MX2007014976A - Anticuerpos monoclonales y policlonales de albumina equina y hemoglobina y aparatos y metodo empleando los anticuerpos enla identificacion y localizacion de ulceras y otros sangrados en el tracto digestivo en equinos. - Google Patents

Abstract

Un aparato de prueba y diagnóstico así como métodos relacionados para el uso del mismo se divulgan, que a su vez se derivan y emplean anticuerpos de albúmina equina y hemoglobina equina en aparatos de pruebas, kits y métodos para detectar y localizar úlceras gástricas y de colon o sangrado en caballos. Las heces fecales de un caballo que se a va a someter a prueba se colocan en un recipiente junto con una solución estabilizadora y se mezclan, seguido de la colocación de unas gotas el líquido del recipiente en el kit de pruebas. Los marcadores visuales en los kits de prueba significan que la detección de los indicadores de hemoglobina equina o de albúmina equina, que respectivamente indican la presencia de úlcera gástrica y/o de colon o sangrado.

Description

ANTICUERPOS MONOCLONALES Y POLICLONALES PARA ALBÚMINA Y HEMOGLOBINA EQUINA Y APARATO Y MÉTODOS QUE EMPLEAN ANTICUERPOS EN LA IDENTIFICACIÓN Y LOCALIZACIÓN DE ÚLCERAS Y OTROS SANGRADOS EN EL TRACTO DIGESTIVO EN EQUINOS.

ANTECEDENTES DEL INVENTO Campo del invento- — el presente invento se relaciona generalmente a aparatos y métodos para el diagnóstico y pruebas, y en particular para anticuerpos de albúmina equina y hemoglobina equina y su uso en aparatos de pruebas, kits y métodos para detectar y localizar úlceras gástricas y de colon en caballos. Antes de discutir las pruebas y el diagnóstico de úlceras en caballos, es benéfico discutir la anatomía única del sistema digestivo de los caballos que contribuye a una alta incidencia de úlceras digestivas en los caballos. En el caso de los humanos y en la mayoría de otros animales, el ácido gástrico es secretado en el estómago en respuesta a la alimentación. En contraste, los caballos se han desarrollado durante miles de años como rumiantes (comer lentamente pero en forma continua durante el día) y sus sistemas digestivos están configurados para este tipo de dieta con una producción continua de jugos gástricos y secreción de bilis a la parte delantera del tubo digestivo desde el hígado. De esta manera, el estómago de un caballo se puede considerar como una bomba de ácido que produce ácido gástrico en forma continua más o menos durante el día sin importar si el caballo está siendo alimentado.

Como consecuencia de su anatomía y de las prácticas modernas de alimentación y cuidados, todos los caballos y en particular los caballos de exhibición tienen un alto índice de úlceras gástricas (estomacales). Por ejemplo, casi el noventa y siete por ciento de la población de caballos de carreras ha sido reportado con la aparición de úlceras del tracto digestivo, con un porcentaje en caballos de exhibición con úlceras gástricas que están muy poco por debajo de los anteriores. Aún los potrillos de los caballos de exhibición han sufrido de esta condición con aproximadamente un sesenta por ciento de los potrillos de caballos de exhibición con úlceras del tracto digestivo. Aún cuando los caballos de recreación tienen una menor incidencia de úlceras del tracto digestivo en relación con los caballos de exhibición, el aumento de la incidencia de las úlceras del tracto digestivo en las últimas dos décadas ha sido muy significativo para todos los segmentos de la población de caballos incluyendo los caballos de recreación. Aunque las incidencias de úlceras de colon (úlceras en el intestino ciego y/o colon del caballo) han sido muy poco exploradas, también pueden representar un problema igualmente severo para la salud de los caballos. Uno de los pocos estudios científicos a la fecha que ha estudiado específicamente la incidencia de úlceras de colon ha demostrado resultados sorprendentes. En este estudio se realizó una prueba cruzada aleatoria de una variedad de caballos en donde aproximadamente el 55 por ciento presentó la incidencia de úlceras de gástricas y cuarenta por ciento de incidencia de úlceras de colon. Las incidencias de úlceras gástricas no fueron idénticas, lo que significa que algunos caballos sólo tenían úlceras gástricas y otros caballos úlceras de colon. Sin embargo, un gran porcentaje de caballos que han tenido úlceras de colon también han tenido úlceras gástricas, con menos del 30% de la población de caballos como un todo que no presentaron ni úlceras gástricas ni de colon. Como se menciona anteriormente, la incidencia de úlceras del tracto digestivo para caballos de exhibición y caballos de carreras es aún más alta que estas estadísticas para la población general equina. Existen varias soluciones para el problema de las úlceras gástricas en los caballos que se han empleado en el arte. Dichas soluciones incluyen el uso de antiácidos para neutralizar temporalmente el ácido en el estómago, el uso de medicamentos para inhibir la producción de ácido gástrico y reposo y una dieta de forraje. A últimas fechas, se ha desarrollado un suplemento alimenticio muy novedoso para tratar y/o prevenir las úlceras gástricas y de colon como se divulga en la Patente U.S. N° 10/435,367 ingresada el 9 de mayo del 2003, intitulada "Dietary Supplement and Method for Treatment and Prevention of Digestive Tract Ulcers in Equines and Other Animáis" -Suplemento Alimenticio para el Tratamiento y Prevención de Ulceras en el Tracto Digestivo de Equinos y otros Animales, cuya aplicación de patente está asignada al apoderado del presente invento y cuya patente se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. Aunque dichos tratamientos están disponibles, ha sido extremadamente difícil el diagnosticar con precisión las úlceras gástricas en caballos y no ha sido posible diagnosticar las úlceras de colon en los caballos. El método de uso más común para el diagnóstico de úlceras en equinos es el emplear los síntomas (que con frecuencia son vagos, signos no específicos como pérdida de peso, poco apetito, letargo, o fiebre intermitente) combinados con los resultados arrojados por el tratamiento; estos han demostrado que son muy poco confiables. Esto se debe al hecho de que existen muchas causas potenciales con los mismos síntomas y no todos los caballos presentan los mismos síntomas o incluso síntomas de ulceración acentuada. Como tal, el uso de esta técnica es con frecuencia igual que un juego de azar.

