MX2007013257A - Conjugados de ester de alfa-aminoacido-farmaco hidrolizables por carboxilesterasa. - Google Patents

Conjugados de ester de alfa-aminoacido-farmaco hidrolizables por carboxilesterasa.

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Alan Hastings Drummond
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Abstract

La presente invencion se refiere a la conjugacion covalente de un ester de alfa-aminoacido a un modulador de la actividad de una enzima o receptor intracelular objetivo, en donde el grupo ester del conjugado es hidrolizable por una o mas enzimas carboxilesterasas intracelulares al acido correspondiente, lo que conduce a la acumulacion del producto de la hidrolisis de acido carboxilico en la celula y hace posible una modulacion mejorada o mas prolongada de la enzima o receptor con relacion al modulador no conjugado.

Description

CONJUGADOS DE ESTER DE ALFA-AMINOACIDO-FARMACO HIDROLIZAB ?S POR CARBOXI ESTERASA Campo de la Invención Esta invención se refiere a un método general para incrementar o prolongar la actividad de un compuesto el cual modula la actividad de una enzima o receptor intracelular por medio de la conjugación covalente de una configuración de éster de alfa-aminoácido al modulador. La invención también se refiere a moduladores a los cuales se ha conjugado covalentemente una configuración de éster de alfa-aminoácido y a un método para la identificación de estos conjugados que tienen propiedades superiores con relación al modulador precursor no conjugado. La invención se refiere además al uso de moduladores que contienen configuraciones de éster de aminoácido que permiten la acumulación selectiva de conjugados de aminoácidos dentro de las células del linaje de monocitos-macrófagos .
Antecedentes de la Invención Muchas enzimas y receptores intracelulares son objetivos para fármacos farmacéuticamente útiles los cuales modulan sus actividades al enlazarse a sus sitios activos. Los ejemplos aparecen en la Tabla 1 posterior. Para alcanzar las enzimas y receptores objetivo, los compuestos moduladores deben cruzar por supuesto la membrana celular desde el KEFs 186308 plasma/fluido extracelular. En general, los moduladores de carga neutra cruzan la membrana celular más fácilmente que las especies cargadas. Entonces se establece un equilibrio dinámico por lo cual el modulador se equilibra entre el plasma y el interior de la célula. Como resultado del equilibrio, los tiempos de residencia intracelular y las concentraciones de muchos moduladores de enzimas y receptores intracelulares son muy bajos frecuentemente, especialmente en casos donde el modulador es evacuado rápidamente del plasma. Por lo tanto, las potencias de los moduladores son pobres a pesar de sus altas afinidades de enlace por la enzima o receptor objetivo. Por lo tanto, seria deseable si estuviera disponible un método para incrementar la concentración intracelular de un modulador dado de una enzima o receptor intracelular. Esto daria por resultado una potencia incrementada y al prolongar la residencia del modulador dentro de la célula daria por resultado propiedades far acocinéticas y farmacodinámicas mejoradas. Se lograrla una exposición más consistente y frecuencias de dosificación reducidas. Un beneficio adicional podría obtenerse si el fármaco pudiera dirigirse a las células objetivo especificas que son responsables de su acción terapéutica, reduciendo la exposición sistémica y por lo tanto los efectos secundarios.
Breve Descripción de la Invención Esta invención proporciona este método y describe moduladores mejorados que incorporan los principios estructurales sobre los cuales se basa el método. Toma ventaja del hecho que las moléculas lipófilas (baja polaridad o carga neutra) pasan a través de la membrana celular y entran a las células de manera relativamente fácil y las moléculas hidrófilas (polaridad más alta, cargadas) no lo hacen. Por lo tanto, si una configuración lipófila es atraída a un modulador dado, permitiendo que el modulador entre a la célula, y si esa configuración se convierte en la célula a una configuración de polaridad más alta, se debe esperar que el modulador con la configuración de polaridad más alta unida se acumule dentro de la célula. A condición de que esta configuración se una al modulador de una manera que no altere su modo de enlace con la enzima o receptor objetivo, se espera por lo tanto que la acumulación del modulador con la configuración de polaridad más alta unida de por resultado una actividad prolongada y/o incrementada. La presente invención hace uso del hecho que existen enzimas carboxilesterasa dentro de las células, las cuales se pueden utilizar para hidrolizar una configuración de éster de alfa-aminoácido unida a un modulador dado al ácido precursor. Por lo tanto, un modulador puede administrarse como un conjugado covalente con un éster de alfa-aminoácido, forma en la cual entra fácilmente a la célula donde es hidrolizado eficientemente por una o más carboxilesterasas intracelulares y el conjugado de alfa-a inoácido-modulador resultante se acumula dentro de la célula, incrementando la potencia total y/o tiempo de residencia activa. También se ha descubierto que por medio de la modificación de la configuración de alfa-aminoácido o la forma en la cual se conjuga, los modulares pueden dirigirse a monocitos y macrófagos. En este documento, a menos que se especifique "monocito" o "monocitos", el término macrófago o macrófagos se utilizara para designar macrófagos (inclusive macrófagos asociados con tumores) y/o monocitos.
Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 muestra la expresión de carboxilesterasas humanas en diferentes lineas celulares (cuyo titulo es "Cuantificacion absoluta de la expresión de carboxilesterasas humanas"). La Figura 2 muestra a (2 G = N) acoplado en DHFR y un punto de unión de la configuración de esterasa.
Descripción Detallada de la Invención Por lo tanto en un aspecto amplio, la presente invención proporciona un conjugado covalente de un éster de alfa-aminoácido y un modulador de la actividad de una enzima o receptor intracelular objetivo, en donde: el grupo éster del conjugado es hidrolizable por una o más enzimas carboxilesterasa intracelulares al ácido correspondiente; y el éster de alfa-aminoácido se une covalentemente al modulador en una posición remota de la interfaz de enlace entre el modulador y la enzima o receptor objetivo y/o se conjuga al modulador de tal manera que el modo de enlace del modulador conjugado y el ácido correspondiente a la enzima o receptor objetivo es el mismo que aquel del modulador no conjugado. Analizada de otra manera, la invención proporciona un método para incrementar o prolongar la potencia intracelular y/o tiempo de residencia de un modulador de la actividad de una enzima o receptor intracelular objetivo que comprende una modificación estructural del modulador por medio de la unión covalente al mismo de un éster de alfa-aminoácido en una posición remota de la interfaz de enlace entre el modulador y la enzima o receptor objetivo y/o de tal manera que el modo de enlace del modulador conjugado y el ácido correspondiente a la enzima o receptor objetivo sea el mismo que aquel del modulador no conjugado, el grupo éster del conjugado es hidrolizable por una o más enzimas carboxilesterasa intracelulares al ácido correspondiente. Como se establece, la invención está relacionada con la modificación de moduladores de enzimas o receptores intracelulares. Aunque el principio de la invención es de aplicación general, no estando restringido por la identidad química del modulador o la identidad de la enzima o receptor objetivo, se prefiere contundentemente que el modulador sea uno que ejerza su efecto por medio del enlace reversible a la enzima o receptor objetivo, opuesto a aquellos cuyo efecto es debido al enlace covalente a la enzima o receptor objetivo. Puesto que para la utilidad práctica se requiere que el conjugado hidrolizado por carboxilesterasa retenga la actividad de enlace intracelular del modulador precursor con su enzima o receptor objetivo, la unión de la configuración de éster debe tener en cuenta ese requerimiento, el cual será satisfecho si la configuración de alfa-aminoácido-éster de carboxilesterasa se une al modulador de tal manera que el modo de enlace del producto de hidrólisis de carboxilesterasa correspondiente (es decir el ácido correspondiente) al objetivo sea esencialmente el mismo que el modulador no conjugado. En general, esto se logra por medio de la unión covalente de la configuración de éster de carboxilesterasa al modulador en una posición alejada de la interfaz de enlace entre el modulador y la enzima o receptor objetivo. De esta manera, la configuración está ordenada para extenderse en el solvente, preferiblemente que interferir potencialmente con el modo de enlace. Además, la configuración de aminoácido-carboxilesterasa debe ser obviamente un substrato para la carboxilesterasa si el primero debe ser hidrolizado por la última dentro de la célula. Las carboxilesterasas intracelulares son preferiblemente promiscuas en general, en cuanto a que su capacidad para hidrolizarse no depende de requerimientos estructurales muy estrictos del substrato de éster de aminoácido. Por lo tanto, la mayoría de modos de conjugación covalente de la configuración de ammoácido-carboxilesterasa a un modulador permitirá la hidrólisis. La unión por medio de una cadena conectora flexible será usualmente como se logra esto. Se apreciará que cualquier modificación química de un fármaco puede alterar sutilmente su geometría de enlace y la estrategia química para la unión de la configuración de éster de carboxilesterasa puede introducir interacciones de enlace adicionales con el objetivo o puede sustituirse por una o más interacciones de ese tipo. Por lo tanto, el requerimiento que el modo de enlace del conjugado hidrolizado al objetivo sea el mismo que el modulador no conjugado debe interpretarse como el requerimiento que no exista una perturbación significativa del modo de enlace, en otras palabras que el modo de enlace sea esencialmente el mismo que aquel del modulador no conjugado. Cuando se satisface el requerimiento, se retienen las características de enlace principales del modulador precursor y los moduladores modificados y no modificados tienen un conjunto común, total de características de enlace. Los puntos de vista "el mismo modo de enlace" y "unión alejada" son similares debido a que, como se estableciera anteriormente, la forma usual para lograr el requerimiento de "el mismo modo de enlace" es unir la configuración de carboxilesterasa en un punto en la molécula del modulador que esté alejado de la interfaz de enlace entre el inhibidor y la enzima o receptor objetivo. Sin embargo, se debe observar que esos requerimientos no implican que el conjugado y/o su ácido correspondiente deban tener la misma potencia moduladora in vi tro o in vivo que el modulador precursor. En general, sin embargo, se prefiere que el ácido carboxilico hidrolizado por esterasa tenga una potencia en un ensayo de enlace de enzimas o receptores in vi tro no menor que un décimo de la potencia del modulador precursor en ese ensayo y que el éster tenga una potencia en un ensayo de actividad celular al menos tan alta como aquella del modulador precursor en el mismo ensayo. Aunque los métodos de química medicinal tradicionales para cartografiar las relaciones de estructura-actividad son perfectamente capaces de identificar una estrategia de unión para satisfacer los requerimientos anteriores de "el mismo modo de enlace" y "la unión alejada", las técnicas modernas tales como RMN y cristalografía de rayos X han avanzado al punto donde es muy común para que el modo de enlace de un modulador conocido de una enzima o receptor sea conocido o determinable . Esta información está en la gran mayoría de los casos en el dominio público o puede modelarse utilizando métodos de modelaje basados en computadora tales como acoplamiento de ligandos y modelaje de homología, basados en los modos de enlace conocidos de moduladores estructuralmente similares o la estructura conocida del sitio activo de la enzima o receptor objetivo. Con el conocimiento del modo de enlace del modulador obtenido por medio de esas técnicas, se puede identificar una ubicación adecuada para la unión de la configuración de éster de carboxilesterasa, usualmente (como se estableciera anteriormente) en un punto en el modulador el cual está alejado de la interfaz de enlace entre el inhibidor y la enzima o receptor objetivo. Las enzimas carboxilesterasas intracelulares que son capaces de hidrolizar el grupo éster del alfa-aminoácido conjugado al ácido correspondiente incluyen los tres isotipos de enzimas carboxilesterasas humanas conocidas ("hCE") hCE-1 (también conocida como CES-1), hCE-2 (también conocida como CES-2) y hCE-3 (Drug Disc. Today 2005, 10, 313-325). Aunque se considera que éstas son las enzimas principales otras enzimas de carboxiléster tales como bifenilhidrolasa (BPH) también pueden tener un papel en la hidrólisis de los conjugados.
El ensayo de células rotas descrito posteriormente es un método simple para confirmar que un conjugado dado de modulador y ester de alfa-aminoácido o un éster de alfa-ammoácido dado que se valora como una posible configuración de éster de carboxilesterasa, es hidrolizado como se requiere. Estas enzimas también pueden expresarse fácilmente utilizando técnicas recombinantes y las enzimas recombinantes pueden utilizarse para determinar o confirmar que ocurre la hidrólisis . Una característica de la invención es que el conjugado deseado retiene la configuración de alfa-aminoácido unida covalentemente cuando es hidrolizada por la(s) carboxilesterasa (s ) dentro de la célula, puesto que es el grupo carboxilo polar de esa configuración el cual impide o reduce la evacuación del conjugado hidrolizado de la célula y por lo cual contribuye a su acumulación dentro de la célula. En realidad, la potencia celular del modulador modificado es predominantemente debido a la acumulación del ácido y su modulación de la actividad del objetivo (aunque el éster no hidrolizado también ejerce su actividad sobre el objetivo siempre y cuando permanezca no hidrolizado) . Puesto que las células contienen en general varios tipos de enzimas peptidasas, es preferible que el conjugado o más especialmente el conjugado hidrolizado (el ácido correspondiente) no sea un substrato para estas peptidasas.
En particular, se prefiere contundentemente que el grupo éster de alfa-aminoácido no debe ser el elemento C-terminal de una configuración dipeptidica en el conjugado. Sin embargo, fuera de esa limitación sobre el modo de unión covalente, el grupo éster de alfa-aminoácido puede unirse covalentemente al modulador por via de su grupo amino o por via de su átomo de carbono alfa. En algunos casos, el modulador tendrá un punto conveniente de unión para la configuración de éster de carboxilesterasa y en otros casos tendrá que idearse una estrategia de síntesis para su unión. Se ha descubierto que las células que solo expresan las carboxilesterasas hCE-2 y/o hCE-3 y las formas recombinantes de esas enzimas solo hidrolizarán los conjugados de éster de aminoácido a sus ácidos resultantes si el átomo de nitrógeno del grupo de alfa-aminoácido es ya sea no sustituido o se une directamente a un grupo carbonilo, mientras que las células que contienen hCE-1 o hCE-1 recombinante puedan hidrolizar los conjugados de aminoácidos con una amplia gama de grupos en el átomo de nitrógeno. Este requerimiento de selectividad de hCE-2 y hCE-3 puede volverse una ventaja donde se requiere que el modulador debe dirigirse a enzimas o receptores en ciertos tipos de células únicamente. Se ha descubierto que las cantidades relativas de esas tres enzimas carboxilesterasas varian entre los tipos de células (véase la Figura 1 y la base de datos en http: /symatlas . gnf . org/SymAtlas (se debe observar que en esta base de datos hCE-3/CES3 es referida por el símbolo FLJ21736) ) . Si el modulador está propuesto para actuar únicamente en los tipos de células donde se encuentra la hCE-1, la unión de la configuración de éster de carboxilesterasa en donde el grupo amino se une directamente a un grupo diferente de carbonilo da por resultado el conjugado de modulador hidrolizado que se acumula preferentemente en células con concentraciones efectivas de hCE-1. Establecido de otra manera, la acumulación especifica del ácido derivado del conjugado de modulador en células que expresan hCE-1 puede lograrse al unir la configuración de éster de aminoácido al modulador de tal manera que el átomo de nitrógeno del éster de aminoácido no se una directamente a un grupo carbonilo o se deje sin sustituir. Se sabe que los macrófagos juegan un papel clave en trastornos inflamatorios a través de la liberación de citocinas en particular TNFa e IL-1 (van Roon y colaboradores Arthritis and Rheumatism, 2003, 1229-1238). En la artritis reumatoide son contribuyentes principales para la inflamación de articulaciones y la destrucción de articulaciones (Conell en N. Eng J. Med. 2004, 350, 2591-2602). Los macrófagos también están implicados en el crecimiento y desarrollo de tumores (Naldini y Carraro en Curr Drug Targets Inflamm Allergy, 2005, 3-8). Por lo tanto, los agentes que fijen como objetivo de manera selectiva células de macrófagos podrían ser valiosos en el tratamiento del cáncer, inflamación y una enfermedad autoinmune. Se esperarla que la fijación como objetivo de tipos de células específicos condujera a efectos secundarios reducidos. La presente invención hace posible un método para dirigir moduladores a macrófagos, el cual se basa en la observación anterior que la forma en la cual la configuración de éster de carboxilesterasa se une al modulador determina si es hidrolizado por carboxilesterasas especificas y por lo tanto si el ácido resultante se acumula o no en diferentes tipos de células. Específicamente, se ha descubierto que los macrófagos contienen la carboxilesterasa humana hCE-1 mientras que otros tipos de células no la contienen. En los conjugados de la invención, cuando el nitrógeno de la configuración de éster es sustituido pero no se enlaza directamente a un radical de grupo carbonilo el éster solo será hidrolizado por hCE-1 y por lo tanto los conjugados de moduladores hidrolizados por esterasa solo se acumularán en los macrófagos. Por supuesto que existen muchos grupos éster posibles los cuales pueden estar presentes en principio en la configuración de éster de carboxilesterasa para la unión al modulador. Del mismo modo, existen muchos alfa-aminoácidos, tanto naturales como no naturales, que difieren en la cadena lateral en el átomo de carbono alfa, los cuales se pueden utilizar como esteres en la configuración de ester de carboxilesterasa . Algunos esteres de alfa-aminoácidos son hidrolizados rápidamente por uno o mas de los isotipos o células de hCE-1, -2 y -3 que contienen estas enzimas, mientras que otros son hidrolizados mas lentamente o son hidrolizados únicamente a un grado muy pequeño. En general, si la carboxilesterasa hidroliza el éster de aminoácido libre al ácido precursor, sujeto a la dependencia de N-carbonilo de hCE-2 y hCE-3 abordados anteriormente, también hidrolizará la configuración ester cuando sea conjugada covalentemente al modulador. Por lo tanto, el ensayo de células rotas y/o el ensayo de carboxilesterasa aislada descritos en este documento proporcionan una primera selección directa, rápida y simple para esteres los cuales tienen el perfil de hidrólisis requerido. Las configuraciones de ester seleccionadas de esta manera entonces pueden someterse a ensayo nuevamente en el mismo ensayo de carboxilesterasa cuando se conjugan al modulador por via de la química de conjugación seleccionada, para confirmar que es aun un substrato de carboxilesterasa en ese ambiente. Los tipos adecuados de ester serán abordados posteriormente, pero en este punto se puede mencionar que se ha descubierto que los esteres t-butilicos de alfa-ammoacidos son substratos relativamente pobres para hCE-1, -2 y -3, mientras que los esteres ciclopentilicos son hidrolizados de manera efectiva.
Los alfa-aminoácidos adecuados también serán abordados con mayor detalle posteriormente, pero en este punto se puede mencionar que la fenilalanina, homofenilalanina, fenilglicina y leucina son adecuadas generalmente y se prefieren los esteres de alcoholes secundarios. Como se estableciera anteriormente, el éster de alfa-aminoácido puede conjugarse al modulador por via del grupo amino del éster de aminoácido o por via del átomo de carbono alfa (por ejemplo a través de su cadena lateral) del éster de aminoácido. Un radical conector puede estar presente entre la configuración de éster de carboxilesterasa y el modulador. Por ejemplo, el éster de alfa-aminoácido puede conjugarse al modulador como un radical de la fórmula (IA), (IB) o (IC) : en donde Y1 (Alq3)s Ri es un grupo éster el cual es hidrolizable por una o más enzimas carboxilesterasa intracelulares a un grupo de ácido carboxilico; R2 es la cadena lateral de un alfa-aminoácido natural o no natural; R4 es hidrógeno; o alquilo de 1 a 6 átomos de carbono sustituido opcionalmente, cicloalquilo de 3 a 7 átomos de carbono, arilo o heteroarilo o (C=0)R3, -(C=0)OR3 o -(C=0)NR3 en donde R3 es hidrógeno o alquilo de 1 a 6 átomos de carbono sustituido opcionalmente; B es un anillo heterociclico monociclico de 5 o 6 átomos que forman el anillo en donde Ri se une a un átomo de carbono del anillo adyacente al átomo de nitrógeno del anillo mostrado y el anillo B es fusionado opcionalmente a un segundo anillo carbociclico o heterociclico de 5 o 6 átomos que forman el anillo caso en el cual el enlace a L puede ser de un átomo del anillo en el segundo anillo Y es un enlace, -C(=0)- -S(=0)2-, -C(=0)0-, -C(=0)NR3-, -C(=S)-NR3-, -C(=NH)NR3- o -S(=0)2NR3- en donde R3 es hidrógeno o alquilo de 1 a 6 átomos de carbono sustituido opcionalmente; Y1 es un enlace, -(C=0)-, -S(02)-, -C{=0)0-, -OC(=0)-, -(C=0)NR3-, -NR3(C=0)-, -S(02)NR3-, -NR3S(02)- O -NR3 (C=0) NR5-, en donde R3 y R5 son independientemente hidrógeno o alquilo de 1 a 6 átomos de carbono sustituido opcionalmente, L es un radical divalente de la fórmula - (Alq1) m (Q) n (Alq2) p-en donde m, n y p son independientemente 0 o 1, Q es (i) un radical carbociclico o heterociclico, mono- o biciclico divalente, sustituido opcionalmente que tiene 5 - 13 miembros que forman el anillo o (ii), en el caso donde tanto m como p son 0, un radical divalente de la fórmula -X2-Q1- o -Qx-X2- en donde X2 es -O-, -S- o NRA- en donde RA es hidrógeno o alquilo de 1 a 3 átomos de carbono sustituido opcionalmente y Q1 es un radical carbociclico o heterociclico, mono- o biciclico, divalente, sustituido opcionalmente que tiene 5 - 13 miembros que forman el anillo, Alq1 y Alq2 representan independientemente radicales cicloalquilo de 3 a 7 átomos de carbono divalentes sustituidos opcionalmente o radicales alquileno de 1 a 6 átomos de carbono, alquenileno de 2 a 6 átomos de carbono o alquinileno de 2 a 6 átomos de carbono de cadena recta o ramificada sustituidos opcionalmente los cuales pueden contener o terminar opcionalmente en una conexión de éter (-0-), tioéter (-S-) o amino (-NRA-) en donde RA es hidrógeno o alquilo de 1 a 3 átomos de carbono sustituido opcionalmente; X representa un enlace, -C(=0)-; -S(=0)2-; -NR3C(=0)-, -C(=0)NR3-, -NR3C(=0)NR5-, -NR3S(=0)2- o -S(=0)2NR3- en donde R3 y R5 son independientemente hidrógeno o alquilo de 1 a 6 átomos de carbono sustituido opcionalmente; z es 0 o 1; s es O o 1; y Alq3 representa un radical cicloalquilo de 3 a 7 átomos de carbono divalente sustituido opcionalmente o un radical alquileno de 1 a 6 átomos de carbono, alquenileno de 2 a 6 átomos de carbono o alquinileno de 2 a 6 átomos de carbono de cadena recta o ramificada sustituido opcionalmente el cual puede contener o terminar opcionalmente en una conexión de éter (-0-), tioéter (-S-) o amino (-NR-) en donde RA es hidrógeno o alquilo de 1 a 3 átomos de carbono sustituido opcionalmente; El término "éster" o "grupo carboxilo esterificado" significa un grupo RgO(C=0)- en el cual Rg es el grupo que caracteriza el éster, derivado idealmente del alcohol R9OH . Como se utiliza en este documento, el término "alquilo de a a b átomos de carbono" en donde a y b son números enteros se refiere a un radical alquilo de cadena recta o ramificada que tiene de a a b átomos de carbono. De esta manera, cuando a es 1 y b es 6, por ejemplo, el término incluye metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, t-butilo, n-pentilo y n-hexilo. Como se utiliza en este documento, el término "radical alquileno de a a b átomos de carbono divalente" en donde a y b son números enteros se refiere a una cadena de hidrocarburo saturada que tiene de a a b átomos de carbono y dos valencias no satisfechas.
