clonados reconstruidos fueron lavados y cultivados a fondo en 50 µl gotas de NCSU23 suplementado con un aminoácido no esencial de 1 % MEM, aminoácidos de 2 % BME y 0.4 mg/ml BSA por 5 días a 38.5°C en 5 % CO2 en aire sin un cambio de medio. Después de 120 h en cultivo, el suero fetal de becerro (10 %) fue agregado a todos las mícrogotas que contienen embriones reconstruidos. Los índices de desarrollo fueron examinados diariamente por la división in vitro después de la activación y los embriones divididos en 2-4 etapas de la célula fueron seleccionados para la transferencia. Superovulación y transferencia de embrión. Cerdas pubertas cruzadas de 8 a 10 meses fueron sincronizadas con Regumate (que contiene 0.4 % altrenogest; 10 mg/día; Intervet, Boxmeer, Netherlands) mezclado en la alimentación comercial y dado cada mañana por 17-19 días. Las cerdas dondoras fueron inyectadas con 2.000 IU PMSG (Folligon y Chorulon) y 80 h después con 1.000 IU hCG (Folligon y Chorulon). Las cerdas receptoras fueron inyectadas con la mitad de la dosis de PMSG y hCG administradas a los donadores. Los oocitos fueron recogidos quirúrgicamente 46-50 h después de la inyección de hCG con un chorro de agua del oviducto con HEPES amortiguado de NCSU-23. Para producir cerdos clonados, los embriones reconstruidos fueron quirúrgicamente transferidos en el oviducto de cada madre adoptiva sincronizada por 20-24 h después de la activación. Los embriones de transferencia nuclear (N = 385) fueron transferidos en tres recipientes, 2302, 5570 y 2175 el día 1. Una semana después, un grupo adicional de embriones reconstruidos (N = 360) fue transferido a tres recipientes adicionales, 2306, 5638 y 2211. Un explorador de ultrasonido (Aloka SSD-500, JAPÓN) con un accesorio de pruebaPtransabdominal de 3.5 MHz fue utilizado para comprobar embarazos en 25 y 35 días después de la transferencia del embrión; zinco de 6 recipientes poseyeron por lo menos 1 feto en este tiempo (83 %). Zinco cerdos embarazados fueron obtenidos. Los recipientes de embarazo fueron reexaminados por ultrasonido en aproximadamente 30 días antes de la fecha prevista del parto. El recipiente 2211 no fue estro embarazado y exhibido aproximadamente 1 mes después de la trasplantación, dando un índice total de embarazo de 67 %. Una semana antes de la fecha de parto proyectado, todas las cerdas fueron movidas a los cajones del parto. A las cerdas 2302, 5570 y 2175 les fue dado 2 mL de PGF2a en el día 113, 112 y 111 de gestación y 2 mL de oxitocina 24 horas después. El día 118 después de la transferencia del embrión, un clon macho de 700g fue retirado manualmente del recipiente 5570. En el mismo día, el recipiente 2175 pasó a una momia degenerada. El recipiente restante 2302, que ha exhibido el descenso sustancial de leche seguido por la inyección de oxitocina, fue retirado del cajón y dio una inyección de 15 mL de la Lidocaína en un disco vertebral entre un conjunto de vértebras lumbares inferiores. Después de esperar 20 minutos la anestesia tomo efecto, una alta incisión flanqueada fue hecha y ambas trompas del útero fueron expuestas. Ninguna de las dos trompas contuvo ningún feto o momia. Sin embargo, el endometrio en ambas trompas exhibió hiperplasia cística extensiva, que dio al útero el aspecto de ser grávida. El recipiente 2302 fue después puesto en anestesia general (acepromazina + cetamina) y eutanizado. El recipiente 2175 fue también anestesiado y eutanizado y su útero examinado por la presencia adicional de momias o fetos; que no fueron encontrados. El día 112 de gestación, el recipiente 5638 recibió 2 mL de PGF2a. La oxitocina (2 mL) fue administrada a las 6 AM del día siguiente. A las 7:20 AM, el primero de zinco clones de machos fue retirado manualmente del recipiente. Por las 11:00 AM, un total de 5 clones machos han sido entregados. Así, 6 clones transgénicos recién nacidos fueron generados de un total de 6 recipientes. Todos los clones exhibieron artrogriposis de moderado a severol severo en las patas posteriores, que redujeron grandemente su movilidad. El clon 1 (700g) fue retirado manualmente del recipiente 5570 pero fue incapaz de amamantar de modo que fue fotografiado y eutanizado al día siguiente. Los clones 2 (1000 g) y 3 (700 g) murieron a las pocas horas del nacimiento. El clon 4 (700 g), quién tuvo tenían un caso bastante severo de artrogriposis, murió más tarde en el mismo día. Los clones 2 (1000 g) y 3 (700 g) murieron a las pocas horas del nacimiento. El clon 4 (700 g), quien tuvo un caso bastante severo de artrogriposis, murió más tarde en el mismo día. Los clones 5 (1200 g) y 6 (1200 g) fueron alimentados manualmente cada hora, vía una jeringa y la alimentación del ratón por huso, con Esbilac (fórmula de reemplazo de leche). La salud del clone 6 mejoró visiblemente durante este período de lactancia, mientras que la salud del clon 5 declinó. El clon 5 estuvo extremadamente débil y no trago más Esbilac y fue eutanizado al día siguiente. El clon 6 fue vuelto a su presa y fue viable por 2 semanas, pero tuvo abscesos importantes en las partes superiores de sus patas posteriores y de sus trabaderos delanteros hinchados. Las inyecciones diarias de Tylan 200 y penicilina no resolvieron esta condición así que el cochinillo fue sometido a eutanasia y las células fueron cosechadas. La reprogramación epígenética puede ser deficiente en embriones clonados. Los núcleos pueden ser reprogramados más eficientemente reprogramados pasándolos a través de múltiples ciclos de aislamiento de fibroblasto fetal y de clonación antes de llevar los cochinillos para llamar. Las células Transgénicas producidas pueden utilizarse para generar embriones reconstruidos, que entonces serían implantados e pendientes para desarrollarse por aproximadamente 40 días antes de la terminación del embarazo. Los fibroblastos después serían aislados de estos fetos y cultivados brevemente antes del uso en otro ciclo de transferencia nuclear de la célula somática para generar cochinillos nuevos. Otra alternativa se confiaría en el uso de fibroblastos fetales para iniciar con, es decir, el uso de fibroblastos fetales para generar nuevas células transgénicas que expresan las proteínas de APOBEC, y después generar cerdos por transferencia nuclear de la célula somática según lo descrito arriba. La mayoría de los experimentos de clonación de cerdo acertados han utilizado células derivadas de fibroblastos fetales, en comparación con el jabalí adulto usado en este ejemplo. Otras fuentes de células, incluyendo células madre embrionarias o de adulto también pueden utilizarse.
OTRAS MODALIDADES Mientras que la invención se ha descrito en conjunto con la descripción y ejemplos detallados precedentes, la descripción y ejemplos precedentes están deseados para ilustrar y no limitar el alcance de la invención, que está definido por el alcance de las reivindicaciones anexas. Otros aspectos, ventajas, y modificaciones están dentro del alcance de las reivindicaciones.
Claims (9)
1. Cerdo transgénico, células nucleadas las cuales comprenden un constructo de ácido nucleico, el constructo de ácido nucleico comprende una unidad transcripcional que comprende una región reguladora operablemente ligada a una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de citosina diaminasa no porcina, en donde la expresión del polipéptido de citosina diaminasa no porcina en por lo menos algunas de las células del cerdo resulta, hasta el co-cultivo con las células humanas, en una capacidad disminuida de las células para transmitir los retrovirus endógenos porcinos a las células humanas.
2. Cerdo transgénico de conformidad con la reivindicación 1, en donde la región reguladora es un promotor constitutivo.
3. Cerdo transgénico de conformidad con la reivindicación 1, en donde la región reguladora porcina es un tejido específico o un promotor específico del órgano.
4. Cerdo transgéníco de conformidad con la reivindicación 1, en donde un elemento aislante y una repetición invertida de un transposón flanquean en cada lado de la unidad transcripcional.
5. Cerdo transgénico de conformidad con la reivindicación 1, en donde la citosina deaminasa no porcina es seleccionada del grupo que consiste de, APOBEC1, APOBEC2, APOBEC3A, APOBEC3B, APOBEC3C, APOBEC3D, APOBEC3E, APOBEC3F, APOBEC3G, y APOBEC3H.
6. Cerdo transgénico de conformidad con la reivindicación 1, en donde la citosina deaminasa no porcina es APOBEC3F humano o ABOBEC3G humano.
7. Células derivadas del cerdo transgénico de conformidad con la reivindicación 1.
8. Tejido aislado del cerdo transgénico de conformidad con la reivindicación 1.
9. Progenie del cerdo transgéníco de conformidad con la reivindicación 1.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US60/694,054 | 2005-06-24 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
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MX2008000199A true MX2008000199A (es) | 2008-09-02 |
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