La única forma confiable para diagnosticar úlceras ha sido a través del uso de un endoscopio de tres metros que cuenta con muchas desventajas al ser tan costoso, tomar tanto tiempo y ser estresante (tanto para el caballo como para en entrenador/propietario) el costo de un endoscopio de tres metros de largo es muy elevado y es prohibitivo para los propietarios aún siendo de la élite. Uno de los costos más importantes del endoscopio es el hecho de que este procedimiento es engorroso y toma tiempo. Los entrenadores, propietarios, y veterinarios que no cuentan con un endoscopio de tres metros deben consultar con una clínica o veterinario que lo tenga. Esto toma tiempo adicional y es costoso y es aún más estresante para el caballo y frustrante ya que quita del cuidado del entrenador al caballo, propietario o a su veterinario normal.

Además, aún si el video del endoscopio se emplea, los resultados son restrictivos a lo que puede detectar el aparato es decir, los tejidos estomacales. Aunque dicho aparato es efectivo para observar y diagnosticar las úlceras estomacales, el diagnóstico de la ulceración en el noventa y cinco por ciento restantes del tracto digestivo sigue siendo imposible con este aparato. La parte posterior o colon descendente no se puede ver con el endoscopio ya que no tiene el endoscopio el largo suficiente y tendrían que vaciar el colon descendente en forma suficiente que probablemente mataría al caballo. De hecho, sólo hasta últimas fechas es que la alta incidencia de úlceras de colon en los caballos ha sido documentada y esto fue solamente a través del análisis visual post mortem.

Es de esta manera, que el principal objetivo del presente invento es presentar una kit de pruebas para úlceras y método relacionado para el uso del kit de pruebas y método relacionado para del kit de pruebas que sean eficaces en el diagnóstico de úlceras gástricas y úlceras de colon en caballos. Es otro objetivo relacionado del presente invento que es altamente confiable tanto para la identificación de úlceras existentes en el caballo así como la identificación de los tipos de úlceras presentes en el caballo y que no producen lecturas con un falso positivo.

Es otro objetivo del presente invento que la prueba sea simple y de fácil realización y que no requiera habilidades especiales o algún tipo de entrenamiento para que el usuario realice la prueba. Es otro objetivo del presente invento que se encuentre totalmente contenido, sin requerir ningún análisis adicional o equipo de procesamiento para que pueda ser realizado como prueba en el campo. Es otro objetivo del presente invento que proporcione los resultados de la prueba rápidamente en minutos en lugar de requerir un tiempo adicional.

El kit de pruebas para úlceras en equinos del presente invento debe ser de una construcción que sea durable y que tenga un tiempo largo de vida y no requiera de almacenamiento especial para asegurar que los kits de prueba sean precisos. Para mejorar la apariencia para el público de este kit de pruebas para equinos del presente invento, debe ser poco costoso en cuanto a construcción para que sea accesible al mercado en forma más amplia. Por último, también es el objetivo de todas las ventajas anteriores y objetivos que el kit de úlceras para equinos y método del presente invento se logre sin incurrir en cualquier otra desventaja sustancial relativa.

RESUMEN DEL INVENTO Las desventajas y limitaciones del arte previo discutidas anteriormente se superan con el presente invento. Con este invento, un kit de pruebas para úlceras en equinos y método para emplear el kit de pruebas se proporcionan y son capaces de proporcionar una identificación alta y sensible de la presencia de úlceras gástricas y de colon en caballos, con el kit de pruebas para la detección de úlceras en equinos y el método que claramente distinguen entre úlceras gástricas y úlceras de colon. El kit de úlceras del presente invento es en cuestión un Test de prueba de sangre en heces, ya que identifica los componentes de sangre contenidos en las heces del caballo que está siendo probado. De acuerdo con las enseñanzas del presente invento, dos componentes de la sangre han sido identificados, y que son altos indicadores de la presencia de úlceras gástricas y de colon. Los inventores del presente invento han determinado que la presencia de albúmina equina intacta que se encuentra en las heces es con la mayor certeza de origen en el colon. Esto se debe a que la albúmina de sangre equina de una úlcera gástrica (y de otra sangre craneal al duodeno de hecho) sería degradada por los ácidos y peptidasas en el estómago, haciendo que la albúmina equina no sea detectada en las heces fecales. Sin embargo, la albúmina equina contenida en la sangre de una úlcera gástrica o sangrado sobrevivirá a los ácidos y peptidasas en el estómago por lo menos en parte haciendo que esta sea detectada en las heces fecales. De esta manera, la presencia de albúmina equina intacta en las heces es un indicador de la existencia de una úlcera de colon, mientras que la presencia de hemoglobina es indicativa de la existencia de una úlcera gástrica o sangrado o de una úlcera de colon o sangrado o ambas úlcera gástrica o sangrado y úlcera de colon o sangrado.

Será apreciado por los conocedores del arte que el kit de pruebas para úlceras en equinos y método empleando indicadores de albúmina y hemoglobina equina será un buen indicador tanto de la presencia como la ubicación o localización de una o más úlceras en el caballo. La forma preferida del kit de pruebas de úlceras en equinos y método del presente invento es un inmunoensayo que está diseñado para detectar la presencia de albúmina equina y hemoglobina y específicamente el kit de pruebas de úlceras para equinos de la inclusión preferida es una prueba ELISA ensayo inmunoabsorbente de enzimas conectadas que es el método típicamente empleado en bioquímica para detectar la presencia o ausencia de una sustancia particular en la presente muestra.

Las pruebas de ELISA son pruebas rápidas inmunológicas que emplean un antígeno o antígeno (moléculas inmunológicas) y una enzima (una proteína que cataliza una reacción bioquímica) una prueba ELISA se emplea para detectar la sustancia que cuenta con propiedades antígenas, principalmente proteínas (en oposición a las moléculas pequeñas y iones como la glucosa y potasio), como por ejemplo anticuerpos, antígenos bacteriales y hormonas. La llamada prueba "rápida" ELISA es un inmuno ensayo de flujo lateral ("LFI") que consiste en una membrana que cuenta con camino o trayectoria de fluido de un extremo de la misma que está conectado a una fuente de fluido a otro extremo de la misma que a su vez está conectada a una tarja de fluido con tres áreas separadas a lo largo de una membrana.