Como se utiliza en este documento, el término "alquenilo de a a b átomos de carbono" en donde a y b son números enteros se refiere a un radical alquenilo de cadena recta o ramificada que tiene de a a b átomos de carbono que tiene al menos un enlace doble de una estereoquímica ya sea E o Z donde sea aplicable. El término incluye, por ejemplo, vinilo, alilo, 1- y 2-butenilo y 2-metil-2-propenilo . Como se utiliza en este documento, el término "radical alquenileno de a a b átomos de carbono divalente" significa una cadena de hidrocarburo que tiene de a a b átomos de carbono, al menos un enlace doble y dos valencias no satisfechas. Como se utiliza en este documento, el término "alquinilo de a a b átomos de carbono en donde a y b son números enteros se refiere a grupos de hidrocarburo de cadena recta o cadena ramificada que tienen de dos a seis átomos carbono y que tienen además un enlace triple. Este término incluirla por ejemplo etinilo, 1-propinilo, 1- y 2-butinilo, 2-metil-2-propinilo, 2-pentinilo, 3-pentinilo, 4-pentinilo, 2-hexinilo, 3-hexinilo, 4-hexinilo y 5-hexinilo. Como se utiliza en este documento, el término "radical alquinileno de a a b átomos de carbono divalente" en donde a y b son números enteros se refiere a una cadena de hidrocarburo divalente que tiene de 2 a 6 átomos de carbono y al menos un enlace triple.
Como se utiliza en este documento, el término "carbociclico" se refiere a un radical mono-, bi- o triciclico que tiene hasta 16 átomos que forman el anillo, todos los cuales son carbono e incluye arilo y cicloalquilo. Como se utiliza en este documento, el término "cicloalquilo" se refiere a un radical carbociclico, saturado, monociclico que tiene de 3 a 8 átomos de carbono e incluye, por ejemplo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciciohexilo, cicioheptilo y ciclooctilo. Como se utiliza en este documento, el término no calificado "arilo" se refiere a un radical aromático, carbociclico, mono-, bi- o tri-ciclico e incluye radicales que tienen dos anillos aromáticos, carbociclicos, monociclicos los cuales se unen directamente por medio de un enlace covalente. Los ejemplos ilustrativos de estos radicales son fenilo, bifenilo y naftilo. Como se utiliza en este documento, el término no calificado "heteroarilo" se refiere a un radical aromático, mono-, bi- o tri-ciclico que contiene uno o más heteroátomos seleccionados de S, N y O, e incluye radicales que tienen dos anillos monociclicos de ese tipo o un anillo monociclico de ese tipo y un anillo de arilo monociclico, los cuales se unen directamente por medio de un enlace covalente. Los ejemplos ilustrativos de radicales de ese tipo son tienilo, benztienilo, furilo, benzfurilo, pirrolilo, imidazolilo, bencimidazolilo, tiazolilo, benztiazolilo, isotiazolilo, benzisotiazolilo, pirazolilo, oxazolilo, benzoxazolilo, isoxazolilo, benzisoxazolilo, isotiazolilo, triazolilo, benztriazolilo, tiadiazolilo, oxadiazolilo, piridinilo, piridazinilo, pirimidinilo, pirazinilo, triazinilo, indolilo e indazolilo. Como se utiliza en este documento, el término no calificado "heterociclilo" o "heterociclico" incluye "heteroarilo" como se definiera anteriormente y en su significado no aromático se refiere a un radical no aromático, mono-, bi- o tri-ciclico que contiene uno o más heteroátomos seleccionados de S, N y O y a grupos que contienen un radical no aromático, monociclico que contiene uno o más heteroátomos de ese tipo el cual se une covalentemente a otro radical de ese tipo o a un radical carbociclico monociclico. Los ejemplos ilustrativos de radicales de ese tipo son los grupos pirrolilo, furanilo, tienilo, piperidinilo, imidazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, tiazolilo, tiadiazolilo, pirazolilo, piridinilo, pirrolidinilo, pirimidinilo, morfolinilo, piperazinilo, indolilo, morfolinilo, benzfuranilo, piranilo, isoxazolilo, bencimidazolilo, metilendioxifenilo, etilendioxifenilo, maleimido y succinimido. A menos que se especifique de otra manera en el contexto en el cual aparece, el término "sustituido" aplicado a cualquier radical en este documento significa sustituido por hasta cuatro sustituyentes compatibles, cada uno de los cuales puede ser independientemente, por ejemplo, alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 6 átomos de carbono, hidroxi, hidroxi-alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, mercapto, mercapto-alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, alquiltio de 1 a 6 átomos de carbono, fenilo, halo (que incluye fluoro, bromo y cloro) , trifluorometilo, trifluorometoxi, nitro, nitrilo (-CN), oxo, -COOH, -COORA, -CORA, -S02RA, -CONH2, -S02NH2, -CONHRA, -S02NHRA, -CONRARB, -S02NRARB, -NH2, -NHRA, -NRARB, -OCONH , -OCONHRA, -OCONRARB, -NHCORA, -NHCOORA, -NRBCOORA, -NHS02ORA, -NRBS02OH, -NRBS02ORA, -NHCONH2, -NRACONH , -NHCONHRB, -NRACONHRB, -NHCONRARB o -NRACONRARB en donde RA y RB son independientemente un grupo alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, cicloalquilo de 3 a 6 átomos de carbono, fenilo o heteroarilo monociclico que tiene 5 o 6 átomos que forman el anillo. Un "sustituyente opcional" puede ser uno de los grupos sustituyentes anteriores. El término "cadena lateral de un alfa-aminoácido natural o no natural" se refiere al grupo R1 en un aminoácido natural o no natural de la fórmula NH2-CH (R1) -COOH . Los ejemplos de cadenas laterales de alfa-aminoácidos naturales incluyen aquellas de alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteina, cistina, ácido glutámico, histidina, 5-hidroxilisina, 4-hidroxiprolina, ísoleucma, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolma, sepna, treomna, triptófano, tirosina, valina, ácido a-ammoadipico, acido a-ammo-n-butipco, 3,4-dihidroxifenilalanina , homoserma, a-metilserma, ornitma, ácido pipecólico y tiroxina. Los alfa-ammoacidos naturales que contienen sustituyentes funcionales, por ejemplo grupos amino, carboxilo, hidroxi, mercapto, guanidilo, ímidazolilo o indolilo en sus cadenas laterales característica incluyen argimna, lisma, acido glutamico, ácido aspartico, triptófano, histidma, sepna, treonina, tirosma y cisteina. Cuando R2 en los compuestos de la invención es una de esas cadenas laterales, el sustituyente funcional puede protegerse opcionalmente . El termino "protegido" cuando se utiliza con relación a un sustituyente funcional en una cadena lateral de un alfa-aminoacido natural significa un derivado de este sustituyente el cual no es funcional sustancialmente . Por ejemplo, los grupos carboxilo pueden esterificarse (por ejemplo como un ester alquilico de 1 a 6 átomos de carbono), los grupos amino pueden convertirse a amidas (por ejemplo como una amida de NHCOC-alquilo de 1 a 6 átomos de carbono) o carbamatos (por ejemplo, como un NHC (=0) O-alquilo de 1 a 6 átomos de carbono o carbamato de NHC (=0) 0CH2Ph) , los grupos hidroxilo pueden convertirse a éteres (por ejemplo un éter 0-alquilico de 1 a 6 átomos de carbono o un éter 0 (alquil C?~ Cg)fenilico o esteres (por ejemplo un éster OC (=0) -alquilico de 1 a 6 átomos de carbono) y los grupos tiol pueden convertirse a tioéteres (por ejemplo un tioéter terc-butilico o bencílico) o tioésteres (por ejemplo un tioéster SC(=0)-alquilico de 1 a 6 átomos de carbono) . Los ejemplos de cadenas laterales de alfa-aminoácidos no naturales incluyen aquellos referidos posteriormente en la descripción de los grupos R2 adecuados para el uso en los compuestos de la presente invención.
El grupo éster Rj Además del requerimiento que el grupo éster debe ser hidrolizable por una o más enzimas intracelulares, puede ser preferible para algunas aplicaciones (por ejemplo para la administración sistémica del conjugado) que sea resistente a la hidrólisis por enzimas que hidrolizan el carboxiléster en el plasma, puesto que esto asegura que el modulador conjugado sobrevivirá después de la administración sistémica durante tiempo suficiente para penetrar las células como el éster. Es una cuestión simple someter a prueba cualquier conjugado dado para medir su vida media en el plasma como el éster, por medio de la incubación en plasma. Sin embargo, se ha descubierto que los esteres derivados idealmente de alcoholes secundarios son más estables hacia las enzimas que hidrolizan el carboxiléster del plasma que aquellos derivados de alcoholes primarios. Además, también se ha descubierto que aunque los esteres derivados idealmente de alcoholes terciarios son estables generalmente hacia las enzimas que hidrolizan el carboxiléster del plasma, con frecuencia éstos también son relativamente estables hacia las carboxilesterasas intracelulares. Tomando en cuenta esos descubrimientos, se prefiere actualmente que Ri en las fórmulas (IA), (IB) y (IC) anteriores sea un grupo éster de la fórmula -(C=0)ORg en donde R9 es (i) R7R8CH- en donde R7 es alquil- (C?~C3) - (Z1) a-alquilo de 1 a 3 átomos de carbono sustituido opcionalmente o alquenil (C2-C ) - (Z1) a-alquilo de 1 a 3 átomos de carbono en donde a es 0 o 1 y Z1 es -O-, -S- o -NH- y Re es hidrógeno o alquilo de 1 a 3 átomos de carbono o R7 y Rs tomados junto con el átomo de carbono al cual están unidos forman un anillo de cicloalquilo de 3 a 7 átomos de carbono sustituido opcionalmente o un anillo heterociclico sustituido opcionalmente de 5 o 6 átomos que forman el anillo; o (ii) fenilo sustituido opcionalmente o un anillo heterociclico monociclico que tiene 5 o 6 átomos que forman el anillo. Dentro de estas clases, R9 puede ser, por ejemplo, metilo, etilo, n- o iso-propilo, n- o sec-butilo, ciciohexilo, alilo, fenilo, bencilo, 2-, 3- o 4- piridilmetilo, N-metilpiperidin-4-ilo, tetrahidrofuran-3-ilo o metoxietilo. Actualmente se prefiere donde Rg es ciclopentilo.
La cadena la tera l de aminoácido R Sujeta a la condición que el grupo éster Ri sea hidrolizable por las enzimas carboxilesterasas intracelulares, la selección del grupo de cadena lateral R2 puede determinar la proporción de hidrólisis. Por ejemplo, cuando el átomo de carbono en R2 adyacente al átomo de carbono del alfa-aminoácido no contiene una ramificación por ejemplo cuando R2 es etilo, isobutilo o bencilo el éster es hidrolizado más fácilmente que cuando R2 es ramificado por ejemplo isopropilo o t-butilo. Los ejemplos de cadenas laterales de aminoácidos incluyen grupos alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, fenilo, 2-, 3- o 4-hidroxifenilo, 2-, 3- o 4-metoxifenilo, 2-, 3- o 4-piridilmetilo, bencilo, feniletilo, 2-, 3- o 4-hidroxibencilo, 2-, 3- o 4-benciloxibencilo, 2-, 3- o 4-alcoxibencilo de 1 a 6 átomos de carbono y benciloxi-alquilo de 1 a 6 átomos de carbono; el grupo característico de un aminoácido a natural, en el cual se puede proteger cualquier grupo funcional; los grupos -[Alq]nR6 donde Alq es un grupo alquilo de 1 a 6 átomos de carbono o alquenilo de 2 a 6 átomos de carbono interrumpido opcionalmente por uno o más átomos de -O- o -S-o grupos -N(R7)- [donde R7 es un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo de 1 a 6 a átomos de carbono] , n es 0 o 1 y R6 es un grupo cicloalquilo o cicloalquenilo sustituido opcionalmente ; un grupo bencilo sustituido en el anillo de fenilo por un grupo de la formula -OCH2COR3 donde R8 es hidroxilo, auno, alcoxi de 1 a 6 átomos de carbono, fenil-alcoxi de 1 a 6 átomos de carbono, alquilammo de 1 a 6 átomos de carbono, di (alquil (C?-C6) ) amino, fenil-alquilammo de 1 a 6 átomos de carbono, el residuo de un aminoácido o haluro ácido, derivado de éster o amida del mismo, el residuo que está unido por via de un enlace de amida, el aminoácido que se selecciona de glicina, a o ß alanina, valma, leucina, isoleucina, fenilalamna, tirosina, triptofano, sepna, treomna, cisteina, metiomna, asparagina, glutamina, lisma, histidma, argmina, ácido glutámico y ácido aspártico; un grupo alquilo de 1 a 6 átomos de carbono heterociclico, que es ya sea no sustituido o mono- o di-sustituido en el anillo heterociclico por halo, nitro, carboxi, alcoxi de 1 a 6 átomos de carbono, ciano, alcanoilo de 1 a 6 átomos de carbono, trifluorometil-alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, hidroxi, formilo, amino, alquilammo de 1 a 6 átomos de carbono, di-alquilamino de 1 a 6 átomos de carbono, mercapto, alquiltio de 1 a 6 átomos de carbono, hidroxi-alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, mercapto-alquilo de 1 a 6 átomos de carbono o alquilfenilmetilo de 1 a 6 átomos de carbono; y un grupo -CRaRbRc en el cual: cada uno de Ra, Rb y Rc es independientemente hidrogeno, alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, alquenilo de 2 a 6 átomos de carbono, alquinilo de 2 a 6 átomos de carbono, fenil-alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, cicloalquilo de 3 a 8 átomos de carbono; o Rc es hidrógeno y Ra y Rb son independientemente fenilo o heteroarilo tal como piridilo; o Rc es hidrógeno, alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, alquenilo de 2 a 6 átomos de carbono, alquinilo de 2 a 6 átomos de carbono, fenil-alquilo de 1 a 6 átomos de carbono o cicloalquilo de 3 a 8 átomos de carbono, y Ra y Rb junto con el átomo de carbono al cual están unidos forman un anillo de cicloalquilo de 3 a 8 miembros o un anillo heterociclico de 5 a 6 miembros; o Raí R y Rc junto con el átomo de carbono al cual están unidos forman un anillo triciclico (por ejemplo adamantilo) ; o Ra y Rb son cada uno independientemente alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, alquenilo de 2 a 6 átomos de carbono, alquinilo de 2 a 6 átomos de carbono, fenil-alquilo de 1 a 6 átomos de carbono o un grupo definido para Rc posteriormente diferente de hidrógeno o Ra y Rb junto con el átomo de carbono al cual están unidos forman un anillo de cicloalquilo o heterociclico y Rc es hidrógeno, -OH, -SH, halógeno, -CN, -C02H, perfluoroalquilo de 1 a 4 átomos de carbono, -CH20H, -CO?-alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, -O-alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, -O-alquenilo de 2 a 6 átomos de carbono, -S-alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, -S0-alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, -S02-alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, -S-alquenilo de 2 a 6 átomos de carbono, -SO-alquenilo de 2 a 6 átomos de carbono, S02-alquenilo de 2 a 6 átomos de carbono o un grupo -Q-W en donde Q representa un enlace o -0-, -S-, -SO- o -S02- y W representa un grupo fenilo, fenilalquilo, cicloalquilo de 3 a 8 átomos de carbono, cicloalquilalquilo de 3 a 8 átomos de carbono, cicloalquenilo de 4 a 8 átomos de carbono, cicloalquenilalquilo de 4 a 8 átomos de carbono, heteroarilo o heteroarilalquilo, el grupo W que puede ser sustituido opcionalmente por uno o más sustituyentes seleccionados independientemente de hidroxilo, halógeno, -CN, -C02H, -C02-alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, -C0NH2, -CONH-alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, -CONH (alquilo C?-C6)2, -CHO, -CH2OH, perfluoroalquilo de 1 a 4 átomos de carbono, -O-alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, -S-alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, -SO-alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, -S02-alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, -N02, -NH2, -NH-alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, -N- (alquilo d-C6)2, -NHCO-alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, alquenilo de 2 a 6 átomos de carbono, alqumilo de 2 a 6 átomos de carbono, cicloalquilo de 3 a 8 átomos de carbono, cicloalquenilo de 4 a 8 átomos de carbono, fenilo o bencilo. Los ejemplos de grupos R2 particulares incluyen bencilo, fenilo, ciclohexilmetilo p?r?dm-3-ilmet?lo terc-butoximetilo, iso-butilo, sec-butilo, tere-butilo, 1-benc?lt?o-1-met?let?lo, 1-met?lt?o-l-met?let lo y 1-mercapto- 1-met?let?lo, feniletilo. Los grupos R2 actualmente preferidos incluyen fenilo, bencilo, terc-butoximetilo, feniletilo e iso-butilo.
El grupo R4 Como se mencionara anteriormente, si se propone que el modulador actúa únicamente en tipos de células donde la hCE-1 esta presente tales como macrófagos, el grupo ammo de la configuración de éster de carboxilesterasa debe ser sustituido de tal manera que se una directamente a un grupo diferente de carbonilo. En casos de ese tipo, R4 puede ser alquilo de 1 a 6 átomos de carbono sustituido opcionalmente, cicloalquilo de 3 a 7 átomos de carbono, arilo o heteroarilo, por ejemplo metilo, etilo, n- o iso-propilo, ciclopropilo, ciclopentilo, ciclohexilo, fenilo o piridilo. En casos donde no se requiere la especificidad hacia los macrófagos, R4 puede ser H, -(CO)R3, -(C=0)0R3 o -(C=0)NR3 en donde R3 es hidrógeno o alquilo de 1 a 6 átomos de carbono sustituido opcionalmente, por ej emplo metilo, etilo o n- o iso-propilo y CH2CH2OH .
El anillo o sis temas de ani ll os B El anillo o sistema de anillos B puede ser uno seleccionado de, por ej emplo, los siguientes : El radical -Y-L-X- [CH2] z- Cuando el éster de alfa-aminoácido se conjuga al inhibidor como un radical de la fórmula (IA) este radical (o enlace) surge de la estrategia química particular seleccionada para unir la configuración de éster de aminoácido R?CH(R2)NH- al modulador. Claramente la estrategia química para ese acoplamiento puede variar ampliamente y de esta manera son posibles muchas combinaciones de las variables Y, L, X y z. También se debe observar que los beneficios de la configuración de éster de aminoácido-carboxilesterasa descrita anteriormente (facilitan la entrada en la célula, la hidrólisis de carboxilesterasa dentro de la célula y la acumulación dentro de la célula del producto de la hidrólisis activa de ácido carboxilico) se alcanzan mejor cuando la unión entre la configuración de éster de aminoácido y el modulador no es un substrato para la actividad de peptidasa dentro de la célula, lo cual podria dar por resultado la escisión del aminoácido de la molécula. Por supuesto que la estabilidad para las peptidasas intracelulares se somete a prueba fácilmente al incubar el compuesto con contenidos de células alterados y analizar cualquier escisión de ese tipo. Con las observaciones generales anteriores en mente, tomando las variables que constituyen el radical -Y-L-X- [CH2] z- en turno: z puede ser 0 o 1, de manera que un radical metileno unido al modulador es opcional. Los ejemplos preferidos específicos de Y incluyen un enlace, -(C=0)-, -(C=0)NH- y -(C=0)0-. Sin embargo, para la especificidad hacia hCE-1 cuando el éster de alfa-aminoácido se conjuga al inhibidor como un radical de la fórmula (IA), Y debe ser un enlace. En el radical L, los ejemplos de los radicales Alq1 y Alq2, cuando están presentes, incluyen —CH2-, —CH2CH2-, -CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2-, -CH=CH-, -CH=CHCH2-, -CH2CH=CH-, CH2CH=CHCH2-, -C=C-, -C=CCH2-, CH2C=C- y -CH2C=CCH2. Los ejemplos adicionales de Alq1 y Alq~ incluyen —CH2 -, —CH2CH2W-, -CH2CH2WCH2-, -CH2CH; CH(CH3) -, -CH2WCH2CH2-, -CH2WCH2CH2WCH2- y -WCH2CH2- donde W es -0-, -S-, -NH-, -N(CH3)- o -CH2CH2N(CH2CH2OH)CH2-. Los ejemplos adicionales de Alq1 y Alq2 incluyen los radicales divalentes ciclopropilo, ciclopentilo y ciciohexilo. En L, cuando n es 0, el radical es una cadena de hidrocarburo (sustituida opcionalmente y quizás que tiene una unión de éter, tioéter o amino) . Actualmente se prefiere que no existan sustituyentes opcionales en L. Cuando tanto m como p son 0, L es un radical carbociclico o heterociclico, mono-o biciclico, divalente con 5 - 13 átomos que forman el anillo (sustituidos opcionalmente) . Cuando n es 1 y al menos uno de m y p es 1, L es un radical divalente que incluye una cadena o cadenas de hidrocarburo y un radical carbociclico o heterociclico, mono- o biciclico con 5 - 13 átomos que forman el anillo (sustituidos opcionalmente) . Cuando está presente, Q puede ser, por ejemplo, un radical divalente de fenilo, naftilo, ciclopropilo, ciclopentilo o ciciohexilo o un radical heterociclico mono- o biciclico que tiene de 5 a 13 miembros que forman el anillo, tal como un radical piperidinilo, piperazinilo, indolilo, piridilo, tienilo o pirrolilo, pero actualmente se prefiere 1, -fenileno . Específicamente, en algunas modalidades de la invención, m y p pueden ser 0 con n siendo 1. En otras modalidades, n y p pueden ser 0 con m siendo 1. En modalidades adicionales, m, n y p pueden ser todos 0. En modalidades aún adicionales m puede ser 0, n puede ser 1 con Q siendo un radical heterociclico, monociclico y p puede ser 0 o 1. Alq1 y Alq2, cuando están presentes, se pueden seleccionar de -CH2-, -CH2CH2- y -CH:CH2CH2- y Q puede ser 1, 4-fenileno. Los ejemplos específicos del radical -Y-L-X- [CH2] z-incluyen -C(=0)- y -C(=0)NH- asi como también -(CH2)V-, -(CH2)vO-, -C(=0)-(CH2)„-, -C(=0)-(CH2)vO-, -C (=0) -NH- (CH2) „-, -C(=0)-NH-(CH2)w0- en donde v es l, 2, 3 o 4 y w es 1, 2 o 3, tal como -CH2-, -CH20-, -C(=0)-CH2-, -C(=0)-CH20-, -C (=0) -NH-CH2- y -C(=0)-NH-CH20-.