La primera área contiene un anticuerpo etiquetado que es un anticuerpo conectado a un agente colorante, como por ejemplo perlas de látex coloreadas o un tinte u oro coloidal. Los anticuerpos etiquetados se mueven con el flujo de fluido desde la primera área hacia el segundo y la tercera área, y últimamente a la tarja de fluido. Si la sustancia de interés se encuentra en el fluido. Si la sustancia de interés se encuentra en el fluido se une a los anticuerpos etiquetados. La segunda área, que es típicamente una línea que se extiende a través de la membrana, contiene anticuerpos que se conectan a la membrana.

Los anticuerpos en la segunda área cuentan con una afinidad (y atraerán y se conectarán a) la sustancia de interés y los anticuerpos etiquetados, creando un "sándwich" con los anticuerpos etiquetados y la sustancia de interés se unirá a los anticuerpos en al segunda área, creando una línea coloreada que es positiva en cuanto a lectura indicando la presencia de una sustancia de interés. Entre más se encuentre de esta sustancia de interés en el fluido, más anticuerpo etiquetados se unirán a través de la sustancia de interés a los anticuerpos en la segunda área.

La tercera área que típicamente también es una línea que se extiende a través de la membrana, contiene y atraerá anticuerpos etiquetados creando una línea coloreada que es un control para indicar que el sistema de prueba se encuentra operando adecuadamente. La tercera área se encuentra del lado opuesto a la segunda área de la primera área para indicar que el fluido que esta siendo probado ha pasado a través a través de la segunda área, indicando que el sistema de prueba cuenta con el fluido suficiente para que el equipo de prueba funcione adecuadamente.

Dicho sistema de prueba generalmente se ilustra en la Patente US. N° 5, 602,040 de May et al., que se basa en dos anticuerpos. Las partículas incluyendo el primer grupo de anticuerpos se conectan a la superficie del látex coloreado o partículas coloidales de oro que han sido secadas en la membrana de nitrocelulosa en el primer extremo de la misma, y representa la primera área de referencia arriba mencionada. Un segundo grupo de anticuerpos se encuentran conectados a la membrana de nitrocelulosa en forma de línea y representan la segunda área referenciada arriba.

La prueba se realiza al absorber el líquido dentro de la membrana de nitrocelulosa en el primer extremo. Las partículas en la primera área se liberan por el flujo de líquido y el analito a ser detectado se une al anticuerpo en dichas partículas. En la segunda área, el analito a ser detectado también se une al otro anticuerpo que se encuentra presente en la línea y se forma una línea visible de color para mostrar la presencia de dicho analito. Este tipo de prueba inmuno cromatográfica, se basa en el flujo de un líquido a través de una membrana y se conoce como "Técnica de Flujo Lateral". La patente US N° 5, 602,040 se incorpora a la presente como referencia al igual que la patente US N° 5, 712,170 de Kouvonen et al que proporciona un excelente resumen del arte en esta área.

Un segundo formato existe y se puede emplear y emplea la técnica de "exclusión competitiva" para generar un resultado positivo o negativo. En lugar del ensayo de tipo "sándwich" arriba mencionado, el antígeno purificado (albúmina equina o hemoglobina equina) se fija a la tira y el anticuerpo objetivo se contiene en la fase móvil. Cuando no se encuentra presente el antígeno objetivo en la prueba, el anticuerpo es libre de moverse en la fase móvil y se conectará al antígeno fijado en la tira, resultando en una línea en la tira. De la misma forma, la presencia de una línea indica un resultado negativo.

Si por otra parte el antígeno objetivo se encuentra presente en la muestra probada, entonces el antígeno se unirá al anticuerpo en la fase móvil, haciendo que no esté disponible la unión a la tira de prueba que dará como resultado que no aparezca la línea. De la misma forma, la ausencia de una línea en esta prueba indica un resultado positivo. Este tipo de técnica de prueba de exclusión competitiva se describe en la utilización de la prueba de drogas realizada bajo la marca ONTRAK TESTCUP de Varían, Inc. Y de venta exclusivamente por Roche Diagnostics. Se describe en la patente U.S. N° 6, 375,897 de Bachand cuya patente se incorpora en la presente como referencia.

Las pruebas LFI son relativamente de bajo costo en cuanto a manufactura, de fácil operación y proporcionan un rápido análisis sin la necesidad de equipo de laboratorio. Los anticuerpos en las pruebas LFI se obtienen al inocular un animal con la sustancia de interés después de dicha inoculación el animal produce anticuerpos a esta sustancia. Esta relación bioquímica se emplea como mecanismo para aislar y detectar la sustancia de interés. Las pruebas LFI son sensibles y específicas y se comparan bien con ensayos radio inmunes o pruebas RIA. Las pruebas LFI cuentan con la ventaja adicional de que no necesitan radioisótopos o aparatos para medir la radiación. La inclusión preferida del kit de pruebas de sangrado o úlceras en equinos del presente invento incluye dos tiras de prueba que encuentran en uno o dos estuches de plástico. Las heces fecales del caballo que va a ser examinado se colocan en un recipiente (que puede ser por ejemplo, una cubeta, palangana, bolsa de plástico o taza) una solución (que puede ser agua o agua con una sustancia neutralizadora como sal) se añade y se mezcla o se amasa para una mezcla homogénea. Un aplicador como por ejemplo un gotero se emplea para verter varias gotas del líquido de la cubeta a las tiras de pruebas dentro de los estuches. En un periodo de tiempo que de preferencia varía de cinco minutos a treinta minutos, las dos tiras de prueba mostrarán un marcador visual que representa el indicador de control y si el indicador que se está probando se encuentra presente, un marcador que significa la detección de estos indicadores que son específicamente indicadores de la presencia de úlceras gástricas o sangrado y/o úlceras de colon o sangrado. El presente invento emplea dos indicadores uno de los cuales, es indicativo de la presencia de úlcera gástrica o sangrado y el otro que es indicativo de la presencia de úlcera de colon o sangrado.

En la inclusión preferida, la sustancia de interés que, cuando se detecta, proporcionará un indicador de la presencia de úlcera de colon o sangrado es la albúmina equina, y la sustancia de interés que cuando se detecta proporcionará un indicador de la presencia de una úlcera gástrica o sangrado es la hemoglobina equina. El kit de pruebas para la detección de úlceras o sagrado en equinos así como el método del presente invento diagnostica las úlceras gástricas y/o de colon o sangrado, proporcionando una. base inmediata para tratamiento.

En consecuencia, es por esto que se puede observar que el presente invento enseña un kit de pruebas para úlceras y sangrado en el tracto digestivo en equinos y método relacionado para el uso del kit de pruebas que es eficaz en el diagnóstico tanto de úlceras gástricas o sangrado y de úlceras de colon o sangrado así como de otros tipos de sangrado del tracto digestivo de los caballos. El kit de pruebas para la detección de úlceras y sangrado en el tracto digestivo de equinos y método del presente invento proporciona un indicador altamente específico de la presencia de ya sea úlceras gástricas o sangrado, úlceras de colon o sangrado o ambas. El kit de pruebas para la detección de úlceras y sangrado del tracto digestivo en equinos y método del presente invento es altamente confiable tanto para la identificación de la existencia de úlceras o sangrado en un caballo asi como de la identificación del tipo (s) de úlceras que se encuentran presentes en el caballo, y no produce un exceso en lecturas con un falso positivo.

El kit de pruebas para la detección de úlceras y sangrado en el tracto digestivo en equinos y método del presente invento son simples y fáciles de realizar y no requieren de una capacitación especial o habilidades especiales para realizar la prueba. El kit de pruebas para la detección de úlceras y sangrado en el tracto digestivo y método del presente invento se encuentra, integrado y no requiere de un análisis en el laboratorio o equipo de procesamiento adicional, permitiendo de esta manera que sea realizado en cualquier parte como prueba de campo. El kit de pruebas para la detección de úlceras y sangrado en el tracto digestivo en equinos y método del presente invento, proporciona resultados de la prueba rápidamente, en minutos en lugar de requerir un largo periodo de tiempo.

El kit de pruebas para la detección de úlceras y sangrado en el tracto digestivo del presente invento es de una construcción que es tanto resistente como de larga duración y los kits de pruebas no requieren de condiciones especiales de almacenamiento y tienen un largo periodo de caducidad. El kit de pruebas para la detección de úlceras y sangrado del presente invento es también de una construcción de bajo costo para tener una mejor comercialización y que el producto se encuentre al alcance de la mano de un mayor número de consumidores. Por último, todas las ventajas antes mencionadas y objetivos del kit de pruebas para la detección de úlceras y sangrado en equinos y método del presente invento se logran sin incurrir en ninguna desventaja sustancial.

DESCRIPCIÓN DE LAS ÍLUSTRACJQNES Estas y otras ventajas del presente invento se entenderían mejor haciendo referencia a las ilustraciones en donde: La fig. 1 es un dibujo o esquema del caballo mostrando la anatomía del tracto digestivo del caballo; La fig. 2 es una vista isométrica mostrando un kit de pruebas para la detección de úlceras y sangrado en equinos que se construye y se emplea de acuerdo a las enseñanzas del presente invento que cuenta con un primer estuche que contiene una tira de prueba para úlceras gástricas o sangrado y un segundo estuche que contiene una tira de prueba para la detección de úlceras de colon o sangrado; La fig. 3 es una vista isométrica mostrando una inclusión alternativa del kit de pruebas para la detección de úlceras y sangrado en equinos también construida y empleada de acuerdo con las enseñanzas del presente invento y que cuenta con un solo estuche que contiene ambas tiras para la detección de úlceras gástricas o sangrado y la tira para la detección de úlceras de colon o sangrado; y La fig. 4 es una gráfica ilustrando los resultados del kit de pruebas para la detección de úlceras y sangrado en equinos como se indica por la presencia o ausencia detectada de albúmina equina y la presencia o ausencia detectada de hemoglobina equina.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DEL PRESENTE INVENTO Previo a la discusión del kit para la detección de úlceras y sangrado en equinos y método del presente invento, es de gran utilidad el discutir brevemente la anatomía del sistema digestivo del caballo. En referencia a la fig. 1 una vista lateral del caballo 20 se ¡lustra, en esquema que muestra el tracto digestivo del caballo. El tracto digestivo del caballo 20 se puede separar en parte delantera del tubo digestivo que se indica generalmente con el número 22 y parte posterior del tracto digestivo que se indica con el numero 24.

El tracto digestivo del caballo 20 comienza en su boca 26 y se extiende secuencialmente a través del esófago 28 al estómago 30 y después al intestino delgado 32 que en conjunto constituyen la parte superior del tracto digestivo 22 del caballo 20. La parte superior 22 del caballo 20 constituye aproximadamente el 35 al 40% de la capacidad relativa del tracto digestivo del caballo 20. Del intestino delgado 32, el tracto digestivo se extiende a través del intestino ciego 34, el colon ascendente 36 y el colon descendente 38 que termina en el recto 40. Estos elementos del tracto digestivo del caballo 20 constituyen la parte posterior 24 del caballo 20. La parte posterior 24 constituye aproximadamente el 60% al 65% de la capacidad relativa del tracto digestivo del caballo 20. La inclusión preferida del kit de pruebas para úlceras en equinos del presente invento se muestra en la fig. 2. Un primer estuche 50 que contiene un Test de úlceras en equinos para detectar úlceras gástricas es ¡lustrado. El primer estuche 50 cuenta con una abertura 52 localizada en la misma a la cual se introduce el fluido a ser analizado. También localizado en el primer estuche 50 se encuentra una ventanilla 54 en donde la tira de membrana de prueba 56 cuenta con una zona de indicador 58 y una zona de control 60 localizada en la misma de forma visible. La zona de prueba 58 será visible cuando se detecta la sustancia de interés en la prueba, proporcionando un indicador de la presencia de úlcera gástrica.

La fig. 2 muestra un segundo estuche 70 que contiene un kit de pruebas para úlceras en equinos para detectar úlceras de colon. El segundo estuche 70 cuenta con una abertura 72 localizada en la misma a la cual se introduce el fluido a ser analizado. También dentro del segundo estuche 70 se encuentra una ventanilla 74 a través de la cual la tira de prueba 76 muestra la zona de prueba 78 y una zona de control 80 localizada en la misma en forma visible. La zona de indicador de prueba 78 será visible cuando se detecte la presencia de la sustancia de interés proporcionando un indicador de la presencia de una úlcera de colon aunque se muestran muy de cerca, el primer estuche 50 y el segundo estuche 70 están separados en la ilustración de la fig. 2.