El radical -L-Y1- Cuando el éster de alfa-aminoácido se conjuga al inhibidor como un radical de la fórmula (IB) este radial (o enlace) surge de la estrategia química particular seleccionada para unir el átomo de carbono alfa de la configuración de éster de aminoácido en la fórmula (IB) o (IC) al modulador. (En el último caso, el radical -L-Y1- se une indirectamente al átomo de carbono alfa a través de los átomos intermedios que forman el anillo del sistema de anillos B) . Claramente, la estrategia química para ese acoplamiento puede variar ampliamente y de esta manera son posibles muchas combinaciones de las variables L e Y1. Por ejemplo, L puede ser como se describiera anteriormente en el contexto del radical -Y-L-X- [CH2] z~ • Por ejemplo, en algunas modalidades m y n son 1 y p es 0; Q es -0-; y Alq1 es un radical alquileno de 1 a 6 átomos de carbono, alquenileno de 2 a 6 átomos de carbono o alquinileno de 2 a 6 átomos de carbono, de cadena recta o ramificada sustituido opcionalmente el cual puede contener o terminar opcionalmente en una conexión de éter (-0-), tioéter (-S-) o amino (-NRA-) en donde RA es hidrógeno o alquilo de 1 a 4 átomos de carbono sustituido opcionalmente. En otras modalidades, m, n y p pueden ser cada uno 1 y en casos de ese tipo Q puede ser, por ejemplo, un radical 1,4-fenileno o un radical ciclopentilo, ciciohexilo, piperidinilo o piperazinilo. En todas las modalidades, Y1 puede ser, por ejemplo, un enlace o -(C=0)-, -(C=0)NH- y -(C=0)0-. Para los compuestos de la invención los cuales deben administrarse por via sistémica, se prefieren los esteres con una velocidad lenta de escisión de carboxilesterasa, puesto que son menos susceptibles al metabolismo pre-sistémico . Por lo tanto, su capacidad para alcanzar su tejido sistémico intacto se incrementa y el éster puede convertirse dentro de las células del tejido objetivo en el producto ácido. Sin embargo, para la administración local, donde el éster ya sea se aplica directamente al tejido objetivo o se dirige ahi, por ejemplo, por medio de la inhalación, frecuentemente será deseable que el éster tenga una velocidad rápida de escisión de esterasa, para minimizar la exposición sistémica y los efectos secundarios, indeseados, consecuentes. Donde la configuración de esterasa se une al modulador por via de su grupo amino, como en la fórmula (IA) anterior, si el átomo de carbono adyacente al átomo de carbono alfa del éster de alfa-aminoácido es monosustituido, es decir R2 es CH2R" (Rz es el mono-sustituyente) entonces los esteres tienden a escindirse más rápidamente que si ese átomo de carbono fuera di- o tri-sustituido, como en el caso donde R2 es, por ejemplo, fenilo o ciciohexilo. Similarmente, donde la configuración de esterasa se une al modulador por via de un átomo de carbono como en las fórmulas (IB) y (IC) anteriores, si un átomo de carbono al cual se unen las configuraciones de esterasa R4NHCH(R?)- o R?~ (anillo B)- no está sustituido, es decir R4NHCH(R?)- o R?~ (anillo B)- se une a un radical de metileno (-CH2)-, entonces los esteres tienden a escindirse más rápidamente que si el átomo de carbono estuviera sustituido o sea parte de un sistema de anillos tal como un anillo de fenilo o ciciohexilo.
Moduladores de Enzimas y Receptores Intracelulares Los principios de esta invención pueden aplicarse a moduladores de un amplio rango de objetivos intracelulares los cuales están implicados en un amplio rango de enfermedades. Como se describiera, los modos de enlace de moduladores conocidos a sus objetivos se conocen generalmente poco después de que los moduladores mismos se conocen. Además, las técnicas modernas tales como la cristalografía de rayos X y la RMN son capaces de revelar estas topologías y geometrías de enlace, como son los métodos de química medicinal tradicionales de relaciones de estructura-actividad características. Con este conocimiento, es sencillo identificar donde en la estructura de un modulador dado podría unirse una configuración de éster de carboxilesterasa sin interrumpir el enlace del modulador a la enzima o receptor por medio del uso de datos estructurales. Por ejemplo, la Tabla 1 lista algunos objetivos de enzimas o receptores intracelulares donde hay datos publicados de estructuras cristalinas.
Tabla 1 Con el propósito de ilustración, se hace referencia a inhibidores conocidos de 5 de los objetivos intracelulares inferiores, cuyo modo de enlace al objetivo es conocido. Estos ejemplos ilustran como los datos estructurales de ese tipo pueden utilizarse para determinar las posiciones apropiadas para la unión de la configuración de éster de carboxilesterasa. Se muestran las representaciones esquemáticas de los sitios activos junto con los inhibidores representativos. En general, las posiciones alejadas de la interfaz de enlace entre el modulador y el objetivo y por consiguiente que apuntan lejos de la interfaz de enlace de enzimas en solvente son lugares adecuados para la unión de la configuración de éster de carboxilesterasa y esas posiciones se indican en los esquemas de reacción. ESQUEMA DE REACCIÓN I HDAC Grupo de Enlace de Metal ESQUEMA DE REACC IÓN 2 Aurora cinasa ESQUEMA DE REACCIÓN 3 Cinasa PB3 ESQUEMA DE REACCIÓN 4 1AP Cinasa P38 ESQUEMA DE REACCIÓN 5 cmasa Sitio de enlace de adenina Un planteamiento similar también se puede utilizar para los otros ejemplos identificados en la Tabla 1. El método de la invención, para incrementar la potencia celular y/o tiempo de residencia intracelular de un modulador de la actividad de una enzima o receptor intracelular objetivo, puede implicar varios pasos: Paso 1 : Identificar una posición o posiciones en una o una pluralidad de moléculas moduladoras que comparten el mismo modo de enlace para la enzima o receptor objetivo, alejadas de la interfaz de enlace entre los moduladores y la enzima o receptor objetivo. Usualmente, estas posiciones se identifican a partir de la estructura co-cristalina de rayos X (o estructura derivada por medio de la rmn) de la enzima o receptor objetivo con un modulador conocido (o un análogo estructural cercano del mismo) enlazado a la enzima o receptor, por medio de la inspección de la estructura. Alternativamente, la estructura cristalina de rayos X de la enzima o receptor objetivo con el modulador acoplado en el sitio activo de la enzima o receptor se modela por medio de métodos gráficos de computadora y el modelo se inspecciona. La suposición es que la modificación estructural del modulador en posiciones alejadas de la interfaz de enlace es probable que interfiera significativamente con el enlace del modulador al sitio activo de la enzima o receptor. Las posiciones adecuadas aparecerán normalmente a partir de la estructura co-cristalina o modelo acoplado para orientarse hacia el solvente.
Paso 2 : Modificar covalentemente el (los) modulador (es) por medio de la unión de un radical de éster de alfa-aminoácido o un rango de radicales de éster de alfa-aminoácido diferentes en una o más de las posiciones identificadas en el Paso 1. La unión de los radicales de éster de alfa-aminoácido (es decir las configuraciones de carboxilesterasas potenciales) puede ser por via de una funcionalidad de acoplamiento covalente existente en el (los) modulador (es) o por via de una funcionalidad adecuada que es introducida específicamente para ese propósito. Las configuraciones de carboxilesterasa pueden estar separadas del volumen molecular principal por un elemento separador o conector, para colocar la configuración más profunda en el solvente y reducir por lo cual aún adicionalmente cualquier efecto pequeño de la configuración en el modo de enlace del modulador y/o para asegurar que la configuración es accesible a la carboxilesterasa al reducir la interferencia esférica que podría resultar del volumen molecular principal del modulador . El desempeño del Paso 2 da por resultado la preparación de uno o, más usualmente, una pequeña colección de moduladores candidatos, cada uno modificado covalentemente con relación a su inhibidor precursor por medio de la introducción de una variedad de radicales de éster de aminoácido en uno o más puntos de unión identificados en el Paso 1.
Paso 3 : Someter a prueba el (los) modulador (es) conjugado (s) a alfa-aminoácidos preparados en el Paso 2 para determinar su actividad contra la enzima o receptor objetivo. Como es normal en la química medicinal, la(s) versión (es) de configuraciones de carboxilesterasas del (los) modulador (es) precursor, preparados como resultado del desempeño de los Pasos 1 y 2, se someten a prueba preferiblemente en ensayos apropiados para determinar si la retención esperada de la actividad del modulador se ha llevado a cabo de hecho y a que grado y con que perfil de potencia. De acuerdo con el propósito fundamental de la invención, el cual es causar la acumulación de actividad moduladora en células, los ensayos adecuados incluirán normalmente ensayos en lineas celulares para evaluar el grado de actividad celular y perfil de potencia de los moduladores modificados. Otros ensayos que pueden emplearse en el Paso 3 incluyen ensayos de modulación in vitro de enzimas o receptores para determinar la actividad intrínseca del modulador modificado y su producto de hidrólisis de carboxilesterasa putativo; ensayos para determinar la velocidad de conversión de los moduladores modificados al ácido carboxilico correspondiente por las carboxilesterasas; y ensayos para determinar la velocidad y/o nivel de acumulación del producto de hidrólisis de carboxilesterasas (el ácido carboxilico) en las células. En estos ensayos, las células tanto monociticas como no monociticas y/o un panel de carboxilesterasas aisladas se pueden utilizar a fin de identificar compuestos que muestren una selectividad de células . Si es necesario o deseable, el paso 3 se puede repetir con un diferente conjunto de versiones conjugadas a esteres de alfa-aminoácidos candidatas del modulador precursor .
Paso : A partir de los datos adquiridos en el Paso 3, seleccionar una o más de las versiones conjugadas a esteres de alfa-aminoacidos sometidas a prueba del (los) modulador (es) precursor (es) que causan la modulación de la actividad de enzimas o receptores dentro de las células, se convierten a y se acumulan como el ácido carboxilico correspondiente dentro de las células y que muestran una potencia celular incrementada o prolongada. Los Pasos 1-4 descritos anteriormente representan un algoritmo general para la implementación de los principios de la presente invención. La aplicación del algoritmo se ilustra en el Ejemplo A a continuación, aplicado a un inhibidor conocido de la enzima intracelular dihidrofolato reductasa (DHFR) .
Ejemplo A El ácido fólico (pteroilglutámico) es una vitamina la cual es un componente clave en la biosintesis de nucleótidos de purina y pirimidina. Después de la absorción, el folato dietético es reducido a dihidrofolato y luego es reducido adicionalmente a tetrahidrofolato por la enzima dihidrofolato reductasa (DHFR). La inhibición de la DHFR conduce a una reducción en la biosintesis de nucleótidos que da por resultado la inhibición de la biosintesis de ADN y una división celular reducida. Los inhibidores de DHFR se utilizan ampliamente en el tratamiento del cáncer (Bertino J, J. Cin. Oncol. 11, 5-14, 1993), enfermedades proliferativas de células tales como artritis reumatoide (Cronstein N., Pharmacol. Rev. 57, 163-1723), psoriasis y rechazo de transplante. Los inhibidores de DHFR también han encontrado uso como agentes anti-infecciosos (Salter A., Rev. Infect. Dis. 4, 196-236, 1982) y antiparasiticos (Plowe C. BMJ 328, 545-548, 2004) . Se han sugerido muchos otros tipos de compuestos inhibidores de DHFR y varios de estos compuestos se utilizan como agentes carcinostáticos, anti-inflamatorios, anti-infecciosos y antiparasiticos . Una plantilla general para los inhibidores de DHFR conocidos se muestra a continuación: G = N o CH 1 El metotrexato ácido ( S) -2- (4- ( ( (2, 4-diaminopteridin-6-il) metil) metilamino) -benzamido) pentanodióico es el inhibidor de DHFR más ampliamente utilizado y contiene una funcionalidad de glutamato la cual hace posible que sea transportado activamente dentro y retenido en el interior de las células. Sin embargo, las células cancerosas pueden volverse resistentes al metotrexato al modificar este mecanismo de transporte activo. Además, las células que no son de mamíferos carecen del sistema de transporte activo y el metotrexato tiene una utilidad limitada como agente antiinfeccioso. Los inhibidores de DHFR lipófilos tales como trimetrexato (2 , 4-diamino-5-metil-6- [ (3, 4 , 5-trimetoxi-anilino)metil] quinazolina) (2 G = CH) (patente GB 1345502) y análogos tales como (2 G = N) (Gangjee y colaboradores J. Med. Chem. 1993, 36, 3437-3443) los cuales se pueden absorber por medio de la difusión pasiva se han desarrollado por consiguiente para tanto circunvenir la resistencia de células cancerosas como para el uso como agentes antiinfecciosos .
Sin embargo, los agentes que se difunden pasivamente dentro de células también saldrán de la célula fácilmente y no son retenidos fácilmente dentro de la célula. De esta manera, un inhibidor de DHFR modificado de acuerdo con la presente invención, que es lipófilo pero cuya actividad se acumula dentro de la célula podría tener ventajas significativas. Además, ambas clases de inhibidores de DHFR tienen efectos secundarios los cuales limitan las dosis que pueden utilizare en la clínica. Un inhibidor de DHFR cuya actividad se acumula selectivamente en macrófagos podría tener valor ya que se sabe que los macrófagos por via de la producción de citocinas, juegan un papel clave en los trastornos inflamatorios y está creciendo la evidencia que tienen un papel negativo en el cáncer.
Paso 1 del Algoritmo General Descrito Anteriormente La estructura de rmn de DHFR con trimetrexato (2 G = CH) acoplado en el sitio activo está publicada (Polshakov, V.I. y colaboradores, Protein Sci . 1999, 8, 467-481) y es aparente que la posición más apropiada para anexar una configuración de carboxilesterasa de acuerdo con la invención fue en el anillo de fenilo como se muestra posteriormente. Se dedujo que la unión en ese punto en análogos estructurales, cercanos, conocidos del trimetrexato, tal como (2 G = N) también seria adecuada. La Figura 2 muestra (2 G = N) acoplado en DHFR mostrando que un punto adecuado para la unión es la posición 4 del anillo aromático puesto que ésta apunta lejos del sitio activo de la enzima.
Paso 2 del Algoritmo General Descrito Anteriormente Los compuestos en los cuales la configuración de carboxilesterasa se une por via de su átomo de nitrógeno de alfa-aminoácido se prepararon como se muestra en los esquemas de reacción I y II. Dentro de esta serie, los compuestos con y sin un carbonilo se hicieron para identificar compuestos potenciales selectivos para macrófagos.
ESQUEMA DE REACCIÓN 6 ESQUEMA DE REACCIÓN 7 También se hicieron compuestos en los cuales la configuración de esterasa se unió al modulador por via de la cadena lateral de alfa-aminoácido, esquemas de reacción 7 y 9. Dentro de esta serie, los compuestos con una sustitución de alquilo en el átomo de nitrógeno también se prepararon para identificar compuestos selectivos para macrófagos (esquema de reacción 9) .
ESQUEMA DE REACCIÓN 8 ESQUEMA DE REACCIÓN 9 Paso 3 del Algoritmo General Descrito Anteriormente Los compuestos que incluyen el análogo de trimetrexato (2 G = N) se sometieron a prueba en el ensayo de la enzima DHFR, el ensayo de proliferación celular, utilizando lineas celulares tanto monociticas como no monociticas y el ensayo de células rotas a fin de evaluar la capacidad para escindirse de los esteres por las lineas celulares monociticas y no monociticas. Los detalles de todos esos ensayos se proporcionan posteriormente.
Paso 4 del Algoritmo General Descrito Anteriormente Como se muestra en la Tabla 2 se identificaron los compuestos cuyos ácidos tienen actividad contra la enzima comparable al análogo de trimetrexato (2 G = N) . También se puede observar que al alterar la forma en la cual se une la configuración de esterasa puede conducir a un compuesto (6) que es 100 veces más potente en las células U937 y 15 veces más potente en las células HCT116 que el análogo no modificado (2 G=N) . Además, las modificaciones de ya sea el conector o el sustituyente en el átomo de nitrógeno de la configuración de esterasa permitieron la identificación de los compuestos 4 y 5 que mostraban una escisión selectiva en las lineas celulares monociticas pero no las lineas celulares no monociticas y que eran significativamente más anti-proliferativos en las lineas celulares monociticas que en las lineas celulares no monociticas (véase la tabla 2).
Tabla 2 Notas Las figuras entre paréntesis se refieren a la enzima IC50s para el ácido resultante de la división de los esteres . 2La cantidad de ácido producido después de la incubación del éster durante 80 minutos en el ensayo de carboxilesterasa de células rotas descrito posteriormente. Utilizando estrategias similares, el concepto se ha aplicado exitosamente a un rango de objetivos intracelulares como se resume en los ejemplos posteriores. A manera de ilustración adicional de los principios de esta invención se presentan los siguientes Ejemplos. En las síntesis de los compuestos descritas a continuación: Los reactivos y solventes comercialmente disponibles (grado de CLAR) se utilizaron sin purificación adicional. La irradiación de microondas se llevó a cabo utilizando un reactor de microondas enfocado CEM DiscoverMR.
Los solventes se retiraron utilizando un dispositivo GeneVac Series I MP' sin calentami•ento o Genevac Seri•es IIMR con VacRampMR a 30 °C. La purificación de los compuestos por medio de la cromatografia en columna con evaporación instantánea se realizó utilizando gel de sílice, tamaño de partícula 40-63 µm (malla 230-400) obtenido de Silicycle. La purificación de los compuestos por medio de la CLAR preparativa se realizó en Gilson systems utilizando columnas C18 de fase inversa ThermoHypersil-Keystone Hyperprep HSMR (12 µm, 100 X 21.2 mm) , gradiente 20-100% de B (A = agua/TFA al 0.1%, B = acetonitrilo/TFA al 0.1%) durante 9.5 minutos, flujo = 30 ml/minuto, solvente de inyección DMSO: acetonitrilo 2:1 (1.6 mi), detección de radiación UV a 215 nm. Los espectros de RMN XH se registraron en un espectrómetro Bruker 400 MHz AV en solventes deuterados. Los cambios químicos (d) son en partes por millón. El análisis mediante la cromatografia de capa delgada (CCD) se realizó con placas Kieselgel 60 F254 (Merck) y se visualizaron utilizando luz UV. La CLAR-EM analítica se realizó en sistemas Agilent HP1100, Waters 600 o Waters 1525 LC utilizando las columnas C18 de fase inversa Hypersil BDSMR (5 µm, 2.1 X 50 mm) , gradiente 0-95% de B (A = agua/TFA al 0.1%, B = acetonitrilo/TFA al 0.1%) durante 2.10 minutos, flujo = 1.0 ml/minuto. Los espectros UV se registraron a 215 nm utilizando un Detector de Red de Diodos Gilson G1315A, un detector de luz UV de longitud de onda individual G1214A, detector de luz UV de longitud de onda doble Waters 2487MR, detector de luz UV de longitud de onda doble Waters 2488MR o detector de luz UV de red de diodos Waters 2996MR. Los espectros de masas se obtuvieron sobre el rango de m/z 150 a 850 a una velocidad de muestreo de 2 exploraciones por segundo o 1 exploración por 1.2 segundos utilizando un dispositivo Micromass LCTMR con interfaz de pulverización Z o Micromass LCTMR con interfaz de pulverización Z o MUX. Los datos se integraron y se reportaron utilizando el programa de cómputo OpenLynx y OpenLynx Browser. Se han utilizado las siguientes abreviaciones: MeOH = MeOH EtOH = EtOH EtOAc = EtOAc Boc = terc-butoxicarbonilo DCM = DCM DMF = dimetilformamida DMSO = sulfóxido de dimetilo TFA = ácido trifluoroacético THF = tetrahidrofurano Na2C03 = carbonato de sodio HCl = ácido clorhídrico DIPEA = diisopropiletilamina NaH = hidruro de sodio NaOH = hidróxido de sodio NaHC03 = carbonato ácido de sodio Pd/C = paladio sobre carbono TBME = éter terc-butil-metilico N = nitrógeno PyBop = hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxi-tris-pirrolidiño-fosfonio Na2S04 = sulfato de sodio Et3N = trietilamina NH3 = amoniaco TMSC1 = trimetilclorosilano NH4C1 = cloruro de amonio LiAlH4 = hidruro de litio-aluminio PyBrop = Bromo-tris-pirrolidino fosfoniohexafluorofosfato MgS0 = MgS04 nBuLi = n-butil-litio C02 = dióxido de carbono EDC1 = clorhidrato de N- ( 3-dimetilaminopropil) -N' -eti1carbodiimida Et20 = éter dietilico LiOH = hidróxido de litio HOBt = 1-hidroxibenzotriazol ELS = Dispersión de Luz Evaporativa CCD = cromatografia de capa delgada mi = mililitro g = gramo (s) mg = miligramo (s) mol = moles mmol = milimol(es) CL-EM = cromatografia liquida de alto desempeño/ espectrometría de masas RM? = resonancia magnética nuclear t. a. = temperatura ambiente min = minuto (s ) h = hora(s) PRODUCTOS INTERMEDIARIOS Los siguientes bloques de construcción se utilizaron para la síntesis de los moduladores modificados: Ester ciclopentilico del ácido Ester ciclopentilico del (S ) -2-terc-butoxicarbonil- ácido ( S ) -4-bromo-2-terc- amino-4-hidroxi-butirico butoxicarbonilamino-butirico Ester ciclopentilico del Ester ciclopentilico del ácido (S) -2-amino-4-metil- ácido (S) -amino-fenil-acético pentanoico Ester 1-ciclopentilico del Ester terc-butilico del ácido ácido (S) -2-terc- (S) -2-benciloxicarbonilamino- butoxicarbónilamino- 4- bromo-butirico pentanodioico Ester 1-terc-butilico del ácido (S)-2- terc-butoxicarbonilamino-pentanodioico Sín tesis del éster ciclopen tílico del ácido (S) -2-terc- butoxicarbonilamino-4-hidro?i -butírico y éster 1 -terc- butílico del ácido (S) -2-terc-butoxicarbonilamino-4- hidr oxi -butírico Ciclope ntanol EDCI, DMAP Etapa 3 DCM Etapa 1 - Síntesis del ácido (S) -2-amino-4- ( terc-butil-dimetil-silaniloxi) -butírico A una suspensión de L-homoserina (1 g, 8.4 mmol) en acetonitrilo (10 mi) a 0°C se agregó el 1,8-diazabiciclo [5.4.0] undec-7-eno (1.32 mi, 8.8 mmol, 1.05 eq) . El cloruro de terc-butil-dimetil-sililo (1.33 g, 8.8 mmol, 1.05 eq) entonces se agregó en porciones durante 5 minutos y la mezcla de reacción se dejó calentar a la temperatura ambiente y se agitó durante 16 horas. Se habla formado un producto precipitado color blanco el cual se filtró y se lavó con acetonitrilo antes del secado bajo vacio. El compuesto del titulo se aisló como un sólido color blanco (1.8 g, 92%) . RMN 1H (500 MHz, DMSO), d: 7.5 (1H, s amplio), 3.7 (1H, m) , 3.35 (4H, m amplio), 1.95 (1H, m) , 1.70 (1H, m) , 0.9 (9H, s), 0.1 (6H, s) .