En referencia a la fig. 3 una inclusión alternativa del kit de pruebas se ilustra con un solo estuche 90. El estuche 90 cuenta con una sola (pero más ancha) apertura 92 localizada en la misma en donde el fluido a ser analizado se introduce. El estuche 90 cuenta con una primer y segunda ventanas 94,96 localizadas en la misma en lados opuestos. Visible a través de la primer ventana 94 se encuentra una tira de prueba o membrana 98 que cuenta con una zona de indicador 100 y una zona de indicador de prueba 102 en la misma. La zona de indicador de prueba 100 será visible cuando la sustancia de interés es detectada, proporcionando un indicador de la presencia de úlcera gástrica. La zona de indicador de control 102 será visible cuando se haya introducido el fluido suficiente dentro del estuche 90 a través de la abertura 92.

Visible a través de la segunda ventanilla 96 se encuentra una tira de prueba 104 que cuenta con indicador de prueba 106 y una zona de control 108 localizada en la misma. La zona de indicador de prueba 106 será visible cuando la presencia de la sustancia de interés es detectada, proporcionando un indicador de la presencia de úlcera gástrica. La zona de control 108 será visible cuando suficiente fluido ha sido introducido en el estuche 90 a través de la abertura 92.

La construcción de las tiras de prueba 56 y 76 en la fig. 2 y las tiras de pruebas 98 y 104 en la fig. 3 son bien conocidos por los expertos en la materia.

En forma similar, la construcción de varios otros tipos de kits de pruebas cuenta con diferentes tipos o diseños de estuches que son bien conocidos en la materia. Las porciones claves de estos estuches de pruebas mostrados en las FIGS. 2 y 3 son del tipo derivado de anticuerpos que se emplean para proporcionar los tests de úlceras gástricas y de colon que se discutirán a continuación.

Antes de dicha discusión, se proporcionará una breve discusión de la operación de los kits de pruebas como se ilustran en las figs. 2 y 3. Un veterinario, entrenador o dueño del caballo recolecta heces fecales (de preferencia todo un movimiento intestinal) del caballo a ser sometido a la prueba. La muestra fecal se coloca en una cubeta de cinco galones y se mezcla con agua tibia mezclada con sal. Empleando un gotero o cualquier otro método adecuado el veterinario, dueño o entrenador coloca unas cuantas gotas del fluido anterior ya bien mezclado dentro del kit de prueba en las aberturas 52 y 72 en los estuches 50 y 70, respectivamente para la inclusión de la fig. 1 o a través de la abertura 92 en el estuche 90 de la inclusión en la fig. 2.

En unos cuantos minutos la zona de control 60 y 80 será visible para la inclusión de la fig. 1 o las zonas de control 102 y 108 serán visibles para la inclusión de la fig. 2 indicando la operación adecuada del kit de prueba. Si se detecta la albúmina equina, la zona de prueba 58 será visible para la fig. 1 o la zona de prueba 100 serán visibles para la fig. 2. en forma similar, si la hemoglobina equina se detecta, la zona de indicador de prueba 78 será visible para la inclusión en la fig. 1 o la zona de prueba 106 serán visibles para la inclusión de la fig. 2. La prueba diagnostica úlceras gástricas o de colon, proporcionando las bases para el tratamiento inmediato si ambas o una es detectada.

Aunque las inclusiones ilustradas en las FIGS. 2 y 3 muestran membranas de tiras de prueba separadas 56 y 76 para la inclusión ilustrada en la Fig. 2, y tiras separadas 98 y 104 para la fig. 3, los conocedores de la materia apreciarán inmediatamente que es posible para combinar ambas pruebas en una sola membrana.

Además, en lugar de la prueba que se describe arriba en donde la aparición de un indicador en el kit de pruebas indica la detección de albúmina equina o hemoglobina equina, también es posible usar la técnica de exclusión competitiva en donde la aparición del indicador de la prueba indica la ausencia de la detección de la albúmina equina o hemoglobina equina.

En la inclusión preferida del kit y método de pruebas de úlceras en equinos del presente invento, la sustancia de interés que cuando se detecta proporciona indicador de la presencia de úlcera de colon o sangrado es la albúmina equina y la sustancia de interés que cuando se detecta proporcionará indicador de la presencia de úlcera gástrica o sangrado es hemoglobina equina.

La elección es albúmina equina para indicar la presencia de una úlcera de colon o sangrado que proporcionada especificación debido a que la albúmina equina se puede detectar en las heces del caballo y sólo se pudo haber originado en el colon. Esto se debe a que la sangre de las úlceras gástricas o sangrado (y de hecho de toda la que llega hasta el duodeno) sería degradada por los ácidos y péptidos en el estomago haciendo que sea esencialmente imposible que la albúmina equina detectada en la heces se haya originado de una úlcera gástrica.

Sin embargo, es muy probable que la acción de los ácidos y péptidos en el estómago hayan podido degradar o digerir la hemoglobina equina. La hemoglobina equina detectada en las heces ciertamente se habrá originado en el estómago y/o colon indicando la presencia de sangrado o úlcera gástrica o úlcera de colon o sangrado o tanto úlcera gástrica o sangrado y úlcera de colon o sangrado. La diferenciación de úlceras de colon y úlceras gástricas se basa en la presencia o ausencia de albúmina equina.

En referencia a la fig. 4, se puede observar que si se detecta la albúmina equina, una úlcera de colon o sangrado ciertamente se encuentran presentes. Si la albúmina no se detecta pero se detecta la hemoglobina equina, se probable la presencia de una úlcera gástrica o sangrado. Si ni la albúmina ni la hemoglobina equina se encuentran presentes, no existe la certeza de la presencia de úlceras de colon o sangrado o de úlceras gástricas o sangrado. Por último, si tanto la albúmina equina como la hemoglobina equina se encuentran presentes, se encontrarán presentes las úlceras de colon o sangrado o ambas o úlceras gástricas o sangrado y úlceras de colon o sangrado. Así, los conocedores de la materia apreciarán que el kit para la detección de úlceras y sangrado en equinos y método para diagnosticar las úlceras gástricas y/o de colon o sangrado, del presente invento permite que el tratamiento de estas úlceras o sangrado sea proporcionado con toda la seguridad de la presencia de las mismas.

LA PRUEBA DE ALBUMINA La prueba de albúmina es un ensayo monoclonal/policlonal altamente sensible. Existen cuatro pasos específicos de dicho inmunoensayo que son, la inmunización, fusión, clonación y producción. La primera etapa es la inmunización en donde un conejo, ratón, conejillo de indias y otros animales de prueba son inyectados con albúmina equina derivada de sangre de caballo. Esto provocará una reacción inmune en el animal de prueba que creará cantidades copiosas de anticuerpos en su sangre y en su bazo. Después de seis semanas, se puede extraer sangre de los animales y los anticuerpos probados usando una prueba ELISA. Esto implica la reacción de la sangre de los animales de prueba con el suero del caballo in Vitro. Si los anticuerpos se encuentran presente, la prueba ELISA cambia de color. Si existe un nivel insuficiente de anticuerpos, los animales de prueba necesitarán refuerzos de vacuna de albúmina equina. Estos primeros sangrados se pueden emplear para producir anticuerpos policlonales. Esta etapa típicamente toma aproximadamente tres meses. La segunda etapa es la fusión en donde los animales de prueba se sacrifican y sus bazos se maceran para liberar las células creando anticuerpos equinos. Estas células se pueden fusionar con una línea de células mieloma para inmortalizarlas como se describe en la patente U.S. N° 5,552,295 de Stanker et, al cuya patente se incorpora como referencia. Una vez inmortalizadas estas células se pueden cultivar en forma indefinida para proporcionar una provisión constante de anticuerpos.

Los hibridomas (células fusionadas) se colocan en un microtiter de 96 contendores. Estas células se someten a otra prueba ELISA y aquellas que muestran una reacción adecuada a anticuerpos se expanden en otros microtiters. Estas células se vuelven a probar con ELISA para proporcionar una línea pura de células que producen los anticuerpos deseados que en esta etapa toma aproximadamente de cinco a seis semanas.

La tercera etapa es la clonación en donde la células que dieron positivo a la segunda etapa se clonan y se someten a otras pruebas de ELISA. Se pueden necesitar varios ciclos para desarrollar clones estables. Estos clones estables se pueden inyectar dentro del abdomen de ratones donde producen ascitis y después están listos para su uso. Esto será aparente para los conocedores de la materia en que esta técnica produce anticuerpos monoclonales novedoso específicos a la albúmina equina. La tercera etapa toma aproximadamente tres meses. Alternativamente se puede inmunizar a los pollos con el antígeno y producirán el anticuerpo en las yemas de los huevos. Esta técnica no requiere de la etapa de clonación arriba mencionada ya que el pollo pondrá suficientes huevos para proporcionar los anticuerpos, sin embargo, las etapas de purificación de estos anticuerpos son similares a las arriba descritas.

La cuarta y última etapa es la producción de los kits de prueba. Los anticuerpos se pintan en una superficie porosa de nitrocelulosa o membrana de nylon. Cuando la albúmina equina se coloca en el aparato de prueba se pasa o entrelaza con la membrana toma los anticuerpos etiquetados que llevan el agente colorante y se queda atrapada por los anticuerpos en la zona de indicador. Ahí, la concentración de los anticuerpos etiquetados provocará el cambio de color claramente indicando la presencia de albúmina en las heces del caballo. De esta manera se puede apreciar por los conocedores del arte que este anticuerpo novedoso es extremadamente sensible (la sensibilidad es igual o mejor a aproximadamente una parte en un millón) un microgramo por milímetro y específico a la albúmina equina.

LA PRUEBA DE HEMOGLOBINA La prueba de hemoglobina equina es un ensayo monoclonal/ policlonal altamente sensible. Existen cuatro pasos específicos en la creación de dicho inmunoensayo específicamente, la inmunización, fusión clonación y producción. La primera etapa es la inmunización en donde a un conejo, ratón, conejillo de indias, o cualquier otro animal de laboratorio adecuado, se le inyecta con las secuencias de péptidos de la hemoglobina equina derivadas de la secuencia genética de la hemoglobina equina, que es única en las especies equinas. Esto proporcionará una reacción inmune en los animales de prueba, que a su vez creará cuantiosas cantidades de anticuerpos en su sangre y en su bazo. Aproximadamente seis semanas después, se puede extraer sangre de los animales y se puede probar para buscar la presencia de anticuerpos medíante un examen ELISA. Esto implica la reacción de la sangre del animal de laboratorio con el suero de caballo in Vitro. Si se encuentran presentes los anticuerpos, la prueba ELISA cambiará de color. Si se encuentra un nivel insuficiente de anticuerpos, los animales de prueba pueden requerir una o más inyecciones de refuerzo de la hemoglobina equina. Los primeros sangrados se pueden emplear para producir anticuerpos policlonales. Esta etapa comúnmente toma aproximadamente tres meses. Los anticuerpos policlonales de esta etapa se emplean para la construcción del kit de pruebas.

La segunda etapa es la fusión en donde los animales de prueba se sacrifican y sus bazos se maceran para liberar las células creando anticuerpos equinos. Estas células se pueden fusionar con una línea de células mieloma para inmortalizarlas como se describe en la patente U.S. N° 5,552,295 de Stanker et, al cuya patente se incorpora como referencia. Una vez inmortalizadas estas células se pueden cultivar en forma indefinida para proporcionar una provisión constante de anticuerpos.

Los hibridomas (células fusionadas) se colocan en un microtiter de 96 contendores. Estas células se someten a otra prueba ELISA y aquellas que muestran una reacción adecuada a anticuerpos se expanden en otros microtiters. Estas células se vuelven a probar con ELISA para proporcionar una línea pura de células que producen los anticuerpos deseados que en esta etapa toma aproximadamente de cinco a seis semanas.

La tercera etapa es la clonación en donde la células que dieron positivo a la segunda etapa se clonan y se someten a otras pruebas de ELISA. Se pueden necesitar varios ciclos para desarrollar clones estables. Estos clones estables se pueden inyectar dentro del abdomen de ratones donde producen ascitis y después están listos para su uso. Esto será aparente para los conocedores de la materia en que esta técnica produce anticuerpos monoclonales novedoso específicos a la hemoglobina equina. La tercera etapa toma aproximadamente tres meses. Alternativamente se puede inmunizar a los pollos con el antígeno y producirán el anticuerpo en las yemas de los huevos. Esta técnica no requiere de la etapa de clonación arriba mencionada ya que el pollo pondrá suficientes huevos para proporcionar los anticuerpos, sin embargo, las etapas de purificación de estos anticuerpos son similares a las arriba descritas.