Etapa 2 - Síntesis del ácido (S) -2-terc-butoxicarbonilamino-4- (terc-butil-dimetil-silaniloxi) -butírico Una suspensión del producto de la Etapa 1 (1.8 g, 7.7 mmol) en DCM (100 mi) a 0°C se trató con trietilamina (2.15 mi, 15.4 mmol, 2 eq) y dicarbonato de di-terc-butilo (1.77 g, 8.1 mmol, 1.05 eq) . La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas para completar la reacción. El DCM se retiró bajo presión reducida y la mezcla se trató con EtOAc/salmuera . La capa de EtOAc se secó sobre MgS04 y se evaporó bajo presión reducida. El producto crudo se llevó hacia adelante sin purificación adicional (2.53 g, 99%). RMN XH (500 MHz, CDC13) , d: 7.5 (1H, s amplio), 5.85 (1H, d, J = 6.5Hz), 4.3 (1H, m) , 3.75 (2H, m) , 1.95 (2H, m) , 1.40 (9H, s) , 0.85 (9H, s), 0.1 (6H, s).
Etapa 3 - Síntesis del éster ciclopentilico del ácido (S)-2-terc-butoxicarbonilamino-4- (terc-butil-dimetil-silaniloxi) -butírico A una solución del producto de la Etapa 2 (2.53 g, 7.6 mmol) en DCM (50 mi) a 0°C se agregó ciclopentanol (1.39 mi, 15.3 mi, 2 eq) , EDC1 (1.61 g, 8.4 mmol, 1.1 eq) y DMAP (0.093 g, 0.76 mmol, 0.1 eq) . La mezcla de reacción se agitó durante 16 horas a temperatura ambiente antes de la evaporación bajo presión reducida. El residuo crudo se disolvió en EtOAc (100 mi) y se lavó con HCl 1M, Na2C03 1M y salmuera. La capa orgánica entonces se secó sobre MgS04 y se evaporó bajo presión reducida. El producto se purificó por medio de la cromatografia en columna utilizando EtOAc/heptano (1:4) para producir el compuesto del titulo (2.24 g, 73%).
Pureza por medio de CL-EM del 100%, m/z 402.5 [M++H] , RMN 1tí. (250 MHz, CDC13), d: 5.2 (1H, d, J = 6.3Hz), 5.15 (lH,m), 4.2 (1H, m) , 3.6 (2H, m) , 2.0 (1H, m) , 1.95-1.55 (9H, m amplio), 1.4 (9H, s), 0.85 (9H, s), 0.1 (6H, s).
Etapa 4 - Síntesis del éster ciclopentilico del ácido (S)-2-terc-butoxicarbonilamino-4-hidroxi-butirico El producto de la Et (1.57 g, 3.9 mmol) se disolvió en ácido acético: THF: agua (3:1:1, 100 mi). La mezcla de reacción se agitó a 30°C durante 16 horas para completar la reacción. Se agregó EtOAc (200 mi) y se lavó con Na2C031M, HCl 1M y salmuera. Los extractos de EtOAc se secaron sobre MgS0 y se evaporaron bajo presión reducida para proporcionar el producto como un aceite claro el cual se cristalizó con el reposo (1.0 g, 95%). Pureza por medio de la CL-EM del 100%, m/z 310.3 [M++Na], RMN XH (250 MHz, CDC13) , d: 5.4 (1H, d, J = 6.5Hz), 5.2 (1H, m) , 4.4 (1H, m) , 3.65 (2H, m) , 2.15 (1H, m) , 1 . 9-1 . 55 ( 9H , m ampl io ) , 1 . 45 ( 9H , s ) . Etapa 5 - Síntesis del éster ciclopentilico del ácido ( S ) - 4 -bromo-2 -terc-butoxicarbon? lamino-butirico A una suspensión espesa de N-bromo-succinimida (1.86 g, 10.4 mmol) en DCM (16.2 mi) se agregó una solución de trifenil-fosfina (2.56 g, 9.74 mmol) en DCM (7.2 mi). La solución se agitó durante 5 minutos adicionales después de la adición. Se agregó piridina (338 µl, 4.18 mmol) seguida por una solución del producto de la Etapa 4 (1.00 g, 3.48 mmol) en DCM (8.8 mi) . La solución se agitó durante 18 horas, se concentró bajo presión reducida y el solvente residual se sometió a la destilación azeotrópica con tolueno (3 x 16 mi) . El residuo se trituró con éter dietilico (10 mi) y acetato de etilo: heptano (1:9, 2 x 10 mi). Las soluciones combinadas de éter y heptano se concentraron sobre silice y se purificaron por medio de la cromatografia en columna eluyendo con EtOAc/heptano (1:9 a 2:8) para proporcionar el compuesto del titulo (1.02 g, 84%). RMN XH (300 MHz, CDC13) , d: 5.30-5.05 (2H, m) , 4.45-4.30 (1H, m) , 3.45 (2H, t, J = 7.3 Hz), 2.50-2.30 (1H, m) , 2.25-2.10 (1H, m) , 1.95-1.60 (8H, m amplio), 1.47 (9H, s) .
Síntesis del éster ciclopen tílico del ácido (S) -2-amino-metil-pen taño ico Etapa 1 - Síntesis del ácido toluen-4-sulfónico de éster ciclopentilico del ácido (S) -2-amino-4-metil-pentanoico A una suspensión de (S)-leucina (15 g, 0.11 mol) en ciclohexano (400 mi) se agregó ciclopentanol (103.78 mi, 1.14 mmol) y ácido p-toluensulfónico (23.93 g, 0.13 mol). La suspensión se calentó a reflujo para efectuar el sulfato. Después de calentar a reflujo la solución durante 16 horas, se enfrió para proporcionar una suspensión color blanco. El heptano (500 mi) se agregó a la mezcla y la suspensión se filtró para proporcionar el producto como un sólido color blanco (35 g, 85%). RMN X (300 MHz, MeOD), d: 1.01 (6H, t, J = 5.8Hz), 1.54-2.03 (11H, m) , 2.39 (3H, s) , 3.96 (1H, t, J = 6.5Hz), 5.26-5.36 (1H, m) , 7.25 (2H, d, J = 7.9Hz), 7.72 (2H, d, J = 8.3Hz) .
Etapa 2 - Síntesis del éster ciclopentilico del ácido (S)-2-amino-4-metil-pentanoico Una solución del producto de la Etapa 1 (2.57 g, 0.013 mol) en DCM (5 mi) se lavó con una solución acuosa saturada de NaHC03 (2 x 3 mi ) . Las capas acuosas combinadas se extrajeron nuevamente con DCM (3 x 4 mi) . Las capas orgánicas combinadas se secaron (MgS04) y el solvente se retiró in va cuo para proporcionar el compuesto del titulo como un aceite incoloro (1.10 g, 80%). RMN XH (300 MHz, CDC13) , d: 0.90 (6H, t, J = 6.4Hz), 1.23-1.94 (11H, m) , 3.38 (1H, dd, J = 8.4, 5.9Hz), 5.11-5.22 (1H, m) .
Síntesis del éster ciclopen tílico del ácido (S) -amíno-fenil -acético El ester ciclopentilico del ácido (S) -amino-fenil-acético se preparo a partir del ácido (S) -amino-fenil-acético siguiendo el mismo procedimiento utilizado para la síntesis del éster ciclopentilico del ácido (S) -2-am?no-4-met?l-pentanoico.
Síntesis del ester 1 -c?clopent? l?co del ácido (S) -2-terc-butoxicarbonilamino-pentanodioico Etapa 1 Pd/C, H2 Etapa 2 EtOH HO ?-? ÑHBoc Etapa 1 - Síntesis del éster 1-c?clopentil?co de éster 5-bencílico del acido (S) -2-terc-butox?carbon?lammo-pentanodioico A una solución agitada del éster 5-bencil?co del ácido (S) -2-terc-butoxicarbonilamino-pentanodioico (5 g, 14.8 mmol) en una mezcla de DCM (50 mi) y DMF (30 mi) a 0°C se agregó ciclopentanol (2.7 mi, 29.6 mmol), EDC1 (4.25 g, 22.2 mmol) y DMAP (0.18 g, 1.48 mmol). La agitación continuó a temperatura ambiente durante toda la noche, tiempo después del cual la CL-EM mostró la consumación de la reacción. El DCM se retiró bajo presión reducida. La mezcla de reacción se diluyó con EtOAc (200 mi), se lavó con agua (100 mi), HCl acuoso 1M (50 mi) seguido por NaHC03 acuoso saturado (50 mi) . La capa de EtOAc se secó (Na2S04) , se filtró y se concentró in va cuo para proporcionar un aceite viscoso el cual se solidificó con el reposo durante toda la noche. La trituración con Et20 (2 x 10 mi) proporcionó el compuesto del titulo como un sólido color blanco (43.78 g, 80%). Pureza por medio de CL-EM del 94%.
Etapa 2 - Síntesis del éster 1-ciclopentilico del ácido (S)-2-terc-butoxicarbonilamino-pentanodioico Una mezcla del producto de la Etapa 1 (1.3 g, 3.20 mmol) y Pd al 10%/C (0.5 g) en EtOH (150 mi) se agitó bajo H2 (balón) a temperatura ambiente durante 4 horas, tiempo después del cual la CL-EM mostró la consumación de la reacción. La mezcla de reacción se filtró a través de una almohadilla de celite, se lavó con EtOH (20 mi) y se concentró in vacuo para proporcionar un sólido color blanco. Para retirar el EtOH residual, el sólido se disolvió en una mezcla de tolueno/THF (5/1) (20 mi) y se concentró in va cuo para producir el compuesto del titulo (0.8 g, 79%). RMN 1H (400 MHz, MeOD), d: 1.35 (9H, s), 1.60-2.10 (10H, m) , 4.05 (1H, m) , 5.20 (1H, m) .
Síntesis del éster 1 -terc-butilíco del ácido (S) -2-terc-but oxi carbón i lamino -pentanodioico El éster 1-terc-butílico del ácido (S)-2-terc-butoxicarbonilamino-pentanodióico se preparó a partir del éster 5-bencilico del ácido (S) -2-terc-butoxicarbonilamino-pentanodióico siguiendo el mismo procedimiento utilizado para la síntesis del éster 1-ciclopentilico del ácido (S)-2-terc-butoxicarbonilamino-pentanodioico Síntesis del éster terc-butílico del ácido (S) -2-benciloxicarbon i lamino -4 -bromo -butírico Dibencildicarbonato, NaOH ?o. -O "?O Dioxano, agua NH2 O H NHZ O Etapa 1 ° ?OH 1) EtOCOCI, NEt3, THF Etapa 2 2) NaBH4, THF/agua Etapa 1 - Síntesis del éster 1-terc-butilico del ácido (S)-2-benciloxicarbonilamino-succinico O- NHZ?O0" El éster 1-terc-butilico del ácido (S)-2-aminosuccinico (0.9 g, 4.75 mmol) e hidróxido de sodio (0.28 g, 7.13 mmol, 1.5 eq) se disolvieron en agua al 25% en dioxano (50 mi) . La solución se agitó a 5°C y se agregó lentamente dibencildicarbonato (2 g, 4.13 mmol, 1.5 eq) en dioxano (10 mi) . La mezcla se agitó a 0°C durante 1 hora y luego a temperatura ambiente durante toda la noche. Se agregó agua (10 mi) y la mezcla se extrajo con EtOAc (2 x 20 mi) . La fase orgánica se extrajo nuevamente con una solución acuosa saturada de bicarbonato de sodio (2 x 10 mi) . Las capas acuosas combinadas se acidificaron a pH 1 con HCl 1M y se extrajeron con EtOAc (3 x 10 mi) . Las fracciones orgánicas combinadas se secaron sobre MgS04 y se concentraron ba o presión reducida. El producto se purificó por medio de la cromatografia en columna (EtOAc al 35% en heptano) para proporcionar el compuesto del titulo como un aceite incoloro (0.76 g, 50%). m/z 346 [M+23]+, RMN X (300 MHz, CDC13) , d: 7.39-7.32 (5H, m) , 5.72 (1H, d, J = 8.1Hz), 5.13 (2H, s), 4.58-4.50 (1H, m) , 3.10-2.99 (1H, m) , 2.94-2.83 91H, m) , 1.45 (9H, s).
Etapa 2 - Síntesis del ester terc-butilico del ácido (S)-2-bencí1oxicarbonilamino-4-hidr0x1-butírico A una solución del producto de la Etapa 1 (0.6 g, 1.87 mmol) en THF anhidro (20 mi) a -20°C se agregó lentamente tpetilamina (0.032 mi, 2.24 mmol, 1.2 eq) y cloroformiato de etilo (0.021 mi, 2.24 mmol, 1.2 eq) . La mezcla se agito a -20°C durante 2 horas. El sólido formado se filtro y se lavó con THF (2 x 10 mi) . El producto filtrado se agregó gota a gota a una solución de borohidruro de sodio (0.2 g, 5.61 mmol, 3 eq) a 0°C y se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. El solvente se retiró bajo presión reducida, el residuo se diluyó con agua (10 mi) acidificada a pH 5 con HCl 1M y se extrajo con EtOAc. Las fracciones orgánicas se combinaron, se lavaron con hidróxido de sodio acuoso al 10%, agua y salmuera, se secaron sobre MgS04 y se concentraron bajo presión reducida para proporcionar el compuesto del titulo como un aceite claro (0.3 g, 51%). m/z 332 [M+23]t.
Etapa 3 - Síntesis del éster terc-butilico del ácido (S)-2-benciloxicarbonilamino-4-bromo-butírico A una solución de la N-bromosuccinimida (0.52 g, 2.91 mmol, 3 eq) en DCM (10 mi) se agregó lentamente una solución de trifenilfosfina (0.71 g, 2.72 mmol, 2.8 eq) en DCM (10 mi). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 5 minutos. La piridina (0.094 mi, 1.16 mmol, 1.2 eq) y una solución del producto de la Etapa 2 (0.3 g, 0.97 mmol, 1 eq) en DCM (20 mi) se agregaron gota a gota y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante toda la noche. El solvente se retiró bajo presión reducida, el residuo se sometió a la destilación azeotrópica con tolueno (2 x 15 mi) y se trituró con éter dietilico (2 x 25 mi) y EtOAc al 10% en heptanos. Las soluciones de la trituración se combinaron y se evaporaron a sequedad. El producto crudo se purificó por medio de la cromatografia en columna (EtOAc al 15% en heptanos) para proporcionar el compuesto del titulo como un aceite claro (0.16 g, 44%). m/z 395 [M+23]+, RMN XH (300 MHz, CDC13), d: 7.39-7.30 (5H, m) , 5.40 (1H, d, J = 6.8Hz), 5.12 (2H, s), 4.38 (1H, q, J = 7.7Hz), 3.47-3.38 (2H, m) , 5.49-2.33 (1H, m) , 2.28-2.13 (1H, m) , 1.48 (9H, s).
EJEMPLO 1 Este ejemplo describe la modificación del inhibidor conocido de HDAC (Histona Desacetilasa) ácido hidroxámico de Suberoilanilida (compuesto 7) referido en este documento como "SAHA", por medio de la unión de las configuraciones de éster de aminoácido en puntos alejados de la interfaz de enlace con el objetivo, donde no ocurre la alteración de su modo de enlace .
Compuesto 7: Acido hidroxámico de suberoilanilida (SAHA) El SAHA se adquirió de BioCat GmbH, Heidelberg, Alemania .
Procedimiento de lavado estándar para la química de la resina La resina se lavó en la siguiente secuencia: DMF, MeOH, DMF, MeOH, DCM, MeOH, DCM, MeOH x 2, TBME x 2.
Escisión de la prueba de resina Una pequeña cantidad de resina de 2-clorotritilo de hidroxilamina funcionalizada (aproximadamente 0.3 mi de mezcla de reacción, aproximadamente 10 mg de resina) se trató con TFA al 2%/DCM (0.5 mi) durante 10 minutos a temperatura ambiente. La resina se filtró y el producto filtrado se concentró al soplar con una corriente de gas de N2. Se obtuvo la CL-EM del residuo.
Preparación de Resina de 2-Clorotritilo de Hidroxilamina Derivatizada con Acido Subérico Etapa 1 - Inmovilización a la resina de 2-clorotritil-0-NH2 A un matraz de fondo redondo cargado con resina de 2-clorotritil-0-NH2 (6 g, carga de 1.14 mmol/g, 6.84 mmol) y DCM (60 mi) se agregó DIPEA (5.30 g, 41.0 mmol, 6 eq) . El 8-cloro-8-oxooctanoato de metilo (4.2 g, 20.5 mmol, 3 eq) se agregó lentamente a la mezcla de reacción con agitación orbital y la mezcla de reacción se agitó durante 48 horas. La resina se filtró y se lavó utilizando el procedimiento del lavado estándar. La resina se secó bajo vacio. La pureza por medio de la CL-EM se determinó por medio de la detección de ELS, 100%, m/z 204 [M++H]+.
Etapa 2 - Saponificación A un matraz de fondo redondo cargado con la resina de la Etapa 1 (4 g, carga de 1.14 mmol/g, 4.56 mmol) se agregó THF (16 mi) y MeOH (16 mi) . A la mezcla de reacción se agregó una solución de NaOH (0.91 g, 22.8 mmol, 5 eq) en agua (16 mi) . La mezcla de reacción se agitó durante 48 horas. La resina se filtró y se lavó con agua x 2, MeOH x 2, seguido por el procedimiento de lavado estándar. La resina se secó bajo vacio. La pureza por medio de CL-EM se determinó por medio de la detección de ELS, 100% m/z 190 [M++H] \ Preparación de derivados de SAHA Los compuestos basados en SAHA se prepararon por medio de los métodos resumidos a continuación. Los compues tos (8) , (9) y (10) se prepararon por medio de la metodología descri ta en el siguien te esquema de rea cción : Hj. Pd/C EtOAc Etapa 3 Compuesto (9) Las Etapas 1 a 5 son ejemplificadas para R = ciclopen tilo Etapa 1 - Síntesis del éster ciclopentilico del ácido (S)-(3-nitro-bencilamino) -fenil-acético El bromuro de 3-nitrobencilo (46 mmol) se disolvió en DMF (180 mi) y se agregó carbonato de potasio (92 mmol), seguido por el éster de (S) -fenilglicina (10.6 g, 46 mmol) . La reacción se agitó durante 17 horas a temperatura ambiente antes de la evaporación a sequedad. El residuo se disolvió nuevamente en EtOAc (150 mi) y se lavó con agua (3 x 80 mi), se secó (Na2S04), se filtró y se concentró a sequedad. Después de la purificación por medio de la cromatografia en columna con evaporación instantánea (EtOAc al 30%/hexano) se obtuvo el éster y se utilizó directamente en la Etapa 2.
Etapa 2 - Síntesis del éster ciclopentilico del ácido (S)-[terc-butoxicarbonil- (3-nitro-bencil ) -amino] -fenil-acético El producto de la Etapa 1 (40.9 mmol) se disolvió en THF (250 mi) antes de la adición de carbonato de potasio (61.4 mmol) y agua (150 mi) . Se agregó di-terc-butil-dicarbonato (163 mmol) y la mezcla de reacción se calentó a 50°C durante 18 horas. Se agregó DCM, la mezcla resultante se lavó consecutivamente con HCl 0.1 M (150 mi), NaHC03 acuoso saturado y agua (150 mi) . La capa de DCM se secó (Na?S04), se filtró y se concentró a sequedad. Después de la purificación por medio de la cromatografia en columna con evaporación instantánea (EtOAc al 5%/hexano) , el sulfato del titulo se aisló y se utilizó directamente en la Etapa 3.
Etapa 3 - Síntesis del éster ciclopentilico del ácido (S)-[ (3-amino-bencil) -terc-butoxicarbonil-amino] -fenil-acético El producto de la Etapa 2 (11.5 mmol) se disolvió en EtOAc (150 mi) antes de la adición de catalizador de Pd/C (10% húmedo) (0.8 g) y se hidrogenó bajo una presión de balón a temperatura ambiente durante 18 horas. La mezcla de reacción se filtró a través de una almohadilla de celite y se evaporó a sequedad para proporcionar un sólido.
Etapa 4 - Acoplamiento de resina La resina de 2-clorotritilo de hidroxilamina derivatizada con ácido subérico (1.0 g, carga de 0.83 mmol/g) se hinchó en DMF (15 mi) y se agregó PyBOP (1.36 g, 2.61 mmol), seguido por DIPEA (1.5 mi, 8.7 mmol). El producto de la Etapa 3 (2.61 mmol) se disolvió en DCM (15 mi) y se agregó a la mezcla de reacción. La reacción se agitó durante 24 horas a temperatura ambiente. La resina se filtró y se lavó utilizando el procedimiento de lavado estándar. La resina se secó bajo vacio.