La cuarta y última etapa es la producción de los kits de prueba. Los anticuerpos se pintan en una superficie porosa de nitrocelulosa o membrana de nylon. Cuando la hemoglobina equina se coloca en el aparato de prueba se pasa o entrelaza con la membrana toma los anticuerpos etiquetados que llevan el agente colorante y se queda atrapada por los anticuerpos en la zona de indicador. Ahí, la concentración de los anticuerpos etiquetados provocará el cambio de color claramente indicando la presencia de hemoglobina en las heces del caballo. De esta manera se puede apreciar por los conocedores del arte que este anticuerpo novedoso es extremadamente sensible (la sensibilidad es igual o mejor a aproximadamente una parte en un millón) un microgramo por mililitro y específico a la hemoglobina equina.

LA PRUEBA DE LA COMBINACIÓN Al combinar la prueba de albúmina con la prueba de hemoglobina equina en un solo kit de pruebas, se puede crear un test de pruebas sencillo, de bajo costo, altamente sensible y de diagnóstico específico para úlceras en equinos o sangrado. Alternativamente, las dos pruebas se pueden proporcionar en kits de pruebas separados. En la inclusión preferida, las dos tiras de prueba se conectan a un solo pozo, para que una sola aplicación de líquido fecal sea suficiente para ambas. Si la prueba de albúmina es positiva, esto indicará la presencia de una úlcera de colon o sangrado. Si sólo la prueba de hemoglobina es positiva esto indicará la presencia de úlcera gástrica o sangrado. Si ambos resultados son positivos, ya sea que una úlcera de colon o sangrado o ambos, una úlcera gástrica o sangrado o ambos sea indicada. Será apreciado por los conocedores de la materia que este kit dual de pruebas puede ser cómodo, una prueba no invasiva para la detección de úlceras gástricas o sangrado / que hoy en día es difícil y costoso de diagnosticar) así como úlceras de colon o sangrado (para las que hoy en día no existe ninguna prueba capaz de proporcionar un diagnóstico preciso).

Aunque el kit de pruebas para la detección de úlceras o sangrado en equinos y método del presente invento en la inclusión preferida se encuentran dirigidas al diagnóstico de úlceras gástricas o sangrado y úlceras de colon o sangrado, se contempla dentro de la envergadura del presente invento que se puede emplear para el diagnóstico de úlceras gástricas o sangrado o úlceras de colon o sangrado en otros animales. El kit de pruebas para la detección de úlceras o sangrado se puede diseñar específicamente para un animal en particular en donde se usará para detectar la albúmina y la hemoglobina de un animal en particular, alternativamente se puede hacer un kit de pruebas para la detección de úlceras o sangrado más genérico al proporcionar un anticuerpo de albúmina que específicamente se une a la albúmina de una pluralidad de diferentes animales y anticuerpo de hemoglobina que específicamente se une a la hemoglobina de una pluralidad de animales diferentes.

En consecuencia se puede apreciar a partir de la descripción detallada de la inclusión preferida del presente invento que enseña un kit para la detección de úlceras y sangrado del tracto digestivo en caballos y método relacionado para el uso de dicho kit de pruebas que es eficaz en el diagnóstico tanto de úlceras gástricas o sangrado como en la detección de úlceras de colon o sangrado en caballos. El kit de pruebas para la detección de úlceras o sangrado en equinos del presente invento proporciona un indicador altamente específico de la presencia de úlceras gástricas o sangrado o de ulceras de colon o sangrado o ambas. El kit de pruebas para la detección de úlceras o sangrado y método del presente invento es altamente confiable tanto en la identificación de la existencia de úlceras o sangrado en un caballo así como en la identificación de los tipos de úlceras o localización del sangrado que pueda presentar el caballo y que no produce un exceso de lecturas de falsos positivos.

El kit de pruebas para la detección de úlceras y sangrado en equinos y método del presente invento son simples y fáciles de realizar y no requieren de habilidades o capacitación especial para que el usuario realice la prueba. El kit de pruebas para la detección de úlceras en equinos o sangrado del presente invento es integral y no requiere de análisis de laboratorio o equipos adicionales, permitiendo que este sea realizado en cualquier lugar como prueba de campo. El kit de pruebas para la detección de úlceras o sangrado en equinos y método del presente invento proporciona los resultados de la prueba rápidamente en minutos en lugar de requerir un mayor tiempo. El kit de pruebas para la detección de úlceras en equinos del presente invento es de una construcción que es duradera y los kits de prueba no requieren de condiciones especiales de almacenaje y cuentan con una un periodo largo de caducidad. El kit d pruebas para la detección de úlceras del presente invento es de una construcción de bajo costo para mejorar su comercialización y que la mayor parte de la población la pueda adquirir. Por último, las ventajas y objetivos arriba mencionados del kit de pruebas para la detección de úlceras y sangrado en equinos del presente invento se logran sin incurrir en ninguna desventaja sustancial.

Aunque la anterior descripción del kit para la detección de úlceras o sangrados en equinos del presente invento se ha mostrado y descrito con referencia a inclusiones en particular y las aplicaciones de las mismas, éstas se han presentado para propósitos de ilustración y descripción y no pretende ser exhaustiva o limitar al invento a inclusiones en particular o a las aplicaciones divulgadas. Será aparente para los conocedores de la materia que varios cambios modificaciones, variaciones o alteraciones al invento como se describe en la presente se pueden realizar, ninguna de las cuales se aleja del espíritu o envergadura del presente invento. Las inclusiones específicas y aplicaciones fueron elegidas y descritas para proporcionar la mejor ilustración de los principios del invento y su aplicación práctica para permitirle a una persona que conoce la materia emplear este invento en varias inclusiones y con varias modificaciones de acuerdo a las necesidades contempladas. Todos éstos cambios, modificaciones, variaciones y alteraciones se deben considerar dentro de la envergadura del presente invento como se determina por las reivindicaciones anexas a las cuales tiene derecho, justa y legalmente.

Claims (29)

REIVINDICACIONES SE REIVINDICA:

1. Un kit de prueba rápida para la detección y localización de úlceras o sangrado en el tracto digestivo en equinos que comprende: Una primera tira de prueba para un inmunoensayo rápido de reacción de peroxidasa para detectar la presencia de una úlcera gástrica o sangrado y/o úlcera de colon o sangrado en equinos; y Una segunda tira de prueba para un inmunoensayo rápido para detectar la presencia de una úlcera de colon o sangrado en equinos.

2. Un kit de prueba rápida como se define en la reivindicación 1 en donde dicha primera tira detecta la presencia de hemoglobina equina que es indicador de la presencia de una úlcera gástrica o sangrado y/o úlcera de colon o sangrado en equinos.

3. Un kit de prueba rápida como se define en la reivindicación 2 en donde dicha primera tira contiene un anticuerpo anti hemoglobina equina que específicamente se une a la hemoglobina equina.

4. Un kit de prueba rápida como se define en la reivindicación 3 en donde dicho anticuerpo anti hemoglobina equina se une a la hemoglobina equina con una sensibilidad igual o mejor que aproximadamente una parte en un millón (un microgramo por mililitro).

5. Un kit de prueba rápida como se define en la reivindicación 3 en donde dicho anticuerpo anti hemoglobina equina es un anticuerpo monoclonal.

6. Un kit de prueba rápida como se define en la reivindicación 3 en donde dicho anticuerpo anti hemoglobina equina es un anticuerpo policlonal.

7. Un kit de prueba rápida como se define en la reivindicación 3 en donde dicho anticuerpo anti hemoglobina equina se aisla del suero de la sangre de los bazos macerados de conejos, ratones, ratas o conejillos de india.

8. Un kit de pruebas rápida como se define en la reivindicación e en donde dicho anticuerpo anti hemoglobina equina se produce por un línea de células hibridomas que produce y secreta anticuerpos monoclonales que específicamente se unen a la hemoglobina equina.

9. Un kit de pruebas rápida como se define en la reivindicación 3 en donde dicho anticuerpo anti hemoglobina equina se produce al exprimir los anticuerpos de hemoglobina equina de células inmunes que han sido hibridizadas con líneas inmortales de mieloma.

10. Un kit de prueba rápida como se define en la reivindicación 9 en donde dichas células inmunes se aislan del suero de la sangre o de bazos macerados provenientes de los ratones, conejos, ratas o conejillos de guinea que han sido inoculados.

11. Un kit de prueba rápida como se define en la reivindicación 1 en donde dichas primera tira de prueba también contiene un indicador de control para demostrar que la prueba se ha realizado de la manera adecuada.

12. un kit de prueba rápida como se define en la reivindicación 1 en donde dicha segunda tira de prueba detecta la presencia de albúmina equina que es indicativa de la presencia de una úlcera de colon o sangrado en equinos.

13. Un kit de prueba rápida como se define en la reivindicación 12 en donde dicha segunda tira de prueba contiene un anticuerpo anti albúmina equina que específicamente se une a la albúmina equina.

14. Un kit de prueba rápida como se define en la reivindicación 13 en donde dicho anticuerpo anti albúmina equina se une a la albúmina equina con una sensibilidad igual a o mejor que aproximadamente una parte en un millón ( un microgramo por mililitro).

15. un kit de prueba rápida como se define en la reivindicación 13 en donde dicho anticuerpo anti albúmina equina es un anticuerpo monoclonal.

16. un kií de prueba rápida como se define en la reivindicación 13 en donde dicho anticuerpo anti albúmina equina es un anticuerpo policlonal.

17. Un kit de prueba rápida como se define en la reivindicación 13 en donde dicho anticuerpo anti albúmina equina se aisla a partir del suero o de los bazos macerados de ratones, conejos, ratas o conejillos de india que han sido inoculados.

18. Un kit de prueba rápida como se define en la reivindicación 13 en donde dicho anticuerpo anti albúmina equina se produce por una línea de células hibridomas que produce y secreta anticuerpos monoclonales que específicamente se unen a la albúmina equina.

19. Un kit de prueba rápido como se define en la reivindicación 13 en donde dicho anticuerpo anti albúmina equina se produce al exprimir los anticuerpos de albúmina equina a partir de células inmunes que han sido hibridizadas con líneas inmortales de mieloma.

20. Un kit de prueba rápida como se define en la reivindicación 19 en donde dichas células inmunes se aislan del suero de la sangre o de los bazos macerados de ratones, conejos, ratas o conejillos de indias que han sido inoculados.

21. Un kit de prueba rápida como se define en la reivindicación 1 en donde dicha segunda tira de prueba contiene un indicador de control para demostrar que la prueba se ha realizado en forma adecuada.

22. Un kit de prueba rápida como se define en la reivindicación 1 en donde dicha primera y segunda tiras de prueba comprende: una tira de prueba única para la detección tanto de la presencia de hemoglobina equina que es indicativo de la presencia de úlcera gástrica o sangrado y/o de úlcera de colon o sangrado en un equino y la presencia de albúmina equina que es indicativo de la presencia de una úlcera de colon o de sangrado en equinos.

23. Un método para hacer un kit de pruebas rápido para la detección y localización de úlceras o sangrado en el tracto digestivo en equinos que comprende: Proporcionar una primera tira para un inmunoensayo rápido o reacción de peroxidasa para detectar la presencia de úlcera gástrica o sangrado y/o de úlcera de colon o sangrado en un equino; y Proporcionar una segunda tira de prueba para un inmunoensayo rápido para detectar la presencia de úlcera de colon o sangrado en equinos.

24. Un método como se define en la reivindicación 23 en donde dicha primera tira de prueba se proporciona para detectar la presencia de hemoglobina equina que es indicativo de la presencia de úlcera gástrica o sangrado y/o úlcera de colon o sangrado en equinos.

25. un método como se define en la reivindicación 24 en donde dicha primera tira contiene un anticuerpo anti hemoglobina equina que específicamente se une a la hemoglobina equina.

26. Un método como se define en la reivindicación 23 en donde dicha segunda tira se proporciona para detectar la presencia de albúmina equina que es indicativo de la presencia de úlcera de colon o sangrado en un equino.

27. Un método como se define en la reivindicación 22 en donde dicha segunda tira de prueba contiene un anticuerpo anti albúmina equina que específicamente se une a la albúmina equina.

28. Un método como se define en la reivindicación 23 en donde dicha primer tira también contiene un indicador de control para demostrar que la prueba ha sido realizada en forma adecuada y en donde dicha segunda tira también contiene una indicador de control para demostrar que la prueba ha sido realizada en forma adecuada.

29. Un método como se define en la reivindicación 23 en donde dicha primera y segunda tira comprenden: una prueba de una sola tira para detectar la presencia de hemoglobina equina y la presencia de albúmina equina.