Etapa 5 - Síntesis del éster ciclopentilico del ácido (S)-[3- (7-hidroxicarbamoil-heptanoilamino) -bencilamino] -fenil-acético compuesto (8) El producto de la Etapa 4 (carga de 0.83 mmol) se agitó suavemente en TFA al 2%/DCM (10 mi) durante 20 minutos. La resina se filtró. El producto filtrado se evaporó bajo presión reducida a temperatura ambiente. La resina se trató nuevamente con TFA al 2%/DCM (10 mi) y se filtró después de 20 minutos. Los productos filtrados combinados se evaporaron a sequedad bajo presión reducida a temperatura ambiente para proporcionar un residuo oleoso. El residuo se dejó reposar en TFA al 20%/DCM durante 40 minutos. Después de la evaporación a sequedad, también bajo presión reducida a temperatura ambiente, el producto crudo se purificó por medio de la CLAR preparativa .
Datos analíticos para el Compuesto 8 Pureza por medio de CL-EM del 100%, m/z 496 [M++H]+, RMN XH (400MHz, MeOD), d: 1.30-1.70 (16H, m) , 2.00 (2H, t) , 2.30 (2H, t), 4.05 (2H, dd), 5.00 (1H, m) , 5.15 (1H, m) , 7.05 (1H, m) , 7.30 (2H, m) , 7.40 (5H, m) , 7.75 (1H, m) .
Datos analíticos para el Compuesto (10) Pureza por medio de CL-EM del 97%, m/z 484 [M++H]+, RMN X (400 MHz, MeOD), d: 1.30 (13H, m) , 1.45-1.65 (4H, m) , 1.93-2.05 (2H, m) , 2.20-2.40 (2H, m) , 3.99 (2H, q) , 4.65-4.95 (1H, m) 7.05 (1H, d) , 7.25-7.33 (2 H, m) , 7.35-7.50 (5H, m) , 7.75 (1H, s) .
Etapa 6 -Saponificación El producto de la Etapa 5 donde R = Et (1.4 g, carga de 0.83 mmol) se suspendió en THF (8.6 mi) y MeOH (8.6 mi) y se agregó una solución de hidróxido de sodio 1.4 M (5.98 mmol) . La mezcla se agitó durante 24 horas y la resina se filtró y se lavó con agua x 2, MeOH x 2, seguido por el procedimiento de lavado estándar. La resina se secó bajo vacio.
Etapa 7 - Síntesis del ácido (S) - [3- (7-hidroxicarbamoil-heptanoilamino) -bencilamino] -fenil-acético (9) El producto de la Etapa 6 (1.44 g, carga de 0.83 mmol) entonces se agitó suavemente en TFA al 2%/DCM (10 mi) durante 20 minutos. La resina se filtró y el producto filtrado se evaporó bajo presión reducida a temperatura ambiente. La resina se trató nuevamente con TFA al 2%/DCM (10 mi) y se filtró después de 20 minutos. Los productos filtrados combinados se evaporaron a sequedad bajo presión reducida a temperatura ambiente para proporcionar un residuo oleoso. El residuo se dejó reposar en TFA al 20%/DCM durante 40 minutos. Después de la evaporación a sequedad, bajo presión reducida a temperatura ambiente, el producto crudo se purificó por medio de la CLAR preparativa para producir el compuesto (9) . Pureza por medio de CL-EM del 100%, m/z 428 [M++H]+, RMN XH (400MHz, MeOD), d: 1.20-1.35 (4H, m) , 1.50-1.65 (4H, m) , 2.00 (2H, m) , 2.30 (2H, m) , 4.00 (2H, dd) , 4.90 (1H, m) , 7.05 (1H, m) , 7.25-7.50 (7H, m) , 7.70 (1H, m) . El compuesto (24) se preparó siguiendo la misma metodología descri ta para la sín tesi s del compues to (8) Ester ciclopentilico del ácido ( { (R) - [ 4-7-hidroxicarbamoil-heptanoilamino) -fenil] -fenil-metil } -amino) acético (24) Pureza por medio de CL-EM del 95%, m/z 496 [M++H]+, RMN X (400 MHz, DMSO), 6:1.30-1.50 (6H, m) , 1.50-1.70 (8H, m) , 1.80 (2H, m) , 2.10 (2H, t) , 2.45 (2H, t) , 4.1 (2H, dd) , 5.25 (1H, m) , 5.35 (1H, m) , 7.45 (2H, d) , 7.60 (5H, m) , 7.80 (2H, d) , .00-10.10 (2H, s amplio), 10.50 (1H, s).
EJEMPLO 2 Este ejemplo describe la modificación del inhibidor conocido de la Aurora Cinasa A ("Aurora A") N- { - ( 7-metoxi-6-metoxi-quinolin-4-iloxi ) -fenil } -benzamida (compuesto (11)) por medio de la unión de una configuración de éster de aminoácido en un punto donde no ocurre la alteración de su modo de enlace.
Compuesto (11) : N- { 4- (7-metox?-6-metox?-qumolm-4-?lox?) fenil } -benza ida El compuesto (11) se preparo como se describe en la Patente Norteamericana No. 6,143,764 Los compuestos basados en el compuesto (11) se prepararon por medio de los métodos resumidos a continuación. Los compues tos (12) y (13) se prepararon por medio del método descri to en el siguien te esquema de reacci ón 10 : ESQUEMA DE REACCIÓN 10 Etapa 1 - Síntesis de la N- ( -hidroxi-fenil) -benzamida A una solución de 4-aminofenol (4.27 g, 39.1 mmol) en DMF (50 mi) a 0°C bajo una atmósfera de argón se agregó trietilamina (7.44 mi, 53.4 mmol, 1.5 eq) . La reacción se agitó durante 10 minutos antes de la adición lenta de cloruro de benzoilo (5 g, 35.6 mmol, 1 eq) durante un periodo de 5 minutos. La mezcla de reacción se dejó calentar a temperatura ambiente y se agitó durante 18 horas. La DMF se retiró bajo presión reducida y la mezcla se trató con EtOAc/agua. Resultó la precipitación de un sólido color blanco, éste se filtró y se secó bajo presión reducida para proporcionar el compuesto del titulo (8.0 g, 96%). RMN :H (270 MHz, DMSO), 6: 10.0 (1H, s), 9.35 (1H, s), 7.9 (2H, d, J = 7.2Hz), 7.5 (5H, m) , 6.75 (2H, d, J = 7.4Hz) . Etapa 2 - Síntesis de la N- [4- (7-benciloxi-6-metoxi-quinolin-4-iloxi) -fenil] -benzamida A un matraz de fondo redondo cargado con 4-cloro-6-metoxi-7-benciloxiquinolina [véase Org. Synth. Col. Vol. 3, 272 (1955) y US006143764A (Kirin Beer Kabushiki Kaisha) para los métodos de síntesis] (1.09 g, 3.6 mmol) se agregó el producto de la Etapa 1 (2.33 g, 10.9 mmol, 3 eq) . La reacción se calentó a 140°C durante 3 horas. Después del enfriamiento a temperatura ambiente, se agregó agua a la mezcla de reacción y la mezcla se extrajo 3 veces con EtOAc. La capa de EtOAc combinada se lavó con NaOH acuoso al 5%, salmuera y se secó sobre MgS04. El solvente se retiró bajo presión reducida y se purificó por medio de la cromatografia en columna eluyendo con EtOAc/heptano (2:1) para obtener el compuesto del titulo (0.56 g, 32%). m/z 477 [M++H] .
Etapa 3 - Síntesis de la N- [4- (7-hidroxi-6-metoxi-quinolin-4-iloxi) -fenil] -benzamida Una mezcla del producto de la Etapa 2 (0.56 g, 1.17 mmol) y Pd al 10%/C (0.08 g) en ciclohexeno al 10%/EtOH (80 mi) se calentó bajo reflujo durante 3 horas. El catalizador de Pd/C se filtró a través de una almohadilla de celite, lavando dos veces con MeOH. El producto filtrado se concentró bajo presión reducida para producir el compuesto del titulo como un sólido color amarillo (0.34 g, 75%). m/z 387 [M++H] .
Etapa 4 - Síntesis del éster ciclopentilico del ácido (S)-4-[4- (4-benzoilamino-fenoxi) -6-metoxi-quinolin-7-iloxi] -2-terc-butoxicarbonilamino-butirico A una solución del producto de la Etapa 3, (0.2 g, 0.52 mmol) en DCM anhidro (30 mi) a 0°C se agregó el éster ciclopentilico del ácido (S) -2-terc-butoxicarbonilamino-4-hidroxi-butirico (0.223 g, 0.78 mmol, 1.5 eq) en 5 mi de DCM. Entonces se agregó Ph3P (0.557 g, 2.1 mmol, 4.1 eq) y DIAD (0.412 mi, 2.1 mmol, 4.1 eq) y la mezcla de reacción se dejó calentar a temperatura ambiente y se agitó durante 16 horas. La mezcla de reacción cruda se evaporó bajo presión reducida y se purificó por medio de la cromatografia en columna para proporcionar el compuesto del titulo (0.135 g, 46%). m/z 656.3 [M++H] .
Etapa 5 - Síntesis del éster ciclopentilico del ácido ((S)-2-amino-4- [4- ( 4-benzoilamino-fenoxi) -6-metoxi-quinolin-7-iloxi] -butírico) (12) A una solución del producto de la Etapa 4 (5.8 mg, 0.009 mmol) en DCM (1 mi) se agregó TFA (1 mi). La mezcla de reacción se dejó agitar durante 16 horas antes de la evaporación bajo presión reducida, sometiendo a la destilación azeotrópica con tolueno para retirar las trazas de TFA. El compuesto (12) se aisló como un sólido color blanquecino (4.7 mg) . Pureza por medio de CL-EM del 95%, m/z 556.2 [M"+H], RMN XH (270 MHz, DMSO), d: 10.4 (1H, s), 8.8 (1H, d, J = 6.5Hz), 8.55 (2H,s amplio), 8.01 (4H, m) , 7.65 (4H, m) , 7.35 (1H, d, J = 7.6Hz), 6.75 (1H, d, J = 6.5Hz), 5.25 (1H, m) , 4.35 (3H, m) , 4.0 (3H, s), 2.4 (2H, m) , 1.85-1.4 (8H, m amplio) .
Etapa 6 - Síntesis del ácido (S) -4- [4- (4-benzoilamino-fenoxi) -6-metoxi-quinolin-7-iloxi] -2-terc-butoxicarbonil-amino-butirico A una solución del producto de la Etapa 4 (17 mg, 0.02 mmol) en THF (1 mi) se agregó NaOH 2M (0.026 mi, 0.046 mmol, 2 eq) . Después de 16 horas, la reacción estaba incompleta de manera que se agregaron 2 equivalentes adicionales de NaOH. La agitación se completó después de 6 horas y el THF se retiró bajo presión reducida. La capa acuosa se diluyó con 3 mi de agua y se acidificó al pH 6 con HCl 1M. El compuesto del titulo se extrajo en EtOAc, se secó sobre MgS04 y se aisló como un sólido color blanco. Este se utilizó directamente en la Etapa 7 sin purificación adicional.
Etapa 7 - Síntesis del ácido (S) -4- [4- ( 4-benzoilamino-fenoxi) -6-metoxi-quinolin-7-iloxi] -2-terc-butilcarbonilamino-butirico (13) A una solución del producto de la Etapa 6 (6.5 mg, 0.011 mmol) en DCM (1 mi) se agregó TFA (1 mi). La reacción se dejó agitar durante 6 horas y luego se evaporó bajo presión reducida para proporcionar el compuesto del titulo (13) como un sólido color blanquecino (90%). Pureza por medio de CL-EM del 100%, m/z 488.2 [M++H] , RMN :H (300 MHz, MeOD), d: 8.75 (1H, d, J = 7.8Hz), 8.00 (4H, m) , 7.65 (4H, m) , 7.4 (1H, d, J = 7.6Hz), 6.95 (1H, d, J = 8.0Hz), 4.6 (2H, m) , 4.3 (1H, m) , 4.2 (3H, s) , 2.6 (2H, m) .
El compuesto (14) se preparó por medio del método descri to en el siguien te esquema de rea cción 11 : ESQUEMA DE REACCIÓN II Las etapas 1, 2 y 3 son las mismas que aquellas descritas anteriormente para la síntesis del compuesto (12) .
Etapa 4 - Síntesis del éster terc-butilico del ácido (S)-4-[4- (4-benzoilamino-fenoxi ) -6-metoxi-quinolin-7-iloxi] -2-benciloxicarbonilamino-butirico El producto de la Etapa 3 (0.15 g, 0.39 mmol), éster terc-butilico del ácido (S) -2-benciloxicarbonilamino-4-bromo-butirico (0.16 g, 0.43 mmol, 1.1 eq) y K2C03 (0.11 g, 0.78 mmol, 2 eq) se disolvieron en DMF anhidro (10 mi) bajo una atmósfera de nitrógeno. La reacción se agitó a 35°C durante toda la noche antes de que la DMF se retirara bajo presión reducida. El residuo se disolvió en DCM y se lavó con agua seguida por salmuera. La capa orgánica se secó sobre MgS0 y se evaporó bajo presión reducida. La cromatografia en columna (eluyendo con MeOH al 1%/DCM) proporcionó el compuesto del titulo (0.16 g, 60%). m/z 678 [M+H]+, RMN XH (300 MHz, CDC13) , d: 8.49 (1H, d, J = 5.3Hz), 7.98 (1H, s), 7.92 (2H, dd, J = 8.2, 1.4Hz), 7.80-7.72 (2H, m) , 7.63-7.48 (4H, m) , 7.43-7.29 (4H, m) , 7.24-7.17 (2H, m) , 6.64 (1H, d, J = 8.9Hz), 6.49 (1H, d, J = 5.3Hz), 5.15 (2H, s), 4.66-4.57 (1H, m) , 4.43-4.34 (1H, m) , 3.85 (3H, s) , 2.55-2.33 (2H, m) , 1.41 (9H, m) .
Etapa 5 - Síntesis del éster terc-butilico del ácido -(S)-2-amino-4- [4- (4-benzoilamino-fenoxi) -6-metoxi-quinolin-7-iloxi] -butírico (14) El producto de la Etapa 4 (0.045 g, 0.066 mmol), se disolvió en EtOAc anhidro (5 mi) y Pd(OH)2/C se agregó bajo una atmósfera de nitrógeno. La reacción se desgasificó y se agitó bajo una atmósfera de hidrógeno a temperatura ambiente durante toda la noche. El catalizador se filtró a través de una almohadilla de celite y el solvente se retiró bajo presión reducida. El compuesto (14) se purificó por medio de la CLAR preparativa, m/z 544 [M+H]+, RMN ?ti (300 MHz, CD3OD) , d: 8.67 (1H, d, J = 6.8Hz), 7.98 (4H,d, J = 8.7Hz), 7.90 (1H, S), 7.68-7.51 (4H, m) , 7.42-7.36 (2H, m) , 6.97 (1H, d, J = 6.6Hz), 4.52 (2H, t, J = 5.7Hz), 4.28 (1H, t, J = 6.5Hz), 4.13 (3H, s), 2.69-2.45 (2H, m) , 1.53 (9H, s).
El compuesto (25) se preparó por medio del método descri to en el siguiente esquema de reacción : Etapa 1 - Síntesis del éster ciclopentilico del ácido ( S ) -4 -[ 4 - ( 4 -benzo?lamino-f enoxi ) -6-metox?-qumolin-7-?lox? ] -2-ciclohexilamino-but ipco (25) Al compuesto (12) (37 mg, 0.066 mmol) en MeOH anhidro (1 mi) se agregaron 100 µL de una solución de 1M de ciclohexanona en MeOH y 1 gota de ácido acético. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. Entonces se agregó cianoborohidruro de sodio (10.3 mg, 0.165 mmol) y la reacción se dejó agitar durante 4 horas a temperatura ambiente, antes de la concentración ba o vacio. La purificación por medio de la CLAR preparativa proporcionó el compuesto del titulo (25) como una sal de di-TFA. m/z 638 [M+H] + . RMN XH (300 MHz, CD3OD) d; 8.72 (1H, d, J = 6.8 Hz), 8.02-7.98 (4H, m) , 7.93 (1H, s), 7.67 (1H, s), 7.66-7.53 (3H, m) , 7.42 (2H, m) , 6.99 (1H, d, J = 6.8 Hz), 5.38 (1H, m) , 4.49 (3H, m) , 4.14 (3H, s), 3.27 (11H, m) , 2.66 (2H, m) , 2.20 (2H, m) , 12.05-1.46 (16H, m) .
EJEMPLO 3 Este ejemplo describe la modificación del inhibidor conocido de cinasa P38 6-amino-5- (2 , 4-difluoro-benzoil) -1- (2, 6-difluoro-fenil) -lH-piridin-2-ona (compuesto 3258) por medio de la unión de una configuración de éster de aminoácido en un punto donde no ocurre la alteración de su modo de enlace .
Compuesto (15): 6-amino-5- (2 , 4-difluoro-benzoil) -1- (2, 6-difluoro-fenil)-lH-piridin-2-ona El compuesto (15) se preparó como se describe en el documento WO03/076405. Los compuestos basados en el compuesto (15) se prepararon por medio de los métodos resumidos a continuación.
Los compues tos (16) y (17) se prepararon por medio del método descri to en el siguiente esquema de reacción 12 : ESQUEMA DE REACCIÓN 12 TFA / DCM Etapa 2 Compuesto (17) Compuesto (16) Etapa 1 Síntesis del S ) -4 - { 4 - [ 6-amino-5- ( 2 , 4 -difluorobenzoi1 ) -2-oxo-2H-piridin-l-il] -3, 5-difluorofenoxi ) -2-terc-butoxicarbonilaminobutirato de ciclopentilo A una mezcla agitada de la 6-amino-5- (2, 4-difluorobenzoil) -1- (2, 6-difluoro-4-hidroxi-fenil ) -lH-piridin- 2-ona [preparada por medio de los métodos descritos en el documento WO03/076405] (100 mg, 0.265 mmol) y K2C03 en DMF (1.5 mi) se agregó el éster ciclopentilico del ácido (L) -5-bromo-2-terc-butoxicarbonilaminopentanóico (96 mg, 0.265 mmol) . La mezcla de reacción se agitó a 60°C durante 2 horas.
La mezcla de reacción se diluyó con EtOAc (15 mi) y se lavó con NaHC03 acuoso saturado (3 mi) y agua (10 mi) . La capa de EtOAc se secó (Na2S04), se filtró y se concentró a sequedad. La purificación por medio de la cromatografia con evaporación instantánea (EtOAc al 20%/heptano) produjo el compuesto del titulo como un sólido color blanco (50 mg, 29%). Pureza por medio de CL-EM del 100%, m/z 648 [M++H] , RMN X (400 MHz, MeOD), d: 1.30 (9H, s), 1.40-1.65 (6H, m) , 1.70-1.85 (2H, m) , 1.95-2.30 (2H, m) , 4.00-4.10 (2H, m) , 4.15-4.20 (1H, m) , 5.05-5.10 (1H, m) , 5.65 (1H, d) , 6.70-6.80 (2H, m) , 6.95-7.05 (2H, m) , 7.25-7.45 (2H, m) .
Etapa 2 - Síntesis del (S) -2-amino-4- { 4- [ 6-amino-5- (2, 4-difluorobenzoi1 ) -2-oxo-2H-piridin-l-il] -3, 5-difluorofenoxi } -butanoato-trifluoroacetato de ciclopentilo (Id) Una mezcla del producto de la Etapa 1 (10 mg) y TFA al 20%/DCM (0.5 mi) se dejó reposar a temperatura ambiente durante 3 horas. La mezcla de reacción se concentró a sequedad mediante el soplado bajo N2. El residuo se trituró con Et20 (0.3 mi x 2) para proporcionar el compuesto (16) como un sólido color blanco (9.3 mg, 91%). Pureza por medio de CL-EM del 100%, m/z 548 [M++H] , RMN X (400 MHz, MeOD), d: 1.55-1.80 (6H, m) , 1.85-2.00 (2H, m) , 2.30-2.50 (2H, m) , 4.15-4.30 (3H, m) , 5.25-5.35 (1H, m) , 5.75 (1H, d) , 6.85-6.95 (2H, m) , 7.05-7.15 (2H, m) , 7.40-7.55 (2H, m) .
Etapa 3 - Síntesis del ácido (S) -2-amino-4- { 4- [ 6-amino-5-(2, 4-difluorobenzoil ) -2-oxo-2H-piridin-l-il] -3, 5-difluorofenoxi Jbutanoico (17) A una solución del compuesto (16) (20 mg, 0.0317 mmol) en una mezcla de MeOH (0.3 mi) y THF (0.3 mi) se agregó NaOH acuoso 2M (0.3 mi). La mezcla de reacción se dejó reposar a temperatura ambiente durante 3 horas. Con la consumación de la reacción, la mezcla se evaporó a sequedad por medio del soplado bajo un flujo de N2, se acidificó a pH 1-2 por medio de la adición gota a gota de HCl acuoso 2M. El sólido formado resultante color blanco se recolectó por medio de la filtración. Rendimiento = 9 mg, 48%. Pureza por medio de CL-EM del 97%, m/z 480 [M++H] , RMN XH (400 MHz, MeOD), d: 2.35-2.55 (2H, m, CH2) , 4.15-4.20 (1H, m, CH) , 4.25-4.35 (2H, m, CH2) , 5.75 (1H, d, CH) , 6.85-7.00 (2H, m, Ar) , 7.05-7.20 (2H, m, Ar), 7.40-7.55 (2H, m, Ar) .
El compuesto (18) se preparó por medio del método descri to en el siguien te esquema de rea cción 13 : ESQUEMA DE REACCIÓN 13 H-. Pd(OH)2 Etapa 2 EtOAc Etapa 1 - Síntesis del éster terc-butilico del ácido (S)-4- { 4- [ 6-amino-5- (2 , -difluoro-benzoil ) -2-oxo-2H-piridin-l-il] - 3, 5-difluoro-fenoxi } -2-benciloxicarbonilamino-butirico A una solución de la 6-amino-S- (2, 4- difluorobenzoil) -1- (2, 6-difluoro-4-hidroxifenil) -IH-piridin- 2-ona (100 mg, 0.26 mmol) y éster t-butilico del ácido (S)-2- benciloxicarbonilamino-4-bromo-butirico (108 mg, 0.29 mmol) en acetona (2 mL) se agregó yoduro de sodio (79 mg, 0.53 mmol) y carbonato de potasio (146 mg, 1.06 mmol) . La reacción se calentó a reflujo durante 12 horas, se enfrió y se dividió entre agua (20 mL) y acetato de etilo (20 mL) . La capa acuosa se extrajo nuevamente con acetato de etilo (2x10 mL) y los extractos orgánicos combinados se lavaron con salmuera (20 mL) , se secaron (MgS04) y se concentraron bajo presión reducida para proporcionar un aceite color amarillo. Este residuo se sujetó a la cromatografia en columna [gel de sílice, acetato de etilo al 40%-heptano] para proporcionar el producto deseado (186 mg, 79%) como un sólido incoloro, m/z 670 [M+H] .
Etapa 2 - Síntesis del éster terc-butilico del ácido (S)-2-amino-4- { 4- [ 6-amino-5- (2 , -difluoro-benzoil) -2-oxo-2H-piridin-1-il] -3, 5-difluoro-fenoxi} -butírico El éster terc-butilico del ácido (S) -4- { 4- [6-amino-5- (2, 4-difluoro-benzoil ) -2-oxo-2H-piridin-l-il] -3, 5-difluoro-fenoxi } -2-benciloxicarbonilamino-butirico (140 mg, 0.2 mmol) se disolvió en acetato de etilo (15 mL) que contenia hidróxido de paladio al 10% sobre carbón (20 mg) y se agitó bajo una atmósfera de hidrógeno (1 atmósfera) durante 1 hora. La mezcla de reacción se purgó con N2 y se filtró a través de CeliteMR lavando con acetato de etilo adicional. El producto filtrado se concentró bajo presión reducida para proporcionar un sólido el cual se sujetó a la cromatografia en columna [gel de silice:MeOH al 5% en diclorometano]. Esto proporcionó el producto deseado (60 mg, 54%) como un sólido color gris: Pureza por medio de CL-EM del 98%, m/z 536 [M+H]+, RMN XH (300 MHz, CDC13) 7.65-7.44 (1H, m) , 7.39-7.29 (2H, m) , 6.96-6.82 (2H, m) , 6.66 (2H, d amplio, J=8.1 Hz), 5.82 (1H, d, J=9.9 Hz) , 4.20-4.07 (3H, m) , 3.48 (1H, dd, J=4.8, 8.7 Hz), 2.22-2.15 (1H, m) , 1.91-1.84 (1H, m) , 1.62 (2H, s amplio), 1.43 (9H, s) .
EJEMPLO 4 Este ejemplo describe la modificación del inhibidor conocido de DHFR 5-metil-6- ( ( 3, 4 , 5-trimetoxifenilamino) metil)pirido[2, 3-d] pirimidin-2, 4 -diamina (compuesto (2 G=W) ) por medio de la unión de una configuración de éster de aminoácido en un punto donde no ocurre la alteración de su modo de enlace Compuesto (2 G=N) : 5-metil-6- ( ( 3, 4 , 5-trimetoxifenilamino) -metil) pirido [2, 3-d] pirimidin-2, 4 -diamina El compuesto (2 G=N) se preparó por medio de una modificación del método descrito en J. Med. Chem . 1993, 36, 3437-3443. El 2 , -diamino-5-metilpirido [2 , 3-d] pirimidin-6-carbonitrilo (0.10 g, 0.5 mmol), la 3, 4 , 5-trimetoxianilina (0.10 g, 0.55 mmol) y el níquel Raney (0.7 g, húmedo) en ácido acético (20 mi) se agitaron a temperatura ambiente bajo una atmósfera de hidrógeno. Después de 2 horas, la mezcla de reacción se filtró a través de celite y el solvente se evaporó bajo presión reducida. El residuo crudo se purificó por medio de la CLAR de fase inversa para proporcionar el compuesto (2 G=N) como un sólido (22 mg, 16%). Pureza por medio de CL-EM del 94%, m/z 371.1 [M+H]+, RMN XH (400 MHz, DMSO), d: 8.5 (1H, s), 7.0 (2H, s amplio), 6.2 (2H, s amplio), 6.0 (2H, s), 5.7 (1H, m) , 4.2 (2H, d) , 3.7 (6H, s), 3.5 (3H, s) , 2.7 (3H, s) . Los compuestos basados en el compuesto (2 G=N) se prepararon por medio de los métodos resumidos a continuación. Los compuestos (6) y (19) se prepararon por medio del método descri to en el siguien te esquema de reacción 14 : ESQUEMA DE REACC IÓN 14 Acido fórmico Et3N, EtOH Etapa 2 Pd/C Compuesto (19) Etapa 1 - Síntesis del 4-metil-2- (4-nitrobenzamido) pentanoato de ( S) -ciclopentilo El cloruro de 4-nitrobenzoilo (0.60 g, 3.9 mmol) en DCM (2 mi) se agregó gota a gota durante 10 minutos a una solución de 2-amino-4-metilpentanoato de ( S) -ciclopentilo (0.70 g, 3.5 mmol) y diisopropiletilamina (0.94 mi, 5.3 mmol) en DCM (10 mi) a -5°C bajo una atmósfera de nitrógeno. Con la consumación de la adición, la mezcla de reacción se dejó calentar a la temperatura ambiente y se agitó durante 30 minutos adicionales. La mezcla de reacción se vertió sobre NaHC03 acuoso saturado y la capa acuosa se extrajo con DCM. Los extractos orgánicos se combinaron, se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgS04 y se evaporaron bajo presión reducida para proporcionar el compuesto del titulo como un sólido oleoso en un rendimiento cuantitativo. Pureza por medio de CL-EM del 92%, m/z 347.1 [M+H]+.
Etapa 2 - Síntesis del 2- (4-aminobenzamido) -4-metilpentanoato de ( S) -ciclopentilo La trietilamina (1.09 g, 10.8 mmol) y el ácido fórmico (0.50 g, 10.8 mmol) se disolvieron en EtOH (10 mi) y se agregaron a una solución del producto de la Etapa 1 (1.2 g, 3.4 mmol) en EtOH (10 mi) . Se agregó Pd al 10%/C (aproximadamente 10% en mol) y la mezcla calentó a reflujo. Después de 1 hora, la mezcla de reacción caliente se filtró a través de celite y el residuo se lavó con MeOH. El producto filtrado y los lavados se combinaron y se evaporaron y el residuo se dividió entre DCM y NaHC03 acuoso saturado. La capa orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre MgS04 y se evaporó bajo presión reducida para proporcionar el compuesto del titulo como un sólido color blanco (0.80 g, 73%). Pureza por medio de CL-EM del 97%, m/z 319.2 [M+H]+, RMN XH (400 MHz, CDC13) , d: 7.6 (2H, dd) , 6.6 (2H, dd) , 5.2 (1H, ) , 6.4 (1H, d) 4.7 (1H, m) , 4.0 (2H, s) , 1.9 (2H, m) , 1.7 (5H, m) , 1.6 (4H, m) , 0.9 (6H, dd) .
Etapa 3 - Síntesis del éster ciclopentilico del ácido (S)-2-{ 4- [ (2 , 4-diamino-5-metil-pirido [2, 3-d] pirimidin-6-ilmetil) -amino] -benzoilamino} -4-metil-pentanoico (6) El 2, -diamino-5-metilpirido [2, 3-d] pirimidin-6-carbonitrilo (0.47 g, 2.4 mmol), el producto de la Etapa 2 (300 mg, 0.94 mmol) y el níquel Raney (1 g, húmedo) en ácido acético (40 mi) se agitaron a temperatura ambiente bajo una atmósfera de hidrógeno. Después de 48 horas, la mezcla de reacción se filtró a través de celite y el solvente se evaporó bajo presión reducida. El material se cargó en MeOH sobre una columna SCX y se eluyó con una solución de amoniaco al 1% en MeOH. El producto crudo entonces se adsorbió sobre sílice y se purificó por medio de la cromatografia en columna (MeOH al 10%/DCM) para proporcionar el compuesto (6) (60 mg, 13%). Pureza por medio de CL-EM del 95%, m/z 506.1 [M+H]+, RMN lH (400 MHz, DMSO), d: 8.5 (1H, s), 8.2 (1H, d) , 7.7 (2H, d) , 7.0 (2H, s amplio), 6.7 (2H, d) , 6.5 (1H, m) , 6.2 (2H, s amplio), 5.1 (1H, m) , 4.4 (1H, m) , 4.3 (2H, d) , 2.7 (3H, s), 1.7 (11H, m) , 0.9 (6H, dd) .
Etapa 4 - Síntesis del ácido ( S) -2- ( 4- ( (2, 4-diamino-5-metilpirido[2, 3-d] pirimidin-6-il) metilamino) benzamido) -4-metilpentanoico (19) El producto de la Etapa 3 (39 µM) se suspendió en EtOH (1.0 mi). Una solución de hidróxido de litio 1M (156 µl) se agregó a lo anterior y la suspensión se dejó agitar durante 48 horas. El EtOH se retiró subsecuentemente bajo presión reducida, el residuo se diluyó con agua y se bajó a pH 4 con ácido acético diluido. La solución se lavó con DCM, se evaporó y se sujetó a la purificación de SCX para proporcionar el compuesto (19) . Pureza por medio de CL-EM del 92%, m/z 438 [M+H]+; RMN XH (400 MHz, DMSO) d: 8.5 (1H, s), 8.1 (1H, d) , 7.7 (2H, d) , 7.2 (2H, s amplio), 6.7 (2H, d) , 6.5 (1H, t), 6.4 (2H, s amplio), 4.4 (1H, m) , 4.3 (2H, d) , 2.7 (3H, s), 1.8-1.6 (2H, m) , 1.6-1.5 (1H, m) , 0.9 (6H, dd) . El compuesto (5) y el ácido correspondiente se prepararon por medio del método descri to en el siguiente esquema de reacción 15 : ESQUEMA DE REACCIÓN 15 Ni Raney H2NNr Etapa 2 EtOH Etapa 1 - Síntesis del 4-metil-2- (4-nitrobencilamino) pentanoato de ( S) -ciclopentilo A una solución del 2-amino-4-metilpentanoato de (S) -ciclopentilo (2.00 g, 10.0 mmol) y 4-nitrobenzaldehido (3.04 g, 20.0 mmol) en DCM (40 mi) se agregó ácido acético glacial (2 gotas) . La solución se dejó agitar a temperatura ambiente durante 1 hora después de lo cual se agregó triacetoxiborohidruro de sodio (6.40 g, 30.2 mmol) en una porción individual. Después de la agitación durante 3 horas, la solución se vertió sobre HCl 1M acuoso, se dejó agitar durante 30 minutos, se neutralizó con NaOH 1M acuoso y se extrajo con DCM. Los elementos orgánicos combinados se lavaron con agua y salmuera, se secaron sobre MgS04 y se evaporaron bajo presión reducida. El material crudo se purificó por medio de la cromatografia (EtOAc al 5%/isohexano) para proporcionar el compuesto del titulo como un aceite (1.51 g) . Este se utilizó sin purificación adicional para el siguiente paso. Pureza por medio de CL-EM del 71%, m/z 335.1 [M-H]+.
Etapa 2 - Síntesis del éster ciclopentilico del ácido (S)-2-( 4 -amino-bencilamino) -4-metil-pentanoico El producto de la Etapa 1 (0.90 g, 2.7 mmol) se disolvió en EtOH (5 mi) y se agregó a una suspensión de níquel Raney (~ 0.5 g) y monohidrato de hidrazina (0.38 mi, 8.1 mmol) en EtOH (5 mi) . Después del calentamiento bajo reflujo durante 1 hora, la mezcla de reacción caliente se filtró a través de celite y el residuo se lavó con MeOH. El producto filtrado y los lavados se combinaron y se evaporaron y el residuo se dividió entre DCM y carbonato ácido de sodio acuoso saturado. La capa orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre MgS04 y se evaporó bajo presión reducida. El material crudo se purificó por medio de la cromatografia (EtOAc al 20%/isohexano) para proporcionar el compuesto del titulo como un aceite (0.50 g, 61%). Pureza por medio de CL-EM del 99%, m/z 305.2 [M+H]t, RMN H (400 MHz, CDC13) , d: 7.1 (2H, d) , 6.6 (2H, d) , 5.2 (1H, m) , 3.7 (1H, d) , 3.5 (1H, d) , 3.2 (1H, t), 1.9 (2H, m) , 1.7 (5H, m) , 1.6 (4H, m) , 0.9 (6H, dd) .
Etapa 3 - Síntesis del éster ciclopentilico del ácido (S)-2-{ 4- [ (2 , 4 -diamino-5-metil-pirido [2 , 3-d] pirimidin-6-ilmetil ) -amino] -bencilamino} -4-metil-pentanoico (5) El 2, 4-diamino-5-metilpirido [2, 3-d] pirimidin-6-carbonitrilo (0.16 g, 0.83 mmol), el producto de la Etapa 2 (100 mg, 0.33 mmol) y niquel Raney (1 g, húmedo) en ácido acético (10 mi) se agitaron a temperatura ambiente bajo una atmósfera de hidrógeno. Después de 5 horas, la mezcla de reacción se filtró a través de celite y el solvente se evaporó bajo presión reducida. El material se cargó en MeOH sobre una columna SCX y se eluyó con una solución de amoniaco al 1% en MeOH. El producto crudo entonces se adsorbió sobre sílice y se purificó por medio de la cromatografia en columna (MeOH al 10%/DCM) para proporcionar el compuesto del titulo (5) (30 mg, 19%). Pureza por medio de CL-EM del 95 %, m/z 492.1 [M+H]\ RMN 1ti (400 MHz, DMSO), d: 8.5 (1H, s), 7.2 (2H, s amplio), 7.0 (2H, d) , 6.6 (2H, d) , 6.2 (2H, s amplio), 5.8 (1H, m) , 5.1 (1H, m) , 4.2 (2H, s), 3.6 (1H, m) , 3.4 (1H, m) , 3.1 (1H, m) , 2.7 (3H, s), 1.5 (11H, m) , 0.8 (6H, dd) .
Etapa 4 - Síntesis del ácido (S) -2- { 4- [ (2 , 4-diamino-5-metil-pirido [2, 3-d] pirimidin-6-ilmetil) -amino] -bencilamino} -4-metil-pentanoico El producto de la Etapa 3 (39 µM) se suspendió en EtOH (1.0 mi). Una solución de hidróxido de litio 1M (156 µl) se agregó a lo anterior y la suspensión se dejó agitar durante 48 horas. El EtOH se retiró subsecuentemente bajo presión reducida, el residuo se diluyó con agua y se bajó a pH 4 con ácido acético diluido. La solución se lavó con DCM, se evaporó y se sujetó a la purificación de SCX para proporcionar el compuesto del titulo, pureza por medio de CLEM: 95% a Rt 0.52 y 1.91 minutos, m/z (ES+) 424 [M+H]+; RMN XH (400 MHz, DMSO) d: 8.5 (1H, s), 7.1 (2H, d) , 7.0 (2H, s amplio), 6.6 (2H, d) , 6.2 (2H, s amplio), 5.7 (1H, t), 4.3 (2H, d) , 3.6 (1H, m) , 3.3 (2H, oscurecido por el agua), 2.7 (3H, s), 1.8 (1H, m) , 1.3 (1H, m) , 1.2 (1H, m) .
El compues to (3) se preparó por medio del método descri to en el siguien te esquema de rea cción 16: ESQUEMA DE REACCIÓN 16 Acido fórmico Et3N, Pd/C Etapa 2 EtOH Ni Raney AcOH Etapa 3 Compuesto (3) Etapa 1 - Síntesis del ( S) -ciclopentil-2- ( terc-butoxicarbonilamino) -4- ( 4-nitrofenoxi) butanoato A una solución de 4-nitrofenol (2.18 g, 15.7 mmol) en tetrahidrofurano (100 mi) a 0°C bajo nitrógeno se agregó hidruro de sodio (0.63 g, 15.7 mmol). Después del calentamiento a la temperatura ambiente y la agitación durante 10 minutos, se agregó una solución de (S)-ciclopentil-4-bromo-2- ( terc-butoxicarbónilamino) butanoato (5.0 g, 14.3 mmol) en DMF (20 mi). La reacción se calentó a 60°C durante 10 horas, después de lo cual la reacción se enfrió a temperatura ambiente y se vertió sobre éter/carbonato de sodio. La capa orgánica se recolectó y se lavó con una solución acuosa de carbonato de sodio 2M, HCl 1M y salmuera antes de secarse sobre MgS0 y se concentró bajo presión reducida para proporcionar un aceite el cual se solidificó con el reposo para producir el compuesto del titulo (4.0 g, 69%) . Pureza por medio de CL-EM del 97%, m/z 407.1 [M+H]+, RMN XH (400 MHz, CDC13), d: 8.2 (2H, d) , 7.4 (1H, d) , 7.1 (2H, d) , 5.1 (1H, m) , 4.1 (3H, m) , 2.1 (2H, m) , 1.8 (2H, m) , 1.6 (6H, m) , 1.4 (9H, Etapa 2 - Síntesis del (S) -ciclopentil-4- (4-aminofenoxi) -2- ( terc-butoxicarbonilamino) butanoato La trietilamina (0.77 mi, 5.2 mmol) y ácido fórmico (0.19 mi, 5.2 mmol) se disolvieron en EtOH (4 mi) y se agregaron a una solución del producto de la Etapa 1 (0.7 g, 1.7 mmol) en EtOH (4 mi). Se agregó Pd al 10%/C (aproximadamente 10% en mol) y la mezcla se calentó a reflujo. Después de 2 horas, la mezcla se reacción caliente se filtró a través de celite y el residuo se lavó con MeOH. El producto filtrado y los lavados se combinaron y se evaporaron y el residuo se dividió entre DCM y carbonato ácido de sodio acuoso saturado. La capa orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre MgS04 y se concentró bajo presión reducida. El residuo se purificó por medio de la cromatografia en columna (elución de gradiente, 10-40% de EtOAc en hexano) para proporcionar el compuesto del titulo (0.3 g, 46%). Pureza por medio de CL-EM del 93%, m/z 379.1 [M+H]+, RMN XH (400 MHz, CDC13), d: 6.9 (2H, d) , 6.8 (2H, d) , 5.3 (2H, m) , 4.4 (1H, m) 4.0 (2H, m) , 2.3 (1H, m) , 2.2 (1H, m) , 1.9 (2H, m) , 1.7 (4H, m) , 1.6 (2H, m) , 1.4 (9H, s).
Etapa 3 - Síntesis del ( S) -ciclopentil-2- ( terc-butoxicarbonilamino) -4- (4- ( (2, 4-diamino-5-metilpirido [2,3-d] pirimidin-6-il) metilamino) fenoxi) butanoato El 2, 4-d?ammo-5-met?lpir?do [2, 3-d] p?pmidin-6-carbonitrilo (0.50 g, 2.5 mmol), el producto de la Etapa 2 (0.38 g, 1.0 mmol) y el níquel Raney (3 g, húmedo) en ácido acético (40 mi) se agitaron a temperatura ambiente bajo una atmósfera de hidrógeno. Después de 16 horas, la mezcla de reacción se filtró a través de celite y el solvente se evaporó bajo presión reducida. El material se cargó en MeOH sobre una columna SCX y se eluyó con una solución de amoniaco al 1% en MeOH. El producto crudo entonces se adsorbió sobre sílice y se purifico por medio de la cromatografia en columna (MeOH al 5%/DCM) para proporcionar el compuesto del titulo (145 mg, 26%). Pureza por medio de CL-EM del 95 %, m/z 566.2 [M+H]+, RMN 1H (400 MHz, DMSO), d: 8.5 (1H, s), 7.3 (2H, m) , 7.0 (2H, m) , 6.7 (2H, d) , 6.6 (2H, d) , 6.2 (2H, s amplio), 5.5 (1H, s amplio), 5.1 (1H, m) , 4.1 (3H, m) , 3.9 (2H, m) , 2.6 (3H, s), 2.0 (1H, m) , 1.8 (3H, m) , 1.6 (6H, m) , 1.4 (9H, s) .
Etapa 4 - Síntesis del éster ciclopentilico del ácido (S)-2-amino-4-{ 4- [ (2, 4-d?ammo-5-met?l-p?r?do [2, 3-d] p?pmidin-6-ílmetil ) -ammo] -fenoxi } -butírico (3) A una solución del producto de la Etapa 3 (145 mg, 0.26 mmol) en DCM (3 mi) se agregó ácido trifluoroacético (3 mi) y la reacción se agitó durante 30 minutos a temperatura ambiente. El solvente se evaporó bajo presión reducida y el residuo crudo se purificó por medio de la carga en MeOH sobre una columna SCX y eluyendo con una solución de amoniaco al 1% en MeOH para proporcionar el compuesto (3) (39 mg, 33%).
Pureza por medio de CL-EM del 94 %, m/z 466.1 [M+H]', RMN XH (400 MHz, DMSO), d: 8.5 (1H, s), 7.0 (2H, s amplio), 6.7 (2H, d) , 6.6 (2H, d) , 6.2 (2H, s amplio), 5.5 (1H, s amplio), 5.1 (1H, m) , 4.1 (2H, s), 3.9 (2H, m) , 3.4 (1H, m) , 2.7 (3H, s), 2.0 (2H, m) , 1.8 (3H, m) , 1.6 (6H, m) .
El Compues to (4) se preparó por medio del método descri to en el si guien te esquema de rea cción 1 1 : ESQUEMA DE REACCIÓN 17 TFA / DCM Etapa 2 xy NH, Acido fórmico Et-N, Pd/C Etapa 4 EtOH Compuesto (4) La Etapa 1 es la misma que aquella descrita para el compuesto (3) .
Etapa 2 - Síntesis del 2-ammo-4- (4-n?trofenoxi ) butanoato de (S) -ciclopentilo A una solución del producto de la Etapa 1 (4.0 g, 9.8 mmol) en DCM (12 mi) se agrego ácido tpfluoroacéti co (12 mi). Después de la agitación a temperatura ambiente durante 1 hora, la reacción se diluyó con DCM, se enfrió en hielo y se neutralizó por la adición de amoniaco acuoso. La capa orgánica se recolectó y se lavó con agua, carbonato ácido de sodio acuoso y salmuera, luego se secó sobre MgS04 y se concentro ba o presión reducida para proporcionar el compuesto del titulo como un aceite color amarillo (3.0 g, 100%). Pureza por medio de CL-EM del 97%, m/z 309.1 [M+H]+, RMN XH (400 MHz, CDC13), d: 8.2 (2H, d) , 7.0 (2H, d) , 5.2 (1H, m) , 4.2 (2H, m) , 3.6 (1H, dd) , 1.7-1.5 (10H, m) .
Etapa 3 - Síntesis del 2- (ciclohexilammo) -4- (4-nitrofenoxi) butanoato de ( S) -ciclopentilo A un matraz que contenia el producto de la Etapa 2 (1.0 g, 3.3 mmol) y ciclohexanona (0.34 mi, 3.3 mmol) bajo nitrógeno se agregó MeOH anhidro (10 mi) . Después de la agitación durante 12 horas a temperatura ambiente se agregó triacetoxiborohidruro de sodio (2.07 g, 9.75 mmol). Después de 4 horas, la reacción se vertió lentamente sobre una mezcla de DCM/HC1 acuoso (1M). Después de la agitación durante 10 minutos, la capa orgánica se recolectó y se lavó con carbonato ácido de sodio y salmuera, luego se secó sobre MgS04 y se concentró bajo presión reducida para proporcionar el compuesto del titulo como un sólido oleoso color amarillo (1.21 g, 95%) . Pureza por medio de CL-EM del 92%, m/z 391.1 [M+H]+.
Etapa 4 - Síntesis del 4- (4-aminofenoxi ) -2- (ciclohexilamino) -butanoato de ( S) -ciclopentilo La trietilamina (1.29 mi, 9.3 mmol) y el ácido fórmico (348 µl , 9.3 mmol) se disolvieron en EtOH (10 mi) y se agregaron a una solución del producto de la Etapa 3 (1.2 g, 3.1 mmol) en EtOH (10 mi). Se agregó Pd al 10%/C (aproximadamente 10% en mol) y la mezcla se calentó a reflujo. Después de 30 minutos, la mezcla de reacción caliente se filtró a través de celite y el residuo se lavó con MeOH. El producto filtrado y los lavados se combinaron y se evaporaron y el residuo se dividió entre DCM y NaHC03 acuoso saturado. La capa orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre MgS04 y se concentró bajo presión reducida para proporcionar el compuesto del titulo (1.01 g, 92%). Pureza por medio de CL-EM del 94%, m/z 361.1 [M+H]4, RMN 1ti (400 MHz, CDC13), d: 6.7 (2H, d) , 6.6 (2H, d) , 5.2 (1H, m) , 4.0 (1H, m) , 3.9 (1H, m) , 3.5 (1H, dd) , 2.3 (1H, m) , 2.1 (1H, m) , 1.9 (4H, m) , 1.7 (7H, m) , 1.6 (3H, m) , 1.3-0.9 (5H, m) .
Etapa 5 - Síntesis del éster ciclopentilico del ácido (S)-2-ciclohexilamino-4- { 4- [ (2 , 4-diamino-5-metil-pirido [2,3-d] pirimidin-6-ilmetil ) -amino] -fenoxi } -butírico (4) El 2, 4-diamino-5-metilpirido [2, 3-d] pirimidin-6-carbonitrilo (0.50 g, 2.5 mmol), el producto de la Etapa 4 (0.36 g, 1.0 mmol) y el níquel Raney (3 g, húmedo) en ácido acético (40 mi) se agitaron a temperatura ambiente bajo una atmósfera de hidrógeno. Después de 48 horas, la mezcla de reacción se filtró a través de celite y el solvente se evaporó bajo presión reducida. El material se cargó en MeOH sobre una columna SCX y se eluyó con una solución de amoniaco al 1% en MeOH. El producto crudo entonces se adsorbió sobre sílice y se purificó por medio de la cromatografia en columna (MeOH al 10%/DCM) para proporcionar el compuesto del titulo (76 mg, 14%). Pureza por medio de CL-EM del 90 %, m/z 548.2 [M+H]+, RMN ? (400 MHz, DMSO), d: 8.5 (1H, s), 7.0 (2H, s amplio), 6.7 (2H, d) , 6.6 (2H, d) , 6.2 (2H, s amplio), 5.5 (1H, m) , 5.1 (1H, m) , 4.1 (2H, s), 3.9 (2H, m) , 3.4 (1H, m) , 2.7 (3H, s) , 2.3 (1H, m) , 1.9 (1H, m) , 1.8 (4H, m) , 1.6 (11H, m) , 1.1 (5H, m) .
EJEMPLO 5 Este ejemplo describe la modificación del inhibidor conocido de cinasa PI3 N- [5- (4-cloro-3-metanosulfonil-fenil) -4-metil-tiazol-2-il] -acetamida (compuesto (20)) por medio de la unión de una configuración de éster de aminoácido a un punto donde no ocurre la alteración de su modo de enlace.
Compuesto (20): N- [5- (4-cloro-3-metanosulfonil-fenil) -4-metil-tiazol-2-il ] -acetamida El compuesto (20) se preparó como se describe en el documento O03072552 Los compuestos basados en el compuesto (20) se prepararon por medio de los métodos resumidos a continuación. Los compues tos (21) y (22) se prepararon por medio del método descri to en el siguien te esquema de reacción 18 : ESQUEMA DE REACCIÓN 18 Etapa 3 EDCI, HOBt Etapa 5 NaOH, THF, MeOH Etapa 7 Etapa 1 - Síntesis del cloruro de 2-cloro-5- (2-oxo-propil' bencensulfonilo La 4-clorofenilacetona (4 g, 0.023 mol) se agregó gota a gota al ácido clorosulfónico (30 mi, 0.45 mol) a -10°C bajo N2 con agitación suave. La mezcla de reacción se dejó calentar a la temperatura ambiente y la agitación continuó durante 18 horas. La mezcla de reacción se enfrió rápidamente de manera cuidadosa por la adición gota a gota al hielo triturado (500 mi) . La solución acuosa se extrajo con EtOAc (3 x 250 mi) . Las capas de EtOAc se combinaron, se secaron (Na2S04), se filtraron y se concentraron a sequedad in va cuo para proporcionar el compuesto crudo del titulo (6.3 g, 65%) el cual se utilizó en el siguiente paso sin purificación adicional. Pureza por medio de CL-EM del 92%. RMN 1ñ (400 MHz, CDC13), d: 2.30 (3H, s), 3.85 (2H, s), 7.50 (1H, d) , 7.65 (1H, d) , 7.95 (1H, s) .
Etapa 2 - Síntesis de la 1- (4-cloro-3-metanosulfonil-fenil) -propan-2-ona Una mezcla de Na2S03 (3.79 g, 0.030 mol) y NaHC03 (2.53 g, 0.030 mol) en agua (90 mi) se agitó a 70°C. A esta solución se agregó una solución del producto de la Etapa 1 (4.65 g, 0.015 mol) en dioxano (190 mi). La agitación continuó a 70°C durante 1 hora. Con el enfriamiento a la temperatura ambiente, la mezcla de reacción se concentró a sequedad in va cuo proporcionando un sólido color café. La DMF (190 mi) se agregó seguida por Mel (1.88 mi, 0.030 mol) . La mezcla de reacción se agitó a 40°C durante 1 hora. Después de la consumación de la reacción, la mezcla se vertió en agua (90 mi) y se extrajo con EtOAc (500 mi) . El EtOAc se secó (Na2S04) , se filtró y se concentró in va cuo para proporcionar el compuesto del titulo como un sólido color café (2.49 g, 67%) el cual se utilizó en el siguiente paso sin purificación adicional. Pureza por medio de CL-EM del 81%, m/z 247 [M++H] ; RMN XH (400 MHz, CDC13), d: 2.15 (3H, s), 3.20 (3H, s), 3.75 (2H, s), 7.35 (1H, d) , 7.45 (1H, d) , 7.85 (1H, s).
Etapa 3 - Síntesis de la 1-bromo-l- (4-cloro-3-metanosulfonil-fenil) -propan-2-ona A una solución agitada del producto de la Etapa 2 (1.88 g, 7.60 mmol) en 1,4-dioxano (120 mi) el bromuro (0.292 mi, 5.72 mmol) se agregó gota a gota a temperatura ambiente proporcionando una solución color anaranjado oscuro. La agitación continuó durante 18 horas. La mezcla de reacción se evaporó a sequedad in va cuo evitando el calentamiento sobre 30°C durante la evaporación. El residuo se disolvió nuevamente en EtOAc (100 mi) y se lavó con NaHC03 acuoso saturado (20 mi) seguido por agua (20 mi). La capa de EtOAc se secó (Na2S04) , se filtró y se concentró in va cuo . La purificación por medio de la cromatografia con evaporación instantánea (EtOAc al 50%/heptano) proporcionó el compuesto del titulo como un aceite color amarillo (2.0 g, 80%) . Pureza por medio de CL-EM del 74%, m/z 325/327 [M++H] ; RMN TH (400 MHz, CDC13) , d: 2.35 (3H, s), 3.25 (3H, s), 5.35 (1H, s), 7.50 (1H, d) , 7.65 (1H, dd) , 8.05 (1H, s).
Etapa 4 - Síntesis del 5- (4-cloro-3-metanosulfonil-fenil) -4-meti1-tiazol-2-ilamina Una mezcla del producto de la Etapa 3 (2 g, 6.15 mmol) y tiourea (468 mg, 6.15 mmol) en EtOH (65 mi) se agitó a 70°C durante 1.5 horas. La reacción entonces se enfrió a temperatura ambiente y ocurrió la precipitación. El sólido color crema se recolectó por medio de la filtración para proporcionar el compuesto del titulo (1.2 g, 64%). Pureza por medio de CL-EM del 91%, m/z 303 [M++H] , RMN XH (400 MHz, MeOD), d: 2.35 (3H, s), 3.35 (3H, s), 7.75-7.85 (2H, m) , 8.15 (1H, s) .
Etapa 5 - Síntesis del éster ciclopentilico del ácido (S)-2-terc-butoxicarbonilamino-4- [5- ( 4-cloro-3-metanosulfonil-fenil) -4-metil-tiazol-2-ilcarbamoil] -butírico A una mezcla agitada del éster 1-ciclopentilico del ácido 2-terc-butoxicarbonilamino-pentanodióico (208 mg, 0.66 mmol), EDC1 (190 mg, 0.99 mmol) y HOBt (107 mg, 0.79 mmol) en DMF (1.5 mi) se agregó gota a gota una solución del producto de la Etapa 4 (200 mg, 0.66 mmol) en DMF (1.5 mi) a temperatura ambiente. Se agregó trietilamina (0.138 mi, 0.99 mmol) y la agitación continuó durante 18 horas. La mezcla de reacción se diluyó con agua (10 mi) y se extrajo con EtOAc (15 mi) . La capa de EtOAc se lavó con agua (10 mi), se secó (Na2S04) , se filtró y se concentró in vacuo . La purificación por medio de la CCD preparativa (EtOAc al 70%/heptano, Rf 0.5) proporcionó el compuesto del titulo (160 mg, 40%). Pureza por medio de CL-EM del 91%, m/z 600/602 [M++H] , RMN XH (400 MHz, DMSO), d: 1.45-1.55 (9H, s), 1.65-2.15 (10H, m) , 2.45 (3H, s), 2.70 (2H, m) , 3.45 (3H, s), 4.10-4.25 (1H, m) , 5.25 (1H, m) , 7.75-7.90 (2H, m) , 8.25 (1H, s).
Etapa 6 - Síntesis del éster ciclopentilico del ácido (S)-2-amino-4- [5- (4-cloro-3-metanosulfonil-fenil ) -4-metil-tiazol-2-ilcarbamoil] -butírico (21) Una solución del producto de la Etapa 5 (140 mg, 0.233 mmol) en TFA al 20%/DCM (2 mi) se dejó reposar a temperatura ambiente durante 3 horas. Después de la consumación de la reacción, la mezcla se concentró in va cuo para proporcionar el compuesto (21) (143 mg, 100%). Pureza por medio de CL-EM del 97%, m/z 500/502 [M++H] , RMN 1H (400 MHz, MeOD), d: 1.35-1.85 (8H, m) , 2.00-2.20 (2H, m) , 2.25 (3H, s), 2.60 (2H, m) , 3.20 (3H, s), 3.85-4.00 (1H, m) , 5.10 (1H, m) , 7.50-7.65 (2H, m) , 7.95 (1H, s).
Etapa 7 - Síntesis del ácido ( S) -2-terc-butox?carbon?lam?no-4- [5- (4-cloro-3-metanosulfon?l-fenil) -4-met?l-t?azol-2-ílcarbamoil] -butírico A una solución del producto de la Etapa 5 (20 mg, 0.033 mmol) en una mezcla de THF (0.5 mi) y MeOH (0.5 mi) se agregó NaOH acuoso 2M (0.5 mi) . La mezcla se dejó reposar a temperatura ambiente durante 3 horas. Con la consumación de la reacción, la mezcla se concentró casi a sequedad y el HCl 1M se agregó gota a gota hasta pH 1-2. El producto precipitado resultante se recolectó por medio de la filtración bajo una presión ligera. El sólido se lavó con agua (0.5 mi) y se secó completamente m vacuo para producir el compuesto del titulo (12 mg, 68%) . Pureza por medio de CLEM del 94%, m/z 532/534 [M++H] , RMN XH (400 MHz, CDC13) , d: 1.55-1.70 (9H, s), 2.15-2.55 (2H, m) , 2.60 (3H, s), 2.75-2.90 (2H, m) , 3.55 (3H, s), 4.25-4.45 (1H, m) , 7.85-8.00 (2H, m) , 8.35 (1H, s) .
Etapa 8 - Síntesis del ácido (S) -2-amino-4- [ 5- (4-cloro-3-metanosulfonil-fenil) -4-metil-tiazol-2-ilcarbamoil] -butírico (22) Una solución del producto de la Etapa 7 (12 mg, 0.0225 mmol) en TFA al 20%/DCM (0.3 mi) se dejó reposar a temperatura ambiente durante 3 horas. Después de la consumación de la reacción, la mezcla se concentró in va cuo para proporcionar el compuesto del titulo (22) (12 mg, 100%) . Pureza por medio de CL-EM del 94%, m/z 432/434 [M++H] , RMN 3H (400 MHz, MeOD), d: 2.10-2.25 (2H, m) , 2.30 (3H, s) , 2.65-2.75 (2H, m) , 3.25 (3H, s), 3.95-4.05 (1H, m) , 7.60-7.80 (2H, m) , 8.05 (1H, s) .
El compues to (23) se preparó por medio del método descri to en el siguiente esquema de reacción 19 : ESQUEMA DE REACCIÓN 19 , dioxano Etapa 3 EDCI, HOBt Et3N, DMF Etapa 5 Las etapas 1, 2, 3 y 4 son las mismas que aquellas descritas para la preparación de los compuestos (21) y (22) Etapa 5 - Síntesis del éster terc-butilico del ácido (S)-2-amino-4- [5- (4-cloro-3-metanosulfonil-fenil) -4-metil-tiazol-2-ilcarbamoil] -butírico Este compuesto se preparó a partir del éster 1-terc-butilico del ácido 2-terc-butoxicarbonilamino-pentanodióico y la 5- (4-cloro-3-metanosulfonil-fenil) -4-metil-tiazol-2-ilamina (producto de la Etapa 4) siguiendo el procedimiento descrito para la síntesis del compuesto (21) .
Etapa 6 - Síntesis del éster terc-butilico del ácido (S)-2-amino-4- [5- ( 4-cloro-3-metanosulfonil-fenil) -4-metil-tiazol-2-ilcarbamoil] -butírico (23) A una solución del producto de la Etapa 5 (50 mg, 0.085 mmol) en EtOAc (0.25 mi) se agregó una solución de HCl/éter 2M (0.25 mi) a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se agitó vigorosamente durante 4 horas. La reacción se trató nuevamente con una mezcla de EtOAc (0.25 mi) y HCl/éter 2 M (0.25 mi). La agitación continuó durante 1 hora. El producto precipitado que se formó se recolectó por medio de la filtración bajo gravedad, se dividió entre EtOAc (3 mi) y NaHC03 acuoso saturado (0.5 mi) . La capa de EtOAc se lavó con agua (1 mi), se secó (Na2S04), se filtró y se concentró in va cuo para proporcionar el compuesto (23) (6.5 mg, 16%) . Pureza por medio de CL-EM del 95%, m/z 488/490 [M++H] , RMN XH (400 MHz, MeOD), d: 1.35-1.40 (9H, s), 1.80-2.05 (2H, m) , 2.30 (3H, s), 2.45-2.55 (2H, m) , 3.25 (3H, s) , 3.30-3.35 (1H, m) , 7.60-7.70 (2H, m) , 8.05 (1H, s).
Ensayos Biológicos Ensayo de actividad inhibitoria de histona desacetilasa La capacidad de los compuestos para inhibir las actividades de histona desacetilasa se midió utilizando el ensayo de actividad fluorescente de HDAC comercialmente disponible de Biomol. En resumen, el substrato Fluor de LysMR, una lisina con una acetilación en épsilon-amino se incuba con la fuente de la actividad de histona desacetilasa (extracto nuclear de células HeLa) en presencia o ausencia de un inhibidor. La desacetilación del substrato sensibiliza al substrato hacia el desarrollador Fl uor de LysMR , el cual genera un fluoróforo. De esta manera, la incubación del substrato con una fuente de actividad de HDAC da por resultado un incremento en la señal que es disminuida en presencia de un inhibidor de HDAC. Los datos se expresan como un porcentaje del control, medido en ausencia del inhibidor, con una señal de fondo que es substraída de todas las muestras, como sigue: - % de actividad = ( (S1 - B)/(S° - B) ) x 100 donde S1 es la señal en presencia de un substrato, enzima e inhibidor, S° es la señal en presencia de un substrato, enzima y el vehículo en el cual se disuelve el inhibidor y B es la señal de fondo medida en ausencia de una enzima. Los valores IC50 se determinaron por medio del análisis de regresión no lineal, después de ajustar los resultados de ocho puntos de datos a la ecuación para la respuesta a la dosis sigmoidal con una pendiente variable (% de actividad contra la concentración logarítmica del compuesto) , utilizando el programa de computo Graphpad Prism. La actividad de histona desacetilasa de un extracto nuclear crudo derivado de células HeLa se utilizó para la selección. La preparación, adquirida de 4C (Seneffe, Bélgica) , se preparo de células HeLa recolectadas mientras estaban en la fase de crecimiento exponencial. El extracto nuclear se preparo de acuerdo con Dignam JD 1983 Nucí. Acid. Res. 11, 1475-1489, se congeló instantáneamente en nitrógeno liquido y se almaceno a -80°C. La composición de amortiguador final fue Hepes 20 mM, KCl 100 mM, EDTA 0.2 mM, DTT 0.5 mM, PMSF 0.2 mM y glicerol al 20% (v/v).
Ensayo de Actividad Inhibitoria de Aurora Cinasa A La capacidad de los compuestos para inhibir la actividad de la aurora cmasa A se midió utilizando un ensayo de microplacas. En resumen, las placas de 96 pocilios FlashplatesMR (PerkinElmer Life Sciences) se revistieron previamente con proteina básica mielina (MBP, por sus siglas en inglés) . La MBP (100 ul de 100 mg/ml en PBS) se incubó a 37 °C durante 1 hora, seguido por la incubación durante toda la noche a 4°C. Las placas entonces se lavaron con PBS y se dejaron secar al aire. Para determinar la actividad de la aurora cinasa A, 40 ng de enzima (ProQuinase: aurora cinasa A humana de longitud completa recombinante, fusionada en la N-terminal a GST y expresada por baculovirus en células de insecto Sf21) se incubaron en amortiguador de ensayo (Tris 50 mM (pH 7.5), NaCl 10 mM, MgCl22.5 mM, DTT 1 mM, DMSO al 0.4 %), ATP 10 µM (Km de la enzima) y [?-33P] -ATP 0.5 µCi y con concentraciones variantes de inhibidor. Los pocilios que carecían de inhibidor se utilizaron como controles de vehículo y los pocilios que no contenían enzima se utilizaron para medir la señal de fondo' . Las placas se incubaron durante toda la noche a 30°C. Después de la incubación, los contenidos de los pocilios se retiraron y las placas se lavaron 3 veces con PBS que contenia pirofosfato de tetra-sodio 10 mM antes del conteo de centelleo utilizando un dispositivo Wallac MicroBeta TriLux. Las curvas de respuesta a la dosis se generaron a partir de 10 concentraciones (concentración final superior 10 µM, con diluciones de 3 veces) , utilizando pocilios por triplicado. Los valores IC50 se determinaron por medio del análisis de regresión no lineal, después del ajuste de los resultados de puntos de datos a la ecuación para la respuesta a la dosis sigmoidal con una pendiente variable (% de actividad contra la concentración logarítmica del compuesto) , utilizando el programa de cómputo Xlfit.
Ensayo de Actividad Inhibitoria de la Dihidrofolato Reductasa (DHFR) La capacidad de los compuestos para inhibir la actividad de DHFR se midió en un ensayo basado en la capacidad de DHFR para catalizar la reducción dependiente de NADPH reversible del ácido dihidrofólico a ácido tetrahidrofólico utilizando un equipo Sigma (Número de catalogo CS0340) . Este utiliza un amortiguador de ensayo de marca registrada y DHFR humana recombinante a 7.5xl0"4 Unidades por reacción, NADPH a 60 µM y ácido dihidrofólico a 50 µM. La reacción fue seguida por la supervisión de la disminución en la absorbancia de 340 nm, durante un periodo de 2 minutos, a temperatura ambiente y la actividad de la enzima se calculó como la velocidad de disminución en absorbancia. La actividad de la enzima, en presencia del inhibidor, se expresó como un porcentaje de la actividad libre de inhibidor y el valor IC50 del inhibidor se determinó a partir de una curva de respuesta a la dosis sigmoidal utilizando el programa de cómputo Xlfit (% de actividad contra la concentración logarítmica del compuesto) . Cada muestra se condujo por triplicado y cada curva de respuesta a la dosis estaba compuesta de 10 diluciones del inhibidor.
Ensayo de Actividad Inhibitoria de la MAP Cinasa a P38 La capacidad de los compuestos para inhibir la actividad de MAP cinasa a P38 (enzima humana de longitud completa expresada en E coli como una proteina etiquetada con GST en la N-terminal) se midió en un ensayo realizado por Upstate (Dundee UK) . En un volumen de reacción final de 25 µl, la MAP cinasa a p38 (5-10 mU) se incubó con Tris 25 mM pH 7.5, EGTA 0.02 mM, 0.33 mg/ml de proteina básica mielina, acetato de magnesio 10 mM, ATP 90 µM (Km 97 µM) y [?-3 P]-ATP (actividad especifica de aproximadamente 500 cpm/pmol). La reacción se inició por la adición de la mezcla MgATP. Después de la incubación durante 40 minutos a temperatura ambiente, la reacción se detuvo por la adición de 5 µl de una solución de ácido fosfórico al 3%. 10 µl de la reacción entonces se colocaron sobre una estera de filtro P30 y se lavaron tres veces durante 5 minutos en ácido fosfórico 75 mM y una vez en metanol, antes del secado y el conteo de centelleo. Las curvas de respuesta a la dosis se generaron a partir de una serie de diluciones logarítmicas 1/2 de una solución madre inhibidora en DMSO. Se realizaron nueve pasos de dilución a partir de una concentración final superior de 10 µM y se incluyó una solución vacia "sin compuesto". Las muestras se condujeron en duplicado. Los datos de los conteos de centelleo se recolectaron y se sujetaron al análisis libre de ajustes por medio del programa de cómputo Graphpad Prism. A partir de la curva generada, se determinó la concentración que proporcionaba 50% de inhibición.
Ensayo de Inhibición de PI 3-Cinasa ? La medición de la actividad de la PI 3-cinasa ? es dependiente del enlace de afinidad especifico y alto del dominio de homología pleckstrin GRP1 (PH) para PIP3, el producto de la actividad de PI 3-cinasa. Se forma un complejo entre el anticuerpo monoclonal anti-GST etiquetado con europio, un dominio de PH GRP1 etiquetado con GST, PIP3 biotinilado y estreptavidina-aloficocianina (APC) . Este complejo genera una señal de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia con resolución temporal estable (FRET, por sus siglas en inglés), la cual es disminuida por la competencia de PIP3, generada en el ensayo de PI 3-cinasa, con el PIP3 biotinilado. El ensayo se realizó en Upstate (Dundee, UK) como sigue: en un volumen de reacción final de 20 µl, la PI 3-cinasa ? (enzima humana de longitud completa etiquetada con H?s6 en la N-terminal recombinante, expresada por baculovirus en células de insecto Sf21) se incubó en amortiguador de ensayo que contenía fosfat?d?lmos?tol-4 , 5-b?sfosfato 10 µM y MgATP 100 µM (Km de la enzima 117 µM) . La reacción se inició por la adición de la mezcla de MgATP. Después de la incubación durante 30 minutos a temperatura ambiente, la reacción se detuvo por medio de la adición de 5 µl de solución de detención que contenía EDTA y fosfatidilmositol-3, 4 , 5-tr?sfosfato biotmilado. Finalmente, se agregaron 5 µl de amortiguador de detección, el cual contenia anticuerpo monoclonal anti-GST etiquetado con europio, dominio de PH GRP1 etiquetado con GST y estreptavidma-APC . La placa entonces se leyó en un modo de fluorescencia con resolución temporal y la señal de fluorescencia con resolución temporal homogénea (HTRF, por sus siglas en ingles) se determino de acuerdo con la formula HTRF = 10000 x (Em665nm/Em620nm) . Los puntos de datos duplicados se generaron a partir de una serie de diluciones logarítmicas 1/2 de una solución madre del compuesto en DMSO. Se realizaron nueve pasos de dilución a partir de una concentración final superior de 10 µM y se incluyo una solución vacia "sin compuesto". Los datos de la relación de HTRF se transformaron en % de actividad de controles y se analizaron con una aplicación de respuesta a la dosis sigmoidal de cuatro parámetros (pendiente variable) . Se determinó la concentración que proporcionaba 50% de inhibición (IC50).
Ensayo de Inhibición de la Proliferación Celular Las lineas celulares de cáncer (U937 y HCT 116) que se desarrollaban en una fase logarítmica se recolectaron y se sembraron a 1000 - 2000 células/pocilio (volumen final de 100 µl) en placas de cultivo de tejido de 96 pocilios. Después de 24 horas de crecimiento, las células se trataron con el compuesto. Las placas entonces se incubaron nuevamente durante 72-96 horas adicionales antes de que se condujera un ensayo de viabilidad de células WST-1 de acuerdo con las instrucciones de los proveedores (Roche Applied Science) . Los datos se expresaron como un porcentaje de inhibición del control, medido en ausencia del inhibidor, como sigue :- % de inhibición = 100- ( (SVS° ) xlOO ) donde S1 es la señal en presencia del inhibidor y S° es la señal en presencia de DMSO. Las curvas de respuesta a la dosis se generaron a partir de 8 concentraciones (concentración final superior 10 µM, con diluciones de 3 veces), utilizando 6 duplicados. Los valores IC50 se determinaron por medio de un análisis de regresión no lineal, después de ajustar los resultados a la ecuación para la respuesta a la dosis sigmoidal con pendiente variable (% de actividad contra la concentración logarítmica del compuesto) , utilizando el programa de cómputo Graphpad Prism.
Estimulación de LPS de sangre entera humana La sangre entera se extrajo por medio de una punción en las venas utilizando los sistemas vacutainerMR heparinizado (Becton Dickinson) y se diluyó en un volumen igual de medio de cultivo de tejido RPMI1640. 100 µl se colocaron en placas de cultivo de tejido de 96 pocilios con fondo en forma de V. El inhibidor se agregó en 100 µl del medio RPMI1640 y 2 horas después la sangre se estimuló con LPS (cepa de E col i 005 :B5, Sigma) a una concentración final de 100 ng/ml y se incubó a 37 °C en C02 al 5% durante 6 horas. Los niveles de TNF-a se midieron de los sobrenadantes libres de células por medio del ensayo ELISA de emparedado (R&D Systems #QTA00B) .
Ensayo de Carboxilesterasa de Células Rotas Preparación del extracto de células Las células de tumor U937 o HCT 116 (~ 109) se lavaron en 4 volúmenes de Dulbeccos PBS (~ 1 litro) y se aglomeraron a 525 g durante 10 minutos a 4°C. Esto se repitió dos veces y el aglomerado de células final se resuspendió en 35 mi de amortiguador de homogenización frió (Trizma 10 mM, NaCl 130 mM, CaCl: 0.5 mM pH 7.0 a 25°C). Los homogenados se prepararon por medio de la cavitación de nitrógeno (49.151 kg/cm2 (700 lb/pulg7) durante 50 minutos a 4°C). El homogenado se mantuvo sobre hielo y se complementó con un cóctel de inhibidores a concentraciones finales de: Leupeptma 1 µM Aprotinina 0.1 µM E64 8 µM Pepstat na 1.5 µM Bestatina 162 µM Quimostatma 33 µM Después de la aclaración del homogenado de células por medio de la centrifugación a 525 g durante 10 minutos, el sobrenadante resultante se utilizó como una fuente de actividad de esterasa y se almacenó a -80°C hasta que se requirió.
Medición de la escisión de éster La hidrólisis de esteres a los ácidos carboxilicos correspondientes puede medirse utilizando el extracto de células, como se preparó anteriormente. Para este efecto el extracto de células (~ 30 µg/volumen de ensayo total de 0.5 mi) se incubó a 37 °C en un amortiguador de Tris-HCl 25 mM, NaCl 125 mM, pH 7.5 a 25°C. En el momento cero, el éster (substrato) entonces se agrego a una concentración final de 2.5 µM y las muestran se incubaron a 37°C durante el tiempo apropiado 14! (usualmente O u 80 minutos) . Las reacciones se detuvieron por medio de la adición de 3 x volúmenes de acetonitrilo. Para las muestras del momento cero, el acetonitrilo se agregó antes del compuesto de éster. Después de la centrifugación a 12000 g durante 5 minutos, las muestras se analizaron por el éster y su ácido carboxilico correspondiente a temperatura ambiente por medio de CL-EM (Sciex API 3000, bomba binaria HP1100, CTC PAL) . La cromatografia se basó en una columna AceCN (75*2.1 mm) y una fase móvil de 5-95% de acetonitrilo en agua/0.1% de ácido fórmico.
Cuantificación de la expresión de hCB-1, hCE-2 y hCE-3 en lineas celulares monociticas y no monociticas Los cebadores específicos para los genes se utilizaron para amplificar por medio de la PCR la hCE-1, -2 y -3 del ADNc humano. Los productos de la PCR se clonaron en un vector de plásmido y se verificó la secuencia. Entonces se diluyeron en serie para el uso como curvas estándar en reacciones PCR en tiempo real. El ARN total se extrajo de varias lineas celulares humanas y se preparó el ADNc. Para cuantificar los niveles absolutos de las hCE' s en las lineas celulares, los niveles de expresión de genes se compararon con los estándares de productos de PCR clonados en un ensayo de PCR SYBR Green en tiempo real. La Figura 1 muestra que la hCE-1 solo es expresada a una cantidad significativa en una linea celular monocitica.
Resultados Biológicos Los compuestos referidos en los Ejemplos 1-5 anteriores se investigaron en los ensayos de inhibición de enzimas, proliferación celular y escisión de éster descritos anteriormente y los resultados se muestran en las Tablas 3 y 4.
Potencia Tabla 3 Los resultados anteriores muestran que: (i) los compuestos modificados por éster de aminoácido (Compuestos 8 y 10) y el ácido (Compuesto 9) los cuales resultarían de la escisión de la configuración de éster, tienen valores IC50 en el ensayo de enzimas comparables al valor para el inhibidor de HDAC no modificado (SAHA Compuesto 7) indicando que la configuración de éster de alfa-aminoácido se unió a SAHA en un punto el cual no alteró su modo de enlace. (ii) aún cuando los esteres (Compuestos 8 y 10) y el ácido (Compuesto 9) tienen actividades comparables con el inhibidor no modificado (SAHA - Compuesto 7) hay un incremento significativo en la potencia celular del éster ciclopentilico escindible por esterasa (Compuesto 8) sobre el inhibidor no modificado (Compuesto 7) pero una disminución sustancial en la potencia celular en el caso del éster t-butilico estable a la esterasa (Compuesto 10), indicando que este último no acumula el ácido en células para generar una potencia celular incrementada. (iii) la actividad más grande en el ensayo de proliferación celular para el Compuesto 8 sobre la contraparte no modificada, Compuesto 7 (o el derivado de éster no hidrolizable, Compuesto 10), indica que el éster es hidrolizado al ácido precursor Compuesto 9 en la célula donde se acumula y ejerce un efecto inhibitorio más grande.
Tabla 3 continuación Los resultados anteriores muestran que: (i) el inhibidor modificado por el alfa-aminoácido, Compuesto 13, el cual resultarla de la escisión de la configuración de éster en el Compuesto 12, tiene un valor IC50 en el ensayo de enzimas comparable a aquel del inhibidor de aurora cinasa no modificado (Compuesto 11) indicando que es posible unir la configuración de éster de alfa-ammoácido en un punto el cual no altera el enlace a la aurora cinasa A. (n) aún cuando el acido (Compuesto 13) tiene una actividad de enzima comparable al inhibidor no modificado (Compuesto 11) y el ester (Compuesto 12) es un inhibidor mas débil, hay un incremento significativo en la potencia celular del Compuesto 12 sobre el inhibidor no modificado (Compuesto 11) . El éster t-butilico escindido menos fácilmente (Compuesto 14) tiene una actividad de enzima comparable con el éster ciclopentilico escindible (Compuesto 12) pero es unas 20 veces menos activo en el ensayo de células, (m) la actividad mas grande en el ensayo de proliferación celular del Compuesto 12 sobre tanto la contraparte no modificada (Compuesto 11) como el éster t-butilico escindido menos fácilmente (compuesto 14) indica que el éster ciclopentilico es hidrolizado al ácido precursor en la célula, donde se cumula y ejerce su efecto inhibitorio mas grande.
Tabla 3 continuación Los resultados anteriores muestran que: (i) el inhibidor modificado por alfa-aminoácido, Compuesto 16 y el ácido, Compuesto 17, el cual resultarla de la escisión de la configuración de éster en el compuesto 16, tienen los valores IC50 en el ensayo de enzimas comparable al valor para el inhibidor de MAP cinasa P38 no modificado (Compuesto 15) indicando que es posible unir la configuración de éster de alfa-aminoácido en un punto el cual no altera la unión a la MAP cinasa P38. (ii) el ácido, Compuesto 17, tiene actividad comparable contra la enzima para el inhibidor no modificado (Compuesto 15) y para el éster t-butilico (Compuesto 18) . Sin embargo, hay un incremento significativo en la capacidad del éster ciclopentilico (Compuesto 16) para inhibir la producción de TNF dentro de células monociticas que están presentes en la sangre entera en comparación con el inhibidor no modificado (Compuesto 15) y el éster t-butilico escindido menos fácilmente (Compuesto 18). (iii) la actividad más grande en el ensayo de sangre entera para el Compuesto 16 sobre la contraparte no modificada Compuesto 15 y el éster t-butilico escindido menos fácilmente, Compuesto 18, indica que el éster ciclopentilico es hidrolizado al ácido precursor en la célula, donde se acumula y ejerce un efecto inhibitorio más grande.
Tabla 3 continuación Los resultados anteriores muestran que: (i) el inhibidor modificado por alfa-aminoácido, Compuesto 19, el cual resultarla de la escisión de la configuración de éster en el Compuesto 6, tiene un valor IC50 en el ensayo de enzimas comparable a aquel del inhibidor de DHFR no modificado (Compuesto 2 (G=N) ) indicando que es posible unir la configuración de éster de alfa-aminoácido en un punto el cual no altera el enlace a DHFR. (ii) aún cuando el ácido (Compuesto 19) tiene una actividad inhibitoria de enzimas comparable al inhibidor no modificado (Compuesto 2 (G=N) ) , el éster (Compuesto 6) es significativamente más potente en la inhibición de la proliferación celular que el inhibidor no modificado (Compuesto 2 (G=N) ) . (iii) la actividad más grande en el ensayo de proliferación celular del Compuesto 6 sobre la contraparte no modificada (Compuesto 2 (G=N) ) indica que el éster ciclopentilico es hidrolizado al ácido precursor en la célula, donde se acumula y ejerce su efecto inhibitorio más grande.
Tabla 3 continuación Los resultados anteriores muestran que: (i) el inhibidor modificado por éster de alfa-aminoácido, Compuesto 21, y el ácido, Compuesto 22, el cual resultarla de la escisión de la configuración de éster en el Compuesto 21, tienen valores IC50 en el ensayo de enzimas dentro de un factor de 10 del valor del inhibidor de PI 3-cmasa no modificado (Compuesto 20) , indicando que es posible unir la configuración de éster de alfa-ammoácido en un punto el cual aún retiene un enlace razonable a la PI 3-cmasa. (íi) aunque el ácido (Compuesto 22, tiene una actividad comparable con el inhibidor no modificado (Compuesto 20) y el éster (Compuesto 21), hay un incremento significativo en la potencia del éster para inhibir la producción de TNF en células monociticas que están presentes en la sangre entera en comparación con el inhibidor no modificado (Compuesto 20) y el éster t-butilico escindido menos fácilmente (Compuesto 23) . (íii) la actividad más grande en el ensayo de sangre entera para el Compuesto 21 sobre la contraparte no modificada (Compuesto 20 y el éster t-butilico escindido menor fácilmente Compuesto 23 indica que el éster ciclopentilico es hidrolizado al ácido precursor en la célula, donde se acumula y ejerce un efecto inhibitorio más grande.
Selectividad Tabla 4: Comparación de la proliferación celular y escisión de éster para una línea celular monocítica y no monocítica 1 La cantidad del ácido producido después de la incubación del compuesto modificado (Compuesto 24) durante 80 minutos en el ensayo de carboxilesterasa de células rotas descrito anteriormente.
Los resultados anteriores muestran: (i) que el compuesto no modificado (Compuesto 7) no muestra selectividad entre una linea celular monocitica y no monocitica en tanto que esto se puede lograr por medio de la unión de una configuración de éster apropiada, como en el Compuesto 24. (ii) esta selectividad se correlaciona con la escisión mejorada del éster al ácido por la linea celular monocitica. (iii) la actividad celular mejorada solo se observa en la linea celular donde se produce el ácido indicando que este mejoramiento en la potencia celular es debido a la acumulación del ácido.
Tabla 4 continuación La cantidad del ácido producido después de la incubación del compuesto (25) durante 80 minutos en el ensayo de carboxilesterasa de células rotas descrito anteriormente. Los resultados anteriores muestran: i) que el compuesto no modificado (compuesto (10)) no muestra selectividad entre una linea celular monocitica y no monocitica en tanto que esto se logra por medio de la unión de una configuración de éster apropiada, como en el Compuesto 25. ii) esta selectividad se correlaciona con la escisión mejorada del éster al ácido por la linea celular monocitica. iii) la actividad celular mejorada solo se observa en la linea celular donde se produce el ácido indicando que este mejoramiento en la potencia celular es debido a la acumulación del ácido.
Tabla 4 continuación 1 La cantidad del ácido producido después de la incubación del compuesto (5) durante 80 minutos en el ensayo de carboxilesterasa de células rotas descrito anteriormente. Los resultados anteriores muestran que: (i) el compuesto no modificado (compuesto 2 G = N) no muestra selectividad entre lineas celulares monociticas y no monocíticas en tanto que esto se puede lograr por medio de la unión de una configuración de éster apropiada como en el compuesto 5. (ii) esta selectividad se correlaciona con la escisión mejorada del éster al ácido por la línea celular monocítica. (iii) la actividad celular mejorada solo se observa en la línea celular donde se produce el ácido indicando que este mejoramiento en la potencia celular es debido a la acumulación del ácido. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (16)

  1. Reivindicaciones Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un conjugado covalente de un éster de alfa-aminoácido y un modulador de la actividad de una enzima o receptor intracelular objetivo, caracterizado porque: el grupo éster del conjugado es hidrolizable por una o más enzimas carboxilesterasas intracelulares al ácido correspondiente; y el éster de alfa-aminoácido se conjuga al modulador en una posición alejada de la interfaz de enlace entre el inhibidor y la enzima o receptor objetivo.
  2. 2. Un conjugado covalente de un éster de alfa-aminoácido y un modulador de la actividad de una enzima o receptor intracelular objetivo, caracterizado porque: el grupo éster del conjugado es hidrolizable por una o más enzimas carboxilesterasas intracelulares al ácido correspondiente; y el éster de alfa-aminoácido se conjuga al modulador de tal manera que el modo de enlace del modulador conjugado y el ácido correspondiente a la enzima o receptor objetivo sea el mismo que aquel del modulador no conjugado.
  3. 3. Un método para incrementar o prolongar la potencia intracelular y/o tiempo de residencia de un modulador de la actividad de una enzima o receptor intracelular objetivo, caracterizado porque comprende la modificación estructural del modulador por medio de la unión covalente al mismo de un éster de alfa-aminoácido en una posición alejada de la interfaz de enlace entre el inhibidor y la enzima o receptor objetivo, el grupo éster del conjugado es hidrolizable por una o más enzimas carboxilesterasas intracelulares al ácido correspondiente.
  4. 4. Un método para incrementar o prolongar la potencia intracelular y/o tiempo de residencia de un modulador de la actividad de una enzima o receptor intracelular objetivo, caracterizado porque comprende la modificación estructural del modulador por medio de la unión covalente al mismo de un éster de alfa-aminoácido de tal manera que el modo de enlace del modulador conjugado y el ácido correspondiente a la enzima o receptor objetivo sea el mismo que aquel del modulador no conjugado, el grupo éster del conjugado es hidrolizable por una o más enzimas carboxilesterasas intracelulares al ácido correspondiente.
  5. 5. Un conjugado de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 2 o un método de conformidad con la reivindicación 3 o la reivindicación 4, caracterizado porque el éster de alfa-aminoácido conjugado covalentemente no es el elemento C-terminal de una configuración dipeptídica del modulador conjugado.
  6. 6. Un conjugado o método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el modulador es uno el cual se enlaza de manera no covalente a la enzima o receptor intracelular objetivo.
  7. 7. Un conjugado o método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el éster de alfa-aminoácido se conjuga covalentemente al modulador a través de un radical conector.
  8. 8. Un conjugado o método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el éster de alfa-aminoácido se conjuga al modulador por via del grupo amino del éster de aminoácido.
  9. 9. Un conjugado o método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el éster de alfa-aminoácido se conjuga al modulador por vía del átomo de carbono alfa del éster de aminoácido.
  10. 10. Un conjugado o método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el éster es hidrolizable por células que contienen una o más de la enzimas carboxilesterasas intracelulares hCE-1, hCE-2 y hCE-3 al alfa-aminoácido correspondiente.
  11. 11. Un conjugado o método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el éster es hidrolizable por células que contienen la enzima carboxilesterasa intracelular hCE-1 al alfa-aminoácido correspondiente y no por las células que contienen hCE-2 o hCE-3.
  12. 12. Un conjugado o método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el átomo de nitrógeno del grupo amino del éster de aminoácido es sustituido pero no unido directamente a un radical carbonilo.
  13. 13. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 y 5 a 12 y un portador farmacéuticamente aceptable.
  14. 14. Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque está adaptada para la administración tópica y en donde el conjugado (a) cuando el éster de alfa-aminoácido se une al modulador por via de su grupo amino, el átomo de carbono adyacente al átomo de carbono alfa del éster de alfa-aminoácido es monosustituido o (b) cuando el éster de alfa-aminoácido se une al modulador por vía de un átomo de carbono del aminoácido, el átomo de carbono adyacente a aquel átomo de carbono del aminoácido no es sustituido.
  15. 15. Un método para incrementar o prolongar selectivamente la potencia intracelular y/o tiempo de residencia de un modulador de la actividad de una enzima o receptor intracelular objetivo en macrófagos y/o monocitos con relación a los otros tipos de células, caracterizado porque comprende tratar una población mezclada de células in vi tro o in vivo con un conjugado del modulador de conformidad con la reivindicación 12.
  16. 16. Un método para identificar un conjugado covalente de un éster de alfa-aminoácido de un modulador dado de la actividad de una enzima o receptor intracelular objetivo, el conjugado tiene potencia celular incrementada o prolongada con relación al modulador dado, el método está caracterizado porque comprende: (i) identificar una posición o posiciones sobre un modulador dado de la actividad de una enzima o receptor intracelular objetivo o sobre una pluralidad de moduladores dados de la actividad de una enzima o receptor intracelular objetivo que comparte el mismo modo de enlace para la enzima o receptor objetivo, la posición o posiciones están alejadas de la interfaz de enlace entre los moduladores y la enzima o receptor objetivo; (ii) modificar covalentemente el (los) modulador (es) por medio de la unión de un radical de éster de alfa-aminoácido o un rango de diferentes radicales de éster de alfa-aminoácido en una o más de las posiciones identificadas en (i) ; (iii) someter a prueba el (los) modulador (es ) conjugados al alfa-aminoácido que se prepararon en (ii) para determinar su actividad contra la enzima o receptor objetivo; y (iv) de los datos adquiridos en (iii), seleccionar una o más de las versiones conjugadas al éster de alfa-aminoácido sometidas a prueba del (los) modulador (es) dado(s) que causan la modulación de la actividad de enzimas o receptores dentro de las células, se convierten a y se acumulan como el ácido carboxílico correspondiente dentro de las células y que muestran potencia celular incrementada o prolongada.